JP7539220B2 - Method for Producing 6-Hydroxydaidzein - Google Patents
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Description
本発明は、６－ヒドロキシダイゼインの製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing 6-hydroxydaidzein.
イソフラボン類は腸内細菌によりエクオールに変換されることが知られている。エクオールは女性ホルモン様の生理作用が強いため、更年期症状や骨粗鬆症の予防や改善（特許文献１）、皮膚の老化及びシワの予防や治療（特許文献２）、アレルギー症状の緩和（特許文献３）等への利用が提案されている。 It is known that isoflavones are converted to equol by intestinal bacteria. Because equol has a strong physiological effect similar to that of female hormones, its use has been proposed for preventing and improving menopausal symptoms and osteoporosis (Patent Document 1), preventing and treating skin aging and wrinkles (Patent Document 2), and alleviating allergy symptoms (Patent Document 3).
しかし、イソフラボン類の代謝には個人差があり、イソフラボン類を含む大豆等を摂取しても体内でエクオールを産生できない人も多い。そのため、エクオールの様々な製造方法がこれまでに報告されている。例えば、イソフラボン類を含む培地にβ－シクロデキストリン等を添加し、エクオール生産能を有する微生物を作用させることを特徴とするエクオールの製造法が知られている（特許文献４）。 However, metabolism of isoflavones differs from person to person, and many people are unable to produce equol in their bodies even when they ingest soybeans and other foods containing isoflavones. For this reason, various methods for producing equol have been reported. For example, a method for producing equol is known that involves adding β-cyclodextrin or the like to a medium containing isoflavones and allowing a microorganism capable of producing equol to act on it (Patent Document 4).
また、イソフラボン類の代謝について、これまでに下記のことが知られている。
ダイゼイン配糖体であるダイジン、グリシチン、ゲニスチンは、β－グルコシダーゼ活性により、それぞれ、ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステインに変換される（特許文献５）。このβ－グルコシダーゼ活性を有する微生物として、例えば、ブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）DSM 2950株、ブラウチア・コッコイデス（Blautia coccoides
）DSM 935株、ブラウチア・シンキ（Blautia schinki）DSM 10518株、ユーバクテリウム
・レクタレ（Eubacterium rectale）A1-86株、同M104/1株、同T1-815株、ユーバクテリウム・シラエウム（Eubacterium siraeum）70/3株が知られている（非特許文献１、非特許
文献２）。
Furthermore, the following is known about the metabolism of isoflavones:
Daidzein glycosides, daidzin, glycitin, and genistin, are converted to daidzein, glycitein, and genistein, respectively, by β-glucosidase activity (Patent Document 5). Examples of microorganisms having this β-glucosidase activity include Blautia producta DSM 2950 strain, Blautia coccoides
Known examples of such bacteria include Blautia schinki DSM 935 strain, Blautia schinki DSM 10518 strain, Eubacterium rectale A1-86 strain, Eubacterium rectale M104/1 strain, Eubacterium siraeum T1-815 strain, and Eubacterium siraeum 70/3 strain (Non-Patent Documents 1 and 2).
また、グリシテインは、腸内細菌による脱メチル化により６－ヒドロキシダイゼインに変換される。このような腸内細菌として、ユーバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）が知られている（特許文献５）。 Glycitein is also converted to 6-hydroxydaidzein through demethylation by intestinal bacteria. One such intestinal bacterium is Eubacterium limosum (Patent Document 5).
また、６－ヒドロキシダイゼインやダイゼインは、腸内細菌によりエクオールに変換されることが知られている。このような腸内細菌として、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）に属する微生物や、アドレクラウチア・エクオリファシエン
ス（Adlercreutzia equolifaciens）に属する微生物が知られている（特許文献４、特許
文献５）。
It is also known that 6-hydroxydaidzein and daidzein are converted to equol by intestinal bacteria, such as microorganisms belonging to Asaccharobacter celatus and Adlercreutzia equolifaciens (Patent Documents 4 and 5).
しかし、ブラウチア（Blautia）属に属する微生物が、グリシテインを脱メチル化して
６－ヒドロキシダイゼインを生成することは知られていない。
However, it is not known that microorganisms belonging to the genus Blautia demethylate glycitein to produce 6-hydroxydaidzein.
本発明は、６－ヒドロキシダイゼインの新規製造方法の提供を課題とする。また、好ましい態様では、該製造方法で製造された６－ヒドロキシダイゼインを用いたエクオールの新規製造方法の提供を課題とする。 The present invention aims to provide a new method for producing 6-hydroxydaidzein. In a preferred embodiment, the present invention aims to provide a new method for producing equol using the 6-hydroxydaidzein produced by the above-mentioned production method.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ブラウチア（Blautia）属に属する微生物が、グリシテインから６－ヒドロキシダイゼインを生成する能力を
有することを見出し、本発明を完成させた。本発明は以下のとおりである。
As a result of intensive research aimed at solving the above problems, the present inventors have found that a microorganism belonging to the genus Blautia has the ability to produce 6-hydroxydaidzein from glycitein, and have thus completed the present invention.
〔１〕下記工程（ａ）を含む、６－ヒドロキシダイゼインの製造方法。
工程（ａ）：グリシテインを含有する溶液において、ブラウチア（Blautia）属に属す
る微生物に、グリシテインから６－ヒドロキシダイゼインを生成させる工程
〔２〕前記ブラウチア（Blautia）属に属する微生物が、ブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）に属する微生物、ブラウチア・コッコイデス（Blautia coccoides）に属する微生物、及びブラウチア・シンキ（Blautia schinki）に属する微生物から成る群から
選択される一又は複数の微生物である、〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕前記ブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）に属する微生物が、ブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）JCM 1471株である、〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕前記ブラウチア・コッコイデス（Blautia coccoides）に属する微生物が、ブラウ
チア・コッコイデス（Blautia coccoides）JCM 1395株である、〔２〕又は〔３〕に記載
の製造方法。
〔５〕前記ブラウチア・シンキ（Blautia schinki）に属する微生物が、ブラウチア・シ
ンキ（Blautia schinki）JCM 14657株である、〔２〕～〔４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔６〕前記工程（ａ）と同一の系で行われる下記工程（ｃ）を含む、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の製造方法。
工程（ｃ）：グリシチンを含有する溶液において、グリシチンからグリシテインを生成する能力を有する微生物に、グリシチンからグリシテインを生成させる工程
〔７〕同一の系で行われる下記工程（ａ）及び工程（ｂ）を含む、エクオールの製造方法。
工程（ａ）：グリシテインを含有する溶液において、ブラウチア（Blautia）属に属す
る微生物に、グリシテインから６－ヒドロキシダイゼインを生成させる工程
工程（ｂ）：前記工程（ａ）で生成した６－ヒドロキシダイゼインを含有する溶液において、アサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物、アドレクラウチア（Adlercreutzia）属に属する微生物、ラクトコッカス（Lactococcus）属に属する微生物、
及びエガセラ（Eggerthella）属に属する微生物から成る群から選択される一又は複数の
微生物に、６－ヒドロキシダイゼインからエクオールを生成させる工程
〔８〕前記アサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物が、アサッカロバ
クター・セラツス（Asaccharobacter celatus）に属する微生物である、〔７〕に記載の
製造方法。
〔９〕前記アドレクラウチア（Adlercreutzia）属に属する微生物が、アドレクラウチア
・エクオリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）に属する微生物である、〔７
〕又は〔８〕に記載の製造方法。
〔１０〕前記アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）に属する微生
物が、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株である、
〔８〕又は〔９〕に記載の製造方法。
〔１１〕前記アドレクラウチア・エクオリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens
）に属する微生物が、アドレクラウチア・エクオリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）DSM 19450株である、〔９〕又は〔１０〕に記載の製造方法。
〔１２〕前記ラクトコッカス（Lactococcus）属に属する微生物が、ラクトコッカス・ガ
ルビエ（Lactococcus garvieae）に属する微生物である、〔７〕～〔１１〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１３〕前記エガセラ（Eggerthella）属に属する微生物が、エガセラ・エスピー（Eggerthella sp）YY 7918株である、〔７〕～〔１２〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１４〕前記工程（ａ）及び工程（ｂ）と同一の系で行われる下記工程（ｃ）を含む、〔７〕～〔１３〕のいずれかに記載の製造方法。
工程（ｃ）：グリシチンを含有する溶液において、グリシチンからグリシテインを生成する能力を有する微生物に、グリシチンからグリシテインを生成させる工程
[1] A method for producing 6-hydroxydaidzein, comprising the following step (a):
Step (a): A step of causing a microorganism belonging to the genus Blautia to produce 6-hydroxydaidzein from glycitein in a solution containing glycitein. [2] The production method according to [1], wherein the microorganism belonging to the genus Blautia is one or more microorganisms selected from the group consisting of microorganisms belonging to Blautia producta, microorganisms belonging to Blautia coccoides, and microorganisms belonging to Blautia schinki.
