JP7862005B2 - 環状ｒｎａ発現のための組成物および方法 - Google Patents

環状ｒｎａ発現のための組成物および方法

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関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年２月４日出願の米国仮特許出願第６２／９６９，７５８号に対する優先権を主張し、その内容は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府支援の説明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与されたＦｅｄｅｒａｌ Ｇｒａｎｔ Ｎｏ．Ｒ０１ＮＳ０９９３７１の下で政府の支持によりなされた。連邦政府は、本発明に対して特定の権利を有する。
電子的に提供された配列表の参照による組み込み
電子バージョンの配列表が、本明細書と共に提出され、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。この電子ファイルは、サイズが２３キロバイトであり、表題は２１＿２０００＿ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。
発明の背景
ＲＮＡモジュレーションは、いくつかの型の疾患の処置のための有望な治療的アプローチになっている。環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）は、治療的タンパク質および非コードＲＮＡの発現のための魅力的な鋳型である、高度に安定なＲＮＡ分子である。ｃｉｒｃＲＮＡは、種々の細胞機能および経路を直接的または間接的のいずれかでモジュレートする、さらなるレベルの制御を導入する。増え続ける証拠が、ｃｉｒｃＲＮＡが神経学的障害、アテローム硬化性血管疾患およびがんにおいて重要な役割を果たすことを示している。ｃｉｒｃＲＮＡの長い寿命およびＲＮＡ崩壊機構に対する耐性に加えて、少なくともこれらの理由のために、ｃｉｒｃＲＮＡベースの治療薬の開発への興味が増え続けている。
現在、治療的使用のための合成ｃｉｒｃＲＮＡの設計は欠如している。本開示は、治療的送達のための組換えＡＡＶベクターへとパッケージングされ得る、少なくとも２つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする組成物を含む合成ｃｉｒｃＲＮＡカセットの合理的設計を提供する。
本開示の概要
本開示は、一部、少なくとも２つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子、少なくとも２つのｃｉｒｃＲＮＡをコードする核酸分子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、医薬組成物、およびそれを対象に送達するための方法を提供する。
本開示の一態様は、少なくとも２つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子を提供する。一部の実施形態では、本明細書の組成物は、少なくとも２つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子を含み得、この核酸分子は、（ｉ）目的の第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列を有する第１のｃｉｒｃＲＮＡ、（ｉｉ）目的の第２のｃｉｒｃＲＮＡコード配列を有する第２のｃｉｒｃＲＮＡをさらに含み、第２のｃｉｒｃＲＮＡは、第１のｃｉｒｃＲＮＡ中の目的の第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列とタンデムであり、タンデムの目的の第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列および第２のｃｉｒｃＲＮＡに、イントロンエレメントが隣接している。一部の実施形態では、本明細書で開示される第１のｃｉｒｃＲＮＡは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）中、かつタンデムの目的の第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列および第２のｃｉｒｃＲＮＡに隣接するイントロンエレメントの外側の、プロモーター領域、３’ＵＴＲ中、かつタンデムの目的の第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列および第２のｃｉｒｃＲＮＡに隣接するイントロンエレメントの外側の、翻訳調節領域、またはそれらの任意の組合せをさらに有し得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物は、タンデムの目的の第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列および第２のｃｉｒｃＲＮＡに隣接するイントロンエレメントを有し得、かかるイントロンエレメントは、バックスプライスされて、ｃｉｒｃＲＮＡが共有結合的に閉環される部位において傷跡を形成することなしに少なくとも２つのｃｉｒｃＲＮＡを生じる。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される少なくとも２つのｃｉｒｃＲＮＡをコードする核酸分子のいずれか１つを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムを提供する。
本開示の別の態様は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を提供する。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶ粒子は、少なくとも１つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子を有する少なくとも１つのＡＡＶゲノムカセット、バックスプライシングカセット中にオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に先行する内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを包含する少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡを含み、バックスプライシングカセットは、目的の少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡコード配列を含む。一部の実施形態では、本明細書のＡＡＶ粒子は、目的の少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接するイントロン対をさらに含み得、目的の少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接するイントロン対は、約７５０ヌクレオチドの欠失を含む。一部の実施形態では、本明細書のＡＡＶ粒子は、目的の少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接するイントロン対をさらに含み得、目的の少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接するイントロン対は、約２５０ヌクレオチドの欠失を含む左イントロンおよび約５００ヌクレオチドの欠失を含む右イントロンを含む。
一部の実施形態では、本開示は、目的のｃｉｒｃＲＮＡコード配列を細胞に送達する方法であって、細胞を、本明細書で開示される組成物またはＡＡＶ粒子のいずれかに導入するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、目的のｃｉｒｃＲＮＡコード配列を組織に送達する方法であって、組織を、本明細書で開示される組成物またはＡＡＶ粒子のいずれかに導入するステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、対象における疾患または状態を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、本明細書の対象における疾患または状態を処置する方法は、本明細書で開示される組成物またはＡＡＶ粒子のいずれかの有効量を対象に投与するステップを含み、有効量は、対象における疾患または状態の少なくとも１つの症状を低減させる量である。
一部の実施形態では、本明細書の方法は、本明細書で開示される組成物またはＡＡＶ粒子のいずれかを組織に投与することによって、組織において少なくとも１つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）を発現させるステップを含み、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡの発現は、ベースラインと比較して実質的に増加し得る。一部の態様では、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡの発現は、ベースラインと比較して少なくとも２倍増加する。一部の他の態様では、少なくとも１つのＡＡＶ粒子が、心臓組織、肝臓組織、骨格筋組織、またはそれらの任意の組合せに送達された場合、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡの発現は、ベースラインと比較して少なくとも４倍増加する。一部の他の態様では、少なくとも１つのＡＡＶ粒子が骨格筋組織に送達された場合、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡの発現は、ベースラインと比較して少なくとも５０倍増加する。
一部の実施形態では、本明細書で開示される組成物またはＡＡＶ粒子のいずれかは、筋肉内注射、静脈内注射、冠動脈内注射、動脈内注射、またはそれらの任意の組合せによって投与され得る。
本開示のある態様は、本明細書で開示される本明細書で開示される組成物またはＡＡＶ粒子のいずれかおよび少なくとも１つの容器を含み得るキットを提供する。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の態様をさらに実証するために含まれ、かかる態様は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて図面を参照することによって、より良く理解され得る。
図１Ａ～１Ｑは、本開示の実施形態に従う、上流および下流イントロンが異なる、Ａｌｕエレメントとスプライス部位との間の距離要件を示す概略図、画像およびグラフである。図１Ａは、ＨＩＰＫ３遺伝子からイントロンの部分を抽出し、それらを分割ＧＦＰレポーターエクソンの周囲に配置することによって構築したレポーターの概略図を示す。イントロン中の逆位Ａｌｕ反復は相互作用し、バックスプライシングが起こるのを可能にして、ｃｉｒｃＲＮＡを形成した。ＩＲＥＳ配列の存在は、翻訳を駆動して、ＧＦＰタンパク質発現をもたらした。図１Ｂ～１Ｆは、ＨＩＰＫ３イントロンの左の配列挿入を示す概略図、画像およびグラフである。図１Ｂは、示された位置において左ＨＩＰＫ３イントロン中に挿入された１００ｎｔ～１，５００ｎｔの範囲の配列を有する構築物の概略図を示す。図１Ｃおよび１Ｄは、ＧＦＰ発現についてのウエスタンブロット解析を示し、図１Ｃは、ブロットの代表的画像を示し、図１Ｄは、ローディング対照としてアクチンを用いたブロットの定量化のグラフを示す。図１Ｅおよび１Ｆは、ＧＦＰ ＲＮＡについてプローブするノザンブロット解析を示し、図１Ｅは、ブロットの代表的画像を示し、図１Ｆは、ブロットの定量化のグラフを示す。図１Ｇ～１Ｋは、右ＨＩＰＫ３イントロン中への配列挿入を示す概略図、画像およびグラフである。図１Ｇは、示された位置において右ＨＩＰＫ３イントロン中に挿入された１００ｎｔ～１，５００ｎｔの範囲の配列を有する構築物の概略図を示す。図１Ｈおよび１Ｉは、ＧＦＰ発現についてのウエスタンブロット解析を示し、図１Ｈは、ブロットの代表的画像を示し、図１Ｉは、ローディング対照としてアクチンを用いたブロットの定量化のグラフを示す。図１Ｊおよび１Ｋは、ＧＦＰ ＲＮＡについてプローブするノザンブロット解析を示し、図１Ｊは、ブロットの代表的画像を示し、図１Ｋは、ブロットの定量化のグラフを示す。図１Ｌ～１Ｑは、ｔｒｉｃＲＮＡが右ＨＩＰＫ３イントロン中に挿入された場合のｔｒｉｃＲＮＡの形成を示す概略図、画像およびグラフである。図１Ｌは、右ＨＩＰＫ３イントロン中の同じ位置に挿入されたＢｒｏｃｃｏｌｉを含む環状ｔｒｉｃＲＮＡ（ｔｒｉｃＹ－Ｂｒｏｃｃｏｌｉ）の形成を駆動する配列を有する構築物の概略図を示す。図１Ｍは、ゲル電気泳動とその後のＤＦＨＢＩ－１Ｔ染色とによるｔｒｉｃＹ－Ｂｒｏｃｃｏｌｉ発現の検証を示すゲルの代表的画像を示す。図１Ｎおよび１Ｏは、ＧＦＰ発現についてのウエスタンブロット解析を示し、図１Ｎは、ブロットの代表的画像を示し、図１Ｏは、ローディング対照としてアクチンを用いたブロットの定量化のグラフを示す。図１Ｐおよび１Ｑは、ＧＦＰ ＲＮＡについてプローブするノザンブロット解析を示し、図１Ｐは、ブロットの代表的画像を示し、図１Ｑは、ブロットの定量化のグラフを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図２Ａ～２Ｃは、本開示の実施形態に従う、ＨＩＰＫ３（図２Ａ）、ラッカーゼ２（図２Ｂ）およびＺＫＳＣＡＮ１（図２Ｃ）イントロン対についての配列情報を示す概略図である。相補的領域とスプライス部位との間の距離は、概略図の上に示され、相補的領域およびスプライス部位の情報は、配列上にオーバーレイされている。 同上。
図３Ａ～３Ｅは、本開示の実施形態に従う、左Ａｌｕエレメントとスプライスアクセプター部位との間の距離の増加が、スプライス部位に対して遠位に挿入された場合であっても有害であったことを示す概略図、画像およびグラフである。図３Ａは、スプライス部位に対して遠位の部位において左ＨＩＰＫ３イントロン中に挿入された１００ｎｔ～１５００ｎｔの範囲の配列を有する構築物の概略図を示す。図３Ｂおよび３Ｃは、ＧＦＰ発現についてのウエスタンブロット解析を示し、図３Ｂは、ブロットの代表的画像を示し、図３Ｃは、ローディング対照としてアクチンを用いたブロットの定量化のグラフを示す。図３Ｄおよび３Ｅは、ＧＦＰ配列についてプローブするノザンブロット解析を示し、図３Ｄは、ブロットの代表的画像を示し、図３Ｅは、ブロットの定量化のグラフを示す。
図４Ａ～４Ｐは、本開示の実施形態に従う、イントロン配列の部分的短縮がｃｉｒｃＲＮＡ発現を増加させたことを示す概略図、画像およびグラフである。図４Ａは、ＨＩＰＫ３左および右イントロンの部分を欠失させた構築物の概略図を示し、欠失は、そのそれぞれのイントロンの始まりから番号付けされる。図４Ｂ～４Ｇは、以下の構築物によるトランスフェクションの４日後のＨＥＫ２９３細胞におけるＧＦＰ蛍光の代表的画像を示す：ＨＩＰＫ３分割ＧＦＰ（図４Ｂ）；ＬΔ４２－２６７（図４Ｃ）；ＲΔ１０－６５４（図４Ｄ）；ＲΔ１０－４９７（図４Ｅ）；ＲΔ１６１－６５４（図４Ｆ）；およびＬΔＲΔ（図４Ｇ）。図４Ｈおよび４Ｉは、ＧＦＰ発現についてのウエスタンブロット解析を示し、図４Ｈは、ブロットの代表的画像を示し、図４Ｉは、ローディング対照としてアクチンを用いたブロットの定量化のグラフを示す。図４Ｊおよび４Ｋは、ＧＦＰ ＲＮＡについてプローブするノザンブロット解析を示し、図４Ｊは、ブロットの代表的画像を示し、図４Ｋは、ブロットの定量化のグラフを示す。図４Ｌは、ＨＩＰＫ３イントロンから左または右のいずれかの部分的Ａｌｕエレメントを欠失させた構築物の概略図を示す。図４Ｍおよび４Ｎは、ＧＦＰ発現についてのウエスタンブロット解析を示し、図４Ｍは、ブロットの代表的画像を示し、図４Ｎは、ローディング対照としてアクチンを用いたブロットの定量化のグラフを示す。図４Ｏおよび４Ｐは、ＧＦＰ ＲＮＡについてプローブするノザンブロット解析を示し、図４Ｏは、ブロットの代表的画像を示し、図４Ｐは、ブロットの定量化のグラフを示す。 同上。 同上。
図５Ａ～５Ｈは、本開示の実施形態に従う、挿入および欠失の効果が神経膠芽腫および肝細胞癌細胞系において保存されたことを示す概略図、画像およびグラフである。図５Ａ～５Ｄは、示された構築物でトランスフェクトしたＵ８７神経膠芽腫細胞におけるＧＦＰ発現を示す。図５Ａおよび５Ｂは、ＧＦＰ発現についてのウエスタンブロット解析を示し、図５Ａは、ブロットの代表的画像を示し、図５Ｂは、ローディング対照としてアクチンを用いたブロットの定量化のグラフを示す。図５Ｃおよび５Ｄは、ＧＦＰ ＲＮＡについてプローブするノザンブロット解析を示し、図５Ｃは、ブロットの代表的画像を示し、図５Ｄは、ブロットの定量化のグラフを示す。図５Ｅ～５Ｈは、示された構築物でトランスフェクトしたＨｕｈ７肝細胞癌細胞におけるＧＦＰ発現を示す。図５Ｅおよび５Ｆは、ＧＦＰ発現についてのウエスタンブロット解析を示し、図５Ｅは、ブロットの代表的画像を示し、図５Ｆは、ローディング対照としてアクチンを用いたブロットの定量化のグラフを示す。図５Ｇおよび５Ｈは、ＧＦＰ ＲＮＡについてプローブするノザンブロット解析を示し、図５Ｇは、ブロットの代表的画像を示し、図５Ｈは、ブロットの定量化のグラフを示す。 同上。
図６Ａ～６Ｔは、本開示の実施形態に従う、ｃｉｒｃＲＮＡ形成に対するイントロンスペーシング効果が、ラッカーゼ２およびＺＫＳＣＡＮ１イントロン対において保存されたことを示す概略図、画像およびグラフである。図６Ａ～６Ｅは、示されたランダム化した配列挿入を有するＺＫＳＣＡＮ１イントロン対を含む構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＧＦＰ発現を示す。図６Ａは、配列挿入の位置を伴うＺＫＳＣＡＮ１構築物の概略図を示す。図６Ｂおよび６Ｃは、ＧＦＰ発現についてのウエスタンブロット解析を示し、図６Ｂは、ブロットの代表的画像を示し、図６Ｃは、ローディング対照としてアクチンを用いたブロットの定量化のグラフを示す。図６Ｄおよび６Ｅは、ＧＦＰ ＲＮＡについてプローブするノザンブロット解析を示し、図６Ｄは、ブロットの代表的画像を示し、図６Ｅは、ブロットの定量化のグラフを示す。図６Ｆ～６Ｊは、示されたランダム化した配列挿入を有するラッカーゼ２イントロン対を含む構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＧＦＰ発現を示す。図６Ｆは、配列挿入の位置を伴うラッカーゼ２構築物の概略図を示す。図６Ｇおよび６Ｈは、ＧＦＰ発現についてのウエスタンブロット解析を示し、図６Ｇは、ブロットの代表的画像を示し、図６Ｈは、ローディング対照としてアクチンを用いたブロットの定量化のグラフを示す。図６Ｉおよび６Ｊは、ＧＦＰ ＲＮＡについてプローブするノザンブロット解析を示し、図６Ｉは、ブロットの代表的画像を示し、図６Ｊは、ブロットの定量化のグラフを示す。図６Ｋ～６Ｏは、示された配列欠失を有するＺＫＳＣＡＮ１イントロン対を含む構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＧＦＰ発現を示す。図６Ｋは、配列欠失の位置を伴うＺＫＳＣＡＮ１構築物の概略図を示す。図６Ｌおよび６Ｍは、ＧＦＰ発現についてのウエスタンブロット解析を示し、図６Ｌは、ブロットの代表的画像を示し、図６Ｍは、ローディング対照としてアクチンを用いたブロットの定量化のグラフを示す。図６Ｎおよび６Ｏは、ＧＦＰ ＲＮＡについてプローブするノザンブロット解析を示し、図６Ｎは、ブロットの代表的画像を示し、図６Ｏは、ブロットの定量化のグラフを示す。図６Ｐ～６Ｔは、示された配列欠失を有するラッカーゼ２イントロン対を含む構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＧＦＰ発現を示す。図６Ｐは、配列欠失の位置を伴うラッカーゼ２構築物の概略図を示す。図６Ｑおよび６Ｒは、ＧＦＰ発現についてのウエスタンブロット解析を示し、図６Ｑは、ブロットの代表的画像を示し、図６Ｒは、ローディング対照としてアクチンを用いたブロットの定量化のグラフを示す。図６Ｓおよび６Ｔは、ＧＦＰ ＲＮＡについてプローブするノザンブロット解析を示し、図６Ｓは、ブロットの代表的画像を示し、図６Ｔは、ブロットの定量化のグラフを示す。 同上。 同上。 同上。
