JPH01281079A - Attenuated strain of plant virus and preparation thereof - Google Patents
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は植物ウィルスの弱毒株およびそれを効率よく人
為的に作成する方法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Field of Industrial Application] The present invention relates to an attenuated strain of a plant virus and a method for efficiently and artificially producing the same.
植物に感染するウィルスの圧倒的大多数はRNAウィル
スである。植物RNAウィルスには1本のRNAをゲノ
ムとする単粒゛子性のものと2本以上のRNAにゲノム
が分節した多粒子性のものとがあり、それぞれ数多くの
種類がある。代表的な植物RNAウィルスとして、タバ
コモザイクウィルス(TMV)、キュウリモザイクウィ
ルス(CMV) 、アルファルファモザイクウィルス(
AIMV) 、ブロムモザイクウィルス(BMV) 、
ササゲモザイクウィルス(CPMV) 、ジャガイモウ
ィルスX (PVX)、ジャガイモウィルスY(PVY
)などをあげることができる。The overwhelming majority of viruses that infect plants are RNA viruses. There are many types of plant RNA viruses, including uniparticulate ones whose genome consists of one RNA and multiparticulate ones whose genomes are segmented into two or more RNAs. Representative plant RNA viruses include tobacco mosaic virus (TMV), cucumber mosaic virus (CMV), and alfalfa mosaic virus (
AIMV), Brome Mosaic Virus (BMV),
Cowpea mosaic virus (CPMV), potato virus X (PVX), potato virus Y (PVY)
) etc. can be given.
遺伝子構造が解明された植物RNAウィルスはまだ数少
ないが、ゲノムRNAはウィルスの機能に必要な遺伝子
をコードした部分とタンパク質に翻訳されない部分(非
コード領域)とからなることが知られている。算コード
領域はゲノムRNAの両末端部分にそれぞれ数十から数
百塩基存在し、ウィルスの複製過程において何らかの働
きをしているものと想像されている。ゲノム内部の遺伝
子間にも非コード領域が介在することがある。Although there are still only a few plant RNA viruses whose genetic structures have been elucidated, it is known that genomic RNA consists of a portion that encodes genes necessary for virus function and a portion that is not translated into proteins (non-coding region). The computational coding region exists at each end of the genomic RNA from several tens to several hundred bases, and is thought to play some role in the viral replication process. Non-coding regions may also exist between genes within the genome.
ウィルスによる病害は作物に甚大な被害を与えており、
例えば昭和58年の日本国内におけるウィルスによる被
害額は約8(10億円と見積られている。Diseases caused by viruses are causing severe damage to crops.
For example, in 1982, the amount of damage caused by the virus in Japan was estimated to be approximately 8 billion yen.
しかしながら現在まだウィルスに対する効果的な治療法
はなく、その防除はもっばらウィルスの感染を防ぐこと
に主眼がおかれている。そのような感染防除に効果をあ
げている技術の一つとして、近縁ウィルス間の干渉作用
を利用した方法があり、いくつかのウィルス病において
実用化されている〔栃原、農業技術41.48H198
6))。However, there is currently no effective treatment for the virus, and the main focus of its control is on preventing virus infection. One of the effective techniques for controlling such infections is a method that utilizes the interference between closely related viruses, and has been put into practical use for several viral diseases [Tochihara, Agricultural Technology 41.48H198
6)).
干渉作用とは、あるウィルスに感染した植物は近縁のウ
ィルスによる二次感染から保護されるという現象である
。そこで、病害を引き起こすウィルスにごく近縁でそれ
自身は病害を全くあるいはごくわずかしか起こさないよ
うなウィルス株、すなわち弱毒株が得られれば、作物に
あらかじめ弱毒株を感染させておくことにより、病害を
起こすウィルスの感染を抑えることができる。Interference is a phenomenon in which plants infected with one virus are protected from secondary infection by closely related viruses. Therefore, if a virus strain that is closely related to the virus that causes disease and causes no or very little disease damage, that is, a weakly virulent strain, can be used to infect crops with the weakened strain in advance to prevent disease. It can suppress the infection of viruses that cause
干渉作用を利用してウィルス防除を行おうとする場合、
最大のポイントは実用に耐える優秀な弱毒株が得られる
かどうかである。現在実用されている弱毒ウィルスには
、自然界から分離されたもの(例えばカンキツトリスブ
ザウィルス(CT V )の弱毒株)および人工的に作
出されたもの(トマト系タバコモザイクウィルス(TM
V)の弱毒株、キュウリ縁座モザイクウィルス(CGM
MV)の弱毒株など)がある0人工的に弱毒株を作出す
る方法として従来用いられてきたのは、野外の強毒株か
ら高温処理や亜硝酸処理などにより弱毒性突然変異株を
誘発して選抜する方法[例えば、後藝・41本、北海道
農業試験場電報99.67(1971);Yehand
Gonsalves、 Phytopatholog
y 74+1086(1984)]であるが、その作出
は偶然に依存しており効率的でない。近年、多粒子性ウ
ィルスでのゲノム成分の交換やサテライトRNAの利用
による弱毒株の作出が試みられている[花田、BIOI
NDtlSTRY 4゜357(1987) ]が、ま
だ実用的な弱毒株の作出には至っておらず、また単粒子
性のウィルスあるいはサテライトRNAを持たないウィ
ルスには応用できない。When trying to control viruses by using interference,
The most important point is whether an excellent attenuated strain that can withstand practical use can be obtained. Attenuated viruses currently in use include those isolated from nature (for example, attenuated strains of Citrus tris buzavirus (CT V )) and those artificially created (Tomato tobacco mosaic virus (TM)).
V), an attenuated strain of cucumber marginal locus mosaic virus (CGM)
Conventionally, the method used to artificially create attenuated strains is to induce attenuated mutant strains from highly virulent strains in the field through high temperature treatment, nitrous acid treatment, etc. [For example, Gogi 41, Hokkaido Agricultural Experiment Station Telegram 99.67 (1971);
Gonsalves, Phytopatholog
y 74+1086 (1984)], but its creation depends on chance and is not efficient. In recent years, attempts have been made to create attenuated strains of multiparticulate viruses by exchanging genome components and using satellite RNA [Hanada, BIOI
NDtlSTRY 4゜357 (1987)], but a practical attenuated strain has not yet been produced, and it cannot be applied to single-particle viruses or viruses without satellite RNA.
一方最近になって、いくつかの植物RNAウィルスにお
いてその完全長cDNAからインビトロ転写反応により
感染性のあるウィルスRNAを作成することが可能にな
り[Ahlquist et al、、Proc。On the other hand, recently, it has become possible to generate infectious viral RNA from the full-length cDNA of several plant RNA viruses by in vitro transcription reaction [Ahlquist et al., Proc.
Natl、Acad、Sci、USA 81.7066
(1984);Meshi et al、、Proc、
Natl、Acad、Sci、USA 83.504
3(1986) ] 、cDNAを改変することにより
ウィルスゲノムRNA上の任意の場所に計画的に突然変
異を導入できるようになった。Natl, Acad, Sci, USA 81.7066
(1984); Meshi et al., Proc.
Natl, Acad, Sci, USA 83.504
3 (1986)], by modifying cDNA, it has become possible to intentionally introduce mutations into any location on the viral genome RNA.
