JP7784433B2 - テトラデンテート窒素供与体リガンドを含む遷移金属錯体およびこれを含む電気化学的バイオセンサー - Google Patents

テトラデンテート窒素供与体リガンドを含む遷移金属錯体およびこれを含む電気化学的バイオセンサー

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Description

[関連出願の相互参照]
本出願は、２０２０年１２月３１日付の韓国特許出願第１０－２０２０－０１８９１３９号に基づく優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。
本発明は、電子伝達メディエータとして有用なテトラデンテート窒素供与体リガンドを含む遷移金属錯体およびこれを含む電気化学的バイオセンサーに関する。
糖尿病は高い血糖数値が長い間持続した時現れる疾患で、心血管疾患、脳卒中、腎臓疾患などの合併症を誘発する。高い血糖数値に対応してインシュリン注入により血糖数値を減少させる過程が必要であるが、もし、インシュリンが過多注入されると、低血糖症状が発生し、これによりショックまたは死亡に至る場合もある。これを防止するために糖尿病患者は適切な血糖数値を維持する目的で血糖測定センサーを用いて持続的に体内血糖濃度を測定することが必須である。
最近では、持続血糖測定システム（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、ＣＧＭＳ）が適用された血糖センサーが多く研究されて商用化されている。ＣＧＭＳセンサーは皮下組織に挿入され、血液ではなく細胞間液により連続してブドウ糖の濃度を測定する装置である。指採血方式の場合、一日に５～６回の血糖測定では正確な血糖数値変化を確認することが難しい反面、ＣＧＭＳは一日に血糖数値変化と傾向性を確認できる長所がある。これにより、患者は高血糖症状または低血糖症状を迅速に認識することができ、血糖管理能力をさらに改善することができる。
バイオセンサーは選択的に生体試料を感知し、これを特定の信号に切り替える機器を意味する。特に、電気化学的方式を用いた酵素ベースのバイオセンサーは、酵素によって選択性が向上するだけでなく、小型化が可能で、測定の正確性のために使用することが好ましい。
電気化学方式を用いた血糖バイオセンサーは大きく１世代と２世代方式に分けられる。１世代血糖センサーは、クラーク（Ｃｌａｒｋ）とリヨン（Ｌｙｏｎ）により最初に開発され、酵素の酸化－還元反応を経て減少した酸素濃度および発生した過酸化水素の濃度変化により血糖数値を測定する方式であり、２世代血糖センサーは、酵素の酸化－還元反応により発生した電子を電子伝達メディエータにより電極に伝達する方式である。第２世代センサーは、第１世代センサーより酸素濃度による誤差が少なく、媒介体による電子伝達反応が効率的でかつ速いという点で多くの長所を有している。このような理由から、電子伝達メディエータを含む第２世代センサー方式がＣＧＭＳ血糖センサーに適用されている。
電気化学方式の酵素ベースの血糖バイオセンサーは、一般に酵素、電子伝達メディエータ、および電極で構成されている。最初は酵素によってブドウ糖がグルコノラクトン（ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ）に酸化され、次いで、還元された酵素は酸化され、電子伝達メディエータに電子を供与する。その後、還元された媒介体が酸化され、電極に電子を伝達する過程を経る。このような一連の過程から血糖数値を電気的信号により確認することができる。
血糖センサーに適用される酵素は、一般にグルコース酸化酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ、ＧＯｘ）とグルコース脱水素酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＧＤＨ）がある。ＧＯｘは選択的にグルコースを酸化させ、低い価格と高い安定性のために血糖センサーに幅広く適用されている。しかし、ＧＯｘは酸化過程で酸素によって大きく影響を受けるため、ＧＯｘベースの血糖センサーは高度が高いかまたは気圧が低い地域で実際の数値よりも高い血糖数値が測定される誤差が現れることが知られている。ＧＯｘとは異なり、ＧＤＨは酸素濃度とは関係なく、グルコースを選択的に酸化させることができるという特徴がある。特に、ＦＡＤ（ｆｌａｖｉｎ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含むＧＤＨは酸素の影響を受けず、優れた熱安定性のために血糖センサーに適用されることに大きな利点を有する。しかし、厚いタンパク質膜がＦＡＤ活性部位を囲んでいるため、ＧＤＨが電極表面に直接電子を伝達することは困難である。このような問題を解決するために、酵素と電極表面との間に電子伝達反応を容易にする電子伝達メディエータの役割が非常に重要である。
電子伝達メディエータの電気化学的特性は、血糖センサー内で迅速な電子伝達、選択性および感度にも影響を与えられる核心的な要素である。媒介体の電位により生体内の妨害物質の干渉を避けることができ、隣接する電極間の媒介体が繰り返し酸化／還元反応で電流の誤差を発生させる現象であるレドックスシャトル（ｒｅｄｏｘ ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ）を熱力学的に避けることができる。したがって、電子伝達メディエータが効率的な機能を行うためには適切に低い酸化－還元電位（－０．２Ｖ～０Ｖ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）を有することが理想的である。さらに、酸化種と還元種はいずれも化学的に安定で、体内で毒性があってはならない。
これまで多く研究されている電子伝達メディエータは、フェロセン（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ）誘導体、フェリシアニド（ｆｅｒｒｉｃｙａｎｉｄｅ）、テトラチアフルバレン（ｔｅｔｒａｔｈｉａｆｕｌｖａｌｅｎｅ）、および遷移金属錯体などがある、最近では鉄、ルテニウム、オスミウムを中心金属とした錯体が電子伝達メディエータとして多く研究されているが、依然として高い効率性を有し、安定で体内での毒性のない新たな電子伝達メディエータが求められる。
このような背景下で、本発明者らは電気化学的バイオセンサーのための電子伝達メディエータとして有用な遷移金属錯体に対して研究を重ねた結果、四座リガンド（テトラデンテートリガンド）としてトリス－２－ピリジルメチルアミン（ｔｒｉｓ（２－ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｅ、ＴＰＭＡ）を導入する場合、従来の単座または二座リガンドに比べて優れた安定性を示し、これらから製造された遷移金属錯体は容易に合成が可能で、安定した電気化学的特徴を示すことを確認して本発明を完成した。
本発明の目的は、テトラデンテート窒素供与体リガンドを含む電子伝達メディエータ用新規な遷移金属錯体を提供することである。
本発明の他の目的は、前記遷移金属錯体を含む酸化－還元重合体を含む電気化学的バイオセンサーを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記遷移金属錯体の製造方法を提供することである。
本発明の一側面によれば、電子伝達メディエータとして有用な、テトラデンテート窒素供与体リガンドを含む遷移金属錯体が提供される。
本発明の一側面によれば、前記遷移金属錯体を製造する方法が提供される。
本発明の一側面によれば、前記遷移金属錯体を電子伝達メディエータとして含む装置が提供される。
本発明の一側面によれば、液体性生体試料を酸化還元させることができる酵素；および前記遷移金属錯体を電子伝達メディエータとして含む電気化学的バイオセンサー用センシング膜が提供される。
本発明に係るテトラデンテート窒素供与体リガンドを含む遷移金属錯体は、電気化学的センサーに用いる場合、電気化学的センサーの性能を優れるように向上させる。
本発明の遷移金属錯体を製造するためのテトラデンテートリガンドを製造するための多様な合成方法を示す図である。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）錯体およびこれから合成できる多様な誘導体の合成方法を示す反応式である。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）の結晶構造を示す図である。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ錯体およびこれから合成できる多様な誘導体の合成方法を示す反応式である。 ヒドロキシメチルＴＰＭＡオスミウム錯体のＥＳＩ－ＭＳ上で確認される質量シグナルの変化を示す図である。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（Ｘ－）（１８）のＣＶデータを示すグラフである。 ＴＰＭＡ系のオスミウム錯体の構造と酸化／還元電位を示す図である。 ＴＰＭＡ系のオスミウム錯体の構造と酸化／還元電位を示す図である。 ＴＰＭＡ系のオスミウム錯体の構造と酸化／還元電位を示す図である。 置換基による［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）錯体の循環電流電圧法による電位値を比較したグラフである。図８ａはＥＤＧを有する錯体と比較（１８、２１、２３したグラフである。濃度に関係なく錯体の電位値を比較するために電流値を１８に合わせて補正し、０．１Ｍ ＴＰＭＰ ｉｎ ＣＨ３ＣＮ溶液で１０ｍＶ／ｓで走査して測定した。 置換基による［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）錯体の循環電流電圧法による電位値を比較したグラフである。図８ｂはＥＷＧを有する錯体と比較（１８、１９、２０、２２）したグラフである。濃度に関係なく錯体の電位値を比較するために電流値を１８に合わせて補正し、０．１Ｍ ＴＰＭＰ ｉｎ ＣＨ３ＣＮ溶液で１０ｍＶ／ｓで走査して測定した。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）Ｃｏｍｐｌｅｘ（１９）のＣＶデータを示すグラフである。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）Ｃｏｍｐｌｅｘ（２０）のＣＶデータを示すグラフである。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）Ｃｏｍｐｌｅｘ（２１）のＣＶデータを示すグラフである。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）Ｃｏｍｐｌｅｘ（２２）のＣＶデータを示すグラフである。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）Ｃｏｍｐｌｅｘ（２３）のＣＶデータを示すグラフである。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（２４）のＣＶデータを示すグラフである。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（２５）のＣＶデータを示すグラフである。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（２６）のＣＶデータを示すグラフである。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（２７）のＣＶデータを示すグラフである。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（２８）のＣＶデータを示すグラフである。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（２９）のＣＶデータを示すグラフである。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（３０）のＣＶデータを示すグラフである。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（３１）のＣＶデータを示すグラフである。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（３２）のＣＶデータを示すグラフである。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（３３）のＣＶデータを示すグラフである。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（３４）のＣＶデータを示すグラフである。 ［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（３５）のＣＶデータを示すグラフである。
本発明の一実施形態は、電子伝達メディエータとして有用なテトラデンテート窒素供与体リガンドを含む遷移金属錯体を提供する。
一例として、前記遷移金属錯体は、下記化学式１または２で表される。
［化学式１］
［化学式２］
前記化学式１または化学式２中、
ＭはＦｅ、Ｃｏ、Ｒｕ、Ｏｓ、ＲｈおよびＩｒからなる群より選択される１つであり；
Ｃａ、ＣｂおよびＣｃはそれぞれ独立して、窒素原子を１つ以上含むヘテロ環化合物であり、好ましくは前記環化合物の２位でアミン基とメチレン基に連結されており；
Ｌｍ１およびＬｍ２はそれぞれ独立して、配位されたモノデンテートリガンドであり；
Ｌｂは窒素または酸素を含むバイデンテートリガンドであり；
ｍは－１～－５または１～５を示す負電荷あるいは正電荷であり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、高分子に連結できる反応基が導入されたリンカー、酸化／還元電位を調節するための電子供与基（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｏｎａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ、ＥＤＧ）または電子求引基（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ ｇｒｏｕｐ、ＥＷＧ）の官能基であり；
Ｘは対イオン（ｃｏｕｎｔｅｒ ｉｏｎ）であり、好ましくはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩおよびＰＦ６からなる群より選択される対イオンであり；
