JPH02110101A - 新規なβ―１，３―グルカンエキソポリサッカリドおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物起源の新規な変性β−１，５−グルカン
　エキソポリサツカリド及びその製造方法に関するもの
である。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕ポリサ
ツカリドは３種の一般的起源、すなわち植物、動物及び
微生物起源のものからなる。

微生物性ポリサツカリドは細菌の細胞壁の構成成分であ
り得るか又は微生物性エキソポリサツカリド（ＥＰＳ）
として知られる細胞外ポリマーとして特定の細菌によっ
て合成され得る。典型的な微生物性ポリサツカリドはデ
キストラン、キサンタン　ガム、プルラン及びカードラ
ンを包含する。親水性コロイドとしての多数のポリサツ
カリドの機能は、比較的低濃度で水性系の流動性を劇的
に変える。微生物性ポリサツカリドは、特に食品、化粧
品及び薬品工業において、増粘剤、安定剤、懸濁剤又は
凝集剤のような種々の目的のために、植物ガム例えばセ
ルロース、ペクチン及び寒天の代わシに使用することが
できる。微生物性ポリサツカリドは成形材料例えば生物
分解性フィルムとして使用することもできる。

独特のレオロジー的及び不可逆的熱ゲル化性を示す水不
溶性のβ−１，３−グルカン　エキソポリサツカリドの
種類は、細菌の２つの異なる属の種類、アルカリゲネス
（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）及びアグロバクテリウム（
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）によって産生されること
が知られている。非導入ポリマーは、アルカリ性とした
細胞除去発酵液の中和の際に不溶性ゲルとして回収する
ことができる〔ティー　ハラｆ　（Ｔ、　Ｈａｒａｄａ
）　、　”カードラン−Ａ　ゲル形成グルカフ　（ｃｕ
ｒｄｌａｎ　−Ａ　Ｇｅｌ　ＦｏｒｍｉｎｇＱｌｕｅａ
ｎ　）″１食品中のポリサツカリド（Ｐｏ１ｙｓａｃｃ
ｈａ　−ｒｉｄｅｓ　ｉｎ　Ｆｏｏｄ　）　、編集者ジ
エ−’　ｘ　ム’ブイ・プランサード（Ｊ、　Ｍ、　Ｖ
、　Ｂｌａｎｓａｒｄ）及びジェーアール、ミッチ、　
＃　（Ｊ、　Ｒ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、バターワスニ−、
ケイ、　（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ　Ｕ、に、　）　（
１９７９）第２８３〜３００頁参照〕。特に、β−１，
５結合によって結合したグルコース残基の直鎖状ポリマ
ーからなシ、“カードラン“と呼ばれる水不溶性熱ゲル
化性β−１，３−グルカン　エキソポリサツカリドはア
ルカリゲネス　フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　
　ｆａｅｃａｌｉｓ）　　変種ミキソゲネス（ｍｙｘｏ
ｇｅｎｅｓ　）　１０　Ｃ５の選ばれた変種（Ｋ株）の
バッチ培養によって製造することができることが知られ
ている〔ハラダ（Ｈａｒａｄａ　）他、Ａｇｒ。

Ｂｉｏｌ、　（Ｊｅｍ、、　　３０，１９６，１９６６
；　Ａｇｒ、　　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　　５０，７６４．１９６６；及びＡｒｃ
ｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　　１２４，２９２．１９６８参照
〕。

キムテ（Ｋｉｍｕｒａ　）他による、１９７３年８月２
８日及び１９７４年７月２日に発行されたアメリカ合衆
国特許第３７５４９２５号及び第３８２２２５０号には
、ＮＴＫ−ｕ株として命名されたエイ、フェカリス（Ａ
、　ｆａｅｃａｌｉｓ）変種ミキノゲネス（ｍｙｘｏ−
ｇｅｎｅｓ）　１０Ｃ３にのウラシル要求栄養要求株の
変１１（ＩＦＯ１３１４０及びＡＴＣＣ２１６８０）ハ
、ハラダ（Ｈａｒａｄａ）他によって開示されたカード
ランとは異なる物理化学的特性を有すると述べられたカ
ードラン様エキソポリサツカリドを産生ずることが記載
されている。キムテ（Ｋｉｍｕｒａ　）他は、前記様か
ら誘導されるポリサツカリド（ｐｓ）（ｐｓ−１３１４
０と表わされる）の水性懸濁液を加熱することによって
生成するゲルは、カードランの従来知られている試料か
ら誘導されるものよりも更に安定であるのみならず優れ
ていることを報告した。しかしながら、公知カードラン
試料との比較データは特許明細書には記載されなかった
。別のカードラン様ポリマー（本文中ではＰＳ−１３１
２６と表わされる）もキムテ（Ｋｉｍｕｒａ　）他によ
って記載され、そしてＰＳ−１３１４０と実質的に同じ
物理化学的性質を有すると述べられた。

ポリマーＰＳ−１３１２６は、アグロバクテリウムラジ
オバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｒａｄｉ
ｏｂａｃｔｅｒ）の変種、すなわち菌株Ｕ−１９（ＩＦ
ｏ　１３１２６及びＡＴＣＣ２１６７９）のバッチ培養
によって産生された。前記変種が誘導された親の培養物
は、アグロバクテリウム　ラジオバクター　ＩＦ０１３
１２７（更にＡＴＣＣ６４６６）として命名されている
。

上記文献に記載されたエキソポリサツカリド産生方法に
おいて、ポリマー合或は生長が停止した後（すなわち、
定常成長期の間）に起る。

前記バッチ醗酵方法は、炭素基質からポリマ産生物への
変換効率約５０チを有する約４日間持続する方法である
。連続法の産生効率はバッチ法の産生効率よりも著しく
優れていることが知られている。しかしながら、生長停
止後の培養の定常期の間に合成さ九る第２の代謝生成物
の産生培養物が成長する単段連続流動系においては効率
よく導かれない。エイ、フェカリス変種ミキソゲネスの
変種によって産生されるカードラン様エキソポリサツカ
リドの連続培養は文献に記載されている〔フィリップス
（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ　）他、Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、、　　２９．１３３１　、１９８３　；　
。

−フォード（Ｌｏｗｆｏｒｄ　）他、　　Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ、　Ｌｅｔｔｓ、、　４　。

６８９．１９８２参照〕。エイ、フェカリス変種ミキソ
ゲネスＡＴＣＣ２１６８０（ＡＴＣＣ３１７９４及びＡ
ＴＣＣ３１７５０として設計された）の安定な非栄養要
求変種を使用するカードラン型エキンボリサッカリドの
２段階又は２期直列、連続醗酵法は、１９８２年１０月
１９日付けでエッチ、ジ、ロウフォード（Ｈ，Ｇ、　Ｌ
ａｗｆｏｒｄ　）に対しテ発行されたアメリカ合衆国特
許第４５５５１０６号の主題である。

本発明者の知るところでは、ただ１種の市販カードラン
様エキソポリサツカリドのみが存在する。日本国の武田
薬品工業■の子会社である和光紬薬工業■は、精製薬品
として和光カードラン産生物として後の本文中に記載さ
れる産生物を供給している。

本発明者のうちの１人による従来の研究（エッチ、ロウ
フォード他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　Ｌｅｔｔｅｒ　
８．１４’；。

１９８６参照）において、発酵液のβ−１，５〜グル力
ンＥＰ８濃度を改善するためにバイオリアクター配置を
変えることができるということが提案された。

前記文献において報告された発酵液の増加したポリマー
濃度は、振動的に混合される振動発酵槽を使用すること
によって、又は慣用のじゃま板付タービン攪拌付バイオ
リアクター内の３千刃タ一ビン攪拌機の一番上の２板の
平刃を船舶型プロペラに代えることによって達成するこ
とができた。

本発明は、後の本文中で説明されるであろう総てにわた
る発酵過程のエキソポリマー産生期（定常期）の間の培
養における特別な酸素要求に関するものであるがしかし
、成長培養における酸２要求は異なることが認められる
。

成長培養（指数的成長期）の呼吸速度、及びこれよシ酸
素要求量は非成長培養のそれらよりも非常に大きいこと
が知られている；しかしながら、溶存酸素濃度を生長限
界濃度（臨界溶存酸素濃度ＤＯｃｒｉｔと呼ばれる）よ
りも高い水準に維持すれば、培養は酸素限界にはならな
いであろう。ＤＯｃｒｉｔＯ値は通常全く低く、Ｑ、２
ないしα４■ＯＬ／Ｌの範囲内である。実際、好気発酵
は酸素を経済的に過剰な水準で供給することなく、酸素
限界に伴う問題を避けるために十分に高いＤＯで行われ
る。同時に、高すぎるＤＯ濃度は細胞機能に対して有害
であるか又は抑制的であり得ることも認められておシ、
そのような条件は避けるべきである。これまで、エキソ
ポリサツカリド発酵においては、酸素は非成長（定常期
）培養の予想し得る酸素要求量に基づいて、上記ＤＯｃ
ｒｉｔを越えないＤＯ値を与えるような速度で内輪に見
積って供給された。約７−５倍ＤＯｃｒｉｔ　（すなわ
ち（１５ないし１．　Ｏｒｒｑ　０２／　Ｌ　）の操作
範囲は十分なものであると考えられたであろう。

