JPH01168270A - 非屈曲熱伝導性壁を有するキュベット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、中に含まれる液体内で反応を行なう（特にこ
几らの反応は注意深い温度調整、およびキュペットへの
またはキュペットからの急速な熱伝達を必要とする）キ
ュペットに関する。

（従来の技術） 本発明は核酸拡張に使用するキュペットに限られるもの
ではないが、そのような拡張は本発明に通じるので、こ
几に関連させて説明する。

核酸拡張は通常特定の方法で進む。有用な方法の１つは
米国特許筒４，６８３，１ν５号に示さｎているもので
あり、そ几はＤＮＡ拡張の場合以下のような特徴ケ有す
る： １）完全なりＮＡ二重らせん乞適当な制限酵素を使って
任意に化学的に切り離して関心のある範囲乞単離する。

２）単離した核酸部分（ここでは、ＤＮＡ）およびヌク
レオチドの溶液を９２〜９５℃に加熱しそして、例えば
約１０分以内の間、この温度に保って２つの核酸ストラ
ンドを変性させる（丁なわ）。

これらのらせんンとき１分離し、そして原型を形成する
）。

３）次に溶液を５０〜６０℃の帯域に通して冷却してプ
ライマー核酸ストランド７アニールする。すなわち２つ
の原型ストランドのそれぞれにこれ乞結合させる。こ几
が確実に起こるようにするために、溶液を適当な温度１
例えば約５５℃、に約１５秒間、「培養」帯域に保つ。

４）次に溶液を約７０℃に加熱し、この温度に保って、
存在するヌクレオチドケ使い、拡張酵素。

好ましくは熱に安定な酵素、で原型ストランドに結合し
たブライマーストランドを拡張させる。

５）完成した新しい対のストランドケ再び９２〜９５゛
Ｃに約１０〜１５秒間加熱して、この対を分離する。

６）次に適当な数のストランドが得らｎるまで工程６）
〜５）ヲ何回か繰り返す。繰り返すほど、多数σ）核酸
（ここでは、ＤＮＡ）が生成さ几る。希望の濃度の核酸
が最少の時間に得ら几るのが好ましい。

キュペットは通常、溶液が前記の温度段階ン通過する間
溶液を保持するのに使わｎる。キュベ。

トＹ速やかに様々な段階に進めることができるかどうか
はキュペットσ）デザインによる。これＺコントロール
する鍵となるものはキュペットの熱伝達効率である−一
すなわち、キュペット内の溶液全体へまたは溶液全体か
ら熱乞瞬時に伝達するキュベ、トカ能力である。熱源ま
たはシンクから比較的離れている溶液部分は望ましい温
度に達するのにより時間がかかるσ）で、配置および溶
液自体の熱抵抗が通常熱伝達に影響を及ぼす主な要素で
ある。

従来使用さ几できた最も素朴で初期のタイプのキュペッ
トは試験管であり、こｎは、ａ）ガラスまたはプラスチ
、りのキュペットの壁か熱エネルギーケよく伝達しない
、およびｂ）円筒状の液体では液体すみずみへの熱伝達
が比較的不十分であるため熱伝導効率が不十分である。

すなわち、液体の熱伝導が低いばかりでなく１円筒状の
液体は表面対容積比（すなわち、約１００μｅｎ注入に
対して約２７ｉｎ−’である）が小さい。

ＤＮＡ拡張における別の問題は１反応の完了後キュペッ
トから液体を簡単に取り出せるようにすることである。

試験管の形はそれが簡単にできる。

しかしながら、キュペアトゲよりよい熱伝導効率のもσ
）に変えると、液体の移動性が悪くなる。すなわち１毛
管間隔のキュペットの入が内容物を急速に加熱すること
ができる。しかしながら１毛管間隔は液体の除去を妨げ
ろ。この問題は米国特許第４，４０５，２３５号に例示
されており、ここでは壁の１つが鋼プレートである液体
容器が教示３ｎている。しかしながら、記載さ几ている
キャピテ４−は厚さが０．１５ｅｔｉであり、これは毛
管間隔である。

