JP7827646B2 - がん免疫療法に対する応答性を決定する方法 - Google Patents

がん免疫療法に対する応答性を決定する方法

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／０４１，４９３号の利益を主張する。
配列表
ファイル５６０２０７＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＣＸＣＲ３＿ＳＴ２５に記載されている配列表は、１４４キロバイトのサイズであり、２０２１年６月１８日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
背景
がん免疫再編成は、腫瘍を排除し、腫瘍が免疫破壊から逃れ、最終的に免疫適格宿主に形成される腫瘍の免疫原性表現型を形成する役割を担っている。免疫系－腫瘍相互作用は、３つの連続相：排除、平衡および回避で起こると仮定される。排除は、Ｔリンパ球による腫瘍細胞の破壊を伴う。平衡において、免疫抵抗性腫瘍細胞の集団が現れる。回避中、腫瘍は免疫検出または破壊を逃れるための戦略を進めている。回避は、腫瘍抗原の喪失または無効な提示、阻害性サイトカインの分泌、または主要組織適合遺伝子複合体分子の下方制御によって起こり得る。
がん免疫療法は、がん退縮をもたらすＴ細胞応答の成功を誘発することを目的とする。エフェクターＴ細胞応答を活性化するための様々な努力がなされており、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による腫瘍抗原の提示、腫瘍を首尾よく標的化して浸潤させるためのＴ細胞のプライミング、および細胞傷害性Ｔ細胞応答を活性化するためのＭＨＣＩ－ペプチド複合体に結合するための浸潤Ｔ細胞の増強が行われている。
研究は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の存在に関連する生存利益を示している。ＩＬ－１２などの免疫刺激性サイトカインが、固形腫瘍における免疫細胞浸潤を増加させ得るという証拠がある。しかしながら、ＩＬ－１２の全身投与は狭い治療指数を有し、許容できないレベルの有害事象を伴うことが多い。ＩＬ－１２の全身投与の制限は、ＩＬ－１２をコードするプラスミドの腫瘍内エレクトロポレーションなどのＩＬ－１２の局所発現をもたらす治療によって克服することができる。
がん免疫療法に応答する可能性が高い患者の同定は、治療から利益を得る可能性が最も高い患者に治療を標的化するのに有用であろう。さらに、非応答患者を応答患者に転換する治療を同定することが有用であろう。
ＩＬ－１２はＴＩＬの数を増加させることができるが、腫瘍内の腫瘍特異的Ｔ細胞の存在および数を増加させる必要性が依然として存在する。ＣＤ３（分化クラスター３）Ｔ細胞共受容体は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞）およびＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞）の両方を活性化するのを助ける。抗ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞応答の活性化におけるその役割のために、免疫抑制治療として使用するために研究されてきた。ＣＤ３およびがん抗原（腫瘍マーカー）を標的化する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含む二重特異性抗体が、Ｔ細胞をがん細胞に標的化するために開発されている。
概要
対象においてがんを処置する方法であって、（ａ）少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを対象に投与すること、（ｂ）対象から腫瘍試料を得ること、（ｃ）腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定すること、（ｄ）所定の対照におけるＣＸＣＲ３発現と比較して、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現が増加しているかどうかを判定すること、および（ｅ）所定の対照におけるＣＸＣＲ３発現と比較して、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現が増加している場合には、少なくとも１つの追加の用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを対象に投与すること、あるいは所定の対照におけるＣＸＣＲ３発現と比較して、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現が増加していない場合には、少なくとも１つの薬学的有効用量のＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥと、少なくとも１つの追加の用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを対象に投与すること、を含む方法が開示される。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、ＩＬ－１２と組み合わせて投与される。ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、ＩＬ－１２の投与前、投与と同時、または投与後に投与することができる。ＣＸＣＬ９、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよび／またはＩＬ－１２は、ＣＸＣＬ９、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよび／またはＩＬ－１２をコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーション（ＩＴ－ＥＰ）によって投与することができる。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤治療は、抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１治療を含む。チェックポイント阻害剤治療は、全身投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫刺激性サイトカインは、ＩＬ－１２またはＩＬ－１２をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインは、典型的に応答性対象において薬学的に有効であると考えられるであろう用量を含む。
対象においてがんを処置する方法であって、（ａ）少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを対象に投与すること、（ｂ）チェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを投与する工程の後に対象から得られた腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルを測定すること、および（ｃ）所定の対照におけるＣＸＣＲ３のレベルと比較して、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルが増加していない場合、少なくとも１つの薬学的有効用量のＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを対象に投与すること、を含む方法が開示される。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、ＩＬ－１２と組み合わせて投与される。ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、ＩＬ－１２の投与前、投与と同時、または投与後に投与することができる。ＣＸＣＬ９、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよび／またはＩＬ－１２は、ＣＸＣＬ９、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよび／またはＩＬ－１２をコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーション（ＩＴ－ＥＰ）によって投与することができる。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤治療は、抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１治療を含む。チェックポイント阻害剤治療は、全身投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫刺激性サイトカインは、ＩＬ－１２またはＩＬ－１２をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインは、典型的に応答性対象において薬学的に有効であると考えられるであろう用量を含む。
がんを有する対象がチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答しないリスクがあるかどうかを判定する方法が記載される。本方法は、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを投与された対象から得られた腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルを測定することを含み、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルが所定の対照未満であることは、対象がチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答しないリスクがあることを示す。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答しないリスクがあると判定された対象に、少なくとも１つの薬学的有効用量のＣＸＣＬ９および／またはＣＤ－３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを投与する。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、ＩＬ－１２と組み合わせて投与される。ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、ＩＬ－１２の投与前、投与と同時、または投与後に投与することができる。ＣＸＣＬ９、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよび／またはＩＬ－１２は、ＣＸＣＬ９、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよび／またはＩＬ－１２をコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーション（ＩＴ－ＥＰ）によって投与することができる。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤治療は、抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１治療を含む。チェックポイント阻害剤治療は、全身投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫刺激性サイトカイン治療は、ＩＬ－１２をコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインは、典型的に応答性対象において薬学的に有効であると考えられるであろう用量を含む。
がんを有する患者を処置する方法であって、（ａ）患者から腫瘍試料を得ること、（ｂ）腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現レベルを測定すること、（ｃ）腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現レベルを、既知の応答者および／または既知の非応答者の集団に由来する所定の対照または標準から得られた参照レベルと相関させて、患者がチェックポイント阻害剤治療で進行するリスクがあるかどうかを判定すること、および（ｄ）発現レベルが参照レベルより大きい場合、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを投与すること、または発現レベルが参照レベルより小さい場合、患者に少なくとも１つの薬学的有効用量のＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥならびに少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを投与すること、を含む方法が記載される。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、ＩＬ－１２と組み合わせて投与される。ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、ＩＬ－１２の投与前、投与と同時、または投与後に投与することができる。ＣＸＣＬ９、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよび／またはＩＬ－１２は、ＣＸＣＬ９、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよび／またはＩＬ－１２をコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーション（ＩＴ－ＥＰ）によって投与することができる。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む。チェックポイント阻害剤治療は、全身投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫刺激性サイトカインは、ＩＬ－１２またはＩＬ－１２をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインは、典型的に応答性対象において薬学的に有効であると考えられるであろう用量を含む。
対象においてがんを処置する方法であって、（ａ）対象から腫瘍試料を得ること、（ｂ）腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定すること、（ｃ）所定の対照におけるＣＸＣＲ３発現と比較して、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現が増加しているかどうかを判定すること、および（ｄ）所定の対照におけるＣＸＣＲ３発現と比較して、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現が増加している場合には、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを対象に投与すること、あるいは所定の対照におけるＣＸＣＲ３発現と比較して、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現が増加していない場合には、少なくとも１つの薬学的有効用量のＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥと、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを対象に投与すること、を含む方法が開示される。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、ＩＬ－１２と組み合わせて投与される。ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、ＩＬ－１２の投与前、投与と同時、または投与後に投与することができる。ＣＸＣＬ９、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよび／またはＩＬ－１２は、ＣＸＣＬ９、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよび／またはＩＬ－１２をコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーション（ＩＴ－ＥＰ）によって投与することができる。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１治療を含む。チェックポイント阻害剤治療は、全身投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫刺激性サイトカイン治療の投与は、ＩＬ－１２をコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションを含む。いくつかの実施形態では、所定の対照は、チェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に対する既知の応答者および／または既知の非応答者の集団に由来する標準を含む。いくつかの実施形態では、所定の対照は、対象への１またはそれを超える治療の投与前に得られた腫瘍試料を含む。事前治療は、ＩＬ－１２治療、チェックポイント阻害剤治療、またはそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインは、典型的に応答性対象において薬学的に有効であると考えられるであろう用量を含む。
チェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答しないリスクがあるがんを有する対象を同定する方法であって、対象から得られた腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルを測定することを含み、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルが所定の対照未満であることは、対象がチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答しないリスクがあることを示す、方法が記載される。腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現のレベルを測定することは、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３ ｍＲＮＡを測定すること、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３タンパク質を測定すること、または、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞の数を測定すること、を含むことができる。いくつかの実施形態では、所定の対照は、チェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に対する既知の応答者および／または既知の非応答者の集団に由来する標準を含む。いくつかの実施形態では、所定の対照は、対象への１またはそれを超える治療の投与前に得られた腫瘍試料を含む。事前治療は、ＩＬ－１２治療、チェックポイント阻害剤治療、またはそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。
ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９＋ＩＬ－１２、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ＋ＩＬ－１２、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよびＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ＋ＩＬ－１２をコードする発現カセット（例えば、核酸）が記載される。記載される発現カセットは、がんの処置に有用である。いくつかの実施形態では、発現カセットは、抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１治療の少なくとも１つのコースに応答しなかった対象、抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１治療に応答しないリスクがあると予測される対象、抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１治療で進行している、または抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１治療で進行した対象においてがんを処置するのに有用である。記載される発現カセットを使用して、がんおよび転移性がんを含む腫瘍を処置する方法も記載される。記載された発現カセットは、エレクトロポレーションなどによって腫瘍に送達されると、コードされたタンパク質の局所腫瘍発現をもたらし、Ｔ細胞動員および抗腫瘍活性をもたらす。いくつかの実施形態では、本方法はまた、アブスコパル効果、すなわち、１またはそれを超える未処置腫瘍の退縮をもたらす。いくつかの実施形態では、退縮は固形腫瘍の減量を含む。
ＣＸＣＬ９をコードする発現カセットが記載される。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ９をコードする発現カセットは、ＩＬ－１２をさらにコードする。記載されるＣＸＣＬ９発現カセットは、腫瘍内、腫瘍周囲、リンパ節内、皮内、および／または筋肉内に送達することができる。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ９およびＩＬ１２コード配列は、単一プロモーターからのマルチシストロン性発現カセット上で発現され、ＩＲＥＳまたは２Ａ翻訳修飾エレメントによって分離される。いくつかの実施形態では、２ＡエレメントはＰ２Ａエレメントである。ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２Ａ（ｐ３５）サブユニットとＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０）サブユニットの両方を有するヘテロ二量体サイトカインである。コードされたＩＬ－１２は、ＩＬ－１２ ｐ３５－ＩＬ－１２ ｐ４０融合タンパク質（ＩＬ１２ ｐ７０）をコードする融合構築物を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ ｐ３５およびｐ４０コード配列は、単一プロモーターからのマルチシストロン性発現カセットから発現され、ＩＲＥＳまたは２Ａエレメントによって分離される。いくつかの実施形態では、２ＡエレメントはＰ２Ａエレメントである。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳまたは２Ａエレメントによって分離されたＣＸＣＬ９、ＩＬ１２ ｐ３５およびＩＬ－１２ ｐ４０コード領域を含むマルチシストロン発現カセットが記載される。いくつかの実施形態では、２ＡエレメントはＰ２Ａエレメントである。
抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖをコードする発現カセットが記載される。抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、抗ＣＴＬＡ－４一本鎖可変フラグメントを含む。記載される抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ発現カセットは、腫瘍内、腫瘍周囲、リンパ節内、皮内、および／または筋肉内に送達することができる。リンパ節は、排出リンパ節であり得る。抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ発現カセットはまた、腫瘍と排出リンパ節との間の腫瘍周囲領域に送達され得る。抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ発現カセットの腫瘍内送達、腫瘍周囲送達、リンパ節送達、皮内送達および／または筋肉内送達のそれぞれについて、送達をエレクトロポレーションによって促進することができる。抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ発現カセットの直接発現は、抗ＣＴＬＡ－４抗体の全身投与と比較した場合、副作用および／または毒性をより少なくすることができる。記載された抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ発現カセットは、局所的であるが有効な用量の抗ＣＴＬＡ－４の送達を促進する。
ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよびＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする発現カセットが記載される。ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、膜貫通ドメイン（ＴＭ）に融合した抗ＣＤ３一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする発現カセットは、シグナルペプチドをさらにコードする。コードされたシグナルペプチドは、抗ＣＤ３一本鎖可変フラグメントのコード配列の５’末端に作動可能に連結することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする発現カセットは、ＩＬ－１２をさらにコードする。記載されるＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ発現カセットは、腫瘍内、腫瘍周囲、リンパ節内、皮内、および／または筋肉内に送達することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよびＩＬ１２コード配列は、単一プロモーターからのマルチシストロン性発現カセット上で発現され、ＩＲＥＳまたは２Ａ翻訳修飾エレメントによって分離される。いくつかの実施形態では、２ＡエレメントはＰ２Ａエレメントである。ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２Ａ（ｐ３５）サブユニットとＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０）サブユニットの両方を有するヘテロ二量体サイトカインである。コードされたＩＬ－１２は、ＩＬ－１２ ｐ３５－ＩＬ－１２ ｐ４０融合タンパク質（ＩＬ１２ ｐ７０）をコードする融合構築物を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ ｐ３５およびｐ４０コード配列は、単一プロモーターからのマルチシストロン性発現カセットから発現され、ＩＲＥＳまたは２Ａ翻訳修飾エレメントによって分離される。いくつかの実施形態では、２ＡエレメントはＰ２Ａエレメントである。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳまたは２Ａ翻訳修飾エレメントによって分離されたＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、ＩＬ１２ ｐ３５およびＩＬ－１２ ｐ４０コード領域を含むマルチシストロン発現カセットが記載される。いくつかの実施形態では、２ＡエレメントはＰ２Ａエレメントである。
腫瘍内エレクトロポレーション（ＩＴ－ＥＰ）によって、治療有効量の１またはそれを超える記載された発現カセットを含む組成物を対象に投与することを含む、がんを処置する方法が記載される。組成物を腫瘍、腫瘍微小環境および／または腫瘍辺縁組織に注射し、エレクトロポレーション治療を腫瘍、腫瘍微小環境および／または腫瘍辺縁組織に適用する。エレクトロポレーション治療は、当技術分野で公知の任意の適切なエレクトロポレーションシステムによって適用され得る。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションは、約６０Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍの電界強度、および約１０マイクロ秒～約２０ミリ秒の持続時間である。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションは電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）を組み込んでいる。対象は哺乳動物であり得る。哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコまたはウマであり得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本方法は、治療効果量の免疫刺激性サイトカインを対象に投与することをさらに含む。免疫刺激性サイトカインは、ＩＴ－ＥＰによって送達される免疫刺激性サイトカインをコードする発現カセットであり得る。免疫刺激性サイトカインは、ＩＬ－１２であり得るが、これに限定されない。免疫刺激性サイトカインは、１またはそれを超える記載されたＣＸＣＬ９、ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖおよびＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ発現カセットの前、後、または同時に送達され得る。
いくつかの実施形態では、本方法は、１またはそれを超える追加の治療の投与をさらに含む。１またはそれを超える追加の治療は、免疫チェックポイント治療であり得るが、これに限定されない。免疫チェックポイント治療は、１またはそれを超える免疫チェックポイント阻害剤の投与であり得るが、これに限定されない。「免疫チェックポイント」分子は、Ｔ細胞機能障害またはアポトーシスを誘導する免疫細胞表面受容体／リガンドの群を指す。これらの免疫阻害性標的は、過剰な免疫反応を減弱させ、自己寛容を確実にする。腫瘍細胞は、これらのチェックポイント分子の抑制効果を利用する。免疫チェックポイント標的分子には、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム死１（ＰＤ－１）、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンＭｕｃｉｎ－３（ＴＩＭ３）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＭＲ）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、ならびにヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）が含まれるが、これらに限定されない。「免疫チェックポイント阻害剤」には、免疫チェックポイント分子の効果を遮断することによって免疫抑制を予防する分子が含まれる。チェックポイント阻害剤には、抗体および抗体フラグメント、ナノボディ、ダイアボディ、チェックポイント分子の可溶性結合パートナー、小分子治療薬、およびペプチドアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストであり得るが、これらに限定されない。ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストは、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり得るが、これらに限定されない。抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１抗体には、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、およびアテゾリズマブが含まれるが、これらに限定されない。免疫チェックポイント（チェックポイント阻害剤）治療は、全身投与され得る。
対象の腫瘍を処置する方法であって、少なくとも１つの処置サイクルを対象に投与することを含み、該サイクルが、ＩＴ－ＥＰによって、治療有効量の１またはそれを超える記載されたＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９＋ＩＬ－１２（すなわち、ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９）、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ＋ＩＬ－１２、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ＋ＩＬ－１２（すなわち、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２）発現カセットを含む組成物を腫瘍に投与することを含む、方法が記載される。いくつかの実施形態では、サイクルは３週間サイクルである。いくつかの実施形態では、サイクルは、４、５、または６週間サイクルである。組成物は、ＩＴ－ＥＰによってサイクルの１、２、３、４、５または６日に投与することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、各サイクルの１日目にＩＴ－ＥＰによって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、各サイクルの１日目および５±２日目にＩＴ－ＥＰによって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、各サイクルの１日目および８±２日目にＩＴ－ＥＰによって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、各サイクルの１日目、５±２日目、および８±２日目にＩＴ－ＥＰによって投与される。サイクルは、対象を処置するために必要な頻度で繰り返すことができる。いくつかの実施形態では、サイクルは、追加の治療薬の投与をさらに含む。追加の治療薬は、免疫チェックポイント治療であり得るが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント治療は、サイクルの１日目、２日目、または３日目に対象に投与される。
いくつかの実施形態では、対象は、１またはそれを超える記載された発現カセットによる１またはそれを超えるＩＴ－ＥＰ治療で処置される。上記のサイクルのいずれも、後続のサイクルにおいて繰り返すことができる。後続のサイクルは、連続サイクルまたは交互サイクルであり得る。交互サイクルは、治療なしまたは代替治療（例えば、免疫チェックポイント治療）の１またはそれを超える介在サイクルを有することができる。例えば、記載された発現カセットのいずれかを、交互のサイクル（例えば、必要に応じてサイクル１、３、５など）の１日目、５±２日目および８±２日目に投与することができ、代替治療を、例えば、連続サイクル（例えば、必要に応じてサイクル１、２、３、４、５など）の１日目、２日目または３日目に投与することができる。
