JPH01304882A - Stable storing method of superoxide dismutase of human cu, zn-type - Google Patents
Stable storing method of superoxide dismutase of human cu, zn-typeInfo
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、特定のｍＷを使用して、ヒトＣｕ。[Detailed description of the invention] [Industrial application field] The present invention uses a specific mW for human Cu.
Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼ（以下、ヒトＳＯ
Ｄと略す）を凍結状態などで安定に保存する方法に関す
るものである。Zn-type superoxide dismutase (hereinafter referred to as human SO
This article relates to a method for stably preserving the food (abbreviated as D) in a frozen state.
ヒトＳＯＤは、下式に示す不均化反応によって、スーパ
ーオキシドを消失させる作用を持つ酵素である。Human SOD is an enzyme that has the effect of eliminating superoxide through a dismutation reaction shown in the following formula.
２・Ｏ；＋２）！” −一→ ０２＋Ｈ２０□従って、
ヒトＳＯＤは、生体内で発生したスーパーオキシドによ
る組織障害（例えば、炎症、変形性関節炎、慢性関節リ
ウマチ、放射線照射による障害、紫外線による障害、未
熟児酸素網膜症、白内障、アドリアマイシンなどの制癌
剤の副作用、虚血部分への血流再開に伴う障害など）に
対する有効な治療薬として注目されている。2・O;+2)! ” -1 → 02+H20□ Therefore,
Human SOD is caused by tissue damage caused by superoxide generated in vivo (e.g., inflammation, osteoarthritis, chronic rheumatoid arthritis, damage caused by radiation exposure, damage caused by ultraviolet rays, oxygen retinopathy of prematurity, cataracts, and side effects of anticancer drugs such as adriamycin). It is attracting attention as an effective therapeutic agent for disorders associated with resumption of blood flow to ischemic areas.
ところで、蛋白質であるヒトＳＯＤは、凍結融解処理ま
たは凍結乾燥処理を行っても、その酵素活性の低下は認
められず、また、不溶性物質の生成も肉眼では認められ
ない。しかし、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミド電気泳動、高速ゲル濾過液体クロマトグラフィー
などによる分析では、前記の処理を受けたヒトＳＯＤは
、主として二量体からなる副生物を生じている。Incidentally, even when human SOD, which is a protein, is subjected to freeze-thawing treatment or freeze-drying treatment, no decrease in its enzyme activity is observed, and no formation of insoluble substances is observed with the naked eye. However, analysis by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide electrophoresis, high-speed gel filtration liquid chromatography, etc. shows that human SOD subjected to the above treatment produces by-products mainly consisting of dimers.
従って、ヒトＳＯＤを医薬品として使用する場合には、
これを安定的に保存する必要があるが、その保存処理で
生じる副生物がアレルギーなどの副作用の原因となる恐
れがあるので、その生成を防ぐ必要がある。Therefore, when using human SOD as a medicine,
It is necessary to store this in a stable manner, but it is necessary to prevent by-products generated during the storage process, as they may cause side effects such as allergies.
一般的に、蛋白質は、凍結融解処理または凍結乾燥処理
によって、副生物の生成、不溶化などの変性を起こし、
その生物学的活性が低下することが知られている。そし
て、そのような変性は、凍結融解処理または凍結乾燥処
理を行う前に、その蛋白質溶液にアルブミン、ＤＮＡ、
カラゲニン、デキストラン、デンプンなどの生物由来の
高分子化合物、アミノ酸、ポリエチレングリコールまた
はグリセロールを添加して、処理することによって防止
されることが知られている。In general, proteins undergo denaturation such as generation of by-products and insolubilization during freeze-thaw or freeze-drying.
It is known that its biological activity is reduced. Such denaturation can be achieved by adding albumin, DNA,
It is known that this can be prevented by adding biologically derived polymer compounds such as carrageenan, dextran, and starch, amino acids, polyethylene glycol, or glycerol to the treatment.
しかしながら、ヒトＳＯＤを医薬品として用いる場合に
は、ヒトにとって異種生物由来のアルブミン、ＤＮＡ、
カラゲニン、デンプンなどは、それ自体がアレルギーを
引き起こすので好ましくない、また、ヒト由来のものを
使用するにしても、その由来がヒトであるが故にその入
手が困難であり、かつ高価であることから、その使用は
実用的ではない。However, when human SOD is used as a medicine, albumin, DNA,
Carrageenin, starch, etc. are undesirable because they themselves cause allergies, and even if they are derived from humans, they are difficult to obtain and expensive due to their human origin. , its use is impractical.
従来、ＳＯＤの安定な保存法としては、ウシ由来のＳＯ
Ｄ （商品名；オルゴテイン、ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＤ
ａｔａ、社製）についての保存法（米国特許 第３゜６
３７．６４号）がある、この場合、ウシ由来のＳＯＤの
変性は、凍結乾燥処理によって２５％以上となる。しか
し、ウシ由来のＳＯＤの凍結乾燥処理前にペントース及
びヘキソース（例えば、ガラクトース、フルクトース、
フッコース、アラビノース、グルコース、マンノース、
スクロースなどの糖類）とウシ由来のＳＯＤとを混合し
て、処理することによって、ウシ由来のＳＯＤの変性が
防止されることが示されている。Conventionally, as a stable storage method for SOD, bovine-derived SO
D (Product name: Orgotein, Diagnostic D
(US Patent No. 3゜6)
37.64); in this case, the denaturation of bovine SOD is 25% or more due to freeze-drying. However, before the freeze-drying process of bovine-derived SOD, pentoses and hexoses (e.g., galactose, fructose,
Fucose, arabinose, glucose, mannose,
It has been shown that denaturation of bovine SOD can be prevented by mixing and treating bovine SOD with sugars such as sucrose.