〔課題を解決するための手段〕

微生物性エキソポリサツカリドに対する継続的研究及び
非イオン性、高機能性粘稠剤及びゲル化剤に対する研究
によシ、本発明者らは単離された微生物性β−１，３−
グルカン　エキソポリサツカリドの物理化学的性質は、
バイオリアクターの操作条件を制御することによって一
定の最終使用用途のために改良することができることを
発見した。特に、エキソポリサツカリドの改良されたレ
オロジー的性質の指標として使用される単離されたエキ
ソポリサツカリドの極限粘度数は、発酵の間中程度の攪
拌を使用した場合には発酵を通じて約６．０ｄＬ／ｇ以
上に維持される（すなわち、定常期において経過した発
酵時間から独立している）ことが判った。本文中で使用
される用語極限粘度数は後の本文中に記載される方法に
よって測定された単離されたエキソポリサツカリドの極
限粘度数を意味する。

定常エキソポリサツカリド生合成期における攪拌は、エ
キソポリサツカリド産生物の極限粘度数を意味の有るほ
ど減少させないように、均−媒体及びエキソポリサツカ
リド産生物の好気性生合成のために十分な酸素移動を提
供するのに十分な混合を与えるように制御することがで
きることが判った。前記の中程度の攪拌は、バイオリア
クターの設計を変更することにより、特に定常期におい
て使用される機械的混合及び／′又はガス吹込み（酸素
導入）を制御することにより達成することができる。前
記の中程度の攪拌技術は、慣用のじゃま板付タービン攪
拌バイオリアクターにおいて生ずるよりも激しくない混
合を起す。

本文中で使用される用語攪拌は、バイオリアクター内で
機械的攪拌機によって達成される混合及びガス吹込み（
酸素導入）によって達成される混合を意味することを明
確とすべきである。

エキソポリサツカリド生合成期は好気性なので、酸素は
ガス吹込みを通して酸素が生合成における制約要素とな
ることを防ぐのに十分な量で存在しなければならない。

言い換えれば、酸素の物質移動を達成するために、攪拌
は生合成のために必要な酸素が供給されるようにガスか
ら溶液に酸素を移動させるために十分な混合を与えなけ
ればならない。更に、攪拌は均一媒体を生ずるために十
分な混合を与え、これは通常媒体を通して反応物及び産
生物の均一分散を生じさせる。

本発明に基づく定常期における好ましい攪拌方法は、慣
用の平刃タービン攪拌翼より激しくない混合を起し、そ
してその結果酸素移動が攪拌！：５（混合装置）とは独
立したガス分散装置の助けによって行われるか、又はそ
の結果酸素移動が過剰圧力を用いてバイオリアクターを
運転することにより強められるか、及び／又はその結果
酸素移動がバイオリアクター内の液体中に吹込まれるガ
スの酸素富化を通して強められる、プロペラ又は水中翼
のような攪拌装置による。

本発明の方法によって産生され単離されるβ−１，３−
グルカン　エキソポリサツカリドは、十分に増大した極
限粘度数を有することによって、従来知られ且つ単離さ
れたβ−１，３−グルカン　エキソポリサツカリドに対
して改良されている。本発明の産生物の他の物理化学的
性質、すなわち分子量、ゲル強さ、変形及び圧縮性も都
合良く影響を受けていることが判った。ＩＩ（、、ＵＶ
及びＮＭＲスペクトル、比施光度及び溶解度を含む他の
物理化学的性質は、Ｗａｋｏカードラン産生物の物理化
学的特性と同様であることがわかυ、そしてカードラン
型、β−１，３−グルカン　エキソポリサツカリドであ
るものと一致している。

また、本発明のエキソポリサツカリド産生物の物理化学
的特性例えば固有粘度、ゲル強度および分子量について
の参考文献は単離されたエキソポリサツカリド産生物の
特性に言及するものであることを明らかにすべきである
。これら特性は、それ自体、産生ずべき産生物の品質の
指標として使用される。

本発明の新規でかつ改良されたβ−１，３−グルカン　
エキソポリサツカリドは、β−１，３−グルカン　エキ
ソポリサツカリドの従来知られた例と比較した場合低濃
度にて高い固有粘度および優れたゲル強度を示す高分子
量で、非イオン性で、熱ゲル化可能なポリマーである。

加えて、本発明の新規なエキソポリサツカリドより形成
されるゲルは、従来知られたカードラン型β〜１，５−
グルカン　エキソポリサツカリドよりのゲルよシ高い弾
性があシかつ優れている。

本発明者の発見よシ、中度攪拌の使用は、醗酵経過時間
（ＥＦＴ）とともに産生ずる単離されたエキソポリサツ
カリドの固有粘度を減少させないという主要な利点が生
じる。ばらつきなくす、ｏｄＬ／ｙよりも大きい固有粘
度をもつ本発明の産生物は、醗酵プロセスの後において
一度に再生することができる。このことは、プロセス経
済において意義ある改良となる、醗酵プロス中の所望産
生物の産生濃度増加を許容する。

単離されたβ−１，５−グルカン　エキソポリサツカリ
ド産生物の固有粘度増加に関する本発明者の発見は、経
過醗酵時間とともにまたはバイオリアクター設計による
醗酵プロス全体のレオロジー特性の変化に関する報告さ
れた他の発見と類似するものではないことに注目すべき
である（例えばＴ、　ＯｏｌｍａｎおよびＨ，Ｈａｒｖ
ｅｙ　、　”　Ｎ）ｎ−Ｎｅｗｔｏｎｉａｎ　Ｆｅｒｍ
ｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　＋、ＣＲＣＣｒ１
ｔ。

Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、、　４　、１５５．
１９８６　；　Ｒｅｕｓｓ等、Ｇｅｒｍ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　Ｅｎｇ、、　Ｊｕｎｅ、　２３３　、１９８２
　）。仙のいくつかのエキソポリサツカリド産生物、例
りはプルランとは異なり、本発明のβ−１，３−グルカ
ン　エキソポリサツカリドは、水に不溶であり、そして
従って醗酵プロス全体の粘度に顕著に影響を与えない。

可溶性ポリサツカリド例えばプルランにあっては、醗酵
プロスの粘度はエキソポリサツカリドの粘度に比例する
であろう。本発明は、β−１，３−結合を介して結合さ
れた線状連結グルコース残基からなり、かつ本開示に記
載された手順により測定して、少なくとも約ａ０ｄＬ／
ｇの固有粘度を有する、改良された、水に不溶で、ゲル
化するβ−１，５−グルカン　エキソポリサツカリドを
提供する。

本発明の他の面において、上記の新規産生物の産生のた
めの方法が提供される。該方法は、（ａ）二つの期、成
長期およびエキソポリサツカリド生合成の定常期におい
てβ−１，３−グルカンエキソポリサッカリドを産生ず
る微生物の株を培養すること、該成長期は同化可能な炭
素、窒素および無機塩を含有する好気的な、攪拌された
水性培地の中で行なわれ、該窒素の量は成長期の最後に
おいて培地が約２７℃ないし約３３℃の温度にてかつｐ
Ｈ約５ないし８にて、実質的に同化可能な窒素を含まな
いように制限され、該定常期は同化可能な炭素を含むが
、約２７℃ないし約３３℃の温度にてかつｐＨ約５ない
し８にて同化可能な窒素を含まない好気的な、攪拌され
た水性培地の中で行なわれ、定常期における攪拌は、均
質な培地を造るのに十分な混合と、産生ずべきエキソポ
リサツカリドの固有粘度を顕著に減少させることなく、
エキソポリサツカリド産生物の好気的生合成にとって十
分な酸素移動とを提供する。：Φ）こうして産生された
エキソポリサツカリド産生物をアルカリ処理でもって可
溶化すること。：および（ｃ）醗酵プロスからエキソポ
リサツカリドを単離させることよりなる。

本発明の方法は、公知のバッチまたは連続培養プロセス
を用いて遂行することができる（　Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ等
、　　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２９　
、　１５３１゜１９８３；　　Ｈ，Ｇ、Ｌａｗｆｏｒｄ
、Ｕ、８．Ｐａｔｅｎｔ　　４，５５５゜１０５　１９
８２年１０月１９日発行）。本発明の新規β−１，６−
グルカン　エキソポリサツカリドの産生は窒素枯渇バッ
チ培養の定常期の間に起きる。該方法は、最も好ましく
は、米国特許第４，３５３、１０６号に開示されたのと
同様な、二段階連続手順によシ行なわれる。本発明に従
って制御された攪拌および通気が、該プロセスの第二非
成長期に用いられる。

本発明の方法において使用されるβ−１，３−グルカン
　エキソポリサツカリドを産生ずる好ましい微生物株は
、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属およびＡｇｒｏ−ｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ属のものである。Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　
ｆａｅｃａｌｉｓ種のｍｙｘｏｇｅｎｅｓ変種の株が最
も好ましい。連続プロセスにあっては、Ａ、　ｆａｅｃ
ａｌｉｓの好ましい株はＡ、ＴＣＣ３１７４９およびＡ
ＴＣＣ３１７５０である。

Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用いたバッチまたは連続
培養にあっては、好ましい培養液は、ＡＴＣＣ２１６７
９である。

本発明のもうひとつの側面において、本発明者は、驚く
べきことに、β−１，３−グルカンエキソポリサッカリ
ドの産生（ｑｐ）の比速度が、定常期における溶存酸素
濃度（ＤＯ）を少なくとも２．０そしてより好ましくは
６．０ηＯｘ／Ｌの値に維持することによって、効果的
に増加することを発見した。本発明の中度攪拌技術に従
い実施したとき、産生物産生（ｑｐ）の比速度が、固有
粘度により測定されるように、産生されるエキソポリサ
ツカリドの品質を害することなく最大化しうることを発
見した。

本発明の新規改良産生物は、β−１，３−グルカン　エ
キソポリサツカリドを産生ずる微生物の株好ましくはＡ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍの培養液を培養することによって産生される。

