JPH01144976A - Novel promoter and production of exogenic protein in high manifestation using said promoter - Google Patents
Novel promoter and production of exogenic protein in high manifestation using said promoterInfo
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/03—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with oxygen as acceptor (1.2.3)
- C12Y102/03003—Pyruvate oxidase (1.2.3.3)
Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は種々の遺伝子を効率良く発現させることができ
るプロモーター、該プロモーターを含む発現ベクター、
該発現ベクターを保持する形質転換体、及び該形質転換
体を利用する種々の蛋白の製造法に関する。Detailed Description of the Invention [Industrial Application Field] The present invention provides a promoter capable of efficiently expressing various genes, an expression vector containing the promoter,
The present invention relates to a transformant carrying the expression vector, and methods for producing various proteins using the transformant.
遺伝子操作技術を用いて医薬または診断用薬上有用なペ
プチド蛋白質、例えばスーパーオキシドジスムターゼ、
インターフェロン、インターロイキン、ツモアー・ネフ
ローシス・ファクター、インスリン、カルシトニン、ソ
マトスタチン、セクレチン、プラスミノーゲン・アクチ
ベーター、ウロキナーゼ、グロスホルモン、エンドルフ
ィン、ウィルス蛋白、アミラーゼ、リパーゼ、アルコー
ルオキシダーゼなどが、エシェリヒア・コリやバチルス
・ズブチリスなとの原核生物、酵母、植物や動物細胞を
宿主生物として製造されるようになってきた。これらの
有用なペプチドや蛋白質（以下これらを単に蛋白という
）は、種々の遺伝子、例えば微生物から単離した遺伝子
、化学合成した遺伝子、ｍ−ＲＮＡから逆転写酵素にて
得た相補的遺伝子などや、さらにこれらの遺伝子を遺伝
子変換技術によって遺伝子の一部を置換、欠損または付
加せしめてなる突然変異手段での改変した生物学的にも
との蛋白の活性を有する活性蛋白（以下これをムティン
という）の遺伝子を宿主生物中で発現せしめることによ
り生産される。宿主生物中でこれらの外来蛋白遺伝子を
効率よく発現せしめ、目的とする蛋白の生産効率を向上
させるには、該外来蛋白遺伝子の転写効率を高める、翻
訳効率を高める、該外来蛋白遺伝子のコピー数を多くす
ることなどが必要とされる。Genetic engineering techniques can be used to produce peptide proteins useful in medicine or diagnostics, such as superoxide dismutase,
Interferon, interleukin, tumour nephrosis factor, insulin, calcitonin, somatostatin, secretin, plasminogen activator, urokinase, gross hormone, endorphin, viral protein, amylase, lipase, alcohol oxidase, etc.・It has come to be produced using prokaryotes such as S. subtilis, yeast, plant and animal cells as host organisms. These useful peptides and proteins (hereinafter simply referred to as proteins) are derived from various genes, such as genes isolated from microorganisms, chemically synthesized genes, complementary genes obtained from m-RNA using reverse transcriptase, etc. Furthermore, these genes are modified by mutagenic means by substituting, deleting, or adding a part of the gene using gene conversion technology to produce an active protein that has the activity of the biologically original protein (hereinafter referred to as mutin). ) is produced by expressing the gene in a host organism. In order to efficiently express these foreign protein genes in host organisms and improve the production efficiency of the target protein, it is necessary to increase the transcription efficiency of the foreign protein gene, increase the translation efficiency, and increase the copy number of the foreign protein gene. It is necessary to increase the number of
そして、外来蛋白遺伝子の転写効率を高めるため、外来
蛋白遺伝子の上流に強力なプロモーターを結合させる（
特開昭５４−９２８９５号公報参照）ことが−船釣に行
なわれており、該プロモーターとしては、例えば、ｌｐ
ｐ、Ｉａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ。In order to increase the transcription efficiency of the foreign protein gene, a strong promoter is attached upstream of the foreign protein gene (
JP-A No. 54-92895) is carried out in boat fishing, and the promoters include, for example, lp
p, Iac, trp, tac.
λＰＬ 、 ｒｅｃＡ 、 ｐｈｏＡなどが知られてい
る。λPL, recA, phoA, etc. are known.
〔発明が解決しようとする問題点）
しかしながら目的とする外来蛋白遺伝子の発現に合致し
たプロモーターを得ようとして遺伝子ライブラリーから
新たにスクリーニングするには、多大の労力を必要とす
る。またプロモーター活性は有していても、適切な制限
酵素認識部位が適当な部位にないために利用できないこ
ともある。[Problems to be Solved by the Invention] However, it requires a great deal of effort to newly screen a gene library in order to obtain a promoter that matches the expression of a target foreign protein gene. Furthermore, even if a promoter has promoter activity, it may not be usable because an appropriate restriction enzyme recognition site is not located at the appropriate site.
従フて、適当な制限酵素認識部位を有し、かつ強いプロ
モーター活性を有するプロモーターを見い出すことは、
遺伝子操作によって種々の蛋白を生産しようとする場合
に極めて重要である。Therefore, finding a promoter that has an appropriate restriction enzyme recognition site and has strong promoter activity is
This is extremely important when trying to produce various proteins through genetic manipulation.
本発明者らは、先にピルビン酸オキシダーゼのアミノ酸
配列をコードする新規なりＮＡ断片、およびこれを含有
するプラスミドを見い出し、特許出願した（特願昭６２
−９０３号）。そしてさらにこのピルビン酸オキシダー
ゼ遺伝子を含むプラスミドについて研究を進めたところ
、意外にも該プラスミドから制限酵素により切断して得
られたＤＮＡ断片がピルビン酸オキシダーゼだけでなく
、スーパーオキシドジスムターゼ等の他のペプチドや蛋
白質の遺伝子をも効率よく発現させることを見い出し、
本発明を完成した。The present inventors previously discovered a novel NA fragment encoding the amino acid sequence of pyruvate oxidase and a plasmid containing the same, and filed a patent application (Patent Application No. 62
-903). Further research on the plasmid containing this pyruvate oxidase gene revealed that, unexpectedly, the DNA fragment obtained by cutting the plasmid with a restriction enzyme contained not only pyruvate oxidase but also other peptides such as superoxide dismutase. discovered that it can efficiently express genes for and proteins.
The invention has been completed.
すなわち本発明はピルビン酸オキシダーゼ遺伝子発現を
支配しているプロモーターを含有するデオキシリボヌク
レオチド配列、該配列の下流に外来蛋白遺伝子を結合し
た発現ベクター、該発現ベクターを保持した形質転換体
、および該形質転換体を利用する外来蛋白の高発現製造
法を提供するものである。That is, the present invention provides a deoxyribonucleotide sequence containing a promoter controlling pyruvate oxidase gene expression, an expression vector in which a foreign protein gene is linked downstream of the sequence, a transformant carrying the expression vector, and the transformation. The present invention provides a method for producing high expression of foreign proteins using the body.
本発明のデオキシリボヌクレオチド配列（以下、本発明
プロモーターという）は、例えばピルビン酸オキシダー
ゼ遺伝子を発現させる組換えベクターからそのプロモー
ター活性を有する部分を制限酵素を用いて切り出すこと
によって簡便に製造される。The deoxyribonucleotide sequence of the present invention (hereinafter referred to as the promoter of the present invention) can be easily produced, for example, by cutting out a portion having promoter activity from a recombinant vector that expresses the pyruvate oxidase gene using a restriction enzyme.
原料となるピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を発現する組
換えベクターは、例えばピルビン酸オキシダーゼ遺伝子
の供与体である微生物よりＤＮＡを分Ｉｉ精製した後、
超音波、制限酵素などを用いて切断したＤＮＡとリニヤ
−な発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑または接着末端部
においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環させ、かく
して得られた組換えＤＮＡベクターを複製可能な宿主微
生物に穆大した後、ベクターのマーカーとピルビン酸オ
キシダーゼの活性とを指標−としてスクリーニングして
、該組換えＤＮＡベクターを保持する微生物を選択し、
該微生物を培養し、該培養菌体から当該組換ベクターを
分離精製することにより得られる。A recombinant vector that expresses the pyruvate oxidase gene as a raw material can be obtained by, for example, purifying DNA from a microorganism that is a donor of the pyruvate oxidase gene, and then
DNA cut using ultrasound, restriction enzymes, etc. and a linear expression vector are bonded and closed at the blunt or adhesive ends of both DNAs using DNA ligase, etc., and the thus obtained recombinant DNA vector is made into a host capable of replicating the resulting recombinant DNA vector. After growing into a microorganism, a microorganism carrying the recombinant DNA vector is selected by screening using vector markers and pyruvate oxidase activity as indicators,
It can be obtained by culturing the microorganism and separating and purifying the recombinant vector from the cultured cells.
ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子の供与体である微生物と
しては、ピルビン酸オキシダーゼ産生能を有する微生物
であればよく、例えば、特開昭５４−１２６７９１号公
報、特開昭５９−１５９７７７号公報、特開昭５９−１
６２８７７号公報、Ａｒｃｈ 。The microorganism that is the donor of the pyruvate oxidase gene may be any microorganism that has the ability to produce pyruvate oxidase, for example, JP-A-54-126791, JP-A-59-159777, JP-A-59. -1
No. 62877, Arch.
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 １１６ １６８
−１７６（１９６６）などに示されているラクトバチル
ス・デルブリウキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄ
ｅｌｂｒｕｃｋｉ）、ヘディオコッヵス・エスピー（Ｐ
ｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ）、ストレプトコッカス畢
エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ）、アエ
ロコツカス・ビリダンス（Ａａｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉ
ｒｉｄａｎｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌ ｌｕｓＰｌａｎｔａｒｕｍ） 、ラ
クトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ５ａｌｉｖａｒｉｕｓ）、 ｏイコノストックー
メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ Ｍｅｓｅ
ｎｔｅｒ−ｏｉｄｅｓ）等のラクトバシラセア科または
ストレプトコッカセア科などの微生物が適宜選ばれる。Biochem, Biophys, 116 168
-176 (1966) etc.
elbrucki), Hediococcus sp.
ediococcus sp), Streptococcus sp, Aerococcus viridans
ridans), Lactobacillus plantarum (La
ctobacillus lus Plantarum), Lactobacillus salivarius (Lactobacillus
us 5alivarius), o Iconostoc-Mesenteroides (Leuconostoc Mese)
Microorganisms from the Lactobacillaceae family, such as C. ter-oides), or from the Streptococceae family, are appropriately selected.
また、遺伝子組換え技術を駆使して、ピルビン酸オキシ
ダーゼ産生能を付与せしめた形質転換微生物をピルビン
酸オキシダーゼ遺伝子の供与体として利用してもよい。Furthermore, a transformed microorganism imparted with the ability to produce pyruvate oxidase by making full use of genetic recombination technology may be used as a donor for the pyruvate oxidase gene.
ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子の供与体である微生物か
ら由来するＤＮＡは次の如くにして採取される。即ち、
供与微生物である上述した細菌のいずれかを、例えば、
液体培地で約１〜３日間通気攪拌培養し、得られる培養
物を遠心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させること
によってピルビン酸オキシダーゼ遺伝子の含有溶菌物を
調製することができる。溶菌方法としては、例えばリゾ
チームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素による
処理が施され、必要によりプロテアーゼなどの他の酵素
やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用され
、さらに細胞壁の物理的破壊法である凍結融解やフラン
チプレス処理を上述の溶菌法との組み合せで行ってもよ
い。DNA derived from the microorganism that is the donor of the pyruvate oxidase gene is collected as follows. That is,
The donor microorganism, any of the bacteria mentioned above, may be, for example,
A lysate containing the pyruvate oxidase gene can be prepared by culturing in a liquid medium with aeration for about 1 to 3 days, centrifuging the resulting culture to collect the bacteria, and then lysing the bacteria. Bacteriolytic methods include treatment with cell wall lytic enzymes such as lysozyme and β-glucanase, and if necessary, other enzymes such as protease and surfactants such as sodium lauryl sulfate, and physical destruction of the cell wall. The freeze-thaw and flanch press treatments may be performed in combination with the above-mentioned lysis method.
このようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離、精製
するには、常法に従って、例えばフェノール抽出による
除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理
、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わ
せることにより行うことができる。In order to separate and purify DNA from the lysate obtained in this way, it is possible to use a conventional method, for example, by appropriately combining methods such as protein removal treatment by phenol extraction, protease treatment, ribonuclease treatment, alcohol precipitation, and centrifugation. It can be carried out.
