JPH0132949B2 - - Google Patents
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- JPH0132949B2 JPH0132949B2 JP56181023A JP18102381A JPH0132949B2 JP H0132949 B2 JPH0132949 B2 JP H0132949B2 JP 56181023 A JP56181023 A JP 56181023A JP 18102381 A JP18102381 A JP 18102381A JP H0132949 B2 JPH0132949 B2 JP H0132949B2
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、家禽類特に鶏の産卵低下症候群
（Egg Drop Syndrome―1976、以下「EDS―76」
と略称する）の血清学的診断の一つであるゲル内
沈降反応の抗原の製造方法に関する。 EDS―76はEDS―76ウイルスの感染により生
ずる伝染病で、1976年ヨーロツパで初発して以
来、徐々に世界各国に広がりつつある。これに感
染した鶏は異常卵を伴つた産卵低下を起こし、そ
の経済的被害は多大なものになつている。そのた
め、本疾病の診断が必要となり、現在では血清診
断としてHI反応及びゲル内沈降反応などが採用
されている。とりわけ、ゲル内沈降反応はその操
作の簡便なことから、かなり広く実施されてい
る。しかしながら、そのゲル内沈降反応に使用す
る抗原の調製は繁雑で、かなり高度の技術および
設備を要するという難点があつた。すなわち従来
のゲル内沈降反応に使用する抗原の調製方法は
「Avian Pathol.」第７巻第629〜639頁（1978）
およびJ.B.McFerran氏編「Studies on the
Antigenic Relationshipbetween an Isolation
（127）from the Egg Drop Syndrome 1976
and ａ Fowl Adenovirus」にも示されている
とおり次のようである。 １） SPF発育鶏卵の胎児肝細胞を採取して細胞
培養を行なう。 ２） 培養細胞にEDS―76ウイルスを接種して
ウイルスを増殖し、その培養液を遠心分離し、
そして上清に等量の飽和硫安液を加えて４℃に
一夜放置する。 ３） 沈澱物を遠心分離して集め、そして原培養
液の1/100量の蒸溜水を加えて沈澱を溶解する。 ４） それをリン酸緩衝食塩液で透析する。 ５） 0.2％の割合にホルマリンを加えてウイル
スを不活化し、そして力価を４単位に調整して
抗原とする。 本発明者らは従来法における難点を解決すべく
研究を行つた結果、ゲル内沈降反応に使用する抗
原を従来法より簡単で且つ高度の技術および設備
を要せずに得る方法を見い出した。本発明による
EDS―76診断用抗原の製造方法を以下に詳細に
説明する。 EDS抗体フリーのアヒル発育卵12〜16日令に
EDS―76ウイルスを接種し、３〜７日間孵卵後
発育卵の漿尿膜を採取し、希釈液を加えプールし
て漿尿膜細胞を破壊しそして遠心分離して上清を
採る。ウイルス接種部位としては漿尿腔、漿尿膜
卵黄曩内などがあるが、漿尿腔接種がもつとも好
ましい。また、孵卵後、一夜冷蔵庫に保存してか
ら漿尿膜を採取すると採取が容易である。また、
希釈液にはリン酸緩衝液、生理食塩水、蒸溜水、
水などを使用する。また、漿尿膜細胞の破壊には
ホモジナイズ、凍結融解、超音波処理などが適当
である。上記の上清を抗原として使用してもよい
が、0.2％の割合にホルマリンを加えて不活化し
て使用すれば一層安全に使用できる。また、使用
前に抗原力価を最適濃度に調整すれば、広範囲の
抗体価の血清または卵黄について診断できる。こ
こで云う最適濃度とは抗原と抗血清とをそれぞれ
PBSで倍々希釈し、それぞれの希釈した抗原と
それぞれの希釈した抗血清とをすべての組み合わ
せでゲル内沈降反応を行なつて希釈した抗血清と
もつともよく反応する抗原の濃度である。 本発明の方法で抗原を調製すれば、従来の方法
で必要な組織培養の技術および設備が必要なく、
さらに抗原の調製に必要な手数が省け、そして特
別な無菌操作も必要でないために、ウイルス取扱
いの初心者でも簡単に抗原を調製することが可能
である。 また、ニワトリの尿膜や漿尿膜を使用して人感
