JPH0219338A - Extraction and purification of poly (unsaturated fatty acid) from natural source - Google Patents
Extraction and purification of poly (unsaturated fatty acid) from natural sourceInfo
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- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
見逃Δ技先公界
本発明は、天然のポリ不飽和脂肪酸源からポリ不飽和脂
肪酸(polyunsaturated fatty
acid)を分離する方法に関するものであり、更に詳
細には、海水動物油といった天然起源のオイルから実質
的に純粋なEI’A及びD HAを分離する方法に関す
るものであり、そしてまた本発明は、一般的に安全と認
識されている材料のみを使用し温和な反応条件のみを用
いる方法に関するものであって、得られた物質は、シス
−トランス転位(cis−transcoversio
n)のない実質的に100%純粋なものであり、食品及
び薬品に使用できるものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention is directed to the production of polyunsaturated fatty acids from natural polyunsaturated fatty acid sources.
The present invention relates to a method for separating substantially pure EI'A and DHA from oils of natural origin, such as marine animal oils; It relates to a method that uses only materials generally recognized as safe and only mild reaction conditions, and the resulting substances have cis-trans rearrangements.
n) is substantially 100% pure and can be used in food and medicine.
主凱■漕景
各種脂肪及び脂油は、脂肪酸のトリグリセリドから成る
ものである。多くの脂肪酸、特にポリ不飽和脂肪酸は1
合成することが難しく、したがってこれら脂肪酸が天然
的に存在するところの天然の脂肪又は脂油から抽出する
ことによってのみ得られている。これら不飽和脂肪酸の
内、多くのものは治療ポテンシャル(therapeu
tic potential)を有することが知られて
いる。その他のものは好ましい作用効果を有するものと
考えられている。Various fats and fatty oils are composed of triglycerides of fatty acids. Many fatty acids, especially polyunsaturated fatty acids, are
They are difficult to synthesize and are therefore only obtained by extraction from natural fats or oils where these fatty acids naturally occur. Many of these unsaturated fatty acids have therapeutic potential.
tic potential). Others are believed to have favorable effects.
また、治療ポテンシャルを有する脂肪酸は、特定のシス
−トランス異性体の形になければならない。Also, fatty acids with therapeutic potential must be in the form of specific cis-trans isomers.
このような不飽和脂肪酸を、純粋な形で多量に且つシス
−トランス転化(conversion)を生じること
なく、取得する方法が長い間求められていた。There has long been a need for a method of obtaining such unsaturated fatty acids in large quantities in pure form and without cis-trans conversion.
治療効果を有し、そして純粋な形でしかもそれを多量に
取得するのが困難であった2つの特定のポリ不飽和脂肪
酸は5次のとおりである: (すべての2の) −5,
8,11,14,17−エイコサペンタエン酸((al
l−z)−5,8,1!、 14.17−eicosa
penta−enoic acid)、以下これをEP
Aという、及び(すべてZの) −4,7,1,0,1
3,16,19−ドコサヘキサエン酸((all−z)
−4,7,10,13,16,19−docosaha
−xaenoic acid) 、以下これをDHAと
いう。EPA及びD HAは、いずれも、プロスタグラ
ンジンPGE、生合成におけるプレカーサーとして知ら
れているものである。Two particular polyunsaturated fatty acids that have therapeutic effects and have been difficult to obtain in pure form and in large amounts are: (of all 2) -5,
8,11,14,17-eicosapentaenoic acid ((al
l-z)-5,8,1! , 14.17-eicosa
penta-enoic acid), hereinafter referred to as EP
A, and (all Z) -4,7,1,0,1
3,16,19-docosahexaenoic acid ((all-z)
-4,7,10,13,16,19-docosaha
-xaenoic acid), hereinafter referred to as DHA. EPA and DHA are both known as precursors in the biosynthesis of prostaglandin PGE.
英国特許第1 、604 、554号及び第2,033
,745号は、血栓異常の治療及び予防におけるEPA
の効果について開示をしている。また、本発明者に係る
英国特許公報第2,148,713号は、血清コレステ
ロール及びトリグリセライドレベルを低下せしめるため
に、他の特定の脂肪酸とEPA及び/又はD HAとを
併用することについて開示をしている。British Patents Nos. 1,604,554 and 2,033
, 745, EPA in the treatment and prevention of thrombotic disorders.
Discloses the effects of British Patent Publication No. 2,148,713 to the present inventor also discloses the use of EPA and/or DHA in combination with other specific fatty acids to reduce serum cholesterol and triglyceride levels. are doing.
従来、純粋なEPA及びDHAを得ることは非常に困難
であった。その理由は、これら脂肪酸の主たる起源が、
サバ、イワシまたはタラといった海産動物の油脂及び亜
麻仁油といった植物油それ自体、又は、トリグリセライ
ドといったこれら油脂類の誘導体だからである。運の悪
いことに、これら脂肪酸以外の脂肪酸が、常に大量に含
まれているのである。EPA及びDHAは医薬効果を有
するものとして知られているので、臨床研究を行うため
には、高度に純粋なEPA及びDHAが大量に必要にな
ったのである。Traditionally, it has been very difficult to obtain pure EPA and DHA. The reason is that the main source of these fatty acids is
This is because they are oils from marine animals such as mackerel, sardines, or cod, vegetable oils such as linseed oil, or derivatives of these oils and fats such as triglycerides. Unfortunately, fatty acids other than these are always present in large amounts. Because EPA and DHA are known to have medicinal effects, large amounts of highly pure EPA and DHA are required for clinical research.
EPA、DHA及びその他有用な高級不飽和脂肪酸をそ
れらのトリグリセライドから抽出するための従来法は、
高度に純粋な脂肪酸を製造するには満足できるものでは
なかった。ここで用いられるパ純粋(purity)”
という語は、鎖長が異なりそしてまた不飽和部分(un
saturation)の数及び位置が異なる他の脂肪
酸をすべて分離する意味で用いられるだけでなく、特定
のシス−トランス構造という面からも純粋であることを
意味するものである。従来法では、充分な純度が得られ
ないだけでなく、多くの場合従来法は、極端な物理的及
び化学的条件を必要とするので、脂肪酸の減成(deg
radation)、ペルオキシドの生成、及び/又は
少なくともいくつかのシス−結合のトランス−形への転
化(conversion)が、ある程度、ひきおこさ
れることになる。更にまた、合衆国食品医薬品局(FD
A)の一般的に安全として認識されているもの(Gen
erally Recognized As 5afe
)(GRAS)にはリストアツブされていない材料(1
material)が1.数多くの従来法では用いられ
ている。最終生産物が食品や医薬品において使用される
ためには、最終生産物中に非−GRAS物質(subs
tances)が存在しないことが重要なのである。Conventional methods for extracting EPA, DHA and other useful higher unsaturated fatty acids from their triglycerides include:
The production of highly pure fatty acids has not been satisfactory. Purity used here
The term refers to groups of different chain lengths and also unsaturated moieties (un
It is used not only to separate all other fatty acids that differ in the number and position of saturation, but also to mean purity in terms of a specific cis-trans structure. Not only do conventional methods not provide sufficient purity, but in many cases conventional methods require extreme physical and chemical conditions, resulting in fatty acid degradation.
radiation), peroxide formation, and/or conversion of at least some cis-bonds to the trans-form. Furthermore, the United States Food and Drug Administration (FD)
A) those generally recognized as safe (Gen
Erally Recognized As 5afe
) (GRAS) contains unrestored materials (1
material) is 1. It is used in many conventional methods. In order for the final product to be used in food or medicine, non-GRAS substances must be present in the final product.
It is important that there are no tances.
EPAを精製する従来法の1つは、米国特許第4.37
7.526号に開示されている。この特許では、飽和脂
肪酸及び不飽和度が比較的低い脂肪酸を除去するために
、EPAを含む脂肪酸混合物を尿素で処理している。そ
の結果得た溶液は、次いで。One conventional method for purifying EPA is described in U.S. Patent No. 4.37.
No. 7.526. In this patent, a fatty acid mixture containing EPA is treated with urea to remove saturated and relatively unsaturated fatty acids. The resulting solution is then prepared.
EPAの収率を更に高めるために、分別蒸留処理する。In order to further increase the yield of EPA, a fractional distillation process is performed.
しかしながら、分別蒸留を行うには、少なくとも180
℃の温度が少なくとも40分間に亘って(over a
period of)必要である。この特許のすべて
の実施例に示されており、この方法によって得ることの
できる最高の純度は、 92.9%である。更にまた、
この方法によって製造された実質量のEPA、いくつか
の場合にはその量は20%の高きに達するが、この実質
的量のEPAにはある程度のシス−トランス転化が存す
ること、も発見された。However, to carry out fractional distillation, at least 180
°C for at least 40 minutes (over a
period of) is required. The highest purity obtainable by this method, as shown in all examples of this patent, is 92.9%. Furthermore,
It has also been discovered that the substantial amount of EPA produced by this method, in some cases reaching as high as 20%, has some degree of cis-trans conversion. .
EPAのトランス一体は1食品又は医薬品に使用するに
はいかなる量でも完全に有害なのである。The trans-form of EPA is completely harmful in any amount for use in food or medicine.
Abu−Nasr、 A、 N、他、J、 Am、 O
il Chemist。Abu-Nasr, A. N., et al., J. Am, O.
il Chemist.
Soc、、 31.41〜45(1945)は、次のこ
とを開示している:尿素コンプレックス沈澱及びそれに
続いて行うクロマトグラフィ分離による予備濃縮処理を
行うことによって、タラの肝油酸を出発原料としてメチ
ル エイコサペンタエノエート(methyleico
sapentaenoate)及びエチル ドコサヘキ
サエノエート(ethyl docosahexaen
oate)を分離すること、を開示している。この技術
では充分に高い純度が得られないし、クロマト分離には
大量の溶媒が必要であって望ましくない。Soc., 31.41-45 (1945) discloses that methyl Eicosapentaenoate (methyleico
sapentaenoate) and ethyl docosahexaenoate
oate). This technique does not provide sufficiently high purity, and chromatographic separation requires large amounts of solvent, which is undesirable.
Te5hinia、 S、他、Bulletin of
the Ja aneseSociet of 5
cientific Fisheries、 44(8
)、 927(1978)には、ヤリイカ肝油を原料と
し、これをエタノール性水酸化カリウムでケン化し、エ
ーテルで脂肪酸を抽出し、そしてメチル化することによ
って、EPA及びDHAを単離する方法が記載されてい
る。粗製の脂肪酸メチルエステルは、シリカゲル60
(Silica Gel 60)上でのカラムクロマト
グラフィーによって精製し、次いで、硝酸銀とシリカゲ
ルとの混合物上でのカラムクロマトグラフィーによって
EPAをDHAから分離する。この技術の問題点は、最
終製品中に痕跡量の銀がしばしば残存することであり、
これは、ヒトが消費する食品又は医薬品において極めて
有害なものなのである。更にまた、カラムクロマトグラ
フィーを行うためには、非常に大量の溶媒が必要である
。Te5hinia, S, et al., Bulletin of
the Japanese Society of 5
scientific Fisheries, 44(8
), 927 (1978) describes a method for isolating EPA and DHA using squid liver oil as a raw material, saponifying it with ethanolic potassium hydroxide, extracting fatty acids with ether, and methylating it. has been done. Crude fatty acid methyl ester is silica gel 60
EPA is purified from DHA by column chromatography on (Silica Gel 60) and then column chromatography on a mixture of silver nitrate and silica gel. The problem with this technology is that trace amounts of silver often remain in the final product;
This is extremely harmful in food or medicine for human consumption. Furthermore, very large amounts of solvent are required to perform column chromatography.
ある程度までEPAを分離、精製するためにカラムクロ
マトグラフィーを使用する点についての開示は、上記の
ほか、日本の時開56−115736号、及びソ連特許
第973,128号において記述されている。Disclosures regarding the use of column chromatography to separate and purify EPA to some extent are described above as well as in Japanese Jikai No. 56-115736 and USSR Patent No. 973,128.