分離精製された微生物ＤＮＡを切断する方法は、例えば
、超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができ
るが、得られるＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易な
らしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配
列に作用する、例えば、ＥｃｏＲＩ 、 ＨｉｎｄｌＩ
Ｉ 、 ＢａｍＨＩなどの！！型制限酵素が適している
。The isolated and purified microbial DNA can be cleaved by, for example, ultrasonication, restriction enzyme treatment, etc. However, in order to facilitate the binding of the obtained DNA fragment to the vector, restriction enzymes, especially specific nucleotides, are used. acts on the sequence, e.g. EcoRI, HindlI
I, BamHI etc! ! type restriction enzymes are suitable.
ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖しつるフ
ァージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築
されたものが適している。Suitable vectors are those constructed for genetic recombination from phages or plasmids that can autonomously propagate in host microorganisms.
ファージとしては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃａｌｆ）を宿主微生物とする場
合には、λｇｔ・λＣ１λｇｔ・λＢなどが使用できる
。Examples of phages include Escherichia coli (Es
cherichia calf) as the host microorganism, λgt, λC1, λgt, λB, etc. can be used.
また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コ
リを宿主微生物とする場合にはｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３
２５，ｐＡｃＹｃ １８４． ｐＵＣ１２，ｐＵｃ１３
゜ｐＵｆｌ：１８ 、ｐＵＣ１９などが、バチルス・ズ
ブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｆｌｌｉｓ）を
宿主微生物とする場合にはｐＵＢｌｌｏ、ｐｃ１９４な
どが使用でき、さらにエシェリヒア・コリおよびサツカ
ロマイセス・セレビシアなどのダラム陰・陽画性にまた
がる二種以上の宿主微生物で自律的に増殖可能なシャト
ルベクターを利用することもできる。このようなベクタ
ーを、先に述べたピルビン酸オキシダーゼ遺伝子供与体
である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同じ制
限酵素で切断して、ベクター断片を得ることが好ましい
。In addition, as a plasmid, for example, when Escherichia coli is used as a host microorganism, pBR322, pBR3
25, pAcYc 184. pUC12, pUC13
゜pUfl:18, pUC19, etc. can be used when the host microorganism is Bacillus subtilis, pUBllo, pc194, etc. can be used. Shuttle vectors that can autonomously propagate in more than one species of host microorganisms can also be used. It is preferable to obtain a vector fragment by cleaving such a vector with the same restriction enzyme used to cleave the microbial DNA that is the pyruvate oxidase gene donor described above.
微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる方法は
、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例
えば、微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクター断片の接
着末端とのアニーリングの後、適当なりＮＡリガーゼの
作用により微生物ＤＮＡ断片とベクター断片との組換え
ＤＮＡを作成する。必要ならば、アニーリングの後、宿
主微生物に移入して、生体内のＤＮＡリガーゼを利用し
組換えＤＮＡを作成することもできる。The method for joining the microbial DNA fragment and the vector fragment may be any method using a known DNA ligase. For example, after annealing the cohesive end of the microbial DNA fragment and the cohesive end of the vector fragment, an appropriate NA ligase is used. By this action, recombinant DNA between the microbial DNA fragment and the vector fragment is created. If necessary, after annealing, the DNA can be transferred into a host microorganism and recombinant DNA can be created using in-vivo DNA ligase.
宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的に
増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質が発現のできるも
のであればよく、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・
コリの場合、エシェリヒア・コリＤＨＩ、エシェリヒア
・コリＨＢＩＯＩ、エシェリヒア・コリＷ３１１０．エ
シェリヒア・コリＣ６００等が利用出来る。 宿主微生
物に組換えＤＮＡを移入する方法としては、例えば、宿
主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、
カルシュラムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行
い、またバチルス属に属する微生物の場合には、コンピ
テントセル法またはプロトプラスト法などを採用するこ
とができ、さらにマイクロインジョン法を用いてもよい
。The host microorganism may be one that allows the recombinant DNA to grow stably and autonomously and that can express the characteristics of the foreign DNA. For example, the host microorganism may be Escherichia spp.
For Escherichia coli, Escherichia coli DHI, Escherichia coli HBIOI, Escherichia coli W3110. Escherichia coli C600 etc. can be used. As a method for transferring recombinant DNA into a host microorganism, for example, when the host microorganism belongs to the genus Escherichia,
Recombinant DNA can be transferred in the presence of calcium ions, and in the case of microorganisms belonging to the genus Bacillus, the competent cell method or protoplast method can be used, and the microinjection method can also be used. good.
宿主微生物への目的組換えＤＮＡ移入の有無についての
選択は、目的組換えＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐
性マーカーとピルビン酸オキシダーゼとを同時に発現し
得る微生物を検索すればよく、例えば、薬剤耐性マーカ
ーに基づく選択培地で生育し、かつピルビン酸オキシダ
ーゼを生成する微生物を選択すればよい。このようにし
て−度選択されたピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を保有
する組換えＤＮＡは、形質転換微生物から取り出され、
他の宿主微生物に移入することも容易に実施できる。To select whether or not to transfer the target recombinant DNA into a host microorganism, it is sufficient to search for a microorganism that can simultaneously express the drug resistance marker and pyruvate oxidase of the vector holding the target recombinant DNA. Microorganisms that grow in a selective medium based on the above and produce pyruvate oxidase may be selected. The recombinant DNA carrying the pyruvate oxidase gene selected in this way is extracted from the transformed microorganism, and
Transfer to other host microorganisms can also be easily carried out.
かくして得られるピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を発現
する組換えベクターの好ましい例としては、プラスミド
ｐＯＸＩ３が挙げられる。A preferred example of a recombinant vector that expresses the pyruvate oxidase gene thus obtained is plasmid pOXI3.
ｐＯＸＩ３から本発明プロモーターを切り出すための制
限酵素としては、ＤｒａＩが最適である。DraI is the most suitable restriction enzyme for cutting out the promoter of the present invention from pOXI3.
ｐＯＸＩ３から制限酵素Ｄｒａ Ｉで切り出された本発
明プロモーターは、少なくとも下記塩基配列５°−ＴＴ
ＧＧＡＡ−Ｘ−ＴＡＴＴＡＴ−３゜〔式中、Ａはアデニ
ン、Ｔはチミン、Ｇはグアニンであり、ＸはＡ、Ｔ、Ｇ
およびＣ（ここでＣはシトシンである）からなる１６〜
２１ｂｐを示す〕
を有する。このうちＸが１７ｂｐ、特に５°−ＴＴＧＧ
ＡＡＴＡＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＡＧＴＧＣＴ八ＴＴＡＴ
−’。The promoter of the present invention excised from pOXI3 with the restriction enzyme Dra I has at least the following base sequence 5°-TT
GGAA-X-TATTAT-3゜ [wherein, A is adenine, T is thymine, G is guanine, and X is A, T, G
and C (where C is cytosine)
21 bp]. Among these, X is 17bp, especially 5°-TTGG
AATAAGCTGTTTTAAGTGCT8TTAT
-'.
であるものが好ましい。It is preferable that
またこのプロモーターは、少なくともこの塩基配列５−
ＴＴＧＧＡＡ−Ｘ−ＴＡＴＴＡＴ−３°を有し、カッ■
５°−ＴＴＧＡＴＴ−＞ｈ−ＴＴＣＴＴＡ−”、■５−
ＴＴＴＡＴＡ−Ｘ３−ＴＡＣＴＧＴ−３°、■”−ＣＴ
ＧＡＡＡ−Ｘ４−ＡＡＴＴＡＴ−３°、■５−ＴＧＧＡ
ＩＩ：［ニーＸ５−ＧＧＧＡＡＴ−”、■”−ＴＴＣＡ
ＴＴ−Ｘｓ−ＴＡＴＴＡＴ−３°、■”−ＴＧＧＡＡＴ
−Ｘｙ−ＴＡＴＴＡＴ−３°、■ ５°−ＴＴＴＡＡＧ
−Ｘａ−ＧＡＴ八Ｔへ−”、および
■ ”−ＴＴＴＡＡＧ−Ｘ、−ＴＡＴＴＴＴ−３°、（
但し、Ｌ、Ｘ＋、Ｘ４．Ｘｓ、Ｘｓ、Ｘｙ、Ｘａ、およ
びＸ９は同一または異なってＡ、Ｔ、ＧおよびＣからな
る１６〜２１ｂｐを示す）からなる群より選ばれた１種
または２種以上の塩基配列を有していてもよい。Further, this promoter has at least this base sequence 5-
It has TTGGAA-X-TATTAT-3°, and
5°-TTGATT->h-TTCTTA-”, ■5-
TTTATA-X3-TACTGT-3°, ■”-CT
GAAA-X4-AATTAT-3°, ■5-TGGA
II: [Knee X5-GGGAAT-”,■”-TTCA
TT-Xs-TATTAT-3°, ■”-TGGAAT
-Xy-TATTAT-3°, ■ 5°-TTTAAG
-Xa-GAT8T-", and ■"-TTTAAG-X, -TATTTT-3°, (
However, L, X+, X4. Xs, Xs, Xy, Xa, and X9 are the same or different and have one or more base sequences selected from the group consisting of 16 to 21 bp consisting of A, T, G, and C. You can.
また上記の■５°−ＴＴＧＡＴＴ−Ｘ２−ＴＴＣＴＴＡ
−’°におイテ×２はＡ、Ｔ、ＧおよびＣからなル２１
ｂｐが好ましく ＴＡＴＡＡＧＧＧＴＴＴＣＴＧＧＡ
ＣＴＴＣＴで例示され、また■”−ＴＴＴＡＴＡ−Ｘ３
−ＴＡＣＴＧＴ−３°（７）Ｘ３はｉ’ｙｂｐが好まし
く ＡＧＧＧＴＴＴＣＴＧＧＡＣＴＴＣＴで例示され、
■５−ＣＴＧＡＡＡ−Ｘ４−ＡＡＴＴＡＴ−３°（７）
Ｘ４は１７ｂｐが好ましく ＡＡＡＧＧＧＴＡＴＴＴＴ
ＴＧＧｆｌ：Ｔで例示され、■５°−ＴＧＧＡＣＣ−Ｘ
ｓ−ＧＧＣＡＡＴ−３°ノｘ５は１７ｂｐが好マシくＴ
ＣＡＣＡＡＡＧＧＡＴＡＴＴＴＧＴ テ例示され、■５
−ＴＴＣＡＴＴ−Ｘ６−Ｔ八ＴＴＡＴ−” の×６は
２１ ｂｐが好ましく ＧＧＡＡＴＡＡＧＣＴＧＴＴＴ
ＴＡＡＧＴＧ［：で例示され、■”−ＴＧＧＡＡＴ−Ｘ
ｙ−ＴＡＴＴＡＴ−” ）Ｘｙは１６ｂｐが好ましく
ＡＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＡＧＴＧＣで例示され、■５−
ＴＴＴＡＡＧ−Ｘａ−ＧＡＴＡＴＴ−” ノＸ８は１８
ｂｐが好ましく ＴＧＣＴＡＴＴＡＴＴＴＣＡＡＴＴＧ
Ｔで例示され、ざらに■”−ＴＴＴＡＡＧ−Ｘ９−ＴＡ
ＴＴＴＴ−” （７）Ｘ、は２０ｂｐが好ましく ＴＧ
（：ＴＡＴＴＡＴＴＴＣＡＡＴＴＧＴＧＡで例示される
。Also, the above ■5°-TTGATT-X2-TTCTTA
-'°Ite x 2 is from A, T, G and C21
bp is preferred TATAAGGGTTTCTGGA
exemplified by CTTCT, and also ■”-TTTATA-X3
-TACTGT-3°(7)X3 is preferably i'ybp, exemplified by AGGGTTTCTGGACTTCT,
■5-CTGAAA-X4-AATTAT-3° (7)
X4 is preferably 17bp AAAGGGTATTTT
TGGfl: exemplified by T, ■5°-TGGACC-X
s-GGCAAT-3°x5 is better with 17bp T
CACAAAGGATATTTGT te example, ■5
-TTCATT-X6-T8TTAT-", x6 is preferably 21 bp. GGAATAAGCTGTTT
TAAGTG[: is exemplified by ■"-TGGAAT-X
y-TATTAT-”)Xy is preferably 16bp
Illustrated in AAGCTGTTTTAAGTGC, ■5-
TTTAAG-Xa-GATATT-” NoX8 is 18
bp is preferred TGCTATTATTTCAATTG
Illustrated with T, roughly ■”-TTTAAG-X9-TA
TTTT-” (7)X is preferably 20bp TG
(Exampled as: TATTATTTCAATTGTGA.