バッチおよび連続培養方法は以前に記載されている（参
照Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ　４４．　　Ｃａｎ、　、Ｔ、　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２９　。

１３３１　、１９８３　：　Ｈ，Ｇ、　Ｌａｗｆｏｒｄ
、　　米国特許第１．５−グルカン　エキソポリサツカ
リドが、上記公報に記載されたように、窒素枯渇）くッ
チ培養の定常期の間に産生される。該方法は、２７℃な
いし３５℃、好まし５〈は３０℃にて行なわれる。

成長期は、最適ｐＨ＆８ないしＺ２、好ましくけ１０に
て行なわれ、一方エキソボリサッカリド生合成定常期は
、最適ｐＨ３、７ないし６．２、好ましくは５．９にて
行なわれる。

微生物は、同化可能な炭素、窒素および無機塩の源を含
有する好気的な水性培地の中で行なわれる。炭素源は、
グルコース、スクロース、マルトース、ラクトース、７
ラクトーヌ、キシロース、でんぷん加水分解物、グリセ
ロールおよびコハク酸やグルタミン酸のような有機塩を
含む、炭水化物の供給材料の広い範囲よシ選択すること
ができる。；最も好ましくはグルコースおよびでんぷん
加水分解物が使用される。同化可能な種々の窒素源は、
例えば蛋白質の酵素消化物（トリプトン、カゼイン加水
分解物、コーンスチーブリカー、酵母抽出液、大豆粉）
ｉたは窒素質無機化合物、たとえば塩化物、スルフニー
）ｔたはホスフェートのアンモニウム塩が用いられうる
。含有窒素の量は、成長期の最後にて、醗酵プロスが実
質的に同化可能な窒素を含まないようなものである。か
かる理由のために、アンモニウム塩の使用が好ましい。

なぜならば、同化可能な窒素の既知量をもつ窒素不足培
地を配合することができこれによって定常期において過
剰の炭素源をもつ細胞総量の制御を可能とするからであ
る。

本発明に従い、産生物をバッチまたは連続プロセスによ
シ産生するにしても、攪拌は、定常期において、均質な
培地を造るのに十分な混合と、醗酵経過時間とともに単
離産生物の固有粘度の顕著な減少をひきおこすことなく
、エキソポリサツカリドの産生のための好気的生合成に
とって十分な酸素移動とを提供するように制御される。

模範的な攪拌技術は、下記におよび実施例に記載する。

本発明の好ましい実施に従う通気は、下記におよび実施
例に記載する。

代表的なβ−１，３−グルカン　エキソポリサツカリド
を産生ずる微生物株を表１に掲げる。

しかしながら、ふたつの属Ａｌｃａｌ　ｉｇｅｎｅｓお
よびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの他の株も、所望のβ
−１，３−グルカン　エキソポリサツカリドを産生ずる
性質をもつ微生物を提供するような選択的培養または突
然変異によりあるいは遺伝子工学技術により得られると
理解すべきである。連続プロセスにあっては、Ａ、　ｆ
ａｅｃａｌｉｓの好ましい株はＡＴＣＣ３１７４９オよ
びＡ’ｌ’ＣＣ３１７５０テある。Ａｇｒｏ　−ｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍを用いたバッチまたは連続培養にあっては
、好ましい培警液は、ＡＴＣＣ２ｊ　６７９である。

表　　１ 本プロセスのβ−１，３−グルカン　エキソポリサツカ
リド生合成定常期における通気は、好筐しくに、プロセ
スが予想された培養液の酸素要求を満たすのに十分な水
準（それは約１，０岬０２／Ｌの濃度であるが）にて行
なわれた場合であろう比速度を越えてエキソポリサツカ
リド産生（ｑｐ）の比速度を増加するために、少なくと
も約２．０　Ｗ　Ｏ，／Ｌそしてより好ましくは少なく
とも約６．Ｏｙａｙ　Ｏｚ／Ｌの溶存酸素濃度（ＤＯ）
ｔ−維持するように、他の全ての操作条件全同一にして
、産生嘔れるエキソポリサツカリド産生物の品質を害す
ることなく行なう。最大のｑｐは、般にＤＯ＝ｉ少なく
ともｔｓ　ｓ　ｍｙ　０２／Ｌの値に維持することによ
って達成される。

プロセスが誘導されるＤＯ＝ｉ計算するために、ガスか
ら液体（ＯＴＲ，）への酸素移動速度とＤＯの相関関係
を理解することは重要である。気泡サイズを小キくシ、
それによりガス及び液体相関の界面面積の増加で物質移
動を改善すべく攪乱及び剪断を増強することによってＯ
ＴＲが増加し得ることは一般的に理解さねている。しか
しながら本発明者らにより発見されたように・慣用され
ている阻流板の付いたタービン攪拌バイオリアクター（
ｂａｆｆｌｅｄ　ｔｕｒｂｉｎｅ−ａｇｉｔａｔｅｄ　
ｂｉｏ−ｒｅａｃｔｏｒ　）で起こる激し攪拌は産生物
量を減らす結果となり、それ故ガス分散を改善する代わ
りの手段が用いられる。一般に、多孔質物質たとえば焼
結ガラス、セラミックス又はステンレススチールのよう
な多孔性金属物質の吹付は器（ｓｐａｒｇｅｒ　）　　
を通してガスは導入さｎる。ＯＴＲを改善するために、
酸素にとっての物質移動係数（ＫＬａ　）は吹付は速度
（ｓｐａｒｇｉｎｇ　ｒａｔｅ）及び液体の粘度ならび
に特に用いられた攪拌／混合のタイプにより影響を受け
るけれども、溶解酸素濃度は通気ガス中の酸素分圧（Ｐ
ｖ）、圧力、温度及び液体の化学組成に影響てれるとい
うことを認めなければならない。

酸素移動速度は次の関係： ＯＴＲ＝　Ｋｒ、　ａ　（ｃ”　　Ｃ）〔式中、 ＫＬ　ａ　＝−酸素物質移動係数（時間の逆数単位）Ｃ
＊＝飽和時の溶解酸素濃度 Ｃ＝観測された溶解酸素濃度　　　　　　〕で定められ
る。

酸素吸収速度（０ＵＩ（）又は培養の酸素要求量は次の
関係： ０ｔＪＲ＝ｑｏ２〔Ｘ） 〔式中、 ｑＱ２＝比呼吸速度（単位０２量／単位乾燥バイオマス
／単位体積） 〔Ｘ〕＝バイオマスＢ度又は培養セル密度（単位乾燥バ
イオマス／単位体積）〕 で表わされる。

本発明のプロセス中、ｏｕｈは測定できる。窒素限定培
養のセル密度（Ｘ）は醗酵媒体に加えられる同化性窒素
の量により定まる。エキンボリサッカリド産生期又は定
常期中の呼吸速度（ｑ　ｏ、、　）は二つの構成分、維
持呼吸およびエキソポリサツカリド生合成のために必要
とされる発生エネルギ（ＡＴＰ　）に係る呼吸から成っ
ている。もし酸化的ホスホリル化に係るＰ２Ｏ比が２．
０であるならば維持エネルギー所要量に関連する呼吸要
求量は、３２乾燥ｗｔ／Ｌ　（ｐＨ＝　５．９　　Ｔ＝
　５０°）のセル密度での定常期窒素不足培養のＯＵＲ
が８．１　ミリモル０２／Ｌ−ｈｒ　（２５９ＷＯ２／
Ｌ−ｈｒニ同じ）として測定された時のポリマー産生定
定期培養の総呼吸速度の約９０％を表わすということが
予測濱れてきた（測定に関しては、Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ及
びＬａｗｆｏｒｄの　”Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ、　２９．１２７０゜１９８３年、参照）。それ
故、類似の条件下では培養のＯＵ　Ｒは比呼吸速度（２
，７ミリモルＯＶタセル・ｈｒ）と培養セル密度を積算
することにより見積ってよい。

ＯＴＲは、攪拌／混合装置のタイプ及びサイズ、内部パ
フリング（１ｎｔｅｒｎａｌ　ｂａｆｆｌｉｎｇ）の使
用、攪拌器の回転速度、ガス吹付は速度及びリアクター
へのガス導入手段を含むバイオリアクターの幾何学的デ
ザイン金倉めた、プロセス操作における多くの独立した
変数に影響される。バイオリアクターに何如なるデザイ
ンが与えられるにしても、ＯＴＲはクーパーら（ｃｏｏ
ｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）によるＩｎｄ、　Ｅｎｇ、　
Ｃｈｅｍ第５６巻第５０４〜５０９頁、１９４４年に記
載されている操作に従い、第二銅イオンを触媒として用
いる亜硫酸酸化の標準的化学方法を用いて見積ることが
できる。該方法は物質移動係数につき醗酵媒体の化学組
成の影響を考慮に入れない。後記するように、ＯＴＲと
攪拌スピード又は空気吹付は速度との関係は三つのりア
クタ−デザインについて実験的に確立てれている。これ
らの関係は攪拌及び通気に係る様々な操作条件下での与
えられたリアクターデザインのＯＴＲｉ予測することを
可能にする。

隔壁の付いた平底ガラスリアクター中の中央シャフト上
にラッシュトン型（凡ｕｓｈｔｏｎ−ｔｙｐｅ　）平刃
タービン羽根を備えているニー−ブランズウィック　サ
イエンティフィック　マルチゲンＦ　２０００リアクタ
ー（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　５ｃｉｅｎｔｉ　−
ｆｉｃ　Ｍｖｌｔｉｇｅｎ　Ｆ２０００　ｒｅａｃｔｏ
ｒ　）にとって、空気吹付は速度α３３Ｖ／Ｖ／Ｍでの
０ＴＲ（ミリモル０２／Ｌ　−ｈｒ　）と攪拌スピード
（ＫＰＭ　）の関係はおよそ ０ＴＩ（、＝９９．２＋α２１（攪拌スピード）である
。