[3] The production method according to [2], wherein the microorganism belonging to Blautia producta is the Blautia producta JCM 1471 strain.
[4] The production method according to [2] or [3], wherein the microorganism belonging to Blautia coccoides is the Blautia coccoides JCM 1395 strain.
[5] The method according to any one of [2] to [4], wherein the microorganism belonging to Blautia schinki is Blautia schinki JCM 14657 strain.
[6] The method according to any one of [1] to [5], further comprising the following step (c) carried out in the same system as the step (a):
Step (c): A step of producing glycitein from glycitin using a microorganism having the ability to produce glycitein from glycitin in a solution containing glycitin. [7] A method for producing equol, comprising the following steps (a) and (b), which are carried out in the same system:
Step (a): A step of producing 6-hydroxydaidzein from glycitein using a microorganism belonging to the genus Blautia in a solution containing glycitein. Step (b): A step of producing 6-hydroxydaidzein from glycitein using a microorganism belonging to the genus Asaccharobacter, a microorganism belonging to the genus Adlercreutzia, a microorganism belonging to the genus Lactococcus, or a microorganism belonging to the genus Lactococcus in a solution containing the 6-hydroxydaidzein produced in the step (a).
and a step (8) of producing equol from 6-hydroxydaidzein using one or more microorganisms selected from the group consisting of microorganisms belonging to the genus Asaccharobacter and microorganisms belonging to the genus Eggerthella. The production method according to item (7), wherein the microorganism belonging to the genus Asaccharobacter is a microorganism belonging to Asaccharobacter celatus.
[9] The microorganism belonging to the genus Adlercreutzia is a microorganism belonging to Adlercreutzia equolifaciens, [7]
］ or the manufacturing method described in [8].
[10] The microorganism belonging to Asaccharobacter celatus is Asaccharobacter celatus DSM 18785 strain.
The manufacturing method according to [8] or [9].
[11] The Adlercreutzia equolifaciens
The method according to claim 9 or 10, wherein the microorganism belonging to the species of Adlercreutzia aequolifaciens is the Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450 strain.
[12] The method according to any one of [7] to [11], wherein the microorganism belonging to the genus Lactococcus is a microorganism belonging to Lactococcus garvieae.
[13] The production method according to any one of [7] to [12], wherein the microorganism belonging to the genus Eggerthella is Eggerthella sp. YY 7918 strain.
[14] The method according to any one of [7] to [13], further comprising the following step (c) which is carried out in the same system as the steps (a) and (b):
Step (c): A step of allowing a microorganism capable of producing glycitein from glycitein to produce glycitein in a solution containing glycitein.
本発明によれば、グリシテインから６－ヒドロキシダイゼインの効率的な製造方法が提供できる。
本発明により得られる６－ヒドロキシダイゼインを、化粧品、医薬部外品、医療用品、衛生用品、医薬品、飲食品（サプリメントを含む。）等に用い、ヒトを含む対象がそれを使用又は摂取等することにより、６－ヒドロキシダイゼインによる公知の効果を簡便に得ることができる。
According to the present invention, there is provided an efficient method for producing 6-hydroxydaidzein from glycitein.
The 6-hydroxydaidzein obtained by the present invention can be used in cosmetics, quasi-drugs, medical supplies, sanitary products, medicines, food and beverages (including supplements), and the like, and subjects including humans can use or ingest them to easily obtain the known effects of 6-hydroxydaidzein.
本発明は、６－ヒドロキシダイゼインの製造方法（第一の発明）、及び該製造方法で製造された６－ヒドロキシダイゼインを用いたエクオールの製造方法（第二の発明）を含む。 The present invention includes a method for producing 6-hydroxydaidzein (first invention), and a method for producing equol using the 6-hydroxydaidzein produced by this method (second invention).
＜１．第一の発明＞
本発明の第一の発明に係る６－ヒドロキシダイゼインの製造方法は、下記工程（ａ）を含む。本発明の第一の発明は、その他の工程を含んでもよい。
<1. First invention>
The method for producing 6-hydroxydaidzein according to the first aspect of the present invention includes the following step (a): The first aspect of the present invention may include other steps.
（１）工程（ａ）
工程（ａ）は、グリシテインを含有する溶液において、ブラウチア（Blautia）属に属
する微生物に、グリシテインから６－ヒドロキシダイゼインを生成させる工程である。
(1) Step (a)
Step (a) is a step of causing a microorganism belonging to the genus Blautia to produce 6-hydroxydaidzein from glycitein in a solution containing glycitein.
（ブラウチア（Blautia）属に属する微生物）
本工程における、グリシテインを含有する溶液においてグリシテインから６－ヒドロキシダイゼインを生成する微生物は、ブラウチア（Blautia）属に属する微生物である。そ
の中でも、ブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）に属する微生物、ブラウチア・コッコイデス（Blautia coccoides）に属する微生物、ブラウチア・シンキ（Blautia schinki）に属する微生物が好ましい。また、それらの中でも、ブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）JCM 1471株、ブラウチア・コッコイデス（Blautia coccoides）JCM 1395株、ブラウチア・シンキ（Blautia schinki）JCM 14657株がより好ましい。
本工程におけるブラウチア（Blautia）属に属する微生物としては、１種でも２種以上
を用いてもよく、１株でも２株以上を用いてもよい。
(Microorganisms belonging to the genus Blautia)
In this step, the microorganisms that produce 6-hydroxydaidzein from glycitein in a solution containing glycitein are microorganisms belonging to the genus Blautia. Among them, microorganisms belonging to Blautia producta, Blautia coccoides, and Blautia schinki are preferred. Among them, Blautia producta JCM 1471 strain, Blautia coccoides JCM 1395 strain, and Blautia schinki JCM 14657 strain are more preferred.
As the microorganism belonging to the genus Blautia in this step, one or more kinds may be used, and one or more strains may be used.
JCM番号が付与された微生物は、Japan Collection of Microorganisms（国立研究開発
法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室、郵便番号：305-0074、住所：茨城県つくば市高野台3-1-1）から入手することができる。
Microorganisms that have been assigned JCM numbers can be obtained from the Japan Collection of Microorganisms (RIKEN BioResource Center, Microbial Materials Division, 3-1-1 Takanodai, Tsukuba, Ibaraki Prefecture, Japan, 305-0074).
ブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）JCM 1471株は、それと実質的に同等の菌株であってもよい。実質的に同等の菌株とは、グリシテインから６－ヒドロキシダイゼインを生成する能力を有するブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）に属する微生物と同属又は同種の微生物であって、当該菌株と同程度の高い６－ヒドロキシダイゼイン生成能を有する菌株をいう。また、その16S rRNA遺伝子の塩基配列が、当該菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列と９８％以上、好ましくは９９％以上、より好ましくは１００％の相同性を有し、且つ、好ましくは当該菌株と同一の菌学的性質を有する。さらに、当該菌株は、当該菌株又はそれと実質的に同等の菌株から、変異処理、遺伝子組換え、自然変異株の選択等によって育種された菌株であってもよい。
このことは、ブラウチア・コッコイデス（Blautia coccoides）JCM 1395株、ブラウチ
ア・シンキ（Blautia schinki）JCM 14657株についても同様である。
The Blautia producta JCM 1471 strain may be a strain substantially equivalent thereto. The term "substantially equivalent strain" refers to a microorganism of the same genus or species as a microorganism belonging to Blautia producta having the ability to produce 6-hydroxydaidzein from glycitein, and having the same high level of 6-hydroxydaidzein production ability as the said strain. The base sequence of the 16S rRNA gene has a homology of 98% or more, preferably 99% or more, more preferably 100% with the base sequence of the 16S rRNA gene of the said strain, and preferably has the same mycological properties as the said strain. Furthermore, the said strain may be a strain bred from the said strain or a strain substantially equivalent thereto by mutation treatment, genetic recombination, selection of natural mutants, or the like.
The same is true for Blautia coccoides JCM 1395 strain and Blautia schinki JCM 14657 strain.
（ブラウチア（Blautia）属に属する微生物の静止菌体）
ブラウチア（Blautia）属に属する微生物は、その静止菌体を含む。静止菌体とは、培
養した微生物から遠心分離等の操作により培地成分を取り除き、塩溶液や緩衝液で洗浄し、該洗浄液と同一の液に懸濁した菌体であって、増殖しない状態の菌体を指し、本発明の第一の発明においては、少なくとも、グリシテインから６－ヒドロキシダイゼインを生成できる代謝系を有している菌体をいう。塩溶液としては生理食塩水等が好ましい。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス－塩酸緩衝液、クエン酸－リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、MOPS緩衝液、酢酸緩衝液、グリシン緩衝液等が好ましい。緩衝液のｐＨや濃度は、常法に従い適宜調製できる。
(Resting cells of microorganisms belonging to the genus Blautia)
Microorganisms belonging to the genus Blautia include resting bacterial cells. The term "resting bacterial cells" refers to bacterial cells that are not growing after removing medium components from a cultured microorganism by an operation such as centrifugation, washing with a salt solution or buffer, and suspending in the same liquid as the washing liquid. In the first aspect of the present invention, the term refers to bacterial cells that have at least a metabolic system capable of producing 6-hydroxydaidzein from glycitein. Physiological saline and the like are preferable as the salt solution. As the buffer solution, phosphate buffer, Tris-HCl buffer, citrate-phosphate buffer, citrate buffer, MOPS buffer, acetate buffer, glycine buffer, and the like are preferable. The pH and concentration of the buffer solution can be appropriately adjusted according to a conventional method.