高純度EPAを得るための他の従来法は、英国特許公報
第2,148,713号に開示されている。この公報に
は次の方法が記載されている:脂肪酸混合物中における
不飽和脂肪酸の二重結合をヨウ素化し1次いでヨウ素化
されたオイルをケン化し、ケン化混合物から脂肪酸を抽
出し、ヨウ素化された脂肪酸をメチル化し、カラムクロ
マトグラフィーによって脂肪酸を分離し、次いで、希望
するフラクションを脱ヨウ素する方法が記載されている
。Another conventional method for obtaining high purity EPA is disclosed in British Patent Publication No. 2,148,713. This publication describes the following method: iodizing the double bonds of unsaturated fatty acids in a fatty acid mixture, then saponifying the iodinated oil, extracting the fatty acids from the saponified mixture, and A method is described for methylating the fatty acids obtained, separating the fatty acids by column chromatography, and then deiodinating the desired fraction.
この方法によれば最後に行う(eventual)カラ
ムクロマトグラフィーにおいて、脂肪酸の卓越したレゾ
リュージョン(resolution)が可能となり、
そして、処理期間中に脂肪酸を酸化から保護することが
できるのである。タラ肝油のような天然のEPA源から
EPAを分離するためにこの方法を利用すれば、収率9
0%以上(over 90%)及び純度96〜100%
が得られる。しかしながら、この方法の工程中に実質量
のシス−トランス転化(conversion)が生じ
ること、そしてその結果、得られた96〜bEPAとは
限らないこと、が判明した。更にまた、ヨウ素はGRA
S材料リストには載っていないのである。This method enables excellent resolution of fatty acids in the final (eventual) column chromatography,
The fatty acids can then be protected from oxidation during the treatment period. Using this method to separate EPA from natural EPA sources such as cod liver oil, yields of 9.
0% or more (over 90%) and purity 96-100%
is obtained. However, it has been found that a substantial amount of cis-trans conversion occurs during the steps of this process, and that the resulting 96-bEPA is not always the same. Furthermore, iodine is GRA
It is not included in the S material list.
脂肪酸一般に関して、各種の分離技術がもちいられてき
た。これら既知の技術には、尿素コンプレックスによる
分離及び低温分別結晶による分離がある。Various separation techniques have been used for fatty acids in general. These known techniques include separation by urea complexes and separation by cryogenic fractional crystallization.
尿素を用いる分離技術には、結晶包接化合物の形成が包
含される。これは、アダクツ(adducts)又はコ
ンプレックス(coIlρlex )とも呼ばれるもの
であって、尿素と各種の直鎖有機化合物との間で形成さ
れるものである。包接化合物は2以上の化合物が結合し
たものであって、該化合物の内の1方が、他方の化合物
の結晶骨格構造のなかに包含されているものである。包
接化合物の各成分は、それぞれ分離して存在しうるもの
であるが、化学的な結合方法ははっきりしていないもの
である。Separation techniques using urea include the formation of crystalline clathrates. This is also called an adduct or a complex (coIlρlex), which is formed between urea and various linear organic compounds. An inclusion compound is a combination of two or more compounds, one of which is included in the crystal skeleton structure of the other compound. Each component of an clathrate compound can exist separately, but the chemical bonding method is unclear.
これら各成分は、二次原子価力(secondaryv
alence force)と水素結合とによって相互
に保持されているのである。しかしながら、包接化合物
は、通常の水素−結合システムとは相違するものである
。その理由は、前者においては、″ホスト(host)
”と“ゲスト(guest)”分子のサイズと形状とが
臨界的に重要であるのに対して、後者においてはそれら
はほとんどないし全く何の役割も果たすものではないか
らである。Each of these components has a secondary valence force (secondary valence force).
They are mutually held together by force (alence force) and hydrogen bonds. However, clathrates are different from normal hydrogen-bonding systems. The reason is that in the former case, "host"
” and the size and shape of the “guest” molecules are of critical importance, whereas in the latter they play little or no role.
長鎖脂肪酸の飽和度が高くなればなるほど、尿素コンプ
レックスの生成がより容易になることは既知である。し
たがって、尿素で処理することによって、飽和した化合
物及びほとんどの七ノー不飽和化合物をポリ不飽和化合
物から分離することができることになる。この尿素コン
プレックスによる分離技術は、次の文献に詳述されてい
る:Production and Uses Jに1
are S、 Markley編、パート3.2309
〜2358ページ、インターサイエンスバブリッシャー
ズ(Interscience Publishers
)。It is known that the higher the degree of saturation of long chain fatty acids, the easier it is to form urea complexes. Therefore, by treatment with urea, it will be possible to separate saturated compounds and most heptano-unsaturated compounds from polyunsaturated compounds. This urea complex separation technique is detailed in the following literature: Production and Uses J.
are S, Markley, part 3.2309
~2358 pages, Interscience Publishers
).
ニューヨーク、1964、におけるSwern、 D、
“分離技術:E、尿素コンプレックス(Techn
iques ofSeparation : E、 U
rea Complexes)”の項Oここのおいては
、これらのページに記載されたすべての内容を参照文献
として扱うことにする。Swern, D., New York, 1964.
“Separation technology: E, urea complex (Techn
Iques of Separation: E, U
For the purposes of this section, all contents described on these pages will be treated as references.
低温分別蒸留は、脂肪酸とモノエステル類の分離のため
に使われてきたし、また同じく天然油脂のグリセライド
と他のリピッド物質の分離のためにも使われてきた。こ
の技術は、脂肪酸を溶媒中に溶解し次いで温度を低下せ
しめて各種脂肪酸を溶媒から結晶せしめる工程を包含す
るものである。Low-temperature fractional distillation has been used for the separation of fatty acids and monoesters, as well as for the separation of glycerides and other lipid substances in natural fats and oils. This technique involves dissolving fatty acids in a solvent and then lowering the temperature to crystallize the various fatty acids from the solvent.
しばしば、零下(sub−zero) (’C)の温度
が使用される。しかしながら、この技術には多くの制約
が存する。多数の脂肪酸の混合物を分離する際、高純度
のものを得ることが難しく、そしてまた各種酸の相互溶
解(mutual 5olubility)の問題も存
する。Often sub-zero ('C) temperatures are used. However, this technology has many limitations. When separating a mixture of a large number of fatty acids, it is difficult to obtain high purity, and there is also the problem of mutual solubility of various acids.
この技術及び低温結晶の制約については、上に引用した
Markleyの本の2081〜2123ページにおけ
る。This technique and the limitations of low temperature crystals are discussed in the Markley book cited above, pages 2081-2123.
Markley、 K、 S、、 ”分離技術:A、
蒸留、塩溶鮮度、低温結晶(Techniques o
f 5eparation : A。Markley, K. S., “Separation Techniques: A.
Distillation, salt freshness, low temperature crystallization (Techniques o
f5eparation: A.
Distjllation、 Sal、t 5olub
ility、 Low−Tempera−ture C
rystallization)”に詳しく記述されて
いる。Distjllation, Sal, t 5olub
ility, Low-Tempera-ture C
rystalization)”.
ここにおいては、これらの個所に記載されたすべての内
容を参照文献として扱うことにする。Here, all contents described in these sections will be treated as reference documents.
Pr1vett、 0.5.他、J、 Am、 Oil
Chemist、 Soc、。Pr1vett, 0.5. et al., J., Am., Oil
Chemist, Soc.
36、443〜449(1959)には、低温結晶と尿
素コンプレックスとの結合を包含する技術が記載されて
いる。ブタ肝臓リピッドの分析では、先ずはじめに低温
分画を用いて2つのフラクションを得、そして、濾液を
尿素包接化合物を経てメタノールからの分画処理に付し
た。各フラクション及び濾液は、それぞれエステル化し
蒸留し、そして各種の留出物を分析した。Swern、
D、他、J、 Am、 Oil Cheo+ist。36, 443-449 (1959) describes a technique involving the combination of low temperature crystals and urea complexes. For the analysis of pig liver lipids, two fractions were first obtained using cryofractionation, and the filtrate was subjected to fractionation from methanol via the urea clathrate. Each fraction and filtrate was individually esterified and distilled, and the various distillates were analyzed. Swern,
D, et al., J. Am, Oil Cheo+ist.
鉢虹、 29.614〜615(1952)は、オリー
ブ油から尿素コンプレックスを沈澱せしめて飽和化合物
と七ノー不飽和化合物を分離し、次いで、尿素コンプレ
ックスから単離した酸又はエステルを低温結晶処理し、
そして分別蒸留してオレイン酸を97〜99%の純度で
製造すること、が開示されている。Hachihong, 29.614-615 (1952), precipitates a urea complex from olive oil to separate saturated compounds and unsaturated compounds, and then subjects the acid or ester isolated from the urea complex to a low-temperature crystallization process.
It is disclosed that oleic acid is produced with a purity of 97 to 99% by fractional distillation.
Swern、 D、他、J、 Am、 Oil Che
mist、 Sac、、 29゜431〜434(19
52)及び米国特許第2,838,480号では、先ず
はじめに0℃において90%メタノールから結晶化する
ことによって飽和酸を分離し、次いで濾液に尿素を加え
てオレイン酸のアダクトを室温で沈澱せしめることによ
って、獣脂、脂(grease)又はレッドオイル(r
ed oil)からオレイン酸を単離している。Swern, D. et al., J. Am., Oil Che.
mist, Sac,, 29°431-434 (19
52) and US Pat. No. 2,838,480, the saturated acid is first separated by crystallization from 90% methanol at 0° C. and then urea is added to the filtrate to precipitate the oleic acid adduct at room temperature. Possibly tallow, grease or red oil (r.
ed oil).
しかしながら、一般的に安全であるとして認められてお
り且つ工業的な方法に使用することのできる材料のみを
用いて、しかもシス−トランス転化をひき起すことなく
、海産動物油からEPA及びD11Aを実質的に100
%の純度で分離するための方法について、これを示唆す
るような従来技術は全くない。また、天然源から他の特
定のポリ不飽和脂肪酸を非常に高い純度で分離する方法
も、当技術分野において長い間求められていたものであ
る。However, it is possible to substantially remove EPA and D11A from marine animal oils using only materials that are generally recognized as safe and can be used in industrial processes, and without causing cis-trans conversion. 100 to
% purity, there is no prior art that suggests this. There has also been a long-standing need in the art for methods of separating certain other polyunsaturated fatty acids from natural sources with very high purity.
l肌殴叉斡
したがって5本発明の目的は、先行技術の問題点を解決
することである。Therefore, it is an object of the present invention to solve the problems of the prior art.
更にまた本発明の目的は、EPA、 DHA及びそれら
のエステルといった希望するポリ不飽和脂肪酸を、減成
せしめること(degradation)なく、分離精
製する方法を提供することである。A further object of the present invention is to provide a method for separating and purifying desired polyunsaturated fatty acids such as EPA, DHA and their esters without degradation.
本発明の別の目的は、海産動物油又は他の天然源から、
EPA及びDNAの混合物又は他の希望するポリ不飽和
脂肪酸を抽出する方法であって、市販の環境のもとて容
易に得ることのできる温度で、減成ないしはシス−トラ
ンス転化を生じることなく、しかも高収車高純度で抽出
する方法を提供することである。Another object of the invention is that from marine animal oil or other natural sources,
A method for extracting mixtures of EPA and DNA or other desired polyunsaturated fatty acids at temperatures readily obtainable under commercial conditions without degradation or cis-trans conversion. Moreover, the objective is to provide a method for extraction with high yield and high purity.
