JPH01242963A - 生物験体の乾燥方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は顕微鏡検査する前に生物験体を乾燥すること
、特に走査型電子顕微鏡用生物験体の作成方法に関する
。

〔従来例］ 走査型電子顕微鏡では、標準的な光学顕微鏡検査法の場
合のような光波ではなく、電子を利用して、研究対象を
視覚化する。電子を験体に透過させ、次に燐光体スクリ
ーンに衝突させて像形成する代わりに、電子を被験体に
衝突させて、二次電子を放出させる点において、走査型
電子顕微鏡は透過型電子顕微鏡　。

と異なっている。この二次電子放出が験体の高解像力映
像のベースを形成する。二次電子放出の発現を補助する
ためには、通常、走査型電子顕微鏡で検査する前に、験
体表面に金属や炭素を蒸着する。

著しい「三次元的」視覚効果が認められるが、この形の
験体顕微鏡検査法は生命科学者にとって重要である。生
体内組織を精密に内視できる。走査型電子顕微鏡法を完
全に利用するために、「限界点乾燥」と呼ばれる方法な
どの、験体の形態を保存する高品質方法が工夫されてい
る。限界点乾燥では、最終的には１００％アルコールや
アセトンになるアルコール／水やアセトン／水などの段
階的系列の乾燥溶媒をまづ被験体に作用させる。通常、
次にアルコール又はアセトンをアミルアセテートに置き
換え、そしてアミルアセテート飽和験体を限界乾燥器に
入れる。

この点で、液体二酸化炭素、亜酸化窒素やトリフルオロ
クロロメタンなどの遷移性流体を徐々に限界点乾燥器に
送り込み、アミルアセテートと置き換える。圧力シール
式乾燥器を次に加熱して、該乾燥器を限界圧力・温度ま
で昇圧・昇温する。この結果ガス状になった遷移性流体
が験体を取囲み、験体表面の表面張力を歪めずに、ブリ
ージングを行うことができる。乾燥した験体は限界乾燥
器から取出し、真空金属又は炭素蒸着すれば、走査型電
子顕微鏡で検査できる状聾になる。

ところで、験体保存について、限界乾燥に匹敵するか、
限界乾燥よりもすぐれた結果が極めて簡単な方法で得ら
れることが見いだされた。即ち、アルコール又はアセト
ン乾燥験体をフルオロカーボン遷移性流体に入れ、フル
オロカーボンを凍結してから、真空昇華すれば、形態の
保存について、品質が限界乾燥に匹敵するか、それより
もすぐれた乾燥験体が得られるが、この場合には、コス
トが高い限界乾燥装置や時間が必要な操作は必要ない。

［発明が解決しようとする課題］ 従って、この発明の目的は走査型電子顕微鏡で検査すべ
き験体を乾燥する、簡単な方法を提供することにある。

別な目的は走査型電子顕微鏡用標本を作成するさいに装
置上要求される必要条件を減らすことにある。

さらに別な目的は走査型電子顕微鏡検査用の所定量の験
体を迅速に作成する方法を提供することにある。

さらに別な目的は比較的不活性な環境中で験体から効率
的かつ選択的に脂質を除去すること１．：、Ｊ５る。

し課題を解決するための手段及び作用］所定群のフルオ
ロカーボン溶媒を使用して、験体の表面張力歪みを防止
すると同時に、験体表面から脂質を選択的に除去して、
走査型電子顕微鏡でより明瞭な視覚化を実現できる本発
明を適用すると、上記目的及び関連目的を達成できる。

所定のフルオロカーボン溶媒、特に通常［フレオン」と
呼ばれているものの幾つかは、脂質に対してすぐれた選
択的溶媒であることが知られている。フレオンはＥ、　
１．　ＤｕＰｏｎｔ　Ｄｅ　Ｎｕｍｏｕｒｇ　＆　Ｇｏ
、、　Ｉｎｃ、の登録商標である。加えて、高密度及び
低表面張力と共に非常に高い化学的安定性を兼ね備えて
いることがこれら溶媒の特徴である。これら化合物は主
にその冷却特性に点において知られている化合物である
。

本発明方法では、最終的には１００％アルコール又はア
セトンのいずれかになる、エチルアルコール／水又はア
セテート／水のいずれかの段階的系列溶媒に被験体を入
れて、験体からまづ水を除去する。次に、フルオロカー
ボン溶媒とアルコールのｌ：ｌ混合物かフルオロカーボ
ンとアセトンの１：Ｉｆｉ合物のいずれかに溶媒飽和験
体を入れる。最後に、フルオロカーボン単味の液体溶媒
に験体を所定時間入れる。この状態で、フルオロカーボ
ン溶媒を凍結し、真空昇華すると、真空蒸着及び走査型
電子顕微鏡検査に好適な、保存形態の良好な験体が得ら
れる。