（グリシテインを含有する溶液）
グリシテインを含有する溶液とは、該溶液において、ブラウチア（Blautia）属に属す
る微生物に、グリシテインから６－ヒドロキシダイゼインを生成させることができるものであれば特に制限されない。好ましくは培地であり、より好ましくは後述する「培地、及び培養による６－ヒドロキシダイゼインの生成」欄に記載した培地である。また、ブラウチア（Blautia）属に属する微生物が静止菌体である場合には、前述した塩溶液や緩衝液
が好ましい。
本明細書に記載されている「培地」とは、いずれも、最少培地を含む、微生物が増殖できる溶液をいい、微生物が増殖できない溶液、例えば、前述した塩溶液や緩衝液などを含まないものとする。
(Solution containing glycitein)
The solution containing glycitein is not particularly limited as long as it allows the microorganism belonging to the genus Blautia to produce 6-hydroxydaidzein from glycitein in the solution. A medium is preferred, and a medium described in the section "Medium and production of 6-hydroxydaidzein by culture" below is more preferred. In addition, when the microorganism belonging to the genus Blautia is in the form of resting cells, the above-mentioned salt solution or buffer solution is preferred.
The term "culture medium" as used herein refers to a solution in which microorganisms can grow, including minimal medium, and does not include solutions in which microorganisms cannot grow, such as the above-mentioned salt solutions and buffer solutions.
該溶液又はその溶媒へグリシテインを添加する場合には、６－ヒドロキシダイゼインの生成前に添加しても、その途中で添加してもよく、また、一括添加、逐次添加、連続添加でもよい。
溶液中のグリシテインの含有量は、通常０．０１ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１ｇ／Ｌ以上である。一方、通常１００ｇ／Ｌ以下、好ましくは２０ｇ／Ｌ以下、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以下である。
When glycitein is added to the solution or its solvent, it may be added before or during the formation of 6-hydroxydaidzein, and may be added all at once, gradually, or continuously.
The content of glycitein in the solution is usually 0.01 g/L or more, preferably 0.1 g/L or more, more preferably 1 g/L or more, and usually 100 g/L or less, preferably 20 g/L or less, more preferably 10 g/L or less.
（培地、及び培養による６－ヒドロキシダイゼインの生成）
工程（ａ）では、前記溶液が培地であることが好ましい。該培地は特に限定されないが、例えば、Oxoid社製のANAEROBE BASAL BROTH（ABB培地）、Oxoid社製のWilkins-Chalgren Anaerobe Broth（CM0643）、日水製薬株式会社製のGAM培地、変法GAM培地、ブレインハートインヒュージョン培地等を使用することができる。
(Medium and production of 6-hydroxydaidzein by culture)
In step (a), the solution is preferably a medium. The medium is not particularly limited, but examples thereof include ANAEROBE BASAL BROTH (ABB medium) manufactured by Oxoid, Wilkins-Chalgren Anaerobe Broth (CM0643) manufactured by Oxoid, GAM medium, modified GAM medium, and brain heart infusion medium manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
また、培地に水溶性の有機物を炭素源として加えることができる。水溶性の有機物として、以下の化合物を挙げることができる。すなわち、グルコース、アラビノース、ソルビトール、フラクトース、マンノース、スクロース、トレハロース、キシロースなどの糖類；グリセロールなどのアルコール類；吉草酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、ギ酸、フマル
酸などの有機酸類などを挙げることが出来る。
Water-soluble organic matter can be added to the medium as a carbon source. Examples of water-soluble organic matter include the following compounds: sugars such as glucose, arabinose, sorbitol, fructose, mannose, sucrose, trehalose, and xylose; alcohols such as glycerol; and organic acids such as valeric acid, butyric acid, propionic acid, acetic acid, formic acid, and fumaric acid.
炭素源としての培地に加える有機物の濃度は、効率的に発育させるために適宜調節することができる。一般的には、０．１～１０ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲から添加量を選択することができる。 The concentration of organic matter added to the medium as a carbon source can be adjusted appropriately to ensure efficient growth. In general, the amount added can be selected from the range of 0.1 to 10 wt/vol%.
前記の炭素源に加えて、培地に窒素源を加えることができる。窒素源としては通常の発酵に用いうる各種の窒素化合物を用いることができる。
好ましい無機窒素源として、アンモニウム塩、硝酸塩などを、より好ましくは、硫安、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、硝酸カリウム及び硝酸ソーダなどを挙げることが出来る。
また、有機窒素源としては、アミノ酸類、酵母エキス、ペプトン類（例えばポリペプトンＮ、大豆ペプトンなど）、肉エキス（例えばエールリッヒカツオエキス、ラブ－レムコ末、ブイヨンなど）、魚介類エキス、肝臓エキス、消化血清末、魚油などを挙げることが出来る。
In addition to the carbon sources, a nitrogen source may be added to the medium, and various nitrogen compounds that can be used in normal fermentation may be used as the nitrogen source.
Preferred inorganic nitrogen sources include ammonium salts and nitrates, and more preferred are ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium hydrogen phosphate, potassium nitrate, and sodium nitrate.
Examples of organic nitrogen sources include amino acids, yeast extract, peptones (e.g., polypeptone N, soybean peptone, etc.), meat extracts (e.g., Ehrlich bonito extract, Lab-Remco powder, bouillon, etc.), seafood extracts, liver extracts, digestive serum powder, fish oil, etc.
さらに、炭素源や窒素源に加えて、例えば、ビタミンなどの補因子や各種の塩類等の無機化合物を培地に加えることによって、増殖や活性を増強できる場合もある。たとえば無機化合物、ビタミン類、脂肪酸など、動植物由来の微生物増殖補助因子として以下のものを挙げることができる。 In addition to carbon and nitrogen sources, growth and activity can sometimes be enhanced by adding cofactors such as vitamins and inorganic compounds such as various salts to the medium. For example, the following are examples of microbial growth cofactors derived from plants and animals, such as inorganic compounds, vitamins, and fatty acids.
無機化合物 ビタミン類
リン酸二水素カリウム ビオチン
硫酸マグネシウム 葉酸
硫酸マンガン ピリドキシン
塩化ナトリウム チアミン
塩化コバルト リボフラビン
塩化カルシウム ニコチン酸
硫酸亜鉛 パントテン酸
硫酸銅 ビタミンＢ１２
明ばん チオオクト酸
モリブデン酸ソーダ ｐ－アミノ安息香酸
塩化カリウム ビタミンＫ
ホウ酸等
塩化ニッケル
タングステン酸ナトリウム
セレン酸ナトリウム
硫酸第一鉄アンモニウム
酢酸ナトリウム三水和物
硫酸マグネシウム七水和物
硫酸マンガン四水和物
Inorganic compounds Vitamins Potassium dihydrogen phosphate Biotin Magnesium sulfate Folic acid Manganese sulfate Pyridoxine Sodium chloride Thiamine Cobalt chloride Riboflavin Calcium chloride Nicotinic acid Zinc sulfate Pantothenic acid Copper sulfate Vitamin B12
Alum, Thiooctic acid, Sodium molybdate, p-aminobenzoic acid, Potassium chloride, Vitamin K
Boric acid, etc. Nickel chloride Sodium tungstate Sodium selenate Ammonium ferrous sulfate Sodium acetate trihydrate Magnesium sulfate heptahydrate Manganese sulfate tetrahydrate
また、培地中に、微生物の生育を良好にするために、システイン、シスチン、硫化ナトリウム、亜硫酸塩、アスコルビン酸、グルタチオン、チオグリコール酸、ルチンなどの還元剤や、カタラーゼ、スーパーオキシドムターゼなどの活性酸素種を分解する酵素を添加することができる。 In addition, reducing agents such as cysteine, cystine, sodium sulfide, sulfite, ascorbic acid, glutathione, thioglycolic acid, and rutin, as well as enzymes that break down reactive oxygen species such as catalase and superoxide mutase, can be added to the medium to promote good microbial growth.
