JP7769691B2 - 新規の改良された塩基編集または編集用融合タンパク質およびその用途 - Google Patents

Description

本発明は、従来開発された塩基エディターに基づいてクロマチン調節ペプチド（ＣＭＰ）などの構成の追加とその配列を異にして開発された融合タンパク質に関し、本発明の前記融合タンパク質は、ＣＭＰを含むことで塩基編集効率が向上し、ｄｅａｄＣａｓ９を用いることで所望しないランダム塩基挿入および欠失発生が除去された新規の塩基エディターとして提供可能である。

７５，０００個以上の病原性突然変異がヒトの遺伝疾患を誘発し、前記病原性突然変異による遺伝疾患中の約５０％が点突然変異により誘導される。ＣＲＩＳＰＲシステムの開発により、ドナーＤＮＡを用いた相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ、ＨＤＲ）方法が治療的接近方法として提案されているが、その効率性が非常に低く、その適用に限界がある。ＨＤＲ方法の限界を克服するために、塩基レベルで調節可能な塩基エディター（Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒ：ＢＥ）が開発されており、近年、新しい精密ゲノム編集ツールであるｎＣａｓ９および逆転写酵素で構成されたプライムエディター（Ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｏｒ：ＰＥ）が遺伝子エディターとして開発されている。プライムエディターは、Ｃａｓ９システムの低いＨＤＲ効率性を克服し、Ｃ→Ａ、Ｃ→Ｇ、Ｇ→Ｃ、Ｇ→Ｔ、Ａ→Ｃ、Ａ→Ｔ、Ｔ→Ａ、およびＴ→Ｇに置換可能であるという長所があるが、依然として様々な有機体におけるその作動可能性が検証されていない。そこで、遺伝子編集のためにプライムエディターとともに塩基エディターの利用が避けられない。

ＣＲＩＳＰＲシステムに基づいて開発された塩基エディターとしては、シトシン塩基エディター（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒ、ＣＢＥ）およびアデニン塩基エディター（ａｄｅｎｉｎｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒ、ＡＢＥ）が挙げられ、ＣＢＥおよびＡＢＥは、様々な有機体において効率的にＣ→Ｔ、Ｔ→Ｃ、Ａ→Ｇ、およびＧ→Ａへの置換が可能である。また、最近の研究から、ヒト細胞においてＣからＧに塩基編集が可能なＣ－ｔｏ－Ｇ塩基エディター（Ｃ－ｔｏ－Ｇ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ）としてＣＧＢＥ１が報告されている。しかし、１つ以上の塩基の挿入、置換、または欠失のような正確な標的突然変異の生成は、細胞内ＨＤＲにより効率性が低いという問題がある。これを改善するために、様々な塩基エディター変異体が開発されており、中でも、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘおよびＡＢＥｍａｘは、ＢＥ３およびＡＢＥよりも大半の標的に対してさらに高い塩基置換能を示すが、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘの編集効率は６９～７７％に過ぎず、ＡＢＥｍａｘの編集効率は２７～５２％に過ぎないため、依然としてその効率向上の課題が残っている。

一方、様々なＰＡＭとの互換性を向上させるためにｘＢＥ３およびｘＡＢＥが開発されているが、ＮＧＧ ＰＡＭシーケンスにもかかわらず、大半の標的において低い編集効率を示すため、現在まで臨床および生物学的研究のための最適の塩基エディターとしては、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘおよびＡＢＥｍａｘが提案される。しかし、上述したように、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘおよびＡＢＥｍａｘの編集効率の上昇問題と、所望しない追加の塩基配列の挿入および欠失とオフターゲット問題が残っている。そこで、本発明者らは、編集効率が向上し、オフターゲット問題と、所望しない塩基の挿入および欠失問題が除去された塩基エディターを開発するために鋭意研究し、本発明を完成するに至った。

Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０２０ Ａｕｇ ２８；２１（１７）：６２４０．

本発明が達成しようとする技術的課題は、従来開発された塩基エディター（ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒ）にクロマチン調節ペプチド（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＣＭＰｓ）をさらに含むことで、塩基編集効率が改善された新規の塩基エディターを提供することにある。

また、本発明は、前記ＣＭＰの追加とともに、ｎｉｃｋａｓｅＣａｓ９の代わりにｄｅａｄＣａｓ９を用いることで、ランダム塩基挿入および欠失発生頻度が著しく減少した新規の塩基エディター提供することを目的とする。

また、本発明は、前記新規の塩基エディターベースの遺伝子編集用組成物、遺伝子編集用ウイルスベクター、およびそれを用いた遺伝子編集方法、並びにそれを用いて形質転換された細胞株および遺伝子組換え哺乳動物を製造する方法などの提供を目的とする。

ただし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に限定されず、言及していない他の課題は、以下の記載から当該技術分野の通常の技術者に明確に理解され得る。

上記の課題を解決するために、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに提供され、塩基編集効率の向上が可能な融合タンパク質を塩基エディター（ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒ）として提供しようとする。

本発明の前記融合タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質とともに、１つ以上のクロマチン調節ペプチド（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＣＭＰ）を含み得る。前記ＣＭＰは、塩基エディターのクロマチンへのアクセシビリティを向上させて塩基編集効率を高めることができ、前記ＣＭＰは、高－移動性グループヌクレオソーム結合ドメイン１（ｈｉｇｈ－ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ １：ＨＮ１）、ヒストンＨ１中央球状ドメイン（ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ１ ｃｅｎｔｒａｌ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ：Ｈ１Ｇ）、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される１種以上であり得る。

本発明の一実施形態として、前記融合タンパク質は、シトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）を含んでシトシン塩基エディター（ＣＢＥ）として提供されるか、またはｔＲＮＡアデノシンデアミナーゼ（ｔＲＮＡ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ：ＴａｄＡ）を含んでアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）として提供され得る。

本発明の他の実施形態として、前記融合タンパク質がシトシンデアミナーゼを含んでＣＢＥとして提供される場合、前記シトシンデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｍＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ、ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ－ｌｉｋｅ）であり得、前記Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインが不活性化されたｄｅａｄ Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）であることが好ましい。ｄＣａｓ９は、従来のＣＢＥが誘導する所望しない塩基の挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）および／または欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、すなわち、ランダムインデル（ｉｎｄｅｌ）の発生頻度を著しく減少させ、正確な塩基エディターとして機能することができる。一方、ｄＣａｓ９の利用による塩基編集効率の減少は、本発明により提案されるＣＭＰの付加によって回復されることができる。

一方、ＣＢＥとして提供される前記融合タンパク質は、ｄＣａｓ９の利用によりランダムインデルの発生を著しく減少させることができるが、依然として発生するランダムインデルは、デアミナーゼ（ｄｅａｍｉｎａｓｅ）と結合したｄＣａｓ９により完全に除去することができる。