いくつかの実施形態では、対象に、記載されているＣＸＣＬ９、ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ、および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ発現カセット（免疫チェックポイント阻害剤治療有りまたは無し）、および免疫チェックポイント阻害剤治療のいずれかのＩＴ－ＥＰの交互サイクルを投与する。換言すれば、対象に、ＩＴ－ＥＰによって、治療有効量の１またはそれを超える記載されたＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９＋ＩＬ－１２、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ＋ＩＬ－１２、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ＋ＩＬ－１２発現カセットを含む組成物を投与することができ、必要に応じて、奇数サイクル（サイクル１、３など）で免疫チェックポイント阻害剤治療を投与し、偶数サイクル（サイクル２、４など）で免疫チェックポイント阻害剤治療を投与することができる。あるいは、患者に、免疫チェックポイント阻害剤治療を奇数サイクル（サイクル１、３など）で投与し、ＩＴ－ＥＰによって、治療有効量の１またはそれを超える記載されたＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９＋ＩＬ－１２、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ＋ＩＬ－１２、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ＋ＩＬ－１２発現カセットを含む組成物を投与し、必要に応じて、免疫チェックポイント阻害剤治療を偶数サイクル（サイクル２、４など）で投与することができる。
発現カセットおよび方法を使用して、進行性、転移性および／または処置難治性腫瘍を有する対象を処置することができる。処置難治性腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤難治性腫瘍、ホルモン難治性腫瘍、放射線難治性腫瘍、または化学療法難治性腫瘍であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象は、免疫チェックポイント阻害剤治療の少なくとも１つのコースに応答しなかった。いくつかの実施形態では、対象は、１またはそれを超える抗がん治療（例えば、チェックポイント阻害剤治療などであるが、これらに限定されない）において進行しているか、または進行した者である。いくつかの実施形態では、対象は、抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１治療の少なくとも１つのコースに応答しなかった者か、抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１治療に応答しないリスクがあると予測される者か、抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１治療で進行している、または抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１治療で進行した者である。
発現カセットおよび方法を使用して、１またはそれを超える抗がん治療に対して難治性であるかまたは応答しないと予測される腫瘍を有する対象を処置することができる。いくつかの実施形態では、対象は、低い腫瘍浸潤リンパ球、低い部分的細胞傷害性リンパ球、または疲弊したＴ細胞を有する。いくつかの実施形態では、記載される発現カセットおよび方法は、対象から得られた腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３レベルがチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答して増加していない対象を処置するために使用される。いくつかの実施形態では、記載される発現カセットおよび方法は、対象から得られた腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３レベルが抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１および／またはＩＬ－１２治療に応答して増加していない対象を処置するために使用される。いくつかの実施形態では、記載される発現カセットおよび方法は、対象から得られた腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３レベルが既知の応答者および／または既知の非応答者の集団に由来する標準よりも低い対象を処置するために使用される。いくつかの実施形態では、対象は、１またはそれを超える以前のがん治療で進行した者である。
ｍＣＸＣＬ９～ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣＸＣＬ９－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ）、ｍＣＸＣＬ９、ｍＩＬ１２－２Ａ（ｍＩＬ－１２ ｐ３５－Ｐ２Ａ－ｍＩＬ－１２ ｐ４０）、ｍＩＬ１２～ｍＣＸＣＬ９（ｍＩＬ－１２ ｐ３５－Ｐ２Ａ－ｍＩＬ－１２ ｐ４０－Ｐ２Ａ－ｍＣＸＣＬ９）のための発現構築物の図。
ｈＣＸＣＬ９、ｈＩＬ１２－２Ａ（ｈＩＬ－１２ ｐ３５－Ｐ２Ａ－ｈＩＬ－１２ ｐ４０）、ｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９（ｈＩＬ－１２ ｐ３５－Ｐ２Ａ－ｈＩＬ－１２ ｐ４０－Ｐ２Ａ－ｈＣＸＣＬ９）のための発現構築物の図。
ｍＩＬ１２－２Ａ、ｍＣＸＣＬ９、およびｍＩＬ１２～ｍＣＸＣＬ９発現ベクターによるトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞における、（Ａ）ｍＩＬ１２ｐ７０タンパク質発現、および（Ｂ）ｍＣＸＣＬ９タンパク質発現を示すグラフ。
マウスＩＬ－１２またはマウスＩＬ－１２－ＣＸＣ構築物で一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からのｍＩＬ－１２ｐ７０に対する用量応答を示すグラフ。両方の構築物は、生物学的に活性なＩＬ－１２をコードする。
５．０ミクロン細孔を有するポリカーボネート膜（Ｃｏｓｔａｒ ３４２１）を通る、ＳＩＩＮＦＥＫＬパルス（１μｇ／ｍＬで２４時間、回収７２時間）ＯＴ－Ｉ脾細胞のトランスフェクション由来マウスＣＸＣＬ９によって誘導された走化性を示すグラフ。遊走指数は、ＯｐｔｉＭＥＭ陰性対照において膜を通って受動的に遊走した細胞の数に対して正規化された、３７°Ｃで２．５時間後に観察された走化性細胞の数として定義される。抗ｍＣＸＣＬ９中和モノクローナル抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ ＢＥ０３０９）のプレインキュベーションにより、走化性の消失が観察された。
５．０ミクロン細孔を有するポリカーボネート膜（Ｃｏｓｔａｒ ３４２１）を通る、ＳＩＩＮＦＥＫＬパルス（１μｇ／ｍＬで２４時間、回収７２時間）ＯＴ－Ｉ脾細胞のトランスフェクション由来（ＨＥＫ２９３）ヒトＣＸＣＬ９によって誘導された走化性を示すグラフ。遊走指数は、ＯｐｔｉＭＥＭ陰性対照に向かって膜を通って受動的に遊走した細胞の数に対して正規化された、３７°Ｃで２時間後に観察された走化性細胞の数として定義される。
５．０ミクロン細孔を有するポリカーボネート膜（Ｃｏｓｔａｒ ３４２１）を通る、ヒト末梢単核細胞（凍結保存から解凍し、Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地中で２４時間静置）のトランスフェクション由来（ＨＥＫ２９３）ヒトＣＸＣＬ９によって誘導された走化性を示すグラフ。遊走指数は、ＯｐｔｉＭＥＭ陰性対照に向かって膜を通って受動的に遊走した細胞の数に対して正規化された、３７°Ｃで２時間後に観察された走化性細胞の数として定義される。
ＣＴ２６腫瘍を有するマウスからの腫瘍溶解物におけるエレクトロポレーションの４８時間後のｍＣＸＣＬ９（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ＤＹ３９２）についてのＥＬＩＳＡを使用したｍＣＸＣＬ９の腫瘍内発現を示すグラフ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５；ウェルチ補正を用いたＴ検定）。
未処置マウスおよび対照ベクター、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２－２Ａ単独、またはＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９と組み合わせたＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２－２Ａで処置したマウスのＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｒ曲線を示すグラフ（＊＊Ｐ＜０．００５；ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定）。
対照プラスミドでのＩＬ－１２治療単独と比較して、ｍＩＬ１２－２Ａ＋ｍＣＸＣＬ９によるＩＴ－ＥＰ治療で処置した腫瘍担持マウスにおける、（Ａ）腫瘍体積の減少、および（Ｂ）対側（未処置）腫瘍体積の減少を示すグラフ。
０日目にＩＴ－ＥＰ ｐＵＭＣＶ３またはＩＬ１２－２Ａで処置し、４日目および７日目にＩＴ－ＥＰ ｐＵＭＶＣ３またはｍＣＸＣＬ９で処置したマウスの脾細胞のフローサイトメトリー分析
対照ベクター（ｐＵＭＶＣ３）、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２（ＩＬ－１２ ｐ３５－Ｐ２Ａ－ＩＬ－１２ ｐ４０）、またはＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２＋ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９で処置したマウス腫瘍におけるＡＨ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加倍率を示すグラフ。３～５匹の動物／群を用いたＮ＝２の独立した実験；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５；一元配置ＡＮＯＶＡ。
（Ａ）ｈＩＬ１２－２ＡおよびｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９発現ベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるｈＩＬ－１２タンパク質発現、ならびに（Ｂ）ｈＣＸＣＬ９およびｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９発現ベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるｈＣＸＣＬ９タンパク質発現を示すグラフ。
組換えヒトＩＬ－１２（ｒｈＩＬ１２、陽性対照）、またはｈＩＬ１２－２Ａ発現ベクターを発現する細胞から産生されたｈＩＬ１２を用いた、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞におけるＳＴＡＴ４経路の活性化を示すグラフ。
ＨＡ－２Ｃ１１－Ｍｙｃ ｓｃＦｖ、ＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ、２Ｃ１１ ｓｃＦｖ、および２Ｃ１１ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２についてのマウスＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ発現カセットの図。
ＨＡ－ＯＫＴ３－Ｍｙｃ ｓｃＦｖ、ＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、ＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２、およびＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２についてのヒトＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ発現カセットの図。
以下を示すウエスタンブロット：（Ａ）ＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖおよびＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ発現ベクターをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞における抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの発現、ならびに（Ｂ）ＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖおよびＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ～ｍＩＬ１２発現ベクターをトランスフェクトしたＢ１６－Ｆ１０細胞におけるＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥの発現。
ＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖおよびＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２発現ベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞における抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの表面発現を示すフローサイトメトリー。
（Ｄ）ＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖおよびＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ～ｍＩＬ１２発現ベクターでトランスフェクトしたＢ１６－Ｆ１０細胞における抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの表面発現を示すフローサイトメトリー。（Ｅ）ｍＩＬ１２－２Ａ、ＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ～ｍＩＬ１２発現ベクターによるトランスフェクション後のＢ１６－Ｆ１０細胞におけるＩＬ１２ｐ７０発現を示すグラフ。
ｈＩＬ１２－２Ａ、ＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２、およびＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２発現ベクターによるトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞におけるＩＬ１２ｐ７０発現を示すグラフ。
（Ａ）ＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖの腫瘍内エレクトロポレーション後のインビボでのＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞または４Ｔ１乳がん細胞におけるＣＤ３ ｓｃＦｖの発現を示すウエスタンブロット。（Ｂ）ＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖの腫瘍内エレクトロポレーション後のインビボでの４Ｔ１乳がん細胞上のＣＤ３ ｓｃＦｖの表面発現のフロー分析。
ｍＩＬ１２－２ＡおよびＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ～ｍＩＬ１２発現ベクターの腫瘍内エレクトロポレーション後のＢ１６－Ｆ１０細胞におけるＩＬ１２ｐ７０発現を示すグラフ。
ナイーブマウス脾細胞と、コントロールベクター（ＥＶ対照）、２Ｃ１１ ｓｃＦｖ発現ベクター（組換えマウスＩＬ１２有りまたは無し）、またはプレート結合抗ＣＤ３（陽性対照）をインビトロでトランスフェクトしたＢ１６Ｆ１０細胞との共培養後のＩＦＮγ発現の誘導を示すグラフ。
ナイーブマウス脾細胞と、コントロールベクター（Ｔｆｘ対照）、２Ｃ１１ ｓｃＦｖ発現ベクター（組換えマウスＩＬ１２有りまたは無し）、またはプレート結合抗ＣＤ３（陽性対照）をインビトロでトランスフェクトしたＢ１６Ｆ１０細胞との共培養後のＣＦＳＥ標識ＣＤ３＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞の増殖のＦＡＣＳ分析を示すグラフ。
２Ｃ１１ ｓｃＦｖ ＩＴ－ＥＰまたは陰性対照で処置したＢ１６－ＯＶＡ腫瘍モデルマウスにおけるＤＬＮ中のインビボＯＴ－１およびポリクローナルＴ細胞増殖を示すグラフ。
２Ｃ１１ ｓｃＦｖ ＩＴ－ＥＰまたは陰性対照で処置したＢ１６－ＯＶＡ腫瘍モデルマウスにおけるＴＩＬ中のＣＤ４５．１＋生細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を示すグラフ。
２Ｃ１１ ｓｃＦｖ ＩＴ－ＥＰまたは陰性対照で処置したＢ１６－ＯＶＡ腫瘍モデルマウスにおけるＴＩＬ中の抗原特異的（ＳＩＩＮＦＥＫＬ＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を示すグラフ。
ＯＶＡ２５７－２６４ペプチドを提示した（Ｈｉ）または提示しない（Ｌｏ）スキャンＣＦＳＥ細胞のＦＡＣＳ分析であり、２Ｃ１１ ｓｃＦｖ ＩＴ－ＥＰで処理したＢ１６－ＯＶＡ腫瘍含有マウスにおけるＯＶＡ２５７－２６４ペプチドを提示しているＣＦＳＥ細胞の溶解が、陰性トランスフェクト対照と比較して増加することを示している。
ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥで処置したＢ１６－ＯＶＡ腫瘍含有マウスにおける養子移入されたＯＶＡ２５７－２６４提示ＣＦＳＥ細胞の溶解の増加を示すグラフである。脾臓および排出リンパ節の両方で観察されたＴ細胞死滅化能力の増加。
ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥで処置したマウスにおけるＯＶＡ発現細胞の腫瘍特異的死滅化の増加を示すＣＦＳＥ細胞のＦＡＣＳ分析。
対照、ＩＬ－１２またはＩＬ－１２＋ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ ＩＴ－ＥＰ治療で処置したメラノーマモデルマウスにおける処置腫瘍の腫瘍進行を示すグラフ。
（Ａ）対照、ＩＬ－１２またはＩＬ－１２＋２Ｃ１１ ＩＴ－ＥＰ治療で処置した乳がんモデルマウスにおける腫瘍進行を示すグラフ。
Ｂ－Ｃ．（Ｂ）対照、ＩＬ１２－２ＡまたはＩＬ１２－２Ａ＋２Ｃ１１ ＩＴ－ＥＰ治療で処置した４Ｔ１乳がんモデルマウスにおける肺転移結節を示すグラフ。（Ｃ）対照、ＩＬ１２－２ＡまたはＩＬ１２－２Ａ＋２Ｃ１１ ＩＴ－ＥＰ治療で処置した４Ｔ１乳がんモデルマウスにおける末梢血（μＬ）あたりのエフェクターＴ細胞（ＣＤ１２７－ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ３＋）の絶対数を示すグラフ。
ｈＩＬ１２－２Ａ、ｈＣＸＣＬ９、およびｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９発現ベクターによるトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞における、（Ａ）ｈＩＬ１２ｐ７０タンパク質分泌、および（Ｂ）ｈＣＸＣＬ９タンパク質分泌を示すグラフ。ＥＬＩＳＡによって検出されたタンパク質、ｎ＝５。
示された遺伝子についてｐ値およびｌｏｇ２倍率変化を示すボルケーノプロット。ｍＣＸＣＬ９単独で処置したマウス（上のパネル）およびＩＬ１２と組み合わせてｍＣＸＣＬ９で処置したマウス（下のパネル）において、差次的な遺伝子発現を調べた。横線は、偽発見率（ＦＤＲ）閾値を示す。
「細胞傷害性免疫細胞」の細胞型スコアを示すグラフ。各細胞型のスコア（Ｌｏｇ２スケール）は、平均０を有するように中心付けられている。
１０μｇもしくは１００μｇのＩＬ１２－２Ａ（ＴＡＶＯ）で１、５、および８日目に処置した後、または１００μｇのＩＬ１２～ＣＸＣＬ９またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２（ＳＰＡＲＫ）で１、５、および８日目のそれぞれに処置した後の、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍を有するマウス由来の腫瘍溶解物におけるエレクトロポレーション後４８時間でのＩＬ１２ ｐ７０発現を示すグラフ（ｎ＝８動物；ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ＤＹ４１９）。
１０μｇもしくは１００μｇのＩＬ１２－２Ａ（ＴＡＶＯ）で１、５、および８日目に処置した後、または１００μｇのＩＬ１２～ＣＸＣＬ９またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２（ＳＰＡＲＫ）で１、５、および８日目のそれぞれに処置した後の、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍を有するマウスにおける、原発性（Ｂ）および続発性（Ｃ）腫瘍成長を示すグラフ。（左から右へ、０日目および１２日目のそれぞれについて：１０μｇのＩＬ１２－２Ａ、ＳＰＡＲＫ、１００μｇのＩＬ１２－２Ａ）。
以下を示すグラフである：（Ａ）組換えｍＣＴＬＡ－４／Ｆｃに結合する抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖトランスフェクション上清、および（Ｂ）ＲＥＮＣＡ腫瘍溶解物上の抗ＣＬＴＡ－４ ｓｃＦｖの検出。
処置スケジュールのグラフ図。ＴＡＶＯ＝ＩＴ－ＥＰによって投与された核酸発現ＩＬ－１２。Ｐ＝ペンブロリズマブ。
ＩＬ－１２およびペンブロリズマブによる処置前後の応答者および非応答者におけるＰＢＭＣ中のＫｉ－６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を示すグラフ。
ＩＬ－１２およびペンブロリズマブによる処置前後の応答者および非応答者における腫瘍内ＣＸＣＲ３転写レベルを示すグラフ。
５０μｇのＩＬ－１２（ＴＡＶＯ＋（ＴＡＶＯ（Ｐ２Ａ））または５０μｇの対照（空）ベクター（ＥＶ）のいずれかを用いたＩＴ－ＥＰの２４時間後のＰＢＭＣ中のＣＤ８＋ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞を示すグラフ。
抗ＣＸＣＲ３抗体の存在下または非存在下でＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２（ＴＡＶＯ＋）空ベクター（ＥＶ）で処置したマウスの排出リンパ節から単離した遊走細胞の数を示すグラフ。
抗ＣＸＣＲ３抗体の存在下または非存在下でＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２（ＴＡＶＯ＋）で処置したマウスにおける原発性および対側腫瘍退縮を示すグラフ。
抗ＣＸＣＲ３抗体の存在下または非存在下でＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２（ＴＡＶＯ＋）で処置した腫瘍モデルマウスにおける生存を示すグラフ。
２μｇまたは５０μｇの空ベクター（ＥＶ）またはＩＬ－１２（ＴＡＶＯ＋）のいずれかを用いてＩＴ－ＥＰで処置したマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γを示すグラフ。
ＩＴ－ＥＰ空ベクター（ＥＶ）、ＩＬ－１２（ＴＡＶＯ＋）またはＩＬ－１２＋ＣＸＣＬ９で処置した腫瘍モデルマウスにおけるトランスクリプトーム解析を示すグラフ。
ＩＴ－ＥＰ空ベクター（ＥＶ）、ＩＬ－１２（ＴＡＶＯ＋）またはＩＬ－１２＋ＣＸＣＬ９で処置した腫瘍モデルマウスにおけるＣＤ８ Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析。
ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２（ＴＡＶＯ＋）およびＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９で逐次処置した腫瘍モデルマウスにおける原発性および対側の腫瘍退縮の増強を示すグラフ（各対の左バー＝ＴＡＶＯ＋＋ＥＶ＋ＥＶ；右バー各対ＴＡＶＯ＋＋ｐＣＸＣＬ９＋ｐＣＸＣＬ９）。
ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２（ＴＡＶＯ＋）およびＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９で逐次処置した腫瘍モデルマウスにおける生存を示すグラフ。
ＩＴ－ＥＰ空ベクター（ＥＶ）、ＩＬ－１２（ＴＡＶＯ＋）、またはＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９で処置したマウスの腫瘍由来のＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＸＣＲ３＋発現を示すグラフ。
ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２（ＴＡＶＯ＋）またはＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９で処置した腫瘍モデルマウスにおける原発性および対側腫瘍抑制の増強を示すグラフ（左バー各対＝ＴＡＶＯ＋；右バー各対ＴＡＶＯ＋＋ＣＸＣ）。
ＩＴ－ＥＰ空ベクター（ＥＶ）、ＩＬ－１２（ＴＡＶＯ＋）、またはＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９で処置した腫瘍モデルマウスの生存を示すグラフ。
抗ＰＤ－１治療有りもしくは無しでＩＴ－ＥＰ空ベクター（ＥＶ）、抗ＰＤ－１治療有りもしくは無しでＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２（ＴＡＶＯ＋）、逐次ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２＋ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９、または、抗ＰＤ－１治療有りもしくは無しで逐次ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２＋ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９で処置した腫瘍モデルマウスの生存を示すグラフ。各群において、抗ＰＤ－１治療で処置したマウスにおいて生存率の増加が観察された。
１００ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ－１２有りまたは無しで、ＥＶまたは抗ＣＤ３ ｓｃＦｖプラスミドでトランスフェクトしたＢ１６－Ｆ１０細胞との４日間の共培養後の増殖ＣＤ３＋Ｔ細胞の割合を示すグラフ。同様の数のＣＤ３＋Ｔ細胞およびＢ１６－Ｆ１０細胞を用いて共培養を開始した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、プレート結合抗ＣＤ３を陽性対照として用いて培養した（ｎ＝３）。
上記のグラフに記載のように様々な条件でトランスフェクトしたＢ１６－Ｆ１０細胞との３日間の共培養後のＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞における細胞内（Ａ）ＩＦＮγおよび（Ｂ）グランザイムＢ発現のフローサイトメトリー分析を示すグラフ（ｎ＝３）。
０日目に５０μｇの空ベクター（ＥＶ）またはＩＬ－１２（ＴＡＶＯ（Ｐ２Ａ））を用いてＩＴ－ＥＰで処置し、続いて３日目および５日目に５０μｇのＥＶまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを用いてＩＴ－ＥＰで処置した４Ｔ１腫瘍における、（Ａ）腫瘍体積および（Ｂ）自発的転移性肺モジュールを示すグラフ：Ｔ細胞集団をＩＴ－ＥＰ処置の６日後に測定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
０日目に５０μｇの空ベクター（ＥＶ）またはＩＬ－１２（ＴＡＶＯ（Ｐ２Ａ））を用いてＩＴ－ＥＰで処置し、続いて３日目および５日目に５０μｇのＥＶまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを用いてＩＴ－ＥＰで処置した４Ｔ１腫瘍における、（Ｃ）ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、（Ｄ）ＣＤ８＋ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞、および（Ｅ）ＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞を示すグラフ：Ｔ細胞集団をＩＴ－ＥＰ処置の６日後に測定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
０日目に５０μｇの空ベクター（ＥＶ）またはＩＬ－１２（ＴＡＶＯ（Ｐ２Ａ））を用いてＩＴ－ＥＰで処置し、続いて３日目および５日目に５０μｇのＥＶまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを用いてＩＴ－ＥＰで処置した４Ｔ１腫瘍における、（Ｆ）エフェクターＴ細胞および（Ｇ）エフェクターメモリーＴ細胞を示すグラフ：Ｔ細胞集団をＩＴ－ＥＰ処置の６日後に測定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
（Ａ）ＩＬ－１２有りまたは無しで空ベクターまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ（αＣＤ３）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞との３日間の共培養後に増殖したＴＩＬ（抗ＰＤ－１治療で活発に進行するメラノーマ患者由来）の割合を示すグラフ（腫瘍浸潤Ｔ細胞を、陽性対照としてのプレート結合抗ＣＤ３抗体と培養した）（ｎ＝３）；（Ｂ）（Ａ）のようにトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞との３日間の共培養後のＣＤ８＋ＴＩＬ上のＰＤ－１発現の割合；＃＝検出未満、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、統計学的有意性は一元配置分散分析によって決定した。
（Ａ）のようにトランスフェクトしたＴＩＬおよびＨＥＫ２９３Ｔ細胞の共培養物の馴化培地中のＩＦＮγを測定するＥＬＩＳＡを示すグラフ。＃＝検出未満、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、統計学的有意性は一元配置分散分析によって決定した。（５つのバーの各セット、順に：ｐＩＬ－１２を含まないＥＶ、ｐＩＬ－１２を含むＥＶ、ｐＩＬ－１－２を含まない抗ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、ｐＩＬ－１２を含む抗ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、プレート結合抗ＣＤ３抗体）
詳細な説明
Ｉ．定義
「核酸」は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む。ＲＮＡおよびＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、縮合核酸、送達ベクターと共に製剤化された核酸、カチオン性脂質と共に製剤化された核酸、ペプチドまたはカチオン性ポリマーと共に製剤化された核酸、ＲＮＡおよびｍＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。核酸には、修飾ＲＮＡまたはＤＮＡも含まれる。
「発現カセット」は、発現産物（例えば、ペプチド（すなわち、ポリペプチドもしくはタンパク質）またはＲＮＡ）をコードする核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）コード配列またはＲＮＡもしくはＤＮＡのセグメントを指す。発現カセットは、プラスミド中に存在し得る。発現カセットは、哺乳動物細胞などの細胞において１またはそれを超えるポリペプチドを発現することができる。発現カセットは、コードされた発現産物の発現に必要な１またはそれを超える配列を含み得る。発現カセットは、ＤＮＡコード配列に作動可能に連結されたエンハンサー、プロモーター、ターミネーターおよびポリＡシグナルのうちの１または複数を含み得る。
「プラスミド」という用語は、哺乳動物細胞で発現することができるポリペプチド（記載された発現カセットのいずれかなど）をコードする少なくとも１つの配列を含む核酸を指す。プラスミドは、閉環状ＤＮＡ分子であり得る。様々な配列をプラスミドに組み込んで、コード配列の発現を変化させて、細胞内でのプラスミドの複製を促進することができる。転写、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の安定性、ＲＮＡプロセシング、または翻訳の効率に影響を及ぼす配列を使用することができる。そのような配列には、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、プロモーター、イントロンおよび３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）が含まれるが、これらに限定されない。プラスミドは、大量かつ／または高収率で製造することができる。プラスミドは、ｃＧＭＰ製造を使用してさらに製造することができる。プラスミドは、大腸菌などの細菌に形質転換することができる。ＤＮＡプラスミドは、哺乳動物対象への注射に安全かつ有効であるように製剤化することができる。
「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、連続ストリングの２またはそれを超えるアミノ酸を含む。「タンパク質配列」、「ペプチド配列」、「ポリペプチド配列」、または「アミノ酸配列」は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中の一連の２またはそれを超えるアミノ酸を指す。
「発現する」および「発現」という用語は、遺伝子、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列中の情報の顕在化を可能にする、または顕在化を生じさせること；例えば、対応する遺伝子の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによってタンパク質を産生することを意味する。ＤＮＡ配列は、細胞内でまたは細胞によって発現されて、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質などの発現産物を形成する。発現産物自体は、細胞によって発現されるともいえる。