ｎは対イオンの数を意味し、１～５である。
一例として、前記遷移金属錯体は、下記化学式３で表されるテトラデンテートリガンドを含むものであり得る。
［化学式３］
上記式中、Ｃａ、ＣｂおよびＣｃはそれぞれ独立して、窒素原子を１つ以上含むヘテロ環化合物であり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、高分子に連結できる反応基が導入されたリンカー、酸化／還元電位を調節するための電子供与基（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｏｎａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ、ＥＤＧ）または電子求引基（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ ｇｒｏｕｐ、ＥＷＧ）の官能基である。
一実施形態で、前記化学式３のテトラデンテートリガンドは、以下の構造を有するリガンドのうちの１つであり得る：
好ましくは、前記ヘテロ環化合物は２位でアミン基とメチレン基に連結され、前記３個のヘテロ環が有する３個の窒素と、前記３個のヘテロ環を互いに連結する中心の１個の窒素が遷移金属Ｍと連結される。
具体的には、前記化学式１～３中のＲ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、－Ｈ；－Ｆ；－Ｃｌ；－Ｂｒ；－Ｉ；－ＮＯ２；－ＣＮ；－ＣＯ２Ｈ；－ＳＯ３Ｈ；－ＮＨＮＨ２；－ＳＨ；－ＯＨ；－ＮＨ２；－ＣＨ２ＯＨ；－ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２；または置換または非置換のアルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカニルアミノ、アリールカルボキサミド、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、アルキルチオ、アルケニル、アリールまたはアルキルであり得る。
具体的には、前記Ｌｍ１およびＬｍ２はモノデンテートリガンドであって、それぞれ独立して－Ｈ、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－ＮＯ２、－ＮＣＣＨ３、－ＣＯ、－ＯＨ２、－ＮＨ３または窒素原子を１つ以上含むヘテロ環化合物であり得る。
具体的には、前記Ｌｂ－Ｌｂはバイデンテートリガンドであり、カテコール、アセチルアセトン、２－ピコリン酸、２－ピリジンカルボキサミド、２，２’－ビピリジンまたは２，２’－ビチアゾールであり得る。
具体的な一様態として、前記ヘテロ環化合物はイミダゾール、ピリジン、ピリミジン、ピラゾール、イソオキサゾール、オキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾオキサゾールおよびジアザフルオレノンからなる群より選択される１種以上であり得る。
具体的な一様態として、前記アルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカニルアミノ、アリールカルボキサミド、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、アルキルチオ、アルケニル、アリール、アルキルおよび３員ヘテロ環が置換される場合、これらは－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－ＯＨ、ｏｘｏ、炭素数１～３のアルキル基および炭素数１～３のアルコキシ基からなる群より選択される１つ以上、好ましくは１～３で置換され得る。
具体的な一様態として、本発明に係る化学式１または２の遷移金属錯体は、下表１に示す遷移金属錯体のうちの１つであり得る：
［表１］
さらに他の様態として、本発明は、前記電子伝達メディエータとして有用な遷移金属錯体の製造方法を提供する。
本発明に係る前記電子伝達メディエータに有用な遷移金属錯体は遷移金属塩、好ましくはオスミウム塩を用いて製造することができる。具体的な一例として、前記遷移金属塩は、下記化学式４のハロゲン化された遷移金属のアンモニウム塩であり、
［化学式４］
［（ＮＨ４）２ＭＸ６］
上記式中、
ＭはＦｅ、Ｃｏ、Ｒｕ、Ｏｓ、ＲｈおよびＩｒからなる群より選択される１つであり；
ＸはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。
好ましくは、前記化学式４のハロゲン化された遷移金属のアンモニウム塩は、化学式５のアンモニウムヘキサクロロオスメートであり、これは商業的に入手可能である。
［化学式５］
［（ＮＨ４）２ＯｓＣｌ６］
一実施形態で、本発明に係る遷移金属錯体の製造方法は、トリス－ピリジンメチルアミン系リガンドとハロゲン化遷移金属のアンモニウム塩を使用して合成することができる。具体的な例として、オスミウムを含む錯体の場合、次の段階を含み得る：
ａ）化学式３で表されるテトラデンテートトリス－ピリジンメチルアミン系リガンドを化学式５のハロゲン化オスミウムのアンモニウム塩に導入して化学式６のオスミウム錯体を合成する段階；および
ｂ）化学式６のオスミウム錯体にＮ－Ｎリガンド、Ｎ－リガンド、Ｎ－ＯリガンドおよびＯ－Ｏリガンドからなる群より選択される１種または２種のモノデンテートリガンドまたはバイデンテートリガンドを導入する段階。
一例として、前記遷移金属錯体は、下記化学式３で表されるテトラデンテートリガンドを含むものであり得る。
［化学式３］
上記式中、Ｃａ、ＣｂおよびＣｃはそれぞれ独立して、窒素原子を１つ以上含むヘテロ環化合物であり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、高分子に連結できる反応基が導入されたリンカーである。
第１段階は、４価イオン状態である化学式５のオスミウム塩に化学式３のトリス－ピリジンメチルアミン系リガンドを導入して、３価イオン状態である化学式６で表されるオスミウム錯体の形態で合成する段階である。
［化学式６］
第２段階は、第１段階で合成されたオスミウム錯体にＮ－Ｎリガンド、Ｎ－リガンド、Ｎ－ＯリガンドおよびＯ－Ｏリガンドからなる群より選択される１種または２種のモノデンテートリガンドまたはバイデンテートリガンドを導入して化学式７～１１のうちのいずれか１つで表されるオスミウム錯体を合成する段階である。好ましくは、第２段階では合成された化学式６のオスミウム錯体に１個のＮ－Ｎリガンド、２個のＮリガンド、１個のＮリガンド、１個のＮ－Ｏリガンド、１個のＯ－Ｏリガンドを導入することができる。
［化学式７］
［化学式８］
［化学式９］
［化学式１０］
［化学式１１］
一例として、前記Ｎリガンドは、－ＮＯ２、－ＮＣＣＨ３、－ＮＨ３または窒素原子を１つ以上含むヘテロ環化合物であり得る。
一例として、前記Ｎ－Ｎリガンドは、２－ピリジンカルボキサミド、２，２’－ビピリジン、２，２’－ビチアゾールまたは２－ピリジルメチルアミンであり得る。
一例として、前記Ｎ－Ｏリガンドは、２－ピコリン酸、２－アミノフェノールまたは２－ヒドロキシメチルピリジンであり得る。
一例として、前記Ｏ－Ｏリガンドは、カテコールまたはアセチルアセトンであり得る。
本発明に係る電子伝達メディエータ遷移金属錯体は、酸化還元酵素が還元（グルコース酸化）されて得られた電子を伝達する役割を果たすもので、ポリビニルピリジン（Ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ）：ＰＶＰ）あるいはポリビニルイミダゾール（Ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）：ＰＶＩ）、ポリアリルグリシジルエーテル（Ｐｏｌｙ ａｌｌｙｌ ｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ：ＰＡＧＥ）からなる群より選択される１種以上などの重合体骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）に相当する高分子マトリックスと連結された酸化－還元重合体の形態で使用することができる。
したがって、本発明の追加一様態は、前記電子伝達メディエータ用遷移金属錯体および重合体骨格を含む酸化－還元重合体に関する。
一例として、前記酸化－還元重合体は、前記重合体骨格と有機系電子伝達メディエータを連結するリンカー構造を含むものであり得る。
また、本発明の追加一様態は、液体性生体試料を酸化還元させ得る酵素と前記遷移金属錯体を含む電子伝達メディエータを含む電気化学的バイオセンサー用センシング膜に関する。
酸化還元酵素は生体の酸化還元反応を触媒する酵素を総称するものであり、本発明では測定しようとする対象物質、例えばバイオセンサーの場合は測定しようとする対象物質と反応して還元される酵素を意味する。このように還元された酵素は電子伝達メディエータと反応し、この時発生した電流変化などの信号を測定して対象物質を定量する。本発明に使用可能な酸化還元酵素は、各種脱水素酵素（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、酸化酵素（ｏｘｉｄａｓｅ）、エステル化酵素（ｅｓｔｅｒａｓｅ）などからなる群より選択される１種以上のものであり、酸化還元または検出対象物質によって、前記酵素群に属する酵素の中で前記対象物質を基質とする酵素を選択して使用することができる。
より具体的には、前記酸化還元酵素は、グルコース脱水素酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、グルタミン酸脱水素酵素（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、グルコース酸化酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ）、コレステロール酸化酵素（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ）、コレステロールエステル化酵素（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ）、乳酸酸化酵素（ｌａｃｔａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ）、アスコルビン酸酸化酵素（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ）、アルコール酸化酵素（ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ）、アルコール脱水素酵素（ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ビリルビン酸化酵素（ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ｏｘｉｄａｓｅ）などからなる群より選択される１種以上であり得る。
一方、前記酸化還元酵素は測定しようとする対象物質（例えば、対象物質）から酸化還元酵素が奪い取った水素を保管する役割をする補助因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）を共に含み得るが、例えば、フラビンアデニンジヌクレオチド（ｆｌａｖｉｎ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＮＡＤ）、ピロロキノリンキノン（Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ｑｕｉｎｏｎｅ、ＰＱＱ）などからなる群より選択される１種以上であり得る。
例えば、血中のグルコース濃度を測定しようとする場合、前記酸化還元酵素としてグルコース脱水素酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＧＤＨ）を使用することができ、前記グルコース脱水素酵素は補助因子としてＦＡＤを含むフラビンアデニンジヌクレオチド－グルコース脱水素酵素（ｆｌａｖｉｎ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＦＡＤ－ＧＤＨ）、および／または補助因子としてＦＡＤ－ＧＤＨを含むニコチンアミドアデニンジヌクレオチド－グルコース脱水素酵素（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）であり得る。
具体例には、前記使用可能な酸化還元酵素はＦＡＤ－ＧＤＨ（例えば、ＥＣ １．１．９９．１０など）、ＮＡＤ－ＧＤＨ（例えば、ＥＣ １．１．１．４７など）、ＰＱＱ－ＧＤＨ（例えば、ＥＣ１．１．５．２など）、グルタミン酸脱水素酵素（例えば、ＥＣ １．４．１．２など）、グルコース酸化酵素（例えば、ＥＣ １．１．３．４など）、コレステロール酸化酵素（例えば、ＥＣ １．１．３．６など）、コレステロールエステル化酵素（例えば、ＥＣ ３．１．１．１３など）、乳酸酸化酵素（例えば、ＥＣ １．１．３．２など）、アスコルビン酸酸化酵素（例えば、ＥＣ １．１０．３．３など）、アルコール酸化酵素（例えば、ＥＣ １．１．３．１３など）、アルコール脱水素酵素（例えば、ＥＣ １．１．１．１など）、ビリルビン酸化酵素（例えば、ＥＣ １．３．３．５など）などからなる群より選択される１種以上であり得る。
最も好ましくは、前記酸化還元酵素は３７℃の緩衝液で１週間７０％以上の活性度を維持できるグルコース脱水素酵素である。
本発明に係るセンシング膜は、酸化還元酵素１００重量部を基準として酸化－還元重合体２０～７００重量部、例えば、６０～７００重量部または３０～３４０重量部を含有することができる。前記酸化－還元重合体の含有量は、酸化還元酵素の活性度に応じて適宜調節することができる。
さらに、本発明に係るセンシング膜は膜性能を高めるためにカーボンナノチューブをさらに含むことができる。具体的には、カーボンナノチューブは遷移金属錯体、特にオスミウムと共に使用時に電子伝達速度が増加してセンシング膜の性能をより高めることができる。
また、本発明に係るセンシング膜は、架橋剤をさらに含むことができる。
一方、本発明に係るセンシング膜は界面活性剤、水溶性高分子、第４級アンモニウム塩、脂肪酸、粘増剤などからなる群より選択される１種以上の添加剤を試薬溶解時の分散剤、試薬製造時の粘着剤、長期保管の安定剤などの役割のためにさらに含むことができる。