さらに、最も好ましい本発明プロモーターの全塩基配列
は、２０２ｂｐよりなるものであり、５′末端側より式
％式％
（：
：
この本発明プロモーターはＲｓａ Ｉ 、 Ｓｐｅ ｔ
。Furthermore, the most preferable entire base sequence of the promoter of the present invention is one consisting of 202 bp, and the promoter of the present invention has the following sequence from the 5' end: Rsa I, Spet
.
Ｍａｅ ｒ 、 Ｓｓｐ Ｉ 、 Ｃｆｒ１３１ 、
Ｍｎｌ Ｉ 、 Ａｖａ ＩＩおよびＡｌｕｌｌの各制
限酵素記識部位を有する。Maer, Ssp I, Cfr131,
It has Mnl I, Ava II and Allull restriction enzyme coding sites.
本発明プロモーターの下流に外来蛋白遺伝子を結合し、
かつ適当な発現ベクターを用いることにより、該外来蛋
白遺伝子の発現ベクターが得られる。A foreign protein gene is linked downstream of the promoter of the present invention,
By using an appropriate expression vector, an expression vector for the foreign protein gene can be obtained.
外来蛋白遺伝子としては、ペプチド遺伝子または蛋白質
遺伝子、具体的にはスーパーオキシドジスムターゼ、イ
ンターフェロン、インターロイキン、ツモアー・ネフロ
ーシス・ファクター、インスリン、カルシトニン、ソマ
トスタチン、セクレチン、プラスミノーゲン・アクチベ
ーター、ウロキナーゼ、グロスホルモン、エンドルフィ
ン、ウィルス蛋白またはそのムティンをコードする遺伝
子等が挙げられる。就中、スーパーオキシドジスムター
ゼの場合に特に良好な結果を与える。Examples of foreign protein genes include peptide genes or protein genes, specifically superoxide dismutase, interferon, interleukin, tumour nephrosis factor, insulin, calcitonin, somatostatin, secretin, plasminogen activator, urokinase, and gross hormone. , endorphins, genes encoding viral proteins or their mutins, and the like. Among these, particularly good results are given in the case of superoxide dismutase.
スーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子を本
発明プロモーターの下流に有する発現ベクターを製造す
るには、例えば、図１に示す如く、まずＰＯＸＩ３より
制限酵素Ｄｒａ Ｉで切り出した本発明プロモーター（
２０２ｂｐ）を制限酵素Ｓａｌ Ｉで切断したｐＵｃ１
２にポリメラーゼを用いて結合せしめる。得られた本発
明プロモーター含有プラスミド Ｉ）ＫＮ１７ （２，
９ｋｂｐ）は、制限酵素Ｘｂａ ＩおよびＢａｍＨＩ認
識部位を有するので、両制限酵素で切断する。一方、ス
ーパーオキシドジスムターゼ発現用プラスミド ｐｓＯ
Ｄ１４〔特開昭６２−１３０６８４号、制限酵素Ｘｂａ
ＩとＢａｍＨＩの間にスーパーオキシドジスムターゼ
（ＳＯＤ）遺伝子を有する）より、Ｘｂａ ＩとＢａ
ｍＨＩで切断して、ＳＯＤ遺伝子断片を得る。これをｐ
ＫＮ１７ と結合せしめることにより、本発明プロモー
ターを有し、その下流にＳＯＤ遺伝子を有するプラスミ
ドｐｓＯＤ１２０が得られる。To produce an expression vector having a gene encoding superoxide dismutase downstream of the promoter of the present invention, for example, as shown in FIG.
pUc1 (202 bp) cut with restriction enzyme Sal I
2 using polymerase. Obtained promoter-containing plasmid of the present invention I) KN17 (2,
9kbp) has recognition sites for restriction enzymes Xba I and BamHI, so it is cut with both restriction enzymes. On the other hand, superoxide dismutase expression plasmid psO
D14 [JP-A-62-130684, restriction enzyme Xba
Xba I and Ba
Cut with mHI to obtain the SOD gene fragment. This is p
By ligation with KN17, a plasmid psOD120 having the promoter of the present invention and the SOD gene downstream thereof can be obtained.
本発明のプロモーターの下流の外来蛋白遺伝子を結合し
たベクターを、種々の宿主生物に導入し、該宿主生物を
形質転換せしめれば、目的とする外来蛋白遺伝子を生産
する形質転換体が得られる。宿主生物としては通常の遺
伝子組換えに用いられる微生物、例えばエシェリヒア・
コリ等が用いられる。またベクターの導入方法も、特に
制限されず前述の塩化カルシウム処理法等が利用できる
。By introducing the vector to which the foreign protein gene downstream of the promoter of the present invention has been linked into various host organisms and transforming the host organisms, transformants that produce the desired foreign protein gene can be obtained. As host organisms, microorganisms commonly used for genetic recombination, such as Escherichia spp.
Cori etc. are used. Furthermore, the method for introducing the vector is not particularly limited, and the above-mentioned calcium chloride treatment method and the like can be used.
目的とする蛋白を製造するには、上記の如くして得られ
た形質転換体を培養し、該培養物から採取すればよい。In order to produce the desired protein, the transformant obtained as described above may be cultured and harvested from the culture.
形質転換体の培養は、その形質転換体の生育に必要な栄
養源を、無機成分を含む培地中、公知の方法で行われる
が、前述のｐｓＯＤ１２０を保持した形質転換体（Ｅ、
ｃｏｌｉ）の場合には、例えば適当量の銅及び／又は亜
鉛イオンを含むあるいは含まない培地中、通気攪拌培養
、振どう培養、回転培養、静置培養等により、３０〜４
２℃、好ましくは３７℃付近で３時間〜４８時間、培養
することにより行われる。The transformant is cultured by a known method in a medium containing inorganic components, which provides nutritional sources necessary for the growth of the transformant.
In the case of E.coli), for example, 30 to 40% of
This is carried out by culturing at 2°C, preferably around 37°C, for 3 to 48 hours.
目的とする蛋白が細胞内に産生される場合には細胞培養
物が高濃度に達した時に、遠心分離により細胞を分離し
、溶解し、そして既知文献記載の種々の方法、例えば、
抽出、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィー、電気泳動、透析、又はこれらの組
合わせにより目的とする蛋白を分１１１Ｉｉ製する。If the protein of interest is produced intracellularly, when the cell culture reaches a high concentration, the cells can be separated by centrifugation, lysed, and treated using various methods described in the known literature, e.g.
The desired protein is prepared in fractions 111Ii by extraction, ion exchange chromatography, affinity chromatography, electrophoresis, dialysis, or a combination thereof.
また、生成物が分泌される場合には、培地について上記
と同様な方法を用いる。Alternatively, if the product is secreted, the same method as above is used for the culture medium.
上述のｐｓＯＤ１２０以外にも、特開昭６２−１３０６
８４号に記載のプラスミドと本発明プロモーターとの組
み合せにより、種々のスーパーオキシドジスムターゼま
たはそのムティン、例えば下記−般式
％式％
（但しＸＩＯは水素原子、アセチル基またはアミノ酸残
基を示し、Ｘ１１およびＸＩ□は、同一または異なって
ＣｙｓまたはＣｙｓ以外のアミノ酸を示す）
で表わされるペプチドが得られる。In addition to the above-mentioned psOD120, JP-A-62-1306
By the combination of the plasmid described in No. 84 and the promoter of the present invention, various superoxide dismutases or their mutins, such as the following general formula % (where XIO represents a hydrogen atom, an acetyl group or an amino acid residue, and X11 and XI□ is the same or different and represents Cys or an amino acid other than Cys).
このペプチドにおいて×１゜が水素原子、アセチル基ま
たはＭｅｔであり、Ｘ１１が中性アミノ酸残基、例えば
Ｇｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒであり、Ｘ１２
が中性アミノ酸残基、例えばＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ。In this peptide, ×1° is a hydrogen atom, an acetyl group, or Met, X11 is a neutral amino acid residue, such as Gys, Ser, Ala, or Thr, and X12
is a neutral amino acid residue, such as Cys, Ser, Ala.
またはＴｈｒで示されるアミノ酸を示すペプチドが好ま
しい。特に、ｐｓＯＤ１２０を用いた場合に得られるペ
プチド（Ｘ＋＋−Ｃｙｓ、 Ｊ２−５ａｒ）が好ましい
。Or, a peptide showing an amino acid represented by Thr is preferable. Particularly preferred is the peptide (X++-Cys, J2-5ar) obtained when psOD120 is used.
本明細書に記載のアミノ酸、ペプチド、核酸、核酸関連
物質、その他に関する略号は、それらの当該分野におけ
る慣用略号に基づくもので、それらの例を以下に列記す
る。またすべてのアミノ酸は５体を示すものとする。Abbreviations for amino acids, peptides, nucleic acids, nucleic acid-related substances, and others described herein are based on their common abbreviations in the field, and examples thereof are listed below. Furthermore, all amino acids are assumed to have 5 forms.
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸 ＲＮＡ：リボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ニゲアニン Ｃ：シトシン Ａｌａ：アラニン Ａｒｇ：アルギニン Ａｓｎニアスパラギン Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｃｙｓニジスティン Ｇｉｎ：グルタミン Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ｇｌｙニゲリシン Ｈｉｓ：ヒスチジン １１ｅ：イソロイシン Ｌｅｕ：ロイシン Ｌｙｓ：リジン Ｍｅｔ：メチオニン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｐｒｏニブロリン Ｓｅｔ ：セリン Ｔｈｒ：スレオニン Ｔｒｐ ： トリプトファン Ｔｙｒ：チロシン Ｖａｌ：バリン 〔実施例〕 次に実施例を挙げて本発明を説明する。DNA: deoxyribonucleic acid RNA: ribonucleic acid A: Adenine T: Thymine G Nigeanin C: Cytosine Ala: Alanine Arg: arginine Asn niasparagine Asp: aspartic acid Cys Nijistin Gin: Glutamine Glu: Glutamic acid Gly nigericin His: histidine 11e: Isoleucine Leu: Leucine Lys: Lysine Met: methionine Phe: Phenylalanine Pro Nibroline Set: Serin Thr: Threonine Trp: tryptophan Tyr: Tyrosine Val: Valin 〔Example〕 Next, the present invention will be explained with reference to Examples.
参考例１゜
染色体ＤＮＡの分離
Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ （ＩＦＯ０
１２２１９）の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した同菌
株を１５０ｍＪ１の普通ブイヨン培地（０，５％チオ硫
酸ソーダ含有）で３７℃−晩振盪培養後遠心（３，００
０回転１０分）により集菌した。１０％サッカロース、
５０ｍＭ）−リス塩酸 （ｐＨａ、ｏ）、５０ ｍＭ
ＥＤＴＡを含んだ溶液５ｍ℃に懸濁させ、１ ｍＪ２
のリゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｍｊｌ ）を加えて３７
℃、１５分間保温し、次いで１ ｍｊｌの１０％５Ｄ
Ｓ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液を加えた、この懸濁
液に等量のクロロホルム−フェノール混液（１：１）を
加え、攪拌混合し、１０，０００ｒｐｍ′３分の遠心で
水層と溶媒層に分け、水層を台数した。この水層に２倍
量のエタノールを静かに重層し、ガラス棒でゆっくり攪
拌しながらＤＮＡをガラス棒にまきつかせて分離した。Reference example 1゜Isolation of chromosomal DNA Aerococcus viridans (IFO0
The chromosomal DNA of 12219) was isolated by the following method, and the same strain was cultured in 150 mJl of ordinary broth medium (containing 0.5% sodium thiosulfate) at 37°C with overnight shaking, followed by centrifugation (3,000 mJl).
0 rotation for 10 minutes) to collect bacteria. 10% sucrose,
50mM)-Lis-HCl (pHa, o), 50mM
Suspend in a solution containing EDTA at 5 m℃, and add 1 mJ2
Add lysozyme solution (10 mg/mjl) to 37
°C for 15 minutes, then 1 mjl of 10% 5D
Add an equal amount of chloroform-phenol mixture (1:1) to this suspension containing S (sodium dodecyl sulfate) solution, stir and mix, and centrifuge at 10,000 rpm for 3 minutes to separate the aqueous and solvent layers. The water layer was counted. Two times the amount of ethanol was gently layered on this aqueous layer, and the DNA was separated by wrapping it around the glass rod while stirring slowly with a glass rod.