これらの目的及び他の目的は、本発明にしたがって以下
の操作を行うことによって達成される:先ずはじめに、
酵素リパーゼを用いるといった温和な条件下でオイル起
源のトリグリセライドを加水分解し;有機溶媒で洗うこ
とによって非ケン化物を分離し;尿素で処理することに
よって、飽和脂肪酸及びモノ−不飽和脂肪酸との尿素コ
ンプレックスを生成゛せしめ、以ってこれら飽和及びモ
ノ−不飽和脂肪酸を除去し:残渣をアセトンが好適であ
るが有機溶媒中に溶解し;ゆっくり冷却し;そして固体
化した物質を生成するにしたがって分画除去するりこと
により上記目的が達成されるのである。好適な実施例で
は、各々の沈澱を生成せしめそしてこれを除去した後、
溶媒部分を蒸発し次いで冷却する工程をくり返して、溶
液中における脂肪酸濃度を高めることによって、純粋な
脂肪酸を完全に沈澱せしめるために行う極低温処理が避
けられる。このようにして、工業的な方法としてはより
望ましくないところの極低温を用いることなく、実質的
にこれと同一の収率及び純度を得ることができるのであ
る。These and other objects are achieved in accordance with the present invention by performing the following operations: First,
Hydrolyze oil-derived triglycerides under mild conditions, such as using the enzyme lipase; separate unsaponifiables by washing with an organic solvent; and separate urea from saturated and mono-unsaturated fatty acids by treatment with urea. to form a complex, thereby removing these saturated and mono-unsaturated fatty acids; dissolve the residue in an organic solvent, preferably acetone; cool slowly; and as the solidified material forms, The above objective is achieved by removing the fraction. In a preferred embodiment, after forming and removing each precipitate,
By repeating the steps of evaporating and then cooling the solvent portion to increase the fatty acid concentration in the solution, the cryogenic treatment required to completely precipitate the pure fatty acids is avoided. In this way, virtually the same yield and purity can be obtained without the use of cryogenic temperatures, which are less desirable in industrial processes.
更にまた、この技術は、例えば亜麻仁油からシス−リノ
ール酸及びα−リルン酸を分離するというように、天然
の起源から前記以外のポリ不飽和脂肪酸を分離精製する
のにもうまく利用することができる。Furthermore, this technique can also be successfully used to separate and purify other polyunsaturated fatty acids from natural sources, such as separating cis-linoleic acid and α-linolenic acid from flaxseed oil. can.
好 な 施 についての な 四
本発明の好適な実施例は、実質的にシス−トランス転化
を生じることなく実質的に100%純粋なEPA及びD
11Aを分離することに関するものであるけれども1本
発明の方法は、天然起源から他の高度に不飽和化された
脂肪酸を分離精製するのにも適用することができる。以
下に行う記述は多くは、海生動物油から純粋なEPA及
びD11Aを分離する点に向けられてはいるが、他の天
然起源から上記とは別の高度にポリ不飽和化された脂肪
酸の分離にも。Preferred embodiments of the present invention provide substantially 100% pure EPA and D without substantially cis-trans conversion.
Although directed to the separation of 11A, the method of the present invention can also be applied to separate and purify other highly unsaturated fatty acids from natural sources. Although much of the description that follows is directed to the isolation of pure EPA and D11A from marine animal oils, the isolation of other highly polyunsaturated fatty acids from other natural sources Also.
同じ技術が使用できることを、充分に理解しておくべき
である。It should be fully understood that the same technology can be used.
本発明の基本的特徴は、処理の全工程に亘って極端な条
件をすべて回避した点、及び、尿素処理と低温分別結晶
とを結合した点にあり、これによって、予期せざること
に、実質的にシス−トランス転化を生じることなく実質
的に純粋なEPA及びDNAを製造するものである。The essential features of the present invention are the avoidance of all extreme conditions throughout the process and the combination of urea treatment with cryogenic fractionation crystallization, which unexpectedly results in substantially This method produces substantially pure EPA and DNA without any cis-trans conversion.
本発明によってEPA及びD11Aを分離するところの
オイルは、脂肪酸のいかなる実質的変成低下も生じる前
に分離を行うよう、出来る限り新鮮であることが好まし
い。EPA及びD11Aを高レベルに含有し本発明にお
いて使用するのに適した天然の油脂には、例えば次のよ
うなものが含まれる:サバ、イワシ、カマス(n+ac
kerel pike)、ニシン等青みの魚といった海
産動物の油脂;タラ肝油;及びオキアミや各種のエビ様
カイアシ類といった海産の動物性プランクトンの油脂。The oil from which EPA and D11A are separated according to the present invention is preferably as fresh as possible so that the separation occurs before any substantial denaturation of the fatty acids occurs. Natural fats and oils containing high levels of EPA and D11A and suitable for use in the present invention include, for example: mackerel, sardines, barracuda (n+ac
kerel pike), herring and other bluish fish; cod liver oil; and marine zooplankton oils such as krill and various shrimp-like copepods.
しかしながら、本発明においてはその他いかなるEPA
及びDHAIも使用できることを理解すべきである。魚
類源は、できる限り冷たい環境から得るのが好ましい。However, in the present invention, any other EPA
It should be understood that and DHAI can also be used. Preferably, the fish source is obtained from an environment that is as cold as possible.
エイコサテ1−ラエン酸がEPAに転化するのを触媒す
るところの酵素であるΔ5−デサチュラーゼ(desa
turase)は、最適のM未活性が90℃で生じるの
である。したがって、冷たい環境からの魚は、暖氷魚よ
りもEPA含量が高いのである。Δ5-desaturase, the enzyme that catalyzes the conversion of eicosate 1-laenoic acid to EPA
turase), optimal M inactivation occurs at 90°C. Therefore, fish from cold environments have higher EPA content than warm ice fish.
また、魚を制御された環境のもとて飼養すると、更にE
PA収率を高めることすら可能となる。α−リルン酸(
a −11nolenic acid)に富んだ餌料を
魚に与えそして塩水中に9℃に維持しておくと、最上の
EPA量が得られよう。Additionally, if the fish are kept in a controlled environment, they can produce even more
It even becomes possible to increase the PA yield. α-Lilunic acid (
The best EPA levels will be obtained if the fish are fed a diet rich in a-11 nolenic acid and maintained in salt water at 9°C.
天然油脂は、ケン化又はアルコール分解(alcoho
lysis) L/て、トリグリセライドを遊離の脂
肪酸又は脂肪酸のエステルに転換する。しかしながら、
高温及び強塩基性試薬は過酸化及びシス−トランス転化
(conversion)を起し得るので、これらを回
避するように方法を選ばなければならない。Natural fats and oils can be saponified or alcohololyzed.
lysis) to convert triglycerides into free fatty acids or esters of fatty acids. however,
High temperatures and strongly basic reagents can cause peroxidation and cis-trans conversion, and methods must be chosen to avoid these.
好適な加水分解法は、酵素リパーゼを温度35〜40℃
及びp116〜7で使用する酵素加水分解である。A preferred hydrolysis method involves using the enzyme lipase at a temperature of 35-40°C.
and enzymatic hydrolysis used in p116-7.
リパーゼは、常法にしたがい、システィンまたはアスコ
ルビン酸を痕跡量用いて賦活しなければならない。ケン
化するのにリパーゼを用いることによる他の利点は、リ
パーゼ酵素は、立体特異性を有するために、トリグリセ
ライドから自然に生成しうるところのトランス−脂肪酸
を全熱分解する(clsave)ことがない点である。Lipase must be activated using trace amounts of cysteine or ascorbic acid according to conventional methods. Another advantage of using lipases for saponification is that, because of their stereospecificity, lipase enzymes do not clsave trans-fatty acids that can be naturally produced from triglycerides. It is a point.
したがって、出発物質中にたとえトランス−EPA又は
DI!Aがあったとしても、これらのものは、非ケン化
物と一緒に除去されて最終製品中に存在することはなく
なることになる。Therefore, even if there is trans-EPA or DI in the starting material! Even if A were present, they would be removed together with the non-saponifiable substances and would no longer be present in the final product.
天然油脂を加水分解するための代替法としては、リパー
ゼまたは強塩基を用いてこれらの油脂を部分的に加水分
解する方法がある。リパーゼを用いる場合には、通常の
ように加水分解を6時間行うよりはむしろ1172〜2
時間の加水分解によって、EPA源を更に富化すること
ができる。その理由は、リパーゼが、処理されたトリグ
リセライドの第1の分枝部分(branch)と第3の
分枝部分を優先して除去するからである。天然トリグリ
セライドにおいて、まん中の分枝部分に(らべて外側の
分枝部分の方がはるかに飽和鎖が多いことは、既に知ら
れていることである。したがって、加水分解の量を制限
すれば、更なる飽和酸の実質量を自動的に除去できるの
である。Alternative methods for hydrolyzing natural fats and oils include partially hydrolyzing these fats and oils using lipases or strong bases. When using lipase, rather than carrying out hydrolysis for 6 hours as usual, 1172-2
By time hydrolysis, the EPA source can be further enriched. This is because lipase preferentially removes the first and third branches of the processed triglycerides. It is already known that in natural triglycerides, there are far more saturated chains in the outer branch than in the middle branch. Therefore, if the amount of hydrolysis is limited, , a substantial amount of further saturated acid can be automatically removed.
天然油脂の部分加水分解には、水酸化カリウムも使用す
ることができる。オイル源を水酸化カリウムで約15〜
20分処理し、トリグリセライドを部分的に加水分解す
るのである。リパーゼの場合のように、この部分的加水
分解によって、トリグリセライドからより富化されたE
PA源が得られる。Potassium hydroxide can also be used for partial hydrolysis of natural fats and oils. The oil source is potassium hydroxide, about 15~
It is treated for 20 minutes to partially hydrolyze triglycerides. As in the case of lipases, this partial hydrolysis produces more enriched E from triglycerides.
A PA source is obtained.
その理由は、トリグリセライドの第1と第3の分枝部分
が該塩基によって優先的に作用を受けるからである。The reason is that the first and third branched portions of the triglyceride are preferentially affected by the base.
部分加水分解後、硫酸、又は、硝酸若しくは塩酸といっ
た強鉱酸を氷解混合物に添加して、脂肪酸混合物を分離
する。脂肪酸混合物は上部に浮遊するので、下部の水相
は排棄する。After partial hydrolysis, sulfuric acid or a strong mineral acid such as nitric acid or hydrochloric acid is added to the ice melting mixture to separate the fatty acid mixture. The fatty acid mixture floats to the top and the bottom aqueous phase is discarded.
また、この加水分解工程は、トリグリセライド源の如何
にかかわらず、他のポリ不飽和体をそれらのトリグリセ
リドから分離するのを増進するのにも有用である。This hydrolysis step is also useful to enhance the separation of other polyunsaturates from triglycerides, regardless of their source.
遊離の脂肪酸は、また、エステル交換法によってもそれ
らの天然源から分離することができる。Free fatty acids can also be separated from their natural sources by transesterification methods.
脂肪酸含有材料(海産動物油、亜麻仁油、大豆油等)を
、乾燥エタノール又は乾燥メタノール及び痕跡量の金属
ナトリウムとともに還流する。これによって遊離脂肪酸
のメチルまたはエチルエステルがそれぞれ生成し、トリ
グリセリド分子から遊離してくる。この方法は、アルカ
リ加水分解よりもより温和な条件を実質的に包含するも
のであって、過酷な条件による反応混合物の黒化を防止
するものである。これらのエステルは、標準的加水分解
技術によって、抽出工程のいかなる過程においても自由
に遊離の脂肪酸に変換することができる。目的によって
は、遊離体の酸に転換することなく、これらのエステル
類を直接用いる方が好ましいこともある。A fatty acid containing material (marine animal oil, linseed oil, soybean oil, etc.) is refluxed with dry ethanol or dry methanol and traces of metallic sodium. This produces methyl or ethyl esters of free fatty acids, respectively, which are liberated from triglyceride molecules. This method involves substantially milder conditions than alkaline hydrolysis and prevents blackening of the reaction mixture due to harsh conditions. These esters can be freely converted to free fatty acids during any part of the extraction process by standard hydrolysis techniques. Depending on the purpose, it may be preferable to use these esters directly without conversion to the free acid.
次の工程では、有機溶媒で洗浄することにより、コレス
テロール、ビタミンA、D及び炭化水素類といった非ケ
ン化物質を除去する。この目的のためには、石油エーテ
ル、メチレンクロライド、エチルエーテル等すべての有
機溶媒が使用できる。In the next step, unsaponifiable substances such as cholesterol, vitamins A and D, and hydrocarbons are removed by washing with an organic solvent. All organic solvents can be used for this purpose, such as petroleum ether, methylene chloride, ethyl ether.