「作動可能に連結された」とは、２またはそれを超える構成要素（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）が、両方の構成要素が正常に機能し、少なくとも１つの構成要素が少なくとも１つの他の構成要素に対して及ぼされる機能を媒介することができる可能性を可能にするように並置されることを指す。例えば、コード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、ｍＲＮＡを含むＲＮＡへのコード配列のＲＮＡポリメラーゼ媒介転写を指示し、次いでこれをスプライシングし（イントロンを含む場合）、必要に応じて、コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳することができる。コード配列は、１またはそれを超える転写または翻訳制御配列に作動可能に連結され得る。遺伝子に作動可能に連結されたターミネーター／ポリＡシグナルは、ＲＮＡへの遺伝子の転写を終結させ、ＲＮＡへのポリＡシグナルの付加を指示する。
「プロモーター」は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、直接的に、または他のプロモーターに結合したタンパク質もしくは物質を介して）に結合し、コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼす１またはそれを超える追加の領域またはエレメント（エンハンサーが含まれるが、これに限定されない）を含み得る。プロモーターは、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、または細胞型特異的プロモーターであり得るが、これらに限定されない。プロモーターの例は、例えば、国際公開第２０１３／１７６７７２号に見出すことができる。プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、Ｉｇκプロモーター、ｍＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、β－アクチンプロモーター、α－アクチンプロモーター、ＳＲαプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターおよびＥＦ１αプロモーターであり得るが、これらに限定されない。ＣＭＶプロモーターは、ＣＭＶ最初期プロモーター、ヒトＣＭＶプロモーター、マウスＣＮＶプロモーターおよびサルＣＭＶプロモーターであり得るが、これらに限定されない。
「翻訳修飾エレメント」は、単一の転写物からの２またはそれを超える遺伝子の翻訳を可能にする。翻訳修飾エレメントには、ｍＲＮＡの内部領域からの翻訳開始を可能にする内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、およびエレメントのＣ末端でのペプチド結合の合成をリボソームにスキップさせるピコルナウイルス由来の２Ａペプチドが含まれる。翻訳調節エレメントの組み込みは、単一のポリシストロン（マルチシストロン）ｍＲＮＡからの２またはそれを超えるポリペプチドの共発現をもたらす。２Ａモジュレーターには、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａが含まれるが、これらに限定されない。２ＡモジュレーターはＰＧ／Ｐ切断部位を含む。
「相同」配列（例えば、核酸配列またはアミノ酸配列）は、例えば、既知の参照配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるように、既知の参照配列と同一または実質的に類似の配列を指す。「オルソロガス」遺伝子（オルソログ）には、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した異なる種の遺伝子が含まれる。オルソログは、典型的には、進化の過程で同じ機能を保持する。配列同一性は、デフォルトのギャップパラメータを使用して、または検査、および最良アライメントによって、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムを使用して配列をアライメントすることによって決定することができる（すなわち、比較ウィンドウにわたって配列類似性の最も高いパーセンテージをもたらす）。配列同一性のパーセンテージは、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較し、両配列において同一の残基が存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を、比較ウィンドウ内のギャップをカウントしないマッチした位置およびミスマッチした位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除算し、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。別段示されない限り、２つの配列間の比較ウィンドウは、２つの配列のうちの短い方の全長によって定義される。
「免疫刺激性サイトカイン」には、ウイルス抗原、細菌抗原または腫瘍抗原を含む外来抗原に対する免疫応答を媒介または増強するサイトカインが含まれる。免疫刺激性サイトカインとしては、限定されないが、ＴＮＦα、ＩＬ－１、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２ ｐ３５、ＩＬ－１２ ｐ４０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－２１およびＴＧＦβを挙げることができる。
「がん免疫療法」は、免疫系の構成要素を含むかまたは使用するがんを処置するために使用される治療である。がん免疫療法は、がんと戦うために対象の免疫系を誘導、改変または増強することができる。がん免疫療法には、がん細胞または免疫細胞によって発現されるタンパク質に結合する、阻害する、またはその機能を改変させる抗体（標的化抗体）、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、およびケモカインが含まれるが、これらに限定されない。
「がん」という用語は、一般に不適切な細胞増殖、または異常もしくは過剰な細胞増殖を特徴とする無数の疾患を含む。がんの例には、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がん、前立腺がん、膵臓がん、メラノーマ、肺がん、卵巣がん、腎臓がん、脳がん、または肉腫が含まれるが、これらに限定されない。
「処置難治性がん」（または難治性がん）は、少なくとも１つの以前の医学的処置に応答しないか、または応答しなかったがんである。いくつかの実施形態では、処置難治性がんは、処置に関して、処置に対する不十分な応答または処置に対する部分的もしくは完全な応答の欠如を示す。例えば、患者は、少なくとも２用量の処置を受けた後に少なくとも部分奏効を示さない場合、処置（例えば、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１阻害剤治療などのチェックポイント阻害剤治療）に対して難治性であると考えられ得る。難治性がんは、処置前または処置開始時に処置に抵抗性であり得る。難治性がんは、処置の経過中に難治性になり得る。
「応答者」は、抗がん治療に対する完全奏効を達成した、または達成している対象である。「非応答者」は、抗がん治療に対して十分な応答を達成しなかった、または達成していない対象である。非応答者は、部分奏効、安定疾患、進行性疾患、がん細胞数の増加、または腫瘍転移の継続もしくは増加を有し得る。疾患の応答、症候、および／または重症度を評価する際の対象の評価は、当技術分野で公知の様々な方法によって行うことができる。
「腫瘍微小環境」とは、腫瘍の周囲の環境を指し、例えば腫瘍に酸素、成長因子および栄養素を提供することによって、または腫瘍に対する免疫応答を阻害することによって、腫瘍の成長および／または生存を助ける非悪性の血管および間質組織を含む。腫瘍微小環境は、周囲の血管、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来炎症細胞、リンパ球、シグナル伝達分子および細胞外マトリックスを含む、腫瘍が存在する細胞環境を含む。
「腫瘍辺縁」または「辺縁組織」は、腫瘍のすぐ近くまたは周囲の視覚的に正常な組織である。典型的には、辺縁組織は、組織から０．１～２ｃｍ以内の視覚的に正常な組織である。腫瘍辺縁組織は、腫瘍を外科的に切除する際に除去されることが多い。
「処置」という用語は、がん細胞の増殖の阻害もしくは減少、がん細胞の破壊、がん細胞の増殖の予防、悪性細胞の開始の予防、形質転換された前悪性細胞の悪性疾患への進行の停止もしくは逆転、または疾患の改善のための医薬または治療を含むが、これらに限定されない。
「エレクトロポレーション」という用語は、プラスミド、核酸、または薬物などの生体分子の細胞への進入を促進するためのエレクトロポレーションパルスの使用を指す。
「排出リンパ節」は、特定の領域または器官からのリンパを濾過するリンパ節である。腫瘍および腫瘍処置に関連して、排出リンパ節は腫瘍のすぐ下流にある。
「エピトープタグ」は、高親和性抗体が結合する短いアミノ酸配列（または短いアミノ酸配列をコードする核酸配列）である。例示的なエピトープタグとしては、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｓｐｏｔタグ、Ｔ７タグおよびＮＥタグが挙げられるが、これらに限定されない。エピトープタグは、免疫検出を容易にするために使用することができる。
腫瘍試料は、対象由来の腫瘍または腫瘍浸潤リンパ球の一部、小片、部分、セグメントまたは画分を指す。腫瘍試料は、当技術分野で公知の方法を使用して対象から得られるかまたは対象から除去され得る。例示的な方法としては、限定されないが、外科的切除、生検、針生検、または腫瘍もしくは腫瘍浸潤リンパ球の一部、小片、部分、セグメントもしくは画分を含む試料を得るための他の手段が挙げられる。腫瘍試料は、原発腫瘍、浸潤性腫瘍、および転移性腫瘍を含む任意の固形腫瘍に由来し得る。腫瘍試料は、例えば、細胞残屑および他の望ましくない分子を除去するために、追加の精製および処理を受けてもよい。追加の処理は、例えばＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いた増幅をさらに含み得る。腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３レベルまたは発現を測定するために、腫瘍試料は、分析に使用される特定の定量試験またはアッセイに適した当技術分野で公知の方法を使用して精製または処理することができる。
ＩＩ．ＣＸＣＲ３
ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３は、ＣＸＣケモカイン受容体ファミリーのＧαｉタンパク質共役受容体である。ＣＸＣＲ３の他の名称は、Ｇタンパク質共役受容体９（ＧＰＲ９）およびＣＤ１８３である。ＣＸＣＲ３は、ＣＸＣケモカインＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１に結合する。ＣＸＣＲ３は、主に活性化Ｔリンパ球およびＮＫ細胞上に発現される。ＣＸＣＲ３は、Ｔｈ１細胞上に優先的に発現される。ＣＸＣＲ３は、白血球輸送を調節することができる。ＣＸＣＲ３－リガンド相互作用は、Ｔｈ１細胞を引きつけ、Ｔｈ１細胞の成熟を促進する。白血球上のＣＸＣＲ３の発現は、腫瘍または腫瘍環境へのそれらの遊走を媒介することが報告されている。
対象から得られた腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３レベルまたは発現を測定することを含む、チェックポイント阻害剤治療および／または免疫刺激性サイトカイン治療に対する応答を予測する方法が記載される。いくつかの実施形態では、腫瘍または腫瘍微小環境におけるＣＸＣＲ３レベルまたは発現は、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを対象に投与した後に測定される。ＣＸＣＲ３のレベルまたは発現は、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３ ｍＲＮＡを測定すること、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３タンパク質を測定すること、または、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞を測定することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインは、典型的に応答性対象において薬学的に有効であると考えられるであろう用量を含む。
腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３レベルまたは発現は、遺伝子またはタンパク質発現の量またはレベルを測定するための当技術分野で公知の試験またはアッセイを使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、試験またはアッセイは、ＦＤＡによって承認された試験またはアッセイである。いくつかの実施形態では、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現のレベルは、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３ ｍＲＮＡのレベルを測定することによって決定される。試料におけるＣＸＣＲ３ ｍＲＮＡレベルを測定する例示的な方法には、核酸増幅アッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ、リアルタイムＰＣＲ、ＴａｑＭａｎベースのアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイおよびマイクロアレイアッセイが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現のレベルは、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３タンパク質のレベルを測定することによって決定される。試料におけるＣＸＣＲ３タンパク質のレベルを測定する例示的な方法には、免疫ベースの検出アッセイ（イムノアッセイ）、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびＡｌｐｈａＬＩＳＡが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現のレベルは、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞の数を測定することによって決定される。試料におけるＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞の数を測定する例示的な方法には、細胞選別アッセイが含まれるが、これに限定されない。
いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、抗がん治療の前に対象から得られる。いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、少なくとも１つのラウンドの抗がん治療の後に対象から得られる。いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、少なくとも１つのラウンドのチェックポイント阻害剤治療の後に対象から得られる。いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、少なくとも１つのラウンドの免疫刺激性サイトカイン治療の後に対象から得られる。いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、少なくとも１つのラウンドのチェックポイント阻害剤＋免疫刺激性サイトカイン治療の後に対象から得られる。いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、少なくとも１つのラウンドのチェックポイント阻害剤治療および／または免疫刺激性サイトカイン治療の１～３０日後に対象から得られる。いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、少なくとも１つのラウンドのチェックポイント阻害剤治療および／または免疫刺激性サイトカイン治療の１～２１日後に対象から得られる。いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、少なくとも１つのラウンドのチェックポイント阻害剤治療および／または免疫刺激性サイトカイン治療の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１日後に対象から得られる。チェックポイント阻害剤治療は、抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１治療であり得るが、これに限定されない。抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１治療は全身投与され得る。免疫刺激性サイトカインは、ＩＬ－１２および／またはＩＬ－１５治療であり得るが、これらに限定されない。ＩＬ－１２および／またはＩＬ－１５治療は、ＩＬ－１２および／またはＩＬ－１５をコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションによって投与することができる。
対象から得られた腫瘍試料において測定されるＣＸＣＲ３発現を、所定の対照において測定されるＣＸＣＲ３発現と比較する。対象から得られた腫瘍試料において決定されるＣＸＣＲ３発現のレベルは、所定の対照におけるＣＸＣＲ３発現のレベルを測定するために使用されるのと同じまたは実質的に同じ方法を使用して測定される。
いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、少なくとも１つのラウンドのチェックポイント阻害剤治療または免疫刺激性サイトカイン治療（処置）を対象に投与した後に対象から得られ、所定の対照は、チェックポイント阻害剤治療または免疫刺激性サイトカイン治療（処置）を対象に投与する前に対象から得られた腫瘍試料を含む。処置を投与した後に得られた対象からの腫瘍試料において測定されたＣＸＣＲ３発現のレベルを、所定の対照において測定されたＣＸＣＲ３発現のレベルと比較する。いくつかの実施形態では、処置後に得られた腫瘍試料において測定されたＣＸＣＲ３発現のレベルが、所定の対照において測定されたＣＸＣＲ３発現のレベルと比較して高いことは、対象がチェックポイント阻害剤治療および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答する可能性が高いことを示し、処置後に得られた腫瘍試料において測定されたＣＸＣＲ３発現のレベルが、所定の対照において測定されたＣＸＣＲ３発現のレベルと同じまたはそれより低いことは、対象がチェックポイント阻害剤治療および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答しないリスクがあることを示す。いくつかの実施形態では、処置後に得られた腫瘍試料において測定されたＣＸＣＲ３発現のレベルが、所定の対照において測定されたＣＸＣＲ３発現のレベルの２倍よりも高いことは、対象がチェックポイント阻害剤治療および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答する可能性が高いことを示し、処置後に得られた腫瘍試料において測定されたＣＸＣＲ３発現のレベルが、所定の対照において測定されたＣＸＣＲ３発現のレベルの２倍未満であることは、対象がチェックポイント阻害剤治療および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答しないリスクがあることを示す。いくつかの実施形態では、処置後に得られた腫瘍試料において測定されるＣＸＣＲ３発現のレベルが、所定の対照において測定されるＣＸＣＲ３発現のレベルの１．９×、１．８×、１．７×、１．６×、１．５、１．４×、１．３×、１．２×、または１．１×を超えることは、対象がチェックポイント阻害剤治療および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態では、処置後に得られた腫瘍試料において測定されるＣＸＣＲ３発現のレベルが、所定の対照において測定されるＣＸＣＲ３発現のレベルの１．９×、１．８×、１．７×、１．６×、１．５、１．４×、１．３×、１．２×、または１．１×未満であることは、対象がチェックポイント阻害剤治療および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答しないリスクがあることを示す。
いくつかの実施形態では、所定の対照は、チェックポイント阻害剤治療に対する既知の応答者および／または既知の非応答者の集団に由来する標準を含む。いくつかの実施形態では、所定の対照は、免疫刺激性サイトカイン治療に対する既知の応答者および／または既知の非応答者の集団に由来する標準を含む。いくつかの実施形態では、所定の対照は、チェックポイント阻害剤＋免疫刺激性サイトカインの併用治療に対する既知の応答者および／または既知の非応答者の集団に由来する標準を含む。既知の応答者および／または既知の非応答者の集団について決定されるＣＸＣＲ３発現のレベルは、対象から得られた腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現のレベルを測定するために使用されるのと同じまたは実質的に同じ方法を使用して測定される。対象から得られた腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現のレベルが、既知の応答者の集団について決定されたＣＸＣＲ３発現のレベルと同じまたはそれより高いことは、対象がチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答する可能性が高いことを示す。対象から得られた腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現のレベルが、既知の応答者の集団について決定されるＣＸＣＲ３発現のレベルと比較して低いか、または既知の非応答者の集団について決定されるＣＸＣＲ３発現のレベルと同じもしくは低いことは、対象がチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答しないリスクがある可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、チェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療の投与前に対象から得られる。いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、少なくとも１つのラウンドのチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療の投与後に対象から得られる。いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、少なくとも１つのラウンドのチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療の投与と同時に対象から得られる。既知の応答者および／または既知の非応答者の集団におけるＣＸＣＲ３発現のレベルは、既知の応答者および／または既知の非応答者において測定されるＣＸＣＲ３発現のレベルの平均値（ａｖｅｒａｇｅ）または平均（ｍｅａｎ）として計算され得るか、または表され得る。
ＩＩＩ．ＣＸＣＬ９
Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド９（ＣＸＣＬ９）は、ＣＸＣケモカインファミリーに属する小さなサイトカインである。ＣＸＣＬ９は、ガンマインターフェロンによって誘導されるモノカイン（Ｍｏｎｏｋｉｎｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｇａｍｍａ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）（ＭＩＧ）としても知られている。ＣＸＣＬ９は、Ｔ細胞走化性因子であり、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の走化性動員を促進する。マウスおよびヒトＣＸＣＬ９のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３５および配列番号５８によって表す。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ９は、（ａ）配列番号３５もしくは５８のアミノ酸配列またはその機能的等価物；または（ｂ）配列番号３５もしくは５８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
ＩＶ．抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ
抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ－４の細胞外ドメインに対する親和性を有しており、かつ／または、ＣＴＬＡ－４シグナル伝達を阻害する、抗ＣＴＬＡ－４一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖは、短いリンカーペプチドで連結された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を含む。例示的なマウス抗ＣＴＬＡ－４重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号３９および４３によって表される。例示的なマウス抗ＣＴＬＡ－４軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号３７および４１によって表される。
抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、ファージディスプレイから同定することができる。抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖはまた、公知の抗ＣＴＬＡ－４抗体、例えばハイブリドーマからＶＨおよびＶＬをサブクローニングすることによって生成することもできる。公知の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、例えばとりわけ、２０１９００４８０９６、２０１３０１３６７４９、２０１２０１４８５９７、２０１４００９９３２５、２０１５０１０４４０９、２０１１０２９６５４６、および２００８０２３３１２２に記載されている。公知の抗ＣＴＬＡ－４抗体には、イピリムマブおよびトレメリムマブが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをヒト化することができる。ヒト化抗体（または抗体フラグメントもしくはドメイン）は、ヒトにおいて天然に産生される抗体バリアントとの類似性を高めるようにタンパク質配列が改変されている非ヒト種由来の抗体である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、抗ＣＴＬＡ－４抗体の関連する相補性決定領域（ＣＤＲ、超可変領域（ＨＶＲ）とも呼ばれる）をヒトＶＨおよびＶＬドメイン足場に挿入することによって作製することができる。
抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、ＶＨ鎖のＣ末端をＶＬのＮ末端と連結することによって形成することができる。あるいは、ＶＬのＣ末端をＶＨのＮ末端に連結することができる。ペプチドリンカーは、約１０～約２５アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖペプチドリンカーは、グリシンが豊富である。ｓｃＦｖペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｘ（式中、ｘは２以上５以下の整数である）であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、連結されたｓｃＦｖペプチドは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含む（すなわち［（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ］３、（Ｇ４Ｓ）３またはＧ４Ｓ（×３）とも呼ばれる）。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖペプチドリンカーは、Ｇ４Ｓ（×３）からなる。いくつかの実施形態では、コードされた抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖポリペプチドは、Ｉｇκシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含む。例示的な抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖアミノ酸配列は、配列番号７０および７２によって表される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、（ａ）配列番号７０もしくは７２のアミノ酸配列またはその機能的等価物；または（ｂ）配列番号７０もしくは７２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
Ｖ．ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ
ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、膜貫通ドメイン（ＴＭ）に融合した抗ＣＤ３一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖは、短いリンカーペプチドで連結された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を含む。例示的な抗ＣＤ３重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８および４７によって表される。例示的なマウス抗ＣＤ３軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１１および５０によって表される。
抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ファージディスプレイから同定することができる。抗ＣＤ３ ｓｃＦｖはまた、公知の抗ＣＤ３抗体、例えばハイブリドーマからＶＨおよびＶＬをサブクローニングすることによって生成することもできる。公知の抗ＣＤ３抗体は、例えば、ＵＳ２０１８０１１７１５２、ＵＳ２０１４０１９３３９９、ＵＳ２０１００１８３５５４、およびＵＳ２００６０１７７８９６に記載されている。公知の抗ＣＤ３抗体には、ＯＫＴ３（ムロモナブ－ＣＤ３）、１４５－２Ｃ１１、１７Ａ２、ＳＰ７、およびＵＣＨＴ１も含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをヒト化することができる。ヒト化抗体（または抗体フラグメントもしくはドメイン）は、ヒトにおいて天然に産生される抗体バリアントとの類似性を高めるようにタンパク質配列が改変されている非ヒト種由来の抗体である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、抗ＣＤ３抗体の関連する相補性決定領域（ＣＤＲ、超可変領域（ＨＶＲ）とも呼ばれる）をヒトＶＨおよびＶＬドメイン足場に挿入することによって作製することができる。
抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ＶＨ鎖のＣ末端をＶＬのＮ末端と連結することによって形成することができる。あるいは、ＶＬのＣ末端をＶＨのＮ末端に連結することができる。ペプチドリンカーは、約１０～約２５アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖペプチドリンカーは、グリシンが豊富である。ｓｃＦｖペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｘ（式中、ｘは２以上５以下の整数である）であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖペプチドリンカーは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含む（すなわち［（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ］３、（Ｇ４Ｓ）３またはＧ４Ｓ（×３）とも呼ばれる）。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖペプチドリンカーは、Ｇ４Ｓ（×３）からなる。
膜貫通ドメイン（ＴＭ）は、生物学的脂質二重層（膜）に挿入され、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを膜にアンカリングすることができるポリペプチドを含む。ＴＭは当技術分野で公知であり、典型的には主に非極性アミノ酸からなる。膜貫通ドメインは、ＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインまたはＰＤＧＦＲα膜貫通ドメイン（ＰＤＧＦＲは血小板由来成長因子受容体である）であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、スペーサーが抗ＣＤ３ ｓｃＦｖと膜貫通ドメインとの間に含まれる。いくつかの実施形態では、ＴＭドメインは、以下を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む：ＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＫＰＲ（配列番号２５）、ＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＫＰＲ（配列番号２７）、ＰＤＧＦＲβ：ＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＶＩＳＬＩＩＬＩ（配列番号８３）、ＰＤＧＦＲβ：ＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩ（配列番号８４）、ＰＤＧＦＲα：ＡＡＶＬＶＬＬＶＩＶＩＩＳＬＩＶＬＶＶＩＷ（配列番号８５）、およびＰＤＧＦＲα：ＡＡＶＬＶＬＬＶＩＶＩＶＳＬＩＶＬＶＶＩＷ（配列番号８６）。いくつかの実施形態では、ＴＭドメインは、以下を含む群から選択される核酸配列によってコードされる：ｇｔｇｇｇｃｃａｇｇａｃａｃｇｃａｇｇａｇｇｔｃａｔｃｇｔｇｇｔｇｃｃａｃａｃｔｃｃｔｔｇｃｃｃｔｔｔａａｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇａｔｃｔｃａｇｃｃａｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃａｃｃａｔｃａｔｃｔｃｃｃｔｔａｔｃａｔｃｃｔｃａｔｃａｔｇｃｔｔｔｇｇｃａｇａａｇａａｇｃｃａｃｇｔ（配列番号２４）、ｇｃｔｇｔｇｇｇｃｃａｇｇａｃａｃｇｃａｇｇａｇｇｔｃａｔｃｇｔｇｇｔｇｃｃａｃａｃｔｃｃｔｔｇｃｃｃｔｔｔａａｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇａｔｃｔｃａｇｃｃａｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃａｃｃａｔｃａｔｃｔｃｃｃｔｔａｔｃａｔｃｃｔｃａｔｃａｔｇｃｔｔｔｇｇｃａｇａａｇａａｇｃｃａｃｇｔ（配列番号２６）、ＰＤＧＦＲβ：ｔｇｇｔｇａｔｃｔｃａｇｃｃａｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃａｃｃａｔｃａｔｃｔｃｃｃｔｔａｔｃａｔｃｃｔｃａｔｃ（配列番号８７）、ＰＤＧＦＲβ：ｇｔｇｇｔｇａｔｃｔｃａｇｃｃａｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃａｃｃａｔｃａｔｃｔｃｃｃｔｔａｔｃａｔｃｃｔｃａｔｃ（配列番号８８）、ＰＤＧＦＲα：ｇｃｔｇｃａｇｔｃｃｔｇｇｔｇｃｔｇｔｔｇｇｔｇａｔｔｇｔｇａｔｃａｔｃｔｃａｃｔｔａｔｔｇｔｃｃｔｇｇｔｔｇｔｃａｔｔｔｇｇａａ（配列番号８９）。
