JPH0222902B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は例えば高速液体クロマトグラフの展開
液のような流動液の経路に設置して通過液中の酸
化還元性物質の濃度を電気化学的にモニターする
ための装置に関するものである。

高速液体クロマトグラフは溶液中の無機物質、
有機物質、生化学物質などの分離分析に最も広く
用いられている方法の１つであるが、この方法は
クロマトカラムによる各種物質の分離法と、流出
液中の分離物質の定量検出法との２つの方法より
成立している。後者の検出法には紫外線吸収法、
呈色法、螢光法、示差屈折法などの光学的検出法
が主として用いられてきたが、最近、一部の酸化
性生理活性物質に対して、電気化学的検出法も導
入されるようになつた。その代表的なものはキツ
シンジヤーら（P.T.Kissinger et al The
ANALYTICAL LETTERS.6(5)、P.495〜477
（1973））により導入されたアドレナリン系ホルモ
ン検出用のボルタンメトリー電極装置で、これは
既に数社により製品化されている。本発明の検出
装置も、これと同じ電気化学反応を応用した装置
であるが、既存のものとは全く異なつた構成をと
つていて、測定感度が著しく向上したものになつ
ている。なお、この検出装置は高速液体クロマト
グラフのみならず、他の方法で分離された流液中
の物質や流液中に外部より注入されたり、酵素反
応などで生成した物質など、流液中に存在する物
質に対して広く適用できる。

現在使用されている高速液体クロマトグラフ用
キツシンジヤー型装置では、測定電極にカーボン
電極が用いられ、＋0.8ボルト（対Ag／AgCl）附
近の電位を与えて生理活性アミン類の検出を行つ
ている。この検出反応はアドレナリンを例として
示すと下式のようになる。

このため電流が測定電極から対照電極（または
補助電極）に流れるので、この電流の強さを測定
することにより、装置内を流れる物質の濃度が連
続的に検出される。

さて、高速液体クロマトグラフ流出液のように
細い流液中に分離されてくる物質の検出装置には
２つの特性が要求される。一つは検出感度が正確
かつ鋭敏であることであり、いま一つは検出部の
容積が小さいことである。前者はあらゆる計器に
必要な要素であるが、後者は流液系の場合に特に
要求される要素で、高速液体クロマトグラフのよ
うに極めて鋭敏な分離帯が得られる場合には、こ
れを鈍化させないで測定するために著しく小さい
容積（20μ以下）でなければならない。上述の
キツシンジヤー型検出装置では、後で詳述するよ
うに測定電極、対照電極、補助電極など総ての電
極が被測定液の流路に沿つて配置されているので
測定電極の面積を大きくして電極感度を上げなが
ら、流路を薄層にして容積を小さくすることが、
不可能であつた。本発明は、この問題を解決する
ために多孔質材質の平板と測定電極とを対面さ
せ、前者の裏側に対照電極や補助電極を置くとい
う構成をとることで、大面積で薄層の検出部を形
成させて、高感度でしかも容積の小さい電極装置
の製作を可能ならしめたものである。以下に図面
を用いて、本発明の構成、特徴、応用例などを詳
述する。

この装置は第１図に示されているように測定電
極部ａ、スペーサー部ｂ、電解液溜部ｃの三部よ
りなる。ａは測定電極１を装着したプラスチツク
板、ｃはプラスチツク板で多孔質板電解液溜め、
対照電極、補助電極などをその内部に収めたも
の、ｂ（即ち５）は上記ａおよびｃの間に挿入さ
れるスペーサーで、中央をくり抜いた極薄プラス
チツクフイルムである。使用時には６本のネジに
よつて測定電極部ａ、スペーサー部ｂ、電解液溜
部ｃの三者が密着して組立てられるが、この図で
は理解の便宜上ａ，ｂ，ｃの間を離した形で示し
てある。