染ウイルスの１種であるムンプスウイルス抗原を
調製すること等が知られているが（特開昭56−
31645号公報）、産卵低下症候群ウイルスの場合
は、ニワトリの漿尿膜を利用しても診断に利用で
きる産卵低下症候群ウイルス抗原は調製できず、
本発明でアヒル発育卵の漿尿膜を使用したことに
よつて初めて産卵低下症候群ウイルス感染症の診
断に有効に利用できる抗原の調製が可能になつ
た。 そして、本発明の方法で調製した抗原を使用し
てゲル内沈降反応を行つた結果は、従来方法で調
製した抗原を使用した結果と実質的に一致した。
本発明方法により得られた診断用抗原を使用して
のゲル内沈降反応の操作は以下のとおりである。 １） スライドグラスに１〜1.2％の寒天溶液ま
たはアガロース溶液（0.1％NaN3含有PBSで
調製）を寒天の厚さ約１mmになるように注ぐ。 ２） 寒天が固つたらパンチヤーでパンチし、そ
してパンチした部分の寒天を取り除いて孔を開
ける。孔と孔との距離は約３〜４mmとする。 ３） 抗原を一つの孔に入れ、そして被検血清ま
たは被検卵黄をもう一つの孔に入れる。 ４） 湿潤箱に入れて室温で静置し、経時的にス
ライドグラスの斜め下方により光源をあてて沈
降線を観察する。 詳細なゲル内沈降反応の術式は「改訂５版細菌
学実習提要」（医科学研究所学友会編）第251〜
253頁の記載を参照されたい。 実施例 EDSウイルス（JAP―１株）108.0TCID50／ml
を0.1mlの量で14日令のSPFアヒル種卵10個の漿
尿腔内に接種した。４日間37.5℃で孵卵後、１夜
４℃の冷蔵庫に移して胎児を殺し、割卵して漿尿
膜を採取した。10個分の漿尿膜をプールし、等量
のPBSを加え、冷却しながら約３分間ホモジナ
イズした。その乳剤について凍結融解を３回繰り
返して行ない、そして約3000rpmにおいて10分間
遠心分離してその上清をとつた〔本発明試料(1)〕。
その上清にホルマリン原液を0.2％の割合で加え
てウイルスを不活化した〔本発明試料(2)〕。 比較例 上記実施例において14日令のSPFアヒル種卵10
個の代わりに、14日令のSPFニワトリ種卵10個を
使用した他は実施例と全く同じ方法で上清を採取
した〔比較例試料(1)〕。さらにこの上清に実施例
と同様にしてホルマリン原液を加えてウイルスを
不活化した試料を調製した〔比較例試料(2)〕。 本発明試料(1)および(2)、ならびに比較例試料(1)
および(2)をゲル内沈降反応のための抗原として使
用して抗血清とのゲル内沈降反応を調べた。 また、同時にSPF発育鶏卵の胎児肝細胞を利用
する従来の方法で調製した産卵低下症候群ウイル
ス抗原を使用して同様の試験を行つた。 得られた結果を下記の表に示す。
（Egg Drop Syndrome―1976、以下「EDS―76」
と略称する）の血清学的診断の一つであるゲル内
沈降反応の抗原の製造方法に関する。 EDS―76はEDS―76ウイルスの感染により生
ずる伝染病で、1976年ヨーロツパで初発して以
来、徐々に世界各国に広がりつつある。これに感
染した鶏は異常卵を伴つた産卵低下を起こし、そ
の経済的被害は多大なものになつている。そのた
め、本疾病の診断が必要となり、現在では血清診
断としてHI反応及びゲル内沈降反応などが採用
されている。とりわけ、ゲル内沈降反応はその操
作の簡便なことから、かなり広く実施されてい
る。しかしながら、そのゲル内沈降反応に使用す
る抗原の調製は繁雑で、かなり高度の技術および
設備を要するという難点があつた。すなわち従来
のゲル内沈降反応に使用する抗原の調製方法は
「Avian Pathol.」第７巻第629〜639頁（1978）
およびJ.B.McFerran氏編「Studies on the
Antigenic Relationshipbetween an Isolation
（127）from the Egg Drop Syndrome 1976
and ａ Fowl Adenovirus」にも示されている
とおり次のようである。 １） SPF発育鶏卵の胎児肝細胞を採取して細胞
培養を行なう。 ２） 培養細胞にEDS―76ウイルスを接種して
ウイルスを増殖し、その培養液を遠心分離し、
そして上清に等量の飽和硫安液を加えて４℃に
一夜放置する。 ３） 沈澱物を遠心分離して集め、そして原培養
液の1/100量の蒸溜水を加えて沈澱を溶解する。 ４） それをリン酸緩衝食塩液で透析する。 ５） 0.2％の割合にホルマリンを加えてウイル