いくつかの実施形態では、コードされたＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥポリペプチドは、Ｉｇκシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含む。
例示的なＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥアミノ酸配列は、配列番号６０、６２、７４、および７６によって表される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、（ａ）配列番号６０、６２、７４、または７６のアミノ酸配列またはその機能的等価物、または（ｂ）配列番号６０、６２、７４、または７６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
ＶＩ．発現カセット
任意の記載されたポリペプチド、ＣＸＣＬ９、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖおよびＩＬ－１２は、核酸上にコードされ得る。核酸は、発現カセットであり得るが、これに限定されない。発現カセットはプラスミド上にあり得る。「プラスミド」という用語は、細菌ベクター、ウイルスベクター、エピソーマルプラスミド、組込みプラスミド、またはファージベクターを含む任意の核酸ベクターを含む。発現カセットの送達には、発現カセットを含むプラスミドまたは核酸ベクター（「発現ベクター」または「ベクター」と呼ばれる）の送達が含まれる。
コードされたポリペプチドは、発現カセットにおいて、第２のポリペプチドをコードする配列に連結され得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは融合タンパク質をコードする。「融合タンパク質」という用語は、ペプチド結合または他の化学結合によって互いに連結された２またはそれを超えるポリペプチドを含むタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、２つのポリペプチドを含む一本鎖ポリペプチドとして組換え発現される。２またはそれを超えるポリペプチドは、直接または１またはそれを超えるアミノ酸を含むリンカーを介して連結することができる。
発現カセットまたはプラスミドは、マルチシストロン発現カセットを含有し得る。マルチシストロン発現カセットは、同じｍＲＮＡから２またはそれを超える別個のタンパク質を発現し、１またはそれを超える翻訳修飾エレメントを含有する。
いくつかの実施形態では、記載される発現カセットは、単一のプロモーターから発現される２つまたは３つのポリペプチドをコードし、２つまたは３つのポリペプチドが単一のｍＲＮＡから発現されることを可能にする１またはそれを超える翻訳修飾エレメントを有する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、以下を含む：
ａ）Ｐ－Ａ－Ｔ－Ｂ、
ｂ）Ｐ－Ｂ－Ｔ－Ａ、
ｃ）Ｐ－Ｂ－Ｔ－Ｂ’
ｃ）Ｐ－Ａ－Ｔ－Ｂ－Ｔ’－Ｂ’または
ｄ）Ｐ－Ｂ－Ｔ－Ｂ’－Ｔ’－Ａ
式中、Ｐはプロモーターであり、ＡはＣＸＣＬ９またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードし、ＢおよびＢ’はサイトカインまたはサイトカインサブユニットをコードし、ＴおよびＴ’は翻訳修飾エレメントである。
プロモーターは、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、または細胞型特異的プロモーターであり得るが、これらに限定されない。プロモーターの例は、例えば、国際公開第２０１３／１７６７７２号に見出すことができる。プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、Ｉｇκプロモーター、ｍＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、β－アクチンプロモーター、α－アクチンプロモーター、ＳＲαプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターおよびＥＦ１αプロモーターであり得るが、これらに限定されない。ＣＭＶプロモーターは、ＣＭＶ最初期プロモーター、ヒトＣＭＶプロモーター、マウスＣＮＶプロモーターおよびサルＣＭＶプロモーターであり得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Ｔおよび／またはＴ’は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントまたはリボソームスキッピングモジュレーターである。リボソームスキップモジュレーターは、２Ａエレメント（２Ａペプチドまたは２Ａ自己切断ペプチドとも呼ばれる）であり得るが、これらに限定されない。２Ａエレメントは、Ｐ２Ａ（配列番号２９）、Ｔ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａエレメントであり得るが、これらに限定されない。
ＣＸＣＬ９は、マウスＣＸＣＬ９およびヒトＣＸＣＬ９、またはその機能的等価物もしくはホモログもしくはオルソログであり得るが、これらに限定されない。
ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－膜貫通ドメイン（ＴＭ）、エピトープタグ（ＥＴ）－抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＥＴ－ＴＭ、ＥＴ－抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＴＭ、抗ＣＤ３、ｓｃＦｖ－ＥＴ－ＴＭ、ＨＡ－抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－Ｍｙｃ－ＴＭ、ＨＡ－抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＴＭ、抗ＣＤ３、ｓｃＦｖ－Ｍｙｃ－ＴＭ、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＴＭ、または抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＴＭであり得るが、これらに限定されない。抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、抗マウスＣＤ３ ｓｃＦｖまたは抗ヒトＣＤ３ ｓｃＦｖであり得る。これらの各々はシグナルペプチドを含むことができる。シグナルペプチドは、Ｉｇκシグナルペプチドであり得るが、これに限定されない。ＴＭは、ＰＤＧＦＲ ＴＭであり得るが、これに限定されない。抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、２Ｃ１１またはＯＫＴ３であり得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、サイトカインは、免疫刺激性サイトカインである。いくつかの実施形態では、免疫刺激性サイトカインは、インターロイキンである。サイトカインには、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３５、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γおよびＴＧＦ－βが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｂおよび／またはＢ’は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２ ｐ３５－ＩＬ－１２ ｐ４０融合物、ＩＬ－１２ ｐ７０、ＩＬ－１２ ｐ３５またはＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドをコードする。ＩＬ－１２、ＩＬ－１２ ｐ３５－ＩＬ－１２ ｐ４０融合物、ＩＬ－１２ ｐ７０、ＩＬ－１２ ｐ３５またはＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドは、マウスまたはヒトＩＬ－１２、ＩＬ－１２ ｐ３５－ＩＬ－１２ ｐ４０融合物、ＩＬ－１２ ｐ７０、ＩＬ－１２ ｐ３５またはＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドであり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＢはＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’はＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。
いくつかの実施形態では、ＰはＣＭＶプロモーターであり、ＡはＣＸＣＬ９をコードし、ＴはＰ２Ａエレメントであり、ＢはＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’はＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。
いくつかの実施形態では、ＰはＣＭＶプロモーターであり、ＡはヒトＣＸＣＬ９をコードし、ＴはＰ２Ａエレメントであり、ＢはＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’はＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。
いくつかの実施形態では、ＰはＣＭＶプロモーターであり、ＡはマウスＣＸＣＬ９をコードし、ＴはＰ２Ａエレメントであり、ＢはＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’はＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。
いくつかの実施形態では、ＰはＣＭＶプロモーターであり、ＡはＩｇκ－ＨＡ－抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＰＤＧＦＲ ＴＭ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードし、ＴはＰ２Ａエレメントであり、ＢはＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’はＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。
いくつかの実施形態では、ＰはＣＭＶプロモーターであり、ＡはＩｇκ－抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＰＤＧＦＲ ＴＭ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードし、ＴはＰ２Ａエレメントであり、ＢはＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’はＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。
いくつかの実施形態では、ＰはＣＭＶプロモーターであり、ＡはＩｇκ－ＨＡ－２Ｃ１１－ＰＤＧＦＲ ＴＭ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードし、ＴはＰ２Ａエレメントであり、ＢはＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’はＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。
いくつかの実施形態では、ＰはＣＭＶプロモーターであり、ＡはＩｇκ－２Ｃ１１－ＰＤＧＦＲ ＴＭ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードし、ＴはＰ２Ａエレメントであり、ＢはＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’はＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。
いくつかの実施形態では、ＰはＣＭＶプロモーターであり、ＡはＩｇκ－ＨＡ－ＯＣＴ３－ＰＤＧＦＲ ＴＭ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードし、ＴはＰ２Ａエレメントであり、ＢはＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’はＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。
いくつかの実施形態では、ＰはＣＭＶプロモーターであり、ＡはＩｇκ－ＯＫＴ３－ＰＤＧＦＲ ＴＭ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードし、ＴはＰ２Ａエレメントであり、ＢはＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’はＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。
いくつかの実施形態では、ＢはＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、ＴはＰ２Ａエレメントであり、Ｂ’はＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。いくつかの実施形態では、ＢはＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、ＴはＩＲＥＳエレメントであり、Ｂ’はＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。プロモーターは、ＣＭＶプロモーターであり得るが、これに限定されない。
いくつかの実施形態では、本発明者らは、配列番号６０、６２、７４もしくは７６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号６０、６２、７４もしくは７６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする発現カセットを記載する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号６０、６２、７４、または７６のアミノ酸配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、コードされたポリペプチドは、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥポリペプチドの機能活性を保持する。
いくつかの実施形態では、本発明者らは、配列番号６４、６６、７８、もしくは７０のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号６４、６６、７８、もしくは７０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする発現カセットを記載する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号６４、６６、７８、または７０のアミノ酸配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、コードされたポリペプチドは、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥポリペプチドおよびＩＬ－１２ポリペプチドの機能活性を保持する。
いくつかの実施形態では、本発明者らは、配列番号３５または５８のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号３５または５８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする発現カセットを記載する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号３５または５８のアミノ酸配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、コードされたポリペプチドは、ＣＸＣＬ９ポリペプチドの機能活性を保持する。
いくつかの実施形態では、本発明者らは、配列番号６８または８２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号６８または８２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする発現カセットを記載する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号６８または８２のアミノ酸配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、コードされたポリペプチドは、ＣＸＣＬ９ポリペプチドおよびＩＬ－１２ポリペプチドの機能活性を保持する。
いくつかの実施形態では、本発明者らは、配列番号７０または７２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号７０または７２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする発現カセットを記載する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号７０または７２のアミノ酸配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、コードされたポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖポリペプチドの機能活性を保持する。
いくつかの実施形態では、本発明者らは、配列番号５９、６１、７３もしくは７５のヌクレオチド配列、または配列番号５９、６１、７３もしくは７５のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む発現カセットを記載する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号５９、６１、７３、または７５のヌクレオチド配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える同一性を有する配列を含み、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥポリペプチドの機能活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、配列番号５９、６１、７３もしくは７５のヌクレオチド配列、または配列番号５９、６１、７３もしくは７５のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、本発明者らは、配列番号６３、６５、７７、もしくは７９のヌクレオチド配列、または配列番号６３、６５、７７、もしくは７９のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む発現カセットを記載する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号６３、６５、７７、または７９のヌクレオチド配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える同一性を有する配列を含み、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥポリペプチドおよびＩＬ－１２ポリペプチドの機能活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、配列番号６３、６５、７７、もしくは７９のヌクレオチド配列、または配列番号６３、６５、７７、もしくは７９のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、本発明者らは、配列番号３４もしくは５７のヌクレオチド配列、または配列番号３４もしくは５７のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む発現カセットを記載する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号３４または５７のヌクレオチド配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える同一性を有する配列を含み、ＣＸＣＬ９ポリペプチドの機能活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、配列番号３４もしくは５７のヌクレオチド配列、または配列番号３４もしくは５７のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、本発明者らは、配列番号６７もしくは８１のヌクレオチド配列、または配列番号６７もしくは８１のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む発現カセットを記載する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号６７または８１のヌクレオチド配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える同一性を有する配列を含み、ＣＸＣＬ９ポリペプチドおよびＩＬ－１２ポリペプチドの機能活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、配列番号６７もしくは８１のヌクレオチド配列、または配列番号６７もしくは８１のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、本発明者らは、配列番号６９もしくは７１のヌクレオチド配列、または配列番号６９もしくは７１のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む発現カセットを記載する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号６９または７１のヌクレオチド配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える同一性を有する配列を含み、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖポリペプチドの機能活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、配列番号６９もしくは７１のヌクレオチド配列、または配列番号６９もしくは７１のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されている。
ＶＩＩ．処置方法
対象における腫瘍の処置のための方法であって、有効量の１またはそれを超える記載されたＣＸＣＬ９、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、およびまたはＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ発現カセットを含む組成物を腫瘍、腫瘍微小環境および／または腫瘍辺縁組織に投与すること、ならびにエレクトロポレーション治療を腫瘍、腫瘍微小環境および／または腫瘍辺縁組織に投与すること（ＩＴ－ＥＰ治療）を含む方法が記載される。ＣＸＣＬ９またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ発現カセットは、ＩＬ－１２をさらにコードし得る。いくつかの実施形態では、有効量の発現カセットは、例えば、発現カセットを腫瘍に注射し、少なくとも１つのエレクトロポレーションパルスを腫瘍に投与することによって腫瘍に投与される。
処置される腫瘍は、皮膚腫瘍、皮下腫瘍、または内臓腫瘍であり得る。腫瘍は、がん性または非がん性であり得る。腫瘍は、固形腫瘍、表面病変、非表面病変、体表面の１５ｃｍ以内の病変、または内臓病変であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、記載される方法および発現ベクターは、原発腫瘍ならびに遠隔（すなわち、未処置）腫瘍および転移を処置するために使用することができる。いくつかの実施形態では、記載される方法は、がんに罹患している対象において、腫瘍のサイズを減少させるかまたは腫瘍の成長を阻害すること、がん細胞の成長を阻害すること、転移を阻害するかまたは減少させること、転移性がんの発生を減少させるかまたは阻害すること、および／またはがんの再発を減少させることを提供する。腫瘍は、特定の種類の腫瘍またはがんに限定されない。
いくつかの実施形態では、本方法は、有効量の免疫刺激性サイトカインを投与することをさらに含む。免疫刺激性サイトカインは、サイトカインをコードする発現カセットのＩＴ－ＥＰによって投与することができる。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＣＸＣＬ９またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする発現カセット上にコードされる。いくつかの実施形態では、サイトカインは、第２の発現ベクター上にコードされ、ＩＴ－ＥＰによってがん性腫瘍に送達される。いくつかの実施形態では、サイトカインはＩＬ－１２である。いくつかの実施形態では、発現カセットはＢ－Ｔ－Ｂ’を含み、ＢはＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、ＴはＰ２Ａエレメントであり、Ｂ’はＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。サイトカインは、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療またはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療の前、同時、または後に投与され得る。
ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療または処置は、ＣＸＣＬ９をコードする有効量の記載された発現カセットで腫瘍、腫瘍微小環境および／または腫瘍辺縁組織を注射することと、エレクトロポレーション治療を腫瘍に投与することとを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは腫瘍に注入される。
ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９治療または処置は、ＣＸＣＬ９およびＩＬ－１２をコードする有効量の記載された発現カセットで腫瘍、腫瘍微小環境および／または腫瘍辺縁組織を注射することと、エレクトロポレーション治療を腫瘍に投与することとを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは腫瘍に注入される。
ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療または処置は、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする有効量の記載された発現カセットで腫瘍、腫瘍微小環境および／または腫瘍辺縁組織を注射することと、エレクトロポレーション治療を腫瘍に投与することとを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは腫瘍に注入される。
ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２または処置治療は、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよびＩＬ－１２をコードする有効量の記載された発現カセットで腫瘍、腫瘍微小環境および／または腫瘍辺縁組織を注射することと、エレクトロポレーション治療を腫瘍に投与することとを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは腫瘍に注入される。
ＩＴ－ＥＰ抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ治療または処置は、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖをコードする有効量の記載された発現カセットで腫瘍、腫瘍微小環境および／または腫瘍辺縁組織を注射することと、エレクトロポレーション治療を腫瘍に投与することとを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは腫瘍に注入される。
ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２治療または処置は、ＩＬ－１２をコードする有効量の発現カセットで腫瘍、腫瘍微小環境および／または腫瘍辺縁組織を注射することと、エレクトロポレーション治療を腫瘍に投与することとを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２をコードする発現カセットは、ＩＬ１２－２Ａ（ｍＩＬ１２－２ＡおよびｈＩＬ１２－２Ａ；図１）を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは腫瘍に注入される。
いくつかの実施形態では、記載された発現カセット、記載された発現カセットを含有するプラスミドおよび方法は、１またはそれを超える腫瘍、腫瘍細胞または腫瘍病変を処置するために使用することができる。腫瘍細胞は、がん細胞であり得るが、これに限定されない。「がん」という用語は、一般に不適切な細胞増殖、異常または過剰な細胞増殖を特徴とする無数の疾患を含む。がんは、固形がん、肉腫、癌腫およびリンパ腫であり得るが、これらに限定されない。がんはまた、膵臓がん、皮膚がん、脳がん、肝臓がん、胆嚢がん、胃がん、リンパ節がん、乳がん、肺がん、頭頸部がん、喉頭がん、咽頭がん、口唇がん、咽喉がん、心臓がん、腎臓がん、筋肉がん、結腸がん、前立腺がん、胸腺がん、精巣がん、子宮がん、卵巣がん、皮膚がんおよび皮下がんであり得るが、これらに限定されない。皮膚がんは、メラノーマおよび基底細胞癌腫であり得るが、これらに限定されない。乳がんは、ＥＲ陽性乳がん、ＥＲ陰性乳がん、およびトリプルネガティブ乳がんであり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、記載された方法は、細胞増殖性障害を処置するために使用することができる。「細胞増殖性障害」という用語は、形態学的にも遺伝子型的にも周囲組織とは異なるように見えることが多い悪性および非悪性の細胞集団を表す。いくつかの実施形態では、記載された方法は、ヒトを処置するために使用することができる。いくつかの実施形態では、記載された方法は、非ヒト動物または哺乳動物を処置するために使用することができる。非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジまたはウマであり得るが、これらに限定されない。
記載される発現カセットおよび方法は、がんまたは他の非がん性（良性）増殖に罹患した対象における使用が企図される。本実施形態の方法で処置される腫瘍は、非浸潤性、浸潤性、表在性、乳頭状、扁平、転移性、限局性、単中心性、多中心性、低悪性度および高悪性度腫瘍のいずれかであり得る。これらの増殖は、病変、ポリープ、新生物（例えば、乳頭状尿路上皮新生物）、乳頭腫、悪性腫瘍、腫瘍（例えば、クラットスキン腫瘍、肺門腫瘍、非浸潤性乳頭状尿路上皮腫瘍、生殖細胞腫瘍、ユーイング腫瘍、アスキン腫瘍、原始神経外胚葉腫瘍、ライディッヒ細胞腫瘍、ウィルムス腫瘍、セルトリ細胞腫瘍）、肉腫、癌腫（例えば、扁平上皮癌腫、総排泄腔癌腫、腺癌、腺扁平上皮癌腫、胆管癌腫、肝細胞癌腫、浸潤性乳頭状尿路上皮癌腫、扁平上皮癌腫）、腫瘤、または任意の他の種類のがん性もしくは非がん性増殖のいずれかとして現れることがある。発現カセットおよび方法は、進行がん、転移がん、または処置難治性がんを処置するために使用することができる。
本明細書に記載の発現カセットおよび方法は、例えば、副腎皮質がん、肛門がん、胆管がん（例えば、末梢がん、遠位胆管がん、肝内胆管がん）膀胱がん、良性およびがん性骨がん（例えば、骨腫、類骨骨腫、骨芽腫、骨軟骨腫、血管腫、軟骨粘液様線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、骨の巨細胞腫、腱索腫、リンパ腫、多発性骨髄腫）、脳および中枢神経系のがん（例えば、髄膜腫、星細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫、神経膠腫、髄芽腫、神経節細胞腫、シュワン細胞腫、胚細胞腫、頭蓋咽頭腫）、乳がん（例えば、非浸潤性乳管癌腫、浸潤性乳管癌腫、浸潤性小葉癌腫、非浸潤性小葉癌腫、女性化乳房）、キャッスルマン病（例えば、巨大リンパ節過形成、血管濾胞性リンパ節過形成）、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん（例えば、子宮内膜腺癌、腺癌腫、乳頭状漿液性腺癌、明細胞がん）食道がん、胆嚢がん（粘液性腺癌、小細胞癌腫）、消化管カルチノイド腫瘍（例えば、絨毛がん（ｃｈｏｒｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、漿液性腺腫（ｃｈｏｒｉｏａｄｅｎｏｍａ ｄｅｓｔｒｕｅｎｓ））、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓がん（例えば、腎細胞がん）、喉頭および下咽頭がん、肝臓がん（例えば、血管腫、肝腺腫、限局性結節性過形成、肝細胞癌腫）、肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん）、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔および副鼻腔がん（例えば、感覚神経芽細胞腫、正中線肉芽腫）、鼻咽頭がん、神経芽腫、口腔および口腔咽頭がん、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽腫、横紋筋肉腫（例えば、胎児性横紋筋肉腫、肺胞横紋筋肉腫、多形性横紋筋肉腫）、唾液腺がん、皮膚がん、メラノーマおよび非メラノーマの両方の皮膚がん、胃がん、精巣がん（例えば、セミノーマ、非セミノーマ胚細胞がん）、胸腺がん、甲状腺がん（例えば、濾胞癌腫、未分化癌腫、低分化癌腫、甲状腺髄様癌腫、甲状腺リンパ腫）、膣がん、外陰がん、子宮がん（例えば、子宮平滑筋肉腫）における使用が企図される。
いくつかの実施形態では、対象は、低い腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）および／または損なわれた腫瘍ＩＦＮγシグナル伝達を有する。