(発明が解決しようとする課題〕
本発明者らは、ウィルスによる作物の病害の防除に用い
うる安定な植物ウィルス弱毒株およびこれを計画的に作
出する方法を開発すべく鋭意研究し、トマト系TMV−
L株を用いて種々の突然変異をゲノムRNA上に導入し
てその効果を研究した結果、驚(べきことにゲノムRN
A上の非コード領域に突然変異を導入することにより弱
毒株が得られることを見いだし、本発明を完成した。(Problems to be Solved by the Invention) The present inventors have conducted extensive research to develop a stable attenuated plant virus strain that can be used to control crop diseases caused by viruses, and a method for systematically producing this strain, and have TMV-
As a result of introducing various mutations into the genomic RNA using the L strain and studying their effects, we found that, surprisingly, the genomic RNA
They discovered that an attenuated strain could be obtained by introducing mutations into the non-coding region of A, and completed the present invention.
なお、ここで「安定な」弱毒株とは復帰突然変異を起こ
して強毒株に戻ることがないことをいう。Note that a "stable" attenuated strain here means that it does not undergo reversion and return to a highly virulent strain.
〔課題を解決するための手段]
本発明は、ゲノムRNA上の非コード領域に突然変異部
位を持つことからなる植物RNAウィルスの弱毒株、ゲ
ノムRNAの3′末端部に位置する非コード領域に突然
変異部位を持つ植物RNAウィルスの弱毒株、ゲノムR
NAの3′末端部のトランスファーRNA様構造部分と
コートタンパク質のコード領域との間にある非コード領
域に突然変異部位を持つ植物RNAウィルスの弱毒株、
上記各ウィルスがトバモウィルスに属するものからなる
植物RNAウィルスの弱毒株、上記各突然変異が欠損突
然変異からなる植物RNAウィルスの弱毒株、並びにこ
れら植物RNAウィルスの弱毒株の作成法である。[Means for Solving the Problems] The present invention provides an attenuated strain of a plant RNA virus that has a mutation site in a non-coding region of the genomic RNA, and a non-coding region located at the 3' end of the genomic RNA. Genome R, an attenuated strain of plant RNA virus with a mutation site
An attenuated strain of plant RNA virus that has a mutation site in the non-coding region between the transfer RNA-like structure at the 3' end of NA and the coat protein coding region;
The present invention is a method for producing attenuated strains of plant RNA viruses in which each of the above-mentioned viruses belongs to Tobamovirus, attenuated strains of plant RNA viruses in which each of the above-mentioned mutations is a deletion mutation, and attenuated strains of these plant RNA viruses.
本発明の植物RNAウィルスとしては、タバコモザイク
ウィルス(TMV)、キュウリ縁座モザイクウィルス(
CGMMV) 、ハイビスカス黄斑ウィルス、オドント
グロッサムリングスポットウィルス、キュウリモザイク
ウィルス(CMV)、アルファルファモザイクウィルス
(AIMV)、ブロムモザイクウィルス(BMV)、サ
サゲモザイクウィルス(CPMV)、ジャガイモウィル
スx(PVX)、ジャガイモウィルスY(PvY)など
が挙げられる。The plant RNA viruses of the present invention include tobacco mosaic virus (TMV), cucumber marginal locus mosaic virus (
CGMMV), Hibiscus yellow spot virus, Odontoglossum ringspot virus, Cucumber mosaic virus (CMV), Alfalfa mosaic virus (AIMV), Brome mosaic virus (BMV), Cowpea mosaic virus (CPMV), Potato virus x (PVX), Potato virus Y (PvY), etc.
本発明のウィルス弱毒株はそのゲノム上の非コード領域
に突然変異を導入することにより作出することができる
ものであり、全身感染植物に感染した場合、全くあるい
はごくわずかの病害しか引き起こさないものである。ま
た、本発明のウィルス弱毒株は、必ずしもその全身感染
能を必須としない。すなわち、弱毒ウィルスゲノムRN
AのcDNAを植物染色体中に導入することにより、ウ
ィルス抵抗性植物を作出する技術が開発されており(特
願昭62−194038号)、本技術を用いれば、ウィ
ルス弱毒株の全身感染能は必要としない。The attenuated virus strain of the present invention can be created by introducing mutations into the non-coding region of its genome, and will cause no or only a slight amount of disease when it infects a systemically infected plant. be. Further, the attenuated virus strain of the present invention does not necessarily have the ability to infect the whole body. That is, the attenuated virus genome RN
A technology has been developed to create virus-resistant plants by introducing the cDNA of A into the plant chromosome (Japanese Patent Application No. 194038/1982). Using this technology, the ability of a weakened virus strain to infect the whole body can be reduced. do not need.
次にトバモウィルスの弱毒株作出を例として本発明を具
体的に説明する。Next, the present invention will be specifically explained using the production of an attenuated strain of tobamovirus as an example.
トバモウィルス(Tobamovtrus)は、単粒子
性の棒状ウィルスであり、タバコ、トマト、ササゲなど
に病害を与えるTMVや、キュウリ、メロンなどに病害
を与えるCGMMV、ハイビスカスに黄斑を生じるハイ
ビスカス黄斑ウィルス、シンビジウム、カドレアなどの
花弁に斑入りを生じるオドントグロソサムリングスポッ
トウィルスなどがこれに属する。TMVはトバモウィル
スの規範ウィルスであり、植物ウィルス中量も研究の進
んだウィルスの一つである。TMVには数多くの株(s
tra in)があるが、そのうち標準株の一つであ
るVulgare 、 l−マド系強毒株りおよびそ
の弱毒株L11Aについてはゲノム全長、ザサゲ系強毒
株CcおよびCGMMVについてはゲノム3′側約1(
100塩基の一次構造が知られている[ Goelet
et at、、Proc、Natl、八cad、
Sci、USA 79. 5818(1982);O
hn。Tobamovirus (Tobamovtrus) is a single-particulate rod-shaped virus, including TMV, which causes disease in tobacco, tomatoes, cowpeas, etc., CGMMV, which causes disease in cucumbers, melons, etc., Hibiscus macular virus, which causes macular spots on hibiscus, Cymbidium, and Cadrea. This includes Odontoglossosum lingspot virus, which causes variegation on the petals of flowers. TMV is a standard virus among tobamoviruses, and is one of the viruses that has been extensively studied as a plant virus. TMV has many stocks (s
Among these, one of the standard strains, Vulgare, a highly virulent strain of the l-mad strain and its attenuated strain L11A, has the full length of the genome, and that of the highly virulent strain of Cowpea, Cc, and CGMMV, approximately the 3' side of the genome. 1(
The primary structure of 100 bases is known [Goelet
et at, Proc, Natl, 8cad,
Sci, USA 79. 5818 (1982); O
hn.
et al、、J、Biochem、 96.1915
(1984); NisN15hi旧et al、、
Nucleic Ac1ds Res、 13.558
5(1985);Meshi et al、、Mo1.
Gen、Genet、184.20(1981);Me
shi et al、、Virology127,54
(1983) ] *それによると、TMVのゲノム
RNAは約64(10塩基であり、5′側から順に13
0 /180にタンパク質、30にタンパク質、コート
タンパク質の4種類のタンパク質がコードされている。et al., J.Biochem, 96.1915
(1984); NisN15hi old et al.
