JP7874331B2 - 弱毒化されたレオウイルスベースのワクチン組成物及びその用途 - Google Patents

弱毒化されたレオウイルスベースのワクチン組成物及びその用途

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Description

本発明は、弱毒化されたレオウイルスベースのワクチン組成物及びその用途に関する。
本出願は、２０２１年０３月２３日付で出願された韓国特許出願第１０－２０２１－００３７１６０号及び２０２２年０３月２２日付で出願された韓国特許出願第１０－２０２２－００３５２２４号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書及び図面に開示されたすべての内容は、本出願に援用される。
ウイルスは、遺伝物質とタンパク質からなる小さな非細胞性有機体であり、異なるタイプのウイルスが存在する。例えば、ウイルスは、宿主の核内で複製するＤＮＡウイルス、または細胞の細胞質内で複製するＲＮＡウイルスであってもよい。ウイルスは、二本鎖または一本鎖であってもよい。さらに、一本鎖ＲＮＡウイルスは、プラス（＋、センス）鎖またはマイナス（－）鎖であってもよい。このような異なるタイプのウイルスは、様々なウイルス性感染を誘発する。
ウイルス感染は、病原性ウイルスが有機体の体内に侵入して入るときに発生する。一旦ウイルスが有機体の体内に入ると、ウイルスは自らを細胞に付着させ、細胞が破裂（ｃｅｌｌ ｂｕｒｓｔ）または死滅するまで細胞が新しいウイルスを複製するように細胞をリプログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）し、ヒトと動物においてウイルスが様々な感染性疾患を誘発させ、急速に広がるようにする。ウイルスによって誘発される感染性疾患は、通常、風邪、インフルエンザ、及びイボ（ｗａｒｔｓ）を含む。しかし、ウイルスは、さらにＡＩＤＳ、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）、Ｃ型肝炎、結核、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、及び中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、重症天然痘（ｓｍａｌｌ ｐｏｘ）、ヘルペス（ｈｅｒｐｅｓ）、出血熱（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ）、小児麻痺（ｐｏｌｉｏ）、麻疹（ｍｅａｓｌｅｓ）、流行性耳下腺炎（ｍｕｍｐｓ）、風疹（ｒｕｂｅｌｌａ）、ロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、非細菌性急性胃腸炎（ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）などの重症疾患を誘発することもある。
近年、ウイルス感染に対抗し、その拡散を制限するための最も重要な保護措置は、予防接種である。現代のワクチンは原則として、表面ウイルス抗原に対する抗体の形成を誘導する。ワクチン効果は、ワクチンに含まれるウイルスの抗原構造と個体群で循環する菌株との間の一致の程度に直接的に依存的である。ほとんどのウイルスの表面タンパク質は、一定の抗原変異（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）（抗原小変異（ｄｒｉｆｔ））を経験し、ワクチン菌株組成の継続的な更新が必要である。広範囲な作用の免疫反応を誘導する高度な免疫原性及び安全なワクチンの開発は、現在、効率的ながんや感染性疾患予防において直面する主な問題の一つである。最近拡散したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるコロナウイルス感染症－１９（ＣＯＶＩＤ－１９）などのような世界的な流行性疾患の拡散と持続的な感染を防ぐためには、ワクチンの開発が必要なのが実状である。そこで、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、アデノウイルス（Ａｄ）、バキュロウイルスなどのプラットフォームを使用し、現在、世界中で多くのウイルスベースのワクチンが開発されている。
レオウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｎｔｅｒｉｃ Ｏｒｐｈａｎ Ｖｉｒｕｓ；Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）は、全ゲノムが１０本の二本鎖のＲＮＡ断片から構成される非エンベロープウイルスであり、一般的な環境に遍在し、正常な免疫機能を有する宿主では症状を示さない無症候性ウイルスである。ヒトへの感染性が弱く、感染部位は、上部呼吸器及び胃腸管に限定されることが知られている。
一方、逆遺伝学技術は、ウイルスの全遺伝体配列を確認して組換えされた人工ウイルスを作り出すことができ、最大の長所は、人工的にウイルスを組換え発現、操作し、合成するために、ウイルス遺伝子に意図する様々な操作を加えることができるという点である。キメラウイルス（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｖｉｒｕｓ）、コドン最適化（ｃｏｄｏｎ ｐａｉｒ ｄｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）、突然変異（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）などの様々な機序をウイルスの遺伝子に搭載し、操作された新しいウイルスを作り出すことができる。古典的な遺伝学的アプローチは、主に与えられた生命体の遺伝体に対して無作為に変異を誘導した後、関心対象の形質を示す突然変異から遺伝子を発掘する方法で、時間と労力を多く消耗し、変異による形質変異効果が強くない遺伝子の変異は、分離が容易ではないという短所を有していた。最近、機能誘電体の発達により、酵母をはじめとするいくつかのモデル生物体において、誘電体レベルの前記突然変異が利用可能になった。一方、逆遺伝学技術は、様々な機序のうち、前記突然変異を用いて各遺伝子の変異が起こり得る形質変異を直接導入して探索することにより、遺伝学的探索の識別能を増加させることができる。前記逆遺伝学技術は、人工的に必要に応じてウイルスを操作でき、その特性を極大化できるという長所があり、ワクチン開発において非常に有用な技術である。
そこで、本発明者らは、逆遺伝学技術を用いて、特定のアミノ酸配列位置が切断され、弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質にがんまたは感染性疾患に対するエピトープが融合して発現されるようにエピトープ塩基配列を挿入する「迅速交換」方法を通じて、弱毒化されたレオウイルスベースのワクチンプラットフォームを開発しようとした。
本発明者らは、２５１～４５５番目のアミノ酸が切断されて弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質において、切断されたアミノ酸の位置にがんまたは感染性疾患に対する様々なエピトープのアミノ酸配列を置換または挿入する方法で導入してその発現を確認した結果、導入したエピトープが細胞内に安定的に発現し、中和抗体を生成するか、または細胞性免疫を誘導するなど免疫反応を示すことを確認し、これに基づいて本発明を完成した。
そこで、本発明の目的は、弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質のアミノ酸配列、及びがんまたは感染性疾患を誘発するエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドを提供することである。
本発明の他の目的は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、弱毒化されたレオウイルスベースのウイルスベクターを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、または前記ウイルスベクターを有効成分として含む、弱毒化されたレオウイルスベースのワクチン組成物及びその製造方法を提供することである。
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、以下の記載から本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者が明確に理解できるだろう。
前記目的を達成するために、本発明は、弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質のアミノ酸配列、及びがんまたは感染性疾患を誘発する抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、