第１図の１は平板状の測定電極で、被検出物質
の種類、濃度、分離の鋭敏度などに応じて10mm²な
いし2000mm²の面積を持たせる。その材質もグラツ
シーカーボンのような炭素板、白金や金のような
貴金属板またはこれらに白金黒を電着したもの、
ニツケル板、鉛板、貴金属粉末を混合したプラス
チツク板、貴金属を蒸着または電鍍したガラス板
またはセラミツク板など多種多様のものが用いら
られる。これらの測定電極はいずれもアドレナリ
ンのようなフエノール化合物、ヒスタミンのよう
なアミン類、各種のアミノ酸類、糖類、酸素、過
酸化水素、アスコルビン酸、金属イオンなど極め
て多種類の酸化還元性物質の検出に用いられる
が、反応性が物質ごとにかなり異つているので、
被検出物質の性質によつて電極の材質を選択する
ことが望ましい。測定電極には対照電極を基準と
して一定の電位を加えて被検出物質と反応させる
が、電位を高くして酸化反応によつて検出するこ
ともあるし、逆に電位を低くして還元反応を行わ
せることもあり、また、その電位の高低の程度も
物質の種類、溶液のPH、電極材質などによつて適
正な値を選ぶ必要がある。例えば医学的に重要な
ホルモンであるカテコールアミン類（アドレナリ
ン、ノルアドレナリン、ドーパミンなど）の検出
では、炭素電極を用いたときには、PH２附近では
±0.8ボルト、PH附近では＋0.6ボルト附近の加電
圧（対Ag／AgCl）が適当で、これより高いと残
余電流が急激に増加し、低いと検出反応が著しく
低下し、いずれも検出精度が悪くなる。

第１図の２は対照電極で、普通飽和または1M
kcl中に浸した大容量のAg／AgCl電極が用いら
れる。３は親水性多孔質材質であるが、極めて緻
密（即ち通過孔が極めて細い）で実質的には液の
流通性が無いが、多量の電解質溶液を含み、しか
もイオンの移動が容易で、十分な導電性をもつこ
とが必要である。この様な材質には多種多様のも
のがあるが、最も良好であつたのは、孔径約10n
ｍ、孔率的50％のポアーガラスで、これは約５mm
の厚さのとき、0.1M NaCl中で電解分析に要求
される値の100倍以上の導電性をもつが、液の通
過は１気圧以下の加圧下でもほとんど認められな
い。このほかにも、極めて緻密な多孔性陶器板、
著しく微細な半熔融ガラス粉板（シンタードガラ
ス）、緻密な硬質スポンジ状親水性プラスチツク
板などが使用できる。また、十分に緻密でないた
めに液の流通性のあるときには寒天やアクリルア
ミドなどを浸み込ませてからゲル化して用いると
有効である。本多孔性質の作用電極に対面する面
はプラスチツク支持板６と共に精密に研磨された
平面で、スペーサー５によつて極めて短距離を隔
てて測定電極１と対面し、この間隙を被測定液が
定速で通過すようになつている。スペーサー５に
は10〜100μｍのテフロン（登録商標名）、ポリプ
ロピレン、ポリカーボネートなどのプラスチツク
フイルムが用いられる。なお、上記の多孔質板３
の裏面は電解液４に接している。また、同様の多
孔質材料は対照電極２と電解液４の電気的導通の
ためにも用いられているが、この材質は前記の測
定電極に対面している多孔質材料よりも導電性の
良いものが望ましい。前記の電解液４は希薄な塩
類溶液であれば何でもよいが、普通被測定用流通
液と同一塩組成の液を貯溜し密閉させておくか、
または測定の終つた流通液を注入管９および流出
管１０を用いて通過させる。