Nucleic Ac1ds Res, 13.558
5 (1985); Meshi et al., Mo1.
Gen, Genet, 184.20 (1981);
Shi et al., Virology127, 54
(1983)] *According to this, the genomic RNA of TMV is approximately 64 (10 bases long, 13 bases from the 5' side)
Four types of proteins are encoded: protein at 0/180, protein at 30, and coat protein.
5′末端部には約70塩基、3′末端部には約2(10
塩基の非コード領域があるが、内部の遺伝子間には非コ
ード領域はないかまたは数塩基しかない。3′末端部の
非コード領域は3′末端から約1(10塩基のトランス
ファーRNA様構造部分およびこれとコートタンパク質
のコード領域との間の約1(10塩基とに分けることが
できるが、後者の部分にはシュードノット(pseud
okno t)構造と呼ばれる三次構造が3つ連続して
存在することが知られている[van Belkume
t al、、Nucleic Ac1ds Res、1
3.7673 (1985)]。Approximately 70 bases are present at the 5' end and approximately 2 (10 bases) at the 3' end.
There is a non-coding region of bases, but there is either no non-coding region or only a few bases between internal genes. The non-coding region at the 3' end can be divided into a transfer RNA-like structural part of about 1 (10 bases) from the 3' end and about 1 (10 bases) between this and the coat protein coding region, but the latter There is a pseudoknot (pseud) in the part.
It is known that there are three consecutive tertiary structures called okno t) structures [van Belkume
tal,, Nucleic Ac1ds Res, 1
3.7673 (1985)].
これらの構造のうち、トランスファーRNA様構造はC
MV、BMV、カブ黄化モザイクウィルス(TYMV)
など他の多くのウィルスにも見られる構造である。Among these structures, the transfer RNA-like structure is C
MV, BMV, turnip yellowing mosaic virus (TYMV)
This structure is also found in many other viruses.
発明者らはこのトランスファーRNA様+ll造とコー
トタンパク質コード領域との間の部分に注目し、ここに
突然変異を導入することにより好ましい弱毒株を作出し
た。前記導入する突然変異としては置換突然変異、挿入
突然変異、欠損突然変異がある。このうち特に好ましい
ものは欠損突然変異であるが必ずしもそれに限るもので
はない。欠損突然変異が好ましいというのは、欠損突然
変異は安定であり、弱毒株の使用に当たってしばしば生
じる問題であるところの強毒株への復帰がほとんど起こ
り得ないからである。The inventors focused on the region between this transfer RNA-like structure and the coat protein coding region, and created a preferred attenuated strain by introducing mutations there. The introduced mutations include substitution mutations, insertion mutations, and deletion mutations. Among these, deletion mutations are particularly preferred, but are not necessarily limited thereto. Deletion mutations are preferred because they are stable and reversion to a virulent strain, a problem that often arises when using attenuated strains, is unlikely to occur.
第1図にトバモウィルスのトランスファーRNA様構造
′部分とコートタンパク質コード領域との間の部分(以
下シュードノット領域という)を示す。前記したように
この領域には3つのシュードノット構造がある。以下本
明細書においては、これらを区別するために、5′側(
第1図の左側)より!頓にそれぞれ5′、中央、3′
シェードノット構造と呼ぶ。FIG. 1 shows the region between the transfer RNA-like structure' portion of tobamovirus and the coat protein coding region (hereinafter referred to as the pseudoknot region). As mentioned above, there are three pseudoknot structures in this region. Hereinafter, in this specification, in order to distinguish between these, the 5' side (
From the left side of Figure 1)! 5', center, 3' respectively
This is called a shade knot structure.
本発明による弱毒株の1つの形態は中央シュードノット
構造に突然変異部位を持つものである。One form of the attenuated strain according to the invention has a mutation site in the central pseudoknot structure.
その例として中央シェードノット構造の一部または全体
を欠損したものがあげられる。An example is one in which part or all of the central shade knot structure is missing.
本発明による弱毒株の別の形態は3′ シェードノット
構造に突然変異部位を持つものである。その例として3
′ シェードノット構造の一部を欠損したものがあげら
れる。しかしながら、発明者らの知見によれば、3′
シュードノット構造はウィルスの複製に重要であり、こ
の部分に大きな変異を導入するとウィルスの増殖が不可
能になる可能性が高く好ましくない。Another form of the attenuated strain according to the invention is one that has a mutation site in the 3' shade knot structure. As an example, 3
′ An example is one in which a part of the shade knot structure is missing. However, according to the inventors' knowledge, 3′
The pseudoknot structure is important for virus replication, and introducing large mutations into this region is undesirable because it is highly likely that the virus will not be able to propagate.
本発明による弱毒株のさらに別の形態は5′ シュード
ノット構造およびその5′上流部分に突然変異部位を持
つものである。しかしながら、この部分への突然変異の
導入だけではウィルスを弱毒化するには不十分であり、
前記した2種類の突然変異と組み合わせることが必要と
なる。そのような例としてコートタンパク質コード領域
の3′ 直下流から中央シュードノット構造までをすべ
て欠損したものがあげられる。このような大きな欠損変
異は前記した中央シュードノット構造部分のみの欠損に
比べてより安定であるという利点を持っている。Yet another form of the attenuated strain according to the present invention has a 5' pseudoknot structure and a mutation site in its 5' upstream region. However, introducing mutations in this part alone is not sufficient to weaken the virus;
It is necessary to combine the two types of mutations described above. An example of such a gene is one in which the entire region from just downstream of the coat protein coding region to the central pseudoknot structure is deleted. Such a large deletion mutation has the advantage of being more stable than the aforementioned deletion of only the central pseudoknot structure.
本発明による弱毒株の作成法は、ウィルスゲノムRNA
上に前記したような突然変異を導入することよりなる。The method for creating an attenuated strain according to the present invention is to use viral genome RNA.
It consists of introducing mutations as described above.
導入に当たっては、本発明にいたる実験の過程において
は、すでに公知であるところの、ウィルスcDNAから
インビトロ転写反応により感染性のあるウィルスRNA
を得る実験系を用いた[八hlquist and J
anda、 Mo1.Ce11.Biol。During the introduction, in the course of experiments leading to the present invention, infectious viral RNA was extracted from viral cDNA by an in vitro transcription reaction, which is already known.
[8hlquist and J.
anda, Mo1. Ce11. Biol.
4.2876(1984); Meshi et al
、、Proc、Natl、Acad。4.2876 (1984); Meshi et al.
, ,Proc, Natl., Acad.
Sci、USA 83.5043(1986) ] 、
これは、この実験系が、現時点においてウィルスゲノム
RNA上に計画された突然変異を導入する最も効率のよ
い方法と判断されたからである。しかしながら本発明は
、ウィルスゲノムRNA上に目的とする突然変異を導入
できるのであれば、必ずしもこの実験系を用いなくとも
よいことはいうまでもない。Sci, USA 83.5043 (1986)],
This is because this experimental system has been judged to be the most efficient method at present for introducing planned mutations into viral genomic RNA. However, it goes without saying that the present invention does not necessarily require the use of this experimental system as long as the desired mutation can be introduced into the viral genome RNA.