Ｎ末端から２５１番目のアミノ酸の位置が切断されて弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質の１～２５０番目のアミノ酸配列、及び
前記弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端から２５１番目を含むもの以降のアミノ酸の位置に挿入され、がんまたは感染性疾患を誘発する抗原のエピトープアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ポリペプチドを提供する。
また、本発明は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、弱毒化されたレオウイルスベースのウイルスベクターを提供する。
また、本発明は、前記ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、または前記ウイルスベクターを有効成分として含む、弱毒化されたレオウイルスベースのワクチン組成物を提供する。
また、本発明は、以下の段階を含む、弱毒化されたレオウイルスベースのワクチン組成物の製造方法を提供する。
ａ）配列番号１で表される弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質をコードする塩基配列を含むように逆進化ウイルスベクターを製造する段階、及び
ｂ）前記シグマ１タンパク質をコードする塩基配列の７６３～１４１６番目の塩基配列位置にがんまたは感染性疾患を誘発する抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）をコードする塩基配列が含まれるように塩基を置換または挿入し、弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質とがんまたは感染性疾患を誘発する抗原のエピトープが融合して発現されるようにコードするポリヌクレオチドを前記ベクターに導入する段階。
本発明の一具現例として、前記弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるものであってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明の他の具現例として、前記弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質は、配列番号２で表される塩基配列によって暗号化されるものであってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明のさらに他の具現例として、前記エピトープは、弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質のカルボキシ末端において融合タンパク質を形成するか、または構成するものであってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明のさらに他の具現例として、前記エピトープのアミノ酸配列の前後にリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）（配列番号１１）、Ｍｙｃタンパク質（配列番号１２）、ＦＬＡＧタンパク質（配列番号１３）、及び２Ａペプチドからなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列をさらに含んでもよいが、これに制限されるものではない。
本発明のさらに他の具現例として、前記がんは、肝がん、神経膠腫、肉腫、大腸がん、乳がん、前立腺がん、黒色腫、肺がん、頭頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、胃がん、食道がん、胆管がん、膵臓がん、子宮頸がん、皮膚がん、リンパ腫、甲状腺がん、骨髄がん、子宮内膜がん、腎臓がん、直腸がん、及び脳腫瘍からなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明のさらに他の具現例として、前記感染性疾患は、コロナウイルス感染症－１９（ＣＯＶＩＤ－１９）、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）誘導エイズ（ＡＩＤＳ）、結核、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、ロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）による乳幼児腸炎、及びノロウイルス（ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）による非細菌性急性胃腸炎からなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明のさらに他の具現例として、前記エピトープのアミノ酸配列は、配列番号３～１０からなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明のさらに他の具現例として、前記エピトープをコードする塩基配列は、弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質をコードする塩基配列の５’末端から７６３～１４１６番目の塩基配列位置に置換または挿入されるものであってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明のさらに他の具現例として、前記エピトープは、宿主で中和抗体を生成するか、または細胞性免疫を誘導して免疫反応を引き起こすものであってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明のさらに他の具現例として、前記エピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＢ細胞エピトープからなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明のさらに他の具現例として、前記ワクチン組成物は、がんまたは感染性疾患の予防または治療用であってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明のさらに他の具現例として、前記ワクチン組成物の製造方法において、ｃ）前記ｂ）段階のポリヌクレオチドを含む弱毒化されたレオウイルスベースのベクターをＢＨＫ２１、Ｌ９２９、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬａ、及びＶｅｒｏ細胞からなる群から選ばれる少なくとも１つの細胞において産生及び増殖させる段階を含んでもよいが、これに制限されるものではない。
また、本発明は、前記ワクチン組成物をそれを必要とする個体に投与する段階を含む、がんまたは感染性疾患の予防または治療方法を提供する。
また、本発明は、前記ワクチン組成物のがんまたは感染性疾患の予防または治療用途を提供する。
また、前記本発明は、本発明によるポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、またはウイルスベクターのがんまたは感染性疾患の予防または治療用ワクチンの製造のための用途を提供する。
本発明による弱毒化されたレオウイルスは、カプシドのシグマ１タンパク質から２５１～４５５番目のアミノ酸が切断されたもので、前記切断されたシグマ１タンパク質部位にがんまたは感染性疾患を誘発する抗原タンパク質のエピトープを導入する場合、抗原タンパク質のエピトープが細胞内に安定して発現し、中和抗体を生成するか、または細胞性免疫を誘導するなど免疫反応を示す効果を有する。そこで、本発明による弱毒化されたレオウイルスの切断されたシグマ１タンパク質部位に抗原タンパク質のエピトープを導入することにより、がんまたは感染性疾患に対するワクチン組成物として有用に利用できるものと期待される。