さらに、この特許に記載されているような容器を用いて
内容物を加熱すると、鋼プレートは、プレートであるた
めに、加熱するのが非常に遅く、上記のサイクルプロセ
スにはあまりにも遅すぎる。

しかしながら、プレートをフォイルの厚さに減じると、
内側で蒸気圧が高まるので、プレートは外側に曲がり易
くなる。よくてもこの曲がりは発熱体との熱接触に影響
を及ぼす。悪くすると、金属層７キユベ、トから分離す
ることになる。

本発明の目的は、熱を急速にサイクルさせる。

そして熱接触Ｚ維持する非屈曲熱伝導性側壁？有するキ
ュペット乞提供することである。

（発明の構成） 本発明の目的は、以下のような加熱器または冷却器によ
って加えられる温度をサイクルさせる液体成分の制御反
応用の熱サイクルキュペットによって達成される。この
キュペットは２つの間隔をおいて離れた向かいあった壁
（そ几ぞれ液体に接する主要面となる）によって定めら
ｎ　ｙ、：少なくとも１つの液体を入れる室を有し；向
かいあった壁の１つは唯一の構造部材としての熱伝導性
材料からなり、この熱伝導性材料は環境に曝さ几ていて
外部加熱器または冷却器に接続でき；この熱伝導性構造
部材力代わりに上記０壁の向かい合った１つが内圧下で
曲がるように、熱伝導性壁の反対側σ）壁の曲げ強さが
熱伝導性構造部材の曲げ強さよりも十分に小さいもθ）
である。

本発明は以後、ＤＮＡストランドの複製化に特に有用な
少なくとも６５℃の範囲に渡る温度サイクルについて述
べる。さらに、これは、その中で反応が行わｎるキュペ
ットの加熱および冷却を繰り返し行う必要のある液体成
分および試薬のどのような種類の反応にも有用である。

サイクルさせる温度範囲が大体６５℃であるとさらに好
ましい。

「上」および「下」のような配置方向は、そのように使
用するのが好ましいキュペットに関して用いる。

まず第１〜２図について述べる。前記の共有出願に記載
のようにして作ったキュベ、）３０Ｙ示す。これは、距
離ｔ１の間隔で離れた２つの向かいあった壁６４および
３６によって定められた液体を入れる室３２（第２図）
よりなる。そのような間隔は室３２の向かいあった端４
２および４４で接合する側壁６８および４０によって得
られる。

最も好ましいのは、側壁３８および４０の形が徐々にへ
こんでいく形のものであり、そσ）ためこれらの壁は末
端４２（第１図）で約９０°の角度にて分かれ、末端４
２および４４の中途の地点から再び約９０°の角度で１
点に集まるように近づき始める。距離１．　　（第２図
）は、側壁６８および４０の形のありかたン考えた場合
、液体を取り除いたときキュペットに留まる液体の量が
最少となるような距離２選ぶ。さらに詳しくは、壁６８
および４０に対する形が一定であるなら、この距離は。

キャピラリー・ナンバー（Ｎｃａ）およびボウチャー（
ｇｏｕｃｈｅｒ）　　＊ナンバー（Ｎｇｏ）　　（共に
流体管理の技術分野で公知の標準用語である）がそれぞ
れ０．０５未満であるように選択する。そのように選択
した場合、特に液体輸送システム下での運動量輸送は、
液体を室３２から大部分除去することになる。ｔ、の非
常に好ましい値は約０．５〜約２．５ｍｍである。

壁３４および３６は液体と接触する主要面となる。その
ため、厚さを間隔ｔ、と考えた場合、そｎらの表面積を
、室６２の表面対容積比が高速度ノ熱エネルギー伝達に
最も適するように選択する。