しかしながら、ヒトＳＯＤの凍結乾燥処理では、ガラク
トース、アラビノース、グルコースなどの単糖のアルド
ース類とヒトＳＯＤとを混合して処理しても、陰イオン
交換クロマトグラフィーによる分析から、その変性が認
められるので（比較例３〜５）、単糖のアルドース類で
は、ヒトＳＯＤの凍結または凍結乾燥処理において、そ
の変性を防止するために使用する物質としては好ましく
ない。However, in freeze-drying human SOD, even if human SOD is mixed with monosaccharide aldoses such as galactose, arabinose, and glucose, denaturation is observed from anion exchange chromatography analysis. (Comparative Examples 3 to 5) Monosaccharide aldoses are not preferred as substances used to prevent denaturation of human SOD in freezing or freeze-drying treatment.
本発明の目的は、特定の糖類を使用して処理したヒトＳ
ＯＤの溶液を、凍結状態または凍結乾燥状態で安定に保
存する方法を提供することである。The purpose of the present invention is to provide human S.
An object of the present invention is to provide a method for stably preserving a solution of OD in a frozen state or a lyophilized state.
本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、ヒトＳＯＤの保存において、二糖類、ケトー
ス類の単糖類、糖アルコール類のうちの少なくとも一種
以上の糖とヒトＳＯＤとを混合して、保存することによ
って、ヒトＳＯＤを凍結状態または凍結乾燥状態で安定
に保存することができることを見出し、本発明を完成し
た。As a result of intensive research to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that, in preserving human SOD, at least one type of sugar from disaccharides, ketose monosaccharides, and sugar alcohols is combined with human SOD. The present invention was completed based on the discovery that human SOD can be stably stored in a frozen or lyophilized state by mixing and storing the following.
部ち、本発明は、
ヒトＳＯＤの保存において、二ｖｌ類、ケトース類の単
Ｉｉ類、糖アルコール類のうちの少なくとも一種以上の
糖とヒトＳＯＤとを混合して、保存することを特徴とす
るヒトＳＯＤの安定保存法に関するものである。Particularly, the present invention is characterized in that, in the preservation of human SOD, human SOD is mixed with at least one type of sugar selected from the group II, ketoses, and sugar alcohols. The present invention relates to a method for stably preserving human SOD.
本発明の好適態様は、糖の使用量が、ヒトＳＯＤ量の０
．０５〜１０倍、さらに好ましくは０．１〜６倍の重量
比であるのがよい。In a preferred embodiment of the present invention, the amount of sugar used is 0% of the amount of human SOD.
．． The weight ratio is preferably 0.05 to 10 times, more preferably 0.1 to 6 times.
以下、本発明について、さらに詳しく説明する。The present invention will be explained in more detail below.
本発明におけるヒトＳＯＤとしては、ヒトの細胞、組織
、器官など（例えば、赤血球、肝臓、胎盤など）から抽
出精製されたＳＯＤ、遺伝子組換えによって微生物に生
産させたヒトＳＯＤと同一のアミノ酸配列を有するもの
などを挙げることができる。Human SOD in the present invention includes SOD extracted and purified from human cells, tissues, organs, etc. (e.g., red blood cells, liver, placenta, etc.), and human SOD produced by genetically recombinant microorganisms with the same amino acid sequence as human SOD. Examples include those that have.
本発明において、ヒトＳＯＤを凍結または凍結乾燥状態
で安定に保存するために用いる糖としては、糖アルコー
ル類（例えば、ソルビトール、マンニトール、イノシト
ール、リビトールなど）、−Ｊｉｍ （例、ｔば、スク
ロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、イソ
マルトース、セロビオース、など）、ケトース類の単１
１！（例えば、フルクトース、キシルロース、リブロー
ス、セドヘプツロースなど）などを挙げることができる
。In the present invention, sugars used to stably preserve human SOD in a frozen or lyophilized state include sugar alcohols (e.g., sorbitol, mannitol, inositol, ribitol, etc.), -Jim (e.g., tb, sucrose, trehalose, maltose, lactose, isomaltose, cellobiose, etc.), single ketose
1! (For example, fructose, xylulose, ribulose, sedoheptulose, etc.).
そして、これらの糖を単独または混合して用いることが
できる。These sugars can be used alone or in combination.
ヒトＳＯＤと前記の糖との混合方法は、特に限定されず
、例えば、
（ａ）ヒトＳＯＤ溶液（１〜１００ ｍ、 ｇ ／ ｍ
Ｉ！、）に糖を直接添加した後によく混合してもよい
し、（ｂ）ヒトＳＯＤ溶液（１〜１００ｍｇ／ｍｆ）に
糖溶液を加えた後によく混合してもよいし、（ｃ）糖溶
液にヒトＳＯＤを直接添加した後によく混合してもよい
。The method of mixing human SOD and the sugar described above is not particularly limited, and for example, (a) human SOD solution (1 to 100 m, g/m
I! ,) may be added directly to the sugar solution and then mixed well, (b) the sugar solution may be added to the human SOD solution (1 to 100 mg/mf) and then mixed well, or (c) the sugar solution may be added to the solution and then mixed well. Human SOD may be added directly to the solution and then mixed well.