この実験系を用いて本発明を実施しようとする場合には
、ウィルスcDNA上の適当な制限酵素切断サイトを利
用して、目的とする部分のcDNAに計画された突然変
異部位を導入し、その後この改変されたcDNAを鋳型
としてインビトロ転写反応を行うことにより、計画され
た変異部位を持つウィルスRNAを得ることができる。When attempting to carry out the present invention using this experimental system, a planned mutation site is introduced into the cDNA of the desired portion by utilizing an appropriate restriction enzyme cleavage site on the viral cDNA, and then By performing an in vitro transcription reaction using this modified cDNA as a template, viral RNA having the planned mutation site can be obtained.
利用する制限酵素切断サイトは目的とするウィルスの塩
基配列に応じて異なるべきものであるが、塩基配列が既
知、であれば、利用すべき制限酵素の選択は、当業者に
とって容易である。The restriction enzyme cleavage site to be used should be different depending on the base sequence of the virus of interest; however, if the base sequence is known, those skilled in the art can easily select the restriction enzyme to be used.
上記の場合において、導入しようとする突然変異が欠損
突然変異である場合には、−例としてBat 31ヌク
レアーゼを用いることが可能である。In the above case, if the mutation to be introduced is a deletion mutation, it is possible to use Bat 31 nuclease - by way of example.
Bat 31ヌクレアーゼは2本鎖DNAに作用して末
端からほぼ一定の速度でDNAを短くしていく酵素であ
るので、適当な制限酵素で切断した後Ba131を適当
な時間作用させることにより、はぼ目的とする欠損変異
を導入することができる。Bal 31ヌクレアーゼの
反応条件等は一般の実験書に記載されている[例えばM
aniatis et al、、“Molecular
Clonjng ” 、 Co1d Spring H
arbor Laboratory(19B2) ]
。Bat 31 nuclease is an enzyme that acts on double-stranded DNA and shortens the DNA from the ends at a nearly constant rate. Therefore, after cutting with an appropriate restriction enzyme, allowing Ba 131 to act for an appropriate time will shorten the length of the DNA. A desired deletion mutation can be introduced. The reaction conditions for Bal 31 nuclease are described in general laboratory books [for example, M
Aniatis et al., “Molecular
Clonjng”, Co1d Spring H
arbor Laboratory (19B2)]
.
以下にTMV−Lを用いた実施例をあげ本発明をさらに
詳細に説明する。The present invention will be described in more detail below with reference to Examples using TMV-L.
本発明はこの実施例に限定されるものではなく、本発明
の技術分野において通常なされる変更および改良を含む
と共に、他のウィルスにも応用できるものである。The present invention is not limited to this embodiment, but includes modifications and improvements commonly made in the art, and is applicable to other viruses.
実施例−1
本実施例においてDNAのクローニングには大腸菌88
101株(全酒造■製、Ca t、 kg051)を用
いた。また、本実施例中特に反応条件等を明記していな
い工程は、一般の実験書[例えばManiatis e
tal、、“Mo1ecular Cloning”、
Co1d Spring HarborLabora
tory(1982) ]を参考にすれば当業者には容
易に実施できる工程である。Example-1 In this example, E. coli 88 was used for DNA cloning.
101 strain (manufactured by Zenshuzo ■, Cat, kg051) was used. In addition, steps in this example where reaction conditions etc. are not specified are described in general experimental books [e.g. Maniatis e
tal,, “Molecular Cloning”,
Co1d Spring Harbor Labora
Tory (1982)], it is a process that can be easily carried out by those skilled in the art.
なお、以下の説明においては特に断わらない限りTMV
ゲノムRNAおよびそのcDNAは5′末端より順に番
号をつけて表した。In addition, in the following explanation, unless otherwise specified, TMV
Genomic RNA and its cDNA are numbered sequentially from the 5' end.
1)シュードノット領域に欠損突然変異をもつ転写ベク
ターの作成
TMV−Lの全長cDNAを組み込んだ転写ベクタープ
ラスミドpLFW 3はすでに公知であり、Meshi
et al、 [Proc、 Natl、 Acad
、 Sci、USA 83゜5043(1986) ]
の方法に従って作成した。このベクターでは、RNAへ
の転写がウィルスcDNAの5′末端から始まるように
なっており、さらにcDNAの3′末端直下流に制限酵
素旧ul (全酒造■製、Cat、No、1071A)
の切断サイトを持っている。そこでこのベクタープラス
ミドを旧uIで切断したものを鋳型としてインビトロ転
写反応を行うことにより、感染性のあるTMV−L
RNAを得ることができる。1) Creation of a transcription vector with a deletion mutation in the pseudoknot region The transcription vector plasmid pLFW 3, which incorporates the full-length cDNA of TMV-L, is already known and is available from Meshi.
et al, [Proc, Natl, Acad
, Sci, USA 83°5043 (1986)]
Created according to the method. In this vector, transcription into RNA starts from the 5' end of the viral cDNA, and the restriction enzyme (ul) (manufactured by Zenshuzo ■, Cat, No. 1071A) is added immediately downstream of the 3' end of the cDNA.
has a cutting site. Therefore, by performing an in vitro transcription reaction using this vector plasmid cut with old uI as a template, we were able to detect infectious TMV-L.
RNA can be obtained.
シュードノット領域に欠損を導入する作業を容易にする
ため、pLF賀3をにρnl (全酒造■製、Cat。To facilitate the task of introducing a defect in the pseudoknot region, pLFga3 was added to ρnl (manufactured by Zenshuzo, Cat.
No、 1068A)とBawtll(全酒造■製、C
at、No、101OA)とで切断してシュードノット
領域を含むTMVcDNAの3′側2kbを分取し、こ
れをpUclB(全酒造■製、Cat、No、3218
)にクローニングして作業用プラスミドpUc3L−1
を得た。これにより、次の工程で用いる制限酵素N5i
lの切断サイトがプラスミド上に1つになるので、以下
の工程が容易になる。No. 1068A) and Bawtll (made by Zenshuzo ■, C
At, No, 101OA), the 3' side 2 kb of TMV cDNA containing the pseudoknot region was separated, and this was divided into pUclB (manufactured by Zenshuzo ■, Cat, No. 3218).
) to create the working plasmid pUc3L-1.
I got it. This allows restriction enzyme N5i to be used in the next step.
Since there is only one cleavage site for 1 on the plasmid, the following steps become easier.
TMV−LcDNAには6183番にN5iIサイトが
あるが、これはコートタンパク質コード領域(6182
番まで)の3′直下流にあたる。そこでシュードノット
領域に欠損を導入するにあたり、二〇N5ilサイトを
欠損の開始点として利用した。TMV-L cDNA has an N5iI site at position 6183, which is located in the coat protein coding region (6182
3' immediately downstream of the Therefore, when introducing a deletion into the pseudoknot region, the 20N5il site was used as the starting point for the deletion.
p[1c3L−1をN5il(NEBSff127)で
切断して線状化した後、その5Ugに反応液1(107
71 (0,6M NaC1゜20+oM Tris−
HCI pH8,0(25°C) 、12mM MgC
1g、12mM CaC1z)中2.3UのBal 3
1ヌクレアーゼ(BRL Cat。After cutting p[1c3L-1 with N5il (NEBSff127) to linearize it, reaction solution 1 (107
71 (0,6M NaC1゜20+oM Tris-
HCI pH 8,0 (25°C), 12mM MgC
2.3U of Bal 3 in 1g, 12mM CaC1z)
1 nuclease (BRL Cat.