非常に好ましい例は、各様６４および３６の露出表面積
が２．４α（０，３７ｔｎ　　）であり、０．兄αの接
触面積で側壁の面と接触している場合である。したかっ
て１表面対容積比が、注入容積２００〜１００μｅに対
し、そｎぞｎ約６５〜１３０ｉｎ−’であるのが最も好
ましい。

液体表面積対容積比がそのように大きいと、急速な熱エ
ネルギー伝達とは別の利点がもたらされる。これは、一
定の容積に対して、より広い表面積が塗布試薬に提供さ
ｎることを意味する。このことは、早すぎる混合、すな
わち、液体を室に注入する前の混合、？防ぐために表面
上の離れた位置に塗布しなければならない試薬の場合、
特に重要なことである。また、キュペットの大きなＳ　
／Ｖ比によってもたらされる大きな試薬／液体界面領域
および短い拡散路により、外部刺激（例えば振盪）欠必
要とせずに試薬は速やかに溶解する。

従って、任意に、１つ以上の試薬層（図示されていない
）を、１層以上が、室３２に挿入する液体試料との反応
に加わるようにする形で壁６６の内面に塗布することが
できる。ここで使う「試薬」には、不連続な点として塗
布した試薬が含ま几る。

液体出入口６０は端４２に隣接する壁６６に形成される
（第２図）。この出入口は上部６２および下部６４を有
し、上部を室３２に接続している。

好ましくは、少なくとも上ｓ６２は円錐形であり。

その傾斜は円錐ピペットＰ（第１図）が合うようになっ
ている。

反対の端４４には、米国特許第４，４２６，４５１号に
記載のように空気抜き７０が設けられている。最も好ま
しくは、空気抜き７０は通路７２に延び（第６図）、端
４２の隣接点に戻り、出入口６゜に隣接する開ロア４で
終わる。

単一の密封機構で出入口６０および空気抜き開ロア４ｙ
ａ−共にシールするには、高くした円筒状ボス８０でこ
ルらを囲む。どのような密封機構（たとえば栓８２．第
１０図）もボス８ｏに対して有用である。そσ）ような
栓には、ボスの雌ねじ（図示されていない）に合う雄ね
じ８４があってもよ（、あるいはボス８０内への押し込
入式にしてもよい。

壁３６の反対側の壁３４は熱伝達性の壁であり。

熱エネルギー伝達が高速となる予め決めらｎた熱路長さ
および熱抵抗を有するよ５ＩＣ作る。最も好ましいのは
、そのような路の長さ（第２図の１．　　）が約０．３
ａｍ以下であり、熱抵抗が約０．０１℃／ワ。

ト以下である。このような性質は、厚さ約０．１５電の
アルミニウムのような金属から壁６４を作ることによっ
て簡単に得らｎる。そのようなアルミニウムは、厚さＸ
・１／（熱伝導率Ｋ・表面積Ａ）として計算して、約０
．００３℃／ワ、トの熱抵抗を有する。（こｎらの値は
、約０．２４℃の熱抵抗ン有する同じ厚さの普通のガラ
スと対照的である。）壁３４は側壁６８および４０にど
σ）ような適当な手段で固定してもよい。そ（７’）よ
うな１つの手段は１例えば一般的な高温硬化接着剤より
なる層９０（第２図）および一般的なポリエステル接着
剤の層９２である。最も好ましくは１層９０は壁６４の
表面領域−面に延ばす必要はない。というのは。

このように−面に延ばすと壁６４の熱抵抗が高まり、室
内での前述の反応が妨げら几る場合があるからである。

第１〜２図の上記のようなキュペットでは、熱時定数タ
ウ（τ）が約１０秒以下となることがわかった。最も好
ましいのは、τが６〜８秒のものである。水を入れたそ
のようなキュペットを壁６４の外側にそって加熱し、そ
の温度をＹ点（第２図）で測定すると、熱応答曲線が２
８℃〜最終温度１０６℃に生じる。中の液体が７６℃（
初期温度２８℃、プラス差（１０３，９−２８）の６３
％）となるのにかかる時間がタウのおおよその値である
。（おおよその）この値はよく知られた以下の熱応答式
から得られる： （１）温度Ｔ（ｔ）’＝最終温度（時間＝無限大に対す
る）＋（初期温度−最終温度）・ｅ−ｔ／７従って１式
中の時間間隔ｔがタウに等しい場合。