なお、これらの操作は、０〜４０°Ｃ下、好ましくは０
〜１５℃下で行うのがよく、混合後の処理時間は、特に
制限されない。In addition, these operations are carried out at 0 to 40°C, preferably at 0°C.
The treatment is preferably carried out at a temperature of ~15°C, and the treatment time after mixing is not particularly limited.
本発明におけるヒトＳＯＤ溶液または糖溶液で用いる溶
媒は、特に限定されないが、例えば、水、生理食塩水、
リン酸糧衝液などの緩衝液を用いることができる。The solvent used in the human SOD solution or sugar solution in the present invention is not particularly limited, but includes, for example, water, physiological saline,
Buffers such as phosphate buffer can be used.
このようにして調製した糖を含有するヒトＳＯＤ溶液は
、バイアル瓶などの適当な容器に適当量入れ、−８０〜
−１５°Ｃで凍結し、そのまま−８０〜−１５°Ｃで保
存するか、または減圧下（２００〜５００ｍＴ ｏ ｒ
ｒ）で乾燥して一８０〜１０°Ｃで保存する。このよ
うにして、ヒトＳＯＤを凍結状態または凍結乾燥状態で
安定に保存することができる。The sugar-containing human SOD solution prepared in this way is poured into an appropriate container such as a vial in an appropriate amount, and
Freeze at -15°C and store directly at -80 to -15°C, or store under reduced pressure (200 to 500 mT or
r) and store at -80 to 10°C. In this way, human SOD can be stably stored in a frozen or lyophilized state.
以下、本発明を参考例及び実施例によって具体的に説明
する。なお、これらの実施例は、本発明の範囲を限定す
るものではない。Hereinafter, the present invention will be specifically explained using reference examples and examples. Note that these Examples do not limit the scope of the present invention.
各実施例において、ポリアクリルアミド電気泳動試験、
高速ゲル濾過クロマトグラフィー試験及び陰イオン交換
クロマトグラフィー試験は、それぞれ以下に示すような
方法で行った。In each example, polyacrylamide electrophoresis test,
The high-speed gel filtration chromatography test and the anion exchange chromatography test were conducted as shown below.
■ポリアクリルアミド電気泳動試験
特定の糖類を混合し、処理したヒトＳＯＤの凍結または
凍結乾燥保存における副生物生成の分析（以下、電気泳
動分析という）を、レムリの方法（Ｎａｔｕｒｅ、２２
７，６８０ （１９７０））に準じて次の通りに行った
。■Polyacrylamide electrophoresis test Analysis of by-product formation during freezing or freeze-drying storage of human SOD treated with a mixture of specific sugars (hereinafter referred to as electrophoresis analysis) is carried out using Laemmli's method (Nature, 22).
7,680 (1970)) as follows.
濃縮ゲル濃度が３％、分離ゲル濃度が１２．５％のミニ
スラブゲル（縦；６０ｍｍ、横；Ｌｏｏｍｍ、分離部分
；４５ｍｍ。穴；１０個。）を作製し、還元変性処理し
た試料を２０μｇ／穴の割合で穴に入れ、２０ｍＡの一
定電流下で泳動後、コマジ−ブリリアントブルーＲ−２
５０を用いてその泳動試料を染色した。分子量マーカー
としてファルマシア社製の電気泳動用のものを使用した
場合には、ヒトＳＯＤは２０ＫＤ（キロダルトン）（モ
ノマー）の位置に、また、副生物は４０ＫＤの位置に確
認される。A mini-slab gel with a concentration gel concentration of 3% and a separation gel concentration of 12.5% (length: 60 mm, width: Loom, separation section: 45 mm, holes: 10) was prepared, and a sample subjected to reduction denaturation treatment was prepared at 20 μg/min. After electrophoresis under a constant current of 20 mA, Komazi-Brilliant Blue R-2
50 was used to stain the electrophoresis sample. When a molecular weight marker manufactured by Pharmacia for electrophoresis is used, human SOD is confirmed at a position of 20 KD (kilodalton) (monomer), and by-products are confirmed at a position of 40 KD.
■高速ゲル濾過クロマトグラフィー試験特定の糖類を混
合し、処理したヒｌ−３ＯＤの凍結または凍結乾燥保存
における副生物生成の高速ゲル濾過クロマトグラフィー
による分析（以下、ゲル濾過分析という）を、次の通り
に行った。■High-speed gel filtration chromatography test The analysis by high-speed gel filtration chromatography (hereinafter referred to as gel filtration analysis) of the formation of by-products during freezing or freeze-drying storage of HiI-3OD mixed with specific saccharides and treated (hereinafter referred to as gel filtration analysis) is carried out as follows. I went to the street.
カラムとしてＴＳＫ−３０００ＳＷ （東洋曹達層）、
溶出液として５０ｍＭリン酸ナトリウム−０，２Ｍ塩化
ナトリウム溶液（ｐＨ７）を用い、流速０．７ｍｊｌ！
／ｍｉｎで行った。分子量マーカーとしてオリエンタル
酵母社の高速ゲル濾過クロマトグラフィーを用いた場合
には、ヒトＳＯＤは４０ＫＤの位置に確認され、副生物
は７９ＫＤの位置にＴａ認された。TSK-3000SW (Toyo Soda Formation) as a column,
A 50 mM sodium phosphate-0.2M sodium chloride solution (pH 7) was used as the eluent, and the flow rate was 0.7 mjl!