本発明の一具現例による野生型レオウイルス及び弱毒化されたレオウイルスＲＰ１１６の構造を比較して示す図である。 本発明の一具現例による弱毒化されたレオウイルスＲＰ１１６のシグマ１タンパク質の切断された部位に様々な病原体由来抗原のエピトープを追加してレオウイルスワクチンプラットフォームを生成できることを概略的に示す図面である。 本発明の一具現例による弱毒化されたレオウイルスを用いて製造したワクチンの投与経路及び作用を図式化して示す図面である。 本発明の一具現例による迅速交換（ｑｕｉｃｋ ｅｘｃｈａｎｇｅ）レオウイルス逆遺伝学（ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）システム及びレオウイルス増殖過程を図式化して示す図面である。 本発明の一具現例によるＬ９２９細胞に野生型レオウイルス（ＷＴＲｅｏＶ）、切断されたσ１を有する弱毒化されたレオウイルスＲＰ１１６（ＲｅｏＶ＋Ｑ２５１＊）及びＲＢＤを導入したレオウイルス（ＲｅｏＶ＋ＲＢＤ）をそれぞれ感染させた後、抗レオウイルス抗体によるタンパク質検出結果を確認した図である。 本発明の一具現例によるＬ９２９細胞にＲｅｏＶ＋ＲＢＤを感染させて抽出した遺伝物質からＲＢＤ遺伝子が検出されることを確認した図である。 本発明の一具現例によるＬ９２９細胞にＲｅｏＶ＋ＲＢＤを感染させて得られた細胞溶解物においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体（ＮｅｕＡｂ）（上段）及び抗レオウイルス抗体（下段）によるレオウイルスタンパク質とＲＢＤの発現を確認した図である。 本発明の一具現例による弱毒化されたレオウイルスの組換えσ１タンパク質構成設計の概略図を示す図である。 本発明の一具現例による弱毒化されたレオウイルスにおいて様々なＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープをσ１タンパク質と融合して発現するように操作し、組換えレオウイルスから導入した様々な抗原が発現されることをウェスタンブロットを通じて確認した図である。 図４ｂで使用した組換えレオウイルスから導入した抗原が発現されることをＲＴ－ｑＰＣＲ分析を通じて確認した図である。 は、本発明の一具現例による弱毒化されたレオウイルスにおいて様々なＢ細胞エピトープをσ１タンパク質と融合して発現するように操作し、組換えレオウイルスから導入した様々な抗原が発現されることをウェスタンブロットを通じて確認した図である。 図４ｄで使用した組換えレオウイルスから導入した抗原が発現されることをＲＴ－ｑＰＣＲ分析を通じて確認した図である。 本発明の一具現例によるＲｅｏＶ＋ＯＶＡ２５７－２６４でエピトープ発現を免疫細胞化学分析法により確認した図である。 本発明の一具現例によるＲｅｏＶ－Ｓ２１Ｐ２（２）でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の線状Ｂ細胞エピトープ発現を確認した図である。 本発明の一具現例による組換えレオウイルスＲｅｏＶ＋Ｓ２１Ｐ２（１）及びＲｅｏＶ＋ＯＶＡ２５７－２６４の組換えσ１タンパク質構成設計の概略図を示す図である。 本発明の一具現例による組換えレオウイルスにおいてレオウイルス特異的抗体（上段）とＦＬＡＧタグに対する特異的抗体（下端）で抗原を検出することにより、導入したエピトープの安定性を確認した図である。
本発明の一実施例では、ヌクレオチド７６３ＣＡＡ（アミノ酸２５１Ｑ－グルタミン）から７６３ＴＡＡ（終止コドン）へのユニークな終止突然変異のある弱毒化されたレオウイルスＲＰ１１６を使用し、ＲＰ１１６の切断されたシグマ１タンパク質にエピトープアミノ酸配列を追加し、迅速交換（ｑｕｉｃｋ ｅｘｃｈａｎｇｅ）レオウイルス逆遺伝学（ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）システムを通じて弱毒化されたレオウイルスベースのワクチンプラットフォームを構築した（実施例１及び２参照）。
本発明の他の実施例では、レオウイルスワクチンプラットフォームに対する概念証明で、レオウイルスのシグマ１タンパク質と融合タンパク質の形態でコドン最適化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２）受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）配列を発現するＲｅｏＶ－ＲＢＤを製造し、これはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体により検出が可能であることを確認し、ＲＢＤを発現するＲｅｏＶがワクチン候補に理想的な中和抗体を生成することが分かった（実施例３参照）。
本発明のさらに他の実施例では、迅速交換技術を使用し、様々なＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが弱毒化されたレオウイルスのシグマ１タンパク質と融合して発現するように操作し、前記エピトープが実際に発現されることを実験を通じて確認し(実施例４～６参照)、導入したエピトープに変異なく安定的な発現が可能であることを確認した（実施例７参照）。
そこで、本発明は、弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質のアミノ酸配列、及びがんまたは感染性疾患を誘発する抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）アミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、
Ｎ末端から２５１番目のアミノ酸の位置が切断されて弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質の１～２５０番目のアミノ酸配列、及び
前記弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端から２５１番目を含んでそれ以降のアミノ酸の位置に挿入され、がんまたは感染性疾患を誘発する抗原のエピトープアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ポリペプチドを提供する。
本発明において、「レオウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｅｎｔｅｒｉｃ ｏｒｐｈａｎ ｖｉｒｕｓ， ＲＥＯ ｖｉｒｕｓ）」は、二本鎖のＲＮＡ断片をゲノムとして有する、非エンベロープ（ｎｏｎ－ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）２０面体のウイルスである。レオウイルスは、健康なヒトの消化器及び呼吸器からよく分離され、病原性のないバイロム（ｖｉｒｏｍｅ）であると考えられる。レオウイルスは、様々な形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）細胞を感染及び死滅させることができる腫瘍溶解性ウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓ）として知られている。
本発明において、「弱毒化されたレオウイルス」は、野生型レオウイルスのカプシドから放出された付着タンパク質シグマ１から２５１番目のアミノ酸であるグルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｑ）をコードする７６３ＣＡＡから７６３ＴＡＡ（終止コドン）へ突然変異が発生し、前記シグマ１タンパク質の２５１番目のアミノ酸以降が切断され、球状ヘッド形態が切断されたことを特徴とするレオウイルスＲＰ１１６であってもよい。
本発明において、前記弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるものであってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明において、前記弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質は、配列番号２で表される塩基配列によって暗号化されるものであってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明において、「がん」とは、細胞が正常な成長限界を無視して分裂及び成長する 攻撃的（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）特性、周囲組織に浸潤する浸潤的（ｉｎｖａｓｉｖｅ）特性、及び体内の他の部位に広がる転移的（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ）特性を有する細胞による疾患を総称する意味である。
本発明において、前記がんは当業界において悪性腫瘍として知られているものであれば、その種類が特に制限されず、例えば、肝がん、神経膠腫、肉腫、大腸がん、乳がん、前立腺がん、黒色腫、肺がん、頭頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、胃がん、食道がん、胆管がん、膵臓がん、子宮頸がん、皮膚がん、リンパ腫、甲状腺がん、骨髄がん、子宮内膜がん、腎臓がん、直腸がん、及び脳腫瘍からなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよい。
本発明において、「感染」とは、ウイルスのような病原性微生物が宿主となる生物体の体内に侵入して発育、増殖するもので、ヒトや動物、植物の組織、体液、表面に定着して増殖することを意味し、その結果、宿主は、病理学的な変化を受けて疾患が発生することがある。