そこで、前記ＣＢＥとして提供される前記融合タンパク質は、ＵＧＩ（ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ペプチドをさらに含み得、前記ＵＧＩペプチドは、ｄＣａｓ９のＣ－末端に直接的に連結され得、ｄＣａｓ９に連結されるＵＧＩペプチドは、１つ以上であり得、本発明者らが設計して実験的に確認した融合タンパク質は、２個のＵＧＩペプチドを含む。

本発明のまた他の実施形態として、前記融合タンパク質は、核局在化シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ：ＮＬＳ）ペプチドをさらに含み得、ＮＬＳペプチドは、融合タンパク質のＮ－末端およびＣ－末端に位置するが、Ｃ－末端のＮＬＳペプチドは、結合するＣＭＰの位置が可変的であり得る。

より具体的に、前記融合タンパク質は、Ｎ－末端からＣ－末端の順に［ＮＬＳペプチド］－［ＡＰＯＢＥＣ］－［ｄＣａｓ９タンパク質］－［ＮＬＳペプチド］が位置し、ＵＧＩペプチドは、ｄＣａｓ９ Ｃ－末端と直接的に連結され得、ＮＨ１は、ＡＰＯＢＥＣのＮ－末端またはＣ－末端に位置し、ＨＩＧは、ＵＧＩペプチドのＣ－末端または融合タンパク質のＣ－末端に位置し得る（図１におけるＡｎｃｄＢＥ４ｍａｘ変異体、ｐｅｐｔｉｄｅ １ａ－ｂおよび２ａ－ｂ参照）。

本発明のさらに他の実施形態として、前記融合タンパク質がＴａｄＡを含んでＡＢＥとして提供される場合、前記Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣドメインおよび／またはＨＮＨドメインが不活性化されたＣａｓ９タンパク質、すなわち、ｄＣａｓ９またはｎｉｃｋａｓｅ Ｃａｓ９（ｎＣａｓ９）であり得る。

現在まで開発された最も最適化されたＡＢＥであるＡＢＥｍａｘは、ランダムインデルの発生頻度が高くないところ、本発明のＡＢＥ変異体は、ｎＣａｓ９をその通りに含み、ＣＭＰをさらに含むことで、標的塩基編集効率が増進された塩基エディターとして提供可能である。

ＡＢＥとして提供される本発明の融合タンパク質の構造は、Ｎ－末端からＣ－末端の順に［ＮＬＳペプチド］－［ＴａｄＡ］－［ｎＣａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質］－［ＮＬＳペプチド］であり、ＨＮ１は、ＴａｄＡのＮ－末端またはＣ－末端に位置し得、Ｈ１Ｇは、融合タンパク質のＣ－末端またはＣａｓ９タンパク質のＣ－末端に位置し得る。

また、本発明は、前記融合タンパク質をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに利用できるように、前記融合タンパク質、前記融合タンパク質をコード化するプラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡ、または前記プラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡを含むベクターと、
非標的ＤＮＡ鎖とハイブリダイゼーションして標的ＤＮＡ鎖の切断を誘導するｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）、前記ｓｇＲＮＡの発現が可能なプラスミド、または前記プラスミドを含むベクターと、含む、遺伝子編集用組成物およびキットを提供する。

本発明の一実施形態として、前記ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、およびこれらの組み合わせからなる群から選択された１つ以上であり得る。

また、本発明は、前記遺伝子編集用組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ上で標的核酸配列を含む標的領域（ｒｅｇｉｏｎ）と接触させるステップを含む、遺伝子編集方法を提供する。

また、本発明は、融合タンパク質をコード化するｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を含む、レンチウイルスベクターを提供する。

また、本発明は、前記遺伝子編集用組成物またはレンチウイルスベクターを哺乳動物細胞に導入するステップを含む形質転換細胞株の製造方法、およびその方法により製造された形質転換細胞株を提供する。

また、本発明は、前記遺伝子編集用組成物またはレンチウイルスベクターを哺乳動物細胞に導入して遺伝子組換え哺乳動物細胞を得るステップと、前記得られた遺伝子組換え哺乳動物細胞を哺乳動物代理母の卵管に移植するステップと、を含む、遺伝子組換え哺乳動物の製造方法を提供する。

本発明の一実施形態として、前記哺乳動物細胞は、哺乳動物の胚細胞であり得る。

本発明は、クロマチン－調節ペプチド（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＣＭＰｓ）を用いて塩基編集効率を増進させることができ、ｎｉｃｋａｓｅ Ｃａｓ９の代わりにｄｅａｄ Ｃａｓ９を用いる場合にランダムインデルを著しく減少可能であることを確認し、著しく増進されたゲノム編集効率および標的特異性が担保された塩基エディターを提供する。また、本発明は、標的遺伝子の突然変異動物モデルを作製して次世代への突然変異の伝達および表現型の変化などを確認した。従って、本発明に係る改善されたプライムエディターを含む遺伝子編集用組成物は、ヒト化動物モデルの作製および研究、遺伝工学技術分野、および遺伝疾患の治療手段などの様々な用途として有用に活用できることが期待される。