スを不活化し、そして力価を４単位に調整して
抗原とする。 本発明者らは従来法における難点を解決すべく
研究を行つた結果、ゲル内沈降反応に使用する抗
原を従来法より簡単で且つ高度の技術および設備
を要せずに得る方法を見い出した。本発明による
EDS―76診断用抗原の製造方法を以下に詳細に
説明する。 EDS抗体フリーのアヒル発育卵12〜16日令に
EDS―76ウイルスを接種し、３〜７日間孵卵後
発育卵の漿尿膜を採取し、希釈液を加えプールし
て漿尿膜細胞を破壊しそして遠心分離して上清を
採る。ウイルス接種部位としては漿尿腔、漿尿膜
卵黄曩内などがあるが、漿尿腔接種がもつとも好
ましい。また、孵卵後、一夜冷蔵庫に保存してか
ら漿尿膜を採取すると採取が容易である。また、
希釈液にはリン酸緩衝液、生理食塩水、蒸溜水、
水などを使用する。また、漿尿膜細胞の破壊には
ホモジナイズ、凍結融解、超音波処理などが適当
である。上記の上清を抗原として使用してもよい
が、0.2％の割合にホルマリンを加えて不活化し
て使用すれば一層安全に使用できる。また、使用
前に抗原力価を最適濃度に調整すれば、広範囲の
抗体価の血清または卵黄について診断できる。こ
こで云う最適濃度とは抗原と抗血清とをそれぞれ
PBSで倍々希釈し、それぞれの希釈した抗原と
それぞれの希釈した抗血清とをすべての組み合わ
せでゲル内沈降反応を行なつて希釈した抗血清と
もつともよく反応する抗原の濃度である。 本発明の方法で抗原を調製すれば、従来の方法
で必要な組織培養の技術および設備が必要なく、
さらに抗原の調製に必要な手数が省け、そして特
別な無菌操作も必要でないために、ウイルス取扱
いの初心者でも簡単に抗原を調製することが可能
である。 また、ニワトリの尿膜や漿尿膜を使用して人感
染ウイルスの１種であるムンプスウイルス抗原を
調製すること等が知られているが（特開昭56−
31645号公報）、産卵低下症候群ウイルスの場合
は、ニワトリの漿尿膜を利用しても診断に利用で
きる産卵低下症候群ウイルス抗原は調製できず、
本発明でアヒル発育卵の漿尿膜を使用したことに
よつて初めて産卵低下症候群ウイルス感染症の診
断に有効に利用できる抗原の調製が可能になつ
た。 そして、本発明の方法で調製した抗原を使用し
てゲル内沈降反応を行つた結果は、従来方法で調
製した抗原を使用した結果と実質的に一致した。
本発明方法により得られた診断用抗原を使用して
のゲル内沈降反応の操作は以下のとおりである。 １） スライドグラスに１〜1.2％の寒天溶液ま
たはアガロース溶液（0.1％NaN3含有PBSで
調製）を寒天の厚さ約１mmになるように注ぐ。 ２） 寒天が固つたらパンチヤーでパンチし、そ
してパンチした部分の寒天を取り除いて孔を開
ける。孔と孔との距離は約３〜４mmとする。 ３） 抗原を一つの孔に入れ、そして被検血清ま
たは被検卵黄をもう一つの孔に入れる。 ４） 湿潤箱に入れて室温で静置し、経時的にス
ライドグラスの斜め下方により光源をあてて沈
降線を観察する。 詳細なゲル内沈降反応の術式は「改訂５版細菌
学実習提要」（医科学研究所学友会編）第251〜
253頁の記載を参照されたい。 実施例 EDSウイルス（JAP―１株）108.0TCID50／ml
を0.1mlの量で14日令のSPFアヒル種卵10個の漿
尿腔内に接種した。４日間37.5℃で孵卵後、１夜
４℃の冷蔵庫に移して胎児を殺し、割卵して漿尿
膜を採取した。10個分の漿尿膜をプールし、等量
のPBSを加え、冷却しながら約３分間ホモジナ
イズした。その乳剤について凍結融解を３回繰り
返して行ない、そして約3000rpmにおいて10分間
遠心分離してその上清をとつた〔本発明試料(1)〕。
その上清にホルマリン原液を0.2％の割合で加え
てウイルスを不活化した〔本発明試料(2)〕。 比較例 上記実施例において14日令のSPFアヒル種卵10
個の代わりに、14日令のSPFニワトリ種卵10個を
使用した他は実施例と全く同じ方法で上清を採取
した〔比較例試料(1)〕。さらにこの上清に実施例
と同様にしてホルマリン原液を加えてウイルスを
不活化した試料を調製した〔比較例試料(2)〕。 本発明試料(1)および(2)、ならびに比較例試料(1)
および(2)をゲル内沈降反応のための抗原として使
用して抗血清とのゲル内沈降反応を調べた。 また、同時にSPF発育鶏卵の胎児肝細胞を利用