第１図の６はそれぞれ測定電極部（ａ部）や電
解液溜部（ｃ部）を保持するプラスチツク材で、
アクリル樹脂、ポリカーボネイト樹脂、ダイフロ
ンなどが用いられる。ａ部では中央に測定電極１
を固定し、その上下両端附近にそれぞれ被測定液
流入管７および被測定液流出管８が挿入されてい
る。これらの管には普通内径0.2mm外径1.5mmのテ
フロンチユーブを用い、その外面をエツチングし
てからエポキシ樹脂で固定する。ｃ部もａ部と同
様のプラスチツク材が用いられ、多孔性材質板
３、電解液注入管９および電解液流出管１０（後
述）のプラスチツク支持板６への固定にはエポキ
シ樹脂が、また対照電極２の固定にはシリコン樹
脂が用いられる。なお、上記ａ部およびｃ部の互
に対面する部分は全面が平面になる様に精密に加
工されている。さて第１図では既述のように電極
部ａとスペーサーｂと電解液溜部ｃとが離れた形
で描かれているが、実際に使用するときには６本
のネジによつて密着固定される様になつている。
これらのネジ孔は第１図の１１で示されている
が、これらの孔はこの図の断面には存在せず、そ
の向う側と手前とに２本づつ合計６本があるの
で、その位置を点線で示してある。

上記の様にして組立てた装置を２極式回路（後
述）で測定するときには測定電極１と対照電極２
との間に必要な電位を加えて使用すればよいが、
三極式（後述）で用いるときにはこのほかに補助
電極が必要となる。このためには第１図の流出管
１０を白金、ステンレスなどの安定な金属で造つ
てこれを補助電極として用いても良いし、また、
別に白金線の様なものを電解液溜めに挿入して用
いても良い。このときの電気系との接続方法は以
下に説明する第２図Ｂに示されている。

第２図ＡおよびＢは本発明の電極装置に用いる
電気系の概要である。この図では測定電極の参照
電極に対する電位は＋0.7ボルトになるようにし
てあるが、これはカテコールアミン類をPH3.5附
近で検出する場合についての値であつて、この電
位は被検出物質の種類や液のPHによつて適当な値
に変更しなければならない。第２図Ａの二極式で
は、測定電極と多孔質液絡（第１図の３に相当）
の間の間隙を被測定試料液が流れ、その酸化還元
反応（カテコールアミンでは酸化）によつて生じ
た電解電流は測定電極１から多孔質液絡３を経て
参照電極２の方向へと流れるので、この電流を増
巾して記録する。第２図Ｂの三極式では測定電極
１の電位が対照電極２に対して一定値に保れたる
点は二極式と同様であるが、この電位維持はオペ
アンプA′およびA″を通じて行われ、試料の酸化
還元による電解電流は参照電極２には流れずに補
助電極１０に流れる様になつている。このため参
照電極２の消耗が全くないという利点を持つが、
オペアンプA′およびA″のノイズが電極電位に影
響して拡大されたノイズとなる欠点がある。特に
本発明のように大面積の測定電極（作用電極）を
使用する系では、電極の容量因子も加わつて、こ
のオペアンプに由来するノイズが著しく拡大され
て測定精度が非常に悪くなりがちである。これは
回路部品の選択その他によつてかなりの水準まで
改善できる可能性があるが、現段階では、著しく
鋭敏な検出を行うためには、大容量の対照電極を
用いて二極式によつて測定した方が良い結果を示
している。しかし、試料の濃度が高く精度を幾分
下げても良い場合には、三極式を用いる方が対照
電極の消耗がないので有利である。