前記界面活性剤は、組成物を分注する時組成物が電極上でまんべんなく広がって均一な厚さで分注されるようにする役割を果たすものであり得る。前記界面活性剤としてはトリトンＸ－１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）、パーフルオロオクタンスルホネート（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｏｃｔａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ステアリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｔｅａｒａｔｅ）などからなる群より選択される１種以上を使用することができる。本発明に係る試薬組成物は、試薬を分注する時試薬が電極上でまんべんなく広がって試薬が均一な厚さで分注されるようにする役割を適切に果たすために、前記界面活性剤を酸化還元酵素１００重量部を基準として３～２５重量部、例えば、１０～２５重量部の量で含有することができる。例えば、活性度が７００Ｕ／ｍｇである酸化還元酵素を使用する場合、酸化還元酵素１００重量部を基準として界面活性剤１０～２５重量部を含有することができ、酸化還元酵素の活性度がこれより高くなると、界面活性剤の含有量をこれより低く調節することができる。
前記水溶性高分子は、試薬組成物の高分子支持体として酵素の安定化および分散（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ）を助ける役割を果たすものであり得る。前記水溶性高分子としては、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ；ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ；ＰＶＡ）、ポリフルオロスルホネート（ｐｏｌｙｐｅｒｆｌｕｏｒｏ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ヒドロキシエチルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙ ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＣＭＣ）、セルロースアセテート（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｃｅｔａｔｅ）、ポリアミド（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ）などからなる群より選択される１種以上を使用することができる。本発明に係る試薬組成物は、酸化還元酵素の安定化および分散（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ）を助ける役割を十分かつ適切に発揮するために、前記水溶性高分子を酸化還元酵素１００重量部を基準として１０～７０重量部、例えば、３０～７０重量部の量で含有することができる。例えば、活性度が７００Ｕ／ｍｇである酸化還元酵素を使用する場合、酸化還元酵素１００重量部を基準として水溶性高分子３０～７０重量部を含有することができ、酸化還元酵素の活性度がこれより高くなると、水溶性高分子の含有量をこれより低く調節することができる。
前記水溶性高分子は、支持体および酵素の安定化および分散（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ）を助ける役割を効果的に果たすために重量平均分子量が２，５００ｇ／ｍｏｌ～３，０００，０００ｇ／ｍｏｌ程度、例えば、５，０００ｇ／ｍｏｌ～１，０００，０００ｇ／ｍｏｌ程度であり得る。
前記粘増剤は、試薬を電極に堅固に付着する役割を果たす。前記粘増剤としてはナトロゾール、ジエチルアミノエチル－デキストランヒドロクロリド（ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）などからなる群より選択される１種以上を使用することができる。本発明に係る電気化学的センサーは、本発明に係る酸化－還元重合体が電極に堅固に付着するために、前記粘増剤を酸化還元酵素１００重量部を基準として１０～９０重量部、例えば、３０～９０重量部の量で含有することができる。例えば、活性度が７００Ｕ／ｍｇである酸化還元酵素を使用する場合、酸化還元酵素１００重量部を基準として粘増剤３０～９０重量部を含有することができ、酸化還元酵素の活性度がこれより高くなると、粘増剤の含有量をこれより低く調節することができる。
さらに他の様態として、本発明は、このような有機電子伝達メディエータを含む装置、好ましくは、挿入可能な装置、より具体的には人体内に挿入可能な装置であり得る。また好ましくは、前記装置は電気化学的バイオセンサーであり得、より好ましくは電気化学的グルコース（血糖）センサーであり得る。
具体的には、前記電気化学的バイオセンサーの種類には制限がないが、好ましくは、持続血糖モニタリングセンサーであり得る。
このような持続血糖モニタリングセンサーの構成として、本発明は、例えば電極、絶縁体（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）、基板、前記酸化－還元重合体および酸化還元酵素を含むセンシング膜（ｓｅｎｓｉｎｇ ｌａｙｅｒ）、拡散膜（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｌａｙｅｒ）、保護膜（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｌａｙｅｒ）などを含むことができる。電極の場合、作動電極および対向電極などの２種の電極を含むこともでき、作動電極、対向電極および基準電極などの３種の電極を含むこともできる。一実施形態で、本発明に係るバイオセンサーは、少なくとも二つ、好ましくは二つまたは３つの電極を備えた基板に、前記化学式１の有機系電子伝達メディエータを含む酸化－還元重合体と液体性生体試料を酸化還元させ得る酵素を含む試薬組成物を塗布した後、乾燥して製作した電気化学的バイオセンサーであり得る。例えば、電気化学的バイオセンサーにおいて作動電極および対向電極が基板の互いに反対面に備えられ、前記作動電極の上に本発明に係る有機系電子伝達メディエータを有する酸化－還元重合体が含まれるセンシング膜が積層され、作動電極および対向電極が備えられた基板の両側面に順に絶縁体、拡散膜および保護膜が積層されることを特徴とする平面形電気化学的バイオセンサーが提供される。
具体的な様態として、前記基板はＰＥＴ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）、ＰＣ（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）およびＰＩ（ｐｏｌｙｉｍｉｄｅ）からなる群より選択される１種以上の素材からなるものであり得る。
また、作動電極は炭素、金、白金、銀または銀／塩化銀電極を使用することができる。
また、２電極を有する電気化学的バイオセンサーの場合、対向電極が基準電極の役割までともに果たすので、対向電極として金、白金、銀または銀／塩化銀電極を使用することができ、基準電極まで含む３電極の電気化学的バイオセンサーの場合、基準電極として金、白金、銀または銀／塩化銀電極を使用することができ、対向電極として炭素電極を使用することができる。
拡散膜としてはＮａｆｉｏｎ、セルロースアセテート（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｃｅｔａｔｅ）、シリコーンゴム（ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｒｕｂｂｅｒ）を使用することができ、保護膜としてはシリコーンゴム（ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｒｕｂｂｅｒ）、ポリウレタン（ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ）、ポリウレタン（ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ）系の共重合体などを使用できるが、これに制限されるものではない。
非制限的な例として、２電極である場合、対向電極が基準電極の役割までともに果たすので塩化銀または銀を使用することができ、３電極の場合、基準電極が塩化銀または銀が使用され、対向電極は炭素電極を使用することができる。
本発明の実施形態は電気化学的バイオセンサーの適用可能な例としてグルコースを測定するためのバイオセンサーを例示しているが、本発明の試薬組成物に含まれる酵素の種類を異にすることによってコレステロール、ラクテート、クレアチニン、過酸化水素、アルコール、アミノ酸、グルタメートなどの多様な物質の定量のためのバイオセンサーに適用することができる。
以下、本発明を下記の実施例によってより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明を例示するだけであり、本発明の内容は下記の実施例によって限定されるものではない。
実験材料
商業的に購入した溶媒と試薬はそれ以上の精製過程を経ずに使用した。金属錯体の精製のためのアルミナの場合、Ａｌｄｒｉｃｈ社製の中性アルミナを１０ｍＬのピペットを用いてろ過した。錯体のクロライド双性イオン交換のための樹脂の場合、Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＤｏｗｅｘ １×４ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｆｏｒｍ、５０－１００ｍｅｓｈを使用した。
１Ｈ－ＮＭＲおよび１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ ４００（１Ｈに対して４００ＭＨｚ、１３Ｃに対して１００ＭＨｚ）を用いて得た。すべての化学的移動はテトラメチルシランのピーク（δ０．００）または重水素化クロロホルム（１Ｈ ＮＭＲでＣＤＣｌ３に対してδ７．２６、１３Ｃ ＮＭＲでＣＤＣｌ３に対してδ７７．１６）、重水素化ジメチルアセトアミド（１Ｈ ＮＭＲでＤＭＳＯに対してδ２．５０、１３Ｃ ＮＭＲでＤＭＳＯに対してδ３９．５２）に比例して決定した。質量スペクトルは西江大学校の有機化学研究センターでＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＬＴＱ ＸＬモデルの低分解能の場合ＥＳＩ－Ｉｏｎｔｒａｐ、高分解能の場合ＥＳＩ－ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析装置を用いて得た。
実施例１．ＴＰＭＡリガンドの合成
多様な官能基を有するＴＰＭＡリガンドを図１に示す合成経路により合成した。ビス－２－ピリジルメチルアミン（１）とトリス－２－ピリジルメチルアミン（１０）は２－ピリジルアルデヒドと２－ピリジルメチルアミンとの間のｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ａｍｉｎａｔｉｏｎにより合成した。他のリガンド（１１、１２、１５、１６）は文献に知られている方法（Ｋｏｊｉｍａ、Ｔ．；Ｆｕｋｕｚｕｍｉ，Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２００７，１３，８２１２－８２２２）を若干変形して合成した。４位で多様な官能基を有する２－クロロメチルピリジンヒドロクロリドをビス－２－ピリジルメチルアミン（１）と１：１の比率でＳｎ２反応または２－ピリジルメチルアミンと１：２の比率でＳｎ２反応して合成した。また、１３番はエステルを還元して合成し、１４番は過剰のエチレンジアミンとａｍｉｎｏｌｙｓｉｓ反応を経て合成した。合成した大部分のＴＰＭＡリガンドは３つのピリジン環を持つため、強い塩基性を帯びてシリカを利用したカラムクロマトグラフィーによっては精製できず、塩基性または中性アルミナを利用したカラムクロマトグラフィーにより精製した。
１－１．Ｂｉｓ（２－ｐｙｒｉｄｉｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｅ（１）
丸底フラスコに２－ピリジルアルデヒド（３．０ｇ、２７ｍｍｏｌ）と２－アミノメチルピリジン（３．０ｇ、２７ｍｍｏｌ）を入れてメタノール（２５ｍＬ）を入れた。常温で３時間攪拌し、ＮａＢＨ４（３．１ｇ、８１ｍｍｏｌ）を０℃でゆっくり入れた。添加が終わると常温で４時間攪拌した。反応が完全に行われたことを確認したら１０％塩酸水溶液を入れて反応を終結させた。回転蒸発乾燥装置を用いて溶液を濃縮させ、ＮａＣＯ３飽和水溶液を添加してｐＨを９まで合わせた。分別漏斗に移した後、水層をＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。その後、集めた有機層に無水ＭｇＳＯ４を入れて水を除去し、減圧下でガラスフィルターを用いて乾燥剤をろ過した。回転蒸発乾燥装置を用いて有機溶媒を除去した。これにより黄色オイル形態の生成物１を得た。（５．４ｇ、９８％）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．５７（ｄ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．６５（ｄｄ、Ｊ＝７．２、４．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．３７（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．１７（ｄ、Ｊ＝５．２、７．２Ｈｚ、２Ｈ）、３．９９（ｓ、４Ｈ）
１－２．２，４－Ｄｉｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ（２）
丸底フラスコに２，４－ピリジンジカルボン酸（５ｇ、３０ｍｍｏｌ）を入れてエタノール（２５０ｍＬ）を入れて溶かした。反応フラスコに濃硫酸（３．２８ｍＬ）を入れた後、還流管を設置し、２４時間８０℃で還流しながら攪拌した。反応フラスコを常温まで冷却した後、回転蒸発乾燥装置を用いてエタノールを除去した。ＮａＣＯ３飽和水溶液を添加し、分別漏斗に移した後、水層をＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。その後、集めた有機層に無水ＭｇＳＯ４を入れて水を除去し、減圧下でガラスフィルターを用いて乾燥剤をろ過した。回転蒸発乾燥装置を用いて有機溶媒を除去した。これにより白色固体生成物２を得た。（６．５ｇ、９７％）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．９２（ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．６５（ｓ、１Ｈ）、８．０４（ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．５２（ｑ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、４．４６（ｑ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．４８（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、３Ｈ）、１．４３（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、３Ｈ）