図１ａは、ＣＢＥ変異体の構造であり、図１ｂは、ＡＢＥ変異体の構造である。 従来の塩基エディターの活性を確認したものであって、ヒト遺伝子を標的とするＣＢＥ変異体（ａおよびｂ）とＡＢＥ変異体（ｃおよびｄ）の塩基編集効率とランダムインデルの発生頻度を比較確認したものである。各データは、３回繰り返し実験して平均値を示した。また、ｅは、ＣＢＥ変異体により発生するインデルパターンであり、ｆは、ＡＢＥ変異体により発生するインデルパターンである。赤色矢印と点線は、ｓｐＣａｓ９の切断部位を示す。 活性ウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗｓ）においてＣまたはＡターゲットの塩基編集効率を確認したものであって、ａは、ＨＥＫ２９３細胞においてＣＢＥ変異体に対するヒト標的ＨＢＢ、ＲＮＦ２、ＨＥＫ３、およびＳｉｔｅ１８の各編集ウィンドウ（ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ）に対する編集効率を示したものであり、ｂは、ＨＥＫ２９３細胞においてＡＢＥ変異体に対するヒト標的Ｓｉｔｅ１８、Ｓｉｔｅ１９、ＨＢＢ－Ｅ２、およびＨＥＫ２の各編集ウィンドウに対する編集効率を示したものである。各データは３回繰り返し実験の平均±Ｓ．Ｄで示し、ＰＡＭ領域は青色で示し、ターゲット配列はアンダーラインで示し、置換されたターゲットの領域は赤色で示した。 図４ａ～４ｄは、ＣＢＥ標的配列の各位置で塩基置換効率を確認したものである。ＣＢＥ変異体は、ＰＡＭ配列１３－１８ｎｔアップストリームでＣ→Ｔに置換を誘導し、ＣからＴへの変換は、青色で強調表示した。黄色ボックスは、当初意図したターゲット配列であり、ピンク色ボックスは、非標的塩基の転換（Ｃ→ＡまたはＣ→Ｇ）を示す。各データは、３回繰り返し実験の平均値で示した。 図５ａ～図５ｄは、ＡＢＥ標的配列の各位置で塩基置換効率を確認したものである。ＡＢＥ変異体は、ＰＡＭ配列１３－１８ｎｔアップストリームでＡ→Ｇに置換を誘導し、ＡからＧへの変換は、赤色で強調表示した。黄色ボックスは、当初意図したターゲット配列であり、各データは、３回繰り返し実験の平均値で示した。 ｓｇＲＮＡ長による標的位置で編集ウィンドウの特異性と編集効率の変化を確認したものである。ａおよびｂは、ｓｇＲＮＡ長によるＣＢＥ変異体の標的塩基の転換効率を確認したものであり、ｃは、ＲＮＦ２においてｓｇＲＮＡ長によるＣＢＥ変異体の標的塩基の転換効率を示したものであり、ｄおよびｅは、ｓｇＲＮＡ長によるＡＢＥ変異体の標的塩基の転換効率を確認したものであり、ｆは、ＨＥＫ２においてｓｇＲＮＡ長によるＡＢＥ変異体の標的塩基の転換効率を示したものである。各塩基置換頻度は、標的化ディープシーケンシングで分析し、全てのデータは、３回繰り返し実験の平均±ＳＤで示した。 ｎＣａｓ９を用いた塩基エディターがＣａｓ９を用いた塩基エディターよりもランダムインデルの発生頻度を減少させ、ｄＣａｓ９を用いた塩基エディターは、ｎＣａｓ９を用いた塩基エディターよりも著しくインデルの発生頻度を減少させることを確認したものである。各データは、３回繰り返し実験の平均±ＳＤで示した。 ＵＧＩの追加によりＣＢＥ変異体で発生するランダムインデルを除去することを確認したものであって、図８ａは、ターゲット遺伝子の標的位置でＣＢＥ変異体の塩基置換効率を示したものであり、図８ｂは、ＵＧＩの追加処理濃度によるＣＢＥ変異体のターゲット遺伝子（ＨＥＫ３およびＳｉｔｅ１８）において標的塩基の置換効率とランダムインデルの発生頻度を示したものである。ランダムインデルと塩基転換頻度は、標的化ディープシーケンシングを行って確認し、各データは、３回繰り返し実験の平均±ＳＤで示した。 ＣＭＰを含む塩基エディターにおいて所望しないランダムインデルが除去されることを確認したものであって、ａは、ＣＢＥ変異体の塩基置換効率を示したものであり、ｂは、ランダムインデルの発生頻度を示したものである。Ｃは、ＡＢＥ変異体の塩基置換効率を示したものであり、ｄは、ランダムインデルの発生頻度を示したものである。 マウスの筋肉細胞と生体内でＤｍｄ ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ誘導実験結果であって、図１０ａの（Ａ）は、Ｄｍｄ遺伝子においてｅｘｏｎ２０の配列と突然変異配列を示したものであり、（Ｂ）は、ＣＭＰを含むＣＢＥ変異体の塩基置換効率とランダムインデルの発生頻度を示したものであり、図１０ｂは、前記ＣＢＥ変異体、ＢＥ３、およびＡｎｃＢＥ４ｍａｘによるＣからＴへの転換パターンを示したものである。

塩基編集は、様々な研究分野で広く用いられるＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）システムに基づくゲノム編集方法である。塩基編集により、ゲノムに一塩基の置換を誘導することができる。ＢＥ３は、ＣＢＥの１つであり、ｎＣａｓ９、ｒＡＰＯＢＥＣ１（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、およびＵＧＩ（ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含む融合タンパク質で構成される。また、ＡＢＥであるＡＢＥ７．１０は、エンジニアリングされたホモ二量体アデニンデアミナーゼであるＴａｄＡとｎＣａｓ９で構成され、ｇＲＮＡ依存方式でＡをＧに置換する。両塩基エディター活性化された編集ウィンドウを有し、前記編集ウィンドウは、ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）の１３－１７ｎｔ ｕｐｓｔｒｅａｍの領域を含む。

理論的に、病原性一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）中の約１４％はＣＢＥにより編集することができ、約４７％はＡＢＥにより編集することができる。しかし、現在までの研究によれば、塩基エディターは、哺乳動物細胞（マウス胚）において２９％の割合でランダムインデルを誘発する。従って、ＤＮＡ標的部位における塩基エディターによるランダムインデル発生の除去は、臨床に塩基エディターを適用するために必須に解決すべき課題として残っている。

上述したように、塩基エディターは、ゲノムにおいて正確かつ効率的な一塩基置換が可能であるが、標的部位で所望しない挿入および欠失が発生し、このようなランダムインデルは、塩基エディターの臨床適用に制限となる。本発明者らは、標的部位で発生するランダムインデルを除去するために様々なＣＢＥおよびＡＢＥ変異体を作製し、段階的にランダムインデルの除去と塩基編集効率を向上させるための塩基エディターの構成要素とその配列を研究し、本発明を完成するに至った。

先ず、ｎＣａｓ９は、Ｃａｓ９と比較してランダムインデルの発生頻度を著しく減少させることができるが、依然としてランダムインデルを発生させ、ｎＣａｓ９の利用により発生するランダムインデルは、ｄＣａｓ９を用いることで除去可能であることを確認した。しかし、ｄＣａｓ９を用いた塩基エディターは、塩基置換効率が非常に低いという問題がある。これを解決するために、塩基エディターのゲノムＤＮＡに対するアクセシビリティを向上させようとした。

ゲノムＤＮＡに対する塩基エディターのアクセシビリティを向上させるために、クロマチン調節ペプチド（ＣＭＰ）ドメインを追加した塩基エディター変異体を作製し、塩基置換効率とランダムインデルの発生頻度を測定した結果、ＣＭＰドメインの追加は、標的遺伝子に応じて異なるが、塩基置換効率を向上させ、ランダムインデルの発生頻度を著しく減少可能であることを確認した。

一方、ＡＢＥにおけるｎＣａｓ９は、ＣＢＥ塩基エディターにおけるｎＣａｓ９と比較してランダムインデルをほぼ発生させず、そこで、ＡＢＥｍａｘにＣＭＰをさらに含むＡＢＥ変異体を作製して塩基編集効率とランダムインデルの発生頻度を確認した結果、著しく向上した塩基編集効率を示し、ランダムインデルが完全に除去されることを確認した。上記の結果から、塩基エディターにＣＭＰの追加は、標的ＤＮＡへのアクセシビリティの増加により、塩基編集効率の向上とともにランダムインデルの発生頻度を低くすることに効果的であることが分かる。

そこで、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムベースの塩基エディターとして、Ｃａｓ９タンパク質とＣＭＰを含む融合タンパク質を向上した塩基エディターを提供しようとする。