記載された方法は、１またはそれを超える以下のものを引き起こすために使用され得る：腫瘍を炎症させる、腫瘍または腫瘍微小環境へのＴ細胞浸潤を誘導する（腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の数を増加させる）、全身性Ｔ細胞応答を増強する、腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化を誘導する、抗原特異的Ｔ細胞応答を増加させる、抗原特異的Ｔ細胞の増殖を増加させる、ポリクローナルＴ細胞応答を増加させる、処置および／または未処置腫瘍に対する免疫応答を増強する、Ｔ細胞疲弊を減少させる、１またはそれを超える処置または未処置腫瘍におけるリンパ球および単球細胞表面マーカーを増加させる、１またはそれを超える処置または未処置腫瘍におけるＩＮＦγ調節遺伝子の腫瘍内レベルを増加させる、対象の血液における増殖エフェクターメモリーＴ細胞を増加させる、対象の血液における短寿命のエフェクター細胞を増加させる、がん性腫瘍における活性化ナチュラルキラー細胞に存在する遺伝子の発現を増加させる、がん性腫瘍における抗原提示において機能する遺伝子の発現を増加させる、がん性腫瘍におけるＴ細胞生存およびＴ細胞媒介性細胞傷害において機能する遺伝子の発現を増加させる、処置および／または未処置腫瘍の退縮を誘導する、処置および／または未処置腫瘍の減量を誘導する、および、限定されないが免疫チェックポイント阻害剤治療などの第２の治療に対する応答を改善する。いくつかの実施形態では、腫瘍に対する免疫反応の増強は、対象の生存率の増加をもたらす。
いくつかの実施形態では、がん性腫瘍を有する対象を処置する記載された方法は、ＣＸＣＬ９をコードする有効量のプラスミドをがん性腫瘍に注射すること、およびエレクトロポレーション治療を腫瘍に投与することを含む。いくつかの実施形態では、がん性腫瘍を有する対象を処置する記載された方法は、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする有効量のプラスミドをがん性腫瘍に注射すること、およびエレクトロポレーション治療を腫瘍に投与することを含む。いくつかの実施形態では、がん性腫瘍を有する対象を処置する記載された方法は、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖをコードする有効量のプラスミドをがん性腫瘍に注射すること、およびエレクトロポレーション治療を腫瘍に投与することを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、エレクトロポレーション処置と実質的に同時に投与される。「実質的に同時に」という用語は、分子およびエレクトロポレーション処置が時間に関して合理的に近接して、すなわち細胞に対する電気パルスの効果が低下する前に投与されることを意味する。
いくつかの実施形態では、記載される方法は、腫瘍または腫瘍微小環境においてＮＫ細胞およびＴ細胞集団の増加をもたらす。ＣＸＣＬ９、ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２、および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥのＩＴ－ＥＰは、腫瘍特異的Ｔ細胞の腫瘍へのホーミングを増加させ、腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化および／または増殖を増加させ、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞の腫瘍微小環境への動員を増加させる。Ｔ細胞の活性化は、活性化Ｔ細胞による腫瘍細胞死滅化の増加をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰによるＩＬ－１２治療の投与は、腫瘍のＴ細胞浸潤を増強する。腫瘍におけるＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥのその後の発現は、Ｔ細胞を活性化して抗原特異的Ｔ細胞の集団を増強することができる。
いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療はＩＬ－１２効果を増強し、腫瘍特異的リンパ球の効果的な輸送の増加をもたらす。
いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療は、腫瘍または腫瘍微小環境における血管新生を阻害する。いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９をＩＬ－１２治療と組み合わせることにより、腫瘍特異的リンパ球の腫瘍への輸送が増加する。
いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ９をコードする発現カセットの腫瘍内エレクトロポレーションを他の治療実体と共に投与することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療は、併用ＩＬ－１２治療である。ＩＬ－１２治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療の前、同時および／または後に行われ得る。ＩＬ－１２治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療の前および同時に行うことができる。ＩＬ－１２治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療の前および後に行うことができる。ＩＬ－１２治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療と同時および後に行うことができる。ＩＬ－１２治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療の前、同時および後に行われ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療は、ＩＬ－１２治療の前、同時および／または後に行われ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療は、ＩＬ－１２治療の前および同時に行われ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療は、ＩＬ－１２治療の前および後に行われ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療は、ＩＬ－１２治療と同時および後に行われ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療は、ＩＬ－１２治療の前、同時および後に行われ得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２治療は、ＩＬ－１２をコードする発現カセットのＩＴ－ＥＰによって投与される。ＣＸＣＬ９およびＩＬ－１２は、単一の発現カセットもしくはプラスミドから、または複数の発現カセットもしくはプラスミドから発現され得る。いくつかの実施形態では、同時治療のために、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９－ＩＬ１２治療、ＣＸＣＬ９およびＩＬ－１２は、単一の発現カセットまたはプラスミドから発現される。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする発現カセットの腫瘍内エレクトロポレーションを他の治療実体と共に投与することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療は、併用ＩＬ－１２治療である。ＩＬ－１２治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療の前、同時および／または後に行われ得る。ＩＬ－１２治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療の前および同時に行うことができる。ＩＬ－１２治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療の前および後に行うことができる。ＩＬ－１２治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療と同時および後に行うことができる。ＩＬ－１２治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療の前、同時および後に行われ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療は、ＩＬ－１２治療の前、同時および／または後に行われ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療は、ＩＬ－１２治療の前および同時に行われ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療は、ＩＬ－１２治療の前および後に行われ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療は、ＩＬ－１２治療と同時および後に行われ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療は、ＩＬ－１２治療の前、同時および後に行われ得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２治療は、ＩＬ－１２をコードする発現カセットのＩＴ－ＥＰによって投与される。ＣＤ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよびＩＬ－１２は、単一の発現カセットもしくはプラスミドから、または複数の発現カセットもしくはプラスミドから発現され得る。いくつかの実施形態では、同時治療のために、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ－ＩＬ１２治療、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよびＩＬ－１２は、単一の発現カセットまたはプラスミドから発現される。
いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療と組み合わされる。いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９および／またはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療は、ＩＬ－１２治療と併用される。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療の前、同時および／または後に行われ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療の前および同時に行うことができる。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療の前および後に行うことができる。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療と同時および後に行うことができる。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療の前、同時および後に行われ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療の前、同時および／または後に行われ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療の前および同時に行われ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療の前および後に行われ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療と同時および後に行われ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療の前、同時および後に行われ得る。ＣＸＣＬ３またはＣＤ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療のいずれかを、それぞれＣＸＣＬ９とＩＬ－１２の両方またはＣＤ３－ｈａｌｆ－ＢｉＴｅとＩＬ－１２，の両方をコードする発現カセットまたはプラスミドのＩＴ－ＥＰなどによって、ＩＬ－１２治療と組み合わせることができる（すなわちＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９およびＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２治療）。
いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療またはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２治療は、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２治療、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療、およびＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９治療のうちの１またはそれを超えるものと同時投与することができる。
いくつかの実施形態では、記載される発現カセットは、１またはそれを超える薬学的に許容され得る賦形剤と組み合わされる。薬学的に許容され得る賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）は、ＡＰＩ（分子）と共に意図的に含まれる有効活性成分（ＡＰＩ、治療用製品）以外の物質である。賦形剤は、意図された投与量で治療効果を発揮しないか、または発揮することを意図しない。賦形剤は、ａ）製造中のＡＰＩの処理を助け、ｂ）ＡＰＩの安定性、バイオアベイラビリティまたは対象受容性を保護、支持または増強し、ｃ）製品識別を支援し、および／またはｄ）保存または使用中のＡＰＩの送達の全体的な安全性、有効性の任意の他の属性を増強するように作用し得る。薬学的に許容され得る賦形剤は、不活性物質であってもなくてもよい。賦形剤には、吸収促進剤、付着防止剤、消泡剤、酸化防止剤、結合剤、緩衝剤、担体、コーティング剤、着色剤、送達促進剤、送達ポリマー、デキストラン、デキストロース、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、フレーバー、流動促進剤、保湿剤、潤滑剤、油類、ポリマー、保存剤、生理食塩水、塩、溶媒、糖類、懸濁化剤、持続放出マトリックス、甘味料、増粘剤、等張化剤、ビヒクル、撥水剤および湿潤剤が含まれるが、これらに限定されない。
ＶＩＩＩ．処置レジメン／サイクル
記載されたＩＴ－ＥＰ治療は、例えば腫瘍の性質、対象の症状、分子のサイズおよび化学的特徴ならびに分子の半減期などの因子に応じて、様々な間隔で投与することができる。
いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２治療を投与し、続いてＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９および／またはＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９治療を投与することを含む、腫瘍を処置する方法が記載される。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９またはＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９治療は、腫瘍または腫瘍微小環境への腫瘍特異的Ｔ細胞の動員を増加させ、および／またはＴ細胞の活性化を増加させることができる。いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２治療は０日目（±１日）に腫瘍に施され、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療は４日目（±２日）および７日目（±２日）に腫瘍に施される。いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２治療は０日目に腫瘍に施され、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９治療は４日目（±２日）および７日目（±２日）に腫瘍に施される。
いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２治療を投与し、続いてＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよび／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２治療を投与することを含む、腫瘍を処置する方法が記載される。いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２治療は０日目（±１日）に腫瘍に施され、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療は４日目（±２日）および７日目（±２日）に腫瘍に施される。いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２治療は０日目に腫瘍に施され、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２治療は４日目（±２日）および７日目（±２日）に腫瘍に施される。
いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２治療、その後にＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９もしくはＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９治療、および／またはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥもしくはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２治療を含む腫瘍を処置する方法が記載される。
いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２治療は、腫瘍浸潤リンパ球を増加させるために最初に投与される。続いて、腫瘍をＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９もしくはＩＬ１２～ＣＸＣＬ９治療および／またはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥもしくはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２治療で処置する。
いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９治療および／またはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２治療は、０日目、０日目および４日目（±２日）、０日目および７日目（±２日）、または０日目、４日目（±２日）および７日目（±２日）に投与される。いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９治療は、０日目、０日目および４日目（±２日）、０日目および７日目（±２日）、または０日目、４日目（±２日）および７日目（±２日）に投与される。いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２治療は、０日目、１日目および４日目（±２日）、１日目および７日目（±２日）、または１日目、４日目（±２日）および７日目（±２日）に投与される。いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９治療およびＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２治療は、０日目、０日目および４日目（±２日）、０日目および７日目（±２日）、または０日目、４日目（±２日）および７日目（±２日）に投与される。０、４、および７日目は、１、５、および８日目と等価である。
処置サイクルは、１～６回のＩＴ－ＥＰ処置を含むことができる。いくつかの実施形態では、処置サイクルは、１、２、または３回のＩＴ－ＥＰ処置を含む。サイクルは、約１週間～約６週間、または約２週間～約５週間であり得る。いくつかの実施形態では、サイクルは約３週間である。いくつかの実施形態では、サイクルは約６週間である。いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ治療は、０日目、４日目（±２日）、および７日目（±２日）のうちの１つまたは複数に、交互に（１つおきに）３週間サイクルで（すなわち、６週間ごとに）投与される。
いくつかの実施形態では、サイクルは、１～３回のＩＴ－ＥＰ処置を含む。処置は、１日目（±２日）、５日目（±２日）および／または８日目（±２日）に行うことができる（すなわち、０日目（±２日）、４日目（±２日）および／または７日目（±２日））。各処置は、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ２、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２、およびＩＴ－ＥＰ抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖのうちの１つまたは複数を含むことができる。
いくつかの実施形態では、腫瘍を処置する方法であって、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２治療をサイクルの１日目に投与し、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９またはＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９をサイクルの５日目（±２日）および８日目（±２日）に投与することを含む方法が記載される。いくつかの実施形態では、腫瘍を処置する方法であって、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２治療をサイクルの１日目に投与し、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２をサイクルの５日目（±２日）および８日目（±２日）に投与することを含む方法が記載される。いくつかの実施形態では、腫瘍を処置する方法であって、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２治療をサイクルの１日目に投与し、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９またはＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、およびＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２のうちの１つまたは複数をサイクルの５日目（±２日）および８日目（±２日）に投与することを含む方法が記載される。
いくつかの実施形態では、腫瘍を処置する方法であって、ａ）ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２治療を第１のサイクルで投与すること、ｂ）ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９または ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９治療を第２のサイクルで投与すること、およびｃ）ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２治療を第３のサイクルで投与することを含む方法が記載される。各サイクルは、対応するＩＴ－ＥＰ治療の１～３回の投与を含むことができる。
併用ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療および／またはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療におけるＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２治療の投与を含む投与レジメンが記載される。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９またはＩＬ１２～ＣＸＣＬ９治療とＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２治療との投与を含む投与レジメンも記載される。治療は、同時に、連続的に、または別々に投与され得る。いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２治療は第１のサイクルで投与され、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療またはＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９治療は第２のサイクルで投与される。いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２治療は第１のサイクルで投与され、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療またはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ－ＩＬ１２治療は第２のサイクルで投与される。いくつかの実施形態では、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２治療は第１のサイクルで投与され、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療またはＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９－ＩＬ１２治療は第２のサイクルで投与され、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療またはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ－ＩＬ１２治療は第３のサイクルで投与される。ＩＴ－ＥＰ治療は、各サイクルの１日目に送達され得る。１またはそれを超えるサイクルは、必要に応じて繰り返されてもよい。サイクル内で、ＩＴ－ＥＰ治療は、サイクルの少なくとも１日、２日、または３日に投与され得る。例えば、所与の発現カセットは、１日目、５日目（±２日）および／または８日目（±２日）に投与され得る。
いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ９またはＩＬ１２～ＣＸＣＬ９＋ＩＬ－１２発現カセットが、サイクルの１日目、５±２日目および８±２日目に投与される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖまたは抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ＋ＩＬ－１２発現カセットが、サイクルの１日目、５±２日目および８±２日目に投与される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ＋ＩＬ－１２発現カセットが、サイクルの１日目、５±２日目および８±２日目に投与される。
いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ９＋ＩＬ－１２発現カセット（例えば、ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９）を１日目および５±２日目に投与し、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ＋ＩＬ－１２発現カセット（例えば、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２）をサイクルの８±２日目に投与する。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ９＋ＩＬ－１２発現カセットを１日目に投与し、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ＋ＩＬ－１２発現カセットをサイクルの５±２日目および８±２日目に投与する。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ９＋ＩＬ－１２発現カセットを１日目および８±２日目に投与し、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ＋ＩＬ－１２発現カセットをサイクルの５±２日目に投与する。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ＋ＩＬ－１２発現カセットを１日目および５±２日目に投与し、ＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ９＋ＩＬ－１２発現カセットをサイクルの８±２日目に投与する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ＋ＩＬ－１２発現カセットを１日目に投与し、ＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ９＋ＩＬ－１２発現カセットをサイクルの５±２日目および８±２日目に投与する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ＋ＩＬ－１２発現カセットを１日目および８±２日目に投与し、ＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ９＋ＩＬ－１２発現カセットをサイクルの５±２日目に投与する。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２－２Ａ発現カセットを１日目に投与し、ＣＸＣＬ９またはＩＬ１２～ＣＸＣＬ９発現カセットをサイクルの５±２日目および８±２日目に投与する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２－２Ａ発現カセットを１日目および５±２日目に投与し、ＣＸＣＬ９またはＩＬ１２～ＣＸＣＬ９発現カセットをサイクルの８±２日目に投与する。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２－２Ａ発現カセットを１日目に投与し、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２発現カセットをサイクルの５±２日目および８±２日目に投与する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２－２Ａ発現カセットを１日目および５±２日目に投与し、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２発現カセットをサイクルの８±２日目に投与する。
いくつかの実施形態では、ＩＬ１２－２Ａ発現カセットを１日目に投与し、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２発現カセットを５±２日目に投与し、ＣＸＣＬ９またはＩＬ１２～ＣＸＣＬ９発現カセットをサイクルの８±２日目に投与する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２－２Ａ発現カセットを１日目に投与し、ＣＸＣＬ９またはＩＬ１２～ＣＸＣＬ９発現カセットを５±２日目に投与し、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２発現カセットをサイクルの８±２日目に投与する。
いくつかの実施形態では、対象がＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９による少なくとも１つのＩＴ－ＥＰ処置およびＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２による１つのＩＴ－ＥＰ処置を受けるならば、対象はＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９治療またはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２治療のどちらかを０日目、４日目（±２日目）および７日目（±２日目）に投与される。
いくつかの実施形態では、処置は、１サイクルごとまたは１サイクルおきに投与することができる。サイクルは、２またはそれを超えるサイクルが対象に投与されるように繰り返され得る。反復サイクルは、連続的に投与されてもよく、１またはそれを超える異なる処置サイクルと交互に行われてもよく、または１またはそれを超える異なる処置サイクルと同時に行われてもよい。上記の処置のいずれも、他のがん治療と組み合わせることができる。例えば、ＩＴ－ＥＰサイクルをチェックポイント阻害剤治療と組み合わせることができる。
ＩＸ．併用治療
いくつかの実施形態では、治療方法は併用治療を含む。併用治療は、治療分子または処置の組み合わせを含む。治療的処置には、電気パルス（すなわち、エレクトロポレーション）、放射線、抗体治療、チェックポイント阻害剤治療、および化学療法が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、併用治療の投与は、エレクトロポレーション単独によって達成される。いくつかの実施形態では、併用治療の投与は、エレクトロポレーションと全身送達との組み合わせによって達成される。いくつかの実施形態では、併用治療の投与は、エレクトロポレーションと放射線との組み合わせによって達成される。いくつかの実施形態では、併用治療の投与は、エレクトロポレーションと経口投薬との組み合わせによって達成される。治療的エレクトロポレーションは、１またはそれを超える追加の治療的処置と組み合わせてもよく、またはそれと共に投与されてもよい。１またはそれを超える追加の治療薬は、全身送達、腫瘍内注射、エレクトロポレーションを伴う腫瘍内注射、および／または放射線によって送達され得る。１またはそれを超える追加の治療薬は、ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥエレクトロポレーション治療の前、同時、または後に投与することができる。