１－３．４－Ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ（３）
丸底フラスコに開始物質（２）（６．０ｇ、２７ｍｍｏｌ）とＮａＢＨ４（０．６６４ｇ、３５ｍｍｏｌ）を入れてエタノール（５０ｍＬ）を入れて溶かした。反応フラスコにＣａＣｌ２（３．０ｇ、２７ｍｍｏｌ）をエタノールに溶かして０℃でゆっくり入れた。添加が終わると０℃で２時間３０分間攪拌した。反応が完全に行われたことを確認したら濃硫酸を入れて反応を終結させた。ガラスフィルターを用いて白い沈殿物をろ過し、回転蒸発乾燥装置を用いて溶液を濃縮した。ＮａＣＯ３飽和水溶液を添加し、分別漏斗に移した後、水層をＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。その後、集めた有機層に無水ＭｇＳＯ４を入れて水を除去し、減圧下でガラスフィルターを用いて乾燥剤をろ過した。回転蒸発乾燥装置を用いて有機溶媒を除去した。これにより淡い黄色固体生成物３を得た。（３．１ｇ、６４％）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．９６（ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．４２（ｓ、１Ｈ）、８．３４（ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．２２（ｓ、２Ｈ）、４．５３（ｑ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、１．４７（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）
１－４．４－Ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ－２－ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（４）
丸底フラスコに開始物質（３）（２．９ｇ、１６ｍｍｏｌ）を入れてＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）を入れて溶かした。反応フラスコに塩化チオニル（９．５ｇ、８０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）に希釈した後、ゆっくり入れた。添加が終わると常温で一晩攪拌した。反応が完全に行われたことを確認したら回転蒸発乾燥装置を用いて溶媒を除去した。これにより白色固体生成物４を得た。（３．６１６ｇ、９０％）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．８２（ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．５５（ｓ、１Ｈ）、８．３５（ｄ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．２４（ｓ、２Ｈ）、４．５４（ｑ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．４８（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）
１－５．４－Ｍｅｔｈｏｘｙ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ（５）
丸底フラスコに４－メトキシピリジン－２－カルボキシレート（４．９５ｇ、２９ｍｍｏｌ）とＮａＢＨ４（１．４５ｇ、４４ｍｍｏｌ）を入れてエタノール（４０ｍＬ）を入れて溶かした。反応フラスコにＣａＣｌ２（３．２８ｇ、２９ｍｍｏｌ）をエタノールに溶かして０℃でゆっくり入れた。添加が終わると－５℃で２時間３０分間攪拌した。反応が完全に行われたことを確認したら濃硫酸を入れて反応を終結させた。ガラスフィルターを用いて白い沈殿物をろ過し、回転蒸発乾燥装置を用いて溶液を濃縮した。ＮａＣＯ３飽和水溶液を添加し、分別漏斗に移した後、水層をＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。その後、集めた有機層に無水ＭｇＳＯ４を入れて水を除去し、減圧下でガラスフィルターを用いて乾燥剤をろ過した。回転蒸発乾燥装置を用いて有機溶媒を除去した。これにより白色固体生成物５を得た。（２．１４ｇ、５３％）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．３７（ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．７８（ｓ、１Ｈ）、６．７４（ｄ、Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．７１（ｓ、２Ｈ）、３．８６（ｓ、３Ｈ）
１－６．４－Ｍｅｔｈｏｘｙ－２－ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（６）
丸底フラスコに開始物質（５）（１．６０ｇ、１１ｍｍｏｌ）を入れてＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）を入れて溶かした。反応フラスコに塩化チオニル（６．８３ｇ、５７ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に希釈した後、ゆっくり入れた。添加が終わると常温で一晩攪拌した。反応が完全に行われたことを確認したら回転蒸発乾燥装置を用いて溶媒を除去した。これにより白色固体生成物６を得た。（２．１１ｇ、９５％）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＮ）δ８．４２（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．４３（ｓ、１Ｈ）、７．３１（ｄ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．９８（ｓ、２Ｈ）、４．０６（ｓ、３Ｈ）
１－７．２－（Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）－４－ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ（７）
丸底フラスコに開始物質（３）（１．６０ｇ、１１ｍｍｏｌ）を入れてエタノール（１０ｍＬ）を入れて溶かした。反応フラスコに３０％アンモニア水（３０ｍＬ）をゆっくり入れた。添加が終わると常温で２４時間攪拌した。反応が完全に行われたことを確認したら回転蒸発乾燥装置を用いて溶媒を除去した。その後、追加の精製過程なしに次の反応に使用した。これにより白色固体生成物７を得た。（０．７８ｇ、９０％）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ８．６０（ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．４２（ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、１Ｈ、ＮＨ１）、７．８９（ｓ、１Ｈ）、７．６３（ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．５３（ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、１Ｈ、ＮＨ２）、４．６１（ｓ、２Ｈ）
１－８．４－Ｃｙａｎｏ－２－ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ（８）
丸底フラスコに開始物質（７）（９４ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を入れて蒸留して精製したＤＭＦ（３ｍＬ）を入れて溶かした。反応フラスコに塩化チオニル（３２５ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６ｍＬ）に希釈した後、０℃でゆっくり入れた。添加が終わると常温で１２時間攪拌した。ＮａＣＯ３飽和水溶液を添加して中和して反応を終結した。フラスコの生成物を分別漏斗に移した後、水層を酢酸エチルで３回抽出した。その後、有機層をＤＭＦが全て除去されるまで水で洗浄した。集めた有機層に無水ＭｇＳＯ４を入れて水を除去し、減圧下でガラスフィルターを用いて乾燥剤をろ過した。回転蒸発乾燥装置を用いて有機溶媒を除去した。反応が完全に行われたことを確認したら回転蒸発乾燥装置を用いて溶媒を除去した。これにより茶色オイル形態の生成物８を得た。（６９５ｍｇ、７０％）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．７６（ｄ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．７６（ｓ、１Ｈ）、７．５０（ｄ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｓ、２Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１５８．２８、１５０．３２、１２４．４６、１２４．２９、１２１．４７、１１６．１２および４５．６３
１－９．２－ｔｈｉａｚｏｙｌｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（９）
丸底フラスコにＮＨ２ＯＨ・ＨＣｌ（２．３ｇ、３０ｍｍｏｌ）、２－チアゾールカルボキシアルデヒド（２．５ｇ、２０ｍｍｏｌ）、ＮａＯＨ（２．６ｇ、６０ｍｍｏｌ）を入れてエタノール（２０ｍＬ）と蒸留水（４ｍＬ）を入れて溶かした。反応フラスコに還流管を設置し、３０分間８０℃で攪拌しながら還流した。常温まで冷却した後、２Ｎ塩酸を添加してｐＨ４になるまで酸性化した。フラスコの生成物を分別漏斗に移した後、水層をＥｔ２Ｏで２回抽出した。その後、集めた有機層に無水ＭｇＳＯ４を入れて水を除去し、減圧下でガラスフィルターを用いて乾燥剤をろ過した。回転蒸発乾燥装置を用いて有機溶媒を除去した。これにより白色固体の中間生成物を得た。この中間生成物にエタノール（３０ｍＬ）と３０％アンモニア水（６０ｍＬ）を入れて溶かした。Ｚｉｎｃ ｄｕｓｔ（１０．１ｇ、２００ｍｍｏｌ）と酢酸アンモニウム（１．３ｇ、２０ｍｍｏｌ）を順次入れて還流管を設置し、３０分間８０℃で攪拌しながら還流した。常温まで冷却した後、ガラスフィルターを用いてろ過した。ろ過した溶液を水を添加して希釈し、分別漏斗に移した後、ＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。その後、集めた有機層に無水ＭｇＳＯ４を入れて水を除去し、減圧下でガラスフィルターを用いて乾燥剤をろ過した。回転蒸発乾燥装置を用いて有機溶媒を除去した。これにより黄色オイル形態の生成物９を得た。（０．８ｇ、３５％）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ７．６８（ｄ、Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．５５（ｄ、Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．９８（ｓ、２Ｈ）、２．３２（ｂｒ、２Ｈ）
１－１０．Ｔｒｉｓ（２－ｐｙｒｉｄｉｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｅ（１０）
丸底フラスコに開始物質（１）（１．０５ｇ、５．３ｍｍｏｌ）と２－ピリジルアルデヒド（０．６３ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を入れてメタノール（１５ｍＬ）を入れた。常温で２時間攪拌し、ＮａＢＨ４（０．６１ｇ、１６ｍｍｏｌ）を０℃でゆっくり入れた。添加が終わると常温で１２時間攪拌した。反応が完全に行われたことを確認したら１０％塩酸水溶液を入れて反応を終結させた。回転蒸発乾燥装置を用いて溶液を濃縮させ、ＮａＣＯ３飽和水溶液を添加してｐＨを９まで合わせた。分別漏斗に移した後、水層をＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。その後、集めた有機層に無水ＭｇＳＯ４を入れて水を除去し、減圧下でガラスフィルターを用いて乾燥剤をろ過した。回転蒸発乾燥装置を用いて有機溶媒を除去した。その後、Ｅｔ２Ｏで再結晶によって精製して無色結晶の生成物１０を得た。（１．２ｇ、７８％）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．５３（ｄ、Ｊ＝４．４Ｈｚ、３Ｈ）、７．６５（ｄｄ、Ｊ＝５．０、７．６Ｈｚ、３Ｈ）、７．５８（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、３Ｈ）、７．１５（ｄｄ、Ｊ＝５．６、７．２Ｈｚ、３Ｈ）、３．８８（ｓ、６Ｈ）
１－１１．２－（Ｂｉｓ（４，４’－ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ－２，２’－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ（１１）