これを１０ｍｆＬの１０ｍＭ）−リス塩酸（ｐＨ８，０
）、１ ｍＭＥＤＴＡを含んだ溶液（以下ＴＥと略す）
で溶解した。これを等量のクロロホルム−フェノール混
液で処理後、遠心により水層を分取し、２倍量のエタノ
ールを加えて上記の方法でもう一度ＤＮＡを分離し、２
ｍｊ２のＴＥで溶解した。This was added to 10 mfL of 10mM)-Lis-HCl (pH 8.0).
), a solution containing 1 mM EDTA (hereinafter abbreviated as TE)
It was dissolved in After treating this with an equal amount of chloroform-phenol mixture, separate the aqueous layer by centrifugation, add twice the amount of ethanol, and separate the DNA again using the above method.
Dissolved in mj2 TE.
参考例２゜
ｐへＣＹＣｌ３４プラスミドＤＮＡの 離ｐＡｃＹｃ１
８４を保有するエシェリヒア・コリｐＭ１９１（Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ １３４，１１４１（１９８１）；Ａ
ＴＣ（： ３７０３３）を１℃のＢＨＩ培地（Ｄｉｆｃ
ｏ社製）で振盪培養した。濁度がｏＤ６６゜＝１．０に
増殖したとき、スペクチノマイシン（最終濃度３００μ
ｇ／ｍｊりを加え、さらに３７℃で１６時間以上振盪を
続けた。３０００ｒｐｍ １０分間の遠心により集菌し
、リゾチーム−５ＤＳ法とセシウムクロライド−エチジ
ウムブロマイド法（Ｍａｎｉｏｒｔｉｓら： Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｐｐ８６〜９４ Ｃｏ１
ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ （１９８２） ） に
従いプラスミドＤＮＡを調製した。Reference Example 2 Deletion of CYCl34 plasmid DNA to pAcYc1
Escherichia coli pM191 (J, B
acteriol 134, 1141 (1981);A
TC (: 37033) was added to BHI medium (Difc) at 1°C.
(manufactured by o company) was cultured with shaking. When the turbidity increased to oD66° = 1.0, spectinomycin (final concentration 300μ
g/mj was added, and shaking was continued at 37° C. for more than 16 hours. Bacteria were collected by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes, and the cells were collected using the lysozyme-5DS method and the cesium chloride-ethidium bromide method (Maniortis et al.: Mole
cular Cloning pp86-94 Co1
Plasmid DNA was prepared according to Spring Harbor (1982).
参考例３゜
ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｐ 遺伝 をするプラ
スミド０ＸＩ３のイ
（１）参考例１で調製したＡ、ｖｉｒｉｄａｎｓの染色
体ＤＮＡ２μＪｌ （約０．５μｇ）と１００倍量のＥ
ＣＯＲＩ切断用バッファー（５００ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ７，５）、 ７０ ｍＭ ＭｇＣｈ、 Ｉ Ｍ
ＮａＣ１，７０ｍＭメルカプトエタノール） １ ｕｌ
ｌ、 ＥｃｏＲＩ （宝酒造製１０ｕｎｉｔ／ ｐｆＬ
） ｉ ｐｆＬ、水ｆ３μＪｌを混合し、３７℃１時間
切断した。別に調製したプラスミドｐＡｃＹｃ１８４Ｄ
Ｎ Ａ約０．３μｇを同様の方法を用いてＥＣ，ＲＩ
で切断し、さらにアルカリ性フォスファターゼ（以下Ｂ
ＡＰと略すことがある。宝酒造製） ０．６ｕｎｉｔを
加え、６５℃１時間処理した。これらのＥＣＯＲＩで切
断した２種のＤＮＡ溶液を混合し、その１７１０量の３
Ｍ酢酸ナトリウムを加え、さらに全体量と等量のクロロ
ホルム−フェノール混液で処理し、遠心分離により水層
を分取した。この水層に２倍容のエタノールを加え、遠
心でＤＮＡを沈澱させたのち減圧乾燥した。水８９μ文
で溶解後、１００倍量のライゲーションバッファ（０，
５Ｍトリスｍ酸（ｐ）Ｉ７．６）、０．１Ｍ ＭｇＧ１
２．０．１ Ｍジチオスレイトール、１０ｍＭスペルミ
ジン、 １０ｍＭＡＴＰ） １０μにとＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ１μｍ（宝酒造製１７５ ｕｎｉｔ）を加え混合
し４℃で一晩放置した。このＤＮＡ溶液をクロロホルム
−フェノール処理し、エタノール沈澱を集め減圧乾燥し
た後、１０μ℃のＴＥで溶解した。Reference Example 3 A of plasmid 0XI3 carrying pyruvate oxidase (POP gene) (1) 2 μJl (approximately 0.5 μg) of A and viridans chromosomal DNA prepared in Reference Example 1 and 100 times the amount of E
CORI cleavage buffer (500mM Tris-HCl (p
H7,5), 70 mM MgCh, IM
NaCl, 70mM mercaptoethanol) 1 ul
l, EcoRI (10 units/pfL manufactured by Takara Shuzo)
) i pfL and 3 μJl of water were mixed and cut at 37° C. for 1 hour. Separately prepared plasmid pAcYc184D
Approximately 0.3 μg of NA was subjected to EC and RI using the same method.
cleavage with alkaline phosphatase (hereinafter referred to as B
Sometimes abbreviated as AP. 0.6 unit (manufactured by Takara Shuzo) was added and treated at 65°C for 1 hour. These two types of DNA solutions cut with ECORI were mixed, and 1,710 volumes of 3
M sodium acetate was added, and the mixture was further treated with a chloroform-phenol mixture in an amount equal to the total amount, and the aqueous layer was separated by centrifugation. Twice the volume of ethanol was added to this aqueous layer, and the DNA was precipitated by centrifugation, followed by drying under reduced pressure. After dissolving in 89μ of water, add 100 times the volume of ligation buffer (0,
5M Tris m acid (p)I7.6), 0.1M MgG1
2.0.1 M dithiothreitol, 10 mM spermidine, 10 mM ATP) and 1 μm of T4 DNA ligase (175 unit, manufactured by Takara Shuzo) were added and mixed, and the mixture was left at 4° C. overnight. This DNA solution was treated with chloroform-phenol, the ethanol precipitate was collected and dried under reduced pressure, and then dissolved in TE at 10 μC.
（２）１００ｍＡのＢＨＩ培地（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒ
ｔＩｎｆｕｓｉｏｎ、Ｄｉｆｃｏ社製）で培養した対数
増殖期のエシェリヒア・コリＷ３１１０株（国立遺伝学
研究所より分与を受けた、ストック番号Ｍ Ｅ ７７７
８ 。(2) 100 mA BHI medium (Brain Hear
Escherichia coli W3110 strain in the logarithmic growth phase (distributed from the National Institute of Genetics, stock number M E 777) cultured in tInfusion, manufactured by Difco)
8.
ＡＴＣＣ２７３’２５）を遠心分離により集菌しく１０
，０００ｒｐｍ、２分間）４０ｎ＋Ｑの氷冷した３０ｍ
Ｍ酢酸カリウム、１００ ｍＭ Ｒｂ（：ｌ 、 １
０ ｍＭ ＧａＣｌ２．５０ｍＭ ＭｎＣｌ２および１
５％グリセリンを含んだ溶液（ｐＨｓ、ａ）で懸濁した
。０℃で５分間放置後、遠心し上清をすて、さらに４
ｎ＋ＪＺの１０ｍＭＭ０ｐｓ緩衝液（ドータイト社製）
、７５ｍＭＣａＣ１７，１０ｍＭ ＲｂＣ１および１
５％グリセリンを含んだ溶液（ｐＨ６，５）で懸濁し、
０℃で１５分間放置してコンピテント細胞とした。ATCC273'25) was collected by centrifugation10.
,000rpm, 2 minutes) 40n+Q ice-cooled 30m
M potassium acetate, 100 mM Rb (:l, 1
0mM GaCl2.50mM MnCl2 and 1
It was suspended in a solution containing 5% glycerin (pHs, a). After standing at 0℃ for 5 minutes, centrifuge, discard the supernatant, and incubate for another 4 minutes.
n+JZ 10mMMOps buffer (manufactured by Dotite)
, 75mM CaC17, 10mM RbC1 and 1
Suspended in a solution containing 5% glycerin (pH 6.5),
The cells were left at 0°C for 15 minutes to form competent cells.
（３）この大腸菌懸濁液２００μｋに（１）で調製した
ＤＮＡ溶液１０μｍを加え、３０分間０℃で放置した。(3) To 200 μl of this E. coli suspension, 10 μm of the DNA solution prepared in (1) was added and left at 0° C. for 30 minutes.
ＢＨＩ培地１ ｆｆ１ｆＬを加え、３７℃で９０分間
保温後、この１００μ２をテトラサイタリン（１５μｇ
／ｍｌＬ ）を含んだＢＨＩ寒天プレートにまき、３
７℃で一晩培養し形質転換体を得た。この形質転換体を
ＰＯＰ培地（組成はペプトン５ｇ、肉エキス２ｇ、イー
ストエキス５ｇ１Ｎａｉｌ １ ｇＪｉＨＰＯ４１ｇ、
Ｍｇ５Ｏ４ｏ、ｓｇ、パーオキシダーゼ５００ Ｉ Ｕ
、 Ｆ Ａ Ｄ７．８５ｍｇ、ジアニシジン０．１ｇ、
チテミンピロフオスフエートｊ２４Ｂ、ピルビン酸１ｍ
Ｊ２、寒天１５ｇ１蒸溜水ＩＬ、ｐＨ７，０）のプレー
トにレプリカし、３７℃でさらに一晩培養した。Add BHI medium 1ff1fL and incubate at 37°C for 90 minutes, then add 100μ2 of this to tetracytalline (15μg
/ml) on a BHI agar plate containing 3
Transformants were obtained by culturing overnight at 7°C. This transformant was cultured in POP medium (composition: 5 g of peptone, 2 g of meat extract, 5 g of yeast extract, 1 g of Nail, 41 g of JiHPO,
Mg5O4o, sg, peroxidase 500 IU
, F A D 7.85 mg, dianisidine 0.1 g,
titemin pyrophosphate j24b, pyruvic acid 1m
J2, 15 g of agar, 1 IL of distilled water, pH 7.0) was replicated onto a plate, and further cultured overnight at 37°C.
約４５００コロニーの形質転換体を調べたところ、コロ
ニーの周辺が茶褐色に変色したもの１株を得、この株を
エシェリヒア・コリＷ ３１１０φｐｏｘ＋３株「微生
物受託番号 徹工研条寄第１５６５号、ＦＥＲＭ ＢＰ
−１５６５Ｊと命名した。この菌を純粋分離後Ｂ）ＩＩ
培地で３７℃−晩培養し、ピルビン酸オキシダーゼの生
産性を後述するピルビン酸オキシダーゼ活性測定法によ
り調べたところ、約３ｕ／ｍｕのピルビン酸オキシダー
ゼ活性を有していた。When about 4,500 colonies of transformants were examined, one strain was obtained with a brownish color around the colony, and this strain was designated as Escherichia coli W 3110φpox+3 strain ``Microbial accession number Tetsukoken Joyori No. 1565, FERM BP''.
It was named -1565J. After pure isolation of this bacterium B) II
The cells were cultured overnight at 37° C. in a medium, and the productivity of pyruvate oxidase was examined by the pyruvate oxidase activity measurement method described below. As a result, the pyruvate oxidase activity was about 3 u/mu.
この菌株の保育していたプラスミドを参考例２と同様に
してプラスミドを分離し、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝
子を含み、ｐＡｃＹｃ１８４遺伝子を含むプラスミドを
ｐＯＸＩ３ と命名した。A plasmid was isolated from the plasmid harboring this strain in the same manner as in Reference Example 2, and the plasmid containing the pyruvate oxidase gene and the pAcYc184 gene was named pOXI3.
（４）ピルビン酸オキシダーゼ活性測定法本発明におけ
るピルビン酸オキシダーゼの活性測定法は次の通りであ
る。(4) Method for measuring pyruvate oxidase activity The method for measuring the activity of pyruvate oxidase in the present invention is as follows.