７ｃｍ船舶型（ｍａｒｉｎｅ　ｔｙｐｅ　）　　プロペ
ラを備え、５００　ＫＰＭ及び焼結ガラスディスクを通
す吹付は空気で操作される変更丸底二ニー　プランズウ
ィック　サイエンティフィック　マルテゲンＦ　２００
０　　リアクターにとって、その関係はおよそ ＯＴＲ二２．６　＋　１６５．２　（空気吹付は速度）
である。

最後に、これと同じで６０ＯＲＰＭのプロペラスピード
で操作される変更ニュー　ブラズウィック　サイエンテ
ィフィック　マルチゲン　Ｆ２０００１、Ｊアクタ−に
とって、その関係はおよそ０ＴＲ＝　１２ｉ　＋　１５
６．５　（空気吹付は速度）である。

酸素溶解性に影響を与えている主ファクターは培地を通
して吹付けられる酸素分圧〔時々、酸素テンシｑ　７　
（ｏｘｙｇｅｎ　ｔｅｎｓｉｏｎ　）といわれる〕、温
度及び培地中の溶質である。

溶解酸素の飽和濃度は次の関係： Ｃ”＝ＨＰｒ 〔式中、 Ｐ／はガス相の酸素圧（ａｔｍ） Ｈはヘンリーの定数（ｑ／Ｌ　−ａ　ｔｍ　）で温度に
よって変わり、そして Ｃ＊＝酸素の飽和濃度　　　　　　　　　　〕で与えら
れる。

Ｔ：３１：ｌ’ｃ、Ｈ＝　３６．１　ｑＯ，／Ｌ　−ａ
ｔｍ　テＣ”　＝７．５　ｓ　ｍｙ　０２／Ｌ　Ｔ　ｈ
　ル。

下記実施例中に示されているように、β−１゜３−グル
カンエキソポリサッカリド産生の最大比速度（ｑｐ）と
して、ＤＯは約６．８岬０□／Ｌよりも大きくなるべき
であり、それは３０℃（非過圧）での水中の空気につい
ての飽和値７．５５■０２／Ｌの９０％である。

吹付はガスとして空気が用いられ、そして背圧又は過圧
なしでバイオリアクターが操作される場合、９０％飽和
のＤＯ＝ｉ維持するためにＯＴＲ値はＯＵＲ値の約１０
倍であるのが好ましい。

この関係は次のように表わされる： ０ＴＲ＝　１ｏ（ＯＵＲ）＝１００）ｑｏ２定常期のＡ
、　ｆａｅｃａｌｉｓ　ＡＴＣＣ３１７４９にとっての
ｑｏ２値は８６６■０２／２セル・ｈｒであることが測
定された。

ＯＵＲ同義因子（ＯＵＲｒｎｕｌｔｉｐｌｅ　ｆａｃｔ
ｏｒ　）は次式 を用いて誘導することができる。

吹付はガスが空気中に通常存在する量（すなわち２０．
９％Ｏｘ）よりも多い酸素を含む場合或はバイオリアク
ターが背圧で操作されるならば、要求されるＯＴＲは少
なくなり、そしてこの同義因子は１０よりも小さいとい
うことに注意すべきである。例えば０．０５　Ｋ９／ｃ
ＷＬ２（０，７１ｐｓｉｇ　）の背圧で、ＣＩは７．９
１　ｊｖＯ２／Ｌであり、それで６．８■０２／ＬのＤ
Ｏは飽和の８６％のみに等しく、そして最大工キンボリ
サッカライド産生のためのＯＵＲ同義因子は７．１３で
ある。

もし吹付はガスが酸素に富んでいるのであればＯＴＲ所
要量は比例して少なくなる。もし３０％０２で酸素に富
んだ空気が導入された場合（リアクター上に背圧なしで
）、ＣＩは３０℃で１０８３■０２／Ｌとなるはずであ
り、それで６．８のり。

は飽和の６３％のみに等しくなるはずである。

そのような環境では、好ましいＯＴＲはＯＵＲの２７倍
となるであろう。酸素に富んだ空気は戻酸素供給器（ｍ
ｅｍｂｒａｎｅ　ｏｘｙｇｅｎａｔｏｒｓ　）で産生で
き、通常２５〜３５％０２の濃度範囲の酸素に富んだ空
気を供給するということを当業者は理解すべきである。

め１りにも高くシｆｃ豊富値は細胞の機能に有害である
か抑制的となる。

吹付はガス中の酸素分圧および全圧の関数としてのＤＯ
（ｉｉ＝ｉ計算するために、過圧が１気圧を越えるＫｑ
ｌ譚２として測定され次場合：ＤＯ＝Ｈ（特定Ｔで）　
Ｐｙ　＋　（−０，１２９＋　′！、４．７７ＰＰＸ過
圧）。

上記の関係から、本発明に従って増加の又は最大のエキ
ソポリサッカライド産生速度を達成するために、操作に
あたって用いられる他の操作条件が与えられた時のＯＴ
Ｒ又はＤＯｉ計算することは可能である。

０ＴＩ（と０Ｕ）Ｌについての上記関係に基づき、酸素
供給ｉ１　（ＯＴＲ）と培養の酸素要求量（０ｔＪＲ）
が平衡を保っている時には、次の関係が保たれる： ＫＬａ（ｃＩ−Ｃ）＝ｑｏ２〔Ｘ〕 亜硫酸酸化による′ｍ素移動速度の測定において、ＯＴ
　Ｒ＝Ｋ　Ｌ　ａ、　Ｃ”であるので、温度、圧力及び
液体の化学組成の特殊条件下で、Ｃのために方程式を次
のように決め得る。

Ｃ＝　Ｃ”　（ｉ　−ｏｕｈ１０’ｒ几）このようにも
しＯＵ　Ｒと０Ｔ）Ｌの両方が知れたなら、誰でもＣ又
はＤＯ値、観測される溶解酸素濃度全計算することがで
きる。

β−１，５−グルカンエキソポリサッカリド産生菌株の
培養はノ（ツテ又は連続プロセスで行なうことができる
けれども、このステップは好ましい二段直列連続プロセ
ス（ｔｗｏ−ｓｔａｇｅ　ｃａｓ　−ｃａｄｅ　ｃｏｎ
ｔｉｎｕｏｕｓ　ｐｒｏｃｅｓｓ　）に関して更に詳細
に今となっては述べられるであろう。そのようなプロセ
スのよシ詳しい説明は米国特許第４ｊ　５３、１０６号
明細書に見ることができるけれども、しかしながら該プ
ロセスの第二及び定常期は高固有粘度の新規エキソポリ
サツカリドを産生ずるために本発明に従い変更される。

二段連続プロセスの図式的表現は第１図に示されている
。第一および第二定容量醗酵槽１０及び１２は連絡して
操作される。無機塩培地は貯槽１４からポンプ１６を通
して一定速度で第一醗酵槽１０にポンプ輸送される。培
地は同化性炭素および窒素を、微生物によりその成長の
ために必要とされる他の栄養素および無機塩とともに含
んでいる。無機窒素は、成長を限定する量で含まれてい
るけれども、他の必須成長元素は過剰に含まれている。

第一醗酵槽１０は約３０℃、ｐＨ７で充分な混合と通気
によって操作てれる典型的な現行技術水準の恒成分培養
槽（ｃｈｅｍｏｓｔａｔ　）である。例えば作業容量３
４０　ｍｌの醗酵槽は攪拌６０Ｏｒｐｍおよび通気速度
４７０　ＣＣ／分で操作することができる。第一醗酵槽
１０は、醗酵槽からの排出液（ｅｆｆｌｕｅｎｔ　）中
の殆んど取るに足らない無機窒素で最大ノくイオマス生
産性を達成すべく希釈速度で操作される。

第一醗酵槽１０からの排出液は、第二段階醗酵槽１２へ
直接供給され、そこではノくイオマスが所望のエキソポ
リサツカリドを合成する。第１図は、産生されるエキソ
ポリサツカリドの固有粘度を有意には減小させない適度
の攪拌によって操作することのできる模範的な醗酵槽タ
イプを示している。図示されているように、醗酵槽の底
は丸くなっており、攪拌は、ガス分散と酸素移動全良好
にするため回転プロペラの下に直接置かれた焼結ガラス
ディスクスパージャ−２２全通して空気を導入しながら
単一船舶型ステンレススチールプロペラ２０で行われる
。

そこから微生物が所望のエキソポリサツカリド生成物を
合成することができる、窒素を含まない無菌のグルコー
ス溶液は、攪拌された保持タンク２４から、ポンプ２６
を通して連紛的に供給される。さもなければ、余分のグ
ルコースを、第一の７アーメンター１０に溢れ出させる
ことができ、そこから、さらに第二の７アーメンター１
２に溢れ出させることができる。排出用堰３０に連結さ
れ念連絣的に操作てれるポンプ２８は、第二の７アーメ
ンター１２内の容量を一定に維持する。第二の７アーメ
ンター１２内での容量及び希釈率は、第二段階の生物の
滞在時間が、生成物の合成に関するバッチ培養液の能力
が最大となる時間の長さの最大限に等しくなるように決
定される。グルコースはエキソポリサツカリド合成に使
用される速度を超えない速度で添加される。第二段階の
ｐＨは、最も好筐しくけ約５．９であり、温度は約３０
℃である。