培養中の気相及び水相は、空気又は酸素を含まないことが好ましく、例えば、窒素及び／又は水素を任意の比率で含むことや、窒素及び／又は二酸化炭素を任意の比率で含むことが挙げられ、水素を含む気相や水相であることが好ましい。気相における水素の割合は
、６－ヒドロキシダイゼインの生成が促進されることから、通常０．５％以上、好ましくは１．０％以上、より好ましくは２．０％以上であり、一方、通常１００％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下である。
培養中の気相及び水相をこのような環境にする方法は特に制限されないが、例えば、培養前に前記ガスで気相を置換する方法、これに加えて、培養中も培養器の底部から前記ガスを供給する及び／又は培養器の気相部に前記ガスを供給する方法、培養前に前記ガスで水相をバブリングするなどの方法をとることが出来る。前記水素は、水素ガスをそのまま用いてもよい。また、培地にギ酸及び／又はその塩などの水素の原料を添加し、微生物の作用により培養中に水素を生成してもよい。
The gas phase and aqueous phase during culture preferably do not contain air or oxygen, and may, for example, contain nitrogen and/or hydrogen in any ratio, or may contain nitrogen and/or carbon dioxide in any ratio, and are preferably gas phase and aqueous phase containing hydrogen. The proportion of hydrogen in the gas phase is usually 0.5% or more, preferably 1.0% or more, more preferably 2.0% or more, since this promotes the production of 6-hydroxydaidzein, and is usually 100% or less, preferably 20% or less, more preferably 10% or less.
The method for creating such an environment for the gas phase and aqueous phase during culture is not particularly limited, but examples of the method include replacing the gas phase with the gas before culture, supplying the gas from the bottom of the culture vessel and/or supplying the gas to the gas phase part of the culture vessel during culture, and bubbling the aqueous phase with the gas before culture. As the hydrogen, hydrogen gas may be used as it is. Alternatively, a source of hydrogen such as formic acid and/or a salt thereof may be added to the culture medium, and hydrogen may be generated during culture by the action of the microorganism.
前記ガスの通気量としては、通常０．００５～２ｖｖｍであり、０．０５～０．５ｖｖｍが好ましい。また、混合ガスはナノバブルとして供給することもできる。
ブラウチア（Blautia）属に属する微生物の培養温度は、通常２０～４５℃、より好ま
しくは２５～４０℃、さらに好ましくは３０～３７℃である。
培養器の加圧条件は、生育できる条件であれば特に限定されるものではないが、通常０．００１～１ＭＰａ、好ましくは０．０１～０．５ＭＰａである。
培養時間としては、通常８～３４０時間、好ましくは１２～１７０時間、より好ましくは１６～１２０時間である。
The amount of gas passed through the gas supply passage is usually 0.005 to 2 vvm, and preferably 0.05 to 0.5 vvm. The mixed gas may also be supplied in the form of nanobubbles.
The culture temperature for microorganisms belonging to the genus Blautia is usually 20 to 45°C, more preferably 25 to 40°C, and even more preferably 30 to 37°C.
The pressurization conditions for the culture vessel are not particularly limited as long as they allow growth, but are usually 0.001 to 1 MPa, preferably 0.01 to 0.5 MPa.
The culture time is usually 8 to 340 hours, preferably 12 to 170 hours, and more preferably 16 to 120 hours.
また、培養液に界面活性剤や吸着剤、包摂化合物などを添加することにより、６－ヒドロキシダイゼインの生成を促進できる場合がある。
界面活性剤としては、例えばTween 80等が挙げられ、濃度として０．００１～１０ｇ／Ｌ以下とすることができる。
吸着剤としては、例えば、セルロース及びその誘導体；デキストリン；三菱化学株式会社製の疎水吸着剤であるダイアイオンHPシリーズやセパビーズシリーズ；オルガノ株式会社製のアンバーライトXADシリーズなどが挙げられる。
In addition, the production of 6-hydroxydaidzein may be promoted by adding a surfactant, adsorbent, inclusion compound, etc. to the culture medium.
The surfactant may be, for example, Tween 80, and the concentration may be 0.001 to 10 g/L.
Examples of the adsorbent include cellulose and its derivatives; dextrin; hydrophobic adsorbents such as the Diaion HP series and Sepabeads series manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation; and the Amberlite XAD series manufactured by Organo Corporation.
包摂化合物としては、例えば、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン、クラスターデキストリン（高度分岐環状デキストリン）、及びこれらの類縁体でもよい。例えば、メチル－β－シクロデキストリン、トリメチル－β－シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンなどが挙げられる。これらの中で、γ－シクロデキストリンが最も効果的である場合がある。また、２種以上の包摂化合物を共存させることにより、６－ヒドロキシダイゼインの生成を更に促進できる場合がある。
包摂化合物の添加量は、グリシテインに対し、モル比の総量で、通常０．１当量以上、好ましくは０．５当量以上、より好ましくは１．０当量以上であり、一方、通常５．０当量以下、好ましくは２．５当量以下、より好ましくは２．０当量以下である。
Examples of the inclusion compound include α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, γ-cyclodextrin, cluster dextrin (highly branched cyclic dextrin), and analogs thereof. Examples include methyl-β-cyclodextrin, trimethyl-β-cyclodextrin, and hydroxypropyl-β-cyclodextrin. Of these, γ-cyclodextrin may be the most effective. In addition, the coexistence of two or more types of inclusion compounds may further promote the production of 6-hydroxydaidzein.
The amount of the inclusion compound added is, in total, in a molar ratio relative to glycitein, usually 0.1 equivalents or more, preferably 0.5 equivalents or more, more preferably 1.0 equivalents or more, and is usually 5.0 equivalents or less, preferably 2.5 equivalents or less, more preferably 2.0 equivalents or less.
（静止菌体による６－ヒドロキシダイゼインの生成）
ブラウチア（Blautia）属に属する微生物が静止菌体である場合の溶液は、前記培地の
代わりに、前述した「ブラウチア（Blautia）属に属する微生物の静止菌体」欄に記載し
た塩溶液や緩衝液が好ましい。その他の条件については、前記「培地、及び培養による６－ヒドロキシダイゼインの生成」欄の記載を援用する。
(6-hydroxydaidzein production by resting cells)
When the microorganism belonging to the genus Blautia is in the form of resting cells, the solution is preferably a salt solution or a buffer solution as described in the above section "Resting cells of microorganisms belonging to the genus Blautia" instead of the medium. For other conditions, the descriptions in the above section "Medium and production of 6-hydroxydaidzein by culture" are used.
（グリシテイン）
グリシテインは、どのような方法により調製されたものでもよい。例えば、化学合成法や発酵法により合成したものが挙げられる。本発明の第一の発明で製造される６－ヒドロキシダイゼインを飲食品として利用する場合には、飲食品もしくは飲食品素材を原料にして、発酵法や酵素法により調製したグリシテインを利用することが望ましい。
(Glycitein)
Glycitein may be prepared by any method. For example, it may be prepared by chemical synthesis or fermentation. When 6-hydroxydaidzein produced by the first aspect of the present invention is used as a food or drink, it is preferable to use glycitein prepared by fermentation or enzymatic methods using food or drink or food or drink ingredients as a raw material.
発酵法としては、グリシテインの原料を含有する溶液において、グリシテインの原料からグリシテインを生成する能力を有する微生物に、グリシテインの原料からグリシテインを生成させる方法が挙げられる。
グリシテインの原料としては、例えば、グリシチンが挙げられる。グリシチンからグリシテインを生成する能力を有する微生物としては、β－グルコシダーゼ活性を有する微生物であればよい。β－グルコシダーゼ活性を有する微生物としては、例えば、非特許文献１、非特許文献２に記載されているように、ブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）DSM 2950株、ブラウチア・コッコイデス（Blautia coccoides）DSM 935株、ブラウチア・シンキ（Blautia schinki）DSM 10518株、ユーバクテリウム・レクタレ（Eubacterium rectale）A1-86株、同M104/1株、同T1-815株、ユーバクテリウム・シラエウム（Eubacterium siraeum）70/3株などが挙げられる。
The fermentation method includes a method in which a microorganism capable of producing glycitein from the raw material of glycitein is allowed to produce glycitein from the raw material of glycitein in a solution containing the raw material of glycitein.
An example of a raw material for glycitein is glycitin. Microorganisms capable of producing glycitein from glycitin may be any microorganism having β-glucosidase activity. Examples of microorganisms having β-glucosidase activity include Blautia producta DSM 2950 strain, Blautia coccoides DSM 935 strain, Blautia schinki DSM 10518 strain, Eubacterium rectale A1-86 strain, Eubacterium rectale M104/1 strain, Eubacterium siraeum T1-815 strain, and Eubacterium siraeum 70/3 strain, as described in Non-Patent Documents 1 and 2.