有機相を除去した後、水相を酸性化する。この酸性化工
程のためにはすべての酸が使用できるが。After removing the organic phase, the aqueous phase is acidified. Although any acid can be used for this acidification step.
薬学的に許容できる酸の方が好ましい。この処理によっ
て遊離の脂肪酸が分離している有機相の方へ分離してい
くことになろう。そこで、水相を廃棄する。塩化ナトリ
ウムまたはその他の塩類を少量加えると、この分離が高
められる。Pharmaceutically acceptable acids are preferred. This treatment will result in the separation of free fatty acids into the separate organic phase. The aqueous phase is then discarded. Adding small amounts of sodium chloride or other salts enhances this separation.
次に、飽和脂肪酸及びモノ−不飽和脂肪酸を除去するた
め、脂肪酸混合物を尿素処理する。この尿素処理におい
て、尿素と脂肪酸の双方をその中に容易に溶解すること
のできる極性有機溶媒に、尿素を添加する。実施可能な
溶媒の例としては、メタノール、エタノール、イソプロ
パノール、石油エーテル、ベンゼン、トリクロルエチレ
ン、及びメチルイソブチルケトンが包含される。母性の
問題が回避できるため、エタノールを用いるのが好適で
ある。必要あれば加熱しながら溶媒に尿素を溶かして、
通常は尿素を10〜20%含有する尿素溶液を得る。尿
素溶液と脂肪酸混合物とを混合する。脂肪酸混合物を尿
素溶液に添加する場合、はじめに脂肪酸混合物を別途有
機溶媒で希釈して、脂肪酸を尿素溶液の高温からある程
度保護するようにするのが好ましい。遊離脂肪酸は、石
油エーテル、または、アセトン、エタノールもしくはメ
タノールといった極性溶媒中に溶かしてもよい。The fatty acid mixture is then treated with urea to remove saturated and mono-unsaturated fatty acids. In this urea treatment, urea is added to a polar organic solvent in which both urea and fatty acids can be easily dissolved. Examples of workable solvents include methanol, ethanol, isopropanol, petroleum ether, benzene, trichlorethylene, and methyl isobutyl ketone. It is preferable to use ethanol, since maternal problems can be avoided. If necessary, dissolve urea in the solvent while heating.
A urea solution containing usually 10-20% urea is obtained. Mix the urea solution and fatty acid mixture. When adding the fatty acid mixture to the urea solution, it is preferred to first dilute the fatty acid mixture separately with an organic solvent to provide some protection of the fatty acids from the high temperatures of the urea solution. Free fatty acids may be dissolved in petroleum ether or polar solvents such as acetone, ethanol or methanol.
尿素溶液の量は、脂肪酸混合物1重量部当り、少なくと
も0.5重量部、好ましくは1〜4重量部に調節する。The amount of urea solution is adjusted to at least 0.5 parts by weight, preferably from 1 to 4 parts by weight, per part by weight of the fatty acid mixture.
尿素溶液は、脂肪酸と均一に混合する。The urea solution is homogeneously mixed with the fatty acids.
そこで、好ましくは尿素処理した溶液を冷却することに
よって、尿素を沈澱せしめる。この時点で、脂肪酸混合
物中の飽和脂肪酸及び非飽和脂肪酸が、尿素結晶とコン
プレックスを形成し、晶出することになろう。希望する
のであれば、該溶液を長い間装置することによって、冷
却処理を実施してもよい。また5例えばウォーターバス
を用いて強制的に該溶液を冷却してもよい。該溶液を高
々50℃、好ましくは30〜40℃に冷却すると、良い
結果が得られるであろう。更に尿素の除去率を高めよう
とするのであれば、更に該溶液を冷蔵庫内で約−10℃
に冷却すればよい。Therefore, the urea is preferably precipitated by cooling the urea-treated solution. At this point, the saturated and unsaturated fatty acids in the fatty acid mixture will form a complex with the urea crystals and crystallize out. If desired, a cooling process may be carried out by storing the solution for an extended period of time. Alternatively, the solution may be forcibly cooled using, for example, a water bath. Good results will be obtained if the solution is cooled to at most 50°C, preferably 30-40°C. If you want to further increase the urea removal rate, store the solution at about -10°C in the refrigerator.
It should be cooled to
そこで、尿素と飽和及びモノ−不飽和脂肪酸とのコンプ
レックスは、これを濾去ないしは他の方法で除去する。The complex between urea and saturated and mono-unsaturated fatty acids is then filtered off or removed by other methods.
このようにして得た濾液は、例えばエバポレータで濃縮
して、溶媒の大部分を除去し、次いで、5%塩酸を用い
て、残りの尿素のすべてを脂肪酸混合物から洗滌する。The filtrate thus obtained is concentrated, for example in an evaporator, to remove most of the solvent, and then all remaining urea is washed from the fatty acid mixture using 5% hydrochloric acid.
また、溶媒1部に対して10部の水を用いて水抽出を行
い、溶媒を除去してもよい。Alternatively, the solvent may be removed by performing water extraction using 10 parts of water per 1 part of the solvent.
このようにして残った脂肪酸混合物は、高度不飽和脂肪
酸の実質的に純粋な結合体である。次のことが発見され
た:はじめに脂肪酸をアセトン等の有機溶媒に溶かし2
次いで目的とする個々の脂肪酸が溶液から固体化してく
るまでゆっくりと冷却することによって、非常に簡単に
して正確な方法でこれら個々の脂肪酸を完全に分離でき
ることが判ったのである。溶液をゆっくりと冷却してい
くと、溶液中における個々の溶解度にしたがって、各種
の脂肪酸が沈澱してくるのである。これらの脂肪酸の各
々がそれぞれ沈澱してくるので、それを溶液から分離す
るのである。各種の脂肪酸には。The fatty acid mixture thus remaining is a substantially pure conjugate of highly unsaturated fatty acids. The following was discovered: First, fatty acids were dissolved in an organic solvent such as acetone2.
It has been found that by then slowly cooling the individual fatty acids of interest until they solidify from solution, it is possible to completely separate the individual fatty acids in a very simple and accurate manner. As the solution is slowly cooled, various fatty acids precipitate out, depending on their individual solubility in the solution. Each of these fatty acids precipitates and is separated from the solution. For various fatty acids.
溶液中の脂肪酸濃度に応じてそれらが溶液から沈澱して
くる特定のポイン1−がそれぞれ存する。例えば、DN
Aは、約−38〜−40℃で10%アセトン溶液から沈
澱してくることが判った。EPAは約−60℃で沈澱し
てくる。他の脂肪酸は、そのほとんどが−30℃以上(
above)の温度で沈澱する。Depending on the concentration of fatty acids in solution, there are specific points at which they precipitate out of solution. For example, D.N.
A was found to precipitate from a 10% acetone solution at about -38 to -40°C. EPA precipitates at about -60°C. Most of the other fatty acids are above -30℃ (
precipitation at temperatures above).
該溶液は、アセトン中冷凍二酸化炭素(ドライアイス)
浴中で冷却する。−38〜−40℃で生成する沈澱は、
実質的に温度を上げることなく焼結ガラス(sinte
red glass)又はブフナー漏斗を通して濾過す
ることによって、これを分離する。得られた結晶を分析
したところ、実質的に純粋なDHAであることが判った
; NMRで検討したところ、シス−トランス転化(c
onversoin)は認められなかった。The solution is frozen carbon dioxide (dry ice) in acetone.
Cool in bath. The precipitate formed at -38 to -40°C is
Sintered glass (sintered glass) without substantially increasing the temperature
This is separated by filtration through a red glass) or Buchner funnel. Analysis of the resulting crystals revealed that they were essentially pure DHA; NMR analysis revealed that cis-trans conversion (c
oversoin) was not observed.
約−60℃で沈澱してくる物質は、シス−トランス転化
がなく実質的に100%純粋なEPAであることが判っ
た。The material that precipitated at about -60°C was found to be essentially 100% pure EPA with no cis-trans conversion.
EPAとDHAとをそれぞれ別個に分離するのに必要な
極低温を避れるために、各々の結晶化が終った後、上澄
を少なくして脂肪酸類の溶解度を低下せしめ、実質的に
純粋なりNA及びEPAの混合物を得ることができる。To avoid the extremely low temperatures required to separate EPA and DHA separately, the supernatant is reduced after each crystallization to reduce the solubility of the fatty acids and produce substantially pure A mixture of NA and EPA can be obtained.
また、低温処理と溶媒の除去処理との結合も利用できる
。Also, a combination of low temperature treatment and solvent removal treatment can be used.
次の表は、にirk−Othmer、 lj、7エ1豆
狂(Enc clo edia of Che+5ic
al Technolo 、第3版、第4巻、827
ページ(1978)に掲載されているものであって、ア
セトン、トルエン及びn−へブタン中における各種温度
での各種脂肪酸の溶解度の差異を示したものである。The following table shows the difference between Irk-Othmer, lj, Enc clo edia of Che+5ic
al Technolo, 3rd edition, Volume 4, 827
Page (1978), which shows the differences in solubility of various fatty acids at various temperatures in acetone, toluene, and n-hebutane.
有機溶媒中における各種温度での脂肪酸の溶解度〇
18:2(9c、 12c) −5016二〇
18:O
18: 1(9t)
18 : 1(9c)
1.60
0.66
0.27
0.27
0.54
0.11
0.023
0.005
5.2
1.68
0.53
0.17
0.26
0.092
4.10
1.20
0.35
1.41
0.36
0.086
0.018
0.390
0.080
o、ois
0.003
3.12
0.06
0.28
0.86
0.20
0.056
0.30
0.08
0.02
0.005
0.080
0.018
0.004
2.25
0.66
0.19
0.05
0、19
0.06
0.019
0.98
0.20
0.042
上記の表から、温度が10%低下することによって、す
べての溶媒中ですべての脂肪酸の溶解度ファクターが約
3〜7低下することが判る。この溶解度ファクター(s
olubility factor)の故に、次の処理
によって希望する脂肪酸を抽出できることが判った:つ
まり、溶媒の量を減少せしめて溶液の1度をファクター
約2〜9 (by a factor offrom
about 2 to 9)上げ(即ち、その溶植を
もとの容積1/2〜1/9に低下せしめ)1次いで溶媒
の容積を低下せしめることなく必要とされる温度よりも
実質的に高い温度に冷却せしめることによって、希望す
る脂肪酸を抽出できることが判ったのである。Solubility of fatty acids at various temperatures in organic solvents 18:2 (9c, 12c) -50162018:O 18:1 (9t) 18:1 (9c) 1.60 0.66 0.27 0. 27 0.54 0.11 0.023 0.005 5.2 1.68 0.53 0.17 0.26 0.092 4.10 1.20 0.35 1.41 0.36 0.086 0 .018 0.390 0.080 o, ois 0.003 3.12 0.06 0.28 0.86 0.20 0.056 0.30 0.08 0.02 0.005 0.080 0.018 0.004 2.25 0.66 0.19 0.05 0, 19 0.06 0.019 0.98 0.20 0.042 From the above table, it can be seen that by decreasing the temperature by 10%, all solvent It can be seen that the solubility factors of all fatty acids are reduced by about 3 to 7. This solubility factor (s
It has been found that the desired fatty acids can be extracted by the following procedure: by reducing the amount of solvent and reducing the concentration of the solution by a factor of about 2 to 9.
about 2 to 9) raising (i.e. reducing the infusion to 1/2 to 1/9 of its original volume) 1 then a temperature substantially higher than that required without reducing the volume of the solvent; It was discovered that the desired fatty acids could be extracted by cooling the mixture.
この溶媒減少技術には、数多くの利点があり。This solvent reduction technique has a number of advantages.
特に、必要な温度を多くの市販のフリーザーによって得
ることができ、また処理方法においても特別の技術ない
し特別の装置を必要とするものではないという利点があ
る。In particular, it has the advantage that the required temperature can be obtained by many commercially available freezers, and the processing method does not require any special techniques or special equipment.