０．５Ｍピルビン酸カリウム ０．１ ｍＪ：
１０１５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐ）Ｉ ７．０） ０
．２ ｍｊ２０．２％４−アミノアンチピリン ０．
ＩＩＩＩＩＬＯ０２％Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン ０．
２ ｒｎｆＬｌ ０ｍＭ ＭｇＣｌ２５０μρ
１０ｍＭチアミノピロフォスフェート
２０ μ ℃ペルオキシダーゼ（４５ｕ／
ｍＩＬ） ０．１ ｍｌ！１ｍＭＦＡＤ
１０
μ Ｊｌｌ蒸水水 ０．２２
ｍｊｌ上記の組成の反応液１．０ｍｊ！を試験管に分
取し、３７℃、３分間予備加温した後、酵素液２０μｋ
を加えて３７℃、１０分間反応を行い、反応後、０．３
ｍＪ！の０．１ Ｍ ＥＤＴＡ （ｐＨ７，５）を加
えて反応を停止し、次いでこれに蒸溜水１．７ｍＩＬを
加えた後生じた紫色を５６５ｎｍの波長にて比色定量す
る。１分間に１μｍｏｌｅの過酸化水素を生じる活性を
１単位（Ｕ）とした。0.5M potassium pyruvate 0.1 mJ:
1015M phosphate buffer (p)I 7.0) 0
．． 2 mj20.2% 4-aminoantipyrine 0.
IIILO02%N,N-dimethylaniline 0.
2 rnfLl 0mM MgCl250μρ 10mM Thiaminopyrophosphate
20μ℃ peroxidase (45u/
mIL) 0.1 ml! 1mM FAD
10
μ Jll steam water 0.22
mjl Reaction solution with the above composition 1.0mj! Aliquot the enzyme solution into a test tube, prewarm it at 37℃ for 3 minutes, and add 20 μk of the enzyme solution.
was added and reacted at 37°C for 10 minutes. After the reaction, 0.3
mJ! The reaction is stopped by adding 0.1 M EDTA (pH 7.5) and then 1.7 mL of distilled water is added thereto, and the resulting purple color is determined colorimetrically at a wavelength of 565 nm. The activity of producing 1 μmole of hydrogen peroxide per minute was defined as 1 unit (U).
実施例１
ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を含んだプラスミドｐＯ
ＸＩ３を保有している大腸菌Ｗ ３１１０（寄託番号微
工研条寄第１５６５号）から次の方法でｐＯＸＩ３プラ
スミドＤＮＡを調製した。大腸菌Ｗ３１１０ ｐＯＸＩ
３を１４１（７）ＢＨＩ培地（Ｄｉｆｃ。Example 1 Plasmid pO containing pyruvate oxidase gene
pOXI3 plasmid DNA was prepared from Escherichia coli W 3110 harboring XI3 (deposit number: Kaikokenjo 1565) by the following method. E. coli W3110 pOXI
3 in 141(7) BHI medium (Difc.
社製）で振盪培ｆｉ（３７℃）した、濁度がＯＤ、６゜
＝１．０に増殖したときクロラムフェニコール（最終濃
度１５０μｇ／ｍｊＮを加え、さらに３７℃で１６時間
振盪を続けた。 ３０００回転１０分間の遠心により集
菌し、４０ｍＪＺの１０％サッカロースを含んだ５０ｍ
Ｍトリス緩衝液（ｐｌ（８，０）で懸濁した。次に８
ｍＡの０．５ＭＥＤＴＡ （ｐｌ ａ、ｏ）と１
ｍｕのリゾチーム水溶液（２０ｍｇ／＋ｎＪ２ ）を加
えて３７℃１０分間保温した。４ ｍｕの１０％ＳＤ
Ｓ （ドデシル硫酸ナトリウム）溶液を加え混合したの
ち、６ ｍｌｌの５Ｍ酢酸カリウムを加えて混合後０
℃３０分間放置した。３０，０００回転３０分間の遠心
上清に、それと等量のＴＥ（１０ｍＭトリスｌｉ１′ａ
液（ｐ）Ｉ８．０） １ ｍ ＭＥＤＴＡ ）飽和フェ
ノールを加えて３０分間室温で混合攪拌した。１０，０
００ｒｐｍ ５分間の遠心で水層とフェノール層を分け
、水層を分取した。この水層２倍量のエタノールを加え
一２０℃で３０分間放置後６，０００回転１０分間の遠
心で沈澱を集めた。減圧乾燥後６ＩＩＩＪＺのＴＥで溶
解し、ＲＮａｓｅ （ファルマシア製）を最終濃度１
００μｇ／ｍｆＬとなるように加え３７℃３０分間放置
した。等量のクロロホルム、フェノールを加え混合攪拌
したのち１０，０００ｒｐｍ １０分間の遠心により水
層を分取した。この水層に２倍量のエタノールを加え、
−２０℃３０分放置後１０．０００ｒｐｍ １０分間の
遠心で沈澱を集めた。減圧乾燥後１９ｍｌ１のＴＨに溶
解し、２０ｇのＣｓＣ１，２ｍｌＬのエチジウムプロミ
ド（ｔｏｍｇ／ｍＪＺ）を加えて溶解混合したのち５０
．ＯＯＯｒｐｍ１６時間の遠心を行りた。When the turbidity reached OD, 6° = 1.0, chloramphenicol (final concentration 150 μg/mjN) was added, and shaking was continued for 16 hours at 37°C. Bacteria were collected by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes, and 50 mJZ containing 10% sucrose was collected.
Suspended in M Tris buffer (pl(8,0). Then 8
mA of 0.5 MEDTA (pl a, o) and 1
A lysozyme aqueous solution (20 mg/+nJ2) of mu was added and kept at 37°C for 10 minutes. 10% SD of 4 mu
After adding S (sodium dodecyl sulfate) solution and mixing, add 6 ml of 5M potassium acetate and mix.
It was left to stand at ℃ for 30 minutes. Centrifuge the supernatant at 30,000 rpm for 30 minutes and add an equal amount of TE (10mM Trisli1'a) to the supernatant.
Liquid (p)I 8.0) 1 m MEDTA) Saturated phenol was added, and the mixture was mixed and stirred at room temperature for 30 minutes. 10,0
The aqueous layer and phenol layer were separated by centrifugation at 00 rpm for 5 minutes, and the aqueous layer was fractionated. Twice the volume of ethanol was added to this aqueous layer, and the mixture was allowed to stand at -20°C for 30 minutes, and then centrifuged at 6,000 rpm for 10 minutes to collect the precipitate. After drying under reduced pressure, dissolve in 6IIIJZ TE and add RNase (manufactured by Pharmacia) to a final concentration of 1.
00 μg/mfL and left at 37° C. for 30 minutes. After adding equal amounts of chloroform and phenol and stirring, the aqueous layer was separated by centrifugation at 10,000 rpm for 10 minutes. Add twice the amount of ethanol to this aqueous layer,
After being left at -20°C for 30 minutes, the precipitate was collected by centrifugation at 10,000 rpm for 10 minutes. After drying under reduced pressure, it was dissolved in 19 ml of TH, and 20 g of CsCl and 2 ml of ethidium bromide (tomg/mJZ) were added thereto and mixed.
．． Centrifugation was performed at OOOrpm for 16 hours.
遠心後生じたプラスミドＤＮＡのバンドを分取し、等量
のブタノール処理を５回繰り返した。The plasmid DNA band generated after centrifugation was separated and treated with an equal amount of butanol 5 times.
このＤＮＡ液約１．５ ｍｌＬをセルロースチューブ
に移し、ＩＬのＴＥに対して一晩透析を行い、得られた
ものをｐＯＸＩ３ Ｄ Ｎ Ａ液（約１．０Ｍｇ／μ℃
）とした。Approximately 1.5 ml of this DNA solution was transferred to a cellulose tube and dialyzed overnight against TE of IL.
).
；： ノｐＯＸＩ３ Ｄ Ｎ Ａ ２ ｕ ｇ ニ１０
倍量度Ｍ緩衝液（Ｍａｎｉａｔｉｓら：Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ｐｐ１０４．ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８２） ） １ ｕ １１
、制限酵素ＤｒａＩ６ｕ（宝酒造製）と水を加えて全量
１０μ℃とし、３７℃１時間切断した。切断後１．５％
アガロースゲルを用いて電気泳動し、一番小古いＤＮＡ
断片（約２００塩基対）を含む部分の寒天を切り出し電
気泳動溶出法でＤＮＡを溶出し、２回のフェノール処理
によって精製ＤＮＡ断片溶液を得た。このＤＮＡ断片の
塩基配列をＭ１３ファージを用いたジデオキシ法（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２１４．１２０５〜１２１０（１９８２）
）を用いて決定し、その結果を以下に示した。;: NopOXI3 D N A 2 u g Ni10
Double volume M buffer (Maniatis et al.: Molecule
ar Cloning, pp104. ColdSpri
ng Harbor (1982) ) 1 u 11
, restriction enzyme DraI6u (manufactured by Takara Shuzo) and water were added to bring the total volume to 10 μC, and the mixture was digested at 37C for 1 hour. 1.5% after cutting
Electrophoresed using agarose gel, the oldest DNA
A portion of the agar containing the fragment (approximately 200 base pairs) was cut out, the DNA was eluted by electrophoresis, and a purified DNA fragment solution was obtained by treating with phenol twice. The base sequence of this DNA fragment was determined using the dideoxy method (Sc
ience 214.1205-1210 (1982)
), and the results are shown below.
ＡＡＡＡＧＴＴＣＴＴ”ＧＡＴＴＴＡＴＡＡＧ”ＧＧＴ
ＴＴＣＴＧＧＡ”ＣＴＴＣＴＴＡＣＴＧ”ＴへＣＴＡＧ
ＴＡＣＡ”ＡＴＴＴＣＧＣＣ［；Ｃ”ＴＴＧＴＡＣ（：
ＡＴＴ”ＴＴＴＣＴＧＡＴＡＣ”ＡＧＡＡＡＣＡＡＴＡ
”ＴＴＧＴＡＣＴＧＡＡ１０’ＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴ’
”ＴＴＴＴＧＧｆｌ：ＴＡＡ１２’ＴＴＡＴＧＧＡＣ
ＣＴ”’ｌ；ＡＣＡＡ八ＧＧＡＴ”へＡＴＴＴＧＴＧＧ
ＣＡ”’＾ＴＴＣＡＴＴＧＧ八１６０ＡＴＡＡＧへＴＧ
ＴＴ”’ＴＴＡ八ＧＴへＣＴ八１８へＴＴＡＴＴＴＣ＾
＾Ｔ”’ＴＧＴＧＡＴＡＴＴＴ”’Ｔ
実施例２
ベクターにＮ １７の作成
プラスミドＩ）ＩＪ（：１２ （ファルマシア製）Ｄ
ＮＡ０．５Ｍｇを制限酵素Ｓａｌ Ｉ （宝酒造１２ｕ
／μｍ）で切断し、フェノール処理後、エタノール沈澱
によりＤＮＡを回収し、減圧乾固した。このＤＮＡをＴ
Ｅ（１０ｍＭｌ−リス塩酸（ｐＨａ、ｏ）、１ ｍＭ
ＥＤＴＡ （エチレンジアミン四酢酸））１０μぶで
溶解し、１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８，０）２ ｕ Ｒ，０
，１Ｍ ＭｇＣｈ、２．４μＩＩ 、 Ｉ Ｍ Ｎａ
Ｃｌ２μｊｌ、０．３Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）
０．８ ｕ １１ 、５ ｍＭ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、
ｄｃＴＰ、ＴＴＰの等全混合物） ２ ｐ ＩＩ 、
３ ｕｎｉｔの７４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）と
水を加え全量５０μ℃とした。AAAAGTTCTT”GATTTATAAG”GGT
TTCTGGA"CTTCTTACTG"CTAG to T
TACA”ATTTCGCC[;C”TTGTAC(:
ATT”TTTCTGATAC”AGAAACAATA
"TTGTACTGAA10'AAAAGGGTAT'
”TTTTGGfl:TAA12'TTATGGAC
CT”'l;ACAA8GGAT”ATTTTGTGG
CA”'^TTCATTGG 8160 ATAAG to TG
TT"'TTA 8 GT to CT 8 18 TTATTTC^
^T"'TGTGATATTT"'T Example 2 Creation of N17 in the vector Plasmid I) IJ(:12 (manufactured by Pharmacia) D
NA0.5Mg and restriction enzyme Sal I (Takara Shuzo 12u
/μm), and after treatment with phenol, the DNA was recovered by ethanol precipitation and dried under reduced pressure. This DNA is T
E (10mM l-Lis-HCl (pHa, o), 1mM
Dissolve in 10μ of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) and 2μR,0 of 1M Tris-HCl (pH 8.0).
, 1M MgCh, 2.4 μII, IM Na
Cl2μjl, 0.3M dithiothreitol (DTT)
0.8 u 11 , 5 mM (dATP, dGTP,
(equal total mixture of dcTP, TTP) 2 p II,
3 units of 74 DNA polymerase (Takara Shuzo) and water were added to bring the total volume to 50 μC.