No、80195A)を作用させた。反応は30°Cで
行い、反応時間1分から10分まで1分毎に反応液の一
部を取り出してEGTAを加えて反応を止めることによ
り、N5ilサイトからさまざまな長さに削られたDN
Aを得た。これらの反応時間の異なる反応液を混合して
pUC由来のBam1llサイトで切断した後、ウィル
スcDNA3’ 末端を含むさまざまな長さのフラグメ
ント混合物を分取してpuciaのBamHL と旧n
clT (東洋紡■製、Code、No、1lNC−2
01)の間にクローニングし、p tL3NCプラスミ
ドシリーズを得た。No. 80195A) was applied. The reaction was carried out at 30°C, and a portion of the reaction solution was removed every minute from 1 to 10 minutes and EGTA was added to stop the reaction.
I got an A. After mixing these reaction solutions with different reaction times and cleaving at the pUC-derived Bam1ll site, a mixture of fragments of various lengths containing the 3' end of the viral cDNA was separated and separated into BamHL of pucia and old n.
clT (manufactured by Toyobo ■, Code, No, 1lNC-2
01) to obtain the ptL3NC plasmid series.
以上の工程を第2図に模式的に示す。The above steps are schematically shown in FIG.
制限酵素マツピングにより適当な長さに削られたクロー
ンを選び、DNAシークエンシングによって欠損の終点
を決定した[ Luckow et al、、Nucl
eic Ac1ds Res、15.417(1987
)]−以下得られた各クローンを欠損の終点Xにしたが
ってp tL3NG−Xと呼ぶ。ptL3NC−)’/
リーズをMlulとpUc由来のPstl (全酒造■
製、Cat、No、1073A)とで切断してウィルス
cDNA3’ 末端を含むフラグメントを得、これを以
下の欠損変異ウィルス転写ベクターの構築に用いた。こ
のフラグメントにはpUCのポリリンカーに由来するr
GGTCJが挿入されているはずのところ、実際には
クローンごとに挿入されている塩基が異なっていた。す
なわち、ptL3NC−6207、−6209、−62
33には’GJ 、−6189、−6246、−625
3、−6263にはrGGJ 、−6275にはr G
GT J、−6204、−6239にはr GGTCJ
がそれぞれ挿入されていた。これはおそらく本実施例で
用いた制限酵素11incIIにエクソヌクレアーゼ活
性が混入していたためと考えられる。Clones that had been deleted to an appropriate length by restriction enzyme mapping were selected, and the end point of the deletion was determined by DNA sequencing [Luckow et al., Nucl.
eic Ac1ds Res, 15.417 (1987
)] - Hereinafter, each clone obtained will be referred to as ptL3NG-X according to the endpoint X of the deletion. ptL3NC-)'/
Leeds Mlul and Pstl derived from pUc (Zen Shuzo ■
(Cat, No. 1073A) to obtain a fragment containing the 3' end of the viral cDNA, which was used to construct the following deletion mutant virus transcription vector. This fragment contains r derived from the polylinker of pUC.
Although GGTCJ was supposed to have been inserted, the inserted base was actually different for each clone. i.e. ptL3NC-6207, -6209, -62
33 has 'GJ, -6189, -6246, -625
3, -6263 has rGGJ, -6275 has rG
GT J, -6204, -6239 has r GGTCJ
were inserted in each. This is probably because the restriction enzyme 11incII used in this example was contaminated with exonuclease activity.
pLL3Nc−X/Mlul −Psロフラグメントで
pLFW 3のN5il (6183番)−Mlulフ
ラグメントを置き換えることにより、コートタンパク質
コード領域のすぐ3′側からさまざまな長さの欠損部位
を持った変異つィルス転写ベクターpLD3N−Xシリ
ーズを作成した。By replacing the N5il (6183)-Mlul fragment of pLFW 3 with the pLL3Nc-X/Mlul-Ps fragment, mutant virus transcripts with deletions of various lengths immediately 3' of the coat protein coding region were generated. A vector pLD3N-X series was created.
コノシリーズには、5′ シュードノット構造の5′上
流部分のごく一部のみを欠損したもの(pLD3N−6
189)から、シュードノット領域はぼ全体を欠損する
もの(pL03N−6275)までが含まれている。The Kono series contains a strain that lacks only a small part of the 5' upstream part of the 5' pseudoknot structure (pLD3N-6
189) to one lacking almost the entire pseudoknot region (pL03N-6275).
次にptL3NC−XをPstlで切断して大腸菌DN
Aポリメラーゼ■ラージフラグメント (宝酒造■製、
Cat、No、214OA)により末端を平滑化した後
、旧u■で切断してウィルスcDNA3’ 末端を含む
フラグメントを得、これでpLFW 3の5naBI(
NEB 1130)(6231番)−Mlulフラグメ
ントを置き換えることにより、中央シェードノット構造
から3′ シュードノット構造にかけて欠損を持った変
異ウィルス転写ベクターpLD3S−X シリーズを作
成した。pLD3S−Xにおいては結合部分に5naB
Iに由来する配列r TACJを含むべきところ、実際
にはpLD3S−6239、−6253、−6263に
おいてはrACJ 、−62’75においてはrTAC
Jがそれぞれ失われていた。これはおそらく本実施例で
用いた制限酵素5naBIにエクソヌクレアーゼ活性が
混入していたためと考えられる。Next, ptL3NC-X was cut with Pstl and E. coli DN
A Polymerase ■Large Fragment (manufactured by Takara Shuzo ■,
After blunting the ends with 5naBI (Cat, No., 214 OA), the fragment containing the viral cDNA 3' end was obtained by cutting with old u■.
By replacing the NEB 1130) (No. 6231)-Mlul fragment, a mutant viral transcription vector pLD3S-X series having a deletion from the central shade knot structure to the 3' pseudoknot structure was created. In pLD3S-X, 5naB is added to the binding site.
The sequence rTACJ derived from pLD3S-6239, -6253, -6263 is actually rACJ, and -62'75 is rTAC.
Each J was lost. This is probably because the restriction enzyme 5naBI used in this example was contaminated with exonuclease activity.
