JPH02177950A

JPH02177950A - 老化度測定方法

Info

Publication number: JPH02177950A
Application number: JP33193388A
Authority: JP
Inventors: Hirotomo Ochi; 宏倫越智; Morio Kuboyama; 久保山　盛雄
Original assignee: NIKKEN FOOD HONSHA KK
Current assignee: NIKKEN FOOD HONSHA KK
Priority date: 1988-12-28
Filing date: 1988-12-28
Publication date: 1990-07-11
Anticipated expiration: 2014-01-27
Also published as: JP2850128B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は一尿中に排泄される核酸分解物（８）入イドロ
キシデオキシグアノシン）を簡易的に分析定量する測定
方法に関するものであり、特に、老化の進行度を予測す
るため、また、老化を遅らせる物質を探索するために利
用し、さらに糖尿病・循環器系疾患・アルツハイマー病
・虚血性疾患・自己免疫疾患等の老人病の予測予防方法
を探索するために利用する老化度測定器に関するもので
ある。

（従来の技術）長年にわたり、これまで老化の程度を知るために、いろ
いろな方法が考案されている。老化は、電機と言われる
多くの外観的、機能的な特徴によを表現されており、１
０年単位で各年齢を分類すれば、電機は大別的に当ては
まる。しかし、同じ年代の高齢者間で見ると、それぞれ
寿命の差が大きいように、電機も違っており、−概に老
化の程度はわからない。

大別的な電機の分類は、例えば、表１のように報告され
ている（亀山止部　内科５１．１０２２１’１８３）。

日野原は、身体の機能を表２のように１６の項目に分類
し、各項目にスコアーを与え、合計点から老化度を算出
し、第６図の如き結果を得ている（日野原重明　日老医
誌ＬＢ、２３８１９７９　）。

一方、老化を起こす因子として、近年、フリーラジカル
の存在とそのかかわり合いが論じられて来ている。

生体内に、発生する活性酸素は、正常な細胞、組織に損
傷を与え（酸化的ストレス）、老化を起こす原因の一つ
に考えられている（カトラー二第２回協和発酵バイオサ
イエンスシンポジウム、東京　１９８５，９、ソハール
；Ｂａ５ｉｃ　Ｌｌｆ’ｅ　Ｓｃ１．３５ニア５．１９
８５）。

また、糖尿病、虚血性疾患、腎炎、動脈硬化症自己免疫
疾患、癌等、成人病と称される疾患は、その原因機序に
活性酸素が関わることが強ぐ示唆されている（コーエン
ら：Ｊ、Ｂ１ｏ１　、Ｃｈｅ＋＊、、２４９：２４４７
．１９７４　、　マエストロ；＾ｃｔａ、Ｐｌｉｙｓｌ
ｏｌ　、５ｅａｎｄ、４９２　（ｓｕｐｐｌ、）：１５
３．１９８０．　　トーツスら；Ａｄｖ、Ｉｎ　Ｆｒｅ
ｅ　ｒａｄｉ−ｃａｌ　＆　Ｂｌｏｌ　Ｍｅｄ、、Ｈ２
，３４７，１９８Ｂ、ステファンら；ｊ。

Ｎｅｎｒｏｌｏｇｌｃａｌ　Ｓｃｆ、、８７；３１９．
１９８５．末松ら、：医学の歩み、１４２ニア２９，１
９８７．阿部ら；医学の歩み、１４２ニア４２．１９８
７）。活性酸素は、細胞の核酸を修飾し、或いは細胞死
に至らしめることが推測され、核酸由来とみられる修飾
塩基；チミングリコール、チミジングリコールが尿中に
検出され、動物種の酸素消費量と相関が認められ、老化
とのかかわり合いを示唆している（ニーデルマンら、Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｅｄ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ、８５．２７０６．１９８８）
　。また、８−ハイドロキシデオキシグアノシン、チミ
ングリコールそしてチミジングリコールは、核酸に放射
線を照射した時に生成されることも知られている（葛西
ら；癌、７５：１０３７．１９４．フレンケルら；　Ｂ
ｌｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ、２０ニア５Ｂ６．１９８１）
。血液中の過酸化脂質と老化とのかかわり合いはよく知
られているが（ストレーラーら；　Ｊ、Ｇｅｒｏｎｔｏ
ｌ、１４．４３０，１９５９）　、この過酸化脂質と酸
化的ストレスとの間に相関性もあることが我々の研究に
より強く示唆されている。

（発明が解決しようとする課題）老化度測定法は、老化の基準を客観的に設定することで
一致しているが、臓器機能の加齢変化は、個体差が著し
いので、ある臓器の機能から個体差を推定するのは不可
能である。又、スコア一方式についても多次元ベクトル
としての老化の尺度に一歩接近しているとは言えるもの
の、情報の重みが科学的に決定されていない欠点がある
。以上のごとく、これまでも老化度の測定をいろいろ試
みられてはいたが、満足すべきものが得られていない。