図７Ａ～７Ｒは、本開示の実施形態に従う、ＩＲＥＳエレメントが翻訳効率およびｃｉｒｃＲＮＡ発現レベルに影響を与えたことを示す概略図、画像およびグラフである。図７Ａは、ＥＭＣＶ、ポリオ、ＫＳＨＶ ｖＦＬＩＰまたはＨＣＶ ＩＲＥＳエレメントのいずれかを用いて創出したＨＩＰＫ３分割ＧＦＰ構築物の概略図を示す。図７Ｂ～７Ｅは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（図７Ｂ）；ポリオウイルスＩＲＥＳ（図７Ｃ）；ＫＳＨＶ ＩＲＥＳ（図７Ｄ）；およびＨＣＶ ＩＲＥＳ（図７Ｅ）を用いて創出したＨＩＰＫ３分割ＧＦＰ構築物によるトランスフェクションの４日後のＨＥＫ２９３細胞におけるＧＦＰ蛍光の代表的画像を示す。図７Ｆおよび７Ｇは、ＧＦＰ発現についてのウエスタンブロット解析を示し、図７Ｆは、ブロットの代表的画像を示し、図７Ｇは、ローディング対照としてアクチンを用いたブロットの定量化のグラフを示す。図７Ｈ～７Ｐは、示されたようにＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトし、シクロヘキシミド中で収集し、その後、スクロース勾配および分画を行った構築物を示し、矢頭は、ｃｉｒｃＲＮＡが検出された最後の画分をマークする。図７Ｈ～７Ｊは、画分を線によってマークした、ＨＩＰＫ３ ＥＭＣＶ構築物を有する勾配のＯＤ２５４トレースの代表的画像（図７Ｈ）；勾配から抽出し、ゲル電気泳動によって分離し、メンブレンに移し、メチレンブルーで染色してリボソームＲＮＡを可視化したＲＮＡ（図７Ｉ）；およびＧＦＰ ＲＮＡについてプローブした、図７Ｉに示されるのと同じメンブレン（図７Ｊ）を示す。図７Ｋ～７Ｍは、画分を線によってマークした、ＨＩＰＫ３ポリオ構築物を有する勾配のＯＤ２５４トレースの代表的画像（図７Ｋ）；勾配から抽出し、ゲル電気泳動によって分離し、メンブレンに移し、メチレンブルーで染色してリボソームＲＮＡを可視化したＲＮＡ（図７Ｌ）；およびＧＦＰ ＲＮＡについてプローブした、図７Ｌに示されるのと同じメンブレン（図７Ｍ）を示す。図７Ｎ～７Ｐは、画分を線によってマークした、ＨＩＰＫ３ ＫＳＨＶ構築物を有する勾配のＯＤ２５４トレースの代表的画像（図７Ｎ）；勾配から抽出し、ゲル電気泳動によって分離し、メンブレンに移し、メチレンブルーで染色してリボソームＲＮＡを可視化したＲＮＡ（図７Ｏ）；およびＧＦＰ ＲＮＡについてプローブした、図７Ｏに示されるのと同じメンブレン（図７Ｐ）を示す。図７Ｑおよび７Ｒは、ＧＦＰ配列についてプローブするノザンブロット解析を示し、図７Ｑは、ブロットの代表的画像を示し、図７Ｒは、ブロットの定量化のグラフを示す。図７Ｓは、ＲＮａｓｅ Ｒ（ＲｎＲ）によって消化した（＋）または消化しなかった（－）示された構築物から単離したＲＮＡ内のＧＦＰ ＲＮＡについてプローブする代表的ノザンブロットを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。
図８Ａ～８Ｆは、本開示の実施形態に従う、ＨＣＶ ＩＲＥＳおよび対照線状ＲＮＡを用いた翻訳効率を示す概略図、画像およびグラフである。図８Ａ～８Ｃは、画分を線によってマークした、ＨＩＰＫ３ ＨＣＶ構築物を有する勾配のＯＤ２５４トレースの代表的画像（図８Ａ）；勾配から抽出し、ゲル電気泳動によって分離し、メンブレンに移し、メチレンブルーで染色してリボソームＲＮＡを可視化したＲＮＡ（図８Ｂ）；およびＧＦＰ ＲＮＡについてプローブした、図８Ｂに示されるのと同じメンブレン（図８Ｃ）を示す。図８Ｄ～８Ｆは、画分を線によってマークした、ｃａｐ駆動性線状ＧＦＰ ｍＲＮＡ（ｌｉｎＧＦＰ）を有する勾配のＯＤ２５４トレースの代表的画像（図８Ｄ）；勾配から抽出し、ゲル電気泳動によって分離し、メンブレンに移し、メチレンブルーで染色してリボソームＲＮＡを可視化したＲＮＡ（図８Ｅ）；およびＧＦＰ ＲＮＡについてプローブした、図８Ｅに示されるのと同じメンブレン（図８Ｆ）を示す。
図９Ａ～９Ｈは、本開示の実施形態に従う、ＩＲＥＳ媒介性翻訳効率およびｃｉｒｃＲＮＡ発現が、神経膠芽腫および肝細胞癌細胞系において変動したことを示す概略図、画像およびグラフである。図９Ａ～９Ｄは、示された構築物でトランスフェクトしたＵ８７神経膠芽腫細胞におけるＧＦＰ発現を示す。図９Ａおよび９Ｂは、ＧＦＰ発現についてのウエスタンブロット解析を示し、図９Ａは、ブロットの代表的画像を示し、図９Ｂは、ローディング対照としてアクチンを用いたブロットの定量化のグラフを示す。図９Ｃおよび９Ｄは、ＧＦＰ ＲＮＡについてプローブするノザンブロット解析を示し、図９Ｃは、ブロットの代表的画像を示し、図９Ｄは、ブロットの定量化のグラフを示す。図９Ｅ～９Ｈは、示された構築物でトランスフェクトしたＨｕｈ７肝細胞癌細胞におけるＧＦＰ発現を示す。図９Ｅおよび９Ｆは、ＧＦＰ発現についてのウエスタンブロット解析を示し、図９Ｅは、ブロットの代表的画像を示し、図９Ｆは、ローディング対照としてアクチンを用いたブロットの定量化のグラフを示す。図９Ｇおよび９Ｈは、ＧＦＰ ＲＮＡについてプローブするノザンブロット解析を示し、図９Ｇは、ブロットの代表的画像を示し、図９Ｈは、ブロットの定量化のグラフを示す。 同上。
図１０Ａ～１０Ｇは、本開示の実施形態に従う、ＩＲＥＳエレメントがスプライシングに影響を与え、さらなるＲＮＡ種の形成に影響することを示す概略図、画像およびグラフである。図１０Ａは、バックスプライス接合部を標的化するオリゴヌクレオチドを用いて実施したＲＮａｓｅ Ｈ消化の代表的画像を示し、試料は、ノザンブロットによって解析し、ＧＦＰ ＲＮＡに対してプローブした。図１０Ｂは、ノザンブロットによって解析し、バックスプライス接合部に及ぶオリゴヌクレオチドを用いてプローブした示された構築物からのＲＮＡの代表的画像を示す。図１０Ｃおよび１０Ｄは、ノザンブロットによって解析し、ＧＦＰおよび特異的ＩＲＥＳ配列についてプローブしたＨＩＰＫ３ポリオ構築物（図１０Ｃ）およびＨＩＰＫ３ ＫＳＨＶ構築物（図１０Ｄ）からのＲＮＡの代表的画像を示す。図１０Ｅは、バックスプライスおよびリニアスプライスの両方の存在を小さいｃｉｒｃＲＮＡバンドで確認する、バックスプライス接合部（上）またはＩＲＥＳ配列（中央、ポリオウイルスＩＲＥＳ；下、ＫＳＨＶ ｖＦＬＩＰ ＩＲＥＳ）のいずれかに及ぶプライマーを用いた仮想ノザンブロットおよびＲＴ－ＰＣＲの代表的画像を示す。図１０Ｆおよび１０Ｇは、ＧＦＰについてプローブするノザンブロッティングによって解析した、小さいｃｉｒｃＲＮＡバンドを除去するようにスプライシングを改変した、ＨＩＰＫ３ポリオ構築物（図１０Ｆ）およびＨＩＰＫ３ ＫＳＨＶ構築物（図１０Ｇ）中の、図１０Ｅで同定されたスプライスドナー部位への突然変異の代表的画像を示し、全てのノザンブロットについて、＊は、小さい環状種を指す。 同上。
図１１Ａ～１１Ｐは、本開示の実施形態に従う、ｃｉｒｃＲＮＡサイズを発現の喪失なしに増加させることができたことを示す概略図、画像およびグラフである。図１１Ａは、元のＨＩＰＫ３構築物中またはＬΔＲΔイントロン対中のいずれかの、ＧＦＰ断片の終端においてエクソンに付加された自己切断性Ｐ２Ａペプチドとその後のｄｓＲｅｄ ＯＲＦとを有する構築物の概略図を示す。図１１Ｂ～１１Ｄは、以下の構築物によるトランスフェクションの４日後のＨＥＫ２９３細胞におけるＧＦＰ蛍光の代表的画像を示す：ＨＩＰＫ３分割ＧＦＰ（図１１Ｂ）；ＰＰ２Ａ ｄｓＲｅｄ（図１１Ｃ）；およびＬΔＲΔ ＰＰ２Ａ ｄｓＲｅｄ（図１１Ｄ）。図１１Ｂ～１１Ｄは、以下の構築物によるトランスフェクションの４日後のＨＥＫ２９３における赤色蛍光の代表的画像を示す：ＰＰ２Ａ ｄｓＲｅｄ（図１１Ｅ）およびＬΔＲΔ ＰＰ２Ａ ｄｓＲｅｄ（図１１Ｆ）。図１１Ｇおよび１１Ｈは、ＧＦＰ発現についてのウエスタンブロット解析を示し、図１１Ｇは、ブロットの代表的画像を示し、図１１Ｈは、ローディング対照としてアクチンを用いたブロットの定量化のグラフを示す。図１１Ｊ～１１Ｌは、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトし、シクロヘキシミド中で収集し、その後、スクロース勾配分画を行ったＨＩＰＫ３ポリオＰ２ＡｄｓＲｅｄ構築物の画像を示し、図１１Ｊは、画分を線によってマークした、勾配のＯＤ２５４トレースを示し；図１１Ｋは、勾配から抽出し、ゲル電気泳動によって分離し、メンブレンに移し、メチレンブルーで染色してリボソームＲＮＡを可視化したＲＮＡを示し；図１１Ｌは、ＧＦＰ ＲＮＡについてプローブした、図１１Ｋからと同じメンブレンを示す（矢頭は、ｃｉｒｃＲＮＡが検出された最後の画分をマークする）。図１１Ｍおよび１１Ｉは、ＧＦＰ ＲＮＡについてプローブするノザンブロット解析を示し、図１１Ｍは、ブロットの代表的画像を示し、図１１Ｉは、ブロットの定量化のグラフを示す。図１１Ｎは、ＲＮａｓｅ Ｒで処置し、次いで、ＧＦＰ ＲＮＡについてプローブするノザンブロットによって解析したＲＮＡを示す。図１１Ｏは、バックスプライス接合部を標的化するオリゴヌクレオチドを用いて実施したＲＮａｓｅ Ｈ（ＲｎＨ）消化を示し、試料は、ノザンブロットによって解析し、ＧＦＰ ＲＮＡに対してプローブした。図１１Ｐは、ノザンブロットによって解析し、バックスプライス接合部に及ぶオリゴヌクレオチドを用いてプローブしたＲＮＡを示す。 同上。 同上。 同上。
図１２Ａ～１２Ｌは、本開示の実施形態に従う、ＬΔＲΔイントロン対が、複数のマウス組織においてｉｎ ｖｉｖｏでｃｉｒｃＲＮＡ発現を増加させたことを示す概略図、画像およびグラフである。図１２Ａは、組換えＡＡＶ９ベクターへとパッケージングされた、Ｃ５７ＢＬ／６マウス中に静脈内注射した構築物の概略図を示す。図１２Ｂは、マウスラミンＢ２遺伝子座に対して標準化した、ＣＭＶプロモーターについての定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって各組織において定量化した細胞１つ当たりのＡＡＶベクターゲノムを示す。図１２Ｃおよび１２Ｄは、バックスプライス接合部に及ぶ、ＧＦＰを増幅するプライマーを用いて実施した定量的ＲＴ－ＰＣＲからの結果が、ＬΔＲΔイントロン対を用いたときのｃｉｒｃＲＮＡ発現の増加を明らかにしたことを示す。ｃｉｒｃＲＮＡ発現は、各組織において、ＧＡＰＤＨと比較して（図１２Ｃ）またはＨＩＰＫ３ポリオ発現に対して標準化して（図１２Ｄ）グラフ化されている。図１２Ｅ～１２Ｇは、ＨＩＰＫ３ポリオ（図１２Ｆ）およびＨＩＰＫ３ポリオΔΔ（図１２Ｇ）を注射したマウスから収集した組織中のＧＦＰ発現についての切片化した心組織の免疫蛍光染色を示し、図１２Ｅは、一次抗体で染色しなかった。図１２Ｈは、補正総細胞蛍光（ＣＴＣＦ）法によって定量化した、ＨＩＰＫ３ポリオまたはＨＩＰＫ３ポリオΔΔを注射したマウスから収集した心組織中のＧＦＰ発現のレベルを示すグラフを示す。図１２Ｉ～１２Ｋは、ＨＩＰＫ３ポリオ（図１２Ｊ）およびＨＩＰＫ３ポリオΔΔ（図１２Ｋ）を注射したマウスから収集した組織中のＧＦＰ発現についての切片化した骨格筋組織の免疫蛍光染色を示し、図１２Ｉは、一次抗体で染色しなかった。図１２Ｌは、補正総細胞蛍光（ＣＴＣＦ）法によって定量化した、ＨＩＰＫ３ポリオまたはＨＩＰＫ３ポリオΔΔを注射したマウスから収集した骨格筋組織中のＧＦＰ発現のレベルを示すグラフを示す。 同上。 同上。
図１３Ａ～１３Ｄは、本開示の実施形態に従う、ｃｉｒｃＲＮＡレポーターが、肝臓において低いＧＦＰタンパク質レベルを発現したことを示す画像である。図１３Ａおよび１３Ｂは、ＨＩＰＫ３ポリオを注射したマウスから収集した組織中のＧＦＰ発現についての切片化した肝臓組織の免疫蛍光染色を示し、図１３Ｂは、図１３Ａの拡大図である。図１３Ｃおよび１３Ｄは、ＨＩＰＫ３ポリオΔΔを注射したマウスから収集した組織中のＧＦＰ発現についての切片化した肝臓組織の免疫蛍光染色を示し、図１３Ｄは、図１３Ｃの拡大図である。
詳細な説明
ＲＮＡモジュレーションは、いくつかの型の疾患の処置のための有望な治療的アプローチになっており、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）は、急速に、治療的タンパク質および非コードＲＮＡの発現のための魅力的な鋳型になりつつある。本開示は、右イントロン内で許容される、少なくとも２つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子中へのさらなる挿入物を、単一の鋳型から二機能的ＲＮＡ分子を創出するために活用することができるという知見に、少なくとも一部基づく。具体的には、本開示は、バックスプライスされたｃｉｒｃＲＮＡ形成に影響を与えることなしにイントロン配列内に取り込まれ得るｔＲＮＡイントロン由来ｃｉｒｃＲＮＡを提供する。本明細書の知見は、治療的送達のための組換えＡＡＶベクターへとパッケージングされ得るアプタマー、ガイドＲＮＡ、タンパク質スポンジ、ｍｉＲＮＡスポンジ、タンパク質結合性ＲＮＡ、天然に存在するｃｉｒｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体、ｓｉＲＮＡ前駆体、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、機能的非コードＲＮＡ、例えば、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、Ｙ－ＲＮＡ、７ＳＫ ＲＮＡ、７Ｓ ＲＮＡなどの取込みを可能にする合成ｃｉｒｃＲＮＡの合理的設計を提供する。
Ｉ．定義
本開示の原理の理解を促進することを目的として、ここで、好ましい実施形態に対して参照がなされ、特定の言語がそれを記載するために使用される。それにもかかわらず、本開示の範囲の限定がそれによって意図されず、本明細書で例示される本開示のかかる変更およびさらなる改変が、本開示が関する分野の当業者に通常想起されることが企図されることが理解される。
本明細書で使用される場合、冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、その冠詞の文法的対象の１つまたは１つよりも多く（即ち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「１つの（ａｎ）要素」は、少なくとも１つの要素を意味し、１つよりも多くの要素を含み得る。
「約」は、所与の値が、所望の結果に影響を与えることなしに端点を「僅かに上回り」得るまたは「僅かに下回り」得ると定めることによって、数的範囲の端点に柔軟性を提供するために使用される。数値に関連した「約」という用語は、その数値が、その数値のプラスまたはマイナス５％またはそれ未満変動し得ることを意味している。
本明細書を通じて、文脈が他を要求しない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」ならびにバリエーション（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」）は、述べられた構成要素、特色、要素もしくはステップ、または構成要素、特色、要素もしくはステップの群を含むが、任意の他の整数もしくはステップ、または整数もしくはステップの群を排除しないことを暗示すると理解される。
本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連の列挙された項目のうち１つまたは複数の任意のおよび全ての可能な組合せ、ならびに選択肢として解釈される場合（「または」）には組合せの欠如を指し、それを包含する。
本明細書で使用される場合、過渡的な語句「～から本質的になる」（および文法的異形）は、列挙された材料またはステップを包含し、特許請求された発明の「基本的および新規の特徴（複数可）に実質的に影響を与えないもの」と解釈すべきである。したがって、用語「～から本質的になる」は、本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と等価と解釈すべきではない。
さらに、本開示は、一部の実施形態では、本明細書に示される任意の特色または特色の組合せが、排除または割愛され得ることも企図する。例示するために、複合体が構成要素Ａ、ＢおよびＣを含むことを本明細書が述べる場合、Ａ、ＢもしくはＣのいずれか、またはそれらの組合せが、単独でまたは任意の組合せで割愛および排除され得ることが、具体的に意図される。
本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書で他に示されない限り、その範囲内に入る各別々の値に個々に言及する簡略化した方法として機能することを意図しているに過ぎず、各別々の値は、本明細書中で個々に引用されているかのように、本明細書中に組み込まれる。例えば、濃度範囲が１％～５０％と述べられる場合、値、例えば、２％～４０％、１０％～３０％または１％～３％などが、本明細書で明示的に列挙されていると意図される。これらは、具体的に意図されるものの例に過ぎず、列挙された最低値と最高値との間でありかつそれらを含む数値の任意の可能な組合せが、本開示において明示的に述べられているとみなされる。
本明細書で使用される場合、「処置」、「治療」および／または「治療レジメン」は、患者によって呈されるまたは患者がそれに対して感受性であり得る疾患、障害または生理学的状態に応答してなされる臨床的介入を指す。処置の目的には、症状の軽減もしくは予防、疾患、障害もしくは状態の進行もしくは悪化の減速もしくは停止および／または疾患、障害もしくは状態の寛解が含まれる。
本明細書で使用される場合、「予防する」または「予防」は、介入の非存在下での開始または重症度の時間および／または程度と比較した、特定の疾患、障害もしくは生理学的状態の開始の除外もしくは遅延、または特定の疾患、障害もしくは生理学的状態の重症度の程度の低減を指す。
用語「有効量」または「治療有効量」は、有益なもしくは望ましい生物学的および／または臨床的結果をもたらすのに十分な量を指す。
本明細書で使用される場合、用語「対象」および「患者」は、本明細書で相互交換可能に使用され、ヒトおよび非ヒト動物の両方を指す。本開示の「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。一部の実施形態では、対象は、ヒトを含む。他の実施形態では、対象は、疾患または病気に対する処置を必要とするヒトを含む。
他に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
Ｉ．核酸分子組成物
ある特定の実施形態では、本開示は、共有結合的に閉環されている少なくとも１つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子を提供する。一部の実施形態では、本明細書の核酸分子は、以下のうち１つまたは複数を含む：ａ）非コードＲＮＡまたは翻訳可能なｍＲＮＡへと転写され得るｃｉｒｃＲＮＡコード配列；ｂ）ｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する１つまたは複数のイントロンエレメントであって、細胞スプライシング装置によってバックスプライスされて、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡを生じる、イントロンエレメント；ｃ）ｃｉｒｃＲＮＡコード配列から転写された翻訳可能なｍＲＮＡの翻訳を駆動する内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；ｄ）ｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接するイントロンエレメントの上流のプロモーター；およびｅ）３’ＵＴＲ中、かつｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接するイントロンエレメントの外側の、翻訳調節領域。
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも２つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子を提供する。一部の実施形態では、少なくとも２つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子を有する本明細書の組成物は、目的の第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列を有する第１のｃｉｒｃＲＮＡ、および目的の第２のｃｉｒｃＲＮＡコード配列を有する第２のｃｉｒｃＲＮＡを必要に応じて含み得、第２のｃｉｒｃＲＮＡは、第１のｃｉｒｃＲＮＡの目的の第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列とタンデムであり、一部の態様では、タンデムの目的の第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列および第２のｃｉｒｃＲＮＡに、イントロンエレメントが隣接し得る。
ある特定の実施形態では、目的の第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列を有する第１のｃｉｒｃＲＮＡは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含み得る。本明細書での使用に適切なＩＲＥＳの非限定的な例は、脳心筋炎（encephelomyocarditis）ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳ、ポリオウイルスＩＲＥＳ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）ｖＦＬＩＰ ＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＩＲＥＳ、またはそれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、本明細書での使用に適切なＩＲＥＳは、配列番号２６～２９のうちいずれか１つと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、１００％）の配列類似性を共有し得る。