本発明において、「感染性疾患」とは、病原性微生物がヒトや動物、植物の組織、体液、表面に定着して増殖することにより発生する疾患を意味し、感染経路、伝染性の有無によって様々な種類に区分できる。前記感染は、ウイルス性感染、真菌感染、細菌感染、原虫感染、及び寄生虫感染を含む。本発明において、前記感染性疾患は、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）誘導エイズ（ＡＩＤＳ）、結核、コロナウイルス感染症－１９（ＣＯＶＩＤ－１９）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染症、ロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）による乳幼児腸炎、及びノロウイルス（ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）による非細菌性急性胃腸炎からなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよく、本発明の一実施によれば、コロナウイルス感染症－１９であってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明において、「コロナウイルス感染症－１９（ＣＯＶＩＤ－１９）」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が引き起こす重症呼吸器症候群である。２０１９年１２月に中国で初めての事例が報告されて全世界的に広がり、流行病として位置づけられた。ＣＯＶＩＤ－１９の症状は様々であるが、発熱、咳、頭痛、疲労、呼吸困難、嗅覚及び味覚喪失などがある。症状はウイルスに感染してから１～１４日以内に現れる。特に感染した人の３分の１は無症状感染者で、目立つ症状が現れない。患者に分類されるほど目立つ８１％の人々は、軽症から重症の症状が発生し、１４％の人々は呼吸困難、低酸素症などの症状が発生し、５％の人々は呼吸器不全、ショックなど深刻な症状が発生する。高齢者は深刻な症状が発生する確率がさらに高く、一部の人々は、回復後、長い間感染したＣＯＶＩＤ－１９のために臓器損傷が観察された。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、３０ｋｂのヌクレオチドを有し、４つの重要な構造タンパク質を有している。Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｎ），Ｓｐｉｋｅ（Ｓ），Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍ），Ｅｎｖｅｌｏｐｅ（Ｅ）タンパク質。そのうち、Ｓタンパク質は、宿主細胞の受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と結合することで重要な部位であり、細胞内にｖｉｒａｌ ｎｕｃｌｅｏｃａｓｐｉｄを伝達し、複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が行われる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対抗する最も簡単で直接的な方法は、ヒト細胞に入るウイルスを中和させることで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が細胞内に流入して複製が起こり、新しいビリオン（ｖｉｒｉｏｎ）が分泌されて他の細胞に感染させるメカニズムを遮断することである。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ヒト細胞のアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体と結合してウイルス複製が可能であることが知られている。コロナウイルスのＳタンパク質のうち、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、宿主細胞のＡＣＥ２受容体と結合する核心領域であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する強力な中和抗体を誘導する多重形態依存的エピトープ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅｓ））を含んでいるため、コロナウイルス感染症－１９の治療及びワクチンの開発にとって核心標的になりうる（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５；１７４：４９０８－４９１５）。
また、本発明は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、弱毒化されたレオウイルスベースのウイルスベクターを提供する。
また、本発明は、前記ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、または前記ウイルスベクターを有効成分として含む、弱毒化されたレオウイルスベースのワクチン組成物を提供する。
本発明において、前記ワクチン組成物は、がんまたは感染性疾患の予防または治療用であってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明において、「ワクチン」とは、動物において免疫学的応答を誘導する少なくとも１つの免疫学的に活性な成分を含有する組成物を意味する。ワクチンの免疫学的に活性な成分は、生きているウイルスまたは死んだウイルスの適切な要素を含んでもよく（サブユニットワクチン）、これによってこれらの要素は、全ウイルスまたはその成長培養物を破壊し、次に所望の構築物（ら）を得る精製段階によって、または制限されるものではないが、バクテリア、昆虫、哺乳動物または他の種などの適切なシステムの適切な操作によって誘導される合成過程及び、次に単離及び精製過程により、または適切な薬学的組成物を使用して遺伝子物質の直接的な混入によるワクチンを必要とする動物において前記合成過程の誘導によって（ポリヌクレオチドワクチン化）製造される。
ワクチンは、前述した要素の１つまたは１つ以上を含んでもよく、当業界に知られている方法によって製造されてもよい。本発明において、前記ワクチンは、シグマ１タンパク質が切断されて弱毒化されたレオウイルスに基づいて、その切断された部位に様々ながんまたは感染性疾患を誘発するエピトープが融合した形態で発現されるように製造されてもよく、例えば、前記弱毒化されたレオウイルスの切断されたシグマ１タンパク質及びエピトープアミノ酸配列を含むポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターの形態で製造されてもよいが、これに制限されるものではない。本発明のワクチンは、当業界で知られている任意の形態、例えば、液剤及び注射剤の形態または懸濁液に適した固体形態であってもよいが、これに限定されるものではない。このような製剤は、さらにリポソームや可溶性ガラス内に乳化またはカプセル化されるか、またはエアロゾルやスプレーの形態で製造されてもよい。これらは経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）パッチに含ませてもよい。
本発明によるワクチンは、必要に応じて、薬学的に許容されるワクチン保護剤、免疫強化剤、希釈剤、吸収促進剤などを含んでもよい。前記ワクチン保護剤は、例えば、ラクトースリン酸グルタミン酸ゼラチン混合物を含むが、これに限定されるものではない。前記ワクチンが液剤または注射剤の場合、必要に応じてプロピレングリコール及び溶血現象を防止するのに十分な量（例：約１％）の塩化ナトリウムを含有してもよい。
前記免疫増強剤（アジュバント）として使用する物質には特に制限はなく、例えばミョウバン（Ａｌｕｍ）、ＭＰＬ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）、水酸化アルミニウム、鉱油または他のオイルまたはワクチンに添加されるか、またはこのような追加成分によってそれぞれの誘導後、身体によって発生する補助分子であってもよいが、これに制限されるものではない。
このとき、「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容され、個体に投与されるとき、活性成分の作用を阻害せず、通常、胃腸障害、めまいなどのアレルギー反応またはこれに類似した反応を引き起こさない非毒性であることを意味する。
前記ワクチンは、経口、経皮、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下内などの投与経路を通じて投与されてもよいが、これに限定されず、例えば、経口または筋肉投与経路を通じて投与されてもよい。