この低温分別結晶の溶媒減少法は
(solvent reduction method
)、前述した尿素処理工程の結果得られるより高度の不
飽和脂肪酸の結合体(coa+bination)を用
いることによって、完全なものとすることができる。尿
素処理工程によって得た高度不飽和脂肪酸の結合体を、
温度低下法に使用したのと同じタイプの有機溶媒中に溶
解する:例えば、これをアセトン又は石油エーテルの1
0%溶液中に置くことができるのである。約−20℃に
一夜冷却すると、残留している飽和脂肪酸と不飽和度が
低い各種の脂肪酸が、溶液から固化してくる。そこで、
沈澱を分離しそして廃棄する。This solvent reduction method for low-temperature fractionated crystallization is
), can be completed by using a more highly unsaturated fatty acid conjugate (coa+bination) obtained as a result of the urea treatment step described above. The conjugate of highly unsaturated fatty acids obtained through the urea treatment process is
Dissolve it in the same type of organic solvent used for the temperature reduction method: for example, dissolve it in acetone or petroleum ether.
It can be placed in a 0% solution. When cooled overnight to about -20°C, the remaining saturated and less unsaturated fatty acids solidify from solution. Therefore,
Separate the precipitate and discard.
次いで、もとの容積に対するある定められた量になるま
で(例えば、もとの容積の1/3) 、溶媒を蒸発又は
蒸留することによって、該溶液の容積を低下せしめてそ
の濃度を高める。このようにして得た容積が減少した溶
液を再度約−20℃に冷却すると、モノ−不飽和脂肪酸
の新しい結晶が表われてくるので、この結晶を再度濾別
する。そこで再度、この濾液の容積をもとの容積の約1
/2〜1/9フアクター減少せしめ(be reduc
ed by a factor ofabout on
e half to one n1nth)、再度−2
0℃に一夜冷却する。ここで、ジー不飽和脂肪酸(di
−unsaturated fatty acid)が
溶液から固化してくることになろう。これらの結晶を再
度濾別し廃棄する。ジー不飽和脂肪酸結晶が生成及び沈
澱するのに充分に低い温度が得られなかった場合には、
脂肪酸は分離した水相を形成するであろうから、これを
分液漏斗で除去することができる。The volume of the solution is then reduced and its concentration increased by evaporating or distilling the solvent to a predetermined amount of the original volume (eg, 1/3 of the original volume). When the volume-reduced solution thus obtained is cooled again to about -20 DEG C., new crystals of mono-unsaturated fatty acids appear, which are again filtered off. So, once again, the volume of this filtrate is about 1 of the original volume.
/2~1/9 factor reduction
ed by a factor ofabout on
e half to one n1nth), again -2
Cool to 0°C overnight. Here, di-unsaturated fatty acids (di
-unsaturated fatty acid) will solidify from solution. These crystals are filtered off again and discarded. If a temperature low enough to form and precipitate unsaturated fatty acid crystals cannot be obtained,
The fatty acids will form a separate aqueous phase, which can be removed in a separatory funnel.
望ましくない脂肪酸をすべてしかも確実に溶液から結晶
化せしめるためには、濾液を更に一30℃に冷却すれば
よい。分離相又は結晶が表われなかったら、そこで精製
工程は完結ということになる。To ensure that all undesired fatty acids crystallize from solution, the filtrate may be further cooled to -30°C. If no separated phases or crystals appear, the purification process is complete.
そこで、溶媒を蒸発せしめればよい。Therefore, the solvent may be evaporated.
残留した液体は、実質的に純粋なEPAとD11Aの結
合体(combination)から成っている。希望
するのであれば、−38〜−40℃に冷却してDHAを
沈澱せしめることによって、これら2つの成分を分離し
てもよい。しかしながら、最も実用的には、EPAとD
HAとの結合体は少なくとも個々独立の成分と同じであ
るから、これら2次分を分離する必要はない。The remaining liquid consists of a substantially pure EPA and D11A combination. If desired, these two components may be separated by cooling to -38 to -40°C to precipitate the DHA. However, most practically, EPA and D
Since the conjugate with HA is at least the same as the individual components, there is no need to separate these secondary components.
本発明法によってこのような高純度が得られるというこ
とは、まさに予期することができないことであり、とり
わけ、分別結晶法が最初に尿素処理を行わなければ実施
できないということからみると、上記のことは特に予測
を越えたものである。The fact that such high purity could be obtained by the method of the present invention was truly unexpected, especially considering that the fractional crystallization method cannot be carried out without first undergoing urea treatment. This is especially beyond expectations.
加水分解した後、そして非ケン化物を溶解する有機溶媒
を除去した後、に得られる全脂肪酸混合物を冷却すると
、脂肪酸の混合物が混合物として溶液から沈澱してくる
。全く予期せざることに次のことが発見された:飽和及
びモノ−不飽和脂肪酸を尿素法によって先ずはじめに除
去した場合に限り、EPAとD11A相互間での沈澱点
の差、及び、最も沈澱点が近い脂肪酸との沈澱点の差が
、充分に大きなものとなって、脂肪酸の混合物として沈
澱するのではなく純粋なEPA又はDHAとして沈澱す
るのである。海生動物油及び植物油中に見出される脂肪
酸は、その数も多く多様性も高いので、それから純粋な
EPA及びDHAを分離することは極めて困難であった
。この点については、上記した発明の背景の項で挙げた
各種文献で説明されているところである。尿素処理を行
い次いで低温結晶処理を行うという特定の処理の有機的
結合、しかもこの順序で処理を行うという処理順序の特
定によってのみ、シス−トランス転位を生じることなく
100%純粋なEPA及びDHAを得ることができるの
である。After hydrolysis and removal of the organic solvent that dissolves the unsaponifiables, the resulting total fatty acid mixture is cooled and a mixture of fatty acids precipitates out of solution as a mixture. Quite unexpectedly it was discovered that: the difference in precipitation points between EPA and D11A and the highest precipitation point only if the saturated and mono-unsaturated fatty acids were first removed by the urea method. The difference in precipitation point between the fatty acids and the similar fatty acids is sufficiently large that they precipitate as pure EPA or DHA rather than as a mixture of fatty acids. Due to the large number and diversity of fatty acids found in marine animal and vegetable oils, it has been extremely difficult to separate pure EPA and DHA from them. This point is explained in the various documents cited in the Background of the Invention section above. It is only through the organic combination of a specific process of urea treatment followed by low-temperature crystallization, as well as the specific treatment sequence, that 100% pure EPA and DHA can be obtained without any cis-trans rearrangement. You can get it.
このことは、従来技術での一般的知識から自明的になさ
れることではない。This is not something that is obvious from common knowledge in the prior art.
有機溶媒、これから脂肪酸を、溶液の濃度を上昇せしめ
ながら冷却又はゆっくり冷却することによって、沈澱せ
しめるものであるが、この有機溶媒としてアセトンを用
いた場合について本発明方法を記述してきたけれども、
次の点について理解すべきである。すなわち、EPA及
びDMAの比沈澱点(relativeprecipi
tation point)が、これら相互間でそして
また混合物中の他の脂肪酸との間で、純粋な沈澱が分離
し得る程度に布分離れている限りにおいて、アセトン以
外の他の有機溶媒も、上記目的のためすべて使用するこ
とができるのである。次のことが信じられている。すな
わち、溶液中における脂肪酸の濃度によるけれども、は
とんどの溶媒の場合、各種脂肪酸が沈澱する温度は。Although the method of the present invention has been described using acetone as the organic solvent, from which fatty acids are precipitated by cooling or slow cooling while increasing the concentration of the solution,
The following points should be understood: That is, the relative precipitation points of EPA and DMA
Other organic solvents other than acetone can also be used for the above purpose, as long as the tation points are sufficiently separated from each other and also from other fatty acids in the mixture that a pure precipitate can be separated. So all can be used. It is believed that: That is, the temperature at which various fatty acids precipitate in most solvents depends on the concentration of fatty acids in the solution.
使用する特定の溶媒とは無関係なのである。アセトン、
塩化メチレン、シクロヘキサン及び石油エーテルの10
%溶液からのDNAの沈澱点は、すべて、約−38〜−
40℃である。同様に、アセトン、シクロヘキサン及び
石油エーテルの10%溶液からのEPAの沈澱点は、こ
れらの溶液中でのDNA濃度によるが、約−60℃〜約
−30℃である。与えられた溶媒がこの目的のために実
施可能か実施不可能かという点については、常法にした
がって試験をすれば容易にわかることである。例えば、
トルエン及びヘプタンは実施可能ではあろうが、これら
は比較的毒性が強いので好ましくない、ということが判
る。最適な有機溶媒は、毒性が無く一般に安全であると
認識されているもの、又は、実質的な処理をすることな
く完全に除去できるもの、ということになろう。アセト
ン以外の好適な溶媒の例としては、シクロヘキサン、石
油エーテル及びメチレンクロライドが挙げられる。また
、溶質(solute)の濃度に応じて、溶媒が、沈澱
温度の全域に亘って1例えば少なくとも一70℃の温度
においてまでも液体の状態のままで残っていること。It is independent of the particular solvent used. acetone,
10 of methylene chloride, cyclohexane and petroleum ether
The precipitation points of DNA from % solutions are all about -38 to -
The temperature is 40°C. Similarly, the precipitation point of EPA from 10% solutions in acetone, cyclohexane, and petroleum ether is from about -60<0>C to about -30<0>C, depending on the concentration of DNA in these solutions. Whether a given solvent is workable or unworkable for this purpose can easily be determined by testing in accordance with conventional methods. for example,
It has been found that while toluene and heptane may be viable, they are relatively toxic and are therefore not preferred. The optimal organic solvent will be one that is non-toxic and generally recognized as safe, or one that can be completely removed without substantial treatment. Examples of suitable solvents other than acetone include cyclohexane, petroleum ether and methylene chloride. Also, depending on the concentration of the solute, the solvent remains in a liquid state over the entire precipitation temperature range, even at temperatures of 1, for example at least -70°C.
が必要である。is necessary.
本発明の容量減少実施例を実施するに際して。In implementing the capacity reduction embodiment of the present invention.
溶液を冷却する正確な温度及び正確な容量減少量は、結
合体中に存在する特定の脂肪酸に応じて違ってくること
になろう。これらのパラメーターは、当業者が並外れた
実験を行うことなく経験的に決定することができる。該
溶液は、沈澱開始温度よりも少し低い温度に冷却し、そ
して沈澱が完結するまで該温度に維持することができる
。そこで、容量減少工程を行う。大ざっばではあるが実
際に則した経験則にしたがって、各工程において、最初
の工程における容量の173に容量を減少させればよい
。しかしながら、結合体における特定の脂肪酸によるけ
れども、脂肪酸の結合体が一緒になって沈澱するようで
あれば、容量の減少が大きすぎるということが、判るで
あろう。他方、溶液の容量を低下せしめるのに適した温
度でも沈澱が生じない場合には、それは容量の減少が充
分ではないということが1判るであろう。通常の実験に
よって、希望する温度で次のフラクションの沈澱が生じ
るであろうところの容量の減少量がわかるであろう。The exact temperature at which the solution is cooled and the exact volume reduction will vary depending on the particular fatty acids present in the conjugate. These parameters can be determined empirically by one skilled in the art without undue experimentation. The solution can be cooled to a temperature slightly below the precipitation initiation temperature and maintained at that temperature until precipitation is complete. Therefore, a capacity reduction process is performed. According to a rough but practical rule of thumb, in each step the capacity should be reduced to 173 of the capacity in the first step. However, if the conjugates of fatty acids precipitate together, depending on the particular fatty acid in the conjugate, the reduction in capacity will prove to be too great. On the other hand, if precipitation does not occur at a temperature suitable for reducing the volume of the solution, it will be an indication that the volume reduction is not sufficient. Routine experimentation will determine the amount of reduction in volume at which precipitation of the next fraction will occur at the desired temperature.