いくつかの実施形態では、記載されるがんを処置する方法、以下：１日目、１日目および５日目（±２日）、１日目および８日目（±２日）、または１日目、５日目（±２日）および８日目（±２日）にＩＴ－ＥＰ治療を投与することと、３～６週間サイクルの１日目に追加の治療的処置を投与することとを含む方法である。いくつかの実施形態では、記載されるがんを処置する方法、以下：１サイクルおき（すなわち、６週間ごと）の１日目、１日目および５日目（±２日）、１日目および８日目（±２日）、または１日目、５日目（±２日）および８日目（±２日）にＩＴ－ＥＰ治療を投与することと、各３週間サイクルの１日目（すなわち、３週間ごと）に追加の治療的処置を投与することとを含む方法である。いくつかの実施形態では、ついかの治療的処置はチェックポイント阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、追加のチェックポイント阻害剤治療は、抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１治療を含む。チェックポイント阻害剤治療は、全身投与され得る。
Ｘ．エレクトロポレーション（ＥＰ）治療
エレクトロポレーション治療は、少なくとも１つのエレクトロポレーションパルスを、細胞、組織、または腫瘍に投与することを含む。本明細書で使用される場合、エレクトロポレーション治療は「可逆的エレクトロポレーション」を利用する。可逆的エレクトロポレーションは、標的細胞の電界閾値を下回る電気パルスを使用した、細胞膜に対して通常は不透過性である分子への細胞膜の可逆的または一時的な透過化である。電気パルスが細胞の電気閾値を下回るため、細胞は修復することができ、電気パルスによって死滅しない。可逆的エレクトロポレーションを使用して、細胞を死滅させることなく、核酸などの高分子を細胞に送達することができる。可逆的エレクトロポレーションは、電気パルスを印加して、核酸などの高分子の細胞への取り込みを促進する方法である。可逆的エレクトロポレーションは、ＤＮＡワクチンを送達するためにいくつかの臨床試験で使用されており、インビボでの細胞への遺伝子送達を劇的に改善する（１００～１０００倍）ことが示されている。
エレクトロポレーション治療は、哺乳動物対象での使用に適した既知のエレクトロポレーション装置を使用して実施することができる。記載された発現カセットは、電気パルスの投与前、投与中、または投与後に対象に投与することができる。発現カセットは、対象の腫瘍またはその近傍に投与することができる。記載された発現カセットは、皮下注射針を使用して腫瘍に注射することができる。
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション治療は、１またはそれを超える電圧パルスの投与を含む。生成される電界の性質は、組織の性質、選択された組織のサイズおよびその位置によって決定される。腫瘍に送達され得る電圧パルスは、約１００Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍであり得る。いくつかの実施形態では、電圧パルスは約７００Ｖ／ｃｍ～１５００Ｖ／ｃｍである。いくつかの実施形態では、電圧パルスは、約６００Ｖ／ｃｍ、６５０Ｖ／ｃｍ、７００Ｖ／ｃｍ、７５０Ｖ／ｃｍ、８００Ｖ／ｃｍ、８５０Ｖ／ｃｍ、９００Ｖ／ｃｍ、９５０Ｖ／ｃｍ、１０００Ｖ／ｃｍ、１０５０Ｖ／ｃｍ、１１００Ｖ／ｃｍ、１１５０Ｖ／ｃｍ、１２００Ｖ／ｃｍ、１２５０Ｖ／ｃｍ、１３００Ｖ／ｃｍ、１３５０Ｖ／ｃｍ、１４００Ｖ／ｃｍ、１４５０Ｖ／ｃｍ、または１５００Ｖ／ｃｍであり得る。いくつかの実施形態では、電圧パルスは７００±１００である。いくつかの実施形態では、電圧パルスは１３００～１５００Ｖ／ｃｍである。いくつかの実施形態では、電圧パルスは１５００±１００Ｖ／ｃｍである。いくつかの実施形態では、電圧パルスは約１０Ｖ／ｃｍ～７００Ｖ／ｃｍである。いくつかの実施形態では、電圧パルスは、約１００Ｖ／ｃｍ、１５０Ｖ／ｃｍ、２００Ｖ／ｃｍ、２５０Ｖ／ｃｍ、３００Ｖ／ｃｍ、３５０Ｖ／ｃｍ、または４００Ｖ／ｃｍ、４５０Ｖ／ｃｍ、５００Ｖ／ｃｍ、５５０Ｖ／ｃｍ、６００Ｖ／ｃｍ、６５０Ｖ／ｃｍ、または７００Ｖ／ｃｍである。いくつかの実施形態では、電圧パルスは約３００Ｖ／ｃｍ～約５００Ｖ／ｃｍである。いくつかの実施形態では、電圧パルスは３００～５００Ｖ／ｃｍである。いくつかの実施形態では、電圧パルスは３５０±５０Ｖ／ｃｍである。
エレクトロポレーションパルスのパルス持続時間は、１０μ秒～１秒であり得る。いくつかの実施形態では、パルス持続時間は、約１０μ秒～約１００ミリ秒（ｍｓ）である。いくつかの実施形態では、パルス持続時間は、約１００μ秒～約１０ｍｓである。いくつかの実施形態では、パルス持続時間は、１００μ秒、１ｍｓ、５ｍｓ、１０ｍｓ、または１００ｍｓである。パルスセット間の間隔は、１秒などの任意の所望の時間とすることができる。波形、電界強度およびパルス持続時間はまた、細胞の種類およびエレクトロポレーションを介して細胞に入る分子の種類に依存し得る。
パルス発生器によって提供される電気信号の波形は、指数関数的に減衰するパルス、方形パルス、ユニポーラ振動パルス列、バイポーラ振動パルス列、またはこれらの形態のいずれかの組み合わせであり得る。方形波エレクトロポレーションシステムは、制御された電気パルスを送達し、それにより、設定された電圧まで急速に上昇し、設定された時間長（パルス長）の間そのレベルに留まり、次いで急速にゼロに低下する。
１～１００パルスを投与することができる。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０パルスが投与される。いくつかの実施形態では、６パルスが投与される。いくつかの実施形態では、６×０．１ｍｓｅｃパルスが投与される。いくつかの実施形態では、６×０．１ｍｓｅｃパルスを１３００～１５００Ｖ／ｃｍで投与する。いくつかの実施形態では、８パルスが投与される。いくつかの実施形態では、８×１０ｍｓｅｃパルスが投与される。いくつかの実施形態では、８×１０ｍｓｅｃパルスを３００～５００Ｖ／ｃｍで投与する。
エレクトロポレーション装置は、単一の針電極、一対の針電極、または複数の針電極もしくは針電極のアレイを含むことができる。針電極のアレイは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれを超える電極を含むことができる。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置は皮下注射針または同等物を含むことができる。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置は、ユーザ制御およびパルスパラメータの入力に基づいて、アレイ内の電極間に一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成することができる動電装置（「ＥＫＤ装置」）を備えることができる。
記載された化合物、組成物、および方法と共に使用するのに適したエレクトロポレーション装置には、米国特許第７２４５９６３号、第５４３９４４０号、第６０５５４５３号、第６００９３４７号、第９０２０６０５号、および第９０３７２３０号、ならびに米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号、第２０１９／０１１７９６４号、および特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３０４３７号および米国特許出願第１６／２６９，０２２号に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。
「腫瘍内エレクトロポレーション」は、治療用ポリペプチドをコードする有効量の核酸を腫瘍、腫瘍微小環境および／または腫瘍辺縁組織に注射すること、ならびにエレクトロポレーション治療を腫瘍に投与して、核酸の腫瘍細胞への送達および治療用ポリペプチドの発現をもたらすことを含む。核酸は、発現ベクター、プラスミド、またはｍＲＮＡであり得るが、これらに限定されない。
実施形態のリスト：
１．対象のがんを処置する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを対象に投与すること、
（ｂ）対象から腫瘍試料を得ること、
（ｃ）腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定すること、
（ｄ）所定の対象におけるＣＸＣＲ３発現と比較して、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現が増加しているかどうかを判定すること、および
（ｅ）所定の対照におけるＣＸＣＲ３発現と比較して、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現が増加している場合には、少なくとも１つの追加の用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを対象に投与すること、あるいは所定の対照におけるＣＸＣＲ３発現と比較して、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現が増加していない場合には、少なくとも１つの薬学的有効用量のＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥと、少なくとも１つの追加の用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを対象に投与すること、を含む方法。
２．工程（ａ）が、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤を投与することを含み、チェックポイント阻害剤が全身投与される、実施形態１に記載の方法。
３．チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む、実施形態２に記載の方法。
４．チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、またはアテゾリズマブを含む、実施形態３に記載の方法。
５．工程（ａ）が、少なくとも１つの用量の免疫刺激性サイトカインを投与することを含み、免疫刺激性サイトカインが、免疫刺激性サイトカインをコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションによって投与される、実施形態１～４のいずれか一つに記載の方法。
６．免疫刺激性サイトカインがＩＬ－１２またはＩＬ－１５を含む、実施形態５に記載の方法。
７．ＩＬ－１２をコードする核酸が、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットをコードする第１の核酸配列と、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットをコードする第２の核酸配列とを含み、第１の核酸配列および第２の核酸配列が、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａ翻訳修飾エレメントによって分離されている、実施形態６に記載の方法。
８．工程（ａ）が、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および少なくとも１つの用量の免疫刺激性サイトカインを投与することを含み、チェックポイント阻害剤が、全身投与される抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含み、免疫刺激性サイトカインが、ＩＬ－１２をコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションによって投与されるＩＬ－１２を含む、実施形態１に記載の方法。
９．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３ ｍＲＮＡを測定することを含む、実施形態１～８のいずれか一つに記載の方法。
１０．ＣＸＣＲ３ ｍＲＮＡを測定することが、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含む、実施形態９に記載の方法。
１１．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３タンパク質を測定することを含む、実施形態１～８のいずれか一つに記載の方法。
１２．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞の数を測定することを含む、実施形態１～８のいずれか一つに記載の方法。
１３．所定の対照が、工程（ａ）の前に対象から得られた腫瘍試料を含む、実施形態１～１２のいずれか一つに記載の方法。
１４．所定の対照が、チェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に対する既知の応答者および／または既知の非応答者の集団に由来する標準を含む、実施形態１～１２のいずれか一つに記載の方法。
１５．少なくとも１つの薬学的有効用量のＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを投与することが、ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションを含む、実施形態１～１４のいずれか一つに記載の方法。
１６．ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする核酸が免疫刺激性サイトカインをさらにコードし、免疫刺激性サイトカインがＩＬ－１２を含む、実施形態１５に記載の方法。
１７．少なくとも１つの追加の用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを投与することが、少なくとも１つの追加の用量のチェックポイント阻害剤を投与すること、少なくとも１つの追加の用量の免疫刺激性サイトカインを投与すること、または少なくとも１つの追加の用量のチェックポイント阻害剤および免疫刺激性サイトカインを投与することを含む、実施形態１～１４のいずれか一つに記載の方法。
１８．チェックポイント阻害剤が、全身投与される抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む、実施形態１７に記載の方法。
１９．免疫刺激性サイトカインが、ＩＬ－１２をコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションによって投与されるＩＬ－１２を含む、実施形態１７に記載の方法。
２０．ＩＬ－１２をコードする核酸が、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットをコードする第１の核酸配列と、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットをコードする第２の核酸配列とを含み、第１の核酸配列および第２の核酸配列が、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａ翻訳修飾エレメントによって分離されている、実施形態１９に記載の方法。
２１．対象がヒトである、実施形態１～２０のいずれか一つに記載の方法。
２２．対象のがんを処置する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを対象に投与すること、
（ｂ）チェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを投与する工程の後に対象から得られた腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルを測定すること、および
（ｃ）腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルが所定の対照におけるＣＸＣＲ３のレベルと比較して増加していない場合、少なくとも１つの薬学的有効用量のＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを対象に投与すること、を含む方法。
２３．工程（ａ）が、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤を投与することを含み、チェックポイント阻害剤が全身投与される、実施形態２２に記載の方法。
２４．チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む、実施形態２３に記載の方法。
２５．チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、またはアテゾリズマブを含む、実施形態２４に記載の方法。
２６．工程（ａ）が、少なくとも１つの用量の免疫刺激性サイトカインを投与することを含み、免疫刺激性サイトカインが、免疫刺激性サイトカインをコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションによって投与される、実施形態２２～２５のいずれか一つに記載の方法。
２７．免疫刺激性サイトカインがＩＬ－１２またはＩＬ－１５を含む、実施形態２６に記載の方法。
２８．ＩＬ－１２をコードする核酸が、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットをコードする第１の核酸配列と、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットをコードする第２の核酸配列とを含み、第１の核酸配列および第２の核酸配列が、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａ翻訳修飾エレメントによって分離されている、実施形態２７に記載の方法。
２９．工程（ａ）が、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および少なくとも１つの用量の免疫刺激性サイトカインを投与することを含み、チェックポイント阻害剤が、全身投与される抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含み、免疫刺激性サイトカインが、ＩＬ－１２をコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションによって投与されるＩＬ－１２を含む、実施形態２２に記載の方法。
３０．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３ ｍＲＮＡを測定することを含む、実施形態２２～２９のいずれか一つに記載の方法。
３１．ＣＸＣＲ３ ｍＲＮＡを測定することが、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含む、実施形態２９に記載の方法。
３２．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３タンパク質を測定することを含む、実施形態２２～２９のいずれか一つに記載の方法。
３３．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞の数を測定することを含む、実施形態２２～２９のいずれか一つに記載の方法。
３４．所定の対照が、工程（ａ）の前に対象から得られた腫瘍試料を含む、実施形態２２～３３のいずれか一つに記載の方法。
３５．所定の対照が、チェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に対する既知の応答者および／または既知の非応答者の集団に由来する標準を含む、実施形態２２～３３のいずれか一つに記載の方法。
３６．少なくとも１つの薬学的有効用量のＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを投与することが、ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションを含む、実施形態２２～３５のいずれか一つに記載の方法。
３７．ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする核酸が免疫刺激性サイトカインをさらにコードし、免疫刺激性サイトカインがＩＬ－１２を含む、実施形態３６に記載の方法。
３８．少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを投与することが、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤を投与すること、少なくとも１つの用量の免疫刺激性サイトカインを投与すること、または少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および免疫刺激性サイトカインを投与することを含む、実施形態２２に記載の方法。
３９．チェックポイント阻害剤が、全身投与される抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む、実施形態３８に記載の方法。
４０．免疫刺激性サイトカインが、ＩＬ－１２をコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションによって投与されるＩＬ－１２を含む、実施形態３８に記載の方法。
４１．ＩＬ－１２をコードする核酸が、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットをコードする第１の核酸配列と、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットをコードする第２の核酸配列とを含み、第１の核酸配列および第２の核酸配列が、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａ翻訳修飾エレメントによって分離されている、実施形態４０に記載の方法。
４２．対象がヒトである、実施形態２２～４１のいずれか一つに記載の方法。
４３．チェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答しないリスクがあるがんを有する対象を同定する方法であって、
少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインが投与された対象から得られた腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルを測定することを含み、
腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルが所定の対照未満であることは、対象がチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答しないリスクがあることを示す、方法。
４４．チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む、実施形態４３に記載の方法。
４５．チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、またはアテゾリズマブを含む、実施形態４４に記載の方法。
４６．免疫刺激性サイトカインがＩＬ－１２またはＩＬ－１５を含む、実施形態４３に記載の方法。
４７．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルを測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３ ｍＲＮＡを測定することを含む、実施形態４３～４６のいずれか一つに記載の方法。
４８．ＣＸＣＲ３ ｍＲＮＡを測定することが、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含む、実施形態４７に記載の方法。
４９．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルを測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３タンパク質を測定することを含む、実施形態４３～４６のいずれか一つに記載の方法。
５０．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルを測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞の数を測定することを含む、実施形態４３～４６のいずれか一つに記載の方法。
５１．所定の対照が、対象が少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを投与される前に対象から得られた腫瘍試料を含む、実施形態４３～５０のいずれか一つに記載の方法。
５２．所定の対照が、チェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に対する既知の応答者および／または既知の非応答者の集団に由来する標準を含む、実施形態４３～５０のいずれか一つに記載の方法。
５３．対象がヒトである、実施形態４３～５２のいずれか一つに記載の方法。
５４．対象のがんを処置する方法であって、
（ａ）対象がチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答しないリスクがあるかどうかを、以下：
（ｉ）少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを対象に投与すること、および
（ｉｉ）少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを投与する工程の後に対象から得られた腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルを測定すること、によって同定することであって、
腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルが所定の対照未満であることは、対象がチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答しないリスクがあることを示す、応答しないリスクがあるかどうかを同定すること、および
（ｂ）チェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答しないリスクがあると同定された対象に、少なくとも１つの薬学的有効用量のＣＸＣＬ９および／またはＣＤ－３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを投与すること、を含む方法。
５５．工程（ａ）が、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤を投与することを含み、チェックポイント阻害剤が全身投与される、実施形態５４に記載の方法。
５６．チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む、実施形態５５に記載の方法。
５７．チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、またはアテゾリズマブを含む、実施形態５６に記載の方法。
５８．工程（ａ）が、少なくとも１つの用量の免疫刺激性サイトカインを投与することを含み、免疫刺激性サイトカインが、免疫刺激性サイトカインをコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションによって投与される、実施形態５４～５７のいずれか一つに記載の方法。
５９．免疫刺激性サイトカインがＩＬ－１２またはＩＬ－１５を含む、実施形態５８に記載の方法。
６０．ＩＬ－１２をコードする核酸が、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットをコードする第１の核酸配列と、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットをコードする第２の核酸配列とを含み、第１の核酸配列および第２の核酸配列が、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａ翻訳修飾エレメントによって分離されている、実施形態５９に記載の方法。
６１．工程（ａ）が、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および少なくとも１つの用量の免疫刺激性サイトカインを投与することを含み、チェックポイント阻害剤が、全身投与される抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含み、免疫刺激性サイトカインが、ＩＬ－１２をコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションによって投与されるＩＬ－１２を含む、実施形態１に記載の方法。
６２．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルを測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３ ｍＲＮＡを測定することを含む、実施形態５４～６０のいずれか一つに記載の方法。
６３．ＣＸＣＲ３ ｍＲＮＡを測定することが、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含む、実施形態６２に記載の方法。
６４．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルを測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３タンパク質を測定することを含む、実施形態５４～６１のいずれか一つに記載の方法。
６５．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルを測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞の数を測定することを含む、実施形態５４～６１のいずれか一つに記載の方法。
６６．所定の対照が、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを対象に投与する前に対象から得られた腫瘍試料を含む、実施形態５４～６５のいずれか一つに記載の方法。
６７．所定の対照が、チェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に対する既知の応答者および／または既知の非応答者の集団に由来する標準を含む、実施形態５４～６５のいずれか一つに記載の方法。
６８．少なくとも１つの薬学的有効用量のＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを投与することが、ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションを含む、実施形態５４～６７のいずれか一つに記載の方法。
６９．ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする核酸が免疫刺激性サイトカインをさらにコードし、免疫刺激性サイトカインがＩＬ－１２を含む、実施形態６８に記載の方法。
７０．少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを投与することが、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤を投与すること、少なくとも１つの用量の免疫刺激性サイトカインを投与すること、または少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および免疫刺激性サイトカインを投与することを含む、実施形態５４～６７に記載の方法。
７１．チェックポイント阻害剤が、全身投与される抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む、実施形態７０に記載の方法。
７２．免疫刺激性サイトカインが、ＩＬ－１２をコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションによって投与されるＩＬ－１２を含む、実施形態７０に記載の方法。
７３．ＩＬ－１２をコードする核酸が、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットをコードする第１の核酸配列と、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットをコードする第２の核酸配列とを含み、第１の核酸配列および第２の核酸配列が、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａ翻訳修飾エレメントによって分離されている、実施形態７２に記載の方法。
７４．対象がヒトである、実施形態５４～７３のいずれか一つに記載の方法。
７５．がんを有する患者を処置する方法であって、
（ａ）患者から腫瘍試料を得ること、
（ｂ）腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現のレベルを測定すること、
（ｃ）腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現のレベルを、既知の応答者および／または既知の非応答者の集団に由来する所定の対照または標準から得られる参照レベルと相関させて、患者がチェックポイント阻害剤治療で進行するリスクがあるかどうかを判定すること、および
（ｄ）発現レベルが参照レベルよりも大きい場合、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを投与すること、または発現レベルが参照レベルよりも小さい場合、少なくとも１つの薬学的有効用量のＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥならびに少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを患者に投与すること、を含む方法。
７６．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３ ｍＲＮＡを測定することを含む、実施形態７５に記載の方法。
７７．ＣＸＣＲ３ ｍＲＮＡを測定することが、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含む、実施形態７６に記載の方法。
７８．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３タンパク質を測定することを含む、実施形態７５に記載の方法。
７９．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞の数を測定することを含む、実施形態７５に記載の方法。
８０．少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを投与することが、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤を投与すること、少なくとも１つの用量の免疫刺激性サイトカインを投与すること、または少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および免疫刺激性サイトカインを投与することを含む、実施形態７５～７９のいずれか一つに記載の方法。
８１．チェックポイント阻害剤が全身投与される、実施形態８０に記載の方法。
８２．チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む、実施形態８１に記載の方法。
８３．チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、またはアテゾリズマブを含む、実施形態８２に記載の方法。
８４．少なくとも１つの用量の免疫刺激性サイトカインを投与することが、免疫刺激性サイトカインをコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションを含む、実施形態８０のいずれか一つに記載の方法。
８５．免疫刺激性サイトカインがＩＬ－１２またはＩＬ－１５を含む、実施形態８４に記載の方法。