この目的に特に好適な２つの溶媒を見いだした。即ち、
ｌ、Ｉ−ジフルオロテトラクロロエタンと、１．２−ジ
フルオロテトラクロロエタンである。いずれも室温で固
体であり、沸点が約９３℃である。また、いずれの溶媒
も室温より僅かに高い温度で溶解するため、はぼ不活性
な遷移性流体内で験体は極めて温和な温度条件の作用を
受けることになる。溶媒を凍結するためには、これら溶
媒を単に室温で固化するだけでよい。これら溶媒の昇華
は迅速に実施できる。例えば、空密ジャーに容れ、そし
て２５１２／分の２段回転真空ポンプによって排気した
１、１−ジフルオロテトラクロロエタンの１ｇサンプル
は１５分以内で完全に昇華する。いずれの溶媒もすぐれ
た冷却特性（約３７カロリー／　ｇ　）を有しているた
め、該溶媒は昇華中強固な固体状態で存在し、従ってこ
の遷移性液体の除去操作中、験体の構造的保全性が維持
される。

この方法に使用することができる別なフルオロカーボン
溶媒は゛トリフルオロトリクロロエタンであり、これの
凍結点は一３５℃で、沸点は約４８℃である。この場合
、冷却して、溶媒を液状に維持しながら、溶媒を遷移性
流体として作用させる。昇華中、溶媒を固体凍結状態に
維持するためには、冷凍プラテンが必要である。

［実施例］ 本発明の代表的な実施例を以下に示す。

実験例■−犬気管上皮の大形験体 固定方法ニ ー次固定ニリン酸緩衝グルタルアルデヒド（室温で１時
間）。

後固定ニリン酸緩衝オスミウムテトラオキシド（室温で
１時間）。

脱水： １、最終的に１００％になる段階的系列のアセトン。

２、アセトンと１．１−ジフルオロテトラクロロエタン
のｌ：！混合物（４０℃で１時間）。

浸潤： ６０℃で１．１−ジフルオロテトラクロロエラ２９３０
分間、６０分間または９０分間保温。

室温で凝結（凍結）。

乾燥： フルオロカーボン中で験体を凍結した後、機械的前ポン
プで短時間ポンプ作用を加えてから、デシケータ−に入
れ、屋内真空ポンプで一夜ポンプ作用を加えた。それか
ら、験体をスタッドに載せ、１００人の金−パラジウム
を真空蒸発器において蒸着した。

結果； 組織は、限界乾燥の場合の結果に匹敵する、通常特性を
もって保存されていた。

実験例ＩＩ−犬の気管上皮の培養験体 固定方法ニ ー次固定ニリン酸緩衝グルタルアルデヒド（室温で１時
間）。

後固定ニリン酸緩衝オスミウムテトラオキシド（室温で
１時間）。

脱水： １、最終的に１００％になる段階的系列のアルコール。

２、アルコールと１．１−ジフルオロテトラクロロエタ
ンの！：１混合物（４０℃で１時間）。

浸潤： ６０℃で１．１−ジフルオロテトラクロロエタン９５分
間保温。

室温で凝結（凍結）。

乾燥： フルオロカーボン中で験体を凍結した後、。

機械的前ポンプで短時間ポンプ作用を加えてから、デン
ケーターに入れ、屋内真空ポンプで一夜ポンプ作用を加
えた。それから、験体をスタッドに載せ、１００人の金
−パラジウムを真空蒸発器において蒸着した。

結果： 組織は、限界乾燥の場合に結果に匹敵する、通常特性を
もって保存されていた。

本発明の最良の使用態様を詳細に説明してきたが、当業
者ならば、各種の変更及び改良を加えることができるは
ずである。従って、本発明の精神及び範囲は特許請求の
範囲によってのみ限定されるものである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）走査型電子顕微鏡で検査する生物験体を作成する
   さい、 （Ａ）該験体を段階的系列の乾燥溶媒中で乾燥し、 （Ｂ）１，１−ジフルロオロテトラクロロエタンおよび
   １，２−ジフルオロテトラクロロエタンからなる群から
   選択される溶解フルオロカーボン溶媒に該験体を浸漬す
   ることによって該験体中の該乾燥溶媒を置換し、 （Ｃ）該溶解フルオロカーボン溶媒を凝結し、そして （Ｄ）該験体から該凝結フルオロカーボン溶媒を真空昇
   華する、 工程からなることを特徴とする生物験体の作成方法。
2. （２）該フルオロカーボン溶媒が１，１−ジフルオロテ
   トラクロロエタンである請求項第１項記載の作成方法。
3. （３）該フルオロカーボン溶媒が１，２−ジフルオロテ
   トラクロロエタンである請求項第１項記載の作成方法。
4. （４）該乾燥溶媒がアルコールである請求項第１項記載
   の作成方法。
5. （５）該乾燥溶媒がアセトンである請求項第１項記載の
   作成方法。