老化防止策は、食物摂取の栄養的な観点、筋肉・骨組織
機能維持の運動生理学的な観点、住宅環境の改善、太陽
光線被爆防止などの物理学的な観点等、いろいろ方法が
ある。しかし、その最適化をモニターする実用的な方法
はない。

上記のように、個人々々について、体の遺伝的背景、ラ
イフスタイル、栄養の摂取状況が違っ□ており、このよ
うな状況下で老化を防止する為の実用的なモニターの方
法は未だ提案されていない。

（課題を解決する為の手段）本発明は、尿中の核酸分解物；８−ハイドロキシデオキ
シグアノシンについて、老化とのかかわり合いを種々検
討した結果、老化促進度の指標となる。ことを見いだし
、上述した老化度の測定法の問題点を解決し、本発明を
完成した。

すなわち、尿中に排泄される修飾された核酸塩基；８−
ハイドロキシデオキシグアノシンを高□速液クロにより
電気的・紫外部検出器を用いて測定し、これを全身的な
酸化的ストレスの指標とじ、個人、体の能力に応じて、
老化度を測定する方法を提供するものである。活性酸素
による酸化的ストレスは、従来の技術の所で記載したよ
うに、成人病はじめ数多くの疾患の原因機序であり、著
者らは、老化すなわち細胞核酸の損傷をおこす活性酸素
とその防禦について次の概念を推測するに至っている。

酸化的ストレスは以下のように定義される。

酸化的ストレス（Ｑｘ　１ｄａｔｌＶｅ　５ｔｒｅｓｓ
　Ｏ３）乃至はＯＳ−に’　　（Σ［活性酸素］−Σ［
抗酸化性物質］）。Ｋ及びに′は常数である。

以下、この経緯を詳細に述べる。

Ｏ８−ハイドロキシデオキシグアノシン（ｌｌ１０１１
ｄＧ）の調製標準物質として用いた８０ＨｄＧは、地厚らの方法（Ｃ
ｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌ　１．１３．１１４０−１
１．４２．１９６５）に従い合成した。

すなわち、１ｇのデオキシグアノシンを原料とし、７８
０　ｍｌの０．１３Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６，８）に溶解
後、１４０ｍ１の０．１Ｍアスコルビン酸、０．１ＭＦ
ｅＳＯ４と６５ｍ１の０．１Ｍ　　ＥＤＴＡをそれぞれ
加え３７℃下で酸素を吹き込みながら３時間反応を行っ
た。終了後、遮光でＩＮ塩酸でｐＨ３，７とし、１０ｇ
の活性炭を加え、十分撹拌後、それをガラスカラムに通
し濾過した。カラムの残留物は、蒸溜水で数回洗浄後、
５００ｍ１の水・アセトン（１：１　、　ｖ／ｖ）で、
溶出させた。溶出液は、エバポレーターを用いて濃縮乾
固し、さらに高速液体クロマトグラフィーを用いて、精
製を行った（ＣＯｌｕｍ：５ｕｐｅｌｕｃｏ社、ＯＤＳ
　４．６　Ｘ　１００　ｍｍ５ｓｏｌｖｅｎｔ：１５％
ＭｅＯｔｌ）。その結果、８０ＨｄＧは、約９０ｍｇの
白色結晶として得た。

本物質のＮＭＲスペクトル、Ｕｖスペクトル、ＨＰＬＣ
クロマトグラムを第１図、第２図、第３図に示す。

０尿中の８−０ＨｄＧの定量法次に、人の尿に微量存在する８０ＨｄＧの分析方法につ
いて記載する。

尿検体の調整；尿の採取は、午後０時から翌日の午後０
時までの２４時間の全量を同一容器に採取し、その少量
を、フィルター（０，２２μｍ）で濾過した。尿は、予
めメタノールと蒸溜水で洗浄したカラム（Ｃ１ｇ：５ｅ
ｐ−ｐａｃｋ、　　ミリポア社）に通し、蒸溜水と３５
２６メタノールで溶出させ、それぞれの濾液を、水分画
、３５％メタノール分画とした。

ＨＰＬＣの設定；ヒユーレット・パラカート社ノＨＰＬ
Ｃ１０９０で、カラムは、５ｕｐｃｌｕｃｏ社のＯＤＳ
系のプレカラムとＣｌ８Ｓ　　２５０Ｘ４．６關を用い
た。ソルベントは、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ５，５）
と１０％メタノール同緩衝液あるいは、１２．５ｍＭク
エン酸緩衝液（ｐＨ５，１）と１０％メタノール同緩衝
液で、０−６０分間のグラデイエンドをかけ、紫外部ダ
イオードアレイ（２０５，２３１，２９３ｎｍ　）とＥ
Ｃ検出器（東ソ社、　ＥＣ−８０００）で測定した。標
準物質として、８０ＨｄＧの他に、尿酸そしてクレアチ
ニンを用いた。