第二の７アーメンター１２の排出液からの生成物の回収
は、公知方法（参照：　Ｈ，Ｈａｒａｄａ　ｅｔａ　１
．　、　Ｊ、　Ｆｅｒｍｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌ　、　
４６．６７９−−６８４．１９６８）により達成されう
る。エキソポリサツカリドは、位置に関しては細胞外に
あるが、通常は、不溶の物質を除去するための通常の分
離技術、例えば遠心分離及び濾過によりバクテリアの細
胞塊と所望のエキソポリサツカリド生成物の両方を除去
しうるような形式で、細胞表面に付着している。エキソ
ポリサツカリド生成物は有効に細Ｆ！を表面から分離さ
れ、アルカリで処理することにより溶解させて細胞の除
去を可能とする。その後、酸で中和した後、醗酵プロス
から単離する。単離したエキソポリサツカリド生成物を
洗浄して、それに付着した全ての塩を除去する。

塩は、生成物の固有粘度の測定に影ｑ！ｉを及ぼしうる
。一般的に蒸留水または脱イオン水で数回の洗浄が行わ
れる。別の公知の単離技術は、Ｋｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａ
ｌ、　ｉｎ合衆国特許４７５４．９２５号に記載されて
いる。

単離されたβ−１，６−グルカン　エキソポリサツカリ
ドは、広く知られている方法、例えば噴霧乾燥、凍結乾
燥及びアセトンまたはイソプロピルアルコールのような
非極性有機溶媒での脱水法等を用いて脱水することによ
り保存されうる。

本発明のβ−１，３−グルカンエキソポリサッカリド生
成物は、少なくとも約６．ＯｄＬ／ｒの固有粘度を有す
る。本発明の生成物は、高°＜、経済的な収量の生成物
を得るために、一般的に少なくとも約４８時間の醗酵経
過時間（ＥＦＴ　）の後に単離される。バッチ方法にお
いては、この４８時間のＥＦＴは、固相の開始から測定
される。

しかしながら、連続的な方法においては、４８時間のＥ
ＦＴは、少なくとも４８時間の固相中の滞留時間を意味
する。

新規なβ−１，３−グルカンエキソポリサッカリド生成
物の物理化学的性質は、明らかに異なり、特にＷａ　ｋ
　ｏカルトラン製品とは異なり、第２表に示される。測
定は、下記の方法に従って実施される。

第　　２ 表 Ａ、ｆａｅｃａｌｉｓ　　ｖａｒ。

２．３ ｍｘｙｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ３１７４９ Ａ、ｆａｅｃａｌｉｓ　　ｖａｒ。

１．９ ｍｘｙｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ２Ｍ６８０ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｔｕｍ ＆４ ２．３ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ ＡＴＣＣ２１６７９ 賛より高い平均値が得られた板小値 新規な生成物から製造されたゲルは、下り己に記載した
ように、７０％より太きい歪み測定値、及び５０ｔ’／
ｍよシ大きい圧縮率／剛性を有する。

比較の目的のために、ＷＡＫＵカルトラン製品の以下に
記載した同じ方法を使用した物理化学的性質は下記のと
おりである。

固有粘度　　４．０−５．　ＯｄＬ／？ゲル強度　　５
００−７５［’／１α２洲分子量ＣＬ８−１．２×１０
　　ダルトン圧縮率　　　＜　５０　ｒ　／ｒｒｒｍ歪
　　　　　　　　く７０％ これらのＷａｋｏカルトラン製品のための測定値を従来
のカルトラン様生成物に対する報告された文献値と比較
するのは、測定値には異なる技術及び条件が作用するの
で難しい。Ｑｇａｗａｅｔａｌ、、　Ｃａｒｂｏｈｙｄ
ｒａｔｅ　Ｒｅｓ、　２３．３９９．１９７２゜には、
ＰＳ−１５１４０（Ａ、　ｆａｅｃａｌｉｓ　ｗａｒ＋
ｍｘｙｏｇｅｎｅｓ菌種、ＩＦＯ１３１４０，ＡＴＣＣ
２１６８０の生成物〕の固有粘度が、Ｕｂｂｅｌｏｈｄ
ｅ　−’ｒｙｐｅ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ粘度計を用いて３
０℃で、そして０）ｉ−＞α２５Ｎの濃度で測定して約
五５ｄＬ／ｆであることが記載されている。合衆国特許
第３，７５４，９２５号のＫｉｍｕｒａ等のゲル強度技
術は、本発明に記載された技術とは実質的に異なり、値
の比較を困難にしている。分子量の比較はある程度行う
ことができる。

原因等、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、　１２４．１９２゜１９６８には、グルコース単位
の分子量１６２の値から、分子量２１，８７０ダルトン
に対応する重合度、ＤＰｎ、１３ｓ　　が報告されてい
る。８ａｉｔｏ　ｅｔａｌ、、　Ａｇｒ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ、、　３２．　１２６１．　１９６８゜によ
るデータから同様に計算することにより、２１、８７０
ないし７３，７１０ダルトンの分子量が得られる。Ｋｉ
ｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　　合衆国特許第３、７５４
，９２５号によシ彼等の報告したＤＰｎ値から４０，５
００ないし７９．３８０ダルトンの分子量が得られる。

他の比較される物理化学的特性を下記の＠Ｔ、２人表に
示す。

第２Ａ表 試験 ＷＡＫＯ本発明の生成物 製品 赤外線 スペクトル 比旋光度 〔α〕Ｄ２５ 圓スペクトル ｆ８解度 水（ｐ）ｉ＝７） １）ＭＳ（Ｊ エタノール 同様の■几スペクトルが得られ、 下記の波長（ｃｍ）に顕著な吸 数帯が見出された。

３６００−５２００．２９５０−２９００．１６４０゜
１４２０、１３６５．　１３１０．　ｊ２６０，１２０
０゜１１６０、　ｔ１２０．１ｔ００．１ｏａｏ、１ｏ
７ｏ。

１０４０、１０２０．９８０．８９０ ＋１７°　±５°　＋２０°±５°″ ＵＶ吸収は実質的になかった 不溶　　　　不溶 浴 溶 不溶　　　　不溶 Ｃ核磁気共鳴　　下記の顕著な吸収を示すスペクトル（
Ｎ、Ｍ、Ｒ）同様のスペクトルが得ら（ｉｎ　ＤＭＳＯ
，ｐｐｍ）　　れた。（δ、ｐｐｍ）８７（ｃＩ）、７
７（ｃ３）、７３（ｃ５）、５６（ｃ２）、３９．５（
ｃ４）、２２．６（ｃ６）償比旋光度の値は試験片によ
ってかなり変化する。この値はＡＴＣＣ２１６８０によ
り生産された生成物について測定した。しかしながら、
ＡＴＣ（４１７４９かもの濁った検体は＋２９°の値を
与えた。ＰＳ−１３１４Ｑに対して、合衆国特許第へ７
５４，９２５号は、＋３３°±６°　の値を報告してお
り、Ｈａｒａｄａ等は＋１８°の値を報告をしている。

上記の測定に与えられる値は一貫した技術を用いない限
り、かなり変化しうるので、使用した測定法を下記に詳
細に記載する。

本発明の生成物全含有する組成物においては、特足のゲ
ル強度を達成するのに費求される生成物がより少なくて
すむため、本発明の生成物の高いゲル強歴、剛性及び圧
縮性の値は経済的にかなり重要である。エキンボリサッ
カリドから生産されたフィルム生成物において、より高
いゲル強度及び剛性の値は、改良された、よシ強いフィ
ルム特性を得る結果にもなる。他の利点は高い固有粘度
、即ち改良された稠度に関係する。固有粘度における顕
著な低下は生じないので、再現性のある物理化学特性を
有するエキソポリサツカリド生成物を単離することが可
能である。

固有粘度測定は、２５℃（＋／−α１℃）で、ａＳＮの
Ｎ　ａ　０１−１中、ＣＬＯ２〜α０５Ｘ（乾燥重量／
容量）の範囲で、塩を含まない（何度も水洗して）検体
の希釈溶液に対して行われる。使用される装置は、トロ
ント大学のＰｒｏｆ、　Ｊ、　Ｇｕｉｌｌｅｔ　により
設計され、Ｋ１１ｐ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｒｅｖ、　Ｓｃ
ｉ、　Ｉｎｓｔｒｕｍ。

４７、　１４９６．１９７６に記載され、Ｅｃｏｐｌａ
ｓｔｉｃｓ　Ｌｔｄ　。

ｏｆ　Ｗｉｌｌｏｗｄａｌｅ、　０ｎｔａｒｉｏ、　Ｃ
ａｎａｄａにより製造されたＵｂｂｅｌｏｈｄｅ−ｔｙ
ｐｅ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ粘度計である。

装置はポリマーのみに起因する溶液中の生成物の粘度の
増加を決定する。（誤差範囲Ｑ、０５％）。

分子量の決定は、サイズ排除ゲル浸透クロマトグラフィ
（ＧＰＣ）によシ行われる。装置は、各々３０ｃｒｎ及
び６０ｃｍの長さを有する連続した二つのスフェロゲル
ＴＳＫカラム１７．５咽ＩＤ、（Ｂｉ。

−ｆ％ａｄ　Ｌａｂ　Ｌｔｄ、、　Ｍｉｓｓｉｓｓａｕ
ｇａ、　（Ｊｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）からなる。

生成物の検体（αｌＮＮａＯＨ中の０．０５％、４０℃
〕を、１ｄ／分の一定速匠でカラムを油して汲み上げ（
Ｒｅｃｋｍａｎ　ｍｏｄｅｌ　１１０Ａ溶媒ポンプ）、
Ｗａｔｅｒｓ　Ｍｏｄｅｌ　ａ　１０示差屈折計（Ｗａ
ｔｅｒｓ。