８６．ＩＬ－１２をコードする核酸が、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットをコードする第１の核酸配列と、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットをコードする第２の核酸配列とを含み、第１の核酸配列および第２の核酸配列が、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａ翻訳修飾エレメントによって分離されている、実施形態８５に記載の方法。
８７．少なくとも１つの薬学的有効用量のＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを投与することが、ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションを含む、実施形態７５～８６のいずれか一つに記載の方法。
８８．ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする核酸が免疫刺激性サイトカインをさらにコードし、免疫刺激性サイトカインがＩＬ－１２を含む、実施形態８７に記載の方法。
８９．ＩＬ－１２ならびにＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥが、単一のプロモーターから発現される、実施形態８８に記載の方法。
９０．対象がヒトである、実施形態７５～８９のいずれか一つに記載の方法。
９１．がんを有する対象を処置する方法において使用するためのＩＬ－１２をコードする核酸であって、該方法が、
（ａ）少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを対象に投与すること、
（ｂ）対象から腫瘍試料を得ること、
（ｃ）腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定すること、
（ｄ）所定の対象におけるＣＸＣＲ３発現と比較して、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現が増加しているかどうかを判定すること、および
（ｅ）所定の対照におけるＣＸＣＲ３発現と比較して腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現が増加している場合には、腫瘍内エレクトロポレーションによってＩＬ－１２をコードする少なくとも１つの用量の核酸を投与すること、または所定の対照におけるＣＸＣＲ３発現と比較して腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現が増加していない場合には、腫瘍内エレクトロポレーションによりＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする少なくとも１つの薬学的有効用量の核酸および腫瘍内エレクトロポレーションによりＩＬ－１２をコードする少なくとも１つの用量の核酸を対象に投与することを含む、核酸。
９２．対象のがんを処置する方法であって、
（ａ）対象から腫瘍試料を得ること、
（ｂ）腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定すること、
（ｃ）所定の対象におけるＣＸＣＲ３発現と比較して、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現が増加しているかどうかを判定すること、および
（ｄ）所定の対照におけるＣＸＣＲ３発現と比較して、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現が増加している場合には、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを対象に投与すること、あるいは所定の対照におけるＣＸＣＲ３発現と比較して、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現が増加していない場合には、少なくとも１つの薬学的有効用量のＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥと、少なくとも１つの追加のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを対象に投与すること、を含む方法。
９３．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３ ｍＲＮＡを測定することを含む、実施形態９２に記載の方法。
９４．ＣＸＣＲ３ ｍＲＮＡを測定することが、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含む、実施形態９３に記載の方法。
９５．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３タンパク質を測定することを含む、実施形態９２に記載の方法。
９６．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞の数を測定することを含む、実施形態９２に記載の方法。
９７．所定の対照が、チェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に対する既知の応答者および／または既知の非応答者の集団に由来する標準を含む、実施形態９２～９６のいずれか一つに記載の方法。
９８．チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む、実施形態９７に記載の方法。
９９．少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカインを投与することが、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤を投与すること、少なくとも１つの用量の免疫刺激性サイトカインを投与すること、または少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および免疫刺激性サイトカインを投与することを含む、実施形態９２～９８のいずれか一つに記載の方法。
１００．チェックポイント阻害剤が全身投与される、実施形態９９に記載の方法。
１０１．チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む、実施形態１００に記載の方法。
１０２．チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、またはアテゾリズマブを含む、実施形態１０１に記載の方法。
１０３．少なくとも１つの用量の免疫刺激性サイトカインを投与することが、免疫刺激性サイトカインをコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションを含む、実施形態９９のいずれか一つに記載の方法。
１０４．免疫刺激性サイトカインがＩＬ－１２またはＩＬ－１５を含む、実施形態１０３に記載の方法。
１０５．ＩＬ－１２をコードする核酸が、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットをコードする第１の核酸配列と、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットをコードする第２の核酸配列とを含み、第１の核酸配列および第２の核酸配列が、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａ翻訳修飾エレメントによって分離されている、実施形態１０４に記載の方法。
１０６．少なくとも１つの薬学的有効用量のＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを投与することが、ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションを含む、実施形態９２～１０５のいずれか一つに記載の方法。
１０７．ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする核酸が免疫刺激性サイトカインをさらにコードし、免疫刺激性サイトカインがＩＬ－１２を含む、実施形態１０６に記載の方法。
１０８．対象がヒトである、実施形態９２－１０７～２０のいずれか一つに記載の方法。
１０９．チェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答しないリスクがあるがんを有する対象を同定する方法であって、対象から得られた腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルを測定することを含み、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３のレベルが所定の対照未満であることは、対象がチェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に応答しないリスクがあることを示す、方法。
１１０．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３ ｍＲＮＡを測定することを含む、実施形態１０９に記載の方法。
１１１．ＣＸＣＲ３ ｍＲＮＡを測定することが、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含む、実施形態１００に記載の方法。
１１２．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３タンパク質を測定することを含む、実施形態１０９に記載の方法。
１１３．腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定することが、腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞の数を測定することを含む、実施形態１０９に記載の方法。
１１４．所定の対照が、チェックポイント阻害剤および／または免疫刺激性サイトカイン治療に対する既知の応答者および／または既知の非応答者の集団に由来する標準を含む、実施形態１０２～１１３のいずれか一つに記載の方法。
１１５．少なくとも１つの薬学的有効用量のＣＸＣＬ９および／またはＣＤ－３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを投与することが、腫瘍中のＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞の数の増加をもたたす、実施形態１～４２、５４～１１４のいずれか一項に記載の方法。
理解を明確にするために本発明を詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲内で特定の修正を実施することができる。本出願で引用されたすべての刊行物、アクセッション番号、ウェブサイト、特許文献などは、それぞれがそのように個別に示されているのと同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。異なる情報が異なる時点での引用と関連付けられる限りにおいて、本出願の有効出願日の時点で存在する情報が意味される。文脈から明らかでない限り、本発明の任意のエレメント、実施形態、工程、特徴または態様は、他の任意のものと組み合わせて実行することができる。
ＣＸＣＬ９
実施例１．ＣＸＣＬ９プラスミド構築。マウスＣＸＣＬ９（ｍＣＸＣＬ９）またはヒトＣＸＣＬ９（ｈＣＸＣＬ９）核酸配列を、標準的な分子生物学技術を使用して発現ベクターにクローニングした。あるいは、ｍＣＸＣＬ９またはｈＣＸＣＬ９をマウス（ｍＩＬ１２－２Ａ）またはヒト（ｈＩＬ１２－２Ａ）ＩＬ１２ ｐ３５－Ｐ２Ａ－ＩＬ１２ ｐ４０の下流にクローニングして、ｍＩＬ１２～ｍＣＸＣＬ９およびｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９を得た（図１Ａ－Ｂ）。ＩＬ１２ ｐ３５－Ｐ２Ａ－ＩＬ１２ ｐ４０構築物を、国際公開第２０１７／１０６７９５号または国際公開第２０１８／２２９６９６号に本質的に記載されているように作製した。
得られたプラスミドは、ＩＬ－１２ ｐ３５、ＩＬ－１２ ｐ４０およびＣＸＣＬ９を含み、これらはすべて同じプロモーターから発現され、介在するエキソンスキッピング（Ｐ２Ａ）モチーフを含み、３つすべてのタンパク質が単一のポリシストロンのメッセージから発現されることを可能にした。同様の方法を用いてｍＣＸＣＬ９～ｍＣｈｅｒｒｙを作製した。
実施例２．タンパク質発現。ｍＩＬ１２－２Ａ、ｍＣＸＣＬ９、およびｍＩＬ１２～ｍＣＸＣＬ９発現ベクターをインビトロでＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの９６時間後、上清を回収し、ＩＬ１２およびＣＸＣＬ９タンパク質発現をＥＬＩＳＡによってアッセイした。図２に示す結果は、ｍＩＬ１２～ｍＣＸＣＬ９発現ベクターでトランスフェクトした細胞では発現が減少したが、ＩＬ１２およびＣＸＣＬ９の両方の検出可能なレベルが産生されたことを示す。図２７は、ｈＩＬ－１２～ｈＣＸＣＬ９発現ベクターでトランスフェクトした細胞における高レベルの分泌ｈＩＬ１２およびｈＣＸＣＬ９を示す。
同様に、ｈＩＬ１２－２Ａ、ｈＣＸＣＬ９、およびｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９発現ベクターをインビトロでＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの９６時間後、上清を回収し、ＩＬ１２およびＣＸＣＬ９タンパク質の発現をＥＬＩＳＡによってアッセイした。ｈＩＬ１２は、ｈＩＬ１２－２Ａ（１．５９μｇ／ｍＬ）およびｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９（１．３７μｇ／ｍＬ）の両方の発現ベクターからほぼ等しく発現した（図１０Ａ）。ｈＣＸＣＬ９発現ベクター（５．１９μｇ／ｍＬ）でトランスフェクトした細胞と比較して、ｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９発現ベクター（１．７５μｇ／ｍＬ）でトランスフェクトした細胞では、ｈＣＸＣＬ９のレベルは低下したが、なおもかなりのレベルで発現した（図１０Ｂ）。
ｍＩＬ１２～ｍＣＸＣＬ９発現ベクターから産生されたｍＩＬ１２タンパク質を活性についてさらに試験した。ｍＩＬ１２－２ＡまたはｍＩＬ１２～ｍＣＸＣＬ９発現ベクターでトランスフェクトした細胞から産生されたｍＩＬ１２をＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞と共にインキュベートした。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞を使用して、生物活性ヒトおよびマウスＩＬ－１２を検出する。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞は、組換え天然または操作ヒトまたはマウスＩＬ－１２の機能性を検証するために使用される。機能的ＩＬ－１２は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞中のＩＬ－１２受容体に結合し、ＳＴＡＴ－４経路およびＳＴＡＴ４誘導性ＳＥＡＰレポーター遺伝子を活性化する。次いで、ＳＥＡＰ発現をアッセイする。応答比は、処理細胞についての６３０ｎｍでのＯＤを未処理細胞についての６３０ｎｍでのＯＤで割ることによって計算した。図３に示す結果は、ｍＩＬ１２－２ＡまたはｍＩＬ１２～ｍＣＸＣＬ９発現ベクターのいずれかから産生されるＩＬ－１２が機能的であることを実証している。
同様に、ｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９発現ベクターから産生されたｈＩＬ１２タンパク質も活性について試験した。ｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９発現ベクターでトランスフェクトした細胞から産生されたｈＩＬ１２をＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞と共にインキュベートした。図１１に示される結果は、ｈＩＬ１２－２Ａ発現ベクターから産生されたＩＬ－１２が機能的であることを実証している。
実施例３．インビトロでのＴ細胞のＣＸＣＬ９誘導性遊走。哺乳動物（ＨＥＫ２９３）細胞に、ＣＸＣＬ９発現ベクター（ＣＸＣＬ９またはＩＬ１２～ＣＸＣＬ９）をトランスフェクトした。ＯＴ－Ｉマウス脾細胞に１μｇ／ｍＬ ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを２４時間パルスし、次いで７２時間回復させた。次いで、ＣＸＣＬ９トランスフェクト細胞を、５．０ミクロン細孔を有するポリカーボネート膜を介したＳＩＩＮＦＥＫＬパルスＯＴ－Ｉ脾細胞の走化性の誘導についてアッセイした。遊走指数を、ＯｐｔｉＭＥＭ陰性対照において膜を通って受動的に遊走した細胞の数に対して正規化された、観察された走化性細胞の数として定義した。結果を図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃに示す。ｍＣＸＣＬ９およびｍＩＬ１２～ｍＣＸＣＬ９発現ベクターから産生されたｍＣＸＣＬ９は、走化性細胞においてそれぞれ約７倍および約３倍の増加を引き起こした。走化性の増加は、ＣＸＣＬ９中和抗体の添加によって阻害され、この効果がｍＣＸＣＬ９に依存していることを示した。
実施例４．ｍＣＸＣＬ９のインビボ発現。ＣＴ－２６（結腸癌腫）腫瘍をマウスに移植した。その後、腫瘍をＩＴ－ＥＰ ｐＵＭＣＶ３コントロールベクターまたはＩＴ－ＥＰ ｍＣＸＣＬ９発現ベクターで処置した。ＩＴ－ＥＰの４８時間後、腫瘍をホモジナイズし、ＥＬＩＳＡ（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ＤＹ３９２；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５；ウェルチ補正を用いたＴ検定）によってＣＸＣＬ９発現についてアッセイした。図５の結果は、ＩＴ－ＥＰ処置腫瘍がＣＸＣＬ９を発現したことを示す。
実施例５．ｍＩＬ１２－２ＡおよびｍＣＸＣＬ９で処置したマウスにおける腫瘍退縮。マウスに腫瘍細胞を移植した。麻酔したマウスの右側および／または左側腹部に細胞を皮下注射した。平均腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達するまで、デジタルキャリパー測定によって腫瘍増殖をモニターした。
腫瘍を、０日目にＩＴ－ＥＰ対象ベクターまたはＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２－２Ａ発現ベクターで処置し、４日目および７日目にＩＴ－ＥＰ対象ベクターまたはＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９（必要に応じて、ｍｃｈｅｒｒｙ報告タンパク質を含む）で処置した。腫瘍体積および生存をモニターした。原発性および対側の総腫瘍量が２０００ｍｍ３に達したとき、マウスを安楽死させた。
図６に示すデータは、ＩＴ－ＥＰ ｍＩＬ１２－２Ａ＋ｍＣＸＣＬ９治療で処置したマウスが、未処置マウス、対照ビヒクルで処置したマウス、またはＩＴ－ＥＰ ｍＩＬ１２－２Ａ単独で処置したマウスと比較して、生存率の増加を示したことを示す。ＩＴ－ＥＰ ｍＩＬ１２－２Ａ＋ｍＣＸＣＬ９～ｍＣｈｅｒｒｙ治療で処置した腫瘍担持マウスも、原発性（処置）および対側（未処置）腫瘍進行の減少を示した（図７Ａ－Ｂ）。
実施例６．ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２－２Ａ＋ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９は、抗原特異的ＣＤ８および短寿命エフェクター細胞（ＳＬＥＣ）の全身増殖を駆動する。－８日目に、マウスに上記のように腫瘍を移植した。０日目に、腫瘍をＩＴ－ＥＰ ｍＩＬ１２－２Ａで処置した。４日目および７日目に、上記のようにＩＴ－ＥＰを用いて対照プラスミドまたはｍＣＸＣＬ９（ｎ＝３／群）でマウスを処置した。９日目に、脾臓を採取し、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞をＦＡＣＳによって分析した。図８は、ＣＤ３＋Ｔ細胞集団が、ＩＬ１２－２Ａ＋ＣＸＣＬ９で処置されたマウスにおいて有意に増加したことを示す。ＡＨ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞数の増加倍率を図９に示す。
実施例７．腫瘍内ＣＸＣＬ９は、ＩＬ－１２と相乗作用して、腫瘍微小環境を調節し、抗原特異的Ｔ細胞を増殖させ、対側の腫瘍増殖を制御する。マウスモデルを使用して、エレクトロポレーション後の腫瘍内発現を評価した。
ＣＴ２６腫瘍を－７日目にマウスに移植した。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ分析およびフローベースのアッセイのために、単一の腫瘍モデルを使用した。マウスを１日目にＩＴ－ＥＰで最適以下の用量のＩＬ１２－２Ａで処置し、続いて４日目および７日目にＩＴ－ＥＰで１００μｇのｍＣＸＣＬ９またはｐＵＭＶＣ３のいずれかを使用して処置した。次いで、腫瘍および免疫応答をモニターした。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇおよびフローベースの分析のために、最後のＥＰの２日後（すなわち、９日目）に腫瘍および脾細胞を採取した。あるいは、腫瘍体積を回帰／生存研究のために週に３回測定した。エレクトロポレーションしたＣＴ２６病変における遺伝子発現変化を、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）技術によって評価した。ｍＣＸＣＬ９の腫瘍内発現を、ＣＴ２６腫瘍を有するマウスからの腫瘍溶解物におけるエレクトロポレーションの４８時間後のｍＣＸＣＬ９についてのＥＬＩＳＡを使用して確認した（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５；ウェルチ補正を用いたＴ検定）。
各遺伝子のｐ値およびｌｏｇ２倍数変化を示すボルケーノプロットを、ＣＸＣＬ９単独またはＩＬ１２－２Ａと組み合わせたＣＸＣＬ９で処置したマウスにおいて作成した（図２８Ａ）。細胞型スコアの分析は、ＣＸＣＬ９またはＩＬ１２－２Ａのいずれかによる処置に応答した細胞傷害性免疫細胞の増加を示した。ＣＸＣＬ９をＩＬ１２－２Ａと組み合わせて投与した場合、細胞傷害性免疫細胞スコアの相乗的増加がさらに見られた。「細胞傷害性免疫細胞」の細胞型スコアを図２８Ｂに示す。
フローサイトメトリー分析を使用して、処置マウスの脾細胞を分析した。抗原特異的ＡＨ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を四量体分析（Ｉｍｍｕｄｅｘ）によって測定した。細胞を、Ｓｉｎｇｌｅｔｓ＜Ｌｉｖｅ＜ＣＤ３＋ＣＤ４－脾細胞（図８）でゲーティングする。空ベクター対照と比較したＡＨ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加倍率（３～５匹の動物／群を用いたＮ＝２の独立した実験；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５；一元配置ＡＮＯＶＡ）。対照プラスミドのみで処置したマウスでは、ＡＨ１四量体の０．７９％がＣＤ８＋であった。ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２－２Ａで処置したマウスでは、ＡＨ１四量体の１．４３％がＣＤ８＋であった。ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２－２ＡおよびＣＸＣＬ９で処置したマウスでは、ＡＨ１四量体の３．２２％がＣＤ８＋であった。ＡＨ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞数の増加倍率を図９に示す。
結果は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９が、最適以下の用量のＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２－２Ａで以前に処置された動物において抗腫瘍免疫応答を実質的に増強し得ることを示す。
ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ
実施例８．Ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ発現カセットを、ＣＸＣＬ９プラスミドの作製について上述したのと同様の様式で作製した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。
実施例９．タンパク質発現。ＯＫＴ３ ｓｃＦｖおよび２Ｃ１１ ｓｃＦｖ、発現ベクターをインビトロでＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。ＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖおよびＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ～ｍＩＬ１２をＢ１６－Ｆ１０腫瘍細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、上清を回収し、タンパク質をゲル電気泳動によって分離した。ＣＤ３ ｓｃＦｖ、カドヘリン（膜タンパク質）およびＨｓｐ９０をウエスタンブロット分析によって検出した。図１３に示される結果は、発現ベクターがＣＤ３ ｓｃＦｖタンパク質を発現したことを示す。ＣＤ３ ｓｃＦｖタンパク質は主に膜画分に位置していた。
ＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２発現ベクターをインビトロでＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞をＦＡＣＳによって分析してＣＤ３ ｓｃＦｖを検出した（図１４Ａ－Ｃ）。ＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖおよびＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ～ｍＩＬ１２発現ベクターをＢ１６－Ｆ１０細胞にトランスフェクトした。細胞をＦＡＣＳによって分析して、ＣＤ３ ｓｃＦｖの表面発現を検出した（図１４Ｄ）。ＩＬ１２－２ＡおよびＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ～ｍＩＬ１２発現ベクターからのＩＬ１２の発現を図１４Ｅに示す。
ＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２およびＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２発現ベクターをインビトロでＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ１２ｐ７０についてアッセイした。結果は、ＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２およびＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２発現ベクターでトランスフェクトした細胞がｈＩＬ１２ｐ７０を発現および分泌することを確認する（図１５）。
インビボ発現：マウスにＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞または４Ｔ１乳がん細胞を－７日目に接種した。０日目に、腫瘍をＩＴ－ＥＰ ＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２で処置した（図１６）。図１６Ａ～Ｂは、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥが、ＩＴ－ＥＰ後に、メラノーマおよび乳がん腫瘍の表面上に発現されることを示す。図１６Ｃは、ＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２のＩＴ－ＥＰに続いて、発現ベクターがＩＬ－１２も発現することを示す。
実施例１０．インビトロ機能アッセイ。Ｂ１６Ｆ１０細胞を、対照ベクターおよび２Ｃ１１ ｓｃＦｖ発現ベクター（組換えマウスＩＬ１２有りまたは無し）でインビトロでトランスフェクトした。次いで、トランスフェクトしたＢ１６Ｆ１０細胞をナイーブマウス脾細胞と２４、４８、または７２時間共培養した。共培養後、上清をＩＦＮγについてアッセイし、細胞増殖をＦＡＣＳによって評価した。プレート結合抗ＣＤ３を陽性対照として使用した。図１７に示される結果は、脾細胞を２Ｃ１１ ｓｃＦｖを発現するＢ１６Ｆ１０と共培養した場合、ＩＦＮγ発現が実質的に増加したことを示す。ＦＡＣＳ分析を行なって、ナイーブマウス脾細胞と、コントロールベクター（Ｔｆｘ対照）、２Ｃ１１ ｓｃＦｖ発現ベクター（組換えマウスＩＬ１２有りまたは無し）、またはプレート結合抗ＣＤ３（陽性対照）をインビトロでトランスフェクトしたＢ１６Ｆ１０細胞との共培養後のＣＦＳＥ標識ＣＤ３＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞の増殖を分析した（図１８）。
実施例１１．インビボ機能アッセイ。－９日目に、Ｂ１６－ＯＶＡ細胞をマウスに移植した（ｎ＝８／群）。０日目に、腫瘍をＩＴ－ＥＰによって２Ｃ１１ ｓｃＦｖ発現ベクターまたは空ベクター（陰性対照）で処置した。０日目に、養子移入によって、ＯＴ－１（ＧＦＰ）ＣＤ８＋細胞Ｔ細胞とナイーブマウスリンパ球との１：１混合物もマウスに移植した。５日目に、脾臓および排出リンパ節（ＤＬＮ）における養子移入されたＴ細胞増殖をＦＡＣＳによって調べた。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）における内因性Ｔ細胞集団およびＳＩＩＮＦＥＫＬ発現もＦＡＣＳによって調べた。ＤＬＮにおけるポリクローナルＴ細胞増殖の増加が、ＩＴ－ＥＰ ２Ｃ１１ ｓｃＦｖで処置されたマウスにおいて観察された（図１９）。ＯＴ－１およびポリクローナルＴ細胞集団の増加も、ＩＴ－ＥＰ ２Ｃ１１ ｓｃＦｖで処置したマウスの脾細胞で観察された。ＴＩＬ中のＣＤ４５．１＋生細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増加が、２Ｃ１１ ｓｃＦｖ ＩＴ－ＥＰで処置したＢ１６－ＯＶＡ腫瘍モデルマウスにおいて観察された（図２０）。ＴＩＬ中の抗原特異的（ＳＩＩＮＦＥＫＬ＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加が、２Ｃ１１ ｓｃＦｖ ＩＴ－ＥＰで処置したＢ１６－ＯＶＡ腫瘍モデルマウスにおいて観察された（図２１）。結果は、２Ｃ１１によるＩＴ－ＥＰが、ポリクローナルＴ細胞の増殖および腫瘍における腫瘍特異的Ｔ細胞応答の増強をもたらすことを実証している。
実施例１２．インビボ細胞傷害性Ｔ細胞死滅化アッセイ。ナイーブマウスからリンパ球を採取し、ＣＦＳＥで標識した。次いで、標識リンパ球にＯＶＡペプチドをパルスしてＴ細胞を活性化するか（ＣＦＳＥｈｉ、処理）、または未処理のままにした（ＣＦＳＥｌｏ、パルス無し）。ＣＦＳＥｈｉおよびＣＦＳＥｌｏリンパ球を、腫瘍を有するマウスへの投与のために約１：１の比で組み合わせた。
－７日目に、マウスにＢ１６－ＯＶＡ腫瘍細胞（オボアルブミンを発現するＢ１６メラノーマ細胞）をｃ５７／ｂｌ／６マウスの側腹部に移植した。１日目に、マウスをＩＴ－ＥＰ抗２Ｃ１１ ｓｃＦｖまたは空ベクター（ｐＵＭＶＣ３）で処置した。２日目に、マウスに、パルス刺激された標的細胞（１μＭ ＣＦＳＥ（５（６）－カルボキシフルオレセインＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル）で標識された２μｇ／ｍｌ ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドでパルス刺激された細胞）およびパルス刺激されていない細胞を養子移入によって投与した。養子移入の１８時間後、脾臓および排出リンパ節を回収し、分析した。
ウエスタンブロット分析は、腫瘍がＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを発現することを示した。３日目、養子移入の１８時間後に、ＤＬＮを単離した。次いで、ＣＦＳＥｌｏおよびＣＦＳＥｈｉ細胞の存在について、ＤＬＮをＦＡＣＳによって分析した。図２２に示す結果は、ＣＦＳＥｈｉ細胞の数の実質的な減少を示し、ＯＶＡペプチドを提示する細胞の抗原特異的死滅化を示した。以下の式を使用して減少を定量した：
結果を図２３に示し、脾細胞（ＳＰ）およびＤＬＮの両方におけるＣＦＳＥｈｉ細胞の溶解の増加を示す。ＣＦＳＥ細胞のＦＡＣＳ分析を図２４に示す。対照マウスでは、ＣＦＳＥｈｉ細胞の溶解パーセントは５４．６３±１２．７９％であった。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療を受けたマウスでは、ＣＦＳＥｈｉ細胞の溶解パーセントは８２．４４±１１．３５％であった。ＯＶＡ発現細胞は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥで処置したマウスで特異的に死滅し、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答の増強を示した。活性化Ｔリンパ球は、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを発現する腫瘍に優先的に保持された。したがって、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする核酸のエレクトロポレーションは、有効な腫瘍治療を提供する。
ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥのＩＴ－ＥＰは、Ｔ細胞による腫瘍細胞の標的化の増加をもたらした。脾臓および排出リンパ節由来の細胞のフローサイトメトリー分析は、ＩＴ－ＥＰ抗ＣＤ３（２Ｃ１１）群において有意な抗原特異的死滅化を実証している（図２３および図２６）。
実施例１３．腫瘍退縮。
Ａ．メラノーマ：－７日目に、マウスにＢ１６メラノーマ細胞を移植した。０日目に、マウスを、ＩＬ１２－２Ａをコードする発現ベクターである対照空ベクターを用いてＩＴ－ＥＰで処置した。４日目および７日目に、マウスをＩＴ－ＥＰ対照ベクターまたはＩＴ－ＥＰ ２Ｃ１１（ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ）発現ベクターで処置した。腫瘍進行を３日ごとにモニターした。結果は、ＩＬ１２－２Ａ単独での処置と比較して、ＩＬ１２－２Ａ＋ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥで処置したマウスにおける改善された対側（未処置）腫瘍退縮を示す（図２５Ａおよび２５Ｂ）。