３７℃１０分間の反応後、１Ｍトリス塩酸５μＬ、水４
０μｍ、アルカリ性ホスファターゼ（宝酒造０．３８ｕ
／μＪ２ ） ５ ｕ ＩＩを加え、６５℃で１時間反
応させた。２回のフェノール処理の後エタノール沈澱に
よりＤＮＡを回収し、減圧乾燥後ＴＥＩＯμ℃に溶解し
た。以上のようにして調製したｐＵｃ１２ Ｄ Ｎ Ａ
液にピルビン酸オキシダーゼのプロモーター領域を含ん
だＤＮＡ断片０．０１ｇｇと１０倍のライゲーションバ
ッファ（０，５Ｍ トリス塩酸（ｐＨ７，４） 、０．
ＩＭ ＭｇＣｌ２゜０．１Ｍ ＤＴＴ、１０＋ｎＭス
ペルミジン、１０ｍＭＡＴＰ）１０μｌｌと２．８ｕの
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造２．８ｕ／μｍ）、水を加
えて全量を１００μλとして、４℃で一晩放置した。フ
ェノール処理、エタノール沈澱、減圧乾燥後１０μ℃の
ＴＥに溶解した。このＤＮＡ溶液を用いて塩化カルシウ
ム法でコンピテント化した大腸菌ＤＨＩを形質転換し、
アンピシリン耐性（５０ｇｇ／ｍｕ）を指標にして形質
転換体を選択した。得られた形質転換体からプラスミド
ＤＮＡを小スケールで分離しく前述Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃ１ｏｎｉｎｇ ｐｐ３６８〜３８９）まずＥＣＯＲＩ
とＨｉ ｎ ｄ ＩＩＩ （いずれも宝酒造）の二つの
制限酵素で切断し１．５％のアガロースゲル電気泳動で
約２４０塩基対のＤＮＡ断片を生ずるものを選んだ。次
に制限酵素Ａ□ＩＩで切断し、図１で示した塩基配列が
Ｘｂａ Ｉ切断部位の前に組込まれているクローンを選
びｐＫＮ１７ と命名した。このｐＫＮ１７を保有する
大腸菌Ｄ）ＩＩから通常の方法（前述）でｐＫＮ１７プ
ラスミドＩ）ＮＡを調製した。After reaction for 10 minutes at 37°C, add 5 μL of 1M Tris-HCl and 4 mL of water.
0μm, alkaline phosphatase (Takara Shuzo 0.38u
/μJ2) 5 u II was added and reacted at 65°C for 1 hour. After two phenol treatments, the DNA was recovered by ethanol precipitation, dried under reduced pressure, and then dissolved in TEIOμ°C. pUc12 DNA prepared as above
A solution containing 0.01 gg of a DNA fragment containing the promoter region of pyruvate oxidase, 10x ligation buffer (0.5M Tris-HCl (pH 7,4), 0.01g of DNA fragment containing the pyruvate oxidase promoter region,
IM MgCl2゜0.1M DTT, 10+nM spermidine, 10mM ATP), 2.8u of T4 DNA ligase (Takara Shuzo 2.8u/μm), and water were added to bring the total volume to 100μλ, and the mixture was left overnight at 4°C. After phenol treatment, ethanol precipitation, and drying under reduced pressure, it was dissolved in TE at 10 μC. This DNA solution was used to transform E. coli DHI, which had been made competent by the calcium chloride method.
Transformants were selected using ampicillin resistance (50 gg/mu) as an indicator. To isolate plasmid DNA from the obtained transformants on a small scale, we used the Molecular
C1oning pp368-389) First, ECORI
and Hin d III (both Takara Shuzo), and those that yielded DNA fragments of about 240 base pairs by 1.5% agarose gel electrophoresis were selected. Next, it was digested with restriction enzyme A□II, and a clone in which the base sequence shown in FIG. 1 was integrated before the Xba I cleavage site was selected and named pKN17. pKN17 plasmid I)NA was prepared from E. coli D)II harboring this pKN17 by the usual method (described above).
実施例３
ｈ−ｓｏＯプラスミドＳＯ［１１２０の作プラスミドｐ
ＫＮ１７のＤＮＡ約０．５ μｇをＸｂａＩとＢａｍＨ
Ｉの二つの制限酵素（いずれも宝酒造）で切断後前述の
如くアルカリ性ホスファターゼで処理した。これとは別
にｐＯＸＩ３ と同様の方法で調製したｐｓＯＤ１４
（特開昭８２−１３０８８４）ＤＮＡＩＭｇを同様に、
Ｘｂａ ＩとＢａｍＨＩの二つの制限酵素で切断し、生
じた約６００塩基対のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気
泳動（０，７％）により分離調製した。Example 3 Production of h-soO plasmid SO[1120 plasmid p
Approximately 0.5 μg of KN17 DNA was mixed with XbaI and BamH.
After cleavage with two restriction enzymes (both Takara Shuzo) of I, it was treated with alkaline phosphatase as described above. Separately, psOD14 was prepared in the same manner as pOXI3.
(JP 82-130884) Similarly, DNAIMg
The DNA fragment was cleaved with two restriction enzymes, Xba I and Bam HI, and the resulting DNA fragment of about 600 base pairs was separated and prepared by agarose gel electrophoresis (0.7%).
この２つのＤＮＡを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒
造、２．８ｕ／μｆｌ）で結合した。このＤＮＡを用い
て通常の塩化カルシウム法でコンピテント化した大腸菌
ＤＨＩを形質転換し、アンピシリン耐性を指標にして形
質転換体を得た。このようにして得られた形質転換体に
ついて前述と同様に、小スケールでプラスミドＤＮＡを
分離後Ｘｂａ ＩとＢａｍＨＩの二つの制限酵素で切断
した。切断後ｏ、７％のアガロースゲル （電気泳動で
約６００塩基対のＤＮＡ断片を生ずるものをｐｓＯＤ１
２０と命名した。These two DNAs were mixed and ligated using T4 DNA ligase (Takara Shuzo, 2.8u/μfl). This DNA was used to transform E. coli DHI, which had been rendered competent, by the usual calcium chloride method, and transformants were obtained using ampicillin resistance as an indicator. The plasmid DNA of the thus obtained transformant was isolated on a small scale and then digested with two restriction enzymes, Xba I and Bam HI, in the same manner as described above. After cutting, use a 7% agarose gel (electrophoresis produces DNA fragments of about 600 base pairs).
It was named 20.
実施例４
遺伝子の発現
（１） ｐｓＯＤ１２０を保有する大腸菌ＤＨＩのＢＨ
Ｉ培地（５０ｇ／ｍｕアンビシリ・ン含有）による菌培
養液１ ｍｆｌより、菌体を遠心分離にて集め、上澄
液を除いた後、この菌体に１１１１Ｍ ＣｕＳＯ４，１
ｍＭ１ｎｓＯ４，５０ｍＭサッカロースを含む５０ｍＭ
）−リスー塩酸バッフｙ （ｐＨ７，６） １ ｍ
ｊ２を加えた。水冷下にて、５分間超音波処理（トミー
社製、Ｈａｎｄｙ ５ｏｎｉｃ ０Ｒ−２０Ｐ使用）を
行い、菌体を破砕した。Example 4 Gene expression (1) BH of E. coli DHI harboring psOD120
Bacterial cells were collected by centrifugation from 1 mfl of a bacterial culture using I medium (containing 50 g/mu ambicillin), the supernatant was removed, and 1111M CuSO4,1 was added to the cells.
50mM with 1nsO4, 50mM sucrose
)-Li-hydrochloric acid buffer y (pH 7,6) 1 m
Added j2. Under water cooling, ultrasonication was performed for 5 minutes (using Handy 5onic 0R-20P manufactured by Tomy) to disrupt the bacterial cells.
ｈ−５ＯＤに対する抗体を用いたＥＩＡによる測定の結
果、ｐｓＯＤ１２０を保持した大腸菌ＤＨＩはＢＨＩ培
地−晩培養で８０ｇｇ／ｍｉ（培養液）のｈ−５ＯＤを
産生じた。As a result of measurement by EIA using an antibody against h-5OD, Escherichia coli DHI retaining psOD120 produced h-5OD at 80 gg/mi (culture solution) in late culture in BHI medium.
２） ｐｓｏｔ＋ １２０を発現させた、大腸菌体２０
０ｇをｌ ＨＩ ＣｕＳＯ４，１ｍＭ ＺｎＳＯ４，５
０ｍＭサッカロースを含むトリス塩酸バッファーｐＨ’
７．６．６００ｍＡに懸濁した後、セルデイスラブター
９００（Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ ９００；Ｂｒ
ａｎｓｏｎ社製）で３０分間超音波処理を行って、細胞
を破砕した。破砕液に６００ｍＪ！のクロロホルム−エ
タノール混液（３： ５）を加え、４℃で１５分間攪拌
し、遠心分離にて、沈澱物を除いた。上澄液に３００ｇ
のに２）ＩＰＯ４を溶かし、生じたエタノール層（５０
０ｍｆｔ）を−２０℃で３０分間冷却し、析出した沈澱
物を遠心分離にて除き、上澄液をエバポレーターにて減
圧濃縮した。得られた凝縮液３００ｍＩＬは５０ｍＭサ
ッカロース、２５ｍＭリン酸バッファーｐＨ７，８で平
衡化したセファデックスＧ−２５ゲル（ファルマシア社
製）カラム（４，５ｘ ６０ ｃｍ）を用いたゲル口過
により同バッファーに置換した。これにＤＥ５２（ワッ
トマン社製）１０ｇを加え、４℃で３０分間攪拌し、不
純物を吸着させ、グラスフィルターでン戸別した。ン戸
液は５０ｍＭサッカロースを含む２．５ ｍＭリン酸バ
ッフｙ −（ｐＨ６，５）に対し透析を行った後、同バ
ッファーで平衡化したＤＥＡＥ−セファローズＣＬ−６
Ｂ （ファルマシア社製）カラム（１，６ｘ ２０ ｃ
ｍ）を通過させ、ｈ７ｓｏｏを吸着させた。カラムを同
バッファーで洗浄した後、リン酸バッファー濃度を２．
５ ｍＭから５０ｍＭまで直線的に上昇させてｈ−５０
０を溶出させた。ＳＯＤ活性は、はぼ１つのピークとし
て溶出された為、このピークを集め、凍結乾燥した。得
られた凍結乾燥粉末を、１０ｍｊ！の蒸溜水に溶解し、
５０ｍＭサッカロースを含む１０ｍＭトリス塩酸バッフ
ァーｐＨ７，０で平衡化したセファデックスＧ−１００
（ファルマシア社製）カラム（４，５ｘ ８０ ｃｍ）
に流入させ、ゲル口過精製を行った。以上の手法により
得られたｈ−５００は変量としては約２．５ｇで、５０
Ｄ１ｍ１ｇあたり３０００〜３５００ｕｎｉｔで、電気
泳動的に阜−バンドを示し、前記したペプチド配列であ
ることを確認した。2) Escherichia coli cells 20 expressing psot+ 120
0g l HI CuSO4, 1mM ZnSO4,5
Tris-HCl buffer pH' containing 0mM saccharose
7. After suspending at 600 mA, use Cell Disruptor 900 (Br
The cells were disrupted by ultrasonication for 30 minutes using an ultrasonic technology (manufactured by Anson). 600mJ for crushing fluid! A chloroform-ethanol mixture (3:5) was added thereto, stirred at 4°C for 15 minutes, and the precipitate was removed by centrifugation. 300g in supernatant liquid
2) Dissolve IPO4 and remove the resulting ethanol layer (50
0 mft) was cooled at -20°C for 30 minutes, the precipitate was removed by centrifugation, and the supernatant was concentrated under reduced pressure using an evaporator. 300 mL of the obtained condensate was filtered into the same buffer by gel filtration using a Sephadex G-25 gel (manufactured by Pharmacia) column (4.5 x 60 cm) equilibrated with 50 mM saccharose and 25 mM phosphate buffer pH 7.8. Replaced. To this was added 10 g of DE52 (manufactured by Whatman), stirred at 4° C. for 30 minutes to adsorb impurities, and filtered through a glass filter. The solution was dialyzed against 2.5mM phosphate buffer (pH 6,5) containing 50mM saccharose, followed by DEAE-Sepharose CL-6 equilibrated with the same buffer.
B (manufactured by Pharmacia) column (1,6x 20 c
m) to adsorb h7soo. After washing the column with the same buffer, the phosphate buffer concentration was adjusted to 2.