丸底フラスコに開始物質（４）（１．０ｇ、４．２５ｍｍｏｌ）、２－ピリジルメチルアミン（０．２１ｇ、１．９３ｍｍｏｌ）、Ｎａ２ＣＯ３（４．５ｇ、４２．５ｍｍｏｌ）とａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（２０ｍＬ）を入れた。反応フラスコに還流帯を設置し、８０℃で１２時間攪拌しながら還流した。反応が終わると常温まで冷却した後、ガラスフィルターを用いて過剰のＮａ２ＣＯ３を除去した。回転蒸発乾燥装置を用いて溶液を濃縮させ、濃い赤色オイル形態の混合物をｈｅｘａｎｅ：ＥｔＯＡｃ＝２：５の組成を有する展開液を使用して塩基性アルミナを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して赤色オイル形態の生成物１１を得た。（０．５５ｇ、６５％）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．６８（ｄ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、２Ｈ）、８．５４（ｄ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．１０（ｓ、２Ｈ）、７．７０（ｄ、２Ｈ）、７．６９（ｄｄ、１Ｈ）、７．６０（ｄ、Ｊ＝３．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．１６（ｄｄ、Ｊ＝６．０、７．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．４２（ｑ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、４Ｈ）、３．９９（ｓ、２Ｈ）、３．９３（ｓ、４Ｈ）、１．４２（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、６Ｈ）
１－１２．２－（Ｂｉｓ（２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌ－４－ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ（１２）
丸底フラスコに開始物質（１）（０．３５ｇ、１．７７ｍｍｏｌ）、開始物質（４）（０．５ｇ、１．９４ｍｍｏｌ）、Ｎａ２ＣＯ３（２．２ｇ、１９．４ｍｍｏｌ）とａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（１５ｍＬ）を入れた。反応フラスコに還流帯を設置し、８０℃で１２時間攪拌しながら還流した。反応が終わると常温まで冷却した後、ガラスフィルターを用いて過剰のＮａ２ＣＯ３を除去した。回転蒸発乾燥装置を用いて溶液を濃縮させ、濃い赤色オイル形態の混合物をａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅを展開液として使用して塩基性アルミナを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して濃い樺色オイル形態の生成物１２を得た。（０．５３ｇ、８２％）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．６８（ｄ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．５４（ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、２Ｈ）、８．１２（ｓ、１Ｈ）、７．６９（ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．６５（ｄｄ、２Ｈ）、７．６０（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．１５（ｄｄ、Ｊ＝６．０、７．２Ｈｚ、２Ｈ）、４．４２（ｑ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．９６（ｓ、２Ｈ）、３．８９（ｓ、４Ｈ）、１．４２（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）
１－１３．２－（Ｂｉｓ（２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ（１３）
丸底フラスコに開始物質（１２）（１００ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を入れてエタノール（１０ｍＬ）を入れて溶かした。ＮａＢＨ４（２１ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）を０℃でゆっくり入れ、全て添加したら常温で１２時間攪拌した。１２時間後に飽和アンモニウムクロリド水溶液を入れて反応を終結させた。ガラスフィルターを用いて白い沈殿物をろ過し、回転蒸発乾燥装置を用いて溶液を濃縮した。ＮａＣＯ３飽和水溶液を添加し、分別漏斗に移した後、水層をＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。その後、集めた有機層に無水ＭｇＳＯ４を入れて水を除去し、減圧下でガラスフィルターを用いて乾燥剤をろ過した。回転蒸発乾燥装置を用いて有機溶媒を除去した。これにより淡い黄色オイル形態の生成物１３を得た。（４０ｍｇ、４５％）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．５１（ｄ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、２Ｈ）、８．４７（ｄ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．６４（ｄｄ、Ｊ＝３．６、４．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．５９（ｄ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．５５（ｓ、１Ｈ）、７．１６（ｄ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．１３（ｄｄ、Ｊ＝３．２、３．２Ｈｚ、２Ｈ）、４．７３（ｓ、２Ｈ）、３．８８（ｓ、２Ｈ）、３．８６（ｓ、４Ｈ）
１－１４．２－（Ｂｉｓ（２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌ－４－（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ（１４）
丸底フラスコに開始物質（１２）（１．３５ｇ、３．７ｍｍｏｌ）を最小量のＣＨ２Ｃｌ２に溶かして精製されたエチレンジアミン（２２．５ｇ、３７０ｍｍｏｌ）にゆっくり加えた。反応フラスコに還流帯を設置し、８０℃で１６時間攪拌した。反応が終わると常温まで冷却した後、水３０ｍＬを注いだ。フラスコの生成物を分別漏斗に移した後、水層をＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。その後、集めた有機層に無水ＭｇＳＯ４を入れて水を除去し、減圧下でガラスフィルターを用いて乾燥剤をろ過した。回転蒸発乾燥装置を用いて有機溶媒を除去した。これにより淡い黄色オイル形態の生成物１４を得た。（１．２０ｇ、８６％）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．６２（ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．５４（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、８．２３（ｓ、１Ｈ）、７．６４（ｄｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．５５（ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．４９（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．４３（ｂｒ、１Ｈ）、７．１５（ｄｄ、Ｊ＝６．０、６．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．９３（ｓ、２Ｈ）、３．８７（ｓ、４Ｈ）、３．５５（ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．９８（ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）
１－１５．２－（ｂｉｓ（４，４’－ｍｅｔｈｏｘｙ－２，２’－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ（１５）
丸底フラスコに開始物質（６）（１．０ｇ、５．１８ｍｍｏｌ）、２－ピリジルメチルアミン（０．２８ｇ、２．５９ｍｍｏｌ）、Ｎａ２ＣＯ３（２．７ｇ、２５．９ｍｍｏｌ）とａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（２０ｍＬ）を入れた。反応フラスコに還流帯を設置し、８０℃で１２時間攪拌しながら還流した。反応が終わると常温まで冷却した後、ガラスフィルターを用いて過剰のＮａ２ＣＯ３を除去した。回転蒸発乾燥装置を用いて溶液を濃縮させ、濃い赤色オイル形態の混合物をａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅを展開液として使用して中性アルミナを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して樺色オイル形態の生成物１５を得た。（０．５４ｇ、６０％）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．５５（ｄ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．３４（ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．６４（ｄｄ、Ｊ＝４．８、４．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．５８（ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．２１（ｓ、２Ｈ）、７．１５（ｄｄ、Ｊ＝５．２、４．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．６８（ｄ、Ｊ＝３．２Ｈｚ、２Ｈ）、３．９０（ｓ、２Ｈ）、３．８５（ｓ、４Ｈ）３．８４（ｓ、６Ｈ）
１－１６．２－（ｂｉｓ（４，４’－ｃｙａｎｏ－２，２’－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ（１６）
丸底フラスコに開始物質（８）（５４ｍｇ、０．３４５ｍｍｏｌ）、２－ピリジルメチルアミン（１７ｍｇ、０．１５７ｍｍｏｌ）、Ｎａ２ＣＯ３（１６６ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）とａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（１０ｍＬ）を入れた。反応フラスコに還流帯を設置し、８０℃で１２時間攪拌しながら還流した。反応が終わると常温まで冷却した後、ガラスフィルターを用いて過剰のＮａ２ＣＯ３を除去した。回転蒸発乾燥装置を用いて溶液を濃縮させ、濃い赤色オイル形態の混合物をａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅを展開液として使用して中性アルミナを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して黄色オイル形態の生成物１６を得た。（３６ｍｇ、６８％）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．７３（ｄ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、２Ｈ）、８．５８（ｄ、Ｊ＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．８０（ｓ、２Ｈ）、７．７０（ｄｄ、Ｊ＝６．８、５．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．４６（ｄ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．４１（ｄ、Ｊ＝４．４Ｈｚ、２Ｈ）、７．２０（ｄｄ、Ｊ＝７．２、４．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．９９（ｓ、４Ｈ）、３．９１（ｓ、２Ｈ）
１－１７．２－（ｂｉｓ（４，４’－ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ－２，２’－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅ（１７）
丸底フラスコに開始物質（４）（０．４５ｇ、１．９２９ｍｍｏｌ）、開始物質（９）（０．１ｇ、０．８７７ｍｍｏｌ）、Ｎａ２ＣＯ３（２．０４ｇ、１９．３ｍｍｏｌ）とａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（１５ｍＬ）を入れた。反応フラスコに還流帯を設置し、８０℃で３６時間攪拌しながら還流した。反応が終わると常温まで冷却した後、ガラスフィルターを用いて過剰のＮａ２ＣＯ３を除去した。回転蒸発乾燥装置を用いて溶液を濃縮させ、樺色オイル形態の混合物をａｃｅｔｏｎｅを展開液として使用して中性アルミナを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して黄色オイル形態の生成物１７を得た。（０．２２ｇ、５７％）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．６９（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、８．１８（ｓ、２Ｈ）、７．７３（ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．７２（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．３１（ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、２Ｈ）、４．４３（ｑ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、４Ｈ）、４．１６（ｓ、２Ｈ）、４．０４（ｓ、４Ｈ）、１．４３（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、６Ｈ）