Ｂ．乳がん：－７日目に、マウスに４Ｔ１乳がん細胞を移植した。０日目に、マウスを対照ベクターによるＩＴ－ＥＰ、またはＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２－２Ａで処置した。４日目および７日目に、マウスを対照ベクターまたはＩＴ－ＥＰ ２Ｃ１１（ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ）発現ベクターによるＩＴ－ＥＰで処置した。腫瘍進行を３日ごとにモニターした。結果は、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２－２ＡをＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療と組み合わせることにより、乳がん腫瘍退縮が改善されることを示している（図２６Ａ）。ＩＬ１２－２Ａ＋ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ治療はまた、４Ｔ１乳がんモデルマウスにおける肺転移結節の処置に有効であった（図２６Ｂ）。４Ｔ１乳がんモデルマウスにおける末梢血（μＬ）あたりのエフェクターＴ細胞（ＣＤ１２７－ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ３＋）の絶対数を図２６Ｃに示す。
ＣＸＣＬ９／ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ併用治療
実施例１４．ＣＸＣＬ９＋ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ併用治療Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍担持マウスを、１０μｇのＩＬ－１２発現プラスミド、１００μｇのＩＬ－１２発現プラスミド、または１００μｇのＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９／ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２によるＩＴ－ＥＰ（１日目、５日目、８日目）で処置した。ＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９／ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２については、ＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２のいずれかを、対象がＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９による少なくとも１つのＩＴ－ＥＰ処置およびＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２による１回のＩＴ－ＥＰ処置を受けるならば、１日目、５日目および８日目の各々に投与する。腫瘍溶解物においてＩＴ－ＥＰの４８時間後にＩＬ－１２の腫瘍内発現が確認された（ＥＬＩＳＡ）（ｎ＝８匹の動物）。ＩＬ１２ｐ７０発現を図２９Ａに示す。原発性（エレクトロポレーション病変）および対側（非エレクトロポレーション病変）Ｂ１６．Ｆ１０病変の増殖をＩＴ－ＥＰ治療の１２日後に測定した（図２９Ｂ－Ｃ）。ＩＬ１２ｐ７０発現に関して、１０μｇのＩＬ１２－２ＡによるＩＴ－ＥＰで処置した動物は、１００μｇの ＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９／ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２で処置した動物と同じ量のＩＬ１２を発現した（図２９Ａ）。対側の腫瘍は、ＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９／ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２処置動物では、１０μｇのＩＬ１２－２Ａ処置マウスと比較して有意に小さく（８～１０匹の動物／群；二元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定された統計的有意性＊ｐ＜０．０５）、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９／ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２治療を用いた腫瘍退縮の増強を示している。
ＣＬＴＡ－４ ｓｃＦｖ
実施例１５．抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖの腫瘍内発現。マウスＩｇＧ１ ＥＬＩＳＡ（ａｂ１３３０４５）をＲＥＮＣＡ腫瘍溶解物に対して実施して、抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖの腫瘍内発現を定量した。抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖの発現は腫瘍でのみ検出され、血清では検出されず、腫瘍内エレクトロポレーション時の抗体の局所発現が強調された。
プラスミドは、組換えＣＴＬＡ４タンパク質に結合した抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖをコードした。トランスフェクション由来分泌型抗ＣＴＬＡ４（ｓｃＦｖ）を、ＣＴＬＡ－４に対するそれらの結合能について評価した。組換えマウスＣＴＬＡ－４／ヒトＩｇＧ１キメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を９６ウェルプレート（１または５μｇ／ｍＬ、または５０μｇ／ウェルまたは２５０μｇ／ウェル）に室温で１８時間固定した。ウェルをＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で３回洗浄し、ＰＢＳ中１％ＢＳＡでブロックした。９Ｈ１０－ｓｃＦｖ（１６８ｎｇ／ｍＬ）または９Ｄ９－ｓｃＦｖ（１３０ｎｇ／ｍＬ）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの馴化培地をウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、抗マウスＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、０．２μｇ／ｍＬ）を添加し、室温で１．５時間インキュベートした。ウェルを再度３回洗浄し、ＨＲＰ基質試薬（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で発色させ、停止溶液、２Ｎ硫酸（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で停止させた。各ウェルの光学密度を４５０ｎｍで測定した。プラスミド由来の抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖの組換えＣＴＬＡ４タンパク質への結合を実証する、各条件群の平均ＯＤ値のグラフ表示を示す（図３０Ａ）。
マウスＩｇＧ１ ＥＬＩＳＡ（ａｂ１３３０４５）をＲＥＮＣＡ腫瘍溶解物に対して実施して、抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖの腫瘍内発現を定量した。抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖの発現が腫瘍において検出された（図３０Ｂ）。統計学的に有意なレベルの抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖは血清中で観察されず、腫瘍内エレクトロポレーション時の抗体の局所発現を示した。
本発明は、単なる例として上述されていることが理解されよう。実施例は、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。以下の特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲および主旨から逸脱することなく、様々な修正および実施形態を行うことができる。
ＣＸＣＲ３発現
実施例１６．ＣＸＣＲ３の腫瘍内レベルは、抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１治療に対する応答を予測する。臨床研究および前臨床研究は、エレクトロポレーションを介して腫瘍内に送達されたプラスミドＩＬ－１２がＩＦＮ－γ発現を駆動し、Ｔ細胞の増殖をもたらし、Ｔ細胞を腫瘍微小環境に動員することを実証した。この動員は、持続的な全身性Ｔ細胞応答をもたらす。ＩＬ－１２／抗ＰＤ－１併用治療を受けている患者からのバイオマーカーデータの分析は、臨床応答が腫瘍内ＣＸＣＲ３レベルと相関することを示す。すべての患者が周辺部において同様の頻度の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を有していたが、応答患者は、非応答患者（ｐ＝０．４）と比較して、処置後に腫瘍内ＣＸＣＲ３転写物の有意な増加を有していた（ｐ＝０．０３）。したがって、腫瘍浸潤ＣＸＣＲ３＋免疫細胞の存在は、臨床応答のためのバイオマーカーとして使用することができる。
ＣＸＣＬ９の腫瘍内エレクトロポレーションは、腫瘍へのＣＸＣＲ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の効率的な輸送をもたらす。ＣＸＣＬ９勾配は、腫瘍浸潤腫瘍反応性ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞の頻度を生産的に調節することができる。
上記のように、プラスミドＩＬ－１２およびＣＸＣＬ９の腫瘍内エレクトロポレーションは、全身性抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加および処置された腫瘍と対側の腫瘍の両方の退縮の改善によって証明される堅牢な抗腫瘍免疫応答を誘発する。
実施例１７．ＩＬ－１２ ＩＴ－ＥＰおよびペンブロリズマブ併用治療に対する臨床応答。患者を、２７週間にわたって、６週間ごとに１日目、５日目および８日目に０．５ｍｇ／ｍｌのＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２で接近可能な病変部に対して処置し、各３週間サイクルの１日目に２００ｍｇのＩＶペンブロリズマブで処置した（図３１）。ＩＬ－１２をコードする核酸を、０．１ｍＬの最小用量体積で、計算された病変体積の約１／４の用量体積で注射した。エレクトロポレーションは、６本のマイクロニードルの六角形の矢印を有するアプリケータを使用して投与した。注射した腫瘍の中および周囲にマイクロニードルを配置し、先端をプラスミド注射の部位および深さに共局在させた。３００ミリ秒間隔で、電界強度１５００Ｖ／ｃｍ、パルス幅１００μ秒のパルスを６回照射した。
処置後の増殖Ｋｉ－６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加は、応答者と非応答者の両方で観察された。Ｋｉ－６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、応答患者および非応答患者の両方において、処置前（処置前）および処置サイクル２後（処置後）にフローサイトメトリー（ゲーティング戦略Ｓｉｎｇｌｅｔｓ＜Ｌｉｖｅ＜ＣＤ３＜ＣＤ８）によって分析した（ｎ＝６／群）（図３２）。対照的に、腫瘍内ＣＸＣＲ３転写レベルの増加は、応答者でのみ観察された（応答者についてはｎ＝５、非応答者についてはｎ＝８）（図３３）。
実施例１８．抗ＣＸＣＲ３抗体は、ｐＩＬ１２ ＩＴ－ＥＰ治療によって媒介される腫瘍退縮を阻害する。ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２（ＴＡＶＯ（Ｐ２Ａ））は、排出リンパ節においてＣＸＣＲ３＋リンパ球の増加をもたらした。ＣＴ２６腫瘍をマウスの脇腹に移植した。腫瘍の発生後、マウスをＩＴ－ＥＰで５０μｇのＩＬ－１２（ＴＡＶＯ（Ｐ２Ａ））または５０μｇの対照（空）ベクター（ＥＶ）のいずれかで処置した。２４時間後、ＰＢＭＣをマウスから得て、フローサイトメトリー（ゲーティング戦略Ｌｉｖｅ＜ｓｉｎｇｌｅｔｓ＜ＣＤ４５＋ＣＤ３＋＜ＣＤ８＋ＣＤ４－、ＭＦＩ＝平均蛍光強度）によってＣＤ８＋ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞について分析した（図３４）。
９６時間後、排出リンパ節（ＤＬＮ）から細胞を得て、ＣＸＣＬ９誘導性走化性について分析した（図３５）。ＤＬＮ由来の細胞を、５．０ミクロン細孔を有するポリカーボネート膜（Ｃｏｓｔａｒ ３４２１）によって下部チャンバーから分離された上部チャンバーに入れた。下部チャンバーには、ＣＸＣＬ９を発現するプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ細胞からの馴化培地を含めた。観察された走化性細胞の数は、３７°Ｃで２時間後に観察された。ＩＴ－ＥＰ ＴＡＶＯ（Ｐ２Ａ）で処置したマウスのＤＬＮ由来の細胞は、空ベクターで処置したマウスのＤＬＮ由来の細胞と比較して増加した遊走を示した。細胞と抗ＣＸＣＲ３モノクローナル抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ ＢＥ０２４９）とのプレインキュベーションは走化性を消失させ、走化性の増加がＣＸＣ３Ｒ＋細胞の増加の結果であることを示した。
ＣＸＣＲ３枯渇は、ＩＬ－１２応答の完全な消失をもたらした。ＣＴ２６対側腫瘍モデルを、付随する抗ＣＸＣＲ３抗体処置有りまたは無しで、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２で処置した。空ベクター、ＴＡＶＯ（Ｐ２Ａ）またはＴＡＶＯ（Ｐ２Ａ）＋抗ＣＸＣＲ３によるＩＴ－ＥＰ後の原発性（エレクトロポレーション）腫瘍および未処置（対側）腫瘍の増殖を分析した。対側の腫瘍増殖は、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２（ＴＡＶＯ（Ｐ２Ａ））で処置したマウスにおいて阻害された。この阻害は、抗ＣＸＣＲ３抗体によって遮断された（図３６）。
さらに、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２で処置したマウスは、有意な生存利益を示した。生存利益はまた、抗ＣＸＣＲ３抗体によって阻止された（図３７）。
実施例１９．ＩＬ－１２＋ＣＸＣＬ９の腫瘍内エレクトロポレーションは、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２の抗腫瘍効果を増強した。ＣＴ２６対側腫瘍マウスモデルを、２μｇ（低用量）または５０μｇの空ベクターまたはＩＬ－１２（ＴＡＶＯ（Ｐ２Ａ））のいずれかを使用して、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２で処置した。２４時間後、腫瘍常在ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、細胞内ＩＦＮ－γ発現について染色した。ＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍内ＩＦＮ－γ発現は、ＩＬ－１２用量に関係なく類似しており、低用量（２μｇ）のＩＬ－１２が免疫学的に活性であることを示している（図３８）。
次に、マウスを、表２に示されるように、ＩＴ－ＥＰ空ベクター、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２（ＴＡＶＯ（Ｐ２Ａ））＋ＩＴ－ＥＰ空ベクター、またはＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２（ＴＡＶＯ（Ｐ２Ａ））＋ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９（プラスミド発現ＣＸＣＬ９）で処置した。
脾臓および処置腫瘍を１０日目に採取し、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇおよびフローサイトメトリーによって分析した。エレクトロポレーションされた腫瘍における遺伝子発現変化を、経路スコアを用いてＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ技術（マウスＰａｎＣａｎｃｅｒ ｉｏ３６０パネル）によって分析した。経路スコアは、ｔスコアの等しい分散および正規分布の仮定に従った。通常の一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、空ベクター処置群（ｎ＝４／群）と比較した有意性を計算した。腫瘍微小環境のトランスクリプトーム分析により、免疫関連経路（ＩＦＮγシグナル伝達、インターロイキンシグナル伝達、ＧＰＣＲシグナル伝達）、抗原提示機構、およびＴＣＲシグナル伝達に関連する遺伝子の濃縮が明らかになり、この併用治療が抗腫瘍免疫を増強したことが示された（図３９）。
抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞（ＡＨ１＋ＣＤ８＋）を、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２単独または空ベクターと比較した場合、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２＋ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９で処置したマウスにおいて濃縮した（ゲーティング戦略ＳＳＣ＜Ｌｉｖｅ＜Ｓｉｎｇｌｅｔｓ＜ＣＤ４－脾細胞）。
空のベクター対照処置マウスと比較して、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２処置マウスおよびＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２＋ＣＸＣＬ９処置マウスにおいて、ＡＨ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージの有意な増加が観察された。
実施例２０．ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９は、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２媒介性アブスコパル抗腫瘍応答を増強する。左側腹部および右側腹部の両方に移植腫瘍を有するマウス（対側腫瘍モデル）を表２のように処置した。一方の腫瘍のみに処置を投与した。腫瘍体積を、回帰研究および生存研究のために週に３回測定した。処置腫瘍（左パネル）および未処置腫瘍の増殖は、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２治療およびＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９治療による逐次処置が、処置腫瘍および未処置腫瘍（対側）の両方において腫瘍退縮の改善および生存の改善をもたらしたことを示した（図４１）。
単一のＣＭＶプロモーターからＩＬ－１２ ｐ３５、ＩＬ－１２ ｐ４０およびＣＸＣＬ９を発現するプラスミドを使用して、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２＋ＣＸＣＬ９でマウスを処置した。空ベクターＴＡＶＯ（Ｐ２Ａ）またはＴＡＶＯ（Ｐ２Ａ）－ＣＸＣＬ９によるＩＴ－ＥＰ処置の２４時間後に収集した腫瘍由来のＣＤ８細胞のＣＸＣＲ３＋発現の頻度および平均蛍光強度は、ＩＬ－１２またはＩＬ－１２＋ＣＸＣＬ９のＩＴ－ＥＰ後にＣＤ８＋ＣＸＣＲ３＋細胞の増加を示した（図４３）。
ＣＴ２６腫瘍細胞を－７日目にマウスの左右側腹部に移植した。次いで、腫瘍移植マウスを、腫瘍の一方においてＩＴ－ＥＰ空ベクター（群１）、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２（ＴＡＶＯ（Ｐ２Ａ）；群２）またはＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２－ＣＸＣＬ９（ＴＡＶＯ（Ｐ２Ａ）－ＣＸＣＬ９；群３）のいずれかで１日目、５日目、および８日目に処置した。プラスミド用量を、ＥＬＩＳＡによって決定されるＴＡＶＯ（Ｐ２Ａ）－ＣＸＣＬ９プラスミドで処置したマウスにおいて産生されたＩＬ－１２の量に対して正規化した。処置後１２日で、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２－ＣＸＣＬ９群由来の対側腫瘍は有意に小さかった（図４４）。ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９で処置したマウスも生存優位性を示した（図４５）。
実施例２１．ＩＬ－１２およびＣＸＣＬ９の腫瘍内エレクトロポレーションは抗ＰＤ－１治療を改善する。ＣＴ－２６腫瘍細胞をマウスの左右側腹部に移植した。次いで、マウスを表３のスケジュールに従って処置した。腫瘍体積を、回帰研究および生存研究のために週に３回測定した（図４６）。
ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９は、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２と組み合わせた場合、抗原特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＡＨ１＋ＣＤ８＋）の生成の増加、ＩＬ－１２治療に対するアブスコパル応答の増強、および抗ＰＤ－１抗腫瘍応答の改善を引き起こした。理論に拘束されることを望むものではないが、ＩＬ－１２は、ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞の活性化および／または増殖を増加させ得る。次いで、ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞は、ＣＸＣＬ９のＣＸＣＲ３ケモカイン活性によって腫瘍に動員される。
実施例２２．ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、腫瘍においてＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞を増加させる。バイオマーカーデータは、動員されると臨床的免疫療法応答を増加させ得る非腫瘍反応性ＴＩＬを同定した。新生物細胞および間質細胞上のＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ発現はＣＤ３＋ＴＩＬを活性化し、増殖および細胞傷害性の増強を推進する。ナイーブＴ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、および疲弊Ｔ細胞（典型的には強い抗腫瘍応答に関連しないサブセット）は、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよびＩＬ－１２の関与によりエフェクター機能の増強（ＩＦＮγおよびグランザイムＢ放出）を示した（図４７～図４８）。
ＩＬ－１２とＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥとの組み合わせは、それらの同族ペプチド：ＭＨＣに対する親和性にかかわらずＴ細胞の増殖を増強し、Ｔ細胞受容体非依存性機構を示唆した。したがって、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２＋ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、Ｔ細胞の広いサブセットを動員することができる。
腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の免疫プロファイリングを使用して、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、ＣＸＣＲ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞および短寿命エフェクターＴ細胞の頻度を有意に上方制御することが見出された。本発明者らはさらに、抗ＰＤ－１治療で活発な臨床的進行を有するメラノーマ患者におけるＴＩＬの機能的回復が、ＩＬ－１２の存在下におけるＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥの関与によって可能であったことを示す（図４９）。
４Ｔ１腫瘍を、０日目に５０μｇの空ベクター（ＥＶ）またはＩＬ－１２（ＴＡＶＯ（Ｐ２Ａ））を使用してＩＴ－ＥＰで処置し、続いて３日目および５日目に５０μｇのＥＶまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを使用してＩＴ－ＥＰで処置した：（Ａ）腫瘍体積、（Ｂ）自発性転移性肺モジュール、（Ｃ）ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、（Ｄ）ＣＤ８＋ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞、（Ｅ）ＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞、（Ｆ）エフェクターＴ細胞、および（Ｇ）エフェクターメモリーＴ細胞。Ｔ細胞集団をＩＴ－ＥＰ処置の６日後に測定した。
抗ＰＤ－１治療で活発に進行している患者から単離したＴＩＬを、空ベクターまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ（ＩＬ－１２有りまたは無し）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞と３日間共培養した。プレート結合抗ヒトＣＤ３と共に培養したＴＩＬを陽性対照として使用した。ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合、ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合、およびＩＦＮγ発現レベルは、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞とインキュベートしたＴＩＬでより高く、抗ＰＤ－１治療で進行している患者由来のＴＩＬがＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥに応答して免疫機能を回復することを示した（図５０）。
ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２～ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、末梢血中のエフェクターＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、および活性化Ｔ細胞の数を増加させ、抗原特異的細胞傷害性を増加させ、転移性腫瘍量を減少させ、チェックポイント阻害剤治療で進行している患者のＴＩＬの機能的活性を回復させることができる。

Claims (15)

  1. ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする核酸、ならびに薬学的に許容され得る担体を含む、対象におけるがんを処置する方法において使用するための薬学的組成物であって、
    前記対象が、少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または少なくとも１つの用量の免疫刺激性サイトカインを以前に全身投与され、所定の対照におけるＣＸＣＲ３発現と比較して、前記対象から得られた腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現が増加しておらず、
    前記方法が、少なくとも１つの薬学的有効用量の前記薬学的組成物と、少なくとも１つの追加の用量の前記チェックポイント阻害剤および／または少なくとも１つの追加の用量の前記免疫刺激性サイトカインを前記対象に投与すること、を含み、
    前記チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、またはアテゾリズマブを含む、
    薬学的組成物。
  2. 請求項１に記載の方法において使用するための薬学的組成物であって、前記方法が、
    （ａ）少なくとも１つの用量のチェックポイント阻害剤および／または少なくとも１つの用量の免疫刺激性サイトカインで以前に処置された前記対象から得られた腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定すること、
    （ｂ）所定の対照におけるＣＸＣＲ３発現と比較して、前記腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現が増加しているかどうかを判定すること、ならびに
    （ｃ）前記所定の対照におけるＣＸＣＲ３発現と比較して、前記腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現が増加している場合には、少なくとも１つの追加の用量の前記チェックポイント阻害剤および／または少なくとも１つの追加の用量の前記免疫刺激性サイトカインを前記対象に投与すること、あるいは前記所定の対照におけるＣＸＣＲ３発現と比較して、前記腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現が増加していない場合には、少なくとも１つの薬学的有効用量の前記薬学的組成物と、少なくとも１つの追加の用量の前記チェックポイント阻害剤および／または少なくとも１つの追加の用量の前記免疫刺激性サイトカインを前記対象に投与すること、を含む、薬学的組成物。
  3. 前記対象が、前記少なくとも１つの用量の前記チェックポイント阻害剤の全身投与で以前に処置されている、請求項１に記載の方法において使用するための薬学的組成物。
  4. 前記対象が、前記少なくとも１つの用量の前記免疫刺激性サイトカインで以前に処置されており、前記免疫刺激性サイトカインが、前記免疫刺激性サイトカインをコードする核酸の腫瘍内エレクトロポレーションによって投与された、請求項１に記載の方法において使用するための薬学的組成物。
  5. 前記免疫刺激性サイトカインが、ＩＬ－１２またはＩＬ－１５を含む、請求項４に記載の方法において使用するための薬学的組成物。
  6. ＩＬ－１２をコードする前記核酸が、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットをコードする第１の核酸配列と、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットをコードする第２の核酸配列とを含み、前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列が、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａ翻訳修飾エレメントによって分離されている、請求項５に記載の方法において使用するための薬学的組成物。
  7. 前記腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３発現を測定することが、
    （ａ）前記腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３ ｍＲＮＡを測定すること、
    （ｂ）前記腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３タンパク質を測定すること、または
    （ｃ）前記腫瘍試料におけるＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞の数を測定すること、
    を含む、請求項２に記載の方法において使用するための薬学的組成物。
  8. 前記所定の対照が、
    （ａ）工程（ａ）の前に前記対象から得られた腫瘍試料、または
    （ｂ）チェックポイント阻害剤および／もしくは免疫刺激性サイトカイン治療に対する既知の応答者および／もしくは既知の非応答者の集団に由来する標準
    を含む、請求項２に記載の方法において使用するための薬学的組成物。
  9. 少なくとも１つの薬学的有効用量の前記薬学的組成物を投与することが、ＣＸＣＬ９、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、ＣＸＣＬ９とＩＬ－１２、またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥとＩＬ－１２のうちの１または複数をコードする１またはそれを超える核酸の腫瘍内エレクトロポレーションを含む、請求項１に記載の方法において使用するための薬学的組成物。
  10. 少なくとも１つの追加の用量の前記チェックポイント阻害剤および／または前記少なくとも１つの追加の用量の前記免疫刺激性サイトカインを投与することが、少なくとも１つの追加の用量の抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体を全身投与によって投与すること、少なくとも１つの追加の用量のＩＬ－１２をコードする核酸を腫瘍内エレクトロポレーションによって投与すること、または少なくとも１つの追加の用量の抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体を全身投与によって投与すること、および少なくとも１つの追加の用量のＩＬ－１２をコードする核酸を腫瘍内エレクトロポレーションによって投与することを含む、請求項１に記載の方法において使用するための薬学的組成物。
  11. 前記ＩＬ－１２をコードする前記核酸が、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットをコードする第１の核酸配列と、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットをコードする第２の核酸配列とを含み、前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列が、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａ翻訳修飾エレメントによって分離されている、請求項１０に記載の方法において使用するための薬学的組成物。
  12. 前記がんが、メラノーマ、基底細胞癌腫、乳がん、ＥＲ陽性乳がん、ＥＲ陰性乳がんトリプルネガティブ乳がん、または頭頸部がんである、請求項１に記載の方法において使用するための薬学的組成物。
  13. ＣＸＣＬ９、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、ＣＸＣＬ９とＩＬ－１２、および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥとＩＬ－１２の１または複数をコードする前記１またはそれを超える核酸が、少なくとも１つの３週間または６週間サイクルの１日目、５日目および８日目に投与される、請求項９に記載の方法において使用するための薬学的組成物。
  14. 前記チェックポイント阻害剤が、少なくとも１つの３週間サイクルの１日目に投与される、請求項１３に記載の方法において使用するための薬学的組成物。
  15. 少なくとも１つの薬学的有効用量の前記薬学的組成物を投与することが、前記腫瘍中のＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞の数の増加をもたらす、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法において使用するための薬学的組成物。
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