Increase linearly from 5 mM to 50 mM for h-50
0 was eluted. Since SOD activity was eluted as just one peak, this peak was collected and lyophilized. The obtained freeze-dried powder is 10mj! dissolved in distilled water,
Sephadex G-100 equilibrated with 10mM Tris-HCl buffer pH 7.0 containing 50mM saccharose
(manufactured by Pharmacia) Column (4.5 x 80 cm)
and gel filtration purification was performed. h-500 obtained by the above method has a variable weight of about 2.5g and 50g.
An electrophoretic band was observed at 3000 to 3500 units per ml of D1, confirming the above-described peptide sequence.
本発明プロモーターは、強力なプロモーター活性を有す
るだけでなく、多くの制限酵素認識部位をも有する剋め
、種々の蛋白遺伝子のプロモーターとして有用である。The promoter of the present invention not only has strong promoter activity but also has many restriction enzyme recognition sites, and is useful as a promoter for various protein genes.
特に、本発明プロモーターの下流にスーパーオキシドジ
スムターゼ遺伝子を結合させたベクターは、極めて高率
で該遺伝子を発現し、該ベクターを保持する形質転換体
は優れたスーパーオキシドジスムターゼ産生能を示す。In particular, a vector in which a superoxide dismutase gene is linked downstream of the promoter of the present invention expresses the gene at an extremely high rate, and a transformant carrying the vector exhibits an excellent ability to produce superoxide dismutase.
図１はプラスミドｐｓＯＤ１２０を得るための組換え工
程の概略図を示す。
以 上
り ０
手続補正書（自発）
昭和６３年１２月１２日
１、 事件の表示
昭和６２年 脣 許 願第３０１４５７ 号２、発
明の名称
新規なプロモーターおよびそれを用いる外来蛋白の高発
現製造法
３、 補正をする者
事件との関係 出願人
住 所
名 称 東洋醸造株式会社
４、代理人
ａ 補正の対象
明則誉の「発明の詳細な説明」の欄
７、補正の自答
（１） 明細畜第２３頁、最下行
［ａｕｂｔｉｌｌｉｇ Ｊとろるを
［ａｕｂｔｉｌｉｓ Ｊと訂正する。
（２） 同第３０頁、ｉ４９行
「ＰＯＸＩ ３ ｊとめるを
［ｐＯＸＩ３Ｊと訂正する。
（３） 同第３０頁、第１１行
「切断したｐ ＵＣ１２に？リメラーゼを」とろろを
「切断した後Ｔ４ＤＮＡ＆リメラーゼ処理をしたｐＵｃ
１２にリガーゼを」と訂正する。
（４） 同第３６頁、第１２行
「＃液を加えた、」とめるを
「溶液を加えた。」と訂正する。
（５） 同第３６頁、第１５行
「水層を台数」とめる
「水層を分取」と訂正する。
（６）同第４２頁、第１９〜２０行
［クロ２ムフエニコール（最終濃度１５０μｆ／ｍｊ）
Ｊとめるを１
「スペクチノマイシン（最終濃度３００μｒ／ｌｌ１ｔ
）Ｊと訂正する。
（７） 同第４３頁、第１５行
「この水層２倍量」とある′ｆｔ。
「この水層に２倍量」と訂正する。
（８） 同第４４頁、第１８行
［Ｄｒａ Ｉ ６ｕ Ｊとあるを
「Ｄｒａｌ ６ｕ Ｊと訂正する。
（９）同第４７頁、第９行〜１０行および第４８頁、第
１行
「大腸１１ＤＨＩＪとあるを
［大腸菌ＤＨＩＪと訂正する。
住ｌ 同第４８頁、第１０行
「Ｘｂａ Ｉ ｊとろるを
「ＸｂａＩ Ｊと訂正する。
αυ 同第４９頁、第１０行
ｒ５０ｔ／１ｎｔＪとめるを
「５０μｔ／−」と訂正する。Figure 1 shows a schematic diagram of the recombination process to obtain plasmid psOD120. End of 0 Procedural amendment (voluntary) December 12, 1988 1. Indication of the case 1988 Patent Application No. 301457 2. Name of the invention Novel promoter and method for producing high expression of foreign protein using the same 3 , Relationship with the case of the person making the amendment Applicant Address Name Toyo Jozo Co., Ltd. 4, Agent A Column 7 of "Detailed Description of the Invention" of Akinori Homare, the subject of the amendment Self-answer to the amendment (1) Particulars Page 23, bottom line [aubtillig J troll is corrected as [aubtilis J]. (2) On page 30 of the same, line i49, "POXI 3 j stop is corrected to [pOXI3J." (3) On page 30, line 11 of the same, "Add limerase to p UC12 after cutting?" pUc treated with limerase
12 with ligase,” he corrected. (4) On page 36 of the same page, line 12, the stop “#The solution was added” is corrected to “The solution was added.” (5) On page 36 of the same page, line 15 is corrected to ``separate the aqueous layer'' instead of ``the number of units for the aqueous layer''. (6) Same page 42, lines 19-20 [Chro2mufenicol (final concentration 150 μf/mj)
1 Spectinomycin (final concentration 300μr/llt)
) Correct it as J. (7) 'ft, page 43, line 15, "double the amount of this water layer." Correct it to "double the amount in this water layer." (8) Page 44, line 18 [Dra I 6u J is corrected as ``Dral 6u J.'' (9) Page 47, lines 9 to 10 and page 48, line 1, ``Dral 6u J.'' Large intestine 11 DHIJ should be corrected as Escherichia coli DHIJ. shu l Same page 48, line 10 "Xba I j Tororu should be corrected as "XbaI J. αυ Same page 49, line 10 r50t/1ntJ should be stopped. Correct it to "50μt/-".
Claims (1)
プロモーターを含有するデオキシリボヌクレオチド配列
。 ２、プロモーターが、少なくとも下記塩基配列【遺伝子
配列があります】 〔式中、Ａはアデニン、Ｔはチミン、Ｇはグアニンであ
り、ＸはＡ、Ｔ、ＧおよびＣ（ここでＣはシトシンであ
る）からなる１６〜２１ｂｐを示す〕 を有するものである特許請求の範囲第１項記載のデオキ
シリボヌクレオチド配列。 ３、ＸがＡ、Ｔ、ＧおよびＣからなる１７ｂｐである特
許請求の範囲第２項記載のデオキシリボヌクレオチド配
列。 ４、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣからなる１７ｂｐであるＸが、
６０〜７５％のＡおよびＴを含有するデオキシリボヌク
レオチド配列である特許請求の範囲第３項記載のデオキ
シリボヌクレオチド配列。 ５、プロモーターが少なくとも下記塩基配列【遺伝子配
列があります】 を有するものである特許請求の範囲第１項記載のデオキ
シリボヌクレオチド配列。 ６、プロモーターが少なくとも下記塩基配列【遺伝子配
列があります】を有し、かつ 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】 〔式中、Ｘ＿２、Ｘ＿３、Ｘ＿４、Ｘ＿５、Ｘ＿６、Ｘ
＿７、Ｘ＿８、およびＸ＿９は同一または異なってＡ、
Ｔ、ＧおよびＣからなる１６〜２１ｂｐを示す〕 からなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基配列
を有するものである特許請求の範囲第１項記載のデオキ
シリボヌクレオチド配列。 ７、プロモーターが、６０〜７５％のＡおよびＴを含有
するものである特許請求の範囲第６項記載のデオキシリ
ボヌクレオチド配列。 ８、塩基配列が、５′末端側より式 【遺伝子配列があります】 である特許請求の範囲第１項記載のデオキシリボヌクレ
オチド配列。 ９、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子発現を支配している
プロモーターを含有するデオキシリボヌクレオチド配列
の下流に外来蛋白遺伝子を結合した発現ベクター。 １０、プロモーターが、少なくとも下記塩基配列【遺伝
子配列があります】 〔式中、Ａはアデニン、Ｔはチミン、Ｇはグアニンであ
り、ＸはＡ、Ｔ、ＧおよびＣ（ここでＣはシトシンであ
る）からなる１６〜２１ｂｐを示す〕 を有するものである特許請求の範囲第９項記載の発現ベ
クター。 １１、Ｘが、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣからなる１７ｂｐであ
る特許請求の範囲第１０項記載の発現ベクター。 １２、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣからなる１７ｂｐであるＸが
、６０〜７５％のＡおよびＴを含有するデオキシリボヌ
クレオチド配列である特許請求の範囲第１０項記載の発
現ベクター。 １３、プロモーターが少なくとも下記塩基配列【遺伝子
配列があります】 を有するものである特許請求の範囲第９項記載の発現ベ
クター。 １４、プロモーターが少なくとも下記塩基配列【遺伝子
配列があります】を有し、かつ 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】 〔式中、Ｘ＿２、Ｘ＿３、Ｘ＿４、Ｘ＿５、Ｘ＿６、Ｘ
＿７、Ｘ＿８、およびＸ＿９は同一または異なってＡ、
Ｔ、ＧおよびＣからなる１６〜２１ｂｐを示す〕 からなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基配列
を有するものである特許請求の範囲第９項記載の発現ベ
クター。 １５、プロモーターが、６０〜７５％のＡおよびＴを含
有するものである特許請求の範囲第１４項記載の発現ベ
クター。 １６、プロモーターの塩基配列が、５′末端側より式 【遺伝子配列があります】 である特許請求の範囲第９項記載の発現ベクター。 １７、外来蛋白遺伝子が、ペプチド遺伝子または蛋白質
遺伝子である特許請求の範囲第９項記載の発現ベクター
。 １８、ペプチド遺伝子または蛋白質遺伝子が、スーパー
オキシドジスムターゼ、インターフェロン、インターロ
イキン、ツモアー・ネフローシス・ファクター、インス
リン、カルシトニン、ソマトスタチン、セクレチン、プ
ラスミノーゲン・アクチベーター、ウロキナーゼ、グロ
スホルモン、エンドルフィン、ウィルス蛋白またはその
ムテインをコードする遺伝子である特許請求の範囲第１
７項記載の発現ベクター。 １９、ｐＫＮ１７プラスミドである特許請求の範囲第９
項記載の発現ベクター。 ２０、ｐＳＯＤ１２０プラスミドである特許請求の範囲
第９項記載の発現ベクター。 ２１、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子発現を支配してい
るプロモーターを含有するデオキシリボヌクレオチド配
列の下流に外来蛋白遺伝子を結合したデオキシリボヌク
レオチド配列を保持した形質転換体。 ２２、プロモーターが、少なくとも下記塩基配列【遺伝
子配列があります】 〔式中、Ａはアデニン、Ｔはチミン、Ｇはグアニンであ
り、ＸはＡ、Ｔ、ＧおよびＣ（ここでＣはシトシンであ
る）からなる１６〜２１ｂｐを示す〕 を有するものである特許請求の範囲第２１項記載の形質
転換体。 ２３、Ｘが、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣからなる１７ｂｐであ
る特許請求の範囲第２２項記載の形質転換体。 ２４、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣからなる１７ｂｐであるＸが
、６０〜７５％のＡおよびＴを含有するデオキシリボヌ
クレオチド配列である特許請求の範囲第２３項記載の形
質転換体。 ２５、プロモーターが少なくとも下記塩基配列【遺伝子
配列があります】 を有するものである特許請求の範囲第２１項記載の形質
転換体。 ２６、プロモーターが少なくとも下記塩基配列【遺伝子
配列があります】を有し、かつ 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】 〔式中、Ｘ＿２、Ｘ＿３、Ｘ＿４、Ｘ＿５、Ｘ＿６、Ｘ
＿７、Ｘ＿８、およびＸ＿９は同一または異なってＡ、
Ｔ、ＧおよびＣからなる１６〜２１ｂｐを示す〕 からなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基配列
を有するものである特許請求の範囲第２１項記載の形質
転換体。 ２７、プロモーターが、６０〜７５％のＡおよびＴを含
有するものである特許請求の範囲第２６項記載の形質転
換体。 ２８、プロモーターの塩基配列が、５′末端側より式 【遺伝子配列があります】 である特許請求の範囲第２１項記載の形質転換体。 ２９、外来蛋白遺伝子が、ペプチド遺伝子または蛋白質
遺伝子である特許請求の範囲第２１項記載の形質転換体
。 ３０、ペプチド遺伝子または蛋白質遺伝子が、スーパー
オキシドジスムターゼ、インターフェロン、インターロ
イキン、ツモアー・ネフローシス・ファクター、インス
リン、カルシトニン、ソマトスタチン、セクレチン、プ
ラスミノーゲン・アクチベーター、ウロキナーゼ、グロ
スホルモン、エンドルフィン、ウィルス蛋白またはその
ムテインをコードする遺伝子である特許請求の範囲第２
９項記載の形質転換体。 ３１、形質転換体が、エシェリヒア属に属する特許請求
の範囲第２１項記載の形質転換体。 ３２、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子発現を支配してい
るプロモーターを含有するデオキシリボヌクレオチド配
列の下流に外来蛋白遺伝子を結合したデオキシリボヌク
レオチド配列を発現ベクターとして保持せしめた形質転
換体を培養し、該培養物から発現した該外来蛋白を採取
することを特徴とする外来蛋白の高発現製造法。 ３３、プロモーターが、少なくとも下記塩基配列【遺伝
子配列があります】 〔式中、Ａはアデニン、Ｔはチミン、Ｇはグアニンであ
り、ＸはＡ、Ｔ、ＧおよびＣ（ここでＣはシトシンであ
る）からなる１６〜２１ｂｐを示す〕 を有するものである特許請求の範囲第３２項記載の外来
蛋白の高発現製造法。 ３４、Ｘが、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣからなる１７ｂｐであ
る特許請求の範囲第３３項記載の外来蛋白の高発現製造
法。 ３５、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣからなる１７ｂｐであるＸが
、６０〜７５％のＡおよびＴを含有するデオキシリボヌ
クレオチド配列である特許請求の範囲第３４項記載の外
来蛋白の高発現製造法。 ３６、プロモーターが少なくとも下記塩基配列【遺伝子
配列があります】 を有するものである特許請求の範囲第３２項記載の外来
蛋白の高発現製造法。 ３７、プロモーターが少なくとも下記塩基配列【遺伝子
配列があります】を有し、かつ 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】 〔式中、Ｘ＿２、Ｘ＿３、Ｘ＿４、Ｘ＿５、Ｘ＿６、Ｘ
＿７、Ｘ＿８、およびＸ＿９は同一または異なってＡ、
Ｔ、ＧおよびＣからなる１６〜２１ｂｐを示す〕 からなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基配列
を有するものである特許請求の範囲第３２項記載の外来
蛋白の高発現製造法。 ３８、プロモーターが、６０〜７５％のＡおよびＴを含
有するものである特許請求の範囲第３７項記載の外来蛋
白の高発現製造法。 ３９、プロモーターの塩基配列が、５′末端側より式 【遺伝子配列があります】 である特許請求の範囲第３２項記載の外来蛋白の高発現
製造法。 ４０、外来蛋白遺伝子が、ペプチド遺伝子または蛋白質
遺伝子である特許請求の範囲第３２項記載の外来蛋白の
高発現製造法。 ４１、ペプチド遺伝子または蛋白質遺伝子が、スーパー
オキシドジスムターゼ、インターフェロン、インターロ
イキン、ツモアー・ネフローシス・ファクター、インス
リン、カルシトニン、ソマトスタチン、セクレチン、プ
ラスミノーゲン・アクチベーター、ウロキナーゼ、グロ
スホルモン、エンドルフィン、ウィルス蛋白またはその
ムテインをコードする遺伝子である特許請求の範囲第４
０項記載の外来蛋白の高発現製造法。 ４２、スーパーオキシドジスムターゼまたはそのムテイ
ンが、 【遺伝子配列があります】 （但しＸ＿１＿０は水素原子、アセチル基またはアミノ
酸残基を示し、Ｘ＿１＿１およびＸ＿１＿２は、同一ま
たは異なってＣｙｓまたはＣｙｓ以外のアミノ酸を示す
）である特許請求の範囲第４１項記載の外来蛋白の高発
現製造法。 ４３、形質転換体が、エシェリヒア属に属する微生物で
ある特許請求の範囲第３２項記載の外来蛋白の高発現製
造法。[Scope of Claims] 1. A deoxyribonucleotide sequence containing a promoter controlling pyruvate oxidase gene expression. 2. The promoter has at least the following base sequence [there is a gene sequence] [where A is adenine, T is thymine, G is guanine, and X is A, T, G, and C (where C is cytosine)] The deoxyribonucleotide sequence according to claim 1, which has the following: 16 to 21 bp consisting of ). 3. The deoxyribonucleotide sequence according to claim 2, wherein X is 17 bp consisting of A, T, G and C. 4. X, which is 17 bp consisting of A, T, G and C, is