する従来の方法で調製した産卵低下症候群ウイル
ス抗原を使用して同様の試験を行つた。 得られた結果を下記の表に示す。
【表】
(注) ＋：ゲル内沈降反応が生じており、沈降
線が認められる。
−：ゲル内沈降反応が生じておらず、沈降
線が認められない。
上記表の結果から、本発明の方法で調製した抗
原は、その調製が極めて簡単であるにも拘らず発
育鶏卵の胎児肝細胞を利用した従来の抗原に充分
匹敵する良好な結果を与えることがわかる。さら
に上記の表の結果は、同じ漿尿膜であつてもニワ
トリの漿尿膜を使用した場合には、アヒル発育卵
の漿尿膜を利用する本発明とは異なり、抗血清と
ゲル内沈降反応を生じ得る抗原が得られないこと
を示している。
線が認められる。
−：ゲル内沈降反応が生じておらず、沈降
線が認められない。
上記表の結果から、本発明の方法で調製した抗
原は、その調製が極めて簡単であるにも拘らず発
育鶏卵の胎児肝細胞を利用した従来の抗原に充分
匹敵する良好な結果を与えることがわかる。さら
に上記の表の結果は、同じ漿尿膜であつてもニワ
トリの漿尿膜を使用した場合には、アヒル発育卵
の漿尿膜を利用する本発明とは異なり、抗血清と
ゲル内沈降反応を生じ得る抗原が得られないこと
を示している。
Claims (1)
- １ 産卵低下症候群抗体フリーのアヒル発育卵に
産卵低下症候群ウイルスを接種し、孵卵後発育卵
の漿尿膜を採取し、そして漿尿膜細胞を破壊し且
つ遠心分離して上清を得ることを特徴とする、産
卵低下症候群の血清抗体又は卵黄中抗体診断用ゲ
ル内沈降抗原の調製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56181023A JPS5883264A (ja) | 1981-11-13 | 1981-11-13 | 診断用抗原の製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56181023A JPS5883264A (ja) | 1981-11-13 | 1981-11-13 | 診断用抗原の製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5883264A JPS5883264A (ja) | 1983-05-19 |
| JPH0132949B2 true JPH0132949B2 (ja) | 1989-07-11 |
Family
ID=16093405
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56181023A Granted JPS5883264A (ja) | 1981-11-13 | 1981-11-13 | 診断用抗原の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5883264A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102716476B (zh) * | 2012-05-31 | 2015-04-22 | 郑州后羿制药有限公司 | 一种细胞灭活疫苗和卵黄抗体注射液及其制备方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5631645A (en) * | 1979-08-23 | 1981-03-31 | Fujirebio Inc | Sensitized latex for mumps virus infection diagnosis |
-
1981
- 1981-11-13 JP JP56181023A patent/JPS5883264A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5631645A (en) * | 1979-08-23 | 1981-03-31 | Fujirebio Inc | Sensitized latex for mumps virus infection diagnosis |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5883264A (ja) | 1983-05-19 |
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