本発明を以下の実施例について説明するが、本発明はこ
れらの実施例に限定されるものではない:叉庭舅上
500ccのタラ肝油を2Qの蒸留水中で激しく撹拌し
た。乳化剤として、EPAのナトリウム塩を50g加え
た。ホスフェートバッファーとアスコルビン酸とを用い
て1反応中のpHを7に維持した。ブタすい臓のリパー
ゼを該エマルジョンに対して1g添加し、そしてこのエ
マルジョンを6時間撹拌しながら40℃に維持した。The invention is illustrated by the following examples, but the invention is not limited to these examples: 500 cc of cod liver oil was vigorously stirred in 2Q of distilled water. 50 g of sodium salt of EPA was added as an emulsifier. The pH was maintained at 7 during one reaction using phosphate buffer and ascorbic acid. 1 g of porcine pancreatic lipase was added to the emulsion and the emulsion was maintained at 40° C. with stirring for 6 hours.
100ccの石油エーテルを加えて、コレステロール、
ビタミンD、ビタミンA及びその他の不純物といった非
ケン化物を除去した。充分に混合した後、水相から石油
エーテル相を分離し、この石油エーテル相を分液漏斗を
用いて除去した。Add 100cc of petroleum ether to remove cholesterol,
Unsaponifiables such as vitamin D, vitamin A and other impurities were removed. After thorough mixing, the petroleum ether phase was separated from the aqueous phase and the petroleum ether phase was removed using a separatory funnel.
水相は、5%)12So4溶液と塩化ナトリウム50g
を用いて酸性化し、有機相を塩析せしめた。水相から分
れた有機相は、遊離酸を含有しており、この有機相を分
液漏斗を用いて分離し、そして硫酸ナトリウムを用いて
乾燥せしめた。硫酸ナトリウムは濾去した。この時点で
、有機相は、約450ccとなり遊離の脂肪酸を含有し
ていた。次いでこの有機相に絶対エタノールを200c
c混合した。連続的に撹拌し70℃に加熱しながら、絶
対エタノール2Q中に800gの尿素を溶解せしめた。The aqueous phase consists of 5%) 12So4 solution and 50 g of sodium chloride.
The organic phase was salted out. The organic phase separated from the aqueous phase contained the free acid and was separated using a separatory funnel and dried using sodium sulfate. Sodium sulfate was filtered off. At this point, the organic phase was approximately 450 cc and contained free fatty acids. Then add 200 c of absolute ethanol to this organic phase.
c mixed. 800 g of urea was dissolved in absolute ethanol 2Q with continuous stirring and heating to 70°C.
そこで遊離脂肪酸のエタノール溶液にこの尿素−アルコ
ール溶液を混合せしめた。直ちに、尿素と飽和及びモノ
−不飽和脂肪酸とのコンプレックスが、生成しそして沈
澱した。液相をデカントし、そしてエバポレーターを用
いてエタノールを除去し、これを再使用するために回収
した。液相中に残留している尿素を、5%塩酸溶液で洗
滌することによって除去し1次いで蒸留水で洗った。こ
のようにして得た有機相をガスクロマトグラフィーで分
析した。その分析結果は次のとおりであった:
胤−版一筐 パーセント
16 : 1 4.818 :
1 1.518 : 2
1.220 : 5
5722 : 6 1822 :
1 17.5そこで、この有機相をア
セトンに溶かして、約10%の溶液とした。この溶液を
市販のフリーザーに入れて、ゆっくりと溶液の温度を低
下せしめた。Therefore, this urea-alcohol solution was mixed with an ethanol solution of free fatty acids. Immediately, a complex of urea and saturated and mono-unsaturated fatty acids formed and precipitated. The liquid phase was decanted and the ethanol removed using an evaporator, which was recovered for reuse. Urea remaining in the liquid phase was removed by washing with a 5% hydrochloric acid solution and then with distilled water. The organic phase thus obtained was analyzed by gas chromatography. The results of the analysis were as follows: Tane-ban Ichiba percent 16: 1 4.818:
1 1.518: 2
1.220: 5
5722: 6 1822:
1 17.5 This organic phase was then dissolved in acetone to give an approximately 10% solution. This solution was placed in a commercially available freezer and the temperature of the solution was slowly lowered.
約O〜−2℃で、最初の沈澱が生じた。この沈澱を濾去
し、実質的に純粋な24:1脂肪酸であることがわかっ
た。次の沈澱は約−5〜−8℃で生じたのでこれを濾過
回収した。この沈澱は、17:1及び16:1脂肪酸の
混合物であることがわかった。Initial precipitation occurred at about 0 to -2°C. The precipitate was filtered off and found to be essentially pure 24:1 fatty acid. A subsequent precipitate occurred at about -5 to -8°C and was collected by filtration. This precipitate was found to be a mixture of 17:1 and 16:1 fatty acids.
次の沈澱は約−12℃で生じ、これは実質的に18:2
脂肪酸であることがわかった。The next precipitation occurs at about -12°C, which is substantially 18:2
It turned out to be a fatty acid.
残留溶液は、次にドライアイス−アセトン浴中に置いて
更に冷却した。−38〜−40℃で別の沈澱が生じた。The residual solution was then placed in a dry ice-acetone bath for further cooling. Another precipitation occurred between -38 and -40°C.
ブフナー漏斗を用いて実質的に温度を上げることなく、
この沈澱を除去し、これをガスクロマトグラフィーで分
析した。この生成物は100%D11Aであることが判
った。用いたガスクロマ1−グラフィー装置は精度o、
oot%であり、不純物は認められなかった。また、こ
のサンプルをNMRでも分析したが、シス−トランス転
化が生じてないことも判った。この生成物は100%す
べて−シスD11Aであった。 NMR研究の結果、ト
ランス−立体配置(configuration)に対
応するピークは認められなかった。without substantially increasing the temperature using a Buchner funnel.
This precipitate was removed and analyzed by gas chromatography. This product was found to be 100% D11A. The accuracy of the gas chromatography device used was o,
oot%, and no impurities were observed. This sample was also analyzed by NMR, and it was found that no cis-trans conversion occurred. The product was 100% all-cis D11A. As a result of NMR studies, no peaks corresponding to the trans-configuration were observed.
残留溶液の温度をひき続き低下せしめた6約=60℃で
、別の沈澱が生じた。上述したDHAの場合と同じ方法
で分離したところ、この沈澱は100%純粋な[EPA
であることが判った。NMR研究の結果。As the temperature of the residual solution continued to decrease to about 60 DEG C., another precipitation occurred. Separated in the same manner as described above for DHA, this precipitate was 100% pure [EPA
It turned out to be. Results of NMR study.
それこそトランス−立体配置は一切認められなかった・
EPAの収率は、出発原料であるタラ肝油に対し約15
%であり、DNAの収率はもとのタラ肝油に対し約9%
であった。Indeed, no trans-configuration was observed.The yield of EPA was approximately 15% compared to the starting material, cod liver oil.
%, and the DNA yield is approximately 9% of the original cod liver oil.
Met.
実施17−
比較のために、尿素処理を除き他は上記した処理と同じ
処理をくり返した。上記実施例1とすべて同じ方法によ
って、タラ肝油500ccをリパーゼで処理し、そして
非ケン化物(non−saponifiablemat
erial)を除去し、次に水相を酸性化して有機相を
塩析し、これを回収した。この有機相は遊離脂肪酸を含
有しているので、次いで有機相をアセトンに溶かして1
0%溶液を調製した。この溶液を市販のフリーザに入れ
て、溶液温をゆっくりと低下せしめた。約+20℃で沈
澱が始った。この沈澱は、温度が約−15℃に低下する
まで連続して生じた。この沈澱を濾去し、そして脂肪酸
の混合物であることを認めた。濾液を更に冷却したが、
−70℃までは更に沈澱が生じることはなかった。アセ
1〜ンを蒸発せしめた後でさえも、残渣は残らなかった
。このように、最初に尿素処理をしなければ、脂肪酸の
分解(resolution)は不可能なのである。Run 17 - For comparison, the same process as described above was repeated except for the urea treatment. By all the same methods as in Example 1 above, 500 cc of cod liver oil was treated with lipase and non-saponifiable
erial) was removed, the aqueous phase was then acidified and the organic phase was salted out and collected. Since this organic phase contains free fatty acids, the organic phase is then dissolved in acetone and
A 0% solution was prepared. This solution was placed in a commercially available freezer and the temperature of the solution was slowly lowered. Precipitation started at about +20°C. This precipitation occurred continuously until the temperature dropped to about -15°C. The precipitate was filtered off and found to be a mixture of fatty acids. The filtrate was further cooled,
No further precipitation occurred up to -70°C. No residue remained even after the acetone was evaporated. Thus, resolution of fatty acids is not possible without first being treated with urea.
この沈澱を尿素で処理すれば、実施例1で述べた最初に
尿素処理する方法と実質的に同じ結果が得られるはずで
あるが、純粋なEPA又はDHAを分割する(reso
lve)のには役立たないであろう。これは、わずかに
、不飽和脂肪酸の残りから飽和脂肪酸とほとんどのモノ
−不飽和脂肪酸とを分離するだけであろう。Treatment of this precipitate with urea should yield substantially the same results as the initial urea treatment described in Example 1, but with the exception of resolving pure EPA or DHA.
lve). This will only slightly separate the saturated fatty acids and most mono-unsaturated fatty acids from the rest of the unsaturated fatty acids.
失意五主
分別結晶処理においては、アセトンにかえて石油エーテ
ル、シクロヘキサン、又はメチレンクロライドを用い、
実施例1の方法をくり返した。石油エーテル及びシクロ
ヘキサンを用いた場合には。In the five main fractional crystallization process, petroleum ether, cyclohexane, or methylene chloride is used instead of acetone.
The method of Example 1 was repeated. When using petroleum ether and cyclohexane.
アセトンを用いた場合と同じ結果が得られた。アセトン
を用いた場合と同じ温度で、EPA又はDNAの沈澱が
生じた。溶媒として塩化メチレンを用いた場合には、実
施例1と同様に−38〜−40℃で実質的に100%純
粋なりNAが沈澱した。しかしながら、EPAが沈澱す
る以前に、塩化メチレンの同化が始まった;したがって
、塩化メチレンは好適な溶媒ではないことになる。The same results were obtained using acetone. Precipitation of EPA or DNA occurred at the same temperature as with acetone. When methylene chloride was used as the solvent, substantially 100% pure NA was precipitated at -38 to -40°C, as in Example 1. However, assimilation of methylene chloride begins before EPA precipitates; therefore, methylene chloride is not a suitable solvent.
去】11先
生きたサケを0〜4℃で殺す。その内臓を除去し、肉を
スライスにカットする。直ちに、これらスライスの全体
に、γ−トコフェロールとアスコルビル パルミテート
(ascorbyl palmitate)のl:1混
合物をスプレーする。11. Kill the salmon at 0 to 4 degrees Celsius. Remove its internal organs and cut the meat into slices. Immediately spray all over the slices with a 1:1 mixture of γ-tocopherol and ascorbyl palmitate.
次いで、抗酸化剤をスプレーしたスライスはブレンダー
で1〜2分間混合し、そしてブレンドされた混合物は遠
心分離に移して7 、000〜10.OOOrpmで1
0〜15分間処理する。遠心分離後、油相を分離し、そ
してこれを1%塩酸水溶液と1;1の割合で混合する。The antioxidant sprayed slices were then mixed in a blender for 1-2 minutes, and the blended mixture was transferred to a centrifuge for 7,000-10 minutes. 1 at OOOrpm
Process for 0-15 minutes. After centrifugation, the oil phase is separated and mixed with 1% aqueous hydrochloric acid in a 1:1 ratio.
充分に混合した後、放置して各相を分離せしめ、そして
分液漏斗により油相を分離する。希塩酸との混合工程は
、すべてのメチルアミンを除去するために数回くり返し
、次いで、このオイルを蒸留水で洗滌しそれから分離す
るという工程を数回くり返して、残留している酸をすべ
て除去する。次いで、オイルの重量に対してγ−トコフ
ェロール0.02%及びアスコルビル パルミテート0
.02%の量で、抗酸化剤を更に添加する。After thorough mixing, allow the phases to separate and separate the oil phase using a separatory funnel. The mixing step with dilute hydrochloric acid is repeated several times to remove all methylamine, and the oil is then washed several times with distilled water and then separated to remove any remaining acid. . Then 0.02% gamma-tocopherol and 0 ascorbyl palmitate based on the weight of the oil.