さらに3′ シュードノット構造のみに欠損を持った変
異ウィルス転写ベクターpLD3P−Xシリーズを以下
のようにして構築した。この場合にはTMVcDNA上
に適当な制限酵素サイトがないため、まずN5iI (
6183番)と6249番の間のフラグメントをほぼl
long [Btoscience Reports
1,243(1981)]の方法にしたがって作成した
。pLFW3の5au3AI−EcoRI (5934
−6354)フラグメントをMl、3mp9 (宝酒造
■製、Ca t、No、3118)ファージDNAのB
amHrの切断部位とEcoRIの切断部位との間にク
ローニングした後、このファージからTMVRNAと同
じ配列を含む1本31 D N Aを得た。この1末鎖
D N AにTMVRNAの6235番から6249番
に相補的な配列を持つ15merの合成りNAをアニー
ルし、これをブライマーとして大腸菌DNAポリメラー
ゼIラージフラグメントによりファーストストランド合
成ヲ行った。次いでMl3 リバースシーフェンシング
ブライマーを利用してセカンドストランドを合成した後
、得られた2本鎖DNAをN5iIで切断して目的とす
る6183−6249フラグメントを分取した。このフ
ラグメントとptL3Nc−X/旧uL Pstr(末
端平滑化)フラグメントとを組み合わせて、これらでp
LFW3のN5iI−旧ul フラグメントを置き換え
ることにより、pLD3P−Xシリーズを作成した。Furthermore, a mutant virus transcription vector pLD3P-X series having only a deletion in the 3' pseudoknot structure was constructed as follows. In this case, since there is no suitable restriction enzyme site on TMV cDNA, first N5iI (
6183) and 6249.
long [Btoscience Reports
1,243 (1981)]. 5au3AI-EcoRI of pLFW3 (5934
-6354) fragment, 3mp9 (manufactured by Takara Shuzo ■, Cat, No. 3118) B of phage DNA
After cloning between the amHr and EcoRI cleavage sites, one 31 DNA containing the same sequence as TMV RNA was obtained from this phage. A 15-mer synthetic DNA having a sequence complementary to positions 6235 to 6249 of TMV RNA was annealed to this first-strand DNA, and this was used as a primer for first-strand synthesis using E. coli DNA polymerase I large fragment. Next, a second strand was synthesized using Ml3 reverse sea fencing primer, and the resulting double-stranded DNA was cut with N5iI to fractionate the target 6183-6249 fragment. This fragment was combined with the ptL3Nc-X/old uL Pstr (blunt-end) fragment, and these
The pLD3P-X series was created by replacing the N5iI-old ul fragment of LFW3.
以上説明したpL03N−X、 pLD3s−Xおよび
pLD3P−Xシリーズの欠損部位の構造を第3図に示
す。The structure of the deletion site of the pL03N-X, pLD3s-X and pLD3P-X series explained above is shown in FIG.
2)欠損突然変異ウィルスの感染性
前項のようにして作成した欠損変異ウィルス転写ベクタ
ーをウィルスcDNA3’ 末端にある旧ulサイトで
切断し、これを鋳型として大腸菌RNAポリメラーゼに
よるインビトロ転写反応を行った。2) Infectivity of defective mutant virus The defective mutant virus transcription vector prepared as described above was cut at the old ul site at the 3' end of the viral cDNA, and an in vitro transcription reaction using E. coli RNA polymerase was performed using this as a template.
反応はm’GpppG (RNA cap analo
gue+ファルマシア27−4635−01)存在下、
公知の方法[Ahlquist etal、 、 Pr
oc、Natl、Acad、Sci、USA 81.7
066(1984)]により行った。反応に用いたRN
AポリメラーゼはBurgess anti Jend
risak [Biochemistry 14+4
634(1975)]の方法によって大腸菌A19株よ
り精製した。本反応に用いるRNAポリメラーゼとして
は、NEII ENGLAND BioLabs社より
市販されているRNA PoIymerase (Ho
loenzyme、E、coli)11208も使用で
きる。The reaction is m'GpppG (RNA cap analog
gue + Pharmacia 27-4635-01) presence,
Known methods [Ahlquist et al., Pr.
oc, Natl, Acad, Sci, USA 81.7
066 (1984)]. RN used for reaction
A polymerase is Burgess anti-Jend.
risak [Biochemistry 14+4
634 (1975)] from E. coli strain A19. The RNA polymerase used in this reaction is RNA PoIymerase (Ho
loenzyme, E. coli) 11208 can also be used.
得られた転写RNAを、精製したTMV−0M株のコー
トタンパク質(4■/m)とo、iMのリン酸緩衝液中
で20°C116時間インキュベートすることにより、
ウィルス粒子の再構成を行った。再構成した粒子は裸の
RNAに比べてその感染性が1(10倍以上に高められ
ていた。By incubating the obtained transcription RNA with the purified TMV-0M strain coat protein (4/m) in o, iM phosphate buffer at 20°C for 116 hours,
Reconstitution of virus particles was performed. The reconstituted particles were more than 10 times more infectious than naked RNA.
再構成した欠損変異ウィルスRNA (以下簡便の為欠
損変異ウィルスという)をカーボンランダムと共に擦り
つけることによりタバコの葉に接種した。まず局部病斑
(local Iesion)形成タバコ(品種Xan
thi nc)に接種して、局部病斑形成の有無により
欠損変異ウィルスの増殖能を調べ、次いで全身感染タバ
コ (品種Samsun)に接種して欠損変異ウィルス
が全身に広がって病気を引き起こすかどうかを調べた。The reconstituted defective mutant virus RNA (hereinafter referred to as defective mutant virus for convenience) was inoculated onto tobacco leaves by rubbing it together with carbon random. First, local lesions are formed on tobacco (variety Xan).
The multiplication ability of the defective mutant virus was examined by inoculating it into tobacco plants (thin nc) and the presence or absence of local lesion formation, and then it was inoculated into systemically infected tobacco (variety Samsun) to determine whether the defective mutant virus would spread throughout the body and cause disease. Examined.
局部病斑形成タバコへの接種に際しては、ウィルス濃度
を転写ベクターDNAに換算して4 n’g/μPに調
整し、単葉あたりその20−30μ2を接種した。全身
感染タバコへの接種に際しては、ウィルス液20−60
μ!を接種した。When inoculating tobacco plants with localized lesions, the virus concentration was adjusted to 4 n'g/μP in terms of transcription vector DNA, and 20-30μ2 of the virus was inoculated per single leaf. When inoculating systemically infected tobacco, use virus solution 20-60
μ! was inoculated.
そのウィルス液は、50−1(10個の局部病斑を形成
するようにウィルス量が調整されたものである。The amount of virus in the virus solution was adjusted to form 50-1 (10 local lesions).
pLD3N−Xシリーズに由来する欠損変異ウィルス(
以下N−Xと表す)では、N−6253およびそれより
欠損部分の小さい欠損変異ウィルスは局部病斑を作った
が、N−6263およびN−6275は局部病斑を作ら
ず、これら2つの欠損変異ウィルスが増殖能を失ってい
ることを示した。一方全身感染タバコにおいては、N−
6209ウイルスおよびそれより欠損部分の小さいウィ
ルスはタバコの全身に典型的なモザイク症状を引き起こ
したが、N−6233,N−6239,N−6246お
よびN−6253はモザイク症状を引き起こさなかった
。これら4種の欠損変異ウィルスを接種した全身感染タ
バコについて、接種2週間後に接種葉よりも上部の葉へ
のウィルスの移行を調べた。Defective mutant virus derived from pLD3N-X series (
(hereinafter referred to as N-X), N-6253 and the defective mutant virus with a smaller defective region produced local lesions, but N-6263 and N-6275 did not produce local lesions, and these two defects This showed that the mutant virus had lost its ability to proliferate. On the other hand, in systemically infected tobacco, N-
6209 virus and viruses with smaller defective parts caused typical mosaic symptoms throughout the tobacco plant, but N-6233, N-6239, N-6246 and N-6253 did not cause mosaic symptoms. Two weeks after inoculation, virus transfer to leaves above the inoculated leaves was examined for systemically infected tobacco plants inoculated with these four types of defective mutant viruses.