/min. When high-speed gel filtration chromatography from Oriental Yeast Co., Ltd. was used as a molecular weight marker, human SOD was confirmed at the 40 KD position, and Ta was detected as a by-product at the 79 KD position.
■陰イオン交換クロマトグラフィー試験特定の糖類を混
合し、処理したヒトＳＯＤの凍結または凍結乾燥保存に
おける変化を、カラムとしてＴＳ−ＤＥＡＥ ５ＰＷ
（東洋曹達層）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィ
ーによる分析（以下、ＤＥＡＥ分析という）で、次の通
りに行った。■Anion exchange chromatography test Changes during freezing or freeze-drying storage of human SOD mixed with specific sugars and treated with TS-DEAE 5PW as a column.
Analysis by anion exchange chromatography (hereinafter referred to as DEAE analysis) using (Toyo Soda Formation) was performed as follows.
カラムとしてＴＳ−ＤＥＡＥ ５ＰＷを用い、溶出液
としてＡ液〔２０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８゜５）〕とＢ
ｉ（２ＱｍＭトリス酢酸−０，５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ８，５））とを用いたリニアグラデイエンド法（Ｂ液
を７４分で０％から１５％とした。）によって、流速０
．８ｍｆ／ｍｉｎで行った。TS-DEAE 5PW was used as a column, and solution A [20mM Tris acetic acid (pH 8.5)] and B were used as eluents.
i (2QmM Tris acetate-0,5M sodium acetate (p
The flow rate was 0 using the linear gradient end method (liquid B was changed from 0% to 15% in 74 minutes) using H8,5)).
．． The speed was 8mf/min.
実施例１
０．３１ｍ１のヒトＳＯＤ溶液（ヒトＳＯＤ１００ｍｇ
／蒸留水１ｍ１）に７４ｍｇの糖アルコール類であるソ
ルビトールを加えた後に、蒸留水で全量を１ｍ２とした
。これをバイアル瓶に入れ、−２０℃で凍結した後、室
温下で融解し、前記試験法のゲル濾過分析（■）及びＤ
ＥＡＥ分析（■）で糖添加による凍結保存ヒトＳＯＤの
安定性を検討した。Example 1 0.31 ml of human SOD solution (100 mg of human SOD
After adding 74 mg of sorbitol, which is a sugar alcohol, to 1 ml of distilled water, the total volume was made up to 1 m 2 with distilled water. This was placed in a vial, frozen at -20°C, thawed at room temperature, and subjected to gel filtration analysis (■) in the above test method.
The stability of cryopreserved human SOD by addition of sugar was examined by EAE analysis (■).
ゲル濾過分析では、７９ＫＤの副生物が認められた。そ
して、その生成量は、連続５回の凍結融解で０． ＯＯ
７％、連続１０回の凍結融解で０．００８％であった。Gel filtration analysis revealed a 79 KD by-product. The amount produced was 0.0 after freezing and thawing 5 times in a row. OO
7%, and 0.008% after 10 consecutive freeze-thaw cycles.
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た。No denaturation of human SOD was observed in DEAE analysis.
実施例２
ソルビトールの代わりに塘アルコール類であるイノシト
ールを用いた以外は、実施例１と同様にして糖添加によ
る凍結保存ヒトＳＯＤの安定性を検討した。Example 2 The stability of cryopreserved human SOD by addition of sugar was investigated in the same manner as in Example 1, except that inositol, an alcohol, was used instead of sorbitol.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、連続５回、連続１０回の凍結融解で、それぞれ０．０
１４．０．０１１％であった。The amount of the 79KD byproduct observed in gel filtration analysis was 0.0 after 5 consecutive freeze-thaw cycles and 10 consecutive freeze-thaw cycles.
It was 14.0.011%.
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た。No denaturation of human SOD was observed in DEAE analysis.
実施例３−
ソルビトールの代わりに二Ｉｉ類であるスクロースを用
いた以外は、実施例１と同様にして糖添加による凍結保
存ヒトＳＯＤの安定性を検討した。Example 3 - The stability of cryopreserved human SOD by sugar addition was investigated in the same manner as in Example 1 except that sucrose, which is a class IIi substance, was used instead of sorbitol.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．００４．０．００８％であった。The amount of 79KD by-product produced was 0.004.0.008% as determined by gel filtration analysis.
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た。No denaturation of human SOD was observed in DEAE analysis.
実施例４
ソルビトールの代わりに二糖類であるトレハロースを用
いた以外は、実施例１と同様にして糖添加による凍結保
存ヒトＳＯＤの安定性を検討した。Example 4 The stability of cryopreserved human SOD by sugar addition was investigated in the same manner as in Example 1, except that trehalose, a disaccharide, was used instead of sorbitol.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、連続５回、連続１０回の凍結融解で、それぞれＯ，Ｏ
Ｏ８，０，００７％であった。The amount of the 79KD byproduct observed in gel filtration analysis was 5 consecutive freeze-thaw cycles and 10 consecutive freeze-thaw cycles, respectively.
The O was 8,0,007%.
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た。No denaturation of human SOD was observed in DEAE analysis.