ある特定の実施形態では、目的の第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列を有する第１のｃｉｒｃＲＮＡは、タンデムの第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列および第２のｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接するイントロンエレメントの上流のプロモーター領域をさらに含み得る。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、短縮型キメラＣＭＶ－ニワトリβ－アクチン（ｓｍＣＢＡ）プロモーター、哺乳動物β－アクチンプロモーター、アルブミンプロモーターなどであり得る。一部の実施形態では、プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ駆動性プロモーターであり得る。プロモーターは、一般に、当該分野で周知である。
ある特定の実施形態では、本明細書の核酸分子は、ＲＮＡポリメラーゼを動員することができる少なくとも１つのプロモーター領域を含み得る。プロモーターは、遺伝子の転写を開始させるための、ＤＮＡへのＲＮＡポリメラーゼの結合を制御する。現在、全てが異なる遺伝子を転写する公知の３つの型のＲＮＡポリメラーゼが存在する：ＲＮＡポリメラーゼＩ型は、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）をコードする遺伝子を転写することができ；ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を転写することができ；ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型は、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をコードする遺伝子を転写することができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型は、低分子ＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡおよびｇＲＮＡもまた転写することができる。一部の実施形態では、本明細書の核酸分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、またはそれらの任意の組合せを動員することができる少なくとも１つのプロモーター領域を含み得る。一部の実施形態では、本明細書の核酸分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型またはＩＩＩ型を動員することができるプロモーター領域を含み得る。
ある特定の実施形態では、目的の第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列を有する第１のｃｉｒｃＲＮＡは、３’ＵＴＲ中、かつタンデムの目的の第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列および第２のｃｉｒｃＲＮＡに隣接するイントロンエレメントの外側の、翻訳調節領域をさらに含み得る。
ある特定の実施形態では、目的の第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列を有する第１のｃｉｒｃＲＮＡは、ｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する１つまたは複数のイントロンエレメントを有し得、イントロンエレメントは、細胞スプライシング装置によってバックスプライスされて、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡを生じる。一部の実施形態では、本明細書のタンデムの本明細書の目的の第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列および第２のｃｉｒｃＲＮＡに隣接するイントロンエレメントは、バックスプライスされて、ｃｉｒｃＲＮＡが共有結合的に閉環される部位において傷跡を形成することなしに少なくとも２つのｃｉｒｃＲＮＡを生じる。本明細書で使用される場合、ｃｉｒｃＲＮＡ中の「傷跡」は、環状ＲＮＡを生じるためにイントロンエレメントが接続される部位において生成され得る。本開示では、本明細書の少なくとも２つのｃｉｒｃＲＮＡは、シームレスな環状ＲＮＡ（即ち、ｃｉｒｃＲＮＡが共有結合的に閉環される部位において傷跡を有さないｃｉｒｃＲＮＡ）を形成し得る。
ある特定の実施形態では、目的の第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列を有する第１のｃｉｒｃＲＮＡは、ｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する１つまたは複数のイントロンエレメントを有し得、１つまたは複数のイントロンエレメントは、配列番号１、２、６、７、１１、１２および２０～２５のうちいずれか１つと約８５％（例えば、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％）の配列類似性を共有し得る。
ある特定の実施形態では、目的の第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列を有する第１のｃｉｒｃＲＮＡは、ｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する１つまたは複数のイントロンエレメントを有し得、１つまたは複数のイントロンエレメントは、配列番号３、４、８、９、１３および／または１４のうちいずれか１つと約８５％（例えば、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％）の配列類似性を共有するＡｌｕエレメント（または相補的領域）を有し得る。ある特定の実施形態では、目的の第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列を有する第１のｃｉｒｃＲＮＡは、ｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する１つまたは複数のイントロンエレメントを有し得、１つまたは複数のイントロンエレメントは、配列番号５、１０および／または１５のうちいずれか１つと約８５％（例えば、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％）の配列類似性を共有するポリ－ピリミジントラクトを有し得る。ある特定の実施形態では、目的の第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列を有する第１のｃｉｒｃＲＮＡは、ｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する１つまたは複数のイントロンエレメントを有し得、１つまたは複数のイントロンエレメントは、以下のうちいずれか１つと約８５％（例えば、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％）の配列類似性を共有するスプライス部位を有し得る：ＣＡＧＧＴＡＧＧＴ（ＨＩＰＫ３）、ＣＡＧＧＴＡＡＧＴ（ラッカーゼ２）および／またはＣＡＧＧＴＡＡＧＡ（ＺＫＳＣＡＮ１）。
一部の実施形態では、目的の少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する本明細書のイントロンエレメントは、天然に存在する核酸配列中に１つまたは複数の挿入を有し得る。一部の態様では、本明細書の天然に存在する核酸配列イントロンエレメント中の１つまたは複数の挿入は、少なくとも約１～約１０００核酸の挿入であり得る。一部の態様では、本明細書の天然に存在する核酸配列イントロンエレメント中の１つまたは複数の挿入は、ｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する左側のイントロン中の少なくとも約１～約１０００核酸の挿入であり得る。一部の態様では、本明細書の天然に存在する核酸配列イントロンエレメント中の１つまたは複数の挿入は、ｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する右側のイントロン中の少なくとも約１～約１０００核酸の挿入であり得る。
一部の実施形態では、目的の少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する本明細書のイントロンエレメントは、天然に存在する核酸配列中に１つまたは複数の欠失を有し得る。一部の態様では、本明細書の天然に存在する核酸配列イントロンエレメント中の１つまたは複数の欠失は、少なくとも約１～約２０００核酸の欠失であり得る。一部の態様では、本明細書の天然に存在する核酸配列イントロンエレメント中の１つまたは複数の欠失は、ｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する左側のイントロン中の少なくとも約１～約２０００核酸の欠失であり得る。一部の態様では、本明細書の天然に存在する核酸配列イントロンエレメント中の１つまたは複数の欠失は、ｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する右側のイントロン中の少なくとも約１～約２０００核酸の欠失であり得る。
一部の実施形態では、目的の少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する本明細書のイントロン対は、少なくとも約５００ヌクレオチド（例えば、約５００ヌクレオチド、約５５０ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約６５０ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約８５０ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約９５０ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約１５００ヌクレオチド）の欠失を含み得る。一部の実施形態では、目的の少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する本明細書のイントロン対は、約１００～約５００（例えば、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００）ヌクレオチドの欠失を含む左イントロンを有し得る。一部の実施形態では、目的の少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する本明細書のイントロン対は、約２５０ヌクレオチドの欠失を含む左イントロンを有し得る。一部の実施形態では、目的の少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する本明細書のイントロン対は、約３００～約９００（例えば、約３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００）ヌクレオチドの欠失を含む右イントロンを有し得る。一部の実施形態では、目的の少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する本明細書のイントロン対は、約５００ヌクレオチドの欠失を含む右イントロンを有し得る。一部の実施形態では、目的の少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する本明細書のイントロン対は、約１００～約５００（例えば、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００）ヌクレオチドの欠失を含む左イントロンおよび約３００～約９００（例えば、約３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００）ヌクレオチドの欠失を含む右イントロンを有し得る。一部の実施形態では、目的の少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する本明細書のイントロン対は、約２５０ヌクレオチドの欠失を含む左イントロンおよび約５００ヌクレオチドの欠失を含む右イントロンを含む。
ある特定の実施形態では、少なくとも２つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子を有する本明細書の組成物は、バックスプライシングを介して少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡを産生することができ、自己スプライシングを介して少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡを産生することができる。一部の実施形態では、自己スプライシングを介して形成されるｃｉｒｃＲＮＡは、ｔＲＮＡイントロン環状ＲＮＡ、即ち「ｔｒｉｃＲＮＡ」であり得る。一部の実施形態では、少なくとも２つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子を有する本明細書の組成物は、１つまたは複数のｔｒｉｃＲＮＡを産生することができる。一部の実施形態では、少なくとも２つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子を有する本明細書の組成物は、約１～約５０個のｔｒｉｃＲＮＡ、約１～約４０個のｔｒｉｃＲＮＡ、１～約３０個のｔｒｉｃＲＮＡ、１～約２０個のｔｒｉｃＲＮＡ、１～約１０個のｔｒｉｃＲＮＡまたは１～約５個のｔｒｉｃＲＮＡを産生することができる。一部の実施形態では、少なくとも２つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子を有する本明細書の組成物は、配列番号１７～１８のうちいずれか１つと約８５％（例えば、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％）の配列類似性を有する１つまたは複数のｔＲＮＡイントロンを産生することができる。
一部の実施形態では、本明細書のｔＲＮＡイントロンエレメントは、任意の組合せで、ならびに任意の倍数および／または比で、任意の公知のｔＲＮＡイントロンエレメント（複数可）を含み得る。本明細書での使用に適切なｔＲＮＡイントロンエレメントの例には、Abelson et al., J Biol Chem. 273(21):12685-8 (1998)および／または Schmidt et al., Wiley Interdiscip Rev RNA. 11(3):e1583 (2020)に記載されるものが含まれ得、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、少なくとも２つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子を有する本明細書の組成物は、目的のｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する右イントロン中に核酸の挿入を有し得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物は、目的のｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する右イントロン中に核酸の挿入を有し得、挿入は、約０．１ｋｂ～約２．０ｋｂ（例えば、約０．１、０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０ｋｂ）であり得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物は、目的のｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する右イントロン中に核酸の挿入を有し得、挿入は、約１．５ｋｂであり得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物は、目的のｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する右イントロン中に核酸の挿入を有し得、挿入は、バックスプライシングを介して少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡを産生することができる。一部の実施形態では、本明細書の組成物は、目的のｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する右イントロン中に核酸の挿入を有し得、挿入は、自己スプライシングを介して少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡを産生することができる。一部の実施形態では、本明細書の組成物は、目的のｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する右イントロン中に核酸の挿入を有し得、挿入は、１つまたは複数のｔｒｉｃＲＮＡを産生することができる。
一部の実施形態では、少なくとも２つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子を有する本明細書の組成物は、アプタマー、ガイドＲＮＡ、タンパク質スポンジ、ｍｉＲＮＡスポンジ、タンパク質結合性ＲＮＡ、天然に存在するｃｉｒｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、機能的非コードＲＮＡ、例えば、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、Ｙ－ＲＮＡ、７ＳＫ ＲＮＡ、７Ｓ ＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せを各々がコードする１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡを産生することができる。一部の実施形態では、本明細書の組成物は、バックスプライシングを介して少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡを産生することができ、ｃｉｒｃＲＮＡは、アプタマー、ガイドＲＮＡ、タンパク質スポンジ、ｍｉＲＮＡスポンジ、タンパク質結合性ＲＮＡ、天然に存在するｃｉｒｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、機能的非コードＲＮＡ、例えば、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、Ｙ－ＲＮＡ、７ＳＫ ＲＮＡ、７Ｓ ＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せをコードし得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物は、自己スプライシングを介して少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡを産生することができ、ｃｉｒｃＲＮＡは、アプタマー、ガイドＲＮＡ、タンパク質スポンジ、ｍｉＲＮＡスポンジ、タンパク質結合性ＲＮＡ、天然に存在するｃｉｒｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、機能的非コードＲＮＡ、例えば、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、Ｙ－ＲＮＡ、７ＳＫ ＲＮＡ、７Ｓ ＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せをコードし得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物は、アプタマー、ガイドＲＮＡ、タンパク質スポンジ、ｍｉＲＮＡスポンジ、タンパク質結合性ＲＮＡ、天然に存在するｃｉｒｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、機能的非コードＲＮＡ、例えば、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、Ｙ－ＲＮＡ、７ＳＫ ＲＮＡ、７Ｓ ＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せをコードし得る１つまたは複数のｔｒｉｃＲＮＡを産生することができる。
一部の実施形態では、少なくとも２つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子を有する本明細書の組成物は、当該分野で公知の分子生物学の従来の技法（組換え技法を含む）を使用して作製され得る。かかる技法は、文献中、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；およびCell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press中で完全に説明されている。
ＩＩ．ＡＡＶウイルス粒子