実施例２．ＴＰＭＡ系のオスミウム錯体の合成
実施例１（１－１～１－１７）から合成したリガンドから［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）錯体と該誘導体を合成した。合成した錯体は全てヘキサクロロオスミウム酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｏｓｍａｔｅ）から合成することができる。この時、４価イオン状態であるオスミウム塩を３価イオン状態であるオスミウム錯体形態に還元される段階で、反応後、ヘキサフルオロリン酸アンモニウム（ＮＨ４ＰＦ６）水溶液に沈殿を得て、初期に全てＰＦ６を双性イオンとして有する錯体の形態で得た。このような合成反応ｓｃｈｅｍｅを図２に示す。
［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）錯体は全て常磁性体（ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ）特徴を有するため、１Ｈ－ＮＭＲにより観察できなかった。これは常磁性体物質が有する不対電子が核スピンと相互作用しながら弛緩時間（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）を短くするためである。したがって、生成されたオスミウム錯体はＥＳＩ－ＭＳにより合成結果と物質の酸化状態を決定した。そして、［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）（１８）錯体は単結晶Ｘ－ｒａｙ回折分析（Ｓｉｎｇｌｅ ｃｒｙｓｔａｌ Ｘ－ｒａｙ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ）により結晶構造を確認することができ、これを図３に示す。
追加的な段階で合成した［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）系錯体と多様な単座リガンド（モノデンテートリガンド）または二座リガンド（バイデンテートリガンド）を反応させ、様々な種類のＴＰＭＡ系のオスミウム錯体を合成した。１－メチルイミダゾール、ピリジンなどの単座リガンドと４－メトキシ－２－ピリジルカルボキサミド、ピコリン酸、カテコール、アセチルアセトンなどの二座リガンドは［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）と反応して塩素（Ｃｌ）リガンドと交換反応を経て［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］＋（ＰＦ６ －）系錯体を合成することができた。このような合成反応ｓｃｈｅｍｅを図４に示す。
合成した［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ系錯体は［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）錯体と同様に全て常磁性体（ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ）特徴を有するため、１Ｈ－ＮＭＲにより観察できず、ＥＳＩ－ＭＳにより合成結果と物質の酸化状態を決定した。［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ系錯体のうち、カテコール、アセチルアセトン、ピコリン酸などの酸素が配位する化合物（２７～３３）の場合、反応時トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、ＴＥＡ）またはナトリウムヒドロキシド（ＮａＯＨ）などの塩基を添加して反応を行った。
合成したＴＰＭＡ系の錯体のうち、２１、３１、３２のようにＴＰＭＡリガンドにヒドロキシメチル（－ＣＨ２ＯＨ）基がある錯体の場合にはＥＳＩ－ＭＳで特徴的にヒドロキシ（－ＯＨ）基が除去された質量シグナルを確認した。これは反応性の高いピリジルメチル（－ＰｙＣＨ２）基が容易にイオンされ安定性を有するため、ヒドロキシ基が脱離した質量シグナルが観測されると判断される（図５）。
単座リガンドである１－メチルイミダゾールを［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）と反応させた２６、３４、３５の錯体の場合、２～１０当量の１－メチルイミダゾールとエチレングリコール溶媒下で１３０～１８０℃、３～１２ｈの条件で反応させると高い収率で得ることができた。しかし、１－メチルイミダゾールが単座配位した［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（ｉｍｉ）Ｃｌ］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ錯体の場合には１当量の１－メチルイミダゾールのみを反応させると反応が全く行われず、２当量を添加すると２つのイミダゾールリガンドが配位するなど、これを選択的に得ることができなかった。
合成した全てのＴＰＭＡ系のオスミウム錯体は、初期に全てＰＦ６ －双性イオン形態で得られ、Ｃｌ－イオン交換樹脂を用いて［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（Ｃｌ－）または［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（Ｃｌ－）ｎ形態の錯体を得ることができた。ほとんどのＴＰＭＡ系のオスミウム錯体は双性イオンの形態により大きな溶解度の差を示した。ＰＦ６ －が双性イオン形態であるとき、アセトニトリルとアセトン溶媒で良好な溶解度を示す反面、水とメタノールにおいては良くない溶解度を示した。反対に、Ｃｌ－双性イオン形態であるとき、水とメタノールで良好な溶解度を示し、アセトニトリルとアセトンなどの有機溶媒ではほとんど溶解しなかった。
２－１．［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）Ｃｏｍｐｌｅｘ（１８）
ガラス培養チューブにヘキサクロロオスミウム酸アンモニウム（３０ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）と開始物質（１０）（２０ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）を入れてエチレングリコール（２ｍＬ）を入れて混合溶液を作った。その後、アルゴン気体を１０分間吹き込んでガラス培養チューブの中をアルゴン雰囲気に作った後、１４０℃で６時間還流した。蒸留水に過剰のヘキサフルオロリン酸アンモニウムを入れて飽和された溶液に反応が終わった溶液をゆっくり滴下した。溶液に生じた沈殿物をろ過し、蒸留水と過剰のジエチルエーテルで洗浄して双性イオンがＰＦ６ －である緑色固体生成物１８を得た（３５ｍｇ、７３％）。双性イオンをＣｌ－に変換するためにはＰＦ６ －生成物を少量（～１ｍＬ）のアセトニトリルに溶かした後、Ｃｌ－イオン交換樹脂と共に過剰の蒸留水（２５ｍＬ）混合物を作って一晩攪拌した。残っているＣｌ－樹脂をろ過し、濾液を集めて減圧蒸留を用いて溶媒を除去して双性イオンがＣｌ－である生成物を得た。ＥＳＩ－ＭＳ（Ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］＋Ｃ１８Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ４Ｏｓ：５５２．０５ Ｆｏｕｎｄ：５５２．１６［Ｍ］＋
２－２．［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）Ｃｏｍｐｌｅｘ（１９）
ガラス培養チューブにヘキサクロロオスミウム酸アンモニウム（１２９ｍｇ、０．２９３ｍｍｏｌ）と開始物質（１１）（１２０ｍｇ、０．２９３ｍｍｏｌ）を入れてエチレングリコール（３ｍＬ）を入れて混合溶液を作った。その後、アルゴン気体を１０分間吹き込んでガラス培養チューブの中をアルゴン雰囲気に作った後、１４０℃で６時間還流した。蒸留水に過剰のヘキサフルオロリン酸アンモニウムを入れて飽和された溶液に反応が終わった溶液をゆっくり滴下した。溶液に生じた沈殿物をろ過し、蒸留水と過剰のジエチルエーテルで洗浄して双性イオンがＰＦ６ －である茶色固体生成物１９を得た（２２０ｍｇ、９５％）。双性イオンをＣｌ－に変換するためにはＰＦ６－生成物を少量（～１ｍＬ）のアセトニトリルに溶かした後、Ｃｌ－イオン交換樹脂と共に過剰の蒸留水（２５ｍＬ）混合物を作って一晩攪拌した。残っているＣｌ－樹脂をろ過し、濾液を集めて減圧蒸留を用いて溶媒を除去して双性イオンがＣｌ－である生成物を得た。ＥＳＩ－ＭＳ（Ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］＋ Ｃ２４Ｈ２６Ｃｌ２Ｎ４Ｏ４Ｏｓ：６９６．０９ Ｆｏｕｎｄ：６９６．２５［Ｍ］＋
２－３．［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）Ｃｏｍｐｌｅｘ（２０）
ガラス培養チューブにヘキサクロロオスミウム酸アンモニウム（３２７ｍｇ、０．７４４ｍｍｏｌ）と開始物質（１２）（２７０ｍｇ、０．７４４ｍｍｏｌ）を入れてエチレングリコール（３ｍＬ）を入れて混合溶液を作った。その後、アルゴン気体を１０分間吹き込んでガラス培養チューブの中をアルゴン雰囲気に作った後、１４０℃で６時間還流した。蒸留水に過剰のヘキサフルオロリン酸アンモニウムを入れて飽和された溶液に反応が終わった溶液をゆっくり滴下した。溶液に生じた沈殿物をろ過し、蒸留水と過剰のジエチルエーテルで洗浄して双性イオンがＰＦ６ －である茶色固体生成物２０を得た（５２１ｍｇ、９１％）。双性イオンをＣｌ－に変換するためにはＰＦ６－生成物を少量（～１ｍＬ）のアセトニトリルに溶かした後、Ｃｌ－イオン交換樹脂と共に過剰の蒸留水（２５ｍＬ）混合物を作って一晩攪拌した。残っているＣｌ－樹脂をろ過し、濾液を集めて減圧蒸留を用いて溶媒を除去して双性イオンがＣｌ－である生成物を得た。ＥＳＩ－ＭＳ（Ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］＋ Ｃ２１Ｈ２２Ｃｌ２Ｎ４Ｏ２Ｏｓ：６２４．０７ Ｆｏｕｎｄ：６２４．２５［Ｍ］＋
２－４．［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）Ｃｏｍｐｌｅｘ（２１）
ガラス培養チューブにヘキサクロロオスミウム酸アンモニウム（６２ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ）と開始物質（１３）（４５ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ）を入れてエチレングリコール（３ｍＬ）を入れて混合溶液を作った。その後、アルゴン気体を１０分間吹き込んでガラス培養チューブの中をアルゴン雰囲気に作った後、１４０℃で６時間還流した。蒸留水に過剰のヘキサフルオロリン酸アンモニウムを入れて飽和された溶液に反応が終わった溶液をゆっくり滴下した。溶液に生じた沈殿物をろ過し、蒸留水と過剰のジエチルエーテルで洗浄して双性イオンがＰＦ６ －である茶色固体生成物２１を得た（５１ｍｇ、５０％）。双性イオンをＣｌ－に変換するためにはＰＦ６ －生成物を少量（～１ｍＬ）のアセトニトリルに溶かした後、Ｃｌ－イオン交換樹脂と共に過剰の蒸留水（２５ｍＬ）混合物を作って一晩攪拌した。残っているＣｌ－樹脂をろ過し、濾液を集めて減圧蒸留を用いて溶媒を除去して双性イオンがＣｌ－である生成物を得た。ＥＳＩ－ＭＳ（Ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］＋ Ｃ１９Ｈ２０Ｃｌ２Ｎ４ＯＯｓ：５８２．０６ Ｆｏｕｎｄ：５６６．２５００［Ｍ－ＯＨ］＋
２－５．［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）Ｃｏｍｐｌｅｘ（２２）
ガラス培養チューブにヘキサクロロオスミウム酸アンモニウム（３２６ｍｇ、０．７４２ｍｍｏｌ）と開始物質（１４）（２８０ｍｇ、０．７４２ｍｍｏｌ）を入れてエチレングリコール（３ｍＬ）を入れて混合溶液を作った。その後、アルゴン気体を１０分間吹き込んでガラス培養チューブの中をアルゴン雰囲気に作った後、１４０℃で１６時間還流した。蒸留水に過剰のヘキサフルオロリン酸アンモニウムを入れて飽和された溶液に反応が終わった溶液をゆっくり滴下した。溶液に生じた沈殿物をろ過し、蒸留水と過剰のジエチルエーテルで洗浄して双性イオンがＰＦ６ －である茶色または黒色固体生成物２２を得た（３５５ｍｇ、６１％）。双性イオンをＣｌ－に変換するためにはＰＦ６ －生成物を少量（～１ｍＬ）のアセトニトリルに溶かした後、Ｃｌ－イオン交換樹脂と共に過剰の蒸留水（２５ｍＬ）混合物を作って一晩攪拌した。残っているＣｌ－樹脂をろ過し、濾液を集めて減圧蒸留を用いて溶媒を除去して双性イオンがＣｌ－である生成物を得た。ＥＳＩ－ＭＳ（Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］＋ Ｃ２１Ｈ２４Ｃｌ２Ｎ６ＯＯｓ：６３８．１０ Ｆｏｕｎｄ：６３８．０９９８［Ｍ］＋、３１９．５５３８［Ｍ］２＋
２－６．［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（ＰＦ６ －）Ｃｏｍｐｌｅｘ（２３）
ガラス培養チューブにヘキサクロロオスミウム酸アンモニウム（１２９ｍｇ、０．２９３ｍｍｏｌ）と開始物質（１５）（１２０ｍｇ、０．２９３ｍｍｏｌ）を入れてエチレングリコール（３ｍＬ）を入れて混合溶液を作った。その後、アルゴン気体を１０分間吹き込んでガラス培養チューブの中をアルゴン雰囲気に作った後、１４０℃で６時間還流した。蒸留水に過剰のヘキサフルオロリン酸アンモニウムを入れて飽和された溶液に反応が終わった溶液をゆっくり滴下した。溶液に生じた沈殿物をろ過し、蒸留水と過剰のジエチルエーテルで洗浄して双性イオンがＰＦ６ －である茶色固体生成物２３を得た（２２０ｍｇ、９５％）。双性イオンをＣｌ－に変換するためにはＰＦ６ －生成物を少量（～１ｍＬ）のアセトニトリルに溶かした後、Ｃｌ－イオン交換樹脂と共に過剰の蒸留水（２５ｍＬ）混合物を作って一晩攪拌した。残っているＣｌ－樹脂をろ過し、濾液を集めて減圧蒸留を用いて溶媒を除去して双性イオンがＣｌ－である生成物を得た。ＥＳＩ－ＭＳ（Ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］＋ Ｃ２０Ｈ２２Ｃｌ２Ｎ４Ｏ２Ｏｓ：６１２．０７ Ｆｏｕｎｄ：６１２．１６［Ｍ］＋