本発明は、測定手段として、高速液体クロマトグラフに
よりＯＤＳ系カラムＬＣ１８３等、２０ｃｍ〜３０ｃｍ
Ｘ４．６ｍｍ　（１〜２本）を用い、リン酸等の酸性側
緩衝液（ｐ）（，４，５〜６．０）に１０％メタノール
等のグラデイエンドを（０〜６０分間）かけ、電気化学
的（印加電圧５５０ｍＶ〜７００ｍＶ）および紫外部吸
収検出器（２３１，２４３゜２９３ｎｍ　）により、修
飾塩基、尿酸、クレアチニンの同時測定を可能とする条
件を用いることを特徴とする老化度測定法である。

また本発明の測定器の構成は、上記のごとく詳しく述べ
たが、Ａ、尿の処理工程、Ｂ、高速液クロのカラムによ
る分離、Ｃ０検出器として電気化学的もしくは紫外部吸
収によるシステムである。

糖尿病・循環器系疾患・アルツハイマー病・虚血性疾患
・自己免疫疾患等、加令に伴う諸疾患の予知が出来るよ
うにした老化度測定器である。

（実施例１）ここで健康人男子２５名（２０〜３５オ＝７名、３６〜
６０才代＝１８名）について、尿中の８０ＨｄＧを測定
し、８０ＨｄＧと年齢との相関関係を調べ、統計学的に
検討を行った。その結果、３５歳以降においては、加齢
に伴う２４時間尿中の８０ＨｄＧ　／　ｋｇ体重の消長
変化に有意の正相関が見られた（ａｍｏ、　６５．　ｎ
−１８，ｐ＜０．０１．　　ｙｍＯ，０５２χ−１）（
第４図）。すなわち、若々しさが失われてきて、電機が
顕著に出現しだす約３５歳以降は、８−０ＨｄＧは加齢
とともに増加が見られることがわかった。成長過程（２
０歳から３０歳前後）においては、代謝が活発に行われ
、細胞の交代が烈しいため８０ＨｄＧの排泄はむしろ、
増加し、８０ＨｄＧは高く維持されている（みかけの老
化）。３０歳ごろに生物学的に成熟が終わり、３５歳ご
ろまで８０ＨｄＧの変動はみられるが、相関はない。３
５歳以降では、８０ＨｄＧのレベルは必ずしも高くはな
いが、上昇を続け、５０歳以降では、顕著になる。これ
は、明らかに加齢に伴う変化とすることが出来る。

（実施例２）上記、健康人について、血清中の過酸化脂質を八木法（
過酸化脂質実験法、金山ら、１９８４年、医歯薬出版）
により測定し各々の８０ＨｄＧ値と対比を行った。その
結果を第５図に示す。血清中の過酸化脂質の上昇と尿中
の８０ＨｄＧは、相関を有することがわかった。

老化の指標として、過酸化脂質値が使われることがある
が、採血を経なければならず、その点尿中の修飾塩基の
測定法は非侵襲的であるのできわめて便利に利用できる
。

（実施例３）早老症として知られる疾患；ダウン症患者の尿中の８−
０ＨｄＧを経時的に測定したところ表３のように年齢を
問わず健康人に対し排泄量が多く、老化が促進されてい
るのが明らかに認められた。

表３（実施例４）放射線による照射治療を受けた患者の尿中の８−０Ｈｄ
Ｇを治療前後に亘って測定した。照射にしたがって、８
−０ＨｄＧの増加傾向が見られた（表４）。

表４る物質を探索する為に使用し、糖尿病、循環器系疾患、
アルツハイマー病、その他の老人病に有効に対処し、こ
れを予防し得る効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は８０ＨｄＧ標品のＮＭＲスペクトル、第２図は
８０ＨｄＧ標品のＵＶスペクトル、第３図は８０ＨｄＧ
標品ののＨＰＬＣスペクトル、第４図は健康人２４時間
当りの尿中の８０ＨｄＧ値、測定による年齢とのクラス
ター分析、第５図は健康人２４時間当りの８０ＨｄＧ値
と血液中の過酸化脂質値との相関関係を示す図、第６図
は機能上の老化度測定の判定点と年齢とのグラフである
。（発明の効果）

Claims

【特許請求の範囲】１　全身的な酸化的ストレスを指標として測定すること
を特徴とする老化度測定法２　指標は、尿中（２４時間採取）の修飾核酸塩基であ
ることを特徴とする老化度測定法３　修飾核酸塩基は、８−ハイドロキシデオキシグアノ
シン等とすることを特徴とする老化度測定法４　尿中に排泄される酸化的ストレス由来の修飾核酸塩
基を測定し、老化進行の予防・防止方法をモニターする
ために用いる老化度測定法５　測定手段として、高速液体クロマトグラフにより電
気化学的および紫外部吸収検出器により、修飾塩基、尿
酸、クレアチニンの同時測定を可能とする条件を用いる
ことを特徴とする老化度測定法６　尿中に排泄される酸化的ストレス由来の修飾核酸塩
基を測定できる機能を備え、糖尿病・循環器系疾患・ア
ルツハイマー病・虚血性疾患・自己免疫疾患等、老人病
の予知が出来るようにした老化度測定器