4. The deoxyribonucleotide sequence of claim 3, which is a deoxyribonucleotide sequence containing 60-75% A and T. 5. The deoxyribonucleotide sequence according to claim 1, wherein the promoter has at least the following base sequence [there is a gene sequence]. 6. The promoter has at least the following base sequence [there is a gene sequence], and [there is a gene sequence] and [there is a gene sequence] [wherein, X_2, X_3, X_4, X_5, X_6, X
_7, X_8, and X_9 are the same or different A,
The deoxyribonucleotide sequence according to claim 1, which has one or more base sequences selected from the group consisting of 16 to 21 bp consisting of T, G, and C. 7. The deoxyribonucleotide sequence according to claim 6, wherein the promoter contains 60 to 75% A and T. 8. The deoxyribonucleotide sequence according to claim 1, wherein the base sequence is as follows from the 5' end: [There is a gene sequence]. 9. An expression vector in which a foreign protein gene is linked downstream of a deoxyribonucleotide sequence containing a promoter controlling pyruvate oxidase gene expression. 10. The promoter has at least the following base sequence [there is a gene sequence] [where A is adenine, T is thymine, G is guanine, and X is A, T, G, and C (where C is cytosine)] The expression vector according to claim 9, which has 16 to 21 bp consisting of )]. 11. The expression vector according to claim 10, wherein X is 17 bp consisting of A, T, G and C. 11. The expression vector of claim 10, wherein X, which is 17 bp consisting of 12, A, T, G and C, is a deoxyribonucleotide sequence containing 60 to 75% A and T. 13. The expression vector according to claim 9, wherein the promoter has at least the following base sequence [there is a gene sequence]. 14. The promoter has at least the following base sequence [there is a gene sequence], and [there is a gene sequence] and [there is a gene sequence] [wherein, X_2, X_3, X_4, X_5, X_6, X
_7, X_8, and X_9 are the same or different A,
The expression vector according to claim 9, which has one or more base sequences selected from the group consisting of 16 to 21 bp consisting of T, G, and C. 15. The expression vector according to claim 14, wherein the promoter contains 60 to 75% A and T. 16. The expression vector according to claim 9, wherein the base sequence of the promoter is as follows from the 5' end: 17. The expression vector according to claim 9, wherein the foreign protein gene is a peptide gene or a protein gene. 18. The peptide gene or protein gene is superoxide dismutase, interferon, interleukin, tumour nephrosis factor, insulin, calcitonin, somatostatin, secretin, plasminogen activator, urokinase, gross hormone, endorphin, viral protein or its Claim 1, which is a gene encoding a mutein
Expression vector according to item 7. 19, Claim 9 which is pKN17 plasmid
Expression vectors described in section. 20. The expression vector according to claim 9, which is a pSOD120 plasmid. 21. A transformant that retains a deoxyribonucleotide sequence in which a foreign protein gene is linked downstream of a deoxyribonucleotide sequence containing a promoter controlling pyruvate oxidase gene expression. 22. The promoter has at least the following base sequence [there is a gene sequence] [where A is adenine, T is thymine, G is guanine, and X is A, T, G, and C (where C is cytosine)] 22. The transformant according to claim 21, which has 16 to 21 bp consisting of )]. 23. The transformant according to claim 22, wherein X is 17 bp consisting of A, T, G and C. 24. The transformant according to claim 23, wherein X, which is 17 bp consisting of 24, A, T, G and C, is a deoxyribonucleotide sequence containing 60 to 75% A and T. 25. The transformant according to claim 21, wherein the promoter has at least the following base sequence [there is a gene sequence]. 26. The promoter has at least the following base sequence [there is a gene sequence], and [there is a gene sequence] and [there is a gene sequence] [wherein, X_2, X_3, X_4, X_5, X_6, X
_7, X_8, and X_9 are the same or different A,
22. The transformant according to claim 21, which has one or more base sequences selected from the group consisting of 16 to 21 bp consisting of T, G, and C. 27. The transformant according to claim 26, wherein the promoter contains 60 to 75% A and T. 28. The transformant according to claim 21, wherein the base sequence of the promoter is as follows from the 5' end: 29. The transformant according to claim 21, wherein the foreign protein gene is a peptide gene or a protein gene. 30. The peptide gene or protein gene is superoxide dismutase, interferon, interleukin, tumour nephrosis factor, insulin, calcitonin, somatostatin, secretin, plasminogen activator, urokinase, gross hormone, endorphin, viral protein or its Claim 2, which is a gene encoding a mutein
Transformant according to item 9. 31. The transformant according to claim 21, wherein the transformant belongs to the genus Escherichia. 32. Culture a transformant carrying as an expression vector a deoxyribonucleotide sequence in which a foreign protein gene is linked downstream of a deoxyribonucleotide sequence containing a promoter controlling pyruvate oxidase gene expression, and express from the culture. 1. A method for producing high expression of a foreign protein, which comprises collecting said foreign protein. 33. The promoter has at least the following base sequence [there is a gene sequence] [where A is adenine, T is thymine, G is guanine, and X is A, T, G, and C (where C is cytosine)] ) The method for producing high expression of a foreign protein according to claim 32. 34. The method for producing high expression of a foreign protein according to claim 33, wherein X is 17 bp consisting of A, T, G, and C. 35. The method for producing high expression of a foreign protein according to claim 34, wherein X, which is 17 bp consisting of 35, A, T, G, and C, is a deoxyribonucleotide sequence containing 60 to 75% of A and T. 36. The method for producing high expression of a foreign protein according to claim 32, wherein the promoter has at least the following base sequence [there is a gene sequence]. 37. The promoter has at least the following base sequence [there is a gene sequence], and [there is a gene sequence] and [there is a gene sequence] [wherein, X_2, X_3, X_4, X_5, X_6, X
_7, X_8, and X_9 are the same or different A,
33. The method for producing high expression of a foreign protein according to claim 32, which has one or more base sequences selected from the group consisting of 16 to 21 bp consisting of T, G, and C. 38. The method for producing high expression of a foreign protein according to claim 37, wherein the promoter contains 60 to 75% A and T. 39. The method for producing high expression of a foreign protein according to claim 32, wherein the nucleotide sequence of the promoter is as follows from the 5' end: [There is a gene sequence]. 40. The method for producing high expression of a foreign protein according to claim 32, wherein the foreign protein gene is a peptide gene or a protein gene. 41. The peptide gene or protein gene is superoxide dismutase, interferon, interleukin, tumour nephrosis factor, insulin, calcitonin, somatostatin, secretin, plasminogen activator, urokinase, gross hormone, endorphin, viral protein or its Claim 4, which is a gene encoding a mutein
The method for producing high expression of a foreign protein according to item 0. 42. Superoxide dismutase or its mutein has a gene sequence. (However, X_1_0 represents a hydrogen atom, acetyl group, or an amino acid residue, and X_1_1 and X_1_2 are the same or different and represent Cys or an amino acid other than Cys.) The method for producing high expression of a foreign protein according to claim 41. 43. The method for producing high expression of a foreign protein according to claim 32, wherein the transformant is a microorganism belonging to the genus Escherichia.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008123339A (en) * | 2006-11-14 | 2008-05-29 | Sanyo Electric Co Ltd | Beverage dispenser |
| WO2010082665A1 (en) | 2009-01-19 | 2010-07-22 | 旭化成ファーマ株式会社 | Method and reagent for determining mevalonic acid, 3-hydroxymethylglutaryl-coenzyme a and coenzyme a |
-
1987
- 1987-12-01 JP JP62301457A patent/JP2579506B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008123339A (en) * | 2006-11-14 | 2008-05-29 | Sanyo Electric Co Ltd | Beverage dispenser |
| WO2010082665A1 (en) | 2009-01-19 | 2010-07-22 | 旭化成ファーマ株式会社 | Method and reagent for determining mevalonic acid, 3-hydroxymethylglutaryl-coenzyme a and coenzyme a |
| US9458491B2 (en) | 2009-01-19 | 2016-10-04 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method and reagent for measuring mevalonic acid, 3-hydroxymethylglutaryl coenzyme A, and coenzyme A |
| US10975411B2 (en) | 2009-01-19 | 2021-04-13 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method and reagent for measuring mevalonic acid, 3-hydroxymethylglutaryl coenzyme A, and coenzyme A |
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| JP2579506B2 (en) | 1997-02-05 |
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