また、本発明は、前記ＣＭＰを含む融合タンパク質と、編集しようとする遺伝子特異的なｓｇＲＮＡ（または、それを発現するベクター）とを含む、遺伝子編集用組成物を提供する。

前記ｓｇＲＮＡは、非標的ＤＮＡ鎖に相補的に結合して標的ＤＮＡ鎖の切断を誘導する１０～３０ｎｔ長のシングルガイドＲＮＡであり、好ましくは１９～３０ｎｔ長を有し得る。

本発明において、「遺伝子編集（ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）」は、遺伝子矯正、ゲノム編集などと同一の意味として用いられ得る。遺伝子編集は、標的遺伝子内の標的部位に１つ以上の塩基に対して突然変異を誘発する変異（置換、挿入、または欠失）を意味する。好ましくは、前記遺伝子編集は、標的遺伝子の二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ）を伴わないものであり得、具体的には、塩基編集（ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）を介して行われるものであり得る。

本発明の一実施形態において、前記１つ以上の塩基に対して突然変異を誘発する変異または遺伝子編集は、標的部位に終止コドンを生成させるか、または野生型と異なるアミノ酸をコードするコドンを生成させることで、標的遺伝子を不活性化（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）させる。または、開始コドンを他のアミノ酸に置換して遺伝子を不活性化させるかまたは遺伝子変異を編集するか、挿入または欠失によるフレームシフト（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ）により遺伝子を不活性化させるかまたは遺伝子変異を編集するか、タンパク質を生成しない非コードＤＮＡ配列に変異を導入するか、または疾病を誘発する野生型と異なる配列のＤＮＡを野生型と同一の配列に変化させるなどの様々な形態であり得るが、これらに限定されるものではない。

本発明において、用語「塩基配列」は、当該塩基を含むヌクレオチドの配列を意味し、ヌクレオチド配列、核酸配列、またはＤＮＡ配列と同一の意味として用いられ得る。

本発明において、前記「標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）」は、遺伝子編集の対象となる遺伝子を意味し、「標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅまたはｔａｒｇｅｔ ｒｅｇｉｏｎ）」は、標的遺伝子内の標的特異的ヌクレアーゼによる遺伝子編集または矯正が起こる部位を意味し、一例において、前記標的特異的ヌクレアーゼがＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼ（ＲＮＡｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＲＧＥＮ）を含む場合、標的遺伝子内のＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼが認識する配列（ＰＡＭ配列）の５’末端および／または３’末端に隣接して位置し得る。

本発明において、前記クロマチン調節ペプチド（ＣＭＰ）は、ヌクレオソームの再配列および／またはクロマチンの再形成を容易にするためにヌクレオソームおよび／または染色体タンパク質と相互作用する染色体タンパク質またはその断片を意味する。より具体的に、前記クロマチン調節ペプチドは、高－移動性グループヌクレオソーム結合ドメイン１（ｈｉｇｈ－ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ １、ＨＮ１）またはその断片、ヒストンＨ１中央球状ドメイン（ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ１ ｃｅｎｔｒａｌ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ、Ｈ１Ｇ）またはその断片、またはこれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されるものではない。

前記高－移動性グループヌクレオソーム結合ドメイン（ＨＭＧＮ）は、クロマチンの構造および機能を調節する染色体タンパク質であり、前記ヒストンＨ１中央球状ドメイン（ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ１ ｃｅｎｔｒａｌ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ、Ｈ１Ｇ）は、「リンカーヒストン」とも知られたヒストンＨ１を構成するドメインである。ヒストンＨ１は、ヌクレオソームアレイの圧縮状態を調節し、形態に影響を与え、前記中央球状ドメインは、ヌクレオソーム上のリンカーＤＮＡのｅｎｔｒｙ／ｅｘｉｔ部位近くに結合することが知られている。

前記クロマチン調節ペプチドは、化学的結合により直接的に、リンカーにより間接的に、またはこれらの組み合わせにより前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質または逆転写酵素に連結され得る。具体的に、少なくとも１つのクロマチン調節ペプチドは、融合タンパク質のＮ－末端、Ｃ－末端、および／または内部位置に連結され得る。

また、本発明の前記融合タンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞－透過ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはこれらの組み合わせをさらに含み得、好ましくは、Ｎ－末端およびＣ－末端にそれぞれ核局在化シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ、ＮＬＳ）配列をさらに含み得るが、これに限定されるものではない。

本発明において、「Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９）タンパク質」は、ＤＮＡウイルスに対する特定のバクテリアの免疫学的防御において重要な役割をするタンパク質であり、遺伝工学の応用に多く用いられるが、前記タンパク質の主な機能がＤＮＡを切断することであるため、細胞のゲノムを改変する際に適用することができる。具体的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、３世代の遺伝子ハサミであり、利用しようとする特定の塩基配列を認識し切断して編集し、ゲノムの目的部位に特定の遺伝子を挿入するかまたは特定の遺伝子の活動を停止させる操作を簡単、迅速、かつ、効率性よく実施するのに有用である。Ｃａｓ９タンパク質または遺伝子情報は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースから得ることができるが、これに限定されるものではない。また、Ｃａｓ９タンパク質は、その目的に合わせて、当業者が追加のドメインを適宜連結し得る。本発明において、Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９だけでなく、遺伝子編集のための核酸分解酵素の機能を有するものであれば、Ｃａｓ９の変異体を全て含み得る。

前記Ｃａｓ９変異体は、ＤＮＡ二本鎖を切断するエンドヌクレアーゼ活性を失うように変異したものを意味し得る。例えば、前記Ｃａｓ９変異体は、エンドヌクレアーゼ活性を失い、ニッカーゼ活性を有するように変異したＣａｓ９（ｎＣａｓ９）タンパク質、およびエンドヌクレアーゼ活性とニッカーゼ活性を全て失うように変異したＣａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質の中から選択された１種以上であり得る。

前記ｎＣａｓ９は、ヌクレアーゼの触媒活性ドメイン（例えば、Ｃａｓ９のＲｕｖＣまたはＨＮＨドメイン）において変異が起こって不活性化されたものであり得る。具体的に、１０位のアスパラギン酸（Ｄ１０）、７６２位のグルタミン酸（Ｅ７６２）、８４０位のヒスチジン（Ｈ８４０）、８５４位のアスパラギン（Ｎ８５４）、８６３位のアスパラギン（Ｎ８６３）、および９８６位のアスパラギン酸（Ｄ９８６）などからなる群から選択された１つ以上が任意の他のアミノ酸に置換された突然変異を含み得、好ましくは、本発明のｎＣａｓ９は、８４０位のヒスチジンがアラニンに置換（Ｈ８４０Ａ）された変異を含み得るが、これに限定されるものではない。