実施例５
ソルビトールの代わりに二Ｗ類であるマルトースを用い
た以外は、実施例１と同様にして塘添加による凍結保存
ヒトＳＯＤの安定性を検討した。Example 5 The stability of cryopreserved human SOD by addition of a container was examined in the same manner as in Example 1, except that maltose, which is a 2W class, was used instead of sorbitol.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、連続５回、連続１０回の凍結融解で、それぞれ０．０
０４．０． ＯＯ７％であった。The amount of the 79KD byproduct observed in gel filtration analysis was 0.0 after 5 consecutive freeze-thaw cycles and 10 consecutive freeze-thaw cycles.
04.0. OO was 7%.
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た。No denaturation of human SOD was observed in DEAE analysis.
比較例１
ソルビトールを用いない以外は、実施例１と同様にして
糖無添加による凍結保存し）ＳＯＤの安定性を検討した
。Comparative Example 1 The stability of SOD was examined in the same manner as in Example 1 except that sorbitol was not used, and cryopreservation was performed without adding sugar.
ゲル濾過分析で認められた’７９ＫＤの副生物の生成量
は、連続５回、連続１０回の凍結融解で、それぞれ０．
０１９．０．０２８％であった。The amount of the '79KD byproduct observed in gel filtration analysis was 0.00% after 5 consecutive freeze-thaw cycles and 10 consecutive freeze-thaw cycles.
It was 0.019.0.028%.
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかう
た。No denaturation of human SOD was observed in DEAE analysis.
実施例１〜５における糖添加、及び比較例１における塘
無添加による凍結保存ヒトＳＯＤの安定性についての結
果を、第１表に示す。Table 1 shows the results regarding the stability of cryopreserved human SOD with addition of sugar in Examples 1 to 5 and without addition of sugar in Comparative Example 1.
第１表
実施例６
０、５ ｍ ｌのヒトＳＯＤ？８液（ヒトＳＯＤ １０
０ｍｇ／Ｎ留水１ｍｊり にｌ ＯＯｍｇ（７）１ｉｉ
フルコール類であるソルビトールを加えた後に、蒸留水
で全量を１ｍ２とした。これをバイアル瓶に入れ、−８
Ｑ℃で凍結した後、減圧下（２００〜５００ｍＴｏｒｒ
）で−晩乾燥した。得られた凍結乾燥ヒトＳＯＤを蒸留
水に溶解した後、凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討し
た。Table 1 Example 6 0.5 ml of human SOD? 8 liquid (human SOD 10
0mg/N distilled water 1mj l OOmg(7)1ii
After adding sorbitol, which is a flucol, the total volume was made up to 1 m2 with distilled water. Put this in a vial and -8
After freezing at Q℃, under reduced pressure (200-500 mTorr)
) overnight. After dissolving the obtained freeze-dried human SOD in distilled water, the stability of the freeze-dried human SOD was examined.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０８％であった。The amount of 79KD by-product produced was 0.08% as determined by gel filtration analysis.
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た（第１図）。No denaturation of human SOD was observed in DEAE analysis (Figure 1).
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は、認められなかった。In electrophoretic analysis, no by-product with a molecular weight of 40 KD was observed.
実施例７
ソルビトールの代わりに糖アルコール類であるマンニト
ールを用いた以外は、実施例６と同様にして糖添加によ
る凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。Example 7 The stability of freeze-dried human SOD with addition of sugar was examined in the same manner as in Example 6, except that mannitol, a sugar alcohol, was used instead of sorbitol.
ゲル濾過分析で認められた’７９ＫＤの副生物の生成量
は、０．２３％であった。The amount of '79KD by-product produced was 0.23% as determined by gel filtration analysis.
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た（第２図）。No denaturation of human SOD was observed in DEAE analysis (Figure 2).
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物が認められた。In electrophoretic analysis, a by-product with a molecular weight of 40 KD was observed.
実施例８
ソルビトールの代わりに糖アルコール類であるイノシト
ールを用いた以外は、実施例６と同様にして塘添加によ
る凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。Example 8 The stability of freeze-dried human SOD by the addition of a tong was investigated in the same manner as in Example 6, except that inositol, a sugar alcohol, was used instead of sorbitol.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．１１％であった。The amount of 79KD by-product produced was 0.11% as determined by gel filtration analysis.
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た（第３図）。No denaturation of human SOD was observed in DEAE analysis (Figure 3).
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は認められなかった。In electrophoretic analysis, no by-product with a molecular weight of 40 KD was observed.
実施例９
ソルビトールの代わりに二糖類であるスクロースを用い
た以外は、実施例６と同様にして糖添加による凍結乾燥
ヒトＳＯＤの安定性を検討した。Example 9 The stability of freeze-dried human SOD by sugar addition was investigated in the same manner as in Example 6, except that sucrose, a disaccharide, was used instead of sorbitol.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０４％であった。The amount of 79KD by-product produced was 0.04% as determined by gel filtration analysis.
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た（第４図）。No denaturation of human SOD was observed in DEAE analysis (Figure 4).
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は認められなかった。In electrophoretic analysis, no by-product with a molecular weight of 40 KD was observed.