２－７．［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（２４）
ガラス培養チューブに開始物質（１８）（６０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）と４－メトキシ－２－ピリジンカルボキサミド（６５ｍｇ、０．４３０ｍｍｏｌ）を入れてエチレングリコール（３ｍＬ）を入れて混合溶液を作った。その後、アルゴン気体を１０分間吹き込んでガラス培養チューブの中をアルゴン雰囲気に作った後、１３０℃で１２時間還流した。蒸留水に過剰のヘキサフルオロリン酸アンモニウムを入れて飽和された溶液に反応が終わった溶液をゆっくり滴下した。溶液に生じた沈殿物をろ過し、蒸留水と過剰のジエチルエーテルで洗浄して双性イオンがＰＦ６ －である茶色固体生成物２４を得た（３２ｍｇ、４０％）。双性イオンをＣｌ－に変換するためにはＰＦ６ －生成物を少量（～１ｍＬ）のアセトニトリルに溶かした後、Ｃｌ－イオン交換樹脂と共に過剰の蒸留水（２５ｍＬ）混合物を作って一晩攪拌した。残っているＣｌ－樹脂をろ過し、濾液を集めて減圧蒸留を用いて溶媒を除去して双性イオンがＣｌ－である生成物を得た。ＥＳＩ－ＭＳ（Ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］＋ Ｃ２５Ｈ２６Ｎ６Ｏ２Ｏｓ：６３４．１７ Ｆｏｕｎｄ：６３４．２５００［Ｍ］＋、３１７．１６６７［Ｍ］２＋
２－８．［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（２５）
ガラス培養チューブに開始物質（１８）（３０ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）とＮ－メチルイミダゾール（３５ｍｇ、０．４３０ｍｍｏｌ）を入れてエチレングリコール（１．５ｍＬ）を入れて混合溶液を作った。その後、アルゴン気体を１０分間吹き込んでガラス培養チューブの中をアルゴン雰囲気に作った後、１３０℃で３時間還流した。蒸留水に過剰のヘキサフルオロリン酸アンモニウムを入れて飽和された溶液に反応が終わった溶液をゆっくり滴下した。溶液に生じた沈殿物をろ過し、蒸留水と過剰のジエチルエーテルで洗浄して双性イオンがＰＦ６ －である茶色固体生成物２５を得た（３４ｍｇ、８５％）。双性イオンをＣｌ－に変換するためにはＰＦ６ －生成物を少量（～１ｍＬ）のアセトニトリルに溶かした後、Ｃｌ－イオン交換樹脂と共に過剰の蒸留水（２５ｍＬ）混合物を作って一晩攪拌した。残っているＣｌ－樹脂をろ過し、濾液を集めて減圧蒸留を用いて溶媒を除去して双性イオンがＣｌ－である生成物を得た。ＥＳＩ－ＭＳ（Ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］＋ Ｃ２６Ｈ３０Ｎ８Ｏｓ：６４６．２２ Ｆｏｕｎｄ：３２３．０８［Ｍ］２＋
２－９．［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（２６）
ガラス培養チューブに開始物質（１８）（１００ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）とピリジン（１１ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）を入れてエチレングリコール（４ｍＬ）を入れて混合溶液を作った。その後、アルゴン気体を１０分間吹き込んでガラス培養チューブの中をアルゴン雰囲気に作った後、１８０℃で１５時間還流した。蒸留水に過剰のヘキサフルオロリン酸アンモニウムを入れて飽和された溶液に反応が終わった溶液をゆっくり滴下した。溶液に生じた沈殿物をろ過し、蒸留水と過剰のジエチルエーテルで洗浄して双性イオンがＰＦ６ －である茶色固体生成物２６を得た（３１ｍｇ、２９％）。双性イオンをＣｌ－に変換するためにはＰＦ６ －生成物を少量（～１ｍＬ）のアセトニトリルに溶かした後、Ｃｌ－イオン交換樹脂と共に過剰の蒸留水（２５ｍＬ）混合物を作って一晩攪拌した。残っているＣｌ－樹脂をろ過し、濾液を集めて減圧蒸留を用いて溶媒を除去して双性イオンがＣｌ－である生成物を得た。ＥＳＩ－ＭＳ（Ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］＋ Ｃ２３Ｈ２３ＣｌＮ５Ｏｓ：５９６．１３ Ｆｏｕｎｄ：５９６．３３３３［Ｍ］＋
２－１０．［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（２７）
ガラス培養チューブに開始物質（１８）（１００ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）と４－ブロモピコリニックアシッド（１７３ｍｇ、０．８６１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１４５ｍｇ、１．４３０ｍｍｏｌ）を入れて蒸留水（３ｍＬ）を入れて混合溶液を作った。その後、アルゴン気体を１０分間吹き込んでガラス培養チューブの中をアルゴン雰囲気に作った後、１００℃で３時間還流した。蒸留水に過剰のヘキサフルオロリン酸アンモニウムを入れて飽和された溶液に反応が終わった溶液をゆっくり滴下した。溶液に生じた沈殿物をろ過し、蒸留水と過剰のジエチルエーテルで洗浄して双性イオンがＰＦ６ －である茶色固体生成物２７を得た（８９ｍｇ、７５％）。双性イオンをＣｌ－に変換するためにはＰＦ６ －生成物を少量（～１ｍＬ）のアセトニトリルに溶かした後、Ｃｌ－イオン交換樹脂と共に過剰の蒸留水（２５ｍＬ）混合物を作って一晩攪拌した。残っているＣｌ－樹脂をろ過し、濾液を集めて減圧蒸留を用いて溶媒を除去して双性イオンがＣｌ－である生成物を得た。ＥＳＩ－ＭＳ（Ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］＋ Ｃ２４Ｈ２１ＢｒＮ５Ｏ２Ｏｓ：６８２．０５ Ｆｏｕｎｄ：６８２．１６６７［Ｍ］＋
２－１１．［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（２８）
ガラス培養チューブに開始物質（１８）（３０ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）とカテコール（４７ｍｇ、０．４３０ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（５９ｍｇ、０．４３０ｍｍｏｌ）を入れて蒸留水（１．５ｍＬ）を入れて混合溶液を作った。その後、アルゴン気体を１０分間吹き込んでガラス培養チューブの中をアルゴン雰囲気に作った後、１００℃で１２時間還流した。蒸留水に過剰のヘキサフルオロリン酸アンモニウムを入れて飽和された溶液に反応が終わった溶液をゆっくり滴下した。溶液に生じた沈殿物をろ過し、蒸留水と過剰のジエチルエーテルで洗浄して双性イオンがＰＦ６ －である黒色固体生成物２８を得た（１９．６ｍｇ、６２％）。双性イオンをＣｌ－に変換するためにはＰＦ６ －生成物を少量（～１ｍＬ）のアセトニトリルに溶かした後、Ｃｌ－イオン交換樹脂と共に過剰の蒸留水（２５ｍＬ）混合物を作って一晩攪拌した。残っているＣｌ－樹脂をろ過し、濾液を集めて減圧蒸留を用いて溶媒を除去して双性イオンがＣｌ－である生成物を得た。ＥＳＩ－ＭＳ（Ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］＋ Ｃ２４Ｈ２２Ｎ４Ｏ２Ｏｓ：５９０．１４ Ｆｏｕｎｄ：５９０．２５００［Ｍ］＋
２－１２．［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（２９）
ガラス培養チューブに開始物質（１８）（２００ｍｇ、０．２８７ｍｍｏｌ）と４－ブロモピコリニックアシッド（７０ｍｇ、０．５６９ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２９ｍｇ、０．２８７ｍｍｏｌ）を入れてエチレングリコール（３ｍＬ）を入れて混合溶液を作った。その後、アルゴン気体を１０分間吹き込んでガラス培養チューブの中をアルゴン雰囲気に作った後、１４０℃で３時間還流した。蒸留水に過剰のヘキサフルオロリン酸アンモニウムを入れて飽和された溶液に反応が終わった溶液をゆっくり滴下した。溶液に生じた沈殿物をろ過し、蒸留水と過剰のジエチルエーテルで洗浄して双性イオンがＰＦ６ －である茶色固体生成物２９を得た（１１３ｍｇ、５３％）。双性イオンをＣｌ－に変換するためにはＰＦ６ －生成物を少量（～１ｍＬ）のアセトニトリルに溶かした後、Ｃｌ－イオン交換樹脂と共に過剰の蒸留水（２５ｍＬ）混合物を作って一晩攪拌した。残っているＣｌ－樹脂をろ過し、濾液を集めて減圧蒸留を用いて溶媒を除去して双性イオンがＣｌ－である生成物を得た。ＥＳＩ－ＭＳ（Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］＋ Ｃ２４Ｈ２２Ｎ５Ｏ２Ｏｓ：６０４．１４ Ｆｏｕｎｄ：６０４．１３８２４［Ｍ］＋
２－１３．［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（３０）
ガラス培養チューブに開始物質（１８）（３０ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）とアセチルアセトン（４３ｍｇ、０．４３０ｍｍｏｌ）、ＮａＯＨ（８ｍｇ、０．２１５ｍｍｏｌ）を入れて蒸留水（１．５ｍＬ）を入れて混合溶液を作った。その後、アルゴン気体を１０分間吹き込んでガラス培養チューブの中をアルゴン雰囲気に作った後、１００℃で４時間還流した。蒸留水に過剰のヘキサフルオロリン酸アンモニウムを入れて飽和された溶液に反応が終わった溶液をゆっくり滴下した。溶液に生じた沈殿物をろ過し、蒸留水と過剰のジエチルエーテルで洗浄して双性イオンがＰＦ６ －である黒色固体生成物３０を得た（１６ｍｇ、５０％）。双性イオンをＣｌ－に変換するためにはＰＦ６ －生成物を少量（～１ｍＬ）のアセトニトリルに溶かした後、Ｃｌ－イオン交換樹脂と共に過剰の蒸留水（２５ｍＬ）混合物を作って一晩攪拌した。残っているＣｌ－樹脂をろ過し、濾液を集めて減圧蒸留を用いて溶媒を除去して双性イオンがＣｌ－である生成物を得た。ＥＳＩ－ＭＳ（Ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］＋ Ｃ２３Ｈ２５Ｎ４Ｏ２Ｏｓ：５８１．１６ Ｆｏｕｎｄ：５８１．３３３３［Ｍ］＋、２９０．６６６６［Ｍ］２＋
２－１４．［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（３１）
ガラス培養チューブに開始物質（２１）（１００ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）とピコリニックアシッド（６７ｍｇ、０．５４８ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（５６ｍｇ、０．５４８ｍｍｏｌ）を入れてエチレングリコール（３ｍＬ）を入れて混合溶液を作った。その後、アルゴン気体を１０分間吹き込んでガラス培養チューブの中をアルゴン雰囲気に作った後、１４０℃で４時間還流した。蒸留水に過剰のヘキサフルオロリン酸アンモニウムを入れて飽和された溶液に反応が終わった溶液をゆっくり滴下した。溶液に生じた沈殿物をろ過し、蒸留水と過剰のジエチルエーテルで洗浄して双性イオンがＰＦ６ －である茶色固体生成物３１を得た（５４ｍｇ、５１％）。双性イオンをＣｌ－に変換するためにはＰＦ６ －生成物を少量（～１ｍＬ）のアセトニトリルに溶かした後、Ｃｌ－イオン交換樹脂と共に過剰の蒸留水（２５ｍＬ）混合物を作って一晩攪拌した。残っているＣｌ－樹脂をろ過し、濾液を集めて減圧蒸留を用いて溶媒を除去して双性イオンがＣｌ－である生成物を得た。ＥＳＩ－ＭＳ（Ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］＋ Ｃ２５Ｈ２４Ｎ５Ｏ３Ｏｓ：６３４．１５ Ｆｏｕｎｄ：６１８．３３３３［Ｍ－ＯＨ］＋
２－１５．［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（３２）
ガラス培養チューブに開始物質（２１）（１００ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）と４－メチルピコリニックアシッド（７６ｍｇ、０．５５０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（５６ｍｇ、０．５５０ｍｍｏｌ）を入れてエチレングリコール（３ｍＬ）を入れて混合溶液を作った。その後、アルゴン気体を１０分間吹き込んでガラス培養チューブの中をアルゴン雰囲気に作った後、１４０℃で４時間還流した。蒸留水に過剰のヘキサフルオロリン酸アンモニウムを入れて飽和された溶液に反応が終わった溶液をゆっくり滴下した。溶液に生じた沈殿物をろ過し、蒸留水と過剰のジエチルエーテルで洗浄して双性イオンがＰＦ６ －である茶色固体生成物３２を得た（５８ｍｇ、５３％）。双性イオンをＣｌ－に変換するためにはＰＦ６ －生成物を少量（～１ｍＬ）のアセトニトリルに溶かした後、Ｃｌ－イオン交換樹脂と共に過剰の蒸留水（２５ｍＬ）混合物を作って一晩攪拌した。残っているＣｌ－樹脂をろ過し、濾液を集めて減圧蒸留を用いて溶媒を除去して双性イオンがＣｌ－である生成物を得た。ＥＳＩ－ＭＳ（Ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］＋ Ｃ２６Ｈ２６Ｎ５Ｏ３Ｏｓ：６４８．１７ Ｆｏｕｎｄ：６３２．４１６７［Ｍ－ＯＨ］＋
２－１６．［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（３３）
ガラス培養チューブに開始物質（２２）（４０ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）と４－メチルピコリニックアシッド（２８ｍｇ、０．２０４ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１５ｍｇ、１５３ｍｍｏｌ）を入れてエチレングリコール（３ｍＬ）を入れて混合溶液を作った。その後、アルゴン気体を１０分間吹き込んでガラス培養チューブの中をアルゴン雰囲気に作った後、１２０℃で５時間還流した。蒸留水に過剰のヘキサフルオロリン酸アンモニウムを入れて飽和された溶液に反応が終わった溶液をゆっくり滴下した。溶液に生じた沈殿物をろ過し、蒸留水と過剰のジエチルエーテルで洗浄して双性イオンがＰＦ６ －である茶色固体生成物３３を得た（１２ｍｇ、２８％）。双性イオンをＣｌ－に変換するためにはＰＦ６ －生成物を少量（～１ｍＬ）のアセトニトリルに溶かした後、Ｃｌ－イオン交換樹脂と共に過剰の蒸留水（２５ｍＬ）混合物を作って一晩攪拌した。残っているＣｌ－樹脂をろ過し、濾液を集めて減圧蒸留を用いて溶媒を除去して双性イオンがＣｌ－である生成物を得た。ＥＳＩ－ＭＳ（Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］＋ Ｃ２８Ｈ３０Ｎ７Ｏ３Ｏｓ：７０４．２０ Ｆｏｕｎｄ：７０４．２０１９［Ｍ］＋、３５２．６０４４［Ｍ］２＋