それと同様に、ｄＣａｓ９は、１０位のアスパラギン酸（Ｄ１０）、７６２位のグルタミン酸（Ｅ７６２）、８４０位のヒスチジン（Ｈ８４０）、８５４位のアスパラギン（Ｎ８５４）、８６３位のアスパラギン（Ｎ８６３）、および９８６位のアスパラギン酸（Ｄ９８６）などからなる群から選択された１つ以上が任意の他のアミノ酸に置換された突然変異を含み得、好ましくは、本発明のｄＣａｓ９は、１０位のアスパラギン酸がアラニンに置換（Ｄ１０Ａ）された変異と８４０位のヒスチジンがアラニンに置換（Ｈ８４０Ａ）された変異とを含み得るが、これに限定されるものではない。

前記Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体は、その由来が限定されず、非限定的な例示として、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リステリア・イノクア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、またはストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）に由来し得る。

前記Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体は、微生物から分離したもの、または組換え的方法または合成的方法などのように人為的または非自然発生（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）のものであり得る。前記Ｃａｓ９は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで予め転写されたｍＲＮＡまたは予め生産されたタンパク質の形態、または標的細胞または生体内で発現するために組換えベクターに含まれた形態で用いられ得る。一実施形態において、前記Ｃａｓ９は、組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、ｒＤＮＡ）により作られた組換えタンパク質であり得る。組換えＤＮＡは、様々な有機体から得られた異種または同種遺伝物質を含むために分子クローニングのような遺伝子組換え方法により人工的に作られたＤＮＡ分子を意味する。

本発明で用いられる用語「ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）」は、標的遺伝子内の標的部位内の特異的な塩基配列（標的配列）にハイブリダイゼーション可能な標的化配列を含むＲＮＡを意味し、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体（または、細胞）内でＣａｓのようなヌクレアーゼタンパク質と結合し、それを標的遺伝子（または、標的部位）にガイドする役割をする。

前記ガイドＲＮＡは、標的遺伝子（標的部位）内の標的配列と相補的な配列（標的化配列）を有する部分であるスペーサ領域（Ｓｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎ、Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎなどと称する）、およびＣａｓ９タンパク質結合のためのヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造を含み得る。より具体的には、標的遺伝子内の標的配列と相補的な配列を含む部分、Ｃａｓタンパク質結合のためのヘアピン構造、およびターミネータ（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）配列を含み得る。

前記ガイドＲＮＡの標的配列とハイブリダイゼーション可能なガイドＲＮＡの標的化配列は、前記標的配列が位置するＤＮＡ鎖（すなわち、ＰＡＭ配列（５’－ＮＧＧ－３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである）が位置するＤＮＡ鎖）またはその相補的鎖のヌクレオチド配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％の配列相補性を有するヌクレオチド配列を意味し、前記相補的鎖のヌクレオチド配列と相補的結合が可能である。

前記ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態で使用（または、前記組成物に含まれる）されるか、またはそれをコードするＤＮＡを含むプラスミドの形態で使用（または、前記組成物に含まれる）され得る。

本発明で用いられる用語、「クロマチンアクセシビリティ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）」とは、主にヒストン（ｈｉｓｔｏｎｅ）、転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ、ＴＦ）、クロマチン修飾酵素（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ）、およびクロマチンリモデリング複合体（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）で構成されたＤＮＡおよび関連タンパク質により形成された複合体であるクロマチンの物理的圧縮レベルを意味する。真核生物ゲノムは、一般的にヒストン８量体（ｏｃｔａｍｅｒ）を囲んでいる～１４７ｂｐのＤＮＡを含むヌクレオソームに圧縮されるが、ヌクレオソームの占有率は、ゲノムにおいて均一でなく、組織および細胞類型に応じて異なる。ヌクレオソームは、一般的に転写調節因子（例えば、転写因子）と相互作用するシス調節因子（エンハンサーおよびプロモーター）が存在するゲノム位置で枯渇して接近可能なクロマチンを生成することになる。遺伝子編集（遺伝子矯正）に関しては、クローズドゲノム領域よりもオープンゲノム領域を標的とするｇＲＮＡの活性に有意な差があり、Ｃａｓ９の効率が局所的クロマチンアクセシビリティにより影響を受けるため、クロマチンアクセシビリティとＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介の遺伝子編集効率性との間に正の相関関係があることが公知となっている。

本発明の他の態様として、本発明は、前記遺伝子編集用組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ上で標的核酸配列を含む標的領域（ｒｅｇｉｏｎ）と接触させるステップを含む、遺伝子編集方法を提供する。

前記遺伝子編集用組成物は、好ましくは、真核細胞に適用され得、前記真核細胞は、好ましくは、ヒトなどの霊長類、マウスなどの齧歯類を含む哺乳動物に由来し得るが、これらに限定されるものではない。

本発明のまた他の態様として、本発明は、前記遺伝子編集用組成物を含む、遺伝子編集用キットを提供する。

本発明において、前記キットは、前記遺伝子編集用組成物とともに、バッファ（ｂｕｆｆｅｒ）およびデオキシリボヌクレオチド－５－トリホスフェート（ｄＮＴＰ）のような遺伝子編集を実施する際に必要な物質（試薬）を全て含み得る。また、前記キットの特定の反応で用いられる試薬の最適量は、本明細書における開示事項を習得した当業者により容易に決定され得る。

本発明のさらに他の態様として、前記遺伝子編集用組成物をヒトを除いた哺乳動物細胞に注入して遺伝子組換え哺乳動物細胞を得るステップと、前記得られた遺伝子組換え哺乳動物細胞をヒトを除いた哺乳動物代理母の卵管に移植するステップと、を含む、ヒトを除いた遺伝子組換え哺乳動物の製造方法を提供する。

本発明において、前記哺乳動物細胞に遺伝子編集用組成物を導入するステップは、ｉ）前記細胞を本発明に係る融合タンパク質とｓｇＲＮＡをコード化するプラスミドベクターまたはウイルスベクターでトランスフェクションさせるか、
ｉｉ）前記細胞に融合タンパク質をコード化するｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡの混合物またはこれらのそれぞれを直接注入するか、または
ｉｉｉ）前記細胞に融合タンパク質、ｓｇＲＮＡの混合物または複合体形態のリボヌクレオタンパク質を直接注入して行われ得る。

前記直接注入は、前記ｉｉ）またはｉｉｉ）の各ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡまたはリボヌクレオタンパク質が組換えベクターを用いず、細胞膜および／または核膜を通過してゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）に伝達されることを意味し得、例えば、ナノ粒子、電気穿孔法、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）などにより行われ得る。

前記遺伝子編集組成物が導入される哺乳動物細胞は、ヒトなどの霊長類、マウスなどの齧歯類を含む哺乳動物の胚であり得、好ましくは、ヒトを除いた哺乳動物の胚であり得る。例えば、前記胚は、過剰排卵誘発された雌の哺乳動物と雄の哺乳動物を交配して得られた受精胚を前記雌の哺乳動物の卵管から採取し得る。前記塩基編集用組成物が適用（注入）される胚は、受精された１－細胞期の胚（ｚｙｇｏｔｅ）であり得る。