実施例１０
ソルビトールの代わりに二糖類であるトレハロースを用
いた以外は、実施例６と同様にして塘添加による凍結乾
燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。Example 10 The stability of lyophilized human SOD by addition of a tong was investigated in the same manner as in Example 6, except that trehalose, a disaccharide, was used instead of sorbitol.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０５％であった。The amount of 79KD by-product produced was 0.05% as determined by gel filtration analysis.
ＤＥＡＥ分析では、ヒｌ−３ＯＤの変性は認められなか
った（第５図）。No denaturation of HiI-3OD was observed in DEAE analysis (Figure 5).
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は認められなかった。In electrophoretic analysis, no by-product with a molecular weight of 40 KD was observed.
実施例１１
ソルビトールの代わりに二糖類であるマル） −スを用
いた以外は、実施例６と同様にして糖添加による凍結乾
燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。Example 11 The stability of freeze-dried human SOD by addition of sugar was investigated in the same manner as in Example 6, except that the disaccharide malsu was used instead of sorbitol.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０１％であった。The amount of 79KD by-product produced was 0.01% as determined by gel filtration analysis.
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た（第６図）。No denaturation of human SOD was observed in DEAE analysis (Figure 6).
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は認められなかった。In electrophoretic analysis, no by-product with a molecular weight of 40 KD was observed.
実施例１２
ソルビトールの代わりに二糖類であるラクトースを用い
た以外は、実施例６と同様にして糖添加による凍結乾燥
ヒトＳＯＤの安定性を検討した。Example 12 The stability of freeze-dried human SOD by sugar addition was investigated in the same manner as in Example 6, except that lactose, a disaccharide, was used instead of sorbitol.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０％であった。The amount of 79KD by-product produced was 0% as determined by gel filtration analysis.
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た（第７図）。No denaturation of human SOD was observed in DEAE analysis (Figure 7).
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は認められなかった。In electrophoretic analysis, no by-product with a molecular weight of 40 KD was observed.
実施例１３
ソルビトールの代わりにケトース類の単糖類であるフル
クトースを用いた以外は、実施例６と同様にして糖添加
による凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。Example 13 The stability of freeze-dried human SOD by sugar addition was examined in the same manner as in Example 6, except that fructose, a ketose monosaccharide, was used instead of sorbitol.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０１％であった。The amount of 79KD by-product produced was 0.01% as determined by gel filtration analysis.
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た（第８図）。No denaturation of human SOD was observed in DEAE analysis (Figure 8).
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は認められなかった。In electrophoretic analysis, no by-product with a molecular weight of 40 KD was observed.
比較例２ ・
ソルビトールを用いない以外は、実施例６と同様にして
糖無添加による凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した
。Comparative Example 2 - The stability of freeze-dried human SOD without the addition of sugar was examined in the same manner as in Example 6, except that sorbitol was not used.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．４５％であった。The amount of 79KD by-product produced was 0.45% as determined by gel filtration analysis.
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た（第１２図）。No denaturation of human SOD was observed in DEAE analysis (Figure 12).
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物が認められた。In electrophoretic analysis, a by-product with a molecular weight of 40 KD was observed.
比較例３
ソルビトールの代わりに単１！、［であるアラビノース
を用いた以外は、実施例６と同様にして糖添加による凍
結乾燥ヒトＳｏＤの安定性を検討した。Comparative Example 3 Single molecule instead of sorbitol! , [] The stability of freeze-dried human SoD by sugar addition was investigated in the same manner as in Example 6, except that arabinose was used.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０３％であった。The amount of 79KD by-product produced was 0.03% as determined by gel filtration analysis.
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性が認めらた（第９
図）。In DEAE analysis, denaturation of human SOD was observed (9th
figure).
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は認められなかった。In electrophoretic analysis, no by-product with a molecular weight of 40 KD was observed.
比較例４
ソルビトールの代わりに単複類であるグルコースを用い
た以外は、実施例６と同様にして糖添加による凍結乾燥
ヒトＳＯＤの安定性を検討した。Comparative Example 4 The stability of freeze-dried human SOD by sugar addition was investigated in the same manner as in Example 6, except that glucose, which is a simple compound, was used instead of sorbitol.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０１％であった。The amount of 79KD by-product produced was 0.01% as determined by gel filtration analysis.
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性が認めらた（第１
０図）。In DEAE analysis, denaturation of human SOD was observed (first
Figure 0).
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は認められなかった。In electrophoretic analysis, no by-product with a molecular weight of 40 KD was observed.
比較例５
ソルビトールの代わりに単糖類であるガラクトースを用
いた以外は、実施例６と同様にして糖添加による凍結乾
燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。Comparative Example 5 The stability of freeze-dried human SOD by sugar addition was examined in the same manner as in Example 6, except that galactose, a monosaccharide, was used instead of sorbitol.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０６％であうた。The amount of 79KD by-product produced was 0.06%, as determined by gel filtration analysis.
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性が認めらた（第１
１図）。In DEAE analysis, denaturation of human SOD was observed (first
Figure 1).
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は認められなかった。In electrophoretic analysis, no by-product with a molecular weight of 40 KD was observed.
実施例６〜１３及び比較例３〜５における糖添加、及び
比較例２における糖無添加による凍結乾燥保存ヒ、）Ｓ
ＯＤの安定性についての結果を、第２表に示す。Freeze-drying storage with added sugar in Examples 6 to 13 and Comparative Examples 3 to 5, and no added sugar in Comparative Example 2)S
The results for OD stability are shown in Table 2.