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるｃｉｒｃＲＮＡのいずれかを対象に送達するためのビヒクルとしての使用のためのＡＡＶウイルス粒子を提供する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科のメンバーであり、小さい非エンベロープウイルスである。本明細書での使用に適切なＡＡＶ粒子は、一本鎖ＤＮＡゲノムを封入する、カプシドタンパク質サブユニットＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３から構成されたＡＡＶカプシドを含み得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶウイルス粒子は、本明細書で開示されるｃｉｒｃＲＮＡのいずれかを含み得る、一本鎖ＡＡＶ ＤＮＡベクターを保有し得る。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡコード配列は、ｃｉｒｃＲＮＡの発現を駆動する適切なプロモーターと作動可能な連結状態にあり得る。一部の例では、本明細書のＡＡＶ ＤＮＡベクターは、ｃｉｒｃＲＮＡの発現を調節する１つまたは複数の調節エレメント、例えば、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位、エンハンサー、転写因子結合部位、ポリＡシグナル伝達エレメント、またはそれらの組合せを含み得る。
（Ａ）ＡＡＶベクター
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶウイルス粒子は、本明細書で開示されるｃｉｒｃＲＮＡのうち１つまたは複数を発現するためのＡＡＶベクターを有し得る。ＡＡＶベクターは、分子的方法を使用してウイルス（例えば、ＡＡＶ）から野生型ゲノムを除去し、非ネイティブ核酸、例えば、異種ポリヌクレオチド配列（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡのコード配列）で置き換えることによって、ウイルス、例えばＡＡＶの野生型ゲノムから誘導される。典型的には、ＡＡＶベクターについて、野生型ＡＡＶゲノムの一方または両方の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列は、ＡＡＶベクター中に保持されるが、野生型ウイルスゲノムの他の部分は、保持されたＩＴＲ間で、異種ポリヌクレオチド配列などの非ネイティブ配列で置き換えられる。本明細書で開示されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶゲノム由来骨格エレメント、本明細書で開示されるｃｉｒｃＲＮＡのコード配列、およびコード配列と作動可能な連結状態にある適切なプロモーターを包含し得る。一部の例では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターは、コードされたタンパク質の発現および／または分泌を調節する調節配列をさらに含み得る。例には、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル部位、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする配列、ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的部位、またはそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。
一部の例では、本明細書のＡＡＶベクターは、一本鎖核酸を含む通常のＡＡＶベクターであり得る。他の例では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターは、その中に二本鎖部分を含むことが可能な自己相補的ＡＡＶベクターであり得る。
（１）ＡＡＶ骨格エレメント
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターは、１つまたは複数のＡＡＶゲノム由来骨格エレメントを有し得、この骨格エレメントは、ＡＡＶベクターの生物活性のために要求される最小限のＡＡＶゲノムエレメントを指す。例えば、ＡＡＶゲノム由来骨格エレメントは、ＡＡＶウイルス粒子へとアセンブルされるＡＡＶベクターのためのパッケージング部位、宿主細胞におけるベクター複製および／またはその中に含まれるｃｉｒｃＲＮＡコード配列の発現のために必要なエレメントを含み得る。
一部の例では、本明細書で開示されるＡＡＶベクター骨格は、少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含み得る。一部の例では、本明細書のＡＡＶベクター骨格は、２つのＩＴＲ配列を含む。一部の例では、１つのＩＴＲ配列は、ｃｉｒｃＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列の５’側にある。一部の例では、１つのＩＴＲ配列は、ｃｉｒｃＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列の３’側にある。一部の例では、本明細書のｃｉｒｃＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列には、ＩＴＲ配列がどちらの側からも隣接する。
一部の実施形態では、本明細書のＡＡＶベクターは、少なくとも１つの別個のＡＡＶ血清型に起源する配列または構成要素を含む。一部の例では、本明細書で開示されるＡＡＶベクター骨格は、１つの別個のＡＡＶ血清型由来のＩＴＲ配列を少なくとも含み得る。一部の例では、本明細書で開示されるＡＡＶベクター骨格は、１つの別個のヒトＡＡＶ血清型由来のＩＴＲ配列を少なくとも含み得る。かかるヒトＡＡＶは、任意の公知の血清型、例えば、血清型１～１１のうちいずれか１つに由来し得る。一部の例では、本明細書で使用されるＡＡＶ血清型は、中枢神経系（ＣＮＳ）、心組織、骨格筋および／または肝臓組織へのトロピズムを有する。一部の例では、本明細書で開示されるＡＡＶベクター骨格は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９のＩＴＲ配列を有し得る。
一部の実施形態では、本明細書のＡＡＶベクターは、シュードタイプ化ＡＡＶベクターであり得る（即ち、少なくとも２つの別個のＡＡＶ血清型に起源する配列または構成要素を含む）。一部の実施形態では、本明細書のシュードタイプ化ＡＡＶベクターは、１つのＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶゲノム骨格、および別個のＡＡＶ血清型に少なくとも一部由来するカプシドを含む。一部の例では、本明細書のシュードタイプ化ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ゲノム骨格、およびＣＮＳへのトロピズムを有するＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９）に由来するカプシドを有し得る。かかるシュードタイプ化ＡＡＶベクターの具体例には、ＡＡＶ５由来カプシド中にＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；またはＡＡＶ８由来カプシド中にＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；またはＡＡＶ９由来カプシド中にＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター、またはＡＡＶ１由来カプシド中にＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクターが含まれるがこれらに限定されない。
ウイルスベクター媒介性遺伝子移入の成功を解析するために、ベクターの分布およびベクター媒介性遺伝子発現の有効性の両方をモニタリングすることができることが重要であり得る。これは、レポーター遺伝子をウイルスベクター骨格中にサブクローニングすることによって達成され得る。一部の例では、本明細書で開示されるＡＡＶベクター骨格は、レポーター遺伝子を含み得る。いくつかのレポーター遺伝子が、この目的のために一般に使用され、それには、種々の色の蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）が含まれる）、Ｅ．ｃｏｌｉ β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、および種々の形態のルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）が含まれるがこれらに限定されない。一部の例では、本明細書で開示されるＡＡＶベクター骨格は、ＧＦＰを含み得る。
本明細書で開示されるベクター構築物は、公知の技法を使用して調製され得る（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel., F. et al., eds, Wiley and Sons, New York 1995を参照されたい）。断片長は、組換えゲノムがＡＡＶ粒子のパッケージング能力を超えないように選択され得る。必要に応じて、「スタッファー」ＤＮＡ配列が、比較目的のために標準的なＡＡＶゲノムサイズを維持するために、構築物に付加される。かかる断片は、かかる非ウイルス供給源、例えば、ｌａｃＺ、または当業者に公知であり利用可能な他の遺伝子に由来し得る。
（２）自己相補的ＡＡＶウイルスベクター
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターであり得る。自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターは、感染細胞中に進入した場合に自発的にアニーリング（それ自体に折り返されて二本鎖ゲノムを形成）することが可能な相補配列を含み、そうして、細胞のＤＮＡ複製装置を使用して一本鎖ＤＮＡベクターを変換する必要を回避する。自己相補するゲノムを有する本明細書のＡＡＶは、その部分的に相補する配列（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡコード配列の相補するコード鎖および非コード鎖）のおかげで、二本鎖ＤＮＡ分子をすぐに形成し得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるｓｃＡＡＶウイルスベクターは、第１の異種ポリヌクレオチド配列および第２の異種ポリヌクレオチド配列を含み得、これらは鎖内塩基対を形成することができる。一部の例では、第１の異種ポリヌクレオチド配列および第２の異種ポリヌクレオチド配列は、例えば、ヘアピンＤＮＡ構造を形成するように、鎖内塩基対合を促進する配列によって連結される。一部の例では、細胞に進入した際のｓｃＡＡＶベクターのダイマー構造は、２つの末端分離（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）部位（ｔｒｓ）のうち一方の突然変異または欠失によって安定化され得る。ｔｒｓは、各ＩＴＲ内に含まれるＲｅｐ結合部位であるので、かかるｔｒｓの突然変異または欠失は、モノマーを形成するための、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質によるｓｃＡＡＶベクターのダイマー構造の切断を防止し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されるｓｃＡＡＶウイルスベクターは、短縮型５’逆位末端反復（ＩＴＲ）、短縮型３’ＩＴＲ、または両方を含み得る。一部の例では、本明細書で開示されるｓｃＡＡＶベクターは、その中のＤ領域またはその一部分（例えば、その中の末端分離配列）が欠失され得る、短縮型３’ＩＴＲを含み得る。かかる短縮型３’ＩＴＲは、上述の第１の異種ポリヌクレオチド配列と第２の異種ポリヌクレオチド配列との間に位置し得る。
（３）プロモーター
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターは、発現のために必要なさらなるエレメント、例えば、ｃｉｒｃＲＮＡコード配列の発現を制御する少なくとも１つの適切なプロモーターを含む。かかるプロモーターは、感染組織におけるタンパク質の効率的かつ適切な産生を可能にするために、遍在性、組織特異的、強い、弱い、調節された、キメラなどであり得る。プロモーターは、コードされたタンパク質と相同、または細胞、ウイルス、真菌、植物もしくは合成プロモーターを含めて異種であり得る。本発明における使用のための最も好ましいプロモーターは、ヒト細胞中で機能的でなければならない。遍在性プロモーターの非限定的な例には、ウイルスプロモーター、特に、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなど、および細胞プロモーター、例えばＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーターが含まれる。一部の実施形態では、本明細書のウイルスプロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはそれらの任意の組合せであり得る。一部の実施形態では、本明細書のウイルスプロモーターは、以下の配列のうち１つを有し得る：
一部の実施形態では、本明細書のウイルスプロモーターは、配列番号４４～４５のうちいずれか１つと約８５％（例えば、約８５％、９０％、９５％、９９％、１００％）の配列類似性を共有し得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターは、発現のために必要なさらなるエレメント、例えば、適切な細胞の感染後にｃｉｒｃＲＮＡコード配列の発現を制御する少なくとも１つの適切なプロモーターを含む。本明細書での使用に適切なプロモーターには、ＡＡＶプロモーターに加えて、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたはニワトリベータアクチン／サイトメガロウイルスハイブリッドプロモーター（ＣＡＧ）、内皮細胞特異的プロモーター、例えば、ＶＥ－カドヘリンプロモーター、ならびにステロイドプロモーターおよびメタロチオネインプロモーターが含まれる。一部の実施形態では、本明細書で開示されるベクターにおいて使用されるプロモーターは、ＣＡＧプロモーターであり得る。
一部の実施形態では、本発明に従うｃｉｒｃＲＮＡコード配列は、発現されるｃｉｒｃＲＮＡコード配列に機能的に連結された組織特異的プロモーターを含む。したがって、本開示に従うベクターの、組織（例えば、脳、心臓、筋肉、肝臓）に対する特異性は、さらに増加し得る。一部の例では、本明細書で開示されるベクターは、特定の組織におけるその活性が、特定の組織ではない組織における活性よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍または１００倍高い、組織特異的プロモーターを有し得る。一部の例では、本明細書の組織特異的プロモーターは、ヒト組織特異的プロモーターである。一部の例では、発現カセットは、発現される外因性タンパク質の発現レベルを増加させるためのエンハンサーエレメントもまた含み得る。さらに、発現カセットは、ポリアデニル化配列、例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化配列またはウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列をさらに含み得る。一般に、組織特異的プロモーターは、当該分野で周知である。
（４）遺伝子発現のための他の調節エレメント
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターは、本発明によって産生されたプラスミドベクターでトランスフェクトされた細胞またはウイルスに感染した細胞におけるその転写、翻訳および／または発現を可能にする様式でｃｉｒｃＲＮＡコード配列に作動可能に連結した１つまたは複数の従来の制御エレメントを含み得る。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結した」配列は、ｃｉｒｃＲＮＡコード配列と連続した発現制御配列、およびｃｉｒｃＲＮＡコード配列を制御するようにトランスでまたは一定距離で作用する発現制御配列の両方を含む。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（即ち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに所望により、コードされた産物の分泌を増強する配列をさらに含み得る。ネイティブ、構成的、誘導性および／または組織特異的であるプロモーターを含む多数の発現制御配列が、当該分野で公知であり、利用され得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターは、ベクターのトロピズムを変更するために、非ウイルス起源のまたは構造的に改変されたタンパク質またはペプチドを含む改変されたカプシドを含み得る。例えば、カプシドは、それぞれその受容体またはリガンドを発現する細胞型（複数可）に向けてベクターを標的化するために、特定の受容体のリガンドまたは特定のリガンドの受容体を含み得る。
（Ｂ）ＡＡＶウイルス粒子の血清型
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶの種々の血清型から調製または誘導され得る。用語「血清型」は、他のＡＡＶ血清型とは血清学的に別個のカプシドを有するＡＡＶに関する区別である。血清学的弁別性は、他のＡＡＶと比較した、ＡＡＶに対する抗体間での交差反応性の欠如に基づいて決定される。交差反応性は、当該分野で公知の方法を使用して測定され得る。例えば、本明細書の交差反応性は、中和抗体アッセイを使用して測定され得る。このアッセイのために、ポリクローナル血清が、アデノ随伴ウイルスを使用して、ウサギまたは他の適切な動物モデルにおいて、特定のＡＡＶに対して生成される。このアッセイでは、特定のＡＡＶに対して生成された血清は、次いで、同じ（相同な）または異種のいずれかのＡＡＶを中和するその能力において試験される。５０％中和を達成する希釈は、中和抗体力価とみなされる。２つのＡＡＶについて、相同力価によって除算した異種力価の商が逆数様式で１６よりも低い場合、これら２つのベクターは、同じ血清型とみなされる。逆に、異種力価の相同力価に対する比が逆数様式で１６またはそれよりも高い場合、２つのＡＡＶは、別個の血清型とみなされる。
一部の例では、本明細書のＡＡＶベクターは、キメラ（例えば、シュードタイプ化）ＡＡＶウイルスを産生するために、少なくとも２つの血清型のＡＡＶが混合され得る、または他の型のウイルスと混合され得る。特定の実施形態では、本発明における使用のためのＡＡＶベクターは、ヒト血清型ＡＡＶベクターである。かかるヒトＡＡＶは、任意の公知の血清型、例えば、血清型１～１１のうちいずれか１つ、より好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６およびＡＡＶ９に由来し得る。かかるＡＡＶベクターの具体例は、ＡＡＶ１由来カプシド中にＡＡＶ１由来ゲノム（治療的タンパク質をコードする核酸に動作可能に連結した、ＡＡＶ１由来ＩＴＲおよびＡＡＶ１由来パッケージング配列、好ましくは、ＡＡＶ１由来パッケージング配列および治療的タンパク質をコードする核酸に隣接する２つのＡＡＶ１由来ＩＴＲを含む核酸分子）を含むベクター；ＡＡＶ２由来カプシド中にＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；ＡＡＶ４由来カプシド中にＡＡＶ４由来ゲノムを含むベクター；ＡＡＶ６由来カプシド中にＡＡＶ６由来ゲノムを含むベクター、またはＡＡＶ９由来カプシド中にＡＡＶ９由来ゲノムを含むベクターである。
（Ｃ）ＡＡＶ粒子を作製する方法
一部の実施形態では、本明細書のＡＡＶベクターは、標的細胞におけるｃｉｒｃＲＮＡコード配列発現のためにゲノムを送達するために使用され得るウイルス粒子へとパッケージングされ得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターは、一過的トランスフェクション、産生細胞系の使用、ウイルス特色をＡｄ－ＡＡＶハイブリッドへと組み合わせること、ヘルペスウイルス系の使用、またはバキュロウイルスを使用した昆虫細胞における産生によって、粒子へとパッケージングされ得る。
本明細書での使用のためのパッケージング細胞を生成する方法には、ＡＡＶ粒子産生に必要な構成要素の全てを安定に発現する細胞系を創出することが関与し得る。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠如するｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別のＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびに選択可能なマーカー、例えばネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノム中に組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加などの手順によって、または直接的平滑末端ライゲーションによって、細菌プラスミド中に導入されてきた。次いで、パッケージング細胞系に、ヘルパーウイルス、例えばアデノウイルスを感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に適切であることである。本明細書の適切な方法の例は、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞中に導入するために、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを使用する。