その結果、N−6253は上葉からは検出されなかった
が接種葉から該ウィルスが検出され、N−6253か弱
毒株になっていることがわかった。一方、N−6233
、N−6239、N−6246は上葉でも野生型ウィル
スの115から1710程度の濃度でウィルスが検出さ
れた。これは、少なくともN−6233、N−6239
、N−6246は全身に広がるが病気を引き起こさない
、すなわち全身感染能を有する弱毒株になっていること
を示している。なお、ウィルス検出は局部病斑検定およ
びゲル電気泳動によるコートタンパク質の検出により行
った。As a result, although N-6253 was not detected in the upper leaves, the virus was detected in the inoculated leaves, indicating that N-6253 was a weakened strain. On the other hand, N-6233
, N-6239, and N-6246, the virus was detected in the upper leaves at a concentration of about 115 to 1710 of the wild type virus. This is at least N-6233, N-6239
, N-6246 spreads throughout the body but does not cause disease, indicating that it is a weakened strain with the ability to infect the whole body. Note that virus detection was performed by local lesion assay and coat protein detection by gel electrophoresis.
以上をまとめると、N−Xシリーズの欠損変異ウィルス
では、N−6233からN−6253までか弱毒株にな
っており、これらよりも欠損部分が小さいものは野性株
とほとんど変わらず、これらよりも欠損部分が大きいも
のは増殖能を失っていた。To summarize the above, the deletion mutant viruses of the N-X series are attenuated strains from N-6233 to N-6253, and those with smaller deletions are almost the same as the wild strains, and are more virulent than these. Those with large defects had lost their ability to proliferate.
pLD3S−Xシリーズに由来する欠損変異ウィルス(
以下S−Xと表す)では、S−6239、S−6246
およびS−6253は局部病斑を作ったが、S−626
3およびS−6275は局部病斑を作らず、これら2つ
の欠損変異ウィルスが増殖できなくなっていることを示
した。Defective mutant virus derived from pLD3S-X series (
(hereinafter referred to as S-X), S-6239, S-6246
and S-6253 produced local lesions, but S-626
3 and S-6275 did not produce local lesions, indicating that these two deletion mutant viruses were unable to proliferate.
全身感染タバコにおいては、S−6239、S−264
6およびS−6253はすべてモザイク症状を引き起こ
さなかったが、S−6246とS−6253では上葉か
らウィルスが検出され、これら2つの欠損変異ウィルス
が全身感染能を有する弱毒株になっていることがわかっ
た。また、S−6239については、上葉からはウィル
スが検出されなかったが、接種葉からはウィルスが検出
されたことから、S−6239も弱毒株になっているこ
とがわかった。In systemically infected tobacco, S-6239, S-264
6 and S-6253 did not cause any mosaic symptoms, but the virus was detected in the upper leaves of S-6246 and S-6253, indicating that these two defective mutant viruses are attenuated strains capable of systemic infection. I understand. Regarding S-6239, no virus was detected from the upper leaves, but virus was detected from the inoculated leaves, indicating that S-6239 was also an attenuated strain.
pL03P−Xシリーズに由来する欠損変異ウィルス(
以下P−Xと表す)では、P−6253のみが局部病斑
を作り、P−6263とP−6275は増殖能を失って
いた。Defective mutant virus derived from pL03P-X series (
(hereinafter referred to as P-X), only P-6253 produced local lesions, and P-6263 and P-6275 had lost their proliferation ability.
P−6253は全身感染タバコではモザイク症状を起こ
さなかったが、上葉からウィルスが検出され、全身感染
能を有する弱毒株になっていることがわかった。P-6253 did not cause mosaic symptoms in systemically infected tobacco, but the virus was detected in the upper leaves, indicating that it was a weakened strain capable of systemically infecting.
以上説明した欠損変異ウィルスの感染性試験の結果を第
3図の右側に示した。L、Sはそれぞれ局部病斑タバコ
、全身感染タバコへの接種試験の結果であり、病斑形成
または病徴の有無を示す。The results of the infectivity test for the defective mutant virus described above are shown on the right side of FIG. L and S are the results of inoculation tests on locally infected tobacco and systemically infected tobacco, respectively, and indicate the presence or absence of lesion formation or disease symptoms.
以上の結果をまとめると、本実施例において作成された
欠損変異ウィルスの中で弱毒株であったのは、N−62
33、N−6239、N−6246、N−6253、S
−6239、S−6246、S−6253およびP−6
253であった。特に、これらのうち、N−6253お
よびN−6239を除いたものについては、全身感染能
を有する弱毒株であることが確認された。シュードノッ
ト領域のうち、3′シユードノツト構造を大きく欠損し
たウィルスには増殖能がなく、逆に5′ シェードノッ
ト構造の一部およびその5′上流部分を欠損しただけで
は、顕著な弱毒性は示さなかった。To summarize the above results, among the deletion mutant viruses created in this example, the attenuated strain was N-62.
33, N-6239, N-6246, N-6253, S
-6239, S-6246, S-6253 and P-6
It was 253. In particular, it was confirmed that all of these strains, excluding N-6253 and N-6239, were attenuated strains capable of systemic infection. Viruses with a large deletion of the 3' pseudoknot structure in the pseudoknot region do not have the ability to proliferate, and conversely, deletion of only part of the 5' shade knot structure and its 5' upstream region does not show significant attenuation. There wasn't.
3)欠損変異ウィルス弱毒株の干渉効果前項で説明した
欠損変異ウィルス弱毒株のうちN−6239とN−62
46についてその干渉効果を調べた。3) Interference effect of attenuated deletion mutant virus strains Among the attenuated deletion mutant virus strains explained in the previous section, N-6239 and N-62
The interference effect of 46 was investigated.
試験には、再構成した欠損変異ウィルスRNA(インビ
トロ転写反応産物)を接種した全身感染タバコの上葉か
ら回収、精製したウィルス粒子を用いた。Virus particles recovered and purified from the upper leaves of systemically infected tobacco plants inoculated with reconstituted defective mutant virus RNA (in vitro transcription reaction product) were used in the test.
全身感染タバコ (品種Samsun)の幼苗(本葉4
−6枚)に、0.1Mリン酸緩衝液(pH7,0)にg
:IAしたN−6239またはN−6246(5μg/
−)を接種した。Systemically infected tobacco (variety Samsun) seedlings (true leaves 4
-6 sheets) and 0.1M phosphate buffer (pH 7,0).
:IAd N-6239 or N-6246 (5μg/
-) was inoculated.
対照実験としては緩衝液のみを接種した。25°Cに1
5日おいた後、新しく展開してきた上部の葉に強毒株T
MV−L (1μg/rnl)を接種し、25°Cにお
いて観察した。As a control experiment, only the buffer solution was inoculated. 1 at 25°C
After 5 days, the newly developed upper leaves were infected with highly virulent strain T.
MV-L (1 μg/rnl) was inoculated and observed at 25°C.