（以下、余白）
第２表
実施例１４
０．５ ｍ ｌのヒトＳＯＤ溶液（ヒトＳＯＤ １００
ｍｇ／薫留水１ｍ１）に５ｍｇの糖アルコール類である
ソルビトールを加えた後に、蒸留水で全量をＬｍｌとし
た。これをバイアル瓶に入れ、−２０°Ｃで凍結した後
、減圧下（２００−５００ｍＴｏｒｒ）で−晩乾燥した
。得られた凍結乾燥ヒトＳＯＤを蒸留水に溶解した後、
凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。(Hereinafter, blank space) Table 2 Example 14 0.5 ml human SOD solution (human SOD 100
After adding 5 mg of sorbitol, which is a sugar alcohol, to 1 ml of smoked water, the total volume was made up to L ml with distilled water. This was placed in a vial, frozen at -20°C, and then dried under reduced pressure (200-500 mTorr) overnight. After dissolving the obtained freeze-dried human SOD in distilled water,
The stability of lyophilized human SOD was investigated.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．２３６％であった。The amount of 79KD by-product produced was 0.236% as determined by gel filtration analysis.
実施例１５
ソルビトールを１２．５ ｍ ｇ用いた以外は１．実施
例１４と同様にして糖添加による凍結乾燥ヒトＳＯＤの
安定性を検討した。Example 15 1. except that 12.5 mg of sorbitol was used. In the same manner as in Example 14, the stability of freeze-dried human SOD by adding sugar was investigated.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．１０４％であった。The amount of 79KD by-product produced was 0.104% as determined by gel filtration analysis.
実施例１６
ソルビトールを２５ｍｇ用いた以外は、実施例１４と同
様にして糖添加による凍結乾燥ヒトＳ０Ｄの安定性を検
討した。Example 16 The stability of freeze-dried human S0D by sugar addition was investigated in the same manner as in Example 14, except that 25 mg of sorbitol was used.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０６５％であった。The amount of 79KD by-product produced was 0.065% as determined by gel filtration analysis.
実施例１７
ソルビトールを５０ｍｇ用いた以外は、実施例１４と同
様にして塘添加による凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検
討した。Example 17 The stability of lyophilized human SOD by addition of a tong was investigated in the same manner as in Example 14, except that 50 mg of sorbitol was used.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０３８％であった。The amount of 79KD by-product produced was 0.038% as determined by gel filtration analysis.
実施例１８
ソルビトールを１００ｍｇ用いた以外は、実施例１４と
同様にして糖添加による凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を
検討した。Example 18 The stability of freeze-dried human SOD by sugar addition was investigated in the same manner as in Example 14, except that 100 mg of sorbitol was used.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０１２％であった。The amount of 79KD by-product produced was 0.012% as determined by gel filtration analysis.
実施例１９
ソルビトールを２００ｍｇ用いた以外は、実施例１４と
同様にして糖添加による凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を
検討した。Example 19 The stability of freeze-dried human SOD by sugar addition was investigated in the same manner as in Example 14, except that 200 mg of sorbitol was used.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０． ｆ） ２６％であった。The amount of 79KD by-product produced by gel filtration analysis was 0. f) It was 26%.
実施例２０
ソルビトールを３００ｍｇ用いた以外は、実施例１４と
同様にして糖添加による凍結乾燥ヒトｓＯＤの安定性を
検討した。Example 20 The stability of freeze-dried human sOD by sugar addition was investigated in the same manner as in Example 14, except that 300 mg of sorbitol was used.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０％であった。The amount of 79KD by-product produced was 0% as determined by gel filtration analysis.
比較例６
ソルビトールを用いない以外は、実施例１４と同様にし
て媚態添加による凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討し
た。Comparative Example 6 The stability of freeze-dried human SOD by adding aphrodisiacs was investigated in the same manner as in Example 14, except that sorbitol was not used.
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．４２５％であった。The amount of 79KD by-product produced was 0.425% as determined by gel filtration analysis.
実施例１４〜２０における糖添加及び比較例６における
媚態添加による凍結乾燥保存ヒｌ−３ＯＤの安定性につ
いての結果を、第３表及び図１３に示す。Table 3 and FIG. 13 show the results regarding the stability of freeze-dried stored Hi1-3OD obtained by adding sugar in Examples 14 to 20 and adding aphrodisiacs in Comparative Example 6.
第３表
〔発明の効果〕
本発明の方法（即ち、二糖類、ケトース類の単糖類、糖
アルコール類のうちの少なくとも一種以上の糖とヒトＳ
ＯＤとを混合し、処理して得られた溶液を凍結または凍
結乾燥する方法）によって、ヒｌ−３ＯＤを凍結または
凍結乾燥状態で安定に保存することができる。Table 3 [Effects of the Invention] The method of the present invention (i.e., at least one sugar selected from disaccharides, ketose monosaccharides, and sugar alcohols) and human S
Hi1-3OD can be stably stored in a frozen or lyophilized state by mixing with OD and freezing or lyophilizing the resulting solution.
４、図面の説明
第１図は、実施例６に記載したＤＥＡＥ分析の結果を示
す。4. Description of the Drawings FIG. 1 shows the results of the DEAE analysis described in Example 6.
第２図は、実施例７に記載したＤＥＡＥ分析の結果を示
す。FIG. 2 shows the results of the DEAE analysis described in Example 7.