ＩＩＩ．医薬組成物
一部の実施形態では、本明細書で開示されるｃｉｒｃＲＮＡおよび／またはＡＡＶウイルス粒子のいずれかは、医薬組成物を形成するために製剤化され得る。一部の例では、本明細書の医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。本発明の方法において使用される医薬組成物のいずれかは、凍結乾燥された形成または水性溶液の形態中に、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を含み得る。
医薬組成物中の担体は、それが組成物の活性成分と適合性であり、好ましくは、活性成分を安定化することが可能であり、かつ処置される対象にとって有害ではないという意味で、「許容される」必要がある。例えば、「薬学的に許容される」は、生理学的に許容可能であり、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与された場合に望ましくない反応を典型的には生じないものを含む、組成物の分子実体および他の成分を指し得る。一部の例では、本明細書で開示される医薬組成物において使用される「薬学的に許容される」担体は、哺乳動物、より特にはヒトにおける使用ための、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されたもの、または米国薬局方もしくは他の一般に認識された薬局方中に列挙されたものであり得る。
緩衝剤を含む薬学的に許容される担体は、当該分野で周知であり、リン酸、クエン酸および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；アミノ酸；疎水性ポリマー；単糖；二糖；および他の炭水化物；金属錯体；ならびに／または非イオン性界面活性剤を含み得る。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hooverを参照されたい。
一部の実施形態では、医薬組成物または製剤は、非経口投与、例えば、静脈内、脳室内注射、大槽内注射、実質内注射、またはそれらの組合せのためのものである。かかる薬学的に許容される担体は、無菌液体、例えば、水、および石油、動物、植物または合成起源のものを含む油、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱物油などであり得る。食塩水溶液ならびに水性デキストロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびグリセロール溶液もまた、特に、注射可能な溶液のために、液体担体として使用され得る。本明細書で開示される医薬組成物は、さらなる成分、例えば、防腐剤、緩衝剤、等張化剤、抗酸化剤および安定剤、非イオン性湿潤剤または清澄剤、粘度増加剤などをさらに含み得る。本明細書に記載される医薬組成物は、単一の単位投薬量または多投薬量形態で包装され得る。
非経口投与に適切な製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および製剤を意図したレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水性および非水性の無菌注射溶液；ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁物が含まれる。水溶液は、適切に緩衝され得る（好ましくは、３～９のｐＨに）。無菌条件下での適切な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技法によって容易に達成される。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される医薬組成物は、無菌でなければならない。これは、例えば、無菌濾過メンブレンを介した濾過によって、容易に達成される。無菌の注射可能な溶液は、一般に、上で列挙した種々の他の成分と共に、適切な溶媒中に活性薬（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ、ＡＡＶ粒子、ｃｉｒｃＲＮＡおよび／またはＡＡＶ粒子を含む組成物など）を要求される量で取り込み、その後、必要に応じて濾過無菌化することによって調製される。一般に、分散物は、無菌化された活性成分を、基本的分散媒および上で列挙したものからの要求される他の成分を含む無菌ビヒクル中に取り込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、前もって無菌濾過されたその溶液から、活性成分＋任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥およびフリーズドライ技法である。
本明細書で開示される医薬組成物は、他の成分、例えば、希釈剤およびアジュバントもまた含み得る。許容される担体、希釈剤およびアジュバントは、使用される投薬量および濃度においてレシピエントにとって非毒性であり、好ましくは不活性であり、それには、緩衝剤、例えば、リン酸、クエン酸もしくは他の有機酸；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトールもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃもしくはポリエチレングリコールが含まれる。
ＩＶ．使用の方法
本明細書に記載される組成物（例えば、１つ、２つまたはそれよりも多くの環状ＲＮＡをコードする核酸分子、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶゲノム）のいずれかが、疾患または状態を軽減および／または処置するために使用され得る。したがって、一部の態様では、本開示は、本明細書で開示される処置組成物を必要とする対象における１つもしくは複数の症状を軽減するためおよび／または疾患もしくは状態を処置するための方法、ならびに処置組成物を含む医薬組成物を提供する。本明細書で開示される方法を使用して処置され得る例示的な疾患または状態には、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質）および肺の他の疾患、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子）、サラセミア（β－グロビン）、貧血（エリスロポエチン）および他の血液障害、アルツハイマー病（ＧＤＦ；ネプリライシン）、多発性硬化症（β－インターフェロン）、パーキンソン病（グリア細胞系由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ］）、ハンチントン病（反復を除去するためのＲＮＡｉ）、筋萎縮性側索硬化症、てんかん（ガラニン、神経栄養因子）および他の神経学的障害、がん（エンドスタチン、アンジオスタチン、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ－リガンド、インターフェロンを含むサイトカイン；ＶＥＧＦまたは多剤耐性遺伝子産物に対するＲＮＡｉを含むＲＮＡｉ、ｍｉｒ－２６ａ［例えば、肝細胞癌について］）、糖尿病（インスリン）、デュシェンヌ型（ジストロフィン、ミニ－ジストロフィン、インスリン様増殖因子Ｉ、サルコグリカン［例えば、ａ、β、γ］、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、抗炎症ポリペプチド、例えば、ＩカッパＢ優性突然変異体、サルコスパン（ｓａｒｃｏｓｐａｎ）、ユートロフィン、ミニ－ユートロフィン、エクソンスキッピングを誘導するためのジストロフィン遺伝子中のスプライス接合部に対するアンチセンスまたはＲＮＡｉ（例えば、ＷＯ２００３／０９５６４７を参照されたい）、エクソンスキッピングを誘導するためのＵ７ ｓｎＲＮＡに対するアンチセンス（例えば、ＷＯ２００６／０２１７２４を参照されたい）、およびミオスタチンに対する抗体もしくは抗体断片またはミオスタチンプロペプチド）およびベッカー型を含む筋ジストロフィー、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、ハーラー病（α－Ｌ－イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠損症（アデノシンデアミナーゼ）、糖原病（例えば、ファブリー病［ａ－ガラクトシダーゼ］およびポンペ病［ライソゾーム酸α－グルコシダーゼ］）および他の代謝障害、先天性肺気腫（α１－アンチトリプシン）、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、テイ・サックス病（リソソームヘキソサミニダーゼＡ）、メープルシロップ尿症（分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ）、網膜変性疾患（ならびに目および網膜の他の疾患；例えば、黄斑変性のためのＰＤＧＦおよび／あるいはバソヒビンもしくはＶＥＧＦの他の阻害剤、または例えばＩ型糖尿病における網膜障害を処置／予防するための他の血管新生阻害剤）、固形臓器の疾患、例えば、脳（パーキンソン病［ＧＤＮＦ］、星状細胞腫［エンドスタチン、アンジオスタチンおよび／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］、神経膠芽腫［エンドスタチン、アンジオスタチンおよび／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］を含む）、肝臓、腎臓、うっ血性心不全または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を含む心臓（例えば、タンパク質ホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ－ｌ）およびその断片（例えば、ＩＩＣ）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、Ｐ２アドレナリン受容体、ｐ２アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド－３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、Ｇ－タンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンをもたらす分子、例えば、短縮型の構成的に活性なｂＡＲＫｃｔ；カルサルシン（ｃａｌｓａｒｃｉｎ）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバン阻害またはドミナントネガティブ分子、例えば、ホスホランバンＳ１６Ｅなどを送達することによる）、関節炎（インスリン様増殖因子）、関節障害（インスリン様増殖因子１および／または２）、内膜過形成（例えば、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓを送達することによる）、心臓移植片の生存の改善（スーパーオキシドジスムターゼ）、ＡＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）、筋消耗（インスリン様増殖因子Ｉ）、腎臓欠損症（エリスロポエチン）、貧血（エリスロポエチン）、関節炎（抗炎症因子、例えば、ＩＲＡＰおよびＴＮＦａ可溶性受容体）、肝炎（ａ－インターフェロン）、ＬＤＬ受容体欠損症（ＬＤＬ受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、クラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ）、バッテン病、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２およびＳＣＡ３を含む脊髄大脳失調症、フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自己免疫疾患などが含まれ得るがこれらに限定されない。
本明細書で開示される方法を実施するために、組成物（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ、ＡＡＶ粒子）またはそれを含む医薬組成物の治療有効量が、本明細書で開示される適切な量で、適切な経路（例えば、筋肉内、静脈内、脳室内注射、大槽内注射、硝子体内、網膜下、結膜下、球後、前房内、上脈絡膜、冠動脈内注射、動脈内注射および／または実質内注射）を介して、処置を必要とする対象に投与され得る。
ある特定の実施形態では、本開示は、核酸分子を細胞中に導入する方法であって、細胞を、本明細書で開示されるウイルスベクターおよび／または組成物と接触させるステップを含む方法もまた提供する。一部の実施形態では、本明細書の方法は、本明細書の核酸分子を眼細胞に送達するステップを含み得、これは、眼の細胞または層を、本明細書で開示されるウイルスベクターと接触させることを含み、ウイルスベクターは、目的の核酸分子を含む。この方法の一部の実施形態では、目的の核酸分子は、治療的タンパク質または治療的ＲＮＡをコードし得る。一部の実施形態では、治療的タンパク質は、モノクローナル抗体または融合タンパク質であり得る。
ある特定の実施形態では、本開示は、核酸分子を、心臓組織、肝臓組織、骨格筋組織、またはそれらの任意の組合せに導入する方法であって、細胞を、本明細書で開示されるウイルスベクターおよび／または組成物と接触させるステップを含む方法もまた提供する。一部の実施形態では、本明細書の核酸分子は、本明細書の１つまたは複数の核酸分子を有するＡＡＶ粒子を、心臓組織、肝臓組織、骨格筋組織、またはそれらの任意の組合せに投与することによって、特定の組織に送達され得る。
一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の核酸分子を有する少なくとも１つのＡＡＶ粒子を組織に投与する方法は、ベースラインと比較して、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡの発現を実質的に増加させる。本明細書で使用される場合、「ベースライン」は、１つまたは複数の核酸分子を有するＡＡＶ粒子が投与される前の、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡ（およびｃｉｒｃＲＮＡのコードされた産物）の発現を指す。本明細書で使用される場合、「発現を実質的に増加させる」は、ベースラインと比較して、発現における少なくとも１倍の変化を指す。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の核酸分子を有する少なくとも１つのＡＡＶ粒子を組織に投与する方法は、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡの発現を、ベースラインと比較して、少なくとも約２倍～約５０倍（例えば、約２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍）増加させる。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の核酸分子を有する少なくとも１つのＡＡＶ粒子を組織に投与する方法は、少なくとも１つのＡＡＶ粒子が、心臓組織、肝臓組織、骨格筋組織、またはそれらの任意の組合せに送達された場合、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡの発現を、ベースラインと比較して、少なくとも約２倍～約５０倍（例えば、約２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍）増加させる。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の核酸分子を有する少なくとも１つのＡＡＶ粒子を組織に投与する方法は、少なくとも１つのＡＡＶ粒子が、心臓組織、肝臓組織、またはそれらの任意の組合せに送達された場合、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡの発現を、ベースラインと比較して、少なくとも約４倍増加させる。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の核酸分子を有する少なくとも１つのＡＡＶ粒子を組織に投与する方法は、少なくとも１つのＡＡＶ粒子が骨格筋組織に送達された場合、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡの発現を、ベースラインと比較して、少なくとも約５０倍増加させる。
本明細書で開示される方法のいずれかでは、本明細書に記載される組成物（例えば、１つ、２つまたはそれよりも多くの環状ＲＮＡをコードする核酸分子、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶゲノム）の有効量が、疾患およびまたは状態に関連する１つまたは複数の症状を軽減するために、それを必要とする対象に与えられ得る。「有効量」は、本明細書で使用される場合、疾患およびまたは状態を有する対象に対して治療効果を付与するのに十分な、開示される組成物の用量を指す。一部の実施形態では、有効量は、対象における疾患または状態の少なくとも１つの症状を低減させる量であり得る。
Ｖ．キット
本開示は、本明細書に記載される組成物（例えば、１つ、２つまたはそれよりも多くの環状ＲＮＡをコードする核酸分子、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶゲノム）のいずれか１つを調製する際の使用のためのキット、および本明細書に記載される１つまたは複数の治療的用途を有するキットもまた提供する。本明細書に記載される使用のためのキットは、医薬組成物中に製剤化された本明細書に記載される組成物（例えば、１つ、２つまたはそれよりも多くの環状ＲＮＡをコードする核酸分子、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶゲノム）をさらに含む１つまたは複数の容器を含み得る。
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法のいずれかにおける組成物（例えば、１つ、２つまたはそれよりも多くの環状ＲＮＡをコードする核酸分子、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶゲノム）の使用のための使用説明書をさらに含み得る。含まれる使用説明書は、対象において意図した活性を達成するための、対象への組成物またはそれを含む医薬組成物の投与の記載を含み得る。キットは、対象が処置を必要とするかどうかの同定に基づいて、処置に適切な対象の選択に関する記載をさらに含み得る。本明細書に記載される組成物の使用に関する使用説明書は、一般に、意図した処置のための投薬量、投薬スケジュールおよび投与の経路に関する情報を含む。
容器は、単位用量、バルク包装（例えば、多用量包装）またはサブ単位用量であり得る。本開示のキット中で提供される使用説明書は、典型的には、ラベルまたは添付文書上の書面による使用説明書である。ラベルまたは添付文書は、医薬組成物が、対象における疾患もしくは障害を処置する、開始を遅延させる、および／または疾患もしくは障害を軽減するために使用されることを示す。
本明細書で提供されるキットは、適切な包装中にある。適切な包装には、バイアル、ボトル、ジャー、可撓性包装などが含まれるがこれらに限定されない。特定のデバイス、例えば、吸入器、鼻投与デバイスまたは注入デバイスと組み合わせた使用のための包装もまた企図される。キットは、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。容器もまた、無菌アクセスポートを有し得る。