本発明において、「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」とは抗原決定基であり、抗体、Ｂ細胞、Ｔ細胞などの免疫系が抗原を識別させる抗原の特定の部分を意味する。Ｂ細胞（すなわち、抗体）反応を誘導するためには、抗原が「Ｂ細胞エピトープ」を含むべきであり、Ｔ細胞反応を誘導するためには、抗原が「Ｔ細胞エピトープ」を含むべきである。当技術分野で一般的に理解されるように、Ｂ細胞エピトープは、Ｂ細胞受容体によって認識されて結合される抗原の一部である。脂質、多糖類及びタンパク質／ペプチドは、Ｂ細胞エピトープを含んでもよく、これは選択された有機体に導入されると、導入されたエピトープに特異的に結合する抗体をＢ細胞が産生するようにする。
本発明において、前記エピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＢ細胞エピトープからなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよく、本発明の一実施例によれば、ＲＢＤ（配列番号３）、ＯＶＡ２５７－２６４（配列番号４）、ＯＶＡ３２３－３３９（配列番号５）、Ａｄｐｇｋ（配列番号６）、Ｒｐｌ１８（配列番号７）、Ｐ１５Ｅ（配列番号８）、Ｓ２１Ｐ２（１）（配列番号９）、及びＳ２１Ｐ２（２）（配列番号１０）からなる群から少なくとも１つのアミノ酸配列を含むエピトープであってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明において、前記エピトープは、弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質のカルボキシ末端に融合タンパク質を形成するか、または構成するものであってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明において、前記エピトープをコードする塩基配列は、弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質をコードする塩基配列の５’末端から７６３～１４１６番目の塩基配列位置に置換または挿入されるものであってもよいが、これに制限されるものではない。例えば、前記エピトープをコードする塩基配列は、弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質をコードする配列番号２の塩基配列において５’末端から７６３～１４１６番目の塩基配列位置のうち、特定位置の塩基配列の代わりに置換されるものであってもよく、特定の位置の塩基配列の間に挿入されるものであってもよい。これにより、野生型レオウイルスのシグマ１タンパク質のアミノ酸配列においてＮ末端から２５１番目のアミノ酸配列以降が切断され、弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質において、前記２５１番目を含んでそれ以降のアミノ酸の位置に挿入されて融合されるエピトープは、約５個～４００個のアミノ酸配列を含んでもよいがこれに制限されるものではない。
本発明において、前記弱毒化されたレオウイルスのシグマ１タンパク質において２５１番目を含むもの以降のアミノ酸の位置に含まれるエピトープのアミノ酸配列の前後にリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）（配列番号１１）、Ｍｙｃタンパク質（配列番号１２）、ＦＬＡＧタンパク質（配列番号１３）、及び２Ａペプチドからなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列をさらに含んでもよいが、これらに制限されず、それらの順序に制限はない。前記２Ａペプチドは、例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａなどを含む２Ａペプチドの中から選ばれてもよく、その種類に制限はない。
本発明において、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＢ細胞エピトープからなる群から選ばれる少なくとも１つのエピトープは、Ｔ細胞またはＢ細胞が抗原を識別させることにより、宿主で中和抗体を生成するか、または細胞性免疫を誘導することにより、免疫反応を引き起こすものであってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明において、「抗体」とは、抗原に特異的に結合して認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片に由来するフレームワーク領域を含むポリペプチドを意味する。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー不変領域遺伝子をはじめとして、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖はカッパまたはラムダに分類された。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、結果としてそれぞれ免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを限定する。典型的には、抗体の抗原結合領域は、結合特異性及び親和性において最も核心的である。抗体は体液性免疫の主役であり、感作リンパ球とともに生体防御機構の重要な役割を担っており、抗原タンパク質を免疫原として動物に投与して体液性免疫反応を誘導することにより製造される。抗体または抗体の断片は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ラクダ、ウサギなどを含む、異なる個体に由来されてもよいが、これに制限されるものではない。
本発明において、「中和抗体（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、病原体に結合して細胞を感染させるか、または疾患を引き起こす病原体の能力を妨げる任意の抗体またはその抗原結合断片を意味する。
本発明において、「細胞性免疫」とは、あるリンパ系細胞がある抗原に直接的に免疫反応を引き起こす免疫活動をいう。白血球細胞がある抗原に作用してその細胞を食べる大食作用をするか、または毒性細胞反応を起こして抗原を除去する免疫活動をいう。体内で血清抗体により行われる体液性免疫とともに免疫系を構成しており、代表的には細胞毒性を有するＴ細胞の作用が挙げられる。Ｔ細胞は、Ｂ細胞と結合して抗体を構成した後、直接的に抗原と接触して抗原を破壊させる。
本発明において、「抗原」とは、宿主において免疫反応を生成する能力を有するタンパク質を指す。抗原は抗体によって認識され、それに結合されてもよい。抗原は体内または外部環境に由来されるものであってもよく、組換え型タンパク質も含む。本発明において、前記ワクチン組成物は、がんまたは感染性疾患を誘発する抗原のエピトープに対する抗体の産生を誘導することができ、このとき、前記エピトープは、抗原として作用する。前記ワクチン組成物を１回投与する場合に比べて２回または３回繰り返し投与する場合、抗体の産生がさらに増加し得るが、これに制限されるものではない。
また、本発明は、以下の段階を含む、弱毒化されたレオウイルスベースのワクチン組成物の製造方法を提供する。
ａ）配列番号１で表される弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質をコードする塩基配列を含むように逆進化ウイルスベクターを製造する段階、及び
ｂ）前記シグマ１タンパク質をコードする塩基配列の７６３～１４１６番目の塩基配列位置にがんまたは感染性疾患を誘発する抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）をコードする塩基配列が含まれるように塩基を置換または挿入し、弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質とがんまたは感染性疾患を誘発する抗原のエピトープが融合して発現されるようにコードするポリヌクレオチドを前記ベクターに導入する段階。
本発明において、前記逆進化ウイルスベクターは、宿主細胞において弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質をコードするＳ１セグメントＲＮＡを産生できるように製造されたウイルスベクターを意味することができ、当業界で公知の方法を通じて製造されてもよい。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターからウイルスＲＮＡセグメント（ｓｅｇｍｅｎｔ）が転写されるようにベクターを構成し、３’末端はベクターにあるリボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）によって自然に形成されてベクターを導入したＴ７ポリメラーゼ発現細胞でウイルスＲＮＡが産生され、これを用いてウイルスタンパク質が合成されることになり、逆進化システム（ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｓｙｔｅｍ）と命名されている。これはＲＮＡウイルスの変異株をデザインして作り出す有用な方法である。