Ｍｉ　Ｉｆｏｒ　ｄ、Ｕ、Ｓ、Ａ）を用いて検出する。

クロマトグラムｌｒＪ、、５ｐｅｃｔｒａ　Ｐｈｙｓｉ
ｃｓ　ｄａｔａ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｓｙｓｔｅｍ　
（Ｂｉｏ　−Ｒａｄ　Ｌａｂ　Ｌｔｄ、　、　Ｍｉｓｓ
ｉｓｓａｕｇａ。

０ｎｔａｒｉｏ、　Ｃａｎａｄａ　）により特定される
。ポリマースタンダードは、１へ０００ないし１．０６
０．０００ダルトンの範囲の分子量を有するポリスチレ
ン訪導体（Ｗａｔｅｒｓ、　１ｕｌｉｌｆｏｒｄ、　Ｍ
Ａ及びＰｒｅｓｓｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　
Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、　Ｐｋ）でめる。目盛測冗は、
溶離時間と分子量の対数との関係を調べることからなる
。

ゲル強度測定は、生成物に標準的なホモジネ−ジョン及
びゲル化工程を行った後に行われる。

水中の生成物の１．５％懸濁液を準備し、ボＩＪ　）ロ
ン５鰭プローブ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ　）で屋５にセット
し３分間ホモジナイズする。この懸濁液のアリコート５
履ｌを、パイレックスの試験管（ＩｎＩ３酎）に移し、
１５秒間渦巻かせる。試験管を９５℃の水浴中に１０分
間浸漬して、熱ゲル（ｔｈｅｒｍ。

−ｇｅｌ）ｋ形成し、その恢、冷水浴中で１０分間冷却
する。その仮、生成ｖＩＪを試験管から除去し、ゲルの
長平方向に沿って１ｌｌｆｉ　１０　ｔｒａｎの試験片
に切る。その故、ゲル試験片ｆ　Ｉｎ５ｔｒｏｎ　Ｃｏ
ｍｐｒｅｓｓｉｏｎ’ｌ”ｅｓｔｅｒ及び直径６６覇の
アンビルを用いて圧縮する。ゲル強度の試験パラメータ
ーを下記に示す： ゲージ長さ（簡）　　　　　　　　１１．０クロスヘツ
ドスピード　　　２α０ チヤートスピード（ａ／分）　　２００．０サイクル（
圏）９０ ゲル強度は、圧縮の間にゲルを破壊するのに賛する力と
して測定する（り／１［１２６Ｔ４）。

歪み（％〕及び圧縮率または岡す性（Ｐ／ｍｍ）を、上
記のゲルについて測定する。歪みの測定のためには、ゲ
ルが破壊する点において変形される程度を、ゲル強度イ
ンストロンチャー）　（Ｉｎ５ｔｒｏｎ　ｃｈａｒｔ　
）から計算する。ゲル濃度インストロンチャート圧縮率
／剛性は、カーブの上昇点の勾配から計算する。

〔実施例及び発明の効果〕

本発明を下記の実施例によりさらに詳細に説明する。

実施例１ 本発明に従って、第一にバクテリア培養で産生されたエ
キンボリマーのへ品質／Ｉ（経過発酵時間、Ｅ　Ｆ　Ｔ
の関数としての単離されたβ−１，３−グルカンエキソ
ポリサッカリド生成物の固有粘度により決定されたもの
〕及び第二に）、ＦＴの関数として産生されたβ−１，
３−グルカンエキソポリマーの１品質〃（すなわちβ−
１，３−グルカン産生の軸矩の速！、（１，）について
通気及び攪拌の両方の合わせた効果を説明するためＫこ
の実施例は包含される。

第一の発酵は、カードラン型生成物を製造するのに従来
使用したものと類似の慣用のバックルタービン攪拌バイ
オリアクターを使用した。

第二の発酵工程は、最上部のタービンインペラのうちの
２つを１個の船舶型プロペラと取り換えた後に上記の反
応器を使用した。本発明に従って第三の発酵は１個の船
舶型のプロペラで攪拌される丸底発酵器を使用した。

７４リツプス等（ｃａｎ、　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、　２９゜１３３１、１９８３年）の変性された範囲の
定まった無機塩媒体（Ｍ　８　Ｍ　）を全ての発酵に使
用し、そして以下のものを含有させる。：　ＫＨ２ＰＯ
４（１２，８ｍＭ　）　；　Ｋ２ＨＰＯ４（２，８ｍＭ
、　）　；　Ｎａ２８（Ｊ４　（２，９ｍＭ　）　；Ｆ
ｅＣｌ３−６Ｈ２０（９０μＭ）　；ＣａＣＪ２−２Ｈ
２０（１ｏ。

μＭ）　；ＭｇＣｌ２−６Ｈ２０（ｔ２５ｍＭ）　；Ｍ
ｎＣｊ！２　・４Ｈ２０（５０μＭ）；クエンｆｌｐ　
（１，０ｍＭ）及び泡防止剤としてポリプロピレングリ
コール２０２５　（１１ａｔ／　Ｌ　）。

同化可能な窒素（成長のための唯一の窒素源は塩化アン
モニウムである。）に関する成長収量係数（ＹＮ）は約
２２ＤＷセルフ　ｙ　ＮＨ４ＣＩであることが知られて
いる（フィリップス等、Ｃａｎ。

Ｊ、　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、　２９．　ｊ３３１．１９
８３年）ので、２゜イオマスの所望のレベルは通常２８
ｍＭであり、約５２／Ｌのセル密度（乾燥重量に基づい
た）を生じるＮＨ４Ｃｌの添加量により決定される。炭
素源はＤ−グルコース（ｓｏｙ／Ｌ）であり、そして別
々に滅菌されている。ガラス蒸留水を１史用し、そして
発酵培地の滅菌は１２１℃でオートクレーブすることに
より達成する。

アルカリゲネスフェカリスＡＴＣＣ３１７４９ｉ有する
バッチ発酵は標準もしくは慣用の設計の攪拌タンクバイ
オリアクター（ＵＳＡ、　　ＮＪ。

Ｅｄｉｓｏｎ、　Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　５ｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、で製造され７’（ＭｕｌｔｉＧ
ｅｎ　ｍｏｄｅｌ　Ｆ　２０００）中で実施し、そこに
おける撹拌／混合は液体容量範囲内に等距離で配置した
多くの部分から成るラッシュトンタイプ平羽根タービン
インペラ（３）　（ｍ　Ｌｆ＝　４．９ｃｍ）が付いて
いる回転する中央のシャフトによシ遅戚する。底の平ら
なガラス反応容器（直径１１０）をゴム裂ヘッドプレー
トに取り付けた３枚の平羽根で区切り、それは約１５０
０＋ｄの作動容量を有する。攪拌速度は成長期間にＶｉ
６００ＫＰＭに調整し、そして発酵のポリマー産生期に
は８５０　ＲＰＭに増加させる。培養は中央が空洞のシ
ャフトの底に配置した小さな穴を通して存在しているα
３３　Ｖ／Ｖ／Ｍに相当する一定速度５００ｃｃ／分で
空気を噴出する。

ｐＨはインゴールドコンビネーション（滅菌可能な位置
にある）を極によりモニターされ、そして滴定標準ｇ　
（２Ｎ　ＫＯＨ）　′ｆｃ添加することにより一定のｐ
Ｈ値に調整される（　ＮＢＳモデルｐＨＡＯ調整器）。

ｐＨは成長間には７．０で一定に維持し、そして定常期
（すなわち成長が停止したとき）が開始したとき、５．
９に調節する（　ｐＨ調整器を使用してＩＮＨＣ４で行
なう。〕。

発酵を通して温度は５０℃に維持する。

上述の条件下で第二発酵を行なうが、バイオリアクター
は船舶プロペラ（直径４．６σ〕を備えた３枚の平羽根
タービンインペラの最上部のうちの２枚を置き換えるこ
とにより変更する。

発酵全期間を通してシャフトは７５０　ＲＰＭの一定速
度で回転させる。

第三発酵においては、本発明の一態様に従って、Ａ、フ
ェカリスＡＴＣＣ３１７４９を変更したＮＢＳ　Ｍｕｌ
ｔｉＱｅｎベンチトップ発酵器（ｍｏｄｅｌＦ２０００
　）中で行なうこと以外は上記と同様に培養する。ガラ
ス容器（直径１１−）の底を丸くして、そして上部の速
度を変えうるモータードライブにより撹拌／混合全調整
するためにゴム製のヘッドプレートに取り付けた密封し
たベアリングを通って容器を貫通しているステンレスス
チール（ＳＳ）シャフトにより攪拌は達成される。直径
ＺＯｃｒｎの１個の船舶型Ｓ８プロペラ（ＵＳＡ、シカ
ゴのＣａｆｅ　Ｐａｒｍｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｌｃ　
Ｃ。

製）を固体８Ｓシヤフトの底に取り付け、そして容器の
底から約４６ｎ上部に配置する。成長期間にはプロペラ
全６００几ＰＭの一定速度で回転させるが、成長が停止
した後は５００凡ＰＭに減少させる。良好なガスを分散
し、セして散累を運ぶ九めに回転しているプロペラの下
で直接配置されている焼結ガラスろ過日形噴出器（直径
３０℃、穴のサイズ１０−１５μｍ）を通して培養物Ｋ
　５００　ｃｃ／分（（１５３Ｖ／Ｖ／Ｍ　）　ノ速ｅ
テ４人すれたろ過した空気を通気する。