前記得られた遺伝子組換え哺乳動物細胞は、前記遺伝子編集組成物の導入により、標的遺伝子に塩基置換、挿入、または欠失突然変異が発生した細胞であり得る。

前記遺伝子組換え哺乳動物細胞、好ましくは、卵管に遺伝子組換え胚細胞の移植を受ける哺乳動物は、前記胚細胞が由来する哺乳動物と同種の哺乳類（代理母）であり得る。

また、本発明は、前記方法により製造された、遺伝子組換え哺乳動物を提供する。

本発明者らが設計および作製して塩基編集効率およびランダムインデルの発生減少を確認した塩基エディター変異体の構造を図１に示し、それぞれの塩基エディター変異体は、現在知られた最適のＣＢＥであるＡｎｃＢＥ４ｍａｘとＡＢＥのＡＢＥｍａｘをベースにＣＭＰなどの構成を追加し、その配列を異にして作製した。

本発明は、様々な変換を加えてもよく、種々の実施例を有してもよいところ、以下では、特定の実施例を図面に例示し、詳細な説明に詳しく説明しようとする。ただし、これは、本発明を特定の実施形態に対して限定しようとするものではなく、本発明の思想および技術範囲に含まれる全ての変換、等価物ないし代替物を含むものと理解しなければならない。本発明を説明するに際し、関連の公知技術に関する具体的な説明が本発明の要旨を不要に濁す恐れがあると判断される場合にはその詳細な説明を省略する。

［実験方法］
１．ｓｇＲＮＡ製造用プラスミドベクタークローニング
ターゲットｓｇＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドは、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いたＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）実行により合成した。合成されたオリゴヌクレオチドは、Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ、ＵＳＡ）を用いて、ｐＲＧ２－ＧＧベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１０４１７４）にクローニングした。クローニングされたベクターを用いて受容性ＤＨ５ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を形質転換し、形質転換細胞からＭｉｄｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ、Ｕ．Ｋ）を用いてプラスミドを抽出し、Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ、Ｋｏｒｅａ）を用いて塩基配列を分析した。

前記ターゲットｓｇＲＮＡに特異的に合成されたオリゴヌクレオチドとＰＣＲ実行に用いられたプライマーの塩基配列情報を下記表１および表２に示した。

２．塩基編集のためのベクター準備
ｘＣａｓ９（３．７）－ＢＥ３（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１０８３８０）、ｐＣＭＶ－ＢＥ３（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃７３０２１）、ｐＣＭＶ－ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１１２０９４）、ｘＣａｓ９（３．７）－ＡＢＥ７．１０（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１０８３８２）、ｐＣＭＶ－ＡＢＥ７．１０（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１０２９１９）、およびｐＣＭＶ－ＡＢＥｍａｘ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１１２０９５）はＡｄｄｇｅｎｅで作製され、ｐＣＭＶ－ＮＬＳ－ＵＧＩベクターはＧｅｎｅＣｋｅｒ、Ｉｎｃ．（Ｋｏｒｅａ）で作製された。

３．細胞培養およびトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）は、３７℃および５％ ＣＯ_２で１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏのＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｋｏｒｅａ）で培養し、前記培養された細胞は、２４－ウェルプレート（ＳＰＬ、Ｋｏｒｅａ）に各ウェル当たり２×１０^４濃度で接種し、１７時間後、１ｕｌ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いて、製造会社のプロトコルに従って、ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒ ｐｌａｓｍｉｄ（７５０ ｎｇ ）、ｓｇＲＮＡ ｐｌａｓｍｉｄ（２５０ｎｇ）、またはＵＧＩ ｐｌａｓｍｉｄ（２５０ｎｇまたは５００ｎｇ）で形質転換した。形質転換して７２時間後に細胞を収穫して溶解し、ＰＣＲ鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として用いた。

４．ｍＲＮＡ準備
ｐＥＴ－ＡｎｃＢＥ４ｍａｘおよびｐＥＴ－ＵＧＩは、ＧｅｎｅＣｋｅｒ、Ｉｎｃ（Ｋｏｒｅａ）で作製された。

各ｍＲＮＡ鋳型は、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いたＰＣＲ実行により作製された。ＰＣＲに行われたプライマー配列を下記表３に示した。

ｍＲＮＡは、ＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ ｋｉｔ、Ａｍｂｉｏｎ）を用いて準備し、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）で精製した。

７．標的化ディープシーケンシング（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
ゲノムＤＮＡにおいて、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）とＰＣＲ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒを用いて標的部位を増幅した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を用いて、ＰＣＲアンプリコンをｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄシーケンシングした。用いられたプライマーを前記表１に示した。標的化ディープシーケンシングデータは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）およびＥＵＮ ｐｒｏｇｒａｍ（ｄａｅｕｎｙｏｏｎ．ｃｏｍ）を用いて分析した。

８．統計分析
ＳＰＳＳ ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ １８．０（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いてデータを分析した。Ｐ値は独立標本（ｕｎｐａｉｒｅｄ）および両側検定（ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ）Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔｓまたは一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を行い、（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）ｐｏｓｔ－ｈｏｃとしてはＴｕｋｅｙを行って決めた。全てのデータは、平均と標準偏差（Ｓ．Ｄ．）で示した。

［実験結果］
実施例１．塩基エディター変異体がＤＮＡ標的位置で意図しないインデル誘導を確認
ＣＲＩＳＰＲシステムベースの様々な類型の塩基エディター変異体が、より正確かつ効率的な遺伝子操作のために開発された。開発された塩基エディター変異体の中でもＡｎｃＢＥ４ｍａｘおよびＡＢＥｍａｘは、核局在化シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ：ＮＬＳ）、コドン、およびデアミナーゼ（ｄｅａｍｉｎａｓｅ）の構成とその使用を調節して最適化された。このような調節は、細胞において塩基エディターの効率と正確性を著しく向上させ、正確なＳＮＰ修正を可能にする。また、ｘＣａｓ９－ＢＥ３（ｘＢＥ３）およびｘＣａｓ９－ＡＢＥ（ｘＡＢＥ）は、ｘＣａｓ９（３．７）と融合した進化した塩基エディターであり、ＮＧまたはＮＧＴ ＰＡＭ配列を認識して広範囲のＰＡＭとの互換性が向上した塩基エディターである。

本発明者らは、塩基エディターの様々な変異体を作製し、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞において前記変異体の塩基置換および挿入欠失効率を確認しようとした。ＣＢＥ変異体としてｘＢＥ３、ＢＥ３、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘを作製し、ＡＢＥ変異体としてＡｎｃＢＥ４ｍａｘ、ｘＡＢＥ、ＡＢＥ、およびＡＢＥｍａｘを作製し（図１）、ＣＢＥ標的座位は、ヒトＨＢＢ、ＲＮＦ２、ＨＥＫ３、およびＳｉｔｅ１８であり、ＡＢＥ標的座位は、ヒトＳｉｔｅ１８、Ｓｉｔｅ１９、ＨＢＢ－Ｅ２、およびＨＥＫ２２である。