キットは、さらなる構成要素、例えば、緩衝剤および説明的情報を必要に応じて提供し得る。通常、キットは、容器、および容器上のまたは容器に関連したラベルまたは添付文書（複数可）を含む。一部の実施形態では、本開示は、上記キットの内容物を含む製造品を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子であって、ａ）非コードＲＮＡまたは翻訳可能なｍＲＮＡへと転写され得る目的の遺伝子；ｂ）目的の遺伝子に隣接するイントロンエレメントであって、細胞スプライシング装置によってバックスプライスされて、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡを生じる、イントロンエレメント；ｃ）目的の遺伝子から転写された翻訳可能なｍＲＮＡの翻訳を駆動する内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；ｄ）５’非翻訳領域（ＵＴＲ）中、かつ目的の遺伝子に隣接するイントロンエレメントの外側の、プロモーター領域；およびｅ）３’ＵＴＲ中、かつ目的の遺伝子に隣接するイントロンエレメントの外側の、翻訳調節領域を含む、核酸分子を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子であって、ａ）非コードＲＮＡまたは翻訳可能なｍＲＮＡへと転写され得るｃｉｒｃＲＮＡコード配列；ｂ）ｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接するイントロンエレメントであって、細胞スプライシング装置によってバックスプライスされて、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡを生じる、イントロンエレメント；ｃ）ｃｉｒｃＲＮＡ生成のための自己スプライシング機構を必要に応じて含むｃｉｒｃＲＮＡコード配列から転写された翻訳可能なｍＲＮＡの翻訳を駆動する内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；ｄ）ｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接するイントロンエレメントの上流のプロモーター領域；およびｅ）３’ＵＴＲ中、かつｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接するイントロンエレメントの外側の、翻訳調節領域を含む、核酸分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、（ｂ）のイントロンエレメント（即ち、目的の遺伝子に隣接するイントロンエレメント）が、それらの任意の組合せで、ならびに任意の倍数および／または比で、配列番号１、２、６、７、１１および／または１２のいずれかのヌクレオチド配列を含む、核酸分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、（ｂ）のイントロンエレメント（即ち、ｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接するイントロンエレメント）が、それらの任意の組合せで、ならびに任意の倍数および／または比で、配列番号２０～２５のいずれかのヌクレオチド配列を含む、核酸分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、（ｃ）のＩＲＥＳが、それらの任意の組合せで、ならびに任意の倍数および／または比で、配列番号２６～２９のいずれかのヌクレオチド配列を含む、核酸分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、（ｅ）の翻訳調節領域が、ｃｉｒｃＲＮＡを安定化するポリアデニル化（ポリＡ）配列および／または構造的エレメントである、核酸分子を提供する。
例えば、ある特定の実施形態では、開示される核酸分子は、ウイルスＩＲＥＳ、例えば、以下の表１に列挙したウイルスＩＲＥＳなどを含み得る。
例えば、ある特定の実施形態では、開示される核酸分子は、細胞ＩＲＥＳ、例えば、以下の表２に列挙した細胞ＩＲＥＳなどを含み得る。
ある態様では、開示される核酸分子は、１つまたは複数のＩＲＥＳ、例えば、ウイルスＩＲＥＳまたは細胞ＩＲＥＳなどの組合せを含み得る。ある態様では、１つまたは複数のＩＲＥＳの組合せは、１つまたは複数のウイルスＩＲＥＳを含む。ある態様では、１つまたは複数のＩＲＥＳの組合せは、１つまたは複数の細胞ＩＲＥＳを含む。ある態様では、１つまたは複数のＩＲＥＳの組合せは、ウイルスＩＲＥＳおよび細胞ＩＲＥＳの両方を含む。ある特定の実施形態では、本開示は、それらの任意の組合せで、ならびに任意の倍数および／または比でＩＲＥＳを含む核酸分子であって、ＩＲＥＳが、表１に列挙したウイルスＩＲＥＳ、表２に列挙した細胞ＩＲＥＳである、核酸分子を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）が隣接する本明細書で開示される核酸分子のいずれか１つを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムを提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるＡＡＶゲノムを含むＡＡＶカプシドまたは粒子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される核酸分子のいずれかを含むＡＡＶカプシドまたは粒子を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、薬学的に許容される担体中に、本明細書で開示される核酸分子のいずれか、本明細書で開示されるＡＡＶゲノムのいずれかおよび／または本明細書で開示されるＡＡＶカプシドもしくは粒子のいずれかを含む組成物を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞において共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ分子を発現させる方法であって、本明細書で開示される核酸分子のいずれか１つを、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ分子が転写および／または産生される条件下で細胞中に導入するステップを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞において共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ分子を発現させる方法であって、本明細書で開示されるＡＡＶゲノムのいずれかを、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ分子が転写される条件下で細胞中に導入するステップを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞において共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ分子を発現させる方法であって、本明細書で開示されるＡＡＶカプシドまたは粒子のいずれかを、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ分子が転写される条件下で細胞中に導入するステップを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞において共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ分子を発現させる方法であって、本明細書で開示される組成物のいずれかを、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ分子が転写される条件下で細胞中に導入するステップを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ分子を、組織特異的および／または細胞特異的様式で発現させる方法であって、組織および／または細胞を、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ分子が発現される条件下で、本明細書で開示される核酸分子のいずれかと接触させるステップを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ分子を、組織特異的および／または細胞特異的様式で発現させる方法であって、組織および／または細胞を、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ分子が発現される条件下で、本明細書で開示されるＡＡＶゲノムのいずれかと接触させるステップを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ分子を、組織特異的および／または細胞特異的様式で発現させる方法であって、組織および／または細胞を、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ分子が発現される条件下で、本明細書で開示されるＡＡＶカプシドまたは粒子のいずれかと接触させるステップを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ分子を、組織特異的および／または細胞特異的様式で発現させる方法であって、組織および／または細胞を、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ分子が発現される条件下で、本明細書で開示される組成物のいずれかと接触させるステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ分子が、タンパク質をコードする治療的ｍＲＮＡ分子、ＲＮＡサイレンシング分子、ゲノムエレメントを標的化し得るガイドＲＮＡ分子、ＲＮＡ転写物を標的化し得るガイドＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ分子、長鎖非コードＲＮＡ分子、アンチセンスＲＮＡ分子、またはそれらの任意の組合せである、本明細書の方法のいずれかを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、共有結合的に閉環された環状ＲＮＡ分子が、天然に存在するｃｉｒｃＲＮＡ分子、機能的非コードＲＮＡ分子、またはそれらの任意の組合せである、本明細書の方法のいずれかを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、細胞および／または組織が哺乳動物由来である、本明細書の方法のいずれかを提供する。
本開示は、その具体的な実施形態を参照して記載されてきたが、本開示の真の精神および範囲から逸脱することなしに種々の変化がなされ得ることおよび均等物が置換され得ることが、当業者によって理解されるはずである。さらに、多くの改変が、特定の状況、材料、物質の組成物、プロセス、プロセスステップ（単数または複数）を本開示の目的、精神および範囲に適応させるためになされ得る。全てのかかる改変が、本開示の範囲内であることが意図される。
（実施例１）
バックスプライシングイントロンは、挿入を許容して、二重ｃｉｒｃＲＮＡ発現を可能にする
バックスプライシングを媒介するイントロンの共通の特色は、逆位Ａｌｕエレメントまたは他の相補配列の存在である。これらの相補的領域とスプライスドナー／アクセプター部位との間の距離がｃｉｒｃＲＮＡのバックスプライシングにどのように影響を与えるかを調べるために、分割ＧＦＰエクソンの環状化を駆動するためのＨＩＰＫ３遺伝子由来のイントロンを含む、図１Ａに示されるレポーター系を鋳型として使用した。
簡潔に述べると、図１Ａに示されるレポーター系を生成するために、ＨＩＰＫ３発現プラスミドを最初に生成した。ＨＩＰＫ３発現プラスミドを生成するために、ヒトＨＩＰＫ３遺伝子配列の部分を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター中に挿入した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターは、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）がフォワード（＋）配向である、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有する哺乳動物発現ベクターである。天然に存在するＨＩＰＫ３イントロン配列を使用する新たなベクターカセットを、マルチクローニング部位によって分離されたプラスミド骨格中にそれらをクローニングすることによって構築した。図２Ａは、新たなベクターカセット中で使用したＨＩＰＫ３イントロン配列を示す。ＩＲＥＳ（例えば、ＥＭＣＶ、ポリオ、ＫＳＨＶまたはＨＣＶ）および分割ＧＦＰを含むカセットを、イントロン配列間にクローニングした。本明細書の実施例で使用した分割ＧＦＰカセットは、Wang and Wang, RNA. 2015;21(2):172-179に開示された方法と類似の方法を使用してｃｉｒｃＧＦＰプラスミドから誘導したものであり、その開示は、その全体が本明細書に組み込まれる。
天然に存在するＨＩＰＫ３イントロン配列を使用するレポーター系に加えて、他のレポーター系を、ラッカーゼ２およびＺＫＳＣＡＮ１のイントロン配列を使用したことを除いて上記方法と類似の方法を使用して生成した。図２Ｂおよび２Ｃは、これらの新たなベクターカセットにおいて使用した、それぞれラッカーゼ２およびＺＫＳＣＡＮ１のイントロン配列を示す。ＨＩＰＫ３、ラッカーゼ２およびＺＫＳＣＡＮ１のイントロン配列を使用するレポーター系についての配列は、表３に提供される。
図１Ａに示されるように、得られた構築物は、分割ＧＦＰレポーターエクソンの周囲に配置されたＨＩＰＫ３遺伝子由来のイントロンの部分を含んだ。イントロン中の逆位Ａｌｕ反復は相互作用し、バックスプライシングが起こるのを可能にして、ｃｉｒｃＲＮＡを形成した。ＩＲＥＳ配列の存在は、翻訳を駆動して、ＧＦＰタンパク質発現をもたらした。
イントロン中のスペーシングの影響をプローブするために、各Ａｌｕエレメントとスプライス部位との間の距離を、人工的に増加させた。ＨＩＰＫ３イントロンの内容と類似のヌクレオチド内容（例えば、Ｇ／Ｃ）を有するが、いずれの強い予測された二次構造をも欠く、１００～１，５００ｎｔの範囲のランダム挿入物を設計した。挿入物設計がこの基準を満たしたところで、次いで、左および右イントロンについて１．５ｋｂのランダム化した配列を合成した。ＰＣＲおよび制限クローニングを使用して、配列をイントロンまたはエクソン中に挿入した。必要に応じて、部位特異的突然変異誘発を使用して１～２ｎｔの変化を作製して、制限酵素部位を創出した。
第１のランダム挿入物を、スプライスアクセプターから約１００ｎｔの部位において、「左」イントロン（スプライスアクセプター部位の上流）中に挿入した（図１Ｂ）。構築物を、ＨＥＫ２９３（ヒト胚腎臓）細胞中にトランスフェクトした。簡潔に述べると、細胞を、６ウェルプレート中に播種し、約７０％のコンフルエンシーでトランスフェクトした。トランスフェクションを、２．５μｇのプラスミドＤＮＡ（試験構築物は等モルであり、質量は空のベクターを使用して等しくした）および１２．５μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＰＥＩ－ＭＡＸ ４０，０００を使用して実施した。トランスフェクションの４日後に、細胞を収集し、ウエスタンブロッティング解析を使用してＧＦＰタンパク質の発現について、ノザンブロッティング解析を使用してｃｉｒｃＲＮＡ発現についてアッセイした。
ＧＦＰタンパク質のウエスタンブロット（図１Ｃおよび１Ｄ）およびｃｉｒｃＲＮＡのノザンブロット（図１Ｅおよび１Ｆ）からわかるように、さらなる距離の挿入は高度に有害であった。１００ｎｔのみの挿入は、ｃｉｒｃＲＮＡ形成を約５分の１に低下させたが、より大きい距離は、ｃｉｒｃＲＮＡ形成を有効に除去した。
ＨＩＰＫ３スプライスアクセプターが、大きいポリ－ピリミジントラクト（配列番号５）を有することを考慮し、分岐点環境に対する可能な影響について制御するために、スプライス接合部に対して遠位かつＡｌｕエレメントに対して近位にさらなる配列を挿入した、第２の一連の構築物を創出した（図３Ａ）。この第２のセットは、事実上同様に挙動し、１００ｎｔまたはそれよりも大きい挿入は、ＧＦＰ発現（図３Ｂおよび３Ｃ）およびｃｉｒｃＲＮＡ形成（図３Ｄおよび３Ｅ）を大きく低減させた。
「右」イントロン（スプライスドナー部位の下流）中の挿入もまた、図１Ｇに示されるように生成した。驚くべきことに、右挿入の効果は、左イントロン挿入とは別個であり、１．５ｋｂの長さまでの配列は、ＧＦＰ発現（図１Ｈおよび１Ｉ）に対してもｃｉｒｃＲＮＡ形成（図１Ｊおよび１Ｋ）に対しても効果を示さなかった。元のＨＩＰＫ３イントロンの場合に形成されたものとは異なるＲＮＡコンカテマーもまた、右イントロン中に挿入物を有するこれらの構築物において観察された。特に、これらのさらなるバンド／分子実体は、本明細書の他の実施例に記載されるように、後に分析され、ＩＲＥＳなどの他のエレメントに依存することが見出された。
次に、ランダム化した挿入物を、表４に提供される非コードのＲＮＡベースの蛍光アプタマーＢｒｏｃｃｏｌｉを含むイントロンを保有するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｔＲＮＡ：ＴｙｒＧＵＡ遺伝子をコードする配列で置き換えた。
図１Ｌに示される得られた構築物は、ＧＦＰ ｃｉｒｃＲＮＡおよび環状Ｂｒｏｃｃｏｌｉ ｔｒｉｃＲＮＡ（ｔｒｉｃＹ－Ｂｒｏｃｃｏｌｉ）の両方を独立して産生した。ロバストなｔｒｉｃＹ－Ｂｒｏｃｃｏｌｉ発現が、インゲルアッセイを使用して観察された（図１Ｍ）。簡潔に述べると、５μｇのＲＮＡを、変性緩衝剤（６７％脱イオン化ホルムアミド、６．７％ホルムアルデヒド、１×ＭＯＰＳランニング緩衝剤）中に再懸濁し、６５℃で７分間インキュベートし、氷上で冷却した。変性させた試料を、３００Ｖで泳動した１０％トリスホウ酸／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）－尿素ゲル上で分離した。ゲルを、水中で３回洗浄し、次いで、ＤＦＨＢＩ－１Ｔ蛍光プローブ染色溶液（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０μＭ ＤＦＨＢＩ－１Ｔ）中で３０分間染色した。染色したゲルを、４８８励起／５２６発光設定を使用して、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でイメージングした。
ウエスタンおよびノザンブロット解析により、ｔｒｉｃＲＮＡ形成が、ＧＦＰタンパク質レベル（図１Ｎおよび１Ｏ）にもｃｉｒｃＲＮＡレベル（図１Ｐおよび１Ｑ）にも影響を与えなかったことが確認された。したがって、スプライスドナーとＡｌｕエレメントとの間の距離を、さらなる影響なしに増加させることができるだけでなく、さらなる機能的ＲＮＡエレメントをイントロン領域に挿入することができる。
（実施例２）
合成イントロン配列は、ｃｉｒｃＲＮＡ発現を増加させる
次に、Ａｌｕエレメントとスプライス部位との間の距離を減少させることの効果を、実施例１に記載した構築物のイントロン配列を欠失させることによって試験した。欠失した領域を有するＨＩＰＫ３、ラッカーゼ２およびＺＫＳＣＡＮ１イントロンの例は、表５に提供される。
実施例１で開示したように、ＨＩＰＫ３スプライスアクセプターは、大きいポリ－ピリミジントラクトを有する；したがって、スプライス接合部に対して近位の約１２５ｎｔを保存して、ＬΔ４２－２６７構築物を創出した。ＨＩＰＫ３の右イントロンは、完全欠失（ＲΔ１０－６５４）および２つのより小さい欠失（ＲΔ１０－４９７およびＲΔ１６１－６５４）を有したが、これらは共に、約１５０ｎｔの距離を保存する（図４Ａ、そのそれぞれのイントロンの始まりから番号付けた欠失）。構築物を、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトし、発現をトランスフェクションの４日後にアッセイして、ＧＦＰ蛍光（図４Ｂ～４Ｇ）、ウエスタンブロット（図４Ｈおよび４Ｉ）およびノザンブロット（図４Ｊおよび４Ｋ）によって、これらの改変されたイントロンがｃｉｒｃＲＮＡ形成および翻訳を支持する能力を評価した。
簡潔に述べると、細胞を、ＧＦＰライトキューブ（励起４７０ｎｍ、発光５１０ｎｍ）またはＴｅｘａｓ Ｒｅｄライトキューブ（励起５８５ｎｍ、発光６２４ｎｍ）を備えたＥＶＯＳ ＦＬ落射蛍光細胞イメージングシステムを使用して、トランスフェクションの４日後にイメージングして、ＧＦＰ蛍光を検出した。実施例１の方法と同様に、細胞をプレートから収集し、得られた細胞懸濁物を、２つのチューブに分離し、３００×ｇで４℃で４分間遠心分離した。細胞ペレットを、ロッカー上に４℃で１０分間配置した１×Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ ＢｕｆｆｅｒまたはＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔのいずれか中に懸濁し、次いで、使用前に－８０℃で貯蔵した。Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ中の溶解物を、１６，０００×ｇで４℃で５分間遠心分離して、凍結前に細胞デブリを除去した。Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ中で貯蔵した溶解物を、ウエスタンブロッティング解析のために処理し、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ中に貯蔵した溶解物を、ノザンブロッティング解析のために処理した。
ＬΔ４２－２６７は、元の構築物と比較して、約２倍高いＧＦＰおよびｃｉｒｃＲＮＡ発現を示した（図４Ｂ～４Ｋ）。スプライス接合部の２０ｎｔ以内にＡｌｕエレメントを配置する大きいＲΔ１０－６５４欠失は、環状化効率を劇的に低減させた。しかし、より小さい欠失は、ｃｉｒｃＲＮＡバイオジェネシスまたはＧＦＰ発現に影響することなしに許容された。両方のより小さい欠失は、等しく良好にスプライスし、これは、配列非依存的効果を示していることに留意されたい。次いで、上流のＬΔ４２－２６７欠失および下流のＲΔ１０－４９７欠失を組み合わせて、最小ＬΔＲΔイントロンエレメントを創出した。欠失の組合せは、相乗効果をもたらし、ＧＦＰ発現およびｃｉｒｃＲＮＡレベルを約５倍増加させた（図４Ｂ～４Ｋ）。左または右Ａｌｕ領域のいずれかの欠失（図４Ｌ）は、ＧＦＰ発現（図４Ｍおよび４Ｎ）およびｃｉｒｃＲＮＡ形成（図４Ｏおよび４Ｐ）を無効にし、この系におけるＡｌｕエレメントの必要が確認された。