発酵プロスからエキソポリサツカリド生成物を回収する
ために、等容量の発酵プロスと０．６Ｎ水酸化ナトリウ
ムを一緒に添加し、そして２０−３０分間攪拌する。バ
クテリアの細胞塊を約１０．０００ｘｆで１０−１５分
間円心分離することにより懸濁液から除去する。細胞を
含まない上澄液を流し去り、そして４Ｎ酢酸で（一定に
攪拌しながら）ｐＨ７に中和する。

エキソポリサツカリドｆｌｐＨ７で自由な不溶性のゲル
を形成し、そして約ＩＱ、０００Ｘｆで１０−１５分間
遠心分離することにより懸濁液から除去する。回収工程
間に形成した塩を除去するためにゲルペレットを再懸濁
／遠心分離を繰り返して（通常３回）完全に洗浄する。

単崩した塩を甘まないゲルを湿ったゲルとして４℃で保
持する。その代わりとして該ゲルを当業者に公知の数種
の脱水方法、例えばアセトン脱水、凍結乾燥もしくは噴
霧乾燥により乾燥状態で保持する。

各々３回の発酵工程中、発酵プロスのサンプルを数回経
過発酵時間（成長が停止したとき、定常期の開始から時
間ゼロを測定する。）でバイオリアクターから除去し、
そしてβ−１，３−グルカンエキンボリマーを回収する
ために上述したように加工する。各サンプルの固有粘度
全測定する。結果を表２に示した。各発酵試験において
、触媒として銅イオンを有する亜硫酸酸化を使用して標
準化学方法によりＯＴＲｉ決定する（　Ｃ，Ｍ、　Ｃｏ
ｏｐｅｒ等著、Ｉｎｄ、　Ｅｎｇ、　Ｃｈｅｍ、　５６
゜第５０４−５０９頁、１９４４年）。撹拌及び通気に
関してバイオリアクター設計中で（ｉ）エキソポリマー
製造の物足の割合（ｐｑ　）及び固有粘度及び分子ｉｔ
（ＭＷ）で判断されるような回収されたエキソポリマー
の１品質〃上の変化の効果は最後の実施例に包言される
表３中に要約した。

ラッシュトン型の平羽根タービンインペラで行なった発
酵は、最上部のタービンインペラの代わりに１個の船舶
型プロペラヲ後で取９付けた場合でさえも、エキンボリ
サッカリド生成物を産出し、その固有粘度は経過発酵時
間と共に著しく減少したことは明らかである（第２図：
また表５実験番号１及び２）。実験番号１からの生成物
におけるゲル強度測足値は、２５０　ｆ／１０、Ｚ−に
すぎない値を与える。攪拌に関してバイオリアクター設
計中の手直しはエキソポリマー製造の特定の速度（ｑｐ
）に減少をもたらすＯＴＲＫ顕著な効果を有することも
これらの２つの発酵実験から明らかである（表５；央験
番号１及び２）。第三発酵で船舶型プロペラを便用する
ことは経過発酵時間（ＥＦＴ）で著しく減少しない高い
固有粘度の生成物を産生ずる（第２図）。ＥＦＴ７２時
間後、単離された生成物の固Ｍ粘１ｆｌｌ’Ｔ約３２　
Ｒｉｌａｍテ約ａｓｃｉＬ／　ｙ　ｏ（ｉａ−ら約７．
ＯｄＬ／ｆに低下するにすぎない。速度を減少させて（
５００Ｒ）’Ｍ）更に大きな直径の１個の船舶型プロペ
ラを利用した発酵実験中で、空気はプロペラの下に配置
されている焼結ガラス円板を通して導入する。攪拌及び
通気に関するこの配置ｔは、匹敵する空気噴出し連関（
α３３Ｖ／Ｖ／Ｍ）でタービンインペラを有する標準設
計と比較してＯＴＲの減少を導くけれどもｑｐは比較的
影響されない。しかしながら空気噴出し速度力ｃＬ３５
　Ｖ／Ｖ／Ｍ　カらα１５もしくはＣＬ　０８　Ｖ／Ｖ
／Ｍのどちらかに減少したとき、ＯＴＲはｑｐｋ負に影
響するレベルまで減少させ７’ＣＣ表３．実験番号３及
び４）。

慣用のラシュトン型タービンインペラ全備えた、第一発
酵（表５．笑験番号１〕のために便用する操作は、ゆっ
〈シした攪拌速度で繰り返す。ボ常期で６０ＯＲＰＭに
撹拌速度を落とすことは単離したエキンボリマーの固有
粘度を増加させることにはならない。；実際、４８時間
後の固有粘度は、インペラ速度を８５０ＲＰｆν１にし
たとき、ＥＦ’Ｔａｓ時間後に固有粘度が五５ｄＬ／ｌ
であるのと比較して１２ｄＬ／ｌであることがわかる。

ｏｑ’ｇ及び付価ＤＯの（ｌｐ（Ａ−フェカリスＡＴＣ
Ｃ３１７４９での〕に対する効果は、第３図及び第４図
に要約して示した。２−０ηＯ２／Ｌもしくはそれ以上
のＤＯ値で、成長要求にちょうど十分な値に維持された
Ｄｏ値すなわちｔｏ”９０２／Ｌを有するであろう場合
よりもｑｐ値は増加したことに気づくであろう。一般に
６．０■０２／Ｌもしくはそれ以上のＤＯ値を得られる
のが好ましい。ｑ　ｐ　’ｆｔ　ｉａ　太Ｋ　ｆ　ルｆ
ｃ　メにＤｏ値Ｖｉ６．８＋Ｉｖ０２／Ｌであるのが好
ましい。

以下の実施例２−５において、＆ＯｄＬ／Ｖよりも大き
な固有粘度を有するβ−１，３−グルカンエキソポリサ
ッカリド生成物ハ、攪拌／混合及び通気の両方に関して
種々に配置した異なるバイオリアクターで製造する。生
成物＃″ｉ実施例１で設定した装置を使用して発酵プロ
スから単離する。

１、　物理化学的特性は上述したように測定する。

実施例２ 本笑施例は、他の種類の−１，３−グルカンエキンボリ
サッカリドを産生ずる微生物を使用して本発明の方法が
実施可能であることを証明するために包含される。

単一、船舶型プロペラ（＠径７　ｃｍ　）を備えた丸底
バイオリアクター中で、実施例１で述べた操作に従って
発酵を実施する。培誉される微生物は、アルカリゲネス
フェカリスＡＴＣＣ３１７４９及びＡＴＣＣ２１６８０
（ＩＦＯｔｓ１４ｏ　）並びにアグロバクテリウム　ラ
ジオバクチルＡＴＣＣ２１６７９（ＩＦＯ１３１２６）
を含む。Ａ、フェカリスＡＴＣＣ２１６８０は成長する
ためにウラシルを要求する栄養要求性突然変異体であり
、そしてこの栄養素は培地にｃＬ１ｒ／Ｌ（単独Ｋｔ２
菌した）で添加する。定常期間、２つの速度、５００及
び６００）ｔＰＭを使用する。

発酵プロスのサンプルを回収し、セしてＥＦＴ４８時間
後にβ−１，５−グルカンエキソポリマーを単離する。

ＡＴＣＣ２１６８Ｏ１株のために、別のサンプルを回収
して、セしてＥＦＴ７２時間後、エキンボリサッカリド
生成物の固有粘度が著しく減少しないことを証明するた
めに単離する。

測定されたパラメーター　ＯＴＲ，ｑｐ、　固有粘度及
びＭＷは、実販番号５及び６としてＡＴＣＣ３１７４９
株を各５００及び６００　Ｒ，ＰＭで、実験番号１２と
してＡＴＣＣ２１６７ｑ株と及び実験番号１３としてＡ
ＴＣＣ２１６７９株を用いて表３に要約した。実験５か
ら得た生成物で測定したゲル強度Ｖｉ１２００９／ｊ（
Ｌ２ｉよりも大きな値を示した。

固有粘度の値は、タービンインペラを使用したバイオリ
アクターで同様のＥＦＴを実施した後に単離した生成物
よりはるかに大きく、全ての場合において＆　ＯｄＬ、
＃より大きいことがわかるであろう。

実施例１と同様に減少した通気の効果はＡＴＣＣ２１６
８０株全使用して実験した。この菌はよりゆっくりした
空気の噴出し速度でｑｐのための減少した値に関して３
１７４９株と同様に作用することがわかるであろう（表
３．実験番号１０及び１１）。

実施例５ この実施例は、高粘度の−１，３−グルカンエキソポリ
サッカリドがヘリカルプロペラを備えたバイオリアクタ
ー中で産生ずることができることを示す。船舶型プロペ
ラを３枚羽根ヘリカルプロペラ（直径５．５　ｃｍ　）
に置き換えること以外は、Ｂｉｏｌａｆｉｔｔｅ　Ｌｔ
ｄ　（ポイッシーフランス）から購入した変更したＮＢ
８　ＭｕｌｔｉＧｅｎ　Ｆ　２０００ペン−トップ発酵
話中で、実施例１と同様に培養した。成長期間にプロペ
ラを６０ＯＲＰＭで回転させるが、成長が停止した後定
常期の開始したとき速度を５００　ＲＰＭに落とす。実
施例１に記載したように焼結ガラス円板噴出器を通して
培地に（Ｌ３３　Ｖ／Ｖ／Ｍで導入したろ過空気を通気
する。

これらの操作条件下において、（ＪＴＩ（、は６８ミリ
モルＯ，／Ｌ、時間で、ｑｐｈこれらの実験中で観測さ
れた最大値に近い値であった。ＥＦＴ４８時間後に単離
された生成物サンプルは９．７ｄＬ／２の固有粘度を有
していた（表３．実験番号７参照）。