（工程（ａ）の前に含んでもよい工程）
発酵法によりグリシテインを生成後、該グリシテインを分離及び／又は精製して、工程（ａ）のグリシテインとして工程（ａ）に適用することもできるが、分離及び／又は精製せず、該グリシテインを含む溶液をそのまま、又は、希釈もしくは濃縮後に、工程（ａ）のグリシテインとして工程（ａ）に適用することもできる。
すなわち、本発明の第一の発明は、前記工程（ａ）の前に、該工程（ａ）が行われる系とは別の系で行われる、下記工程（ｐｒｅ－ａ´）及び（ｐｒｅ－ａ´´）をこの順に含んでもよく、又は、下記工程（ｐｒｅ－ａ´）及び（ｐｒｅ－ａ´´´）をこの順に含んでもよい。
工程（ｐｒｅ－ａ´）：グリシチンを含有する溶液において、グリシチンからグリシテインを生成する能力を有する微生物に、グリシチンからグリシテインを生成させる工程
工程（ｐｒｅ－ａ´´）：工程（ｐｒｅ－ａ´）で生成したグリシテインを分離及び／又は精製し、該分離及び／又は精製されたグリシテインを、工程（ａ）のグリシテインとして、工程（ａ）に適用する工程
工程（ｐｒｅ－ａ´´´）：工程（ｐｒｅ－ａ´）で生成したグリシテインを含む溶液をそのまま又は希釈もしくは濃縮後に、工程（ａ）のグリシテインとして、工程（ａ）に適用する工程
(Steps that may be included before step (a))
After producing glycitein by a fermentation method, the glycitein can be separated and/or purified and used as the glycitein in step (a) of the process; however, the glycitein-containing solution can be used as the glycitein in step (a) of the process without separation and/or purification, either directly or after dilution or concentration.
That is, the first invention of the present invention may include the following steps (pre-a') and (pre-a") in this order, which are performed in a system separate from the system in which the step (a) is performed, before the step (a), or may include the following steps (pre-a') and (pre-a'") in this order.
Step (pre-a'): A step of causing a microorganism capable of producing glycitein from glycitein in a solution containing glycitein to produce glycitein from glycitein. Step (pre-a"'): A step of separating and/or purifying the glycitein produced in step (pre-a') and applying the separated and/or purified glycitein to step (a) as the glycitein of step (a). Step (pre-a'"'): A step of applying the solution containing the glycitein produced in step (pre-a') to step (a) as the glycitein of step (a) as it is or after dilution or concentration.
（２）工程（ｃ）
本発明の第一の発明である６－ヒドロキシダイゼインの製造方法は、前記工程（ａ）と同一の系で行われる下記工程（ｃ）を含むことが好ましい。
工程（ｃ）は、グリシチンを含有する溶液において、グリシチンからグリシテインを生成する能力を有する微生物に、グリシチンからグリシテインを生成させる工程である。
(2) Step (c)
The method for producing 6-hydroxydaidzein according to the first aspect of the present invention preferably includes the following step (c) which is carried out in the same system as the step (a).
Step (c) is a step of allowing a microorganism capable of producing glycitein from glycitein to produce glycitein in a solution containing glycitein.
（同一の系）
工程（ａ）及び（ｃ）が同一の系で行われるとは、工程（ｃ）において、グリシチンを含有する溶液において、グリシチンからグリシテインを生成する能力を有する微生物により、グリシチンからグリシテインが生成されてから、該生成したグリシテインが工程（ａ）のグリシテインとしてそのまま用いられて、工程（ａ）において６－ヒドロキシダイゼインが生成されるまでの一連の流れが、同一の系で連続して行われることをいう。すなわち、工程（ｃ）と工程（ａ）の間に、例えば、工程（ｃ）で生成したグリシテインを分離及び／又は精製する工程などを含まないことをいう。
(same system)
The phrase "steps (a) and (c) are carried out in the same system" means that a series of steps from the production of glycitein from glycitein in a solution containing glycitein in step (c) by a microorganism capable of producing glycitein from glycitein, to the production of 6-hydroxydaidzein in step (a) are carried out continuously in the same system, with the glycitein thus produced being used as is as the glycitein in step (a). In other words, this means that no step of separating and/or purifying the glycitein produced in step (c) is included between step (c) and step (a).
具体的には、グリシチンからグリシテインを生成する能力を有する微生物とブラウチア（Blautia）属に属する微生物とを同じ培養液に植菌し、培養することにより、６－ヒド
ロキシダイゼインを生成することなどが挙げられる。両微生物は同一の微生物でもよいし、異なる微生物でもよい。
Specifically, a microorganism capable of producing glycitein from glycitin and a microorganism belonging to the genus Blautia are inoculated into the same culture medium and cultured to produce 6-hydroxydaidzein. Both microorganisms may be the same or different.
（グリシチン）
グリシチンは、どのような方法により調製されたものでもよい。グリシチンの原料、さらにはその原料、それ以降についても同様である。例えば、化学合成法や発酵法により合成したものが挙げられる。ただし、本発明の第一の発明で製造される６－ヒドロキシダイゼインを飲食品として利用する場合には、発酵法や酵素法により得られたグリシチンを利用することが望ましい。
(Glycitin)
Glycitin may be prepared by any method. The same applies to the raw material of glycitin, and further raw materials thereafter. For example, glycitin may be synthesized by a chemical synthesis method or a fermentation method. However, when the 6-hydroxydaidzein produced by the first invention of the present invention is used as a food or drink, it is preferable to use glycitin obtained by a fermentation method or an enzymatic method.
（その他の工程）
本発明の第一の発明は、以下の工程を含んでもよい。
本発明の第一の発明は、例えば、得られた６－ヒドロキシダイゼインを定量する工程を含んでもよい。定量方法は常法に従うことができる。たとえば、培養液の一部を採取して適宜希釈し、よく撹拌した後、ポリテロラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜などの膜を使用して濾過し、不溶物を除去したものを高速液体クロマトグラフィーで定量することなどが挙げられる。
(Other processes)
The first aspect of the present invention may include the following steps.
The first aspect of the present invention may include, for example, a step of quantifying the amount of 6-hydroxydaidzein obtained. The quantification method may be a conventional method. For example, a part of the culture solution may be sampled, appropriately diluted, thoroughly stirred, and then filtered using a membrane such as a polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane to remove insoluble matter, followed by quantifying the amount by high performance liquid chromatography.
また、本発明の第一の発明は、得られた６－ヒドロキシダイゼインを回収する工程を含んでもよい。当該回収工程は、精製工程や濃縮工程等を含む。精製工程における精製処理としては、熱などによる微生物の殺菌；精密濾過（ＭＦ）、限外濾過（ＵＦ）などによる除菌；固形物、高分子物質の除去；有機溶媒やイオン性液体などによる抽出；疎水性吸着剤、イオン交換樹脂、活性炭カラム等を用いた吸着、脱色といった処理を行うことができる。また、濃縮工程における濃縮処理としては、エバポレーター、逆浸透膜等による濃縮が挙げられる。
さらに、６－ヒドロキシダイゼインを含む溶液は、凍結乾燥、噴霧乾燥などにより粉末化することができる。粉末化において、ラクトース、デキストリン、コーンスターチ等の賦形剤を添加することもできる。
The first aspect of the present invention may also include a step of recovering the 6-hydroxydaidzein obtained. The recovery step includes a purification step, a concentration step, and the like. Examples of purification treatments in the purification step include sterilization of microorganisms by heat or the like; sterilization by microfiltration (MF), ultrafiltration (UF), and the like; removal of solids and polymeric substances; extraction with an organic solvent, an ionic liquid, and the like; and adsorption and decolorization using a hydrophobic adsorbent, an ion exchange resin, an activated carbon column, and the like. Examples of concentration treatments in the concentration step include concentration using an evaporator, a reverse osmosis membrane, and the like.
Furthermore, a solution containing 6-hydroxydaidzein can be powdered by freeze-drying, spray-drying, etc. In the powdering process, an excipient such as lactose, dextrin, corn starch, etc. can be added.
＜２．第二の発明＞
本発明の第二の発明に係るエクオールの製造方法は、同一の系で行われる下記工程（ａ）及び工程（ｂ）を含む。本発明の第二の発明は、その他の工程を含んでもよい。
<2. Second Invention>
The method for producing equol according to the second aspect of the present invention comprises the following steps (a) and (b) which are carried out in the same system. The second aspect of the present invention may also include other steps.
（１）工程（ａ）
工程（ａ）は、グリシテインを含有する溶液において、ブラウチア（Blautia）属に属
する微生物に、グリシテインから６－ヒドロキシダイゼインを生成させる工程である。
工程（ａ）については、本発明の第一の発明における工程（ａ）の説明を援用する。
(1) Step (a)
Step (a) is a step of causing a microorganism belonging to the genus Blautia to produce 6-hydroxydaidzein from glycitein in a solution containing glycitein.
For step (a), the explanation of step (a) in the first aspect of the present invention is cited.
（２）工程（ｂ）
工程（ｂ）は、前記工程（ａ）で生成した６－ヒドロキシダイゼインを含有する溶液において、アサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物、アドレクラウチア
（Adlercreutzia）属に属する微生物、ラクトコッカス（Lactococcus）属に属する微生物、及びエガセラ（Eggerthella）属に属する微生物から成る群から選択される一又は複数
の微生物に、６－ヒドロキシダイゼインからエクオールを生成させる工程である。
(2) Step (b)
Step (b) is a step of producing equol from 6-hydroxydaidzein in a solution containing the 6-hydroxydaidzein produced in step (a) using one or more microorganisms selected from the group consisting of microorganisms belonging to the genus Asaccharobacter, microorganisms belonging to the genus Adlercreutzia, microorganisms belonging to the genus Lactococcus, and microorganisms belonging to the genus Eggerthella.