本発明のワクチン組成物の製造方法において、ｃ）前記ｂ）段階のポリヌクレオチドを含む弱毒化されたレオウイルスベースのベクターをＢＨＫ２１、Ｌ９２９、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬａ、及びＶｅｒｏ細胞からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞において産生及び増殖させる段階を含んでもよいが、これに制限されるものではない。
また、本発明は、前記ワクチン組成物を、それを必要とする個体に投与する段階を含む、がんまたは感染性疾患の予防または治療方法を提供する。
また、本発明は、前記ワクチン組成物のがんまたは感染性疾患の予防または治療用途を提供する。
また、本発明は、本発明によるポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、または前記ウイルスベクターのがんまたは感染性疾患の予防または治療用ワクチンの製造のための用途を提供する。
本発明において「予防」とは、所望の疾患の発病を抑制するか、または遅延させるすべての行為を意味し、「治療」とは、本発明による薬学的組成物の投与により所望の疾患とそれに伴う代謝異常の症状が好転するか、または有益に変更されるすべての行為を意味する。
本発明で使用される用語の「投与」とは、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。
本発明で使用される用語の「個体」とは、がんまたは感染性疾患の予防を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒトまたは非－ヒトの霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシなどの哺乳類を意味する。
本発明において、「含む」という用語が使用されるとき、これは特に反対の記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含んでもよいことを意味する。本発明の全体で使用される程度の用語の「～（する）段階」または「～の段階」は、「～のための段階」を意味しない。
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、下記の実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
［実施例１．弱毒化されたレオウイルスベースのワクチンプラットフォームの構築］
レオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）は、二本鎖のＲＮＡ非エンベロープウイルスである。ＲＥＯは、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｎｔｅｒｉｃ Ｏｒｐｈａｎの略字で、ヒトの呼吸器及び腸のために分離されたが、既知のヒトの疾患とは関連がない。野生型レオウイルス感染によって発生するほとんどの中和抗体及び免疫反応は、ウイルスのシグマ１（ｓｉｇｍａ １，σ１）タンパク質、より具体的には、カプシドから飛び出したタンパク質の球状ヘッドに対するものである。したがって、レオウイルスに対するσ１のこの領域は、抗原性を高める核心部分を示す。図１ａに示すように、野生型（ＷＴ）レオウイルスは、接合部接着分子－Ａ（ＪＡＭ－Ａ）を認識し、これに結合して進入する外部カプシドに付着タンパク質σ１を表示する（図１ａの左図）。
野生型レオウイルスσ1タンパク質のアミノ酸配列及び塩基配列を下記表１に示した。
弱毒化されたレオウイルスＲＰ１１６は、ヌクレオチド７６３ＣＡＡ（アミノ酸２５１Ｑ－グルタミン）から７６３ＴＡＡ（終止コドン）へのユニークな終止突然変異のあるレオウイルスであり、ＷＴレオウイルスσ１に比べて「ヘッドが切断された」σ１タンパク質を生成する（図１ａの右図）。
図１ｂに示すように、ＲＰ１１６のこのようなσ１タンパク質は、球状ヘッドがレオウイルス複製に必須的ではなく、この部位で様々な病原体由来の他の抗原断片と交換できることを示している。革新的かつ安全なレオウイルスワクチンプラットフォームの生成のために、ＲＰ１１６σ１タンパク質のこのような部位にエピトープ断片の約５個～４００個のアミノ酸を追加してもよい。
また、図１ｃに示すように、非エンベロープレオウイルスは、過酷な環境条件に対する回復力があり、様々な溶液または食品供給源とともに投与してもよい。経口進入の際に、レオウイルスは、小腸のＭ細胞を優先的に感染させ、σ１に表示された様々な病原体エピトープに対する免疫反応を誘導する。
［実施例２．迅速交換（ｑｕｉｃｋ ｅｘｃｈａｎｇｅ）レオウイルス逆遺伝学（ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）システムの構築］
レオウイルスに対する逆遺伝学システムは、１０個のウイルス遺伝子切片及びＴ７発現細胞株で形質感染して、複製可能なレオウイルス粒子を生成し（Kobayshi et al.,2007,Cell Host Microbe.2007 Apr 19;1(2):147-57.）、その後、１０個のウイルス遺伝子切片を含む４つのプラスミドのみがＴ７発現細胞株に形質感染される必要がある逆遺伝学システムの改善されたバージョンが報告された（Kobayashi et al.,2010,Virology.2010 Mar 15; 398(2):194-200.）。本発明では、弱毒化されたレオウイルスＲＰ１１６遺伝子を使用して新しい逆遺伝学システムを構築することにより、ワクチンの設計及びテストのための速い「迅速交換（ｑｕｉｃｋ ｅｘｃｈａｎｇｅ）」アプローチを行った。本発明において前記システムを導入してレオウイルスＲＰ１１６ベースのワクチンを設計するために使用したベクターは、以下の通りである（図２の上段図面参照）：ｐＳ１ＡｔｔまたはｐＳ１ＸＸ、ｐＬ１、ｐＳｅｔ２、ｐＳｅｔ３、ｐＳｅｔ４。
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するように形質転換したＢＨＫ２１細胞に前記ベクターを導入させると、ウイルス遺伝子が転写され、究極的に２４～７２時間以内に複製可能なウイルス粒子の生成を誘導する。ｐＳ１ＸＸは、ｐＳ１Ａｔｔ、すなわち、ＲＰ１１６のＳ１遺伝子のアミノ酸位置２５１で終止コドン突然変異からＣ末端への配列を再設計することにより、非レオウイルスエピトープを導入して製造した。終止コドンと７６３番目のヌクレオチド以降の配列を再設計し、抗原またはエピトープ断片をＲＰ１１６σ１タンパク質配列に「融合」してもよい。特定の制限酵素認識部位は、アミノ酸の位置２５１及びＣ末端の間にも設計され、σ１ペプチドのこの部分を容易に交換することができた。
生成された複製可能な粒子は、感染前にキモトリプシン（ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）５０μｇ／ｍＬ処理を通じて外部カプシドを分解することにより、産生用細胞株ＢＨＫ２１、Ｌ９２９、Ｖｅｒｏ細胞への付着及び進入をさらに容易にした。
このような迅速交換（ｑｕｉｃｋ ｅｘｃｈａｎｇｅ）レオウイルス逆遺伝学（ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）システム及びレオウイルス増殖過程を図式化して図２に示した。
また、本発明で使用したエピトープのアミノ酸配列、構築物のアミノ酸配列及びコドン最適化された構築物のＤＮＡ配列を下記表２に示した。
［実施例３．ＲｅｏＶ－ＲＢＤの製造］
レオウイルスワクチンプラットフォームに対する概念証明として、レオウイルスのσ１タンパク質と融合タンパク質の形態でコドン最適化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２）受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）配列を発現するように弱毒化されたレオウイルスＳ１遺伝子の位置２５１コドン以降にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）塩基配列を導入することにより製造した組換えレオウイルスＲｅｏＶ＋ＲＢＤ（ＲｅｏＶ－ＲＢＤ）、ＷＴσ１（ＷＴ ＲｅｏＶ）及び切断されたσ１（ＲｅｏＶ＋Ｑ２５１＊）を有するレオウイルスはＢＨＫ２１細胞で生成されてＬ９２９で増殖された。この過程でσ１においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を発現する組換えレオウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体により検出が可能である。