実施例４ 本発明の高い固有粘度の産生物はまた、ドラフトチュー
ブおよびピッチ可変プロペラを取付けたバイオリアクタ
ーを用いて産生された。ドラフトチューブおよび３個の
ピッチ可変（３０゜でセット）プロペラ（直径＝　ａ　
９　ｃｍ　）を取付けたビー、ビララン（Ｂ、　Ｂｒａ
ｕｎ　）　（アメリカ合衆国、カリフォルニア州、ビリ
ングケイム）にょυ製造されたモデルイー、１５エル　
バイオリアクターで鉱物塩培地中アルカリゲネス　フェ
カリスＡＴＣＣ３１７４９を培養した。作用容量は１０
Ｌだった。プロペラを成長期の間６ｏ　ｏ　ＫＰＭの固
定速度で回転させたが、しかしその速度を定常期の間５
００ＲＰＭまで減少させた。底部のブ。

ロベラの下に設けたリングスパージャ−を介して導入さ
れる濾過空気によｆｉ　［１３５Ｖ／Ｖ／Ｍの一定速度
で培養液を通気した。

これらの操作条件の下で、（ＪＴＲはわずかに１２ｍ　
ｍｏｊ　Ｕ！　／　Ｌ・時間であり、これは高速度のポ
リマー産生（（１１）＝４１ｑエキソポリマー／２細胞
・時間）を支持するには不十分だった。産生されたポリ
マーの量は理想よシ低かったけれども、産生物の質はタ
ービンインペラを有する慣用ノバイオリアクター中で産
生されたものに比べ改善されていた。４８時間のＥＦＴ
後に分離されたエキンボリマーの固有粘度Ｕ７．９ｄＬ
／りだった（表３．実験番号３ン。

本実施例は、低い酸素圧力は主としてエキソポリマー産
生（量）の速度に影響し、そしてポリマーの「品質」に
影響しないことを示す。

実施例５ 本発明において記載された方法は高品質の産生物を得る
ために２００リツトルの容量まで拡大し得ることを本実
施例は示す。直径３α５ｃｒｎのノ・イドロホイルイン
ペラを２個備える絶縁したニュー　プルンスウィック　
サイエンティフィック　モデＡ／　（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎ
ｓｗｉｃｋ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｎ１ｏｄｅｌ　）
１上１２５０醗酵装置（Ｄｔ＝５五３釧、　Ｄ／Ｄｊ＝
　０．５７　）〔オンタリオ州、ブランプトンのグロケ
ム　ミキシング　エクイップメント　リミテッド（Ｐｒ
ｏｃｈｅｍ　Ｍｉｘｉｎｇ　Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ　Ｌｔ
ｄ−）］中アルカリゲネス　フェカリスＡＴＣＣ３１７
４９で醗酵を行った。攪拌速度は、約１７０ｍ／分の翼
端速度を与えそして約７７ＯＲＰＭの攪拌速度で７ｃｒ
ｎプロペラの翼端速度に匹敵する１ｓ　ｏ　ＲＰｈｉだ
った。培養液には微孔ステンレススチールフィルター〔
バール　カナダ　リミテッド（Ｐａ１１　Ｃａｎａｄａ
Ｌｔｄ、）を通した空気をα５　Ｖ／Ｖ／Ｍと等価の１
００Ｌ／分の一定速度で通した。ｐ）ｌを成長期の間Ｚ
Ｏに調整し、そして定常期に５．９に調整した。温度は
醗酵を通して３０℃に維持した。

これらの条件下でのＯＴＲｉｊ　４２　ｍ　ｍｏ　ｌ　
（Ｊ２／Ｌ　・時間であると測定され、計算された溶存
酸素レベルは＆１η０２／Ｌだった。ポリマー産生の比
速度（ｑｐ）は７７η／？細胞／時間だったが、これは
より小さいスケールの醗酵に基づいた（ＪＴｌｔおよび
ＤＯ値等に対して第３図および第４図から外挿されるで
あろう値に近似している。

実験の過程の鏝に分離された産生物は、高い固有粘度、
ゲル強度およびＭ〜■をＭすることが見い出づれた。２
４時間のＥＦ′Ｐで産生物は９．５ｄＬ／？ｙ）粘度オ
ヨび２４０（１／１ａ２ＱＪのゲル強度をゼしていた。

４８時間でのＥＦＴで産生物の特性を表６．実験番号９
に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、第二期における攪拌のためにプロペラ攪拌機
を使用する二段階連続プロセスにおいて実施された本発
明の方法を示す略流れ図、第２図は、鰻酵経過時間とと
もに単離塩の遊離β−１，３−グルカン　エキンボリサ
ッヵリド産生物の固有粘度について羽根車の効果を示す
醗酵試験の結果のグラフ、 第５図は、産生物産生の比速度（ｑｐ）についての酸素
移動速度（ＯＴＪの効果を示すロリ酵試験の結果のグラ
フ、 Ｆ４図は、産生物産生の比速度（ｑｐ）についての溶存
酸素＃！度（ＤＯ）の効果金示す醗酵試験の結果のグラ
フである。 特許出願人　ジョージ　ウニストン　リミテッド藺　（
θ号Ｍン

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）β−１，３結合を介して結合した線状に連結した
   Ｄ−グルコース残基からなり、そして以下の特性：少な
   くとも約６．０ｄＬ／ｇの固有粘度、ゲル透過サイズ排
   除クロマトグラフィー法により測定される少なくとも約
   １．９×１０＾６の分子量、および少なくとも約７５０
   ｇ／１０．２ｃｍ＾２のゲル強度のうち１つまたはそれ
   以上を有することを特徴とする改良された水不溶性のゲ
   ル形成β−１，３−グルカンエキソポリサッカリド。
2. （２）少なくとも約１０００ｇ／１０．２ｃｍ＾２のゲ
   ル強度、ゲル透過サイズ排除クロマトグラフィー法によ
   り測定される少なくとも約２．０×１０＾６の分子量、
   および少なくとも４８時間経過した醗酵時間の後に少な
   くとも約６．０ｄＬ／ｇの固有粘度を有する請求項１記
   載のβ−１，３−グルカンエキソポリサッカリド。
3. （３）（ａ）同化可能な炭素、窒素および無機塩並びに
   その他のあらゆる必須成長因子からなり、成長期の終点
   で培地が同化可能な窒素を実 質的に含有しないように窒素の量が限定さ れる好気的撹拌水性培地中、約２７℃と３３℃の間の温
   度および約５と８の間のｐＨで誘導される成長期と、 同化可能な炭素を含有するが、しかし同 化可能な窒素を実質的に含有しない好気的 攪拌水性培地中、約２７℃と３３℃の間の 温度および約５と８の間のｐＨで誘導され る非成長定常エキソポリサッカリド生合成 期で、この期間における撹拌は、産生され るエキソポリサッカリド産生物の固有粘度 が約６．０ｄＬ／ｇ以下に著しく減少することなく、均
   質な培地を生成するのに十分な混合 およびエキソポリサッカリド産生物の好気 的生合成に十分な酸素移動を与える非成長 定常エキソポリサッカリド生合成期の２つ の期において微生物のβ−１，３−グルカンエキソポリ
   サッカリド産生株を培養し、 （ｂ）そのように産生されたエキソポリサッカリド産生
   物をアルカリとの処理により可溶 化し、そして細胞塊を除去し、そして （ｃ）醗酵プロスからエキソポリサッカリドを分離する
   、ことからなることを特徴とする 請求項１記載の改良された水不溶性のゲル 形成β−１，３−グルカンエキソポリサッカリドの製造
   方法。
4. （４）通気および混合を容易にするドラフトチューブを
   備えても良い船舶型プロペラを有するバイオリアクター
   中で攪拌を行なうか、またはらせんタイプのプロペラも
   しくは水中翼推進機を有するバイオリアクター中で撹拌
   を行なう請求項３記載の方法。
5. （５）成長期を第一の醗酵装置中で誘導し、その第一の
   醗酵装置からの溶出液を定常エキソポリサツカリド生合
   成期用の第二の醗酵装置中に導き、そして第一の醗酵装
   置内のｐＨが約６．８と７．２の間であり、そして第二
   の醗酵装置内のｐＨが約５．７と６．２の間である２段
   階の連続工程として行われる請求項３記載の方法。
6. （６）定常期において、水性培地中の溶存酸素濃度は、
   エキソポリサッカリド産生の比速度（ｑ＿ｐ）を増加さ
   せるために少なくとも約２０ｍｇＯ＿２／Ｌの値に維持
   される請求項３、４または５記載の方法。
7. （７）定常期において、水性培地中の溶存酸素濃度は、
   エキソポリサッカリド産生の比速度（ｑ＿ｐ）を増加さ
   せるために少なくとも約６．０ｍｇＯ＿２／Ｌの値に維
   持される請求項５記載の方法。
8. （８）定常期において、水性培地中の溶存酸素濃度は、
   エキソポリサッカリド産生の比速度（ｑ＿ｐ）を増加さ
   せるために少なくとも約６．８ｍｇＯ＿２／Ｌの値に維
   持される請求項５記載の方法。
9. （９）微生物がアルカリゲネス属またはアグロバクテリ
   ウム属のものである請求項３、７または８記載の方法。
10. （１０）微生物がアルカリゲネスフェカリスＡＴＣＣ３
    １７４９、アルカリゲネスフェカリスＡＴＣＣ３１７５
    ０、アルカリゲネスフェカリスＡＴＣＣ２１６８０およ
    びアグロバクテリウムラジオバクターＡＴＣＣ２１６７
    ９から選択される請求項３、７または８記載の方法。