（６－ヒドロキシダイゼインからエクオールを生成する微生物）
本工程における、６－ヒドロキシダイゼインを含有する溶液において、６－ヒドロキシダイゼインからエクオールを生成する微生物は、アサッカロバクター（Asaccharobacter
）属に属する微生物、アドレクラウチア（Adlercreutzia）属に属する微生物、ラクトコ
ッカス（Lactococcus）属に属する微生物、及びエガセラ（Eggerthella）属に属する微生物から成る群から選択される一又は複数の微生物である。
(Microorganisms that produce equol from 6-hydroxydaidzein)
In this step, the microorganism that produces equol from 6-hydroxydaidzein in the solution containing 6-hydroxydaidzein is Asaccharobacter
The microorganisms are one or more microorganisms selected from the group consisting of microorganisms belonging to the genus Lactococcus, microorganisms belonging to the genus Adlercreutzia, microorganisms belonging to the genus Lactococcus, and microorganisms belonging to the genus Eggerthella.
アサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物としては、アサッカロバク
ター・セラツス（Asaccharobacter celatus）に属する微生物が好ましく、アサッカロバ
クター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株がより好ましい。
As the microorganism belonging to the genus Asaccharobacter, a microorganism belonging to Asaccharobacter celatus is preferable, and Asaccharobacter celatus DSM 18785 strain is more preferable.
アドレクラウチア（Adlercreutzia）属に属する微生物としては、アドレクラウチア・
エクオリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）に属する微生物が好ましく、ア
ドレクラウチア・エクオリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）DSM 19450株がより好ましい。
Microorganisms belonging to the genus Adlercreutzia include Adlercreutzia
Microorganisms belonging to the genus Adlercreutzia equolifaciens are preferred, and the Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450 strain is more preferred.
ラクトコッカス（Lactococcus）属に属する微生物としては、ラクトコッカス・ガルビ
エ（Lactococcus garvieae）に属する微生物が好ましく、ラクトコッカス・ガルビエ（Lactococcus garvieae）20-92株がより好ましい。
As the microorganism belonging to the genus Lactococcus, a microorganism belonging to Lactococcus garvieae is preferred, and Lactococcus garvieae strain 20-92 is more preferred.
エガセラ（Eggerthella）属に属する微生物としては、エガセラ・エスピー（Eggerthella sp）に属する微生物が好ましく、エガセラ・エスピー（Eggerthella sp）YY 7918株がより好ましい。 As microorganisms belonging to the genus Eggerthella, microorganisms belonging to Eggerthella sp. are preferred, and Eggerthella sp. YY 7918 strain is more preferred.
DSM番号が付与された微生物は、DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) に保存されている微生物であり、同機関から入手することができる微生物である。
本工程における、６－ヒドロキシダイゼインからエクオールを生成する微生物としては、上記微生物のうち１種でも２種以上を用いてもよく、１株でも２株以上を用いてもよい。
Microorganisms that have been assigned DSM numbers are those that are stored at and available from the DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH).
In this step, the microorganism that produces equol from 6-hydroxydaidzein may be one or more of the above-mentioned microorganisms, and one or more strains may be used.
アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株は、それと実質的に同等の菌株であってもよい。実質的に同等の菌株とは、６－ヒドロキシダイゼインからエクオールを生成する能力を有するアサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）に属する微生物と同属又は同種の微生物であって、当該菌株と同程度の高い
エクオール生成能を有する菌株をいう。また、その16S rRNA遺伝子の塩基配列が、当該菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列と９８％以上、好ましくは９９％以上、より好ましくは１００％の相同性を有し、且つ、好ましくは当該菌株と同一の菌学的性質を有する。さらに、当該菌株は、当該菌株又はそれと実質的に同等の菌株から、変異処理、遺伝子組換え、自然変異株の選択等によって育種された菌株であってもよい。
このことは、アドレクラウチア・エクオリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）DSM 19450株、エガセラ・エスピー（Eggerthella sp）YY 7918株についても同様であ
る。
The Asaccharobacter celatus DSM 18785 strain may be a strain substantially equivalent thereto. The term "substantially equivalent strain" refers to a microorganism of the same genus or species as a microorganism belonging to Asaccharobacter celatus having the ability to produce equol from 6-hydroxydaidzein, and having the same level of equol production ability as the said strain. In addition, the base sequence of the 16S rRNA gene has 98% or more, preferably 99% or more, more preferably 100% homology with the base sequence of the 16S rRNA gene of the said strain, and preferably has the same bacteriological properties as the said strain. Furthermore, the said strain may be a strain bred from the said strain or a strain substantially equivalent thereto by mutation treatment, genetic recombination, selection of natural mutants, or the like.
The same is true for Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450 strain and Eggerthella sp. YY 7918 strain.
（６－ヒドロキシダイゼインからエクオールを生成する微生物の静止菌体）
６－ヒドロキシダイゼインからエクオールを生成する微生物は、その静止菌体を含む。当該静止菌体については、本発明の第一の発明における「ブラウチア（Blautia）属に属
する微生物の静止菌体」欄の記載を援用する。
(Resting cells of microorganisms that produce equol from 6-hydroxydaidzein)
The microorganism that produces equol from 6-hydroxydaidzein includes its resting bacterial cell. With regard to the resting bacterial cell, the description in the section "Resting bacterial cell of a microorganism belonging to the genus Blautia" in the first invention of the present invention is incorporated herein by reference.
（６－ヒドロキシダイゼインを含有する溶液）
６－ヒドロキシダイゼインを含有する溶液とは、前記工程（ａ）で生成した６－ヒドロキシダイゼインを含有する溶液である。
(Solution containing 6-hydroxydaidzein)
The solution containing 6-hydroxydaidzein is a solution containing 6-hydroxydaidzein produced in the above step (a).
前記工程（ａ）で生成した６－ヒドロキシダイゼインとは別に、該溶液に、さらに６－ヒドロキシダイゼインを添加する場合には、エクオールの生成前に添加しても、その途中で添加してもよく、また、一括添加、逐次添加、連続添加でもよい。
溶液中の６－ヒドロキシダイゼインの含有量は、通常０．０１ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１ｇ／Ｌ以上である。一方、通常１００ｇ／Ｌ以下、
好ましくは２０ｇ／Ｌ以下、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以下である。
When 6-hydroxydaidzein is added to the solution in addition to the 6-hydroxydaidzein produced in step (a), it may be added before or during the production of equol, and may be added all at once, gradually, or continuously.
The content of 6-hydroxydaidzein in the solution is usually 0.01 g/L or more, preferably 0.1 g/L or more, more preferably 1 g/L or more.
It is preferably 20 g/L or less, more preferably 10 g/L or less.
（培地、及び培養によるエクオールの生成）
本発明の第二の発明に係るエクオールの製造方法では、前記工程（ａ）及び工程（ｂ）が同一の系で行われる。そのため、工程（ｂ）における培地条件、及び培養によるエクオールの生成条件は、工程（ａ）における「培地、及び培養による６－ヒドロキシダイゼインの生成」欄の説明を援用する。
(Culture medium and production of equol by culture)
In the method for producing equol according to the second aspect of the present invention, the steps (a) and (b) are carried out in the same system. Therefore, the medium conditions and the conditions for producing equol by culture in step (b) are the same as those explained in the section "Medium and production of 6-hydroxydaidzein by culture" in step (a).
（静止菌体によるエクオールの生成）
本発明の第二の発明に係るエクオールの製造方法では、前記工程（ａ）及び工程（ｂ）が同一の系で行われる。そのため、６－ヒドロキシダイゼインからエクオールを生成する微生物が静止菌体である場合の溶液も、前記培地の代わりに、前述した「ブラウチア（Blautia）属に属する微生物の静止菌体」欄に記載した塩溶液や緩衝液が好ましい。その他
の条件については、工程（ａ）における「培地、及び培養による６－ヒドロキシダイゼインの生成」欄の説明を援用する。
(Equol production by resting cells)
In the method for producing equol according to the second aspect of the present invention, the steps (a) and (b) are carried out in the same system. Therefore, when the microorganism that produces equol from 6-hydroxydaidzein is a resting cell, the solution is preferably a salt solution or a buffer solution as described in the above section "Resting Cells of Microorganisms Belonging to the Genus Blautia" instead of the medium. For other conditions, the explanation in the section "Medium and Production of 6-hydroxydaidzein by Cultivation" in step (a) is used.