図３aに示すように、Ｌ９２９細胞に野生型レオウイルス（ＷＴ ＲｅｏＶ）、切断されたσ１を有するレオウイルス（ＲｅｏＶ＋Ｑ２５１＊）及びＲＢＤ抗原基を導入したレオウイルス（ＲｅｏＶ＋ＲＢＤ）をそれぞれ感染させて９６時間後、細胞溶解物において抗レオウイルス抗体によってそれぞれのレオウイルスタンパク質が検出されたことをウェスタンブロット結果を通じて確認した。
それぞれの組換えレオウイルスをＬ９２９細胞に感染させて抽出した遺伝物質においてＲＢＤ遺伝子特異的プライマーを使用して組換えレオウイルスの４回継代後、ＲＴ－ｑＰＣＲ分析を行った結果、図３ｂに示すように、ＲｅｏＶ＋ＲＢＤを感染させた場合、ＲＢＤ遺伝子が検出されることを確認した。ＲＴ－ｑＰＣＲ分析に使用したプライマー配列は、下記表３に示した。
また、Ｌ９２９細胞に感染させて得られた細胞溶解物においてドットブロット（ｄｏｔ ｂｌｏｔ）法を行った結果、図３ｃに示すように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体（ＮｅｕＡｂ）（上段）及び抗レオウイルス抗体（下段）により組換えＲＢＤが発現されることを確認した。陽性対照群組換えＲＢＤは、Ｄｒ．Ｊｏｈｎ Ｂｅｌｌ研究室で製造（Ａｚａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０２０ Ａｕｇ ３０；１０（９）：２１５）し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮｅｕＡｂ（４０５９２－ＭＭ５７）は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｗａｙｎｅ、ＰＡ、米国）から購入して使用した。前記結果は、ＲＢＤを発現するＲｅｏＶがワクチン候補に理想的な中和抗体を生成することを示す。
［実施例４．レオウイルス付着タンパク質シグマ１（σ１）を用いた外来抗原の発現］
特定の突然変異の変化は、部位特異的突然変異誘発または複製によって導入され、１つまたは複数のレオウイルス遺伝子部分内で定義された突然変異の役割または結果を調査し、レオウイルスが変形するか、または突然変異を引き起こすことができる。例えば、シグマ３タンパク質をエンコードするレオウイルスのＳ４遺伝子にある特定のアミノ酸突然変異がウイルスベクター内に導入され、ウイルスカプシドのシグマ３タンパク質に特定の変異を有する変形されたレオウイルスが生成される。
本発明の弱毒化されたレオウイルスＲＰ１１６の主な突然変異は、σ１タンパク質をコードするＳ１遺伝子内で７６３ＣＡＡ（アミノ酸２５１Ｑ－グルタミン）から７６３ＴＡＡ（終止コドン）への終止突然変異であり、このシステム内で前記突然変異の生成は、切断されたσ１タンパク質を有する複製可能なＲＰ１１６レオウイルスを生成する。
遺伝子断片の特徴によってヌクレオチド７６３－１４１６位置に選択した特定のエピトープ配列の置換または挿入が可能であり、本質的にσ１の球状ヘッド構造を代替する、この非レオウイルス配列の置換または挿入は、前記非レオウイルス抗原に対する免疫反応を生成する新規エピトープをウイルスのカプシドに露出させる。
図４ａは、組換え付着タンパク質の構成設計の概略図を示すもので、σ１タンパク質の２５１番アミノ酸～４５５番アミノ酸の間の残基は、標識目的のＭｙｃ及びＦＬＡＧタグなどを始めとして、様々なエピトープに代替可能である。
レオウイルスは、「迅速交換（Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｃｈａｎｇｅ）」技術を使用して様々なＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープをσ１タンパク質と融合して発現するように操作し、図４ｂに示すようにウェスタンブロットで組換えレオウイルスから導入した様々な抗原が発現されることを確認し、図４ｃに示すように遺伝子特異的プライマーを使用してＲＴ－ｑＰＣＲ分析を行うことにより、前記図４ｂで使用した組換えレオウイルスから導入した抗原が発現されることをＤＮＡアガロースゲルで分離して確認した。
また、レオウイルスは、迅速交換技術を使用して様々なＢ細胞エピトープをσ１タンパク質と融合して発現するように操作し、図４ｄに示すようにウェスタンブロットで組換えレオウイルスから導入した様々な抗原が発現されることを確認し、図４ｅに示すように遺伝子特異的プライマーを使用してＲＴ－ｑＰＣＲ分析を行うことにより、図４ｄで使用した組換えレオウイルスから導入した抗原が発現されることをＤＮＡアガロースゲルで分離して確認した。
このような実施例は、様々な外来抗原のエピトープを発現する新しいレオウイルスワクチンプラットフォームの様々な有用性を示し、様々な疾患エピトープを導入し、新しいワクチン開発においてスクリーニング段階から使用できることを示唆する。
［実施例５．ＲｅｏＶ－ＯＶＡを感染させた細胞に導入された抗原発現の確認］
図４aに示すように構成したＲｅｏＶ＋オボアルブミン（ＯＶＡ）２５７－２６４において、ＯＶＡ２５７－２６４エピトープの側面にあるＭｙｃ及びＦＬＡＧタグは、免疫細胞化学分析法で検出してもよい。
これを検出するために、カバースリップで成長したＶｅｒｏ細胞をＲｅｏＶ、ＲｅｏＶ＋Ｑ２５１＊、及びＲｅｏＶ＋ＯＶＡ２５７－２６４で４８時間感染させた。その後、細胞を３．７％ＰＦＡに固定し、抗ＲｅｏＶ（１：１０００、ウサギ血清）、抗Ｍｙｃ（１：２００）、及び抗ＦＬＡＧ（１：２００）で１時間反応させた後、抗ＲｅｏＶ抗体に対する２次抗体であるウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８及び抗Ｍｙｃまたは抗ＦＬＡＧ抗体に対する２次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４とともに４５分間培養した。染色したカバースリップは、核カウンター染色用ＤＡＰＩを有するＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇでマウンティングし、イメージは６０Ｘオイル対物レンズを有するオリンパス共焦点顕微鏡で撮影した（スケールバー＝５０μｍ）。
その結果、図５に示すようにＲｅｏＶ＋ＯＶＡ２５７－２６４で感染した場合、Ｍｙｃ及びＦＬＡＧタグに現れる蛍光（赤色）は、レオウイルスタンパク質について検出した蛍光（緑色）と重なることを確認した。
これは組換えレオウイルスが感染した細胞において特異的に抗原が発現されることを示し、組換えレオウイルスが感染性であり、哺乳動物細胞で操作されたネオエピトープ（ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ）を発現できることを示唆する。
［実施例６．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２線状Ｂ細胞エピトープの発現と検出］
ＢＨＫ２１細胞は、野生型（ＷＴ）または操作されたＲｅｏＶ（ＲｅｏＶ＋ｐ１５Ｅ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２線状Ｂ細胞エピトープを発現するＲｅｏＶ－Ｓ２１Ｐ２（２））で感染させた。以前の研究では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２線状Ｂ細胞エピトープは、中和抗体を生成することが検証された（Ｐｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０２０ Ｊｕｎ １；１１（１）：２８０６）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２線状Ｂ細胞エピトープの発現を確認するために、感染４８時間後に細胞を溶解させてウェスタンブロットに使用した。その結果、図６に示すように、レオウイルスタンパク質は、すべての感染されたサンプルから検出できたが、Ｍｙｃ及びＦＬＡＧタグは、両方ともｐ１５ＥまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ細胞エピトープで操作されたＲｅｏＶでのみ検出された。また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＢ細胞エピトープ領域を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）の全Ｓ２部分から生成された抗Ｓ２抗体で標識した後、ＲｅｏＶ＋Ｓ２１Ｐ２（２）に感染されたサンプルでのみ明確に免疫反応性のあるタンパク質バンドを確認できた（矢印で表示）。