ＨＩＰＫ３および改変されたＨＩＰＫ３構築物（例えば、Ｌ１００、Ｒ１５００、ＬΔ４２－２６７、ＲΔ１０－４９７およびＬΔＲΔ）を、Ｕ８７神経膠芽腫およびＨｕｈ７肝細胞癌細胞系中にトランスフェクトした。トランスフェクションの４日後に、Ｕ８７およびＨｕｈ７細胞を収集し、上記のようにウエスタンおよびノザンブロッティング解析のために処理した。Ｕ８７細胞におけるＧＦＰ発現（図５Ａおよび５Ｂ）およびｃｉｒｃＲＮＡ発現（図５Ｃおよび５Ｄ）ならびにＨｕｈ７細胞におけるＧＦＰ発現（図５Ｅおよび５Ｆ）およびｃｉｒｃＲＮＡ発現（図５Ｇおよび５Ｈ）は、上で詳述したＨＥＫ２９３細胞において観察された結果と類似の結果を示した。類似の結果は、ＨＥＫ２９３、Ｕ８７神経膠芽腫およびＨｕｈ７肝細胞癌細胞系において観察され、これは、バックスプライシングの調節が多様な細胞型にわたって保存されていたことを示した。
（実施例３）
ｃｉｒｃＲＮＡ形成に対するイントロンスペーシング効果は保存される
ＨＩＰＫ３由来イントロンから得られた結論がより一般に当てはまるかどうかを確認するために、実施例１および２に記載された実験を、ヒトＺＫＳＣＡＮ１遺伝子またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒラッカーゼ２遺伝子に由来する２つの異なるイントロン対によって駆動されるレポーターを用いて反復した（図２Ｂおよび２Ｃ；表３）。３つの挿入を各イントロン対において創出した（Ｌ１００、Ｌ５００およびＲ１５００）（図６Ａ（ＺＫＳＣＡＮ１）および６Ｆ（ラッカーゼ２））。両方の場合に、左イントロン中の挿入は、ｃｉｒｃＲＮＡ発現（図６Ｄ～６Ｅ（ＺＫＳＣＡＮ１）および６Ｉ～６Ｊ（ラッカーゼ２））およびＧＦＰ発現（図６Ｂ～６Ｃ（ＺＫＳＣＡＮ１）および６Ｇ～６Ｈ（ラッカーゼ２））を減少させた。右ラッカーゼ２イントロン中への挿入は、ＧＦＰ発現（図６Ｇ～６Ｈ）に対してもｃｉｒｃＲＮＡ発現（図６Ｉ～６Ｊ）に対しても変化を与えなかった。しかし、右ＺＫＳＣＡＮ１イントロン中への挿入は、ＧＦＰ発現（図６Ｂ～６Ｃ）およびｃｉｒｃＲＮＡ発現（図６Ｄ～６Ｅ）を僅かに減少させた。
ラッカーゼ２（図６Ｐ）およびＺＫＳＣＡＮ１（図６Ｋ）の両方についても、実施例２において観察されたＨＩＰＫ３イントロン対での結果に基づいて、可能な限り大きい配列を除去するように設計した欠失構築物を創出した。欠失領域を有するラッカーゼ２およびＺＫＳＣＡＮ１イントロン配列の例は、表３に提供される。ＺＫＳＣＡＮ１については、Ａｌｕエレメントとスプライス部位との間のスペースの制約に起因して、左イントロン中に欠失を設計することはできなかった（図６Ｋ）。ラッカーゼ２については、ＬΔ４０３－５０７およびＲΔ１５－１１８構築物ならびに組み合わせた欠失を創出した（図６Ｐ）。
ＺＫＳＣＡＮ１およびラッカーゼ２欠失は全て許容され、元のレベルと等価なレベルでＧＦＰ（図６Ｌ～６Ｍ（ＺＫＳＣＡＮ１）および６Ｑ～６Ｒ（ラッカーゼ２））およびｃｉｒｃＲＮＡ（図６Ｎ～６Ｏ（ＺＫＳＣＡＮ１）および６Ｓ～６Ｔ（ラッカーゼ２））を発現した。したがって、さらなるイントロン対からの結果により、スプライシング効率に対するイントロンスペーシング効果が概して保存されているようであることが確認された。
（実施例４）
ＩＲＥＳエレメントは、ｃｉｒｃＲＮＡレベルおよび翻訳を調節する
上記実施例に記載された系では、ＧＦＰ発現は、ｃｉｒｃＲＮＡレベルおよびＩＲＥＳ活性の両方の産物であった。ｃｉｒｃＲＮＡは５’末端を含まないので、カノニカルなｃａｐ依存的翻訳が生じることはできず、したがって、ｃａｐ非依存的翻訳およびタンパク質合成を開始するのにＩＲＥＳエレメントに依存しなければならい。脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳ、ポリオウイルスＩＲＥＳ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）ｖＦＬＩＰ ＩＲＥＳまたはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＩＲＥＳを含むＨＩＰＫ３分割ＧＦＰ構築物のバージョンを創出した（図７Ａ）。この実施例で使用したこれらの異なるＩＲＥＳエレメントの配列は、表６に提供される。
構築物を、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトし、発現を、トランスフェクションの４日後に、ＧＦＰ蛍光（図７Ｂ～７Ｅ）およびウエスタンブロット解析（図７Ｆ～７Ｇ）によってアッセイした。これらの異なるＩＲＥＳエレメントを含むｃｉｒｃＲＮＡは、変動するレベルのＧＦＰ発現を示し、ポリオウイルスＩＲＥＳ含有ｃｉｒｃＲＮＡ構築物は、ＥＭＣＶおよびＫＳＨＶ ＩＲＥＳエレメントと比較して約５倍高い発現を生じた。対照的に、ＨＣＶ ＩＲＥＳではＧＦＰ発現は観察されなかった（図７Ｂ～７Ｇ）。
翻訳効率を直接評価するために、ポリリボソーム画分を単離し、結合したＲＮＡを、ＧＦＰに特異的なプローブを使用するノザンブロットによって可視化した（図７Ｈ～７Ｐ）。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３細胞を、１０ｃｍプレート中に一晩播種し、８μｇの示されたプラスミドと共にＰＥＩ Ｍａｘを使用して、約７０％のコンフルエンシーでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を分割し、１０ｃｍプレート中に１：２で播種した。細胞を、６０～７０％のコンフルエンシーまで成長させ、次いで、シクロヘキシミド（ＣＨＸ、１００μｇ／ｍＬ）を含む培地中で３７℃で１０分間インキュベートし、その後、ＣＨＸを含む氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を溶解させ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１４０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、２７ １／２ゲージ針を５回通過させて、細胞膜を破壊した。溶解物をスピンして、核を除去し、再度スピンして、残りの細胞デブリを除去した。清澄化した溶解物を、ポリソーム勾配緩衝剤（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１４０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で調製した線形１０～５０％スクロース勾配の上にロードし、ＳＷ４１スインギングバケットローター中で中断なしに３２，０００ｒｐｍで２時間スピンした。勾配を、２５４ｎｍでの吸光度を連続的にモニタリングしながら、Ｂｒａｎｄｅｌ勾配画分器システムを使用して、７５０μＬの画分へと分画した。ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬を使用して各勾配画分から抽出した。ＲＮＡをノザンブロットによって可視化した。
複数のリボソーム（ポリリボソーム）と会合したＲＮＡは、より効率的に翻訳されたが、２つのリボソーム（ジソーム（ｄｉｓｏｍｅ））または単一のリボソーム（モノソーム（ｍｏｎｏｓｏｍｅ））と会合したＲＮＡは、あまり効率的に翻訳されなかった。ＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含むｃｉｒｃＧＦＰ ＲＮＡは、モノソームおよびジソーム上に存在したが、ｃｉｒｃＲＮＡの多くは翻訳されなかった。ＫＳＨＶ ＩＲＥＳ含有ｃｉｒｃＲＮＡもまた、モノソームおよびジソームに対応する画分中に存在したが、ＥＭＣＶ ｃｉｒｃＲＮＡと同様、ｃｉｒｃＲＮＡの大部分は翻訳されず、これは、低いＧＦＰタンパク質レベルがこれらのｃｉｒｃＲＮＡの低い翻訳効率に起因することを示している。ポリオウイルスＩＲＥＳ含有ｃｉｒｃＧＦＰ ＲＮＡは、対照的に、複数の結合したリボソームに対応するより高い画分において検出され、これは、より高いレベルのＧＦＰ発現の観察と相関していた（図７Ｈ～７Ｐ）。
ＨＣＶ ＩＲＥＳを用いた場合にはタンパク質発現の欠如を確認することには、ｃｉｒｃＲＮＡの大多数は、未結合の画分中にあった；対照的に、対照線状ＧＦＰ ｍＲＮＡは、高重量ポリソーム画分中で検出された（図８Ａ～８Ｆ）。全体として、Ｕ８７およびＨｕｈ７細胞系におけるこれらの構築物のＲＮＡおよびタンパク質のレベルは、２９３Ｔ細胞において観察されたレベルと類似であり（図９Ａ～９Ｈ）、これは、これらのｃｉｒｃＲＮＡベクターのＩＲＥＳ媒介性翻訳効率がｉｎ ｖｉｔｒｏで類似であることを示唆している。
これらの構築物から産生された総ＲＮＡをノザンブロットを介して可視化した場合、幾分かの差異が注目された。第１に、産生されたｃｉｒｃＲＮＡの総量は、４つの構築物間で変動した。ＨＣＶ ＩＲＥＳ構築物は、最も高いレベルのｃｉｒｃＲＮＡを発現し、次がＫＳＨＶ、ポリオウイルスであり、最後がＥＭＣＶ ＩＲＥＳであった（図７Ｑおよび７Ｒ）。４つのＩＲＥＳエレメントはサイズが変動したが、ＩＲＥＳ（したがって、ｃｉｒｃＲＮＡ）サイズとｃｉｒｃＲＮＡレベルとの間には強い相関は存在しなかった。第２に、ｃｉｒｃＲＮＡ以外の産生されたＲＮＡ種の型には劇的な差異が存在した。特に、ｃｉｒｃＲＮＡよりも小さいＲＮＡ種が、ポリオウイルスおよびＫＳＨＶ構築物の両方で観察された。さらに、ＫＳＨＶ構築物は、いくつかのより大きいＲＮＡ種を産生した（図７Ｑ）。興味深いことに、これらのより高いバンドは、ポリリボソーム画分中で検出されたが、小さいＲＮＡ種は検出されなかった（図７Ｈ～７Ｐ）。小さいＲＮＡ種およびより大きいＫＳＨＶ ＲＮＡ種は共に、ＲＮａｓｅ Ｒ耐性であり、これは、これらもまた環状であり得ることを示唆している（図７Ｓ）。
（実施例５）
ＩＲＥＳエレメントは、ｃｉｒｃＲＮＡスプライシングパターンに著明に影響を与える
観察されたさらなるＲＮＡ種の正体をさらに調べるために、ＲＮａｓｅ Ｈ消化を、バックスプライス接合部に結合するオリゴヌクレオチドを使用して実施したところ、これらのＲＮＡ種の環状の性質が確認された。主なｃｉｒｃＲＮＡに対応するバンドは残留した。興味深いことに、より高いＫＳＨＶバンドの多くは、完全に消失したかまたは強度が減少した一方で、主なｃｉｒｃＲＮＡおよび小さいｃｉｒｃＲＮＡに対応するバンドは、強度が増加し、これは、これらのより大きい種がコンカテマーであり得ることを示唆している（図１０Ａ）。次いで、総ＲＮＡを、バックスプライス接合部に特異的なプローブを用いてプローブした。ＲＮＡバンド形成パターンは、ＧＦＰエクソンに対するプローブで観察されたパターンと類似であり、これは、これらのＲＮＡ種がスプライスされた産物を示すことを示唆している（図１０Ｂ）。
ポリオウイルスおよびＫＳＨＶ ｃｉｒｃＲＮＡによって産生されたさらなるスプライスされた産物の正体を解明するために、総ＲＮＡを、構築物のそれぞれのＩＲＥＳエレメントに対してプローブした。このプローブは、ＲＮＡ種のほとんどを検出したが、小さいｃｉｒｃＲＮＡを検出することはできず、これは、この種がＩＲＥＳを欠如することを示しており、ＩＲＥＳエレメントがＲＮＡ産物からスプライスアウトされたことを示唆している（図１０Ｃ～１０Ｄ）。次いで、仮想ノザンブロットを、小さいｃｉｒｃＲＮＡに対応する抽出されたＲＮＡを使用して実施した。簡潔に述べると、５μｇのＲＮＡを、変性アガロース上で分離した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色して、リボソームＲＮＡを可視化した。より大きいｃｉｒｃＲＮＡおよびより小さいｃｉｒｃＲＮＡに対応するゲルの小片を、１８Ｓ ｒＲＮＡからの距離（ノザンブロットから測定した距離）に基づいて切断した。ＲＮＡをゲルから抽出した。ＲＮＡを、Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ－ｆｒｅｅキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してＤＮａｓｅ処置した。等しいナノグラム量のＤＮａｓｅ処理したＲＮＡを、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｃＤＮＡに変換した。この逆転写反応の産物を、バックスプライスに特異的なプライマー（５’－ＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧＧＣＣＡＴＧＡＴＡＴＡＧＡＣＧＴＴＧＴＧＧＣ－３’（配列番号３０）；５’－ＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣ－３’；（配列番号３１））またはＩＲＥＳエレメントに及ぶプライマー（５’－ＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧ－３’（配列番号３２）；５’－ＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧ－３’（配列番号３３））を使用するＰＣＲのための鋳型として利用し、その後、精製されたＰＣＲ産物を配列決定した。
ｃＤＮＡ合成後、ＰＣＲ産物を、ＩＲＥＳにわたって増幅するプライマーを使用して得、配列決定して、ＩＲＥＳがこれらのｃｉｒｃＲＮＡ産物から実際にスプライスアウトされたことを確認した。両方の場合に、ＧＦＰの最後の２つのコドン中の弱いスプライスドナーが、ＩＲＥＳの終端において弱いアクセプターにスプライスされた（図１０Ｅ）。関与するスプライス部位を同定したので、代替的ドナー部位を、ＧＦＰコード配列中にサイレント突然変異を作製することによって無効化し、結果として、小さいｃｉｒｃＲＮＡの形成を除外した（図１０Ｆ～１０Ｇ）。これらの結果は、ｃｉｒｃＲＮＡベクターの設計において弱いドナー／アクセプタースプライス部位を同定することの重要性を強調した。
（実施例６）
より大きいｃｉｒｃＲＮＡの生成は、発現に影響を与えない
内因性ｃｉｒｃＲＮＡエクソンのサイズは、約１００ｎｔ～＞１ｋｂの範囲であり得、平均は約７００ｎｔである。本明細書の実施例におけるｃｉｒｃＧＦＰ ＲＮＡは、サイズが１．１～１．５ｋｂ長の範囲であり、内因性ｃｉｒｃＲＮＡと比較してかなり大きいが、高いレベルで発現する。エクソンの長さをさらに増加させることができるかどうかを調査するために、ＧＦＰ ＯＲＦ断片（－ＦＰ）の終端の下流に、Ｐ２Ａ自己切断性配列とその後のｄｓＲｅｄ ＯＲＦとを付加し、エクソンの長さを約７５０ｎｔ増加させて、合計２．２ｋｂにした（図１１Ａ）。このより大きいエクソンを、元のおよびＬΔＲΔ ＨＩＰＫ３イントロン対の両方と対にしたところ、ｄｓＲｅｄを発現すること（図１１Ｅおよび１１Ｆ）に加えて、以前の結果（図４Ａ～４Ｉを参照されたい）と匹敵するＧＦＰ発現（図１１Ｂ～１１Ｈ）が得られた。ポリリボソーム解析により、ＧＦＰ－ｄｓＲｅｄ ｃｉｒｃＲＮＡが、複数の翻訳中のリボソームを含む画分中に存在したことが明らかになり、これは、ＧＦＰ－ｄｓＲｅｄ ｃｉｒｃＲＮＡが効率的に翻訳されることを示している（図１１Ｊ～１１Ｌ）。Ｐ２Ａ配列を付加した場合、ＧＦＰ停止コドンの除去が、以前に同定された弱いスプライスドナー部位を突然変異させた。したがって、総ＲＮＡ種をノザンブロットによって解析した場合、２つの種のみが検出された：ｃｉｒｃＧＦＰ ＲＮＡおよびより大きいＲＮＡ種（図１１Ｍおよび１１Ｉ）。ＲＮａｓｅ ＲおよびＲＮａｓｅ Ｈ解析により、推定ｃｉｒｃＲＮＡバンドの環状の性質が確認され、より大きい種が線状であったことが明らかになった（図１１Ｎおよび１１Ｏ）。バックスプライス接合部についてプローブすることにより、両方のバンドがバックスプライス接合部を含んだことが明らかになり、これは、より大きい線状種がスプライシング事象を受けていたことを示している（図１１Ｐ）。これらの結果は、内因性および合成の両方のＨＩＰＫ３バックスプライシングイントロンが、大きいｃｉｒｃＲＮＡ産物のスプライシングを媒介することができることを示した。
（実施例７）
ｃｉｒｃＲＮＡは、心および筋肉組織において、ＡＡＶベクターを使用して高度に発現され得る
ｉｎ ｖｉｖｏでのｃｉｒｃＲＮＡバックスプライシングおよびＩＲＥＳ媒介性翻訳効率に関するさらなる洞察を集めるために、分割ＧＦＰエクソンを有し、逆位末端反復が隣接する、（１）元のＨＩＰＫ３イントロンおよびポリオウイルスＩＲＥＳまたは（２）ＬΔＲΔイントロンおよびポリオウイルスＩＲＥＳを駆動するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含むＤＮＡ構築物を、ＡＡＶベクターへとパッケージングした（図１２Ａ）。簡潔に述べると、改変を有する三重プラスミドトランスフェクションプロトコールを使用して、組換えＡＡＶベクターを生成した。簡潔に述べると、トランスフェクション混合物は、（１）ｐＸＲヘルパープラスミド；（２）アデノウイルスヘルパープラスミドｐＸＸ６－８０；ならびに（３）ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）が隣接する、ＣＭＶプロモーターによって駆動される示されたｃｉｒｃＲＮＡコード配列およびＳＶ４０ポリＡを含んだ。イオジキサノール勾配超遠心を使用する培地上清からのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿（８％ｗ／ｖ）およびＺｅｂａＳｐｉｎ脱塩カラム（４０Ｋ ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた脱塩に続いてベクター精製を実施した。ベクターゲノム（ｖｇ）力価を、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＡＡＶ２逆位末端反復に選択的に結合するように設計したプライマー（フォワード、５’－ＡＡＣＡＴＧＣＴＡＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧ－３’（配列番号３４）；リバース、５’－ＣＡＴＧＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧ－３’（配列番号３５））を使用する定量的ＰＣＲ（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって得た。
各コホート中のマウス（株：Ｃ５７ＢＬ／６）に、３×１０１１ｖｇ／動物を尾部静脈を介して静脈内注射した。組織を、注射の４週間後に収集した。注射の４週間後、マウスに、腹腔内経路を介してトリブロモエタノール（Ａｖｅｒｔｉｎ）（０．２ｍＬ／１０ｇの１．２５％溶液）を過剰投薬した。この後、リン酸緩衝食塩水の経心腔的灌流を実施した。収集した臓器（心臓、肝臓、骨格筋）の部分を切断し、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で貯蔵した；残りを、４％パラホルムアルデヒド中で後固定（ｐｏｓｔｆｉｘ）した。
次に、組織中のベクターゲノムコピー数を定量化した。簡潔に述べると、ゲノムＤＮＡを、ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して、固定された組織の切片から抽出した。ウイルスゲノムコピー数を計算するために、定量的ＰＣＲを、ＣＭＶプロモーターに特異的なプライマー（５’－ＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣ－３’（配列番号３６）；および５’－ＡＡＧＴＣＣＣＧＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧ－３’（配列番号３７））を用いて実施した。ベクターゲノムコピー数を、ハウスキーピング遺伝子としてのマウスラミンＢ２遺伝子座に対して標準化した（プライマー５’－ＧＧＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＣＴＣＡＡＧＧＧ－３’（配列番号３８）；および５’－ＡＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＧＧＡＡＡＣ－３’（配列番号３９））。ＡＡＶベクターゲノムコピー数は、コホート間で統計的に識別不能であり、等価な投薬が確認された（図１２Ｂ）。