（同一の系）
工程（ａ）及び（ｂ）が同一の系で行われるとは、工程（ａ）において、グリシテインを含有する溶液において、ブラウチア（Blautia）属に属する微生物により、グリシテイ
ンから６－ヒドロキシダイゼインが生成されてから、該生成した６－ヒドロキシダイゼインが工程（ｂ）の６－ヒドロキシダイゼインとしてそのまま用いられて、工程（ｂ）においてエクオールが生成されるまでの一連の流れが、同一の系で連続して行われることをいう。すなわち、工程（ａ）と工程（ｂ）の間に、例えば、工程（ａ）で生成した６－ヒドロキシダイゼインを分離及び／又は精製する工程などを含まないことをいう。
(same system)
"Steps (a) and (b) are carried out in the same system" means that a series of steps from the production of 6-hydroxydaidzein from glycitein in a solution containing glycitein by a microorganism belonging to the genus Blautia in step (a) to the production of equol in step (b) are carried out continuously in the same system, in other words, it means that there is no step between steps (a) and (b) of separating and/or purifying the 6-hydroxydaidzein produced in step (a).
具体的には、グリシテインから６－ヒドロキシダイゼインを生成するブラウチア（Blautia）属に属する微生物と、６－ヒドロキシダイゼインからエクオールを生成する微生物
とを同じ培養液に植菌し、培養することにより、エクオールを生成することなどが挙げられる。両微生物は同一の微生物でもよいし、異なる微生物でもよい。
Specifically, a microorganism belonging to the genus Blautia that produces 6-hydroxydaidzein from glycitein and a microorganism that produces equol from 6-hydroxydaidzein are inoculated into the same culture medium and cultured to produce equol. Both microorganisms may be the same or different.
（３）工程（ｃ）
本発明の第二の発明であるエクオールの製造方法は、前記工程（ａ）及び工程（ｂ）と同一の系で行われる下記工程（ｃ）を含むことが好ましい。
工程（ｃ）は、グリシチンを含有する溶液において、グリシチンからグリシテインを生成する能力を有する微生物に、グリシチンからグリシテインを生成させる工程である。
工程（ｃ）については、本発明の第一の発明における工程（ｃ）の説明を援用する。
(3) Step (c)
The second aspect of the present invention, the method for producing equol, preferably includes the following step (c) which is carried out in the same system as the steps (a) and (b):
Step (c) is a step of allowing a microorganism capable of producing glycitein from glycitein to produce glycitein in a solution containing glycitein.
For step (c), the explanation of step (c) in the first aspect of the present invention is cited.
（同一の系）
工程（ａ）、工程（ｂ）及び工程（ｃ）が同一の系で行われるとは、工程（ｃ）において、グリシチンを含有する溶液において、グリシチンからグリシテインを生成する能力を有する微生物により、グリシチンからグリシテインが生成されてから、該生成したグリシテインが工程（ａ）のグリシテインとしてそのまま用いられて、工程（ａ）において６－ヒドロキシダイゼインが生成され、該生成した６－ヒドロキシダイゼインが工程（ｂ）の６－ヒドロキシダイゼインとしてそのまま用いられて、工程（ｂ）においてエクオールが生成されるまでの一連の流れが、同一の系で連続して行われることをいう。すなわち、工程（ｃ）と工程（ａ）と工程（ｂ）のいずれの間でも、生成物（すなわちグリシテイン及び／又は６－ヒドロキシダイゼイン）を分離及び／又は精製する工程などを含まないことをいう。
(same system)
"The steps (a), (b) and (c) are carried out in the same system" means that a series of steps from producing glycitein from glycitein in a solution containing glycitein in step (c) using a microorganism capable of producing glycitein from glycitein, to using the produced glycitein as it is as the glycitein in step (a) to produce 6-hydroxydaidzein in step (a), and using the produced 6-hydroxydaidzein as it is as the 6-hydroxydaidzein in step (b) to produce equol in step (b) are carried out continuously in the same system. In other words, it means that there is no step of separating and/or purifying the product (i.e., glycitein and/or 6-hydroxydaidzein) between step (c), step (a) and step (b).
（その他の工程）
本発明の第二の発明は、以下の工程を含んでもよい。
本発明の第二の発明は、例えば、得られたエクオールを定量する工程や回収する工程を含んでもよい。これらについては、本発明の第一の発明における「その他の工程」欄の説明を援用する。
(Other processes)
The second aspect of the present invention may include the following steps.
The second aspect of the present invention may include, for example, a step of quantifying the obtained equol or a step of recovering it. For these steps, the explanation in the "Other Steps" section of the first aspect of the present invention is incorporated herein by reference.
以下、具体的な実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail below with reference to specific examples, but the present invention is not limited to these examples.
［実験例１～３］６－ヒドロキシダイゼインの製造方法
（前培養培地の調製）
Thermo scientific社製 Anaerobe Basal Broth (ABB)培地を試験管に5 mL分注した。その後、窒素ガスでガス置換し、滅菌した。
（本培養培地の調製）
ABB培地にグリシテインを40 mg/Lとなるように添加し、試験管に10 mL分注した。その
後、窒素ガスでガス置換し、滅菌した。
（前培養）
前培養培地に、ブラウチア・コッコイデス（Blautia coccoides）JCM 1395株、ブラウ
チア・プロダクタ（Blautia producta）JCM 1471株、ブラウチア・シンキ（Blautia schinki）JCM 14657株をそれぞれ植菌した後、窒素ガスでガス置換し、37 ℃、200 spmで1日
間培養した。
（本培養）
上記前培養した各菌株を本培養培地にそれぞれ植菌した後、窒素ガスでガス置換し、37
℃、200 spmで5日間培養した。
[Experimental Examples 1 to 3] Method for producing 6-hydroxydaidzein (Preparation of pre-culture medium)
5 mL of Anaerobe Basal Broth (ABB) medium (manufactured by Thermo Scientific) was dispensed into a test tube, which was then sterilized by replacing the gas with nitrogen gas.
(Preparation of main culture medium)
Glycitein was added to ABB medium at a concentration of 40 mg/L, and 10 mL of the mixture was dispensed into test tubes. The mixture was then sterilized by replacing the gas with nitrogen gas.
(Preculture)
Blautia coccoides JCM 1395 strain, Blautia producta JCM 1471 strain, and Blautia schinki JCM 14657 strain were inoculated into the preculture medium, and the atmosphere was replaced with nitrogen gas, followed by cultivation at 37°C and 200 spm for 1 day.
(Main culture)
After inoculating each of the above pre-cultured strains into the main culture medium, the gas was replaced with nitrogen gas and incubated for 37
The culture was performed at 200 spm for 5 days.
（測定方法）
培養後の本培養培地から20 μLをサンプリングし、希釈液（エタノール：ミリＱ水＝70:30 (V/V)）で50倍希釈した。これを0.45 μmフィルターでろ過した後に、上清を下記HPLC条件で分析した。
(Measurement method)
After the incubation, 20 μL of the culture medium was sampled and diluted 50-fold with diluent (ethanol: Milli-Q water = 70:30 (V/V)). After filtering through a 0.45 μm filter, the supernatant was analyzed under the following HPLC conditions.
＜イソフラボン類およびエクオールのHPLC分析条件＞
Column: Phenomenex SYNERGI 4 μm POLAR-R 150mm×4.6mm
Eluent: 蒸留水 ／ メタノール ＝ 55 ／ 45 (v/v)
Temperature: 40 ℃
Detection: 280 nm
Flow rate: 1.0 mL/min
Injection: 10 μL
Time: 30 min
<HPLC analysis conditions for isoflavones and equol>
Column: Phenomenex SYNERGI 4 μm POLAR-R 150mm×4.6mm
Eluent: Distilled water / methanol = 55 / 45 (v/v)
Temperature: 40 ℃
Detection: 280 nm
Flow rate: 1.0 mL/min
Injection: 10 μL
Time: 30 minutes
（結果）
表１のように、ブラウチア・コッコイデス（Blautia coccoides）JCM 1395株、ブラウ
チア・プロダクタ（Blautia producta）JCM 1471株、ブラウチア・シンキ（Blautia schinki）JCM 14657株は、いずれもグリシテインを脱メチル化し、６－ヒドロキシダイゼインを生産することが分かった。
(result)
As shown in Table 1, it was found that Blautia coccoides JCM 1395 strain, Blautia producta JCM 1471 strain, and Blautia schinki JCM 14657 strain all demethylate glycitein to produce 6-hydroxydaidzein.
［実験例４～１３］エクオールの製造方法
（前培養培地の調製）
Thermo scientific社製 Anaerobe Basal Broth (ABB)培地を試験管に10 mL分注した。
その後、窒素ガスでガス置換し、滅菌した。
（本培養培地の調製）
ABB培地に、ダイジン、グリシチン及びゲニスチンを含むイソフラボン類を、55 mg/Lとなるように添加し、試験管に5 mL分注した。その後、窒素ガスでガス置換し、滅菌した。（前培養）
前培養培地に、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株、アドレクラウチア・エクオリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）DSM 19450株、ブラウチア・コッコイデス（Blautia coccoides）JCM 1395株、ブラウチア・シン
キ（Blautia schinki）JCM 14657株、ブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）JCM 1471株をそれぞれ植菌した後、窒素ガスでガス置換し、37 ℃、200 spmで1日間培養した
。
（本培養）
上記前培養した各菌株を、表２の組合せで本培養培地に植菌した後、窒素ガスでガス置換し、37 ℃、200 spmで7日間培養した。
[Experimental Examples 4 to 13] Method for producing equol (preparation of pre-culture medium)
Anaerobe Basal Broth (ABB) medium (manufactured by Thermo Scientific) was dispensed into test tubes (10 mL).