２－１７．［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（３４）
ガラス培養チューブに開始物質（２２）（４０ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）とＮ－メチルイミダゾール（４２ｍｇ、０．５１０ｍｍｏｌ）を入れてエチレングリコール（２ｍＬ）を入れて混合溶液を作った。その後、アルゴン気体を１０分間吹き込んでガラス培養チューブの中をアルゴン雰囲気に作った後、１３０℃で３時間還流した。蒸留水に過剰のヘキサフルオロリン酸アンモニウムを入れて飽和された溶液に反応が終わった溶液をゆっくり滴下した。溶液に生じた沈殿物をろ過し、蒸留水と過剰のジエチルエーテルで洗浄して双性イオンがＰＦ６ －である茶色固体生成物３４を得た（５０ｍｇ、９６％）。双性イオンをＣｌ－に変換するためにはＰＦ６ －生成物を少量（～１ｍＬ）のアセトニトリルに溶かした後、Ｃｌ－イオン交換樹脂と共に過剰の蒸留水（２５ｍＬ）混合物を作って一晩攪拌した。残っているＣｌ－樹脂をろ過し、濾液を集めて減圧蒸留を用いて溶媒を除去して双性イオンがＣｌ－である生成物を得た。ＥＳＩ－ＭＳ（Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］＋ Ｃ２９Ｈ３６Ｎ１０ＯＯｓ：７３２．２７ Ｆｏｕｎｄ：３６７．１１８２［Ｍ＋２］２＋
２－１８．［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（３５）
ガラス培養チューブに開始物質（２３）（３０ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）とＮ－メチルイミダゾール（３２ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ）を入れてエチレングリコール（１．５ｍＬ）を入れて混合溶液を作った。その後、アルゴン気体を１０分間吹き込んでガラス培養チューブの中をアルゴン雰囲気に作った後、１３０℃で３時間還流した。蒸留水に過剰のヘキサフルオロリン酸アンモニウムを入れて飽和された溶液に反応が終わった溶液をゆっくり滴下した。溶液に生じた沈殿物をろ過し、蒸留水と過剰のジエチルエーテルで洗浄して双性イオンがＰＦ６ －である茶色固体生成物３５を得た（３１ｍｇ、８０％）。双性イオンをＣｌ－に変換するためにはＰＦ６ －生成物を少量（～１ｍＬ）のアセトニトリルに溶かした後、Ｃｌ－イオン交換樹脂と共に過剰の蒸留水（２５ｍＬ）混合物を作って一晩攪拌した。残っているＣｌ－樹脂をろ過し、濾液を集めて減圧蒸留を用いて溶媒を除去して双性イオンがＣｌ－である生成物を得た。ＥＳＩ－ＭＳ（Ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］＋ Ｃ２８Ｈ３４Ｎ８Ｏ２Ｏｓ：７０６．２４ Ｆｏｕｎｄ：３５３．２５００［Ｍ］２＋
実施例３．本発明に係るＴＰＭＡ系のオスミウム錯体の電気化学的特性分析
合成したＴＰＭＡ系のオスミウム錯体の電気化学的特性を分析するために循環電圧電流法（Ｃｙｃｌｉｃ ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ、ＣＶ）を用いた。よく洗浄した直径３ｍｍの炭素ガラス電極を作業電極として使用し、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を基準電極、Ｐｔ電極を相対電極として１０ｍＶ／ｓの走査速度で測定した。ＰＦ６ －双性イオン形態の錯体は０．１ＭのＴＢＡＰのアセトニトリル溶液で３ｍｇ／ｍＬの濃度で測定した。Ｃｌ－双性イオン形態の錯体は酸化還元ピークの位置のみを確認するためにＣｌ－の物質は陰イオン交換の過程中の溶液状態で測定し、物質別に濃度は一定でない状態で測定した。合成した全てのＴＰＭＡ系のオスミウム錯体の酸化／還元電位を図７ａ～図７ｃに示す。［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（Ｃｌ－）（１８）はいかなる置換基も持たない最も基本的なＴＰＭＡオスミウム錯体で、Ｅ１／２＝－０．３３９Ｖの酸化／還元電位を示し、その結果を図６に示す。該錯体を中心にして置換基および配位したリガンドの種類による酸化／還元電位の変化を分析した。
１８番錯体と同様の配位構造を有し、かつそれぞれ異なる置換基を含む１９～２３番錯体と互いに酸化／還元電位を比較した。エチルエステル（－ＣＯＯＥｔ）基を２個含む１９番錯体と１個含む２０番錯体、およびアミド（－ＣＯＯＮＨ）基を含む２２番錯体のような電子求引基（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ ｇｒｏｕｐ、ＥＷＧ）を含む錯体は１８番錯体の酸化／還元電位よりも正の値で現れた。反面、メチル（－ＣＨ２－）基を含む２１番とメトキシ（－ＯＭｅ）基を２個含む２３番のような電子供与基（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｏｎａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ、ＥＤＧ）を含む錯体は１８番錯体よりも負の値で現れた。このような結果は、ＥＷＧが中心金属の電子密度を低下させ、還元が良くなる傾向により電位が正の方向に移動したものであり、ＥＤＧは電子密度を増加させ、酸化が良好になる傾向により電位がさらに負の方向で現れるとみなされる。２０番、２２番錯体は、１８番錯体の酸化／還元電位より約０．１０２～０．１０３Ｖ程度が正の方向に移動し、２つの錯体はいずれも類似した酸化／還元電位を示すことから、カルボニル基を含むエステル基とアミド基が類似した電気化学的な影響を与えると判断した。１９番錯体は、１８番錯体の酸化／還元電位より約０．１７６Ｖが正の方向に移動し、エステル基などのＥＷＧが多ければ多いほどさらに大きな電気化学的な影響を与えることを確認した。ヒドロキシメチル基を含む２１番錯体は０．０３１Ｖだけ負の方向に僅かに移動し、もっと良いＥＤＧであるメトキシ基が２個含まれている２３番錯体は０．１２５Ｖだけ負の方向に移動し、ＥＤＧの種類と個数によってさらに大きな影響を与えると判断した。この結果により、ＴＰＭＡ系のオスミウム錯体が置換基に応じて傾向のある電位の変形が可能であり、これにより理想的な酸化／還元電位を有する電子伝達メディエータとして適用および改善の可能性を確認した。
多様なリガンドが配位された［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（ＰＦ６ －）ｎ系錯体（２４～３０）は、全て１８番錯体よりも正の方向に増加した酸化／還元電位を示した。アセチルアセトン、１個のピリジン、４－ブロモピコリン酸、ピコリン酸、２個の１－メチルイミダゾール、４－メトキシ－２－ピリジルカルボキサミド、カテコールの順に酸化／還元電位が正の方向に益々大きな増加量を示した。それぞれ４－メトキシ－２－ピリジルカルボキサミドとカテコールが配位された２５番、２８番錯体は２個以上の可逆的な酸化／還元ピークが現れ、安定した１個の酸化還元電位を示さないことから、電子伝達メディエータとして好ましくないと判断した。しかし、ピコリン酸が配位されたＴＰＭＡオスミウム化合物は適当に正の方向に電位値が移動し、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を基準として０Ｖに近い理想的な酸化／還元電位を示すので、電子伝達メディエータに適用される可能性のある適切なＴＰＭＡ系のオスミウム錯体と判断された。また、特徴的に［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）Ｃｌ２］＋（Ｘ－）系の１８～２３番錯体は、双性イオン形態による互いに異なる溶媒の条件下でほぼ類似した酸化還元電位を示したが、これらを除いた［Ｏｓ（ＴＰＭＡ）（Ｌ）１～２］ｎ＋（Ｘ－）ｎ系錯体は全てＰＦ６ －双性イオン形態である時よりもＣｌ－双性イオン形態である時、最小３６ｍＶから最大２１０ｍＶまでさらに負の領域で酸化／還元電位が現れた。

Claims (12)

  1. 電子伝達メディエータとして有用な、下記化学式１または２で表されるテトラデンテート窒素供与体リガンドを含む、遷移金属錯体：
    ［化学式１］
    ［化学式２］
    前記化学式１または化学式２中、
    ＭはＯｓであり；
    Ｃａ、ＣｂおよびＣｃはそれぞれ独立して、窒素原子を１つ以上含むヘテロ環であり、好ましくは前記環の２位でアミン基とメチレン基に連結されており；
    Ｌｍ１およびＬｍ２はそれぞれ独立して、－Ｈ、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、
    または
    であり；
    Ｌｂ－Ｌｂはカテコール、アセチルアセトン、ピコリン酸、４－ブロモピコリン酸、４－メチルピコリン酸、４－メトキシ－２－ピリジルカルボキサミドまたは２，２’－ビチアゾールであり；
    ｍは－１～－５または１～５を示す負電荷あるいは正電荷であり；
    Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、－Ｈ；－ＣＮ；－ＣＯ２Ｈ；－ＣＨ２ＯＨ；－ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、または置換または非置換のアルコキシカルボニルであり、このとき、Ｌｍ１及びＬｍ２がいずれも－Ｃｌである場合、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は－Ｈではなく；
    Ｘは対イオン（ｃｏｕｎｔｅｒ ｉｏｎ）であり；
    ｎは対イオンの数を意味し、１～５である。
  2. 前記遷移金属錯体は、下記化学式３で表されるテトラデンテートリガンドを含む、請求項１に記載の遷移金属錯体：
    ［化学式３］
    上記式中、Ｃａ、ＣｂおよびＣｃはそれぞれ独立して、窒素原子を１つ以上含むヘテロ環であり；
    Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、－Ｈ；－ＣＮ；－ＣＯ２Ｈ；－ＣＨ２ＯＨ；－ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、または置換または非置換のアルコキシカルボニルであり、このとき、Ｌｍ１及びＬｍ２がいずれも－Ｃｌである場合、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は－Ｈではない。
  3. 以下の構造を有するテトラデンテートリガンドのうちの１つを含み、オスミウム錯体である、遷移金属錯体：
  4. 前記遷移金属錯体は、以下の遷移金属錯体のうちの１つである、請求項１～３のいずれか一項に記載の遷移金属錯体：
  5. ａ）化学式３で表されるリガンドを化学式５のハロゲン化オスミウムのアンモニウム塩に導入して化学式６のオスミウム錯体を合成する段階；および
    ｂ）化学式６のオスミウム錯体にＮ－Ｎリガンド、Ｎ－リガンド、Ｎ－ＯリガンドおよびＯ－Ｏリガンドからなる群より選択される１種または２種のモノデンテートリガンドまたはバイデンテートリガンドを導入する段階を含む、請求項１に記載の化学式１または２の遷移金属錯体の製造方法：
    ［化学式３］
    ［化学式５］
    ［（ＮＨ４）２ＯｓＣｌ６］
    ［化学式６］
    上記式中、Ｃａ、ＣｂおよびＣｃはそれぞれ独立して、窒素原子を１つ以上含むヘテロ環であり；
    Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、－Ｈ；－ＣＮ；－ＣＯ２Ｈ；－ＣＨ２ＯＨ；－ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、または置換または非置換のアルコキシカルボニルである。
  6. 前記段階ｂ）で、化学式６のオスミウム錯体に１個のＮ－Ｎリガンド、２個のＮリガンド、１個のＮリガンド、１個のＮ－Ｏリガンドまたは１個のＯ－Ｏリガンドが導入され、下記化学式７～１１の遷移金属錯体を製造する、請求項５に記載の方法：
    ［化学式７］
    ［化学式８］
    ［化学式９］
    ［化学式１０］
    ［化学式１１］
  7. 前記Ｎリガンドは、窒素原子を１つ以上含むヘテロ環であり、
    前記Ｎ－Ｎリガンドは、２－ピリジンカルボキサミドまたは２，２’－ビチアゾールであり、
    前記Ｎ－Ｏリガンドは２－ピコリン酸であり、
    前記Ｏ－Ｏリガンドはカテコールまたはアセチルアセトンである、請求項６に記載の方法。
  8. 請求項１～４のいずれか一項に記載の遷移金属錯体を電子伝達メディエータとして含む、装置。
  9. 前記装置は電気化学的バイオセンサーである、請求項８に記載の装置。
  10. 前記装置は血糖モニタリングセンサーである、請求項８に記載の装置。
  11. 液体性生体試料を酸化還元させることができる酵素；および
    請求項１～４のいずれか一項に記載の遷移金属錯体を電子伝達メディエータとして含む、電気化学的バイオセンサー用センシング膜。
  12. 前記酵素は、脱水素酵素（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、酸化酵素（ｏｘｉｄａｓｅ）、およびエステル化酵素（ｅｓｔｅｒａｓｅ）からなる群より選択される１種以上の酸化還元酵素；または、
    脱水素酵素、酸化酵素、およびエステル化酵素からなる群より選択される１種以上の酸化還元酵素とフラビンアデニンジヌクレオチド（ｆｌａｖｉｎ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＮＡＤ）、およびピロロキノリンキノン（Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ｑｕｉｎｏｎｅ、ＰＱＱ）からなる群より選択される１種以上の補助因子を含む、請求項１１に記載の電気化学的バイオセンサー用センシング膜。
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