これらの結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の線状Ｂ細胞エピトープを保有する組換えレオウイルスがエピトープに対する特異的免疫反応を誘導し得ることを示唆する。
［実施例７．組換えレオウイルスの安定性の確認］
図７ａは、組換えレオウイルスＲｅｏＶ＋Ｓ２１Ｐ２（１）及びＲｅｏＶ＋ＯＶＡ２５７－２６４の組換えσ１タンパク質構成設計の概略図を示した。
それぞれのエピトープは、Ｎ末端及びＣ末端でそれぞれＭｙｃ及びＦＬＡＧタグを含むように設計し、導入されたエピトープが安定して発現するかどうかを確認するために使用した。
ＢＨＫ２１細胞を４８時間組換えレオウイルスで感染させた後、ウェスタンブロッティングで分析し、組換えレオウイルスからレオウイルス特異的抗体（上段）及びＦＬＡＧタグに対する特異的抗体（下端）をすべて検出した。ＧＡＰＤＨ認識抗体（抗ＧＡＰＤＨ）をローディングコントロールとして使用した。
その結果、図７ｂに示すようにＦＬＡＧタグで高濃度の抗原が検出されることを確認したところ、検出される高濃度抗原は、５回の継代後にも導入したエピトープに変異がなく安定的な発現が可能であることが分かった。
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できるだろう。したがって、前述した実施例は、すべての点で例示的なものであり、限定的なものではないと理解しなければならない。
本発明による弱毒化されたレオウイルスの切断されたシグマ１タンパク質部位に抗原タンパク質のエピトープを導入する場合、がんまたは感染性疾患に対するワクチン組成物として有用に利用できるものと期待されるところ、本発明は、産業上利用可能性がある。

Claims (16)

  1. （ｉ）弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質のアミノ酸配列、ここで、前記弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質が、Ｎ末端から２５１番目のアミノ酸の位置が切断された野生型レオウイルスシグマ１タンパク質の１～２５０番目のアミノ酸配列からなり、前記弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列で表される；及び
    （ｉｉ）がんまたは感染性疾患を誘発する抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）アミノ酸配列、ここで、前記エピトープアミノ酸配列は、前記弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端から２５１番目を含んでそれ以降のアミノ酸の位置に挿入される、
    からなるポリペプチド。
  2. 前記エピトープが、弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質のカルボキシ末端において融合タンパク質を形成することを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記がんが、肝がん、神経膠腫、肉腫、大腸がん、乳がん、前立腺がん、黒色腫、肺がん、頭頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、胃がん、食道がん、胆管がん、膵臓がん、子宮頸がん、皮膚がん、リンパ腫、甲状腺がん、骨髄がん、子宮内膜がん、腎臓がん、直腸がん、及び脳腫瘍からなる群から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 前記感染性疾患が、コロナウイルス感染症－１９（ＣＯＶＩＤ－１９）、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）誘導エイズ（ＡＩＤＳ）、結核、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、ロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）による乳幼児腸炎、及びノロウイルス（ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）による非細菌性急性胃腸炎からなる群から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
  5. 前記エピトープのアミノ酸配列が、配列番号３～１０のアミノ酸配列からなる群から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
  6. 前記エピトープが、宿主で中和抗体を生成するか、または細胞性免疫を誘導して免疫反応を引き起こすことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
  7. 前記エピトープが、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＢ細胞エピトープからなる群から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
  8. 請求項１～７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ウイルスベクター。
  9. 前記弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質が、配列番号２で表される塩基配列によって暗号化されることを特徴とする、請求項８に記載のウイルスベクター。
  10. 前記ベクターが、前記エピトープをコードする塩基配列の前後に、リンカー、Ｍｙｃタンパク質、ＦＬＡＧタンパク質、及び２Ａペプチドからなる群から選ばれる少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで、前記リンカーは配列番号１１のアミノ酸配列からなり、前記Ｍｙｃタンパク質は配列番号１２のアミノ酸配列からなり、前記ＦＬＡＧタンパク質は配列番号１３のアミノ酸配列からなる、ことを特徴とする、請求項８に記載のウイルスベクター。
  11. 前記エピトープをコードする塩基配列が、弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質をコードする塩基配列の５’末端から７６３～１４１６番目の塩基配列位置に置換または挿入されることを特徴とする、請求項８に記載のウイルスベクター。
  12. 請求項１～７のいずれか一項に記載のポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、または請求項８に記載のウイルスベクターを有効成分として含む、ワクチン組成物。
  13. 前記ワクチン組成物が、がんまたは感染性疾患の予防または治療用であることを特徴とする、請求項１２に記載のワクチン組成物。
  14. 以下の段階を含む、ワクチン組成物の製造方法：
    ａ）弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質をコードする塩基配列を含む逆進化ウイルスベクターを製造する段階、ここで、前記弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質は、Ｎ末端から２５１番目のアミノ酸の位置が切断された野生型レオウイルスシグマ１タンパク質の１～２５０番目のアミノ酸配列からなり、配列番号１のアミノ酸配列で表される、及び
    ｂ）前記弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質をコードする塩基配列の５’末端から７６３～１４１６番目の位置に、がんまたは感染性疾患を誘発する抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）をコードする塩基配列が挿入または置換されたポリヌクレオチドを前記ベクターに導入し、これにより、前記弱毒化されたレオウイルスシグマ１タンパク質が、前記がんまたは感染性疾患を誘発する抗原のエピトープと融合したものとして発現される、段階。
  15. ｃ）前記ｂ）段階のポリヌクレオチドを含むベクターをＢＨＫ２１、Ｌ９２９、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬａ、及びＶｅｒｏ細胞からなる群から選ばれる少なくとも１つの細胞において産生及び増殖させる段階、をさらに含むことを特徴とする、請求項１４に記載のワクチン組成物の製造方法。
  16. 請求項１に記載のポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターのがんまたは感染性疾患の予防または治療用ワクチンの製造のための使用。
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