その結果、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘおよびＡＢＥｍａｘの塩基置換効率は、他の塩基エディターよりも高いことを確認した（図２）。全てのＡＢＥおよびＣＢＥ変異体は、全てのターゲット座位でＡからＧに、またはＣからＴに塩基置換を誘導した（図３）。ＣＢＥ変異体の中でもＡｎｃＢＥ４ｍａｘは、標的位置で最大８９％の置換効率を示したが、ＢＥ３よりも低い挿入欠失効率を示した（図３ａ）。ＢＥ３に対するＨＥＫ３標的部位の挿入欠失は最大６．５％まで確認された（図３ｂ）。ＡｎｃＢＥ４ｍａｘとは異なり、ＡＢＥｍａｘは、他の塩基エディターに比べてさらに高いレベルの置換および挿入欠失を示した（図３ｃ－ｄ）。基本エディターｘＢＥ３およびｘＡＢＥは、全ての標的部位で最も低い挿入欠失および置換効率を示し、これは、ｘＣａｓ９（３．７）の低い活性によるものと見られた。ＡＢＥ変異体は、ＣＢＥ変異体よりも相対的なインデル効率が低く、標的配列によりインデルがほぼ発生しなかった。上記の結果から、塩基エディター変異体は、高い効率でＤＮＡ標的部位で所望しない塩基の挿入および／または欠失を誘導可能であることが分かる。

実施例２．ｓｇＲＮＡ長が塩基置換効率およびランダムインデルの発生に及ぼす影響を確認
次に、本発明者らは、ｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）長が塩基エディターのインデル効率に及ぼす影響を確認しようとした。具体的に、各ターゲット位置に１９～３０個の塩基を拡張して互いに長さが異なるｓｇＲＮＡを作製し、インデル効率を確認するとともに、標的位置でＣＢＥおよびＡＢＥ変異体の塩基編集効率、特異性、および編集ウィンドウを比較した（図４および図５）。

その結果、ＨＥＫ３およびＲＮＦ２において、置換頻度はＧｘ１９ ｓｇＲＮＡにおいて最も高く、所望しない挿入欠失の頻度はｇｘ３０ ｓｇＲＮＡにおいて最も低かった（図６）。また、ＣＢＥ変異体において拡張されたｓｇＲＮＡは、ＡＢＥ変異体と比較して標的配列の活性編集ウィンドウを拡張させたが、切断部位の位置には影響がないことを確認した。

また、ＡＢＥとＡＢＥｍａｘは、ほぼ全てのｓｇＲＮＡ長において類似した置換効率を示したのに対し、ｘＡＢＥの置換効率は、ｓｇＲＮＡ長が短いほど増加することが確認された（図６）。

標的別ＡＢＥ変異体のインデル効率はｓｇＲＮＡ長に応じて若干異なるが、その差は１％未満であった。また、ＣＢＥ変異体とは異なり、ＡＢＥ変異体は、ｓｇＲＮＡ長に関係なく安定的に狭い編集ウィンドウを一貫して示した。そして、ＡＢＥ変異体のｓｇＲＮＡは、ｇｘ２１を除いた全てのｓｇＲＮＡ長において増加した標的特異性を確認することができた（図６）。

上記の結果から、ＡＢＥおよびＣＢＥ変異体のｓｇＲＮＡ長の調節により、さらに高い塩基置換効率と所望しない塩基の挿入および／または欠失を排除可能であることが分かる。

実施例３．ＵＧＩ処理に応じたＣＢＥによるランダムインデルの発生頻度の減少を確認
ｎＣａｓ９により誘発された挿入欠失の頻度は、標的に応じて最大６．５％であり、挿入欠失は、主にＣａｓ９依存性標的切断部位であるＰＡＭ配列のアップストリームの３個のヌクレオチド周囲で誘導される（図７）。

本発明者らは、デアミナーゼ（ｄｅａｍｉｎａｓｅ）と結合したｄＣａｓ９を用いて、塩基エディター変異体による意図しない塩基挿入および欠失を十分に除去可能であることを確認した。しかし、塩基エディターにおいてｎＣａｓ９の代わりにｄＣａｓ９を用いる場合、ＣＢＥおよびＡＢＥ変異体の両方とも所望しないインデルの発生を完全に除去することができるが、塩基編集効率が著しく低いという問題がある（図７のｃ－ｆ）。特に、標的に応じて異なるが、ＲＮＦ２を標的とする場合、ＣＢＥ変異体の中でもＡｎｃｄＢＥ４ｍａｘは、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘと比較して編集効率が約９．５倍減少した。

実施例４．ｄＣａｓ９を用いたＣＢＥにおいてランダムインデルの発生頻度の減少を確認
前記実施例３から確認したように、ｄＣａｓ９を用いるＣＢＥ基本エディターにおいてｎＣａｓ９の代わりにｄＣａｓ９を用いると、ＣＢＥおよびＡＢＥ変種によるインデルが減少するが、ｄＣａｓ９は、２つの変異体の両方とも非常に低い塩基置換効率を示した（図１）。このような低い編集効率を克服するために、本発明者らは、塩基エディターにクロマチン調節ペプチド（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ：ＣＭＰ）ドメインを追加して、Ｃａｓ９が標的配列にアクセシビリティを増加させようとした。高－移動性グループヌクレオソーム結合ドメイン１（ｈｉｇｈ－ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ １：ＨＮ１）およびヒストンＨ１中央球状ドメイン（ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ１ ｃｅｎｔｒａｌ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ：Ｈ１Ｇ）を様々な領域に配置して塩基エディター変異体を作製した（図８）。ヒト標的を対象とし、各ＣＢＥとＡＢＥとの間でＣＭＰ構成順による塩基編集効率とインデルの発生頻度を確認した（図９）。

ｄＣａｓ９が含まれた全てのＢＰおよびＡＰ変異体はインデルの発生を除去し、その結果、所望しない塩基挿入および欠失無しに、より正確な塩基編集が可能であることを確認した。具体的に、ＢＰ１ａおよびＢＰ２ｂは、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘよりは低い塩基置換効率を示すが、ｄＡｎｃＢＥ４ｍａｘよりは置換効率に優れ、インデルが発生しなかった。また、ＡＰ１ａおよびＡＰ１ｂは、ｄＡＢＥｍａｘよりは若干高い編集効率を示したが、ＡＢＥｍａｘはインデルの発生頻度が低く、ＡＰ１ａおよびＡＰ１ｂ（ｎＡＰ１ａおよびｎＡＰ１ｂ）にｎＣａｓ９を用いた。その結果、ｎＡＰ１ｂは、標的部位で著しく向上した塩基置換効率を示した。