第３図ＡおよびＢはそれぞれ従来の電極装置と
本発明の装置との相異点を示す模式図である。第
３図Ａは現在使用されているキツシンジヤー式装
置の基本的構成を示す断面図であるが、ここでは
測定電極１、対照電極２、補助電極１０の三者が
同一流路上に配置されている。この構成をとると
きには、電極面上の流量を小さくするために測定
電極１とこれに対面する壁面（プラスチツク）と
の間隙を著しく薄くすると、液の電気抵抗が増加
して被測定液Ｓ内に大きな電位勾配が生じる。こ
の結果、正常な電極反応が行われるのは測定電極
１の対照電極２側の周辺部のみとなつて、測定電
極面の大部分は反応を行わないか、または所定の
条件とは異なつた電位での電極反応を行うことに
なる。第３図Ｂは本発明の基本構成を示す断面図
であるが、この場合には測定電極１が均一な多孔
質液絡３と被測定液Ｓの薄膜を隔てて対面してい
て、対照電極２や補助電極１０は多孔質液絡３の
裏面の電解液４内に配置されている。この電解液
４内の導電性は多孔質液絡３内に比して十分に大
きいから、測定電極１から、対照電極２または補
助電極１０への導電性は測定電極１の全面にわた
つて均一になる。このため測定電極面を如何に大
きくしても、また、被測定流通液の層を著しく薄
くしても、その全面が均一な電極反応を行うこと
になるので、電極反応量を大きくさせながらしか
も測定面上の容積を小さくする（即ち、鋭敏なモ
ニターを行う）ことが可能になる。この結果、本
発明の装置では、高速液体クロマトグラフで普通
に用いられる流速（約１ml／分）でも、流動液中
の被測定物質の全量または大部分を電解し得る様
な構造にすることが出来るので、微量物質からも
大きな出力が得られ、測定精度が著しく増大す
る。これに対して従来の電気化学検出装置では試
料中の極く一部のみを電解しているにすぎないの
で、測定値が小さく精度が低くなる。なお、上述
のように被測定物質の全量または大部分を電解す
る分析法は、一定容器内の試料に関しては、電量
分析法と呼ばれて旧くより行われてきた方法であ
るが、本発明のような流動液中の試料分析に行わ
れた例は見当たらない。

第４図Ａ，Ｂ，Ｃはカテコールアミン系ホルモ
ンの高速液体クロマトグラフ流出液に対して、本
発明の電気化学検出装置と、現在最もよく用いら
られている。光学的検出装置とを同時に併用して
両者の精度を比較したものである。本実験では直
径４mm長さ300mmのシリカ系スルホン型カチオン
交換体（東洋ソーダ株式会社の製品IEX510）の
カラムに、４種のカテコールアミン混合物をチヤ
ージし、0.2M NaClを含むPH4.0の0.1M蟻酸緩衝
液を１ml／minの流速で流して展開し、流出液を
まず光学検出装置（280nｍ吸収法）に通してか
ら引き続いて本発明の電気化学検出装置に通して
モニターした結果を２ペンレコーダで記録した。

第４図Ａは流出液を光学検出装置でモニターし
れ結果であり、第４図Ｂは同じ液を本発明の電気
化学検出装置でモニターしたものである。第４図
Ａのグラフの縦軸は280nｍ吸光度（単位
Absorbance：Ａ）で、そのスケールは図の右肩
附近に示されている。横軸は時間であるが液の流
出速度（１ml／min）が一定であるので、これは
同時に流出液量を示し、その１分または１mlに相
当するスケール巾は第４図Ｂの右下に示されてい
る。この実験ではエピネフリン（アドレナリン）、
ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）、ドーパ、
ドーパミン４種のカテコールアミンを100ピコモ
ル（10^-10モル）づつ混合した試料を用いた。グ
ラフ内のＩはこのカテコールアミン混合物をチヤ
ージした位置時間を示し、Ｖはカラムのボイド容
積の位置（吸着せずに素通りする物質の出る位
置）を示し、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｐはそれぞれドーパ、
エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミンの
流出ピークを示す。第４図Ａからわかる様に上記
の量（100ピコモル）のカテコールアミンでは、
光学測定によつて得た分離曲線はかなり大きなノ
イズを伴つている。

第４図Ｂは上述のクロマトグラフ流出液を本発
明の電気検出装置でモニターした結果であるが、
この場合の縦軸は電解電流量を示し、100nA当り
の巾が図の右肩に示されている。横軸やグラフの
Ｉ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｐなどは第４図Ａの場合と
同様である。この図より明らかな様に本発明の検
出装置による記録曲線には全くノイズが含まれて
おらず、極めて正確に検出パターンがモニターさ
れている。

第４図Ｃは、上述の第４図ＡおよびＢの場合の
１／１００量のカテコールアミン混合試料、すなわち
各成分が１ピコモル（10^-12モル）づつ含まれた
試料をチヤージして本発明の電気化学検出装置で
モニターした結果を示す。この様に微量であつて
も全くノイズを含まずに正確に検出されているこ
とがわかる。なお、この場合も本発明の電気化学
的検出装置の前に光学検出装置を置いて同時モニ
ターを行つたが、ノイズのみが記録され、試料に
由来するピークが全く観察されなかつたので、図
示することを省略した。また、この場合の更に10
分の１の0.1ピコモル（10^-13モル）づつのカテコ
ールアミン混合試料をチヤージした場合でも、本
発明の検出装置を用いるときには、僅かにノイズ
が認められるだけで十分な精度のモニターが可能
であつた。