.. Antioxidants are further added in an amount of 0.02%.
このようにして得たオイルは、そこで、実施例1におけ
るタラ肝油の場合と全く同じに処理する。The oil thus obtained is then treated exactly as in the case of cod liver oil in Example 1.
実施例1におけると同様に、100%すべてシスのD1
1Aと同じ<100%すべてシスのEPAが得られる。As in Example 1, 100% all cis D1
The same <100% all-cis EPA as 1A is obtained.
失壽■且
魚油110ccを、95%エタノール80cc及び水2
0ccと混合する。次いで、水酸化カリウム23gを加
える。この混合物を、フラスコ内で連続的に撹拌しなが
ら、還流加熱する。この溶液全体に亘って窒素を泡状に
供給する。混合物の有機相及び水相の双方に痕跡量のア
スコルビン酸、アスコルビルパルミテート、及びγ−ト
コフェロールを添加することにより、オイルが酸化する
のを防止する。110 cc of fish oil, 80 cc of 95% ethanol and 2 ml of water
Mix with 0cc. Then, 23 g of potassium hydroxide is added. The mixture is heated to reflux in the flask with continuous stirring. Nitrogen is bubbled through the solution. The addition of trace amounts of ascorbic acid, ascorbyl palmitate, and gamma-tocopherol to both the organic and aqueous phases of the mixture prevents the oil from oxidizing.
還流60〜90分後に加水分解が完了する。混合物は冷
却しそして砕いた氷上に注ぎ1次いで水200ccを加
える。この混合物を水非混和性有機溶媒と共に振り混ぜ
て、コレステロール、ビタミンA、ビタミンD及び炭化
水素といった非ケン化物質を洗い去る。分液漏斗で有機
相を除去した後、4モルの硫酸又はその当価物を120
〜140wR用いて、水相を酸性化する。この遊離酸混
合物を1石油エーテルで抽出し、分離し、そして硫酸マ
グネシウムで乾燥する。Hydrolysis is complete after 60-90 minutes of reflux. The mixture is cooled and poured onto crushed ice, followed by the addition of 200 cc of water. This mixture is shaken with a water-immiscible organic solvent to wash away unsaponifiable substances such as cholesterol, vitamin A, vitamin D, and hydrocarbons. After removing the organic phase in a separatory funnel, add 4 moles of sulfuric acid or its equivalent to 120
Acidify the aqueous phase using ~140 wR. The free acid mixture is extracted with 1 portion of petroleum ether, separated and dried over magnesium sulfate.
石油エーテルを完全に真空蒸発させ(evaporat
−ad over vacuum)、遊離の脂肪酸をエ
タノール100ccに溶かし、そして、絶対エタノール
中75gの尿素を添加する。これらの混合物をよく撹拌
しそして冷却する。尿素と飽和脂肪酸との包接結晶(i
nclusion crystal)が表われてくる。Completely evaporate the petroleum ether in vacuum.
- ad over vacuum), dissolve the free fatty acids in 100 cc of ethanol and add 75 g of urea in absolute ethanol. Stir these mixtures well and cool. Inclusion crystal of urea and saturated fatty acid (i
nclusion crystal) will appear.
これらを濾過し、そして新しい包接結晶が表われてくる
まで、上澄を蒸発せしめる。更に包接結晶が生成するま
で、上澄を更に冷却し、そしてこれらの結晶を濾出する
。残留上澄は、はとんどのポリ不飽和遊離脂肪酸を含有
しているので、これを蒸発せしめる。上澄からの残渣を
石油エーテルと5%HCIに溶かし、そして分離する。These are filtered and the supernatant is evaporated until new inclusion crystals appear. The supernatant is further cooled until more clathrate crystals form and these crystals are filtered off. The remaining supernatant, which contains most of the polyunsaturated free fatty acids, is evaporated. The residue from the supernatant is dissolved in petroleum ether and 5% HCI and separated.
次いで、有機相を水で洗う。The organic phase is then washed with water.
遊離の脂肪酸は、脂肪酸対石油エーテルの比率が1 :
10となるように、石油エーテルに溶解せしめ、そし
て−20℃に一夜冷却する6次の日、該溶液を濾出しそ
して廃棄する。濾液はもとの容積の1/3に減少し、そ
して再び一20℃に冷却する。モノ−不飽和脂肪酸から
なる新しい結晶が表われてくるので、これらの結晶を濾
出する。そこで濾液はもとの容積の1/9に減少し、そ
して−要冷却する。ジー不飽和脂肪酸からなる新しい結
晶又は新しい相のいずれかが表われてくる;分離してき
た脂肪酸相を分液漏斗で分離するか、又は、結晶を濾出
しそして廃棄する。濾液を再び一30℃に冷却するが1
分離相又は結晶は表われてこない。そこで溶媒を蒸発せ
しめると、残った液体はEPA及びDHAから成ってい
る。Free fatty acids have a fatty acid to petroleum ether ratio of 1:
10 in petroleum ether and cooled overnight to -20°C. On the 6th day, the solution is filtered and discarded. The filtrate is reduced to one third of its original volume and cooled again to -20°C. New crystals of mono-unsaturated fatty acids appear and are filtered out. The filtrate is then reduced to 1/9 of its original volume and - requires cooling. Either new crystals or a new phase consisting of di-unsaturated fatty acids appear; either the separated fatty acid phase is separated in a separatory funnel or the crystals are filtered out and discarded. The filtrate is cooled again to -30°C.
No separate phases or crystals appear. The solvent is then evaporated and the remaining liquid consists of EPA and DHA.
失に孤立
亜麻仁油100gを実施例5と同様に処理して、沈澱し
てくる尿素コンプレックスとポリ不飽和遊離脂肪酸の混
合溶液とを生成せしめる。次いで実施例5に記載したの
と同様にして、冷却工程及び容量減少工程を実施する。100 g of isolated linseed oil is treated as in Example 5 to form a mixed solution of precipitated urea complex and polyunsaturated free fatty acids. A cooling step and a volume reduction step are then carried out in the same manner as described in Example 5.
最初の容量減少工程(volume reductj、
on 5tep)では、バルミチン酸(palmiti
c acid)の結晶が表われてくる。The first volume reduction step (volume reduce,
on 5tep), palmitic acid (palmiti
c acid) crystals appear.
第2の容量減少工程では、液状オレイン酸(oleic
acid 1iquid)の分離相又はオレイン酸の
結晶が表われてくる。In the second volume reduction step, liquid oleic acid (oleic acid)
A separated phase of oleic acid (acid 1iquid) or crystals of oleic acid appear.
第3の容量減少工程では、液状シス−リノール酸(ci
s−1inoleic acid 1iquid)の分
離相又はシス−リノール酸の結晶が表われてくる。In the third volume reduction step, liquid cis-linoleic acid (ci
A separated phase of s-linoleic acid 1quid or crystals of cis-linoleic acid appears.
第3工程後の濾液中に見出される唯一の脂肪酸は、α−
リルン酸(alpha−1inolenic acid
)である。The only fatty acids found in the filtrate after the third step are α-
Alpha-1 inolenic acid
).
本発明の範囲から逸脱することなく各種の変形が実施可
能であり、そして1本発明が本明細書に記述されたこと
のみに限定して考えられるべきものではないことは、当
業者にとって明白なことであろう。It will be apparent to those skilled in the art that various modifications can be made without departing from the scope of the present invention, and that the present invention should not be considered limited to only what is described in this specification. That's probably the case.
代理人 弁理士 戸 1)親 男Agent Patent Attorney 1) Parent Male
Claims (1)
1,14,17−エイコサペンタエン酸(EPA)と(
すべて−z)−4,7,10,13,16,19−ドコ
サヘキサエン酸(DHA)との実質的に純粋な混合物を
分離するための方法であって、次のことから成る方法: (1)オイルから、ポリ不飽和遊離脂肪酸、又はそれら
のメチル若しくはエチルエステルの混合物を抽出し; (2)該脂肪酸又はエステルを尿素及び極性有機溶媒と
混合するのであるが、該溶媒は尿素と脂肪酸又はエステ
ルを溶かすのに充分な量だけ存在せしめ、そして、該尿
素は、それとコンプレックス化しうる脂肪酸又はエステ
ルの実質的に全部と共に配位コンプレックス(coor
dinationcomplex)を形成するのに充分
な量だけ、存在せしめ; (3)該混合工程後に生成する沈澱を除去し、そして濾
液を回収し; (4)濾液から残留溶媒と尿素とを除去して純粋な脂肪
酸又はエステルを得; (5)純粋な脂肪酸又はエステルを有機溶媒に溶かして
溶液とし; (6)第1の沈澱が生成するまで該溶液をゆっくりと冷
却し、そしてこの第1の沈澱を除去し; (7)該溶液の容量を実質的に減少せしめそして溶液の
濃度を増加せしめるのに充分な量の溶媒を、沈澱除去後
に残留する濾液から、除去し; (8)第2の沈澱が生成するまで該溶液をゆっくりと冷
却し、そしてこの第2の沈澱を除去し; (9)該溶液の容量を実質的に減少せしめそしてその濃
度を増加せしめるのに充分な量の溶媒を、該第2の沈澱
除去後に残留する濾液から、除去し; (10)分離液相又は固相が形成されるまで該濾液をゆ
っくりと冷却し、そして該分離相を除去し;そして (11)実質的に純粋なEPAとDHAとの混合物を含
有する残留液相を保持する。 2、特許請求の範囲第1項において、沈澱を得るために
該工程8及び10において溶液を冷却する際の温度が、
該工程6において溶液を冷却する際の温度と実質的に同
一となるよう(suchthat)、該工程7及び9に
おいて充分な溶媒を除去するものである、同項記載の方
法。 3、該温度が約−10〜30℃である、特許請求の範囲
第2項に記載の方法。 4、特許請求の範囲第1項において、その工程7及び9
でそれぞれ溶液から溶媒を除去するのであるが、その際
溶液の量をファクター約2〜9だけ減少せしめるもので
ある、同項記載の方法。 5、該工程7及び9において、溶液の量をファクター約
3だけ(byafactorofabout3)減少せ
しめるものである、特許請求の範囲第4項に記載の方法
。 6、海産動物オイルから実質的に純粋な(オール−z)
−5,8,11,14,17−エイコサペンタエン酸(
EPA)を分離するための方法であって、次のことから
成る方法:(1)オイルから、ポリ不飽和遊離脂肪酸、
又はそれらのメチル若しくはエチルエステルの混合物を
抽出し; (2)該脂肪酸又はエステルを尿素及び極性有機溶媒と
混合するのであるが、該溶媒は尿素と脂肪酸又はエステ
ルを溶かすのに充分な量だけ存在せしめ、そして、該尿
素は、それとコンプレックス化(beingcompl
exed)しうる脂肪酸又はエステルの実質的に全部と
共に配位コンプレックスを形成するのに充分な量だけ、
存在せしめ; (3)該混合工程後に生成する沈澱を除去し、そして濾
液を回収し; (4)濾液から残留溶媒と尿素とを除去して純粋な脂肪
酸又はエステルを得; (5)純粋な脂肪酸又はエステルを有機溶媒に溶かして
溶液とし; (6)ゆっくりと冷却し、この冷却工程中に溶液から分
離してくる新しい固相又は液相は、これをすべて除去し
; そして (7)実質的に純粋なEPAを含有する相を保持する。 7、特許請求の範囲第6項における海生動物油から実質
的に純粋なEPAを分離する方法に、更に、それから実
質的に純粋な(すべてZの)−4,7,10,13,1
6,19−ドコサヘキサエン酸(DHA)を分離する方
法を付加し、そして更に、該方法におけるゆっくりと冷
却した後に除去する工程の後に、実質的に純粋なDHA
を含む相を保持する工程を包含してなる、同項記載の方
法。 8、海産動物オイルから実質的に純粋な(すべてZの)
−4,7,10,13,16,19−ドコサヘキサエン
酸(DHA)を分離するための方法であって、次のこと
からなる方法: (1)オイルから、ポリ不飽和遊離脂肪酸、又はそのメ
チル若しくはエチルエステルの混合物を抽出し; (2)該脂肪酸又はエステルを尿素及び極性有機溶媒と
混合するのであるが、該溶媒は尿素と脂肪酸又はエステ
ルを溶かすのに充分な量だけ存在せしめ、そして、該尿
素は、それとコンプレックス化しうる脂肪酸又はエステ
ルの実質的に全部と一緒になって配位コンプレックスを
生成せしめるのに充分な量だけ、存在せしめ; (3)該混合工程後に生成する沈澱を除去し、そして濾
液を回収し; (4)濾液から残留溶媒と尿素とを除去して純粋な脂肪
酸又はエステルを得; (5)純粋な脂肪酸又はエステルを有機溶媒に溶かして
溶液を生成せしめ; (6)ゆっくりと冷却し、この冷却工程中に溶液から分
離してくる新しい固相又は液相は、これをすべて除去し
;そして (7)実質的に純粋なDHAを含有する相を保持する(
retaining)。 9、特許請求の範囲第1項、第6項又は第8項のいずれ
か1項において、該溶解工程において使用する該有機溶
媒は、エタノール、メタノール、アセトン、シクロヘキ
サン、石油エーテルまたはエチレンクロライドからなる
群から選ばれるものである、同項記載の方法。 10、特許請求の範囲第1項、第6項又は第8項のいず
れか1項において、該工程(1)が次の工程から成る、
同項記載の方法: (a)過酸化及びシス−トランス転化(cis−tra
nsconversion)を回避するのに充分に温和
な条件のもとで、海産動物オイルを加水分解し; (b)有機溶媒で洗うことによって加水分解生成物から
非ケン化物を除去し、そして水相を回収し; そして (c)回収した水相を酸性化して有機相を放出せしめ(
release)、そして純粋な脂肪酸又はエステルを
含有する有機相を回収する。 11、特許請求の範囲第10項において、該加水分解工
程に先立ち、アスコルビン酸、アスコルビルパルミテー
ト、ガンマートコフェロール及びそれらの混合物からな
る群から選択したものを添加することによって、酸化を
防止する、同項記載の方法。 12、該加水分解工程中ずっとオイル全体に対して窒素
をバブリングする、特許請求の範囲第10項記載の方法
。 13、特許請求の範囲第1項、第6項又は第8項にいず
れか1項において、該尿素との混合工程において使用す
る極性有機溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロ
パノール、石油エーテル、ベンゼン、トリクロルエチレ
ン及びメチルイソブチルケトンからなる群から選ばれる
ものである、同項記載の方法。 14、該尿素との混合工程で使用する該溶媒がエタノー
ルである、特許請求の範囲第13項に記載の方法。 15、特許請求の範囲第1項、第6項又は第8項にいず
れか1項において、尿素と脂肪酸又はエステルとを使用
有機溶媒中に溶解せしめるのに充分な温度で、尿素混合
工程を行い、そして更に、沈澱を生ぜしめるために尿素
との混合工程後に行う混合物の冷却工程を包含する、同
項記載の方法。 16、特許請求の範囲第1項、第6項又は第8項にいず
れか1項において、オイルからポリ不飽和脂肪酸混合物
を抽出する該工程が、リパーゼ又は強塩基を用いてオイ
ル中のトリグリセライドを加水分解する工程を包含する
ものである、同項記載の方法。 17、特許請求の範囲第16項において、加水分解剤が
、加水分解を受けるトリグリセライドの第1と第3の分
枝のみを分離して(detach)まん中の分枝はグリ
セライド骨格上に実質的に元のままで残すだけの時間の
み加水分解することから、加水分解工程が構成されるも
のである、同項記載の方法。 18、特許請求の範囲第1項、第6項又は第8項にいず
れか1項において、該工程(1)が、エタノールまたは
メタノールを用いるエステル交換によってオイル中のト
リグリセライドを加水分解する工程を包含するものであ
る、同項記載の方法。 19、特許請求の範囲第18項において、該エステル交
換工程が、痕跡量の金属ナトリウム、ナトリウムエトキ
サイドまたはナトリウムメトキサイドの存在下、無水エ
タノールまたはメタノールとともにオイルを還流せしる
ることから成るものである、同項記載の方法。[Claims] 1. From marine animal oil, (all-z)-5,8,1
1,14,17-eicosapentaenoic acid (EPA) and (