ＨＥＫ３およびＳｉｔｅ１８を標的とするＢＥ３変異体は、オープンクロマチン構造を標的としており、クロマチンアクセシビリティの増加によるインデルの発生頻度の減少効果が大きくなかった。

実施例５．塩基エディター変異体を用いたＤｍｄ ＫＯ動物モデルの作製および塩基編集効率を確認
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ＤＭＤ）は、３５００－５０００人の男性のうち１人の割合で発見される遺伝疾患であり、筋肉弱化および退行を誘発し、ジストロフィン（Ｄｍｄ）の破壊により発生する。

本発明者らは、ｐｒｅ－ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ（ＣＡＧ＞ＴＡＧ）を作製するためにＤｍｄのｅｘｏｎ ２０に特異的なｓｇＲＮＡを設計し、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）においてＣＢＥおよびＢＰ変異体のＣからＴへの置換能を比較し、全てのＢＰ変異体は、高い編集能と所望しないインデル発生の除去効能を確認した（図１０および図１１）。

具体的に、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘおよびＢＰ２ｂは、対照群としてマウス非標的（ｍｏｕｓｅ ｎｏｎｔａｒｇｅｔ：ＭＮＴ）配列を有するｓｇＲＮＡまたはＤｍｄ（ｐｌｅｎｔｉ－ＭＮＴ－ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ、ｐｌｅｎｔｉ－Ｄｍｄ－ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ、ｐｌｅｎｔｉ－Ｄｍｄ－ＢＰ２ｂ）とともにレンチウイルスにパッキングされた。塩基エディターがパッキングされたレンチウイルスをＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（５×１０^５ ＴＵ／ＴＡ ｍｕｓｃｌｅ）のＰ１～Ｐ３に注射し１、３、および６ヶ月後にＮＧＳおよび組織学的分析を行って遺伝子編集を確認した。

その結果、ＣＢＥ変異体を用いて筋肉細胞株であるＣ２Ｃ１２のＤｍｄ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）遺伝子に終止コドンを生成した際に、ＢＰ１ａ～ＡＰ２ｂのいずれもＢＥ３およびＡｎｃＢＥ４ｍａｘよりも高い効率でＣ ｔｏ Ｔ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎを起こし、所望しないインデルが発生しないことを確認した（図１０）。

また、Ｄｍｄ突然変異（Ｑ８６３＊）Ｃ２Ｃ１２も、ＡＢＥおよびＡＰ変異体でトランスフェクションを行った。ＡＰ２ｂまたはｎＡＰ１ｂは、事前に中止した翻訳を正常に復元可能なＡからＧへの置換に最高の効率性を示した。ｐｌｅｎｔｉ－ＭＮＴ－ＡＢＥｍａｘ、ｐｌｅｎｔｉ－Ｄｍｄ ｒｅｓｃｕｅ－ＡＢＥｍａｘ、ｐｌｅｎｔｉ－Ｄｍｄ ｒｅｓｃｕｅ－ＡＰ２ｂ、またはｎＡＰ１ｂは、レンチウイルスにパッキングされ、ＣＢＥと同一の力価（ｔｉｔｅｒ）でＤｍｄ突然変異（Ｑ８６３＊）マウス出生時に注入された（Ｐ１～Ｐ３）。注入１、３、および６ヶ月後にＮＧＳおよび組織学的分析を行って遺伝子編集を確認した。

以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は、単に好ましい実施態様であるに過ぎず、これによって本発明の範囲が限定されるものではないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義される。

Claims (9)

1. Ｃａｓ９タンパク質、
   １つ以上のクロマチン調節ペプチド（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＣＭＰ）、および
   １つ以上の 核局在化シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ：ＮＬＳ）ペプチドを含む、遺伝子編集用融合タンパク質として、
   前記Ｃａｓ９タンパク質は、ｄｅａｄ Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）で
   前記ＣＭＰは、高－移動性グループヌクレオソーム結合ドメイン１（ｈｉｇｈ－ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ １：ＨＮ１）、または ヒストンＨ１中央球状ドメイン（ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ１ ｃｅｎｔｒａｌ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ：Ｈ１Ｇ） であり、
   前記融合タンパク質は、Ｎ－末端からＣ－末端の順に［ＮＬＳペプチド］－［ＨＮ１］－［Ｃａｓ９タンパク質］－［Ｈ１Ｇ］－［ＮＬＳペプチド］が位置するか、または、Ｎ－末端からＣ－末端の順に［ＮＬＳペプチド］－［ＨＮ１］－［Ｃａｓ９タンパク質］－［ＮＬＳペプチド］－［Ｈ１Ｇ］が位置する、
   前記融合タンパク質は、１つ以上のＵＧＩ（ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ペプチドをさらに含み、
   前記ＵＧＩペプチドは、ｄＣａｓ９タンパク質のＣ－末端に直接的に連結されること、および、
   前記融合タンパク質は、シトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）をさらに含み、
   前記シトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）は、ＨＮ１ドメインのＮ－末端またはＣ－末端に融合したこと、を特徴とする、遺伝子編集用融合タンパク質。
2. 前記融合タンパク質は、Ｎ－末端からＣ－末端の順に［ＮＬＳペプチド］－［ＨＮ１］－［ｄＣａｓ９タンパク質］－［ＵＧＩペプチド］－［ＵＧＩペプチド］－［ＮＬＳペプチド］－［Ｈ１Ｇ］が位置するか、または
   Ｎ－末端からＣ－末端の順に［ＮＬＳペプチド］－［ＨＮ１］－［ｄＣａｓ９タンパク質］－［ＵＧＩペプチド］－［ＵＧＩペプチド］－［Ｈ１Ｇ］－［ＮＬＳペプチド］が位置することを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子編集用融合タンパク質。
3. 請求項１に記載の融合タンパク質、前記融合タンパク質をコード化するプラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡ、または前記プラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡを含むベクターと、
   非標的ＤＮＡ鎖とハイブリダイゼーションして標的ＤＮＡ鎖の切断を誘導するｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）、前記ｓｇＲＮＡの発現が可能なプラスミド、または前記プラスミドを含むベクターと、含む、遺伝子編集用組成物。
4. 前記組成物は、ＵＧＩをさらに含むことを特徴とする、請求項３に記載の遺伝子編集用組成物。
5. 請求項３に記載の遺伝子編集用組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ上で標的核酸配列を含む標的領域（ｒｅｇｉｏｎ）と接触させるステップを含む、遺伝子編集方法。
6. 請求項１に記載の融合タンパク質をコード化するｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を含む、レンチウイルスベクター。
7. 前記ｓｇＲＮＡは、１０～３０ヌクレオチド（ｎｔ）長であることを特徴とする、請求項６に記載のレンチウイルスベクター。
8. 請求項６に記載のレンチウイルスベクターを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、哺乳動物細胞と接触させるステップを含む、形質転換細胞株（ヒト胚を除く）の製造方法。
9. 請求項６に記載のレンチウイルスベクターに感染した形質転換細胞株（ヒト胚を除く）。