第３図は、実施例８に記載したＤＥＡＥ分析の結果を示
す。FIG. 3 shows the results of the DEAE analysis described in Example 8.
第４図は、実施例９に記載したＤＥＡＥ分析の結果を示
す。FIG. 4 shows the results of the DEAE analysis described in Example 9.
第５図は、実施例１０に記載したＤＥＡＥ分析の結果を
示す。FIG. 5 shows the results of the DEAE analysis described in Example 10.
第６図は、実施例１１に記載したＤＥＡＥ分析の結果を
示す。FIG. 6 shows the results of the DEAE analysis described in Example 11.
第７図は、実施例１２に記載したＤＥＡＥ分析の結果を
示す。FIG. 7 shows the results of the DEAE analysis described in Example 12.
第８図は、実施例１３に記載したＤＥＡＥ分析の結果を
示す。FIG. 8 shows the results of the DEAE analysis described in Example 13.
第９図は、比較例３に記載したＤＥＡＥ分析の結果を示
す。FIG. 9 shows the results of the DEAE analysis described in Comparative Example 3.
第１Ｏ図は、比較例４に記載したＤＥＡＥ分析の結果を
示す。FIG. 1O shows the results of the DEAE analysis described in Comparative Example 4.
第１１図は、比較例５に記載したＤＥＡＥ分析の結果を
示す。FIG. 11 shows the results of the DEAE analysis described in Comparative Example 5.
第１２図は、比較例２に記載したＤＥＡＥ分析の結果を
示す。FIG. 12 shows the results of the DEAE analysis described in Comparative Example 2.
第１３図は、実施例１４〜２０における塘添加及び比較
例６における媚態添加による凍結乾燥保存ヒトＳＯＤの
安定性の結果を示す。FIG. 13 shows the stability results of freeze-dried stored human SOD by addition of tongs in Examples 14 to 20 and aphrodisiac addition in Comparative Example 6.
特許出願人 宇部興産株式会社
第１図
第２図
第３図
第４図
第５図
第６図
第７図
第８図
第９図
第１０図
第１１図
第１２図
第１３図
ソルビトール／ヒトＳ００ （Ｗ／ｗ）手続補正書（方
式）
％式％
１、事件の表示
特願昭６３−１３５４５７号
２、 発明の名称
ヒトＣｕ、Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼの安定
保存方法
３、補正をする者
事件との関係 特許出願人
郵便番号 ７５５
山口県宇部市西本町１丁目１２番３２号４、補正命令の
日付
発送日：昭和６３年８月３０日
５、補正により増加する発明の数 （なし）６．補正
の対象
図面
７、補正の内容
（１） 図面の第１図〜第１３図を別紙の通り補正す
る。Patent applicant: Ube Industries, Ltd. Figure 1 Figure 2 Figure 3 Figure 4 Figure 5 Figure 6 Figure 7 Figure 8 Figure 9 Figure 10 Figure 11 Figure 12 Figure 13 Sorbitol/Human S00 (W/w) Procedural amendment (method) % formula % 1, Indication of the case Japanese Patent Application No. 1983-135457 2, Name of the invention Method for stable preservation of human Cu, Zn type superoxide dismutase 3, Person making the amendment Case Relationship with Patent applicant postal code 755 1-12-32 Nishihonmachi, Ube City, Yamaguchi Prefecture 4 Date of amendment order Sent date: August 30, 1988 5 Number of inventions increased by amendment (none) 6 ．． Drawing 7 to be corrected, content of correction (1) Figures 1 to 13 of the drawings will be corrected as shown in the attached sheet.
以上 第１図 第２図 第３図 第４図 第５図 第６図 第７図 第８図 第９図 第１０図 第１１図 第１２図 第１３図that's all Figure 1 Figure 2 Figure 3 Figure 4 Figure 5 Figure 6 Figure 7 Figure 8 Figure 9 Figure 10 Figure 11 Figure 12 Figure 13
Claims (1)
、ヒトＳＯＤと略す）の保存において、ヒトＳＯＤと二
糖類、ケトース類の単糖類、糖アルコール類のうちの少
なくとも一種以上の糖とを混合して、保存することを特
徴とするヒトＳＯＤの安定保存法。In preserving human Cu, Zn-type superoxide dismutase (hereinafter abbreviated as human SOD), human SOD is mixed with at least one type of sugar selected from disaccharides, ketose monosaccharides, and sugar alcohols. A method for stably preserving human SOD, characterized by:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13545788A JPH01304882A (en) | 1988-06-03 | 1988-06-03 | Stable storing method of superoxide dismutase of human cu, zn-type |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13545788A JPH01304882A (en) | 1988-06-03 | 1988-06-03 | Stable storing method of superoxide dismutase of human cu, zn-type |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01304882A true JPH01304882A (en) | 1989-12-08 |
Family
ID=15152160
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13545788A Pending JPH01304882A (en) | 1988-06-03 | 1988-06-03 | Stable storing method of superoxide dismutase of human cu, zn-type |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01304882A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
1988
- 1988-06-03 JP JP13545788A patent/JPH01304882A/en active Pending
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| US7186824B2 (en) | 1997-03-04 | 2007-03-06 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Reduction inhibitory agent for active-oxygen eliminating activity |
| WO2001000230A1 (en) * | 1999-06-24 | 2001-01-04 | Ltt Institute Co., Ltd. | Drug composition containing lecithin-modified superoxide dismutase |
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