次に、心、肝臓および骨格筋組織におけるｃｉｒｃＲＮＡ発現を、ＲＴ－ＰＣＲを使用して評価した。簡潔に述べると、５ｕｇのＲＮＡを、Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ－ｆｒｅｅキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してＤＮａｓｅ処置した。等しいナノグラム量のＤＮａｓｅ処理したＲＮＡを、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｃＤＮＡに変換した。逆転写反応の産物を、ＧＦＰに対する遺伝子特異的プライマー（５’－ＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧＧＣＣＡＴＧＡＴＡＴＡＧＡＣＧＴＴＧＴＧＧＣ－３’（配列番号４０）；５’－ＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣ－３’（配列番号４１））およびグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対する遺伝子特異的プライマー（５’－ＣＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＴＧＡＣ－３’（配列番号４２）；５’－ＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣ－３’（配列番号４３））を使用するＰＣＲ（または定量的ＰＣＲ）のための鋳型として利用した。定量的ＰＣＲを、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ－Ｃｙｃｌｅｒ ４８０およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。定量的ＲＴ－ＰＣＲを、ｃｉｒｃＲＮＡバックスプライス接合部に及ぶプライマー対を使用して実施したところ、ＬΔＲΔイントロン対が、元のＨＩＰＫ３イントロンと比較して、有意に高いｃｉｒｃＲＮＡ発現：心臓および肝臓における約４倍高い発現、ならびに筋肉における約５０倍高い発現をもたらしたことが明らかになった（図１２Ｃ～１２Ｄ）。特に、骨格筋におけるｃｉｒｃＲＮＡ発現は、元のＨＩＰＫ３イントロンでは非常に低いレベルで検出されたが、ＬΔＲΔイントロン対を用いた場合の発現は、心臓および肝臓と匹敵するレベルまで劇的に増加した（図１２Ｃ～１２Ｄ）。
次に、収集した組織の免疫蛍光染色を実施した。簡潔に述べると、心臓および肝臓について、５０μｍ厚の切片を、振動刃ミクロトームを使用して、固定された組織から得た。ＧＦＰ発現の免疫組織化学的解析を、ＧＦＰに対する抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒヤギ抗ウサギ４８８二次抗体を使用して実施した。切片を、ＤＮＡ中のアデニン－チミンリッチな領域に強く結合する蛍光染料であるＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）を含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ中でスライド上にマウントした。イメージングを、Ａｐｅｒｉｏ ＳｃａｎＳｃｏｐｅ ＸＴ（明視野）またはＡｐｅｒｉｏ ＳｃａｎＳｃｏｐｅ ＦＬ（蛍光）上で２０×の倍率で実施した。骨格筋試料を、マウントおよび切片化し、その後、免疫蛍光およびスライドスキャンした。蛍光を、ＩｍａｇｅＪで全ての組織において定量化した。
切片化した組織のＧＦＰについての免疫蛍光染色により、ＬΔＲΔ構築物が、心臓（図１２Ｅ～１２Ｈ）ならびに骨格筋（図１２Ｉ～１２Ｌ）において、有意に高いＧＦＰ発現を実証したことが確認された。肝臓におけるＧＦＰ発現は、ｃｉｒｃＲＮＡ発現において差異が見られたにもかかわらず、両方の構築物で低く、これは、ポリオウイルスＩＲＥＳが、肝臓において効率的な翻訳をもたらさなかったことを示している（図１３Ａ～１３Ｄ）。これらの結果は、イントロン距離を変更することが、異なる組織においてｉｎ ｖｉｖｏで合成ｃｉｒｃＲＮＡレベルを調節するために活用され得ることを実証した。
当業者は、本開示が、目的を遂行し、言及された結末および利益ならびにそれに固有のものを得るために十分に適応されることを容易に理解する。本明細書に記載される本開示は、今のところ、好ましい実施形態の代表であり、例示的であり、本開示の範囲に対する限定として意図されない。特許請求の範囲によって定義される本開示の精神の範囲内に包含されるその中の変化および他の使用が、当業者に想起される。
本明細書中で引用された任意の非特許文書または特許文書を含む任意の参考文献が先行技術を構成することの承認は行っていない。特に、他に述べられない限り、本明細書中の任意の文書に対する言及は、これらの文書のいずれかが、米国または任意の他の国において当該分野の共通の一般知識の一部を形成することの承認を構成しないことが理解される。参考文献の任意の考察は、その著者らが主張していることを述べており、出願人は、本明細書で引用された文書のいずれかの正確さおよび適切性に意義を申し立てる権利を有している。本明細書で引用された全ての参考文献は、明示的に他が示されない限り、参照により完全に組み込まれる。
引用された参考文献中に見出される任意の定義および／または記載間に相違がある場合
には、本開示が支配するものとする。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
少なくとも２つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をタンデムでコードする核酸分子を含む組成物。
（項目２）
前記組成物が、少なくとも２つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子を含み、前記核酸分子が、
（ｉ）第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列を含む第１のｃｉｒｃＲＮＡ、および
（ｉｉ）第２のｃｉｒｃＲＮＡコード配列を含む第２のｃｉｒｃＲＮＡ
を含み、前記第２のｃｉｒｃＲＮＡが、前記第１のｃｉｒｃＲＮＡ中の前記第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列とタンデムであり、
タンデムの前記第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列および前記第２のｃｉｒｃＲＮＡが、イントロンエレメントに隣接している、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記核酸分子が、少なくとも１つのプロモーター領域をさらに含み、
前記少なくとも１つのプロモーター領域が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型、またはそれらの任意の組合せを動員することができる、項目１または項目２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４）
前記核酸分子が、左バックスプライシングイントロンエレメントおよび右バックスプライシングイントロンエレメントをさらに含み、
前記第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列が、前記左バックスプライシングイントロンエレメントおよび前記右バックスプライシングイントロンエレメントに隣接しており、
前記右バックスプライシングイントロンが、少なくとも１つのｔＲＮＡ由来イントロンを含み、
前記少なくとも１つのｔＲＮＡ由来イントロンが、スプライシングの際に第２のｃｉｒｃＲＮＡをコードするｔＲＮＡ配列を含む、項目１から３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５）
第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列が、
前記第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接するイントロンエレメントの内側の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）であって、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である５’ＵＴＲ、および
３’ＵＴＲ中、かつ前記第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列および第２のｃｉｒｃＲＮＡに隣接するイントロンエレメントの内側の、翻訳調節領域
をさらに含む、項目１から４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）
タンデムの第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列および第２のｃｉｒｃＲＮＡに隣接するイントロンエレメントが、バックスプライスされて、前記ｃｉｒｃＲＮＡが、共有結合的に閉環される部位において傷跡を形成することなしに前記少なくとも２つのｃｉｒｃＲＮＡを生じる、項目１から５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７）
項目１から６のいずれかの少なくとも２つのｃｉｒｃＲＮＡをコードする前記核酸分子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノム。
（項目８）
少なくとも１つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子を含む少なくとも１つのＡＡＶゲノムカセット
バックスプライシングカセット中にオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に先行する内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを含む少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡ
を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子であって、
前記バックスプライシングカセットが、目的の少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡコード配列を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子。
（項目９）
少なくとも１つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする前記核酸分子が、ｔＲＮＡ由来イントロンエレメントに隣接しており、
前記ｔＲＮＡ由来イントロンエレメントが、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡコード配列のための少なくとも１つのｔＲＮＡスプライシングカセットを含む、項目８に記載のＡＡＶ粒子。
（項目１０）
前記ＡＡＶ粒子が、前記目的の少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接するイントロン対をさらに含み、前記目的の少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する前記イントロン対が、約７５０ヌクレオチドの欠失を含む、項目８または項目９のいずれかに記載のＡＡＶ粒子。
（項目１１）
前記目的の少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡコード配列に隣接する前記イントロン対が、約２５０ヌクレオチドの欠失を含む左イントロンおよび約５００ヌクレオチドの欠失を含む右イントロンを含む、項目１０に記載のＡＡＶ粒子。
（項目１２）
目的のｃｉｒｃＲＮＡコード配列を細胞に送達する方法であって、前記細胞を、項目１から７のいずれか一項に記載の組成物または項目８から１１に記載のＡＡＶ粒子に導入するステップを含む、方法。
（項目１３）
目的のｃｉｒｃＲＮＡコード配列を組織に送達する方法であって、前記組織を、項目１から７に記載の組成物または項目８から１１に記載のＡＡＶ粒子のいずれかに導入するステップを含む、方法。
（項目１４）
対象における疾患または状態を処置する方法であって、項目１から７に記載の組成物または項目８から１１に記載のＡＡＶ粒子のいずれかの有効量を前記対象に投与するステップを含み、前記有効量が、前記対象における疾患または状態の少なくとも１つの症状を低減させる量である、方法。
（項目１５）
組織において少なくとも１つの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）を発現させる方法であって、項目８から１１のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＡＡＶ粒子を前記組織に投与するステップを含み、前記少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡの発現が、ベースラインと比較して実質的に増加する、方法。
（項目１６）
前記少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡの発現が、ベースラインと比較して少なくとも２倍増加する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記少なくとも１つのＡＡＶ粒子が、心臓組織、肝臓組織、骨格筋組織、またはそれらの任意の組合せに送達された場合、前記少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡの発現が、ベースラインと比較して少なくとも４倍増加する、項目１５または項目１６のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
前記少なくとも１つのＡＡＶ粒子が骨格筋組織に送達された場合、前記少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡの発現が、ベースラインと比較して少なくとも５０倍増加する、項目１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記少なくとも１つのＡＡＶ粒子が、筋肉内注射、静脈内注射、冠動脈内注射、動脈内注射、またはそれらの任意の組合せによって投与される、項目１２から１８のいずれか一項に記載の方法。

Claims (21)

  1. 核酸配列を含む核酸分子であって、前記核酸配列が、第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列および第２のｃｉｒｃＲＮＡコード配列を含み、
    前記第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列が、左バックスプライシングイントロンエレメントおよび右バックスプライシングイントロンエレメントに隣接しており、
    前記第２のｃｉｒｃＲＮＡコード配列が、左ｔＲＮＡスプライシングエレメントおよび右ｔＲＮＡスプライシングエレメントに隣接しており、
    前記右バックスプライシングイントロンエレメントが、前記左ｔＲＮＡスプライシングエレメント、前記第２のｃｉｒｃＲＮＡコード配列および前記右ｔＲＮＡスプライシングエレメントを含む、
    核酸分子。
  2. 前記核酸配列が、少なくとも１つのプロモーター領域をさらに含み、前記少なくとも１つのプロモーター領域が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型、またはそれらの任意の組合せを動員することができる、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 前記左バックスプライシングイントロンエレメントが、Ａｌｕエレメントを含み、前記右バックスプライシングイントロンエレメントが、Ａｌｕエレメントを含む、請求項１または２に記載の核酸分子。
  4. 前記左バックスプライシングイントロンエレメントが、配列番号１、６、１１、２１、２３および２５のいずれか１つから選択される核酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子。
  5. 前記右バックスプライシングイントロンエレメントが、配列番号２、７、１２、２０、２２および２４のいずれか１つから選択される核酸配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  6. 前記左バックスプライシングイントロンエレメントが、配列番号１、配列番号６または配列番号１１と比較して、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００ヌクレオチドの欠失を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸分子。
  7. 前記右バックスプライシングイントロンエレメントが、配列番号２、配列番号７または配列番号１２と比較して、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０または９００ヌクレオチドの欠失を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸分子。
  8. 前記左ｔＲＮＡスプライシングエレメントが、配列番号１７の核酸配列を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  9. 前記右ｔＲＮＡスプライシングエレメントが、配列番号１８の核酸配列を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子。
  10. 前記第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列が、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３’ＵＴＲを含み、前記５’ＵＴＲが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸分子。
  11. 前記第１のｃｉｒｃＲＮＡコード配列が、治療的タンパク質または治療的ＲＮＡをコードする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
  12. 前記第２のｃｉｒｃＲＮＡコード配列が、アプタマー、ガイドＲＮＡ、タンパク質スポンジ、ｍｉＲＮＡスポンジ、タンパク質結合性ＲＮＡ、天然に存在するｃｉｒｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、機能的非コードＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、Ｙ－ＲＮＡ、７ＳＫ ＲＮＡ、または７Ｓ ＲＮＡをコードする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
  13. 請求項１から１２のいずれか一項に記載の核酸分子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
  14. 請求項１３に記載のＡＡＶベクターを含むＡＡＶ粒子。
  15. 請求項１から１２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１３に記載のＡＡＶベクター、または請求項１４に記載のＡＡＶ粒子、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
  16. 少なくとも２つのｃｉｒｃＲＮＡを細胞または組織に送達する方法における使用のための、
    組成物であって、請求項１から１２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１３に記載のＡＡＶベクター、もしくは、請求項１４に記載のＡＡＶ粒子を含む組成物、または、
    請求項１５に記載の医薬組成物であって、
    前記方法が、前記組成物または前記医薬組成物を前記細胞または組織に導入するステップを含む、組成物または医薬組成物。
  17. 対象における疾患または状態を処置する方法における使用のための、
    組成物であって、請求項１から１２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１３に記載のＡＡＶベクター、もしくは、請求項１４に記載のＡＡＶ粒子を含む組成物、または、
    請求項１５に記載の医薬組成物であって、
    前記方法が、前記組成物または前記医薬組成物の有効量を前記対象に投与するステップを含み、前記有効量が、前記対象における疾患または状態の少なくとも１つの症状を低減させる量である、組成物または医薬組成物。
  18. 前記方法が、少なくとも１つのＡＡＶ粒子を組織に投与するステップを含み、少なくとも２つの環状ＲＮＡが、前記組織において発現され、前記少なくとも２つのｃｉｒｃＲＮＡの発現が、前記少なくとも１つのＡＡＶ粒子の投与前のベースラインの発現と比較して実質的に増加する、請求項１７に記載の使用のための組成物、または医薬組成物。
  19. 前記少なくとも２つのｃｉｒｃＲＮＡの発現が、前記少なくとも１つのＡＡＶ粒子の投与前のベースラインの発現と比較して少なくとも２倍増加する、請求項１８に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
  20. 前記少なくとも２つのｃｉｒｃＲＮＡの発現が、前記少なくとも１つのＡＡＶ粒子の投与前の、心臓組織、肝臓組織、骨格筋組織、またはそれらの任意の組合せにおけるベースラインの発現と比較して少なくとも４倍増加する、請求項１８に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
  21. 前記少なくとも２つのｃｉｒｃＲＮＡの発現が、前記少なくとも１つのＡＡＶ粒子の投与の前の、骨格筋組織におけるベースラインの発現と比較して少なくとも５０倍増加する、請求項１８に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
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