強毒株接種1カ月後には、弱毒株を接種していないタバ
コはすべてモザイク症状を示したが、N−6239を接
種したタバコでは4氷中1本、N−6246を接種した
タバコでは4氷中3本が磨機を示さなかった。その後、
強毒株接種7週間後まで観察を続けたが、変化はなかっ
た。7週間目に各植物の最上部の葉を採取し、局部病斑
検定によってウィルスの有無を調べたところ、磨機を示
していない植物にも、磨機を示している植物あるいは強
毒株のみを接種した植物のl/10から1150のウィ
ルスが検出された。この結果は磨機を示していない植物
でも弱毒株が増殖していることを強く示唆し、これらの
植物は弱毒株の干渉作用によって病気から保゛護されて
いると考えられる。またこの結果はN−6239および
N−6246の弱毒性をさらにはっきりと示すものであ
る。One month after inoculation with the highly virulent strain, all of the cigarettes that were not inoculated with the attenuated strain showed mosaic symptoms, but cigarettes inoculated with N-6239 showed 1 out of 4 cigarettes, and cigarettes inoculated with N-6246 showed 1 out of 4 cigarettes. Three of them did not show a polisher. after that,
Observation was continued until 7 weeks after inoculation with the virulent strain, but no changes were observed. After 7 weeks, the uppermost leaves of each plant were collected and examined for the presence of viruses by local lesion assay, and it was found that even plants that did not exhibit abrasion, only plants that showed abrasion or only highly virulent strains. 1150 viruses were detected from 1/10 of the plants inoculated with . This result strongly suggests that the attenuated strain is proliferating even in plants that do not exhibit a grinder, and these plants are considered to be protected from disease by the interference of the attenuated strain. This result also clearly shows the attenuated toxicity of N-6239 and N-6246.
本発明により植物ウィルス病防除に有効なウィルス弱毒
株を、従来の方法に比べてはるかに効率よく計画的に短
時間で人為的に作出することが可能になった。また従来
の方法により作出された弱毒株がほとんどの場合におい
て塩基置換突然変異株であるのに対し[例えばTMV−
Lの弱毒株L11A ; NishiN15hi et
al、Nucleic Ac1ds Res。The present invention has made it possible to artificially create attenuated virus strains that are effective for controlling plant virus diseases much more efficiently and systematically in a shorter time than conventional methods. Furthermore, whereas attenuated strains created by conventional methods are base substitution mutant strains in most cases [for example, TMV-
Attenuated strain L11A of L; NishiN15hi et
al, Nucleic Ac1ds Res.
13.5585(1985) ] 、本発明により作出
されるウィルス弱毒株には欠損突然変異のようなより安
定な変異を導入でき、従来弱毒性の使用に当たってしは
しば問題となった強毒株への復帰の欠点を解決すること
ができる。13.5585 (1985)], more stable mutations such as deletion mutations can be introduced into the attenuated virus strain produced by the present invention, and the highly virulent strain, which has often been a problem when using attenuated strains, can be introduced. The shortcomings of returning to can be solved.
第1図の囚はシュードノット領域における相互作用のモ
デルを、■は各種のトバモウィルスのRNAの配列を示
したものである。第2図はシュードノットSN域に欠損
突然変異部位を導入するために用いるp tL3NCプ
ラスミドシリーズの調製法を示し、第3図は、pLD3
N−X、 pLD3s−XおよびpLD3P−Xシリー
ズの欠損部位の構造を示す。The box in Figure 1 shows a model of the interaction in the pseudoknot region, and the box (■) shows the RNA sequences of various tobamoviruses. Figure 2 shows the preparation method of the ptL3NC plasmid series used to introduce a deletion mutation site into the pseudoknot SN region, and Figure 3 shows the method for preparing the ptL3NC plasmid series used to introduce a deletion mutation site into the pseudoknot SN region.
N-X, shows the structure of the deletion site of pLD3s-X and pLD3P-X series.
Claims (10)
持つことからなる植物RNAウィルスの弱毒株。(1) An attenuated strain of plant RNA virus that has a mutation site in the non-coding region of its genomic RNA.
置する非コード領域である請求項1記載の弱毒株。(2) The attenuated strain according to claim 1, wherein the non-coding region is a non-coding region located at the 3' end of the genomic RNA.
ゲノムRNAの3′末端部のトランスファーRNA様構
造部分とコートタンパク質のコード領域との間にある非
コード領域である請求項2記載の弱毒株。(3) The non-coding region at the 3' end of the genomic RNA is a non-coding region located between the transfer RNA-like structural part at the 3' end of the genomic RNA and the coat protein coding region. Attenuated strain.
る請求項1乃至3のいずれかの項記載の弱毒株。(4) The attenuated strain according to any one of claims 1 to 3, wherein the virus belongs to Tobamovirus.
いずれかの項記載の弱毒株。(5) The attenuated strain according to any one of claims 1 to 4, wherein the mutation is a deletion mutation.
導入することよりなる植物RNAウィルスの弱毒株作成
法。(6) A method for creating an attenuated strain of a plant RNA virus, which comprises introducing a mutation site into a non-coding region on genomic RNA.
非コード領域である請求項6記載の弱毒株作成法。(7) The method for producing an attenuated strain according to claim 6, wherein the non-coding region is a non-coding region located at the 3' end of the genomic RNA.
ゲノムRNAの3′末端のトランスファーRNA様構造
部分とコートタンパク質のコード領域との間にある非コ
ード領域である弱毒株作成法。(8) A method for creating an attenuated strain in which the non-coding region at the 3' end of the genomic RNA is a non-coding region located between the transfer RNA-like structural part at the 3' end of the genomic RNA and the coat protein coding region.
る請求項6乃至8のいずれかの項記載の弱毒株作成法。(9) The method for producing an attenuated strain according to any one of claims 6 to 8, wherein the virus is a virus belonging to Tobamovirus.
のいずれかの項記載の弱毒株作成法。(10) Claims 6 to 9 wherein the mutation is a deletion mutation.
A method for producing an attenuated strain as described in any of the above.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63110353A JPH01281079A (en) | 1988-05-09 | 1988-05-09 | Attenuated strain of plant virus and preparation thereof |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63110353A JPH01281079A (en) | 1988-05-09 | 1988-05-09 | Attenuated strain of plant virus and preparation thereof |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01281079A true JPH01281079A (en) | 1989-11-13 |
Family
ID=14533615
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63110353A Pending JPH01281079A (en) | 1988-05-09 | 1988-05-09 | Attenuated strain of plant virus and preparation thereof |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH01281079A (en) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1114693C (en) * | 1998-11-24 | 2003-07-16 | 北京大学 | Three mutant genes of coat protein for mosaic virus of tobacco |
WO2013065439A1 (en) | 2011-11-01 | 2013-05-10 | 味の素株式会社 | Plant virus infection inhibitor and plant virus infection inhibition method using same |
CN112094940A (en) * | 2020-10-10 | 2020-12-18 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | Indel marker linked with cucumber long hypocotyl gene lh1 as well as primer, kit and application thereof |
-
1988
- 1988-05-09 JP JP63110353A patent/JPH01281079A/en active Pending
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US10617122B2 (en) | 2011-11-01 | 2020-04-14 | Ajinomoto Co., Inc. | Plant virus infection inhibitor and a method for inhibiting plant virus infection using the same |
CN112094940A (en) * | 2020-10-10 | 2020-12-18 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | Indel marker linked with cucumber long hypocotyl gene lh1 as well as primer, kit and application thereof |
CN112094940B (en) * | 2020-10-10 | 2022-08-16 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | Indel marker linked with cucumber long hypocotyl gene lh1 as well as primer, kit and application thereof |
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