以上の実験結果及び他の多数の実験結果から、
本発明による電気化学検出装置は、一般的な光学
検出装置の1000倍以上、従来の電気化学装置の
100倍以上の精度を示すことが明らかになり、高
速液体クロマトグラフ流出液のように流液中の微
量酸化還元物質のモニターに極めて有効であるこ
とが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の装置を示す断面図、第２図は
本発明の装置に適用する電気系の概要を示すブロ
ツク図、第３図Ａ及びＢはそれぞれ従来の装置及
び本発明の装置を示す模式図（両者の差異を示す
図）、第４図Ａは被測定液を従来の装置でモニタ
ーした結果を表わす図、第４図Ｂは第４図Ａの場
合と同じ被測定液を本発明の装置でモニターした
結果を表わす図、第４図Ｃは第４図Ａ，Ｂの場合
の1/100量のカテコールアミン混合試料を本発明
の装置でモニターした結果を表わす図である。 １……測定電極、２……対照電極、３……多孔
質材質の平板、５……スペーサー、６……プラス
チツク支持板、７……被測定液流入管、８……被
測定液流出管、９……電解液流入管、１０……電
解液流出管（兼補助電極）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 被測定液の流路、前記流路の一つの壁面を構
   成するように設けられた平面状の反応面を有する
   作用電極、前記作用電極の反応面の何れの方向の
   巾よりも十分に短かい距離をもつて該反応面と平
   行に近接対向して設けられ前記流路の他の一つの
   壁面を構成する緻密且つ含水性で被測定液を流通
   させないがイオンの導通性をもつ多孔質材質の平
   板、前記多孔質材質の平板の前記作用電極に対向
   する面とは反応側の面即ち裏面に接して設けられ
   該裏面を一つの壁面とする電解液溜め、及び前記
   電解液溜め中の電解液に接触するように設けられ
   た対照電極、を具備したことを特徴とする流液中
   の酸化・還元物質検出用の電気化学検出装置。 ２ 前記流路が高速液体クロマトグラフのカラム
   出口に接続された流路であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の電気化学検出装置。 ３ 前記対向する作用電極の反応面と、多孔質材
   質の平板との距離が0.01〜0.2〔mm〕であり且つ前
   記反応面の面積が10〜2000〔mm²〕である特許請求
   の範囲第１項または第２項記載の電気化学検出装
   置。 ４ 被測定液の流路、前記流路の一つの壁面を構
   成するように設けられた平面状の反応面を有する
   作用電極、前記作用電極の反応面の何れの方向の
   巾よりも十分に短かい距離をもつて該反応面と平
   行に近接対向して設けられ前記流路の他の一つの
   壁面を構成する緻密且つ含水性で測定液を流通さ
   せないがイオンの導通性をもつ多孔質材質の平
   板、前記多孔質材質の平板の前記作用電極に対向
   する面とは反応側の面即ち裏面に接して設けられ
   該裏面を一つの壁面とする電解液溜め、前記電解
   液溜め中の電解液に接触するように設けられた対
   照電極、及び前記電解液溜め中の電解液に接触す
   るように設けられた補助電極、を具備したことを
   特徴とする流液中の酸化・還元物質検出用の電気
   化学検出装置。 ５ 前記流路が高速液体クロマトグラフのカラム
   出口に接続された流路であることを特徴とする特
   許請求の範囲第４項記載の電気化学検出装置。 ６ 前記作用電極の反応面と、これに対向する前
   記多孔質材質の平板との距離が0.01〜0.2〔mm〕で
   あり且つ前記反応面の面積が10〜2000〔mm²〕であ
   る特許請求の範囲第４項または第５項記載の電気
   化学検出装置。