。−１／τエロー”ＴｈＱ、３７となる。こθ）ような
場合、Ｔ（ｔ）（ｔ＝タウでの）は初期温度と、（最終
温度−初期温度）の６３％との合計に等しい温度である
。

上記キュペットの場合、そこに含まれる液体のタウは約
６．５秒である。

層９０の接着剤ビ壁６４の表面全体に広げると。

タウは７〜８秒にも増加する。

特にサイクルの高温端でキュペット３０に時々問題が生
じる。キュペット内の液体および空気の熱膨張ならびに
液体中に溶解した気体の放出および上記のような開口６
０のシールによって、圧力が高まる。第２図のキュペッ
トでは、これによって、疑似模型線３４′で示すように
壁６４が外側に変形する傾向となる。外側への変形によ
って、キュベアトロ０が平らな発熱体上に正しく載るの
を妨げる厚さのドームが生じる。すなわち、発熱体と接
触し続けるのは面３４′の少しの部分の入である。従っ
て、そのようなドームの形成は好ましい壁６４を通して
の急速な熱伝達を減じる。本発明によって（第６図）、
上記の問題は以下のキュペ、トにより解消さｎる。そｎ
は熱伝導性壁以外のキュペットの一部が１反応容器壁と
培養器との間の緊密な接触？維持するために、圧力にａ
応するように部分的に変形するものである。前に記載し
たものと類似の部品には識別のための文字「ａ」を添え
た同じ参照番号を付けた。

従って、向かい合った壁５４ａおよび３６ａは側壁４Ｑ
ａ（１つのみ図示）と共に間隔ｔ、χ有する室３２ａ’
Ｙ定める。これらおよび出入口６０ａおよび空気抜き７
０ａは一般に前記と同様に作られている。壁３４ａが加
圧下で確実に変形しないようにするために、壁３６ａは
壁３４ａより小さい曲げ強さ？有するように作ら几てい
る。

詳しくは、以下のようにするのが好ましい：壁３４ａが
厚さ約０．１５ｍｍのアルミニウムからなる場合１曲げ
中心でのその曲げ強ｇＫは以下のようにして判定される
： 撓みＸはよ（知らｎた以下の式で判定さ几る：（２）　
　Ｘ＝αＰａ２／Ｅｔ３ 〔式中、Ｐ＝全加荷重、Ｅ＝ニブレート弾性率。

ｔ＝ニブレート厚さ、そしてαは実験係数（通常約０．
０１５である）〕 整理し直すと。

（３）　　Ｐ／Ｘ＝Ｅｔ３／αａ２ Ｐ／ＸはＫ（曲げ強さ）に等しいＦ／Ｘに類似している
ので。

（４）　　Ｋ＝Ｅ　ｔ”　／αａ２ こθ）ことがらＫは約６．１１Ｘ１０６　ダイン／　ｍ
ｙｘと計算できる。これよりも曲げ強さが小さい（例え
ば、約１×１０　ダイン／朋以下の値）壁３６ａの場合
は、同様に計算して約８．３ｘ１０　　ダイン／朋の曲
げ強さを持つ約０．３順の厚さ（アルミニウムの壁３４
ａの２倍）のポリエチレンまたはポリプロピレンの層よ
りもっばらなる必要がある。そのような構造では、室３
２ａ内に圧（例えば１２ｐｓｉ　）が生じるにつれ、壁
３６ａは上にドーム状にふくらみ、壁３４ａＹ発熱体に
対して平らな状態にしておく（「Ｅ」として疑似模型で
示す）。