Thereafter, the gas was replaced with nitrogen gas and sterilized.
(Preparation of main culture medium)
Isoflavones including daidzin, glycitin and genistin were added to ABB medium at a concentration of 55 mg/L, and 5 mL was dispensed into test tubes. The atmosphere was then replaced with nitrogen gas and sterilized. (Preculture)
Asaccharobacter celatus DSM 18785 strain, Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450 strain, Blautia coccoides JCM 1395 strain, Blautia schinki JCM 14657 strain, and Blautia producta JCM 1471 strain were inoculated into the preculture medium, and the gas was replaced with nitrogen gas and the medium was cultured at 37°C and 200 spm for 1 day.
(Main culture)
The above pre-cultured strains were inoculated into the main culture medium in the combinations shown in Table 2, and then the gas was replaced with nitrogen gas and cultured at 37°C and 200 spm for 7 days.
（測定方法）
培養後の培地から20 μLをサンプリングし、実験例１～３と同様にして測定した。
(Measurement method)
After the culture, 20 μL of the medium was sampled and measured in the same manner as in Experimental Examples 1 to 3.
（結果）
表２の実験例１０～１２より、ブラウチア・コッコイデス（Blautia coccoides）JCM 1395株、ブラウチア・シンキ（Blautia schinki）JCM 14657株、及びブラウチア・プロダ
クタ（Blautia producta）JCM 1471株のいずれかの菌株を用いた場合、ダイジン及びグリシチンが、それぞれダイゼイン及びグリシテイン・ゲニステインに変換された。これは、各菌株がβ－グルコシダーゼ活性を有していることによると推測される。
また、グリシチンから生成したグリシテインは、実施例１～３の結果を加味すると、各菌株によりその一部が脱メチル化され、６－ヒドロキシダイゼインに変換されたと推測される。
(result)
From Experimental Examples 10 to 12 in Table 2, when any of Blautia coccoides JCM 1395, Blautia schinki JCM 14657, and Blautia producta JCM 1471 strains was used, daidzin and glycitin were converted to daidzein and glycitein/genistein, respectively. This is presumably due to the β-glucosidase activity of each strain.
Furthermore, taking into consideration the results of Examples 1 to 3, it is presumed that the glycitein produced from glycitin was partially demethylated by each strain and converted to 6-hydroxydaidzein.
さらに、表２の実験例４～９より、ブラウチア・コッコイデス（Blautia coccoides）JCM 1395株、ブラウチア・シンキ（Blautia schinki）JCM 14657株、及びブラウチア・プ
ロダクタ（Blautia producta）JCM 1471株のいずれかの菌株と、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株又はアドレクラウチア・エクオリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）DSM 19450株との共培養によって、６－ヒドロキシダイゼインがエクオールに変換された。
ここで、実験例４～９では、実験例１０～１２と比べて、ダイゼインの濃度も著しく低下している。これは、特許文献４、特許文献５を加味すると、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株、アドレクラウチア・エクオリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）DSM 19450株が、ダイゼイン及び／又は６－ヒドロキ
シダイゼインを出発物質としてエクオールを生成したことによるものと推測される。
すなわち、ブラウチア（Blautia）属に属する微生物とエクオール生産菌を共培養する
ことによって、従来知られていた、ダイゼイン又は６－ヒドロキシダイゼインからエクオールへの変換のみならず、グリシテインからエクオールへの変換も可能であることが分かった。
Furthermore, from Experimental Examples 4 to 9 in Table 2, 6-hydroxydaidzein was converted to equol by co-culturing any one of Blautia coccoides JCM 1395 strain, Blautia schinki JCM 14657 strain, and Blautia producta JCM 1471 strain with Asaccharobacter celatus DSM 18785 strain or Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450 strain.
Here, the daidzein concentration was also significantly lower in Experimental Examples 4 to 9 compared to Experimental Examples 10 to 12. Taking into consideration Patent Documents 4 and 5, this is presumably because Asaccharobacter celatus DSM 18785 strain and Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450 strain produced equol using daidzein and/or 6-hydroxydaidzein as starting materials.
In other words, it was found that by co-culturing a microorganism belonging to the genus Blautia with an equol-producing bacterium, it is possible to convert not only daidzein or 6-hydroxydaidzein to equol, as has been conventionally known, but also glycitein to equol.
尚、実験例１～１２ではゲニステインは検出されなかった。しかし、ゲニスチン（ゲニステイン配糖体）については、微生物を用いなかった実験例１３と比べて明らかに小さい濃度を示していることから、実験例１～１２では、ゲニスチンがゲニステインに変換され、そのゲニステインは他の代謝物に変換されていると推測される。 In addition, genistein was not detected in Experimental Examples 1 to 12. However, the concentration of genistin (genistein glycoside) was clearly lower than in Experimental Example 13, which did not use microorganisms. Therefore, it is presumed that in Experimental Examples 1 to 12, genistin was converted to genistein, and that genistein was then converted to other metabolites.
本発明の製造方法により製造された６－ヒドロキシダイゼイン及びエクオールは、化粧品、医薬部外品、医療用品、衛生用品、医薬品、飲食品（サプリメントを含む。）等の原料や素材として有用である。 The 6-hydroxydaidzein and equol produced by the manufacturing method of the present invention are useful as raw materials or ingredients for cosmetics, quasi-drugs, medical supplies, hygiene products, pharmaceuticals, food and beverages (including supplements), etc.
Claims (11)
工程（ａ）：グリシテインを含有する溶液において、ブラウチア・シンキ（Blautia schinki）に属する微生物に、グリシテインから６－ヒドロキシダイゼインを生成させる工
程 A method for producing 6-hydroxydaidzein, comprising the steps of:
Step (a): A step of producing 6-hydroxydaidzein from glycitein using a microorganism belonging to Blautia schinki in a solution containing glycitein.
（Blautia schinki）JCM 14657株である、請求項１に記載の製造方法。 2. The method according to claim 1 , wherein the microorganism belonging to Blautia schinki is Blautia schinki JCM 14657 strain.
工程（ｃ）：グリシチンを含有する溶液において、グリシチンからグリシテインを生成する能力を有する微生物に、グリシチンからグリシテインを生成させる工程 The method according to claim 1 or 2 , further comprising the following step (c) carried out in the same system as the step (a):
Step (c): A step of allowing a microorganism capable of producing glycitein from glycitein to produce glycitein from glycitein in a solution containing glycitein.
工程（ａ）：グリシテインを含有する溶液において、ブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）に属する微生物、ブラウチア・コッコイデス（Blautia coccoides）に属す
る微生物、及びブラウチア・シンキ（Blautia schinki）に属する微生物から成る群から
選択される一又は複数の微生物に、グリシテインから６－ヒドロキシダイゼインを生成させる工程
工程（ｂ）：前記工程（ａ）で生成した６－ヒドロキシダイゼインを含有する溶液において、アサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物、アドレクラウチア（Adlercreutzia）属に属する微生物、ラクトコッカス（Lactococcus）属に属する微生物、
及びエガセラ（Eggerthella）属に属する微生物から成る群から選択される一又は複数の
微生物に、６－ヒドロキシダイゼインからエクオールを生成させる工程 A method for producing equol, comprising the following steps (a) and (b) carried out in the same system:
Step (a): A step of producing 6-hydroxydaidzein from glycitein in a solution containing glycitein using one or more microorganisms selected from the group consisting of microorganisms belonging to Blautia producta, microorganisms belonging to Blautia coccoides, and microorganisms belonging to Blautia schinki. Step (b): A step of producing 6-hydroxydaidzein from glycitein in a solution containing the 6-hydroxydaidzein produced in the step (a) using one or more microorganisms selected from the group consisting of microorganisms belonging to the genus Asaccharobacter, microorganisms belonging to the genus Adlercreutzia, microorganisms belonging to the genus Lactococcus,
and allowing one or more microorganisms selected from the group consisting of microorganisms belonging to the genus Eggerthella to produce equol from 6-hydroxydaidzein.
ー・セラツス（Asaccharobacter celatus）に属する微生物である、請求項４に記載の製
造方法。 The method according to claim 4 , wherein the microorganism belonging to the genus Asaccharobacter is a microorganism belonging to Asaccharobacter celatus.
クオリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）に属する微生物である、請求項４
又は５に記載の製造方法。 5. The method according to claim 4 , wherein the microorganism belonging to the genus Adlercreutzia is a microorganism belonging to Adlercreutzia equolifaciens.
6. The method for producing the same according to claim 5 .
アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株である、請求項５に記載の製造方法。 The microorganism belonging to Asaccharobacter celatus is
The method according to claim 5 , wherein the bacterium is Asaccharobacter celatus DSM 18785 