A method for separating a substantially pure mixture of all-z)-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid (DHA), comprising: extracting polyunsaturated free fatty acids, or mixtures of their methyl or ethyl esters, from the oil; (2) mixing the fatty acids or esters with urea and a polar organic solvent, the solvent comprising urea and the fatty acids or esters; and the urea is present in a coordination complex with substantially all of the fatty acids or esters that may be complexed therewith.
(3) removing the precipitate formed after the mixing step and collecting the filtrate; (4) removing residual solvent and urea from the filtrate to obtain a pure (5) Dissolve the pure fatty acid or ester in an organic solvent to form a solution; (6) Slowly cool the solution until a first precipitate forms; (7) removing from the filtrate remaining after removing the precipitate an amount of solvent sufficient to substantially reduce the volume of the solution and increase the concentration of the solution; (8) a second precipitate; (9) adding a sufficient amount of solvent to substantially reduce the volume of the solution and increase its concentration; From the filtrate remaining after removal of the second precipitate, remove; (10) slowly cool the filtrate until a separate liquid or solid phase is formed, and remove the separate phase; and (11) A residual liquid phase containing a mixture of essentially pure EPA and DHA is retained. 2. In claim 1, the temperature at which the solution is cooled in steps 8 and 10 to obtain the precipitate is
The method of the preceding paragraph, wherein sufficient solvent is removed in steps 7 and 9 such that the temperature is substantially the same as that at which the solution is cooled in step 6. 3. The method of claim 2, wherein the temperature is about -10 to 30°C. 4. In claim 1, steps 7 and 9
The method of claim 1, wherein the solvent is removed from the solution in each step, reducing the volume of the solution by a factor of about 2 to 9. 5. The method of claim 4, wherein in steps 7 and 9, the amount of solution is reduced by a factor of about 3. 6. Substantially pure (all-z) from marine animal oils
-5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid (
EPA) comprising: (1) from an oil a polyunsaturated free fatty acid;
(2) mixing the fatty acid or ester with urea and a polar organic solvent, the solvent being present in an amount sufficient to dissolve the urea and the fatty acid or ester; and the urea is complexed with it.
(exed) in an amount sufficient to form a coordination complex with substantially all of the possible fatty acids or esters;
(3) removing the precipitate formed after the mixing step and collecting the filtrate; (4) removing residual solvent and urea from the filtrate to obtain the pure fatty acid or ester; (5) removing the pure fatty acid or ester; Dissolve the fatty acid or ester in an organic solvent to form a solution; (6) slowly cool it and remove any new solid or liquid phase that separates from the solution during this cooling process; and (7) substantially Retain a phase containing essentially pure EPA. 7. The method of separating substantially pure EPA from marine animal oil in claim 6 further includes substantially pure (all of Z) -4,7,10,13,1
Adding a method for separating 6,19-docosahexaenoic acid (DHA) and further providing substantially pure DHA after the slow cooling and subsequent removal step in the method.
The method according to the same item, comprising the step of maintaining a phase containing. 8. Substantially pure from marine animal oils (all Z)
- A method for separating 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid (DHA), comprising: (1) polyunsaturated free fatty acids, or their methyl or extracting a mixture of ethyl esters; (2) mixing the fatty acid or ester with urea and a polar organic solvent, the solvent being present in an amount sufficient to dissolve the urea and the fatty acid or ester; and (3) removing the precipitate that forms after the mixing step; , and collecting the filtrate; (4) removing residual solvent and urea from the filtrate to obtain a pure fatty acid or ester; (5) dissolving the pure fatty acid or ester in an organic solvent to form a solution; (6) ) cooling slowly and removing any new solid or liquid phase that separates from the solution during this cooling step; and (7) retaining a phase containing substantially pure DHA.
(retaining). 9. In any one of claims 1, 6, or 8, the organic solvent used in the dissolution step consists of ethanol, methanol, acetone, cyclohexane, petroleum ether, or ethylene chloride. The method described in the same paragraph, which is selected from the group. 10. In any one of claims 1, 6, or 8, the step (1) consists of the following step.
The method described in the same paragraph: (a) peroxidation and cis-trans conversion (cis-tra
(b) removing unsaponifiables from the hydrolysis product by washing with an organic solvent and removing the aqueous phase; and (c) acidifying the collected aqueous phase to release the organic phase (
release) and recover the organic phase containing pure fatty acids or esters. 11. Claim 10, wherein prior to the hydrolysis step, oxidation is prevented by adding one selected from the group consisting of ascorbic acid, ascorbyl palmitate, gamma tocopherol, and mixtures thereof. The method described in section. 12. The method of claim 10, wherein nitrogen is bubbled through the oil throughout the hydrolysis step. 13. In any one of claims 1, 6, or 8, the polar organic solvent used in the mixing step with urea is methanol, ethanol, isopropanol, petroleum ether, benzene, trichloro The method according to the same item, wherein the compound is selected from the group consisting of ethylene and methyl isobutyl ketone. 14. The method according to claim 13, wherein the solvent used in the mixing step with urea is ethanol. 15. In any one of claims 1, 6, or 8, the urea mixing step is carried out at a temperature sufficient to dissolve the urea and the fatty acid or ester in the organic solvent used. , and further comprising a step of cooling the mixture after the step of mixing with urea to produce a precipitate. 16. In any one of claims 1, 6, or 8, the step of extracting the polyunsaturated fatty acid mixture from the oil comprises removing triglycerides in the oil using lipase or a strong base. The method described in the same section, which includes a step of hydrolyzing. 17. In claim 16, the hydrolyzing agent detaches only the first and third branches of the triglyceride to be hydrolyzed, so that the middle branch is substantially on the glyceride skeleton. The method according to the same item, wherein the hydrolysis step consists of hydrolysis only for a period of time long enough to remain intact. 18. In any one of claims 1, 6, or 8, the step (1) includes a step of hydrolyzing triglycerides in the oil by transesterification using ethanol or methanol. The method described in the same paragraph. 19. Claim 18, wherein the transesterification step consists of refluxing the oil with absolute ethanol or methanol in the presence of trace amounts of sodium metal, sodium ethoxide or sodium methoxide. Yes, the method described in the same section.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP15918588A JPH0219338A (en) | 1988-06-29 | 1988-06-29 | Extraction and purification of poly (unsaturated fatty acid) from natural source |
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JP15918588A JPH0219338A (en) | 1988-06-29 | 1988-06-29 | Extraction and purification of poly (unsaturated fatty acid) from natural source |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0219338A true JPH0219338A (en) | 1990-01-23 |
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ID=15688172
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JP15918588A Pending JPH0219338A (en) | 1988-06-29 | 1988-06-29 | Extraction and purification of poly (unsaturated fatty acid) from natural source |
Country Status (1)
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---|---|
JP (1) | JPH0219338A (en) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07278585A (en) * | 1994-04-06 | 1995-10-24 | Nippon Kagaku Shiryo Kk | Method for purifying eicosapentaenoic acid or its ester |
EP1179689A1 (en) | 2000-08-07 | 2002-02-13 | Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha | Belt for continuously variable transmission |
EP1283378A2 (en) | 2001-08-10 | 2003-02-12 | Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha | Belt for countinuously variable transmission |
JP2018012842A (en) * | 2012-10-01 | 2018-01-25 | 日清ファルマ株式会社 | Method for producing highly unsaturated fatty acid alkyl ester-containing composition |
-
1988
- 1988-06-29 JP JP15918588A patent/JPH0219338A/en active Pending
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US6843743B2 (en) | 2001-08-10 | 2005-01-18 | Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha | Belt for continuously variable transmission |
JP2018012842A (en) * | 2012-10-01 | 2018-01-25 | 日清ファルマ株式会社 | Method for producing highly unsaturated fatty acid alkyl ester-containing composition |
JP2019048902A (en) * | 2012-10-01 | 2019-03-28 | 日清ファルマ株式会社 | Method for producing highly unsaturated fatty acid alkyl ester-containing composition |
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