使用の際、キュベ、）Ｙ４４（第２図）のところあたり
まで満たす。これは反応のための好ましい試料を含む液
体１例えば拡張を行’）ＤＮＡ配列の溶液、で約９０％
満たすことになる。次にこの装置を適当な培養器に入ｎ
１反応に必要な段階をサイクルさせる。

本発明のキュペ、トヲ好ましい加熱および冷却段階にサ
イクルさせるのに、どのような培養器も有用である。最
も好ましいのは１発明の背景テ記載した温度乞サイクル
させる段階ンもたらすものである。こｎｙ；ｒ：行うた
めに都合のよい培養器については前記関連出願に記載ｇ
ｒｔており、その詳細を参考としてここに採用する。以
下刃ステーションン有するものが好ましい： 予備培養ステーションは約９５℃に加熱する加熱手段ケ
有する。ここから、キュベアトゲ従来の押し出し手段で
一定温度のステーションのリング上に押し出す。その最
初のステーションは５５℃に保たれている。このステー
ションからキュペット馨次の隣接する。すなわち第２ス
テーシヨンに動かし、ここで７０℃に加熱する。この温
度にある時間保つ。従って、第３ステーシヨンもその温
度である。次に、９５℃に保たれている短時間変性ステ
ーション（第４ステーシヨン）で新しく複製化しｙ、：
ＤＮＡＹ変性する。ステーション５〜１２はステーショ
ン１〜４でてでに行わｎたサイクルケさらに２回繰り返
すだけである。キュペットは適当な回数培養器の中音サ
イクルさせてから取り出すことができる。サイクル数は
拡張する希望の目標ＤＮＡ配列の試料中の濃度および希
望する最終濃度によって決まる。第１２ステーシヨンの
後。

従来の移動装置でキュペ、トヲリングから次の工程に移
す。（液体のキュペットへの注入および液体のそこから
の取り出しはラインから離れて、すなわち、培養器の外
側、で行わ几る。）（発明の効果） 本発明の有益な技術的効果は、熱伝達壁が内圧下で曲が
る程十分に薄い特徴を有する。急速な熱サイクル用のキ
ュペットにおいて、そのような屈曲ゲ防ぐ手段がとら几
でいるキュペｙ）’ａ’提供することである。本発明に
関連する有益な技術的効果は、熱伝達壁が変形する前に
熱伝達壁の反対側の壁が内圧を除くように変形するよう
熟考して作ら几ているキュベ、トヲ提供することである
。

【図面の簡単な説明】

第１図は１本発明によって改良す几タキュベ。 トの等角投影図である。 第２図は、第１図のキュペットの中実軸に添った垂直断
面図である。 第３図は１本発明を説明するための、第２図と同様な断
面図である。 図中、数字は次の意味を持つ： ３０・・・・・・キュペット　　６２・・・・・・室３
４、３６；３４ａ、　３６ａ・・・・・・液体と接触す
る主要面を有する向かい合った壁、３４および３４ａは
熱伝導性であり、３６ａはろ４ａより曲げ強さが小さい
Ｏ １１・・・・・・非毛管間隔　　ｔ３・・・・・・壁３
６ａの厚さ（外４名）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 加熱器または冷却器によって加えられる温度をサイクル
   させる液体成分の制御反応用の熱サイクルキュペットに
   おいて、前記キュペットは２つの間隔をおいて離れた向
   かいあった壁（それぞれ液体に接する主要面となる）に
   よって定められた少なくとも１つの液体を入れる室を有
   し；向かいあった壁の１つは唯一の構造部材としての熱
   伝導性材料からなり、この熱伝導性材料は環境に曝され
   ていて外部加熱器または冷却器に接続でき；この熱伝導
   性構造部材の代わりに上記の壁の向かい合った１つが内
   圧下で曲がるように、熱伝導性壁の反対側の壁の曲げ強
   さが熱伝導性構造部材の曲げ強さよりも十分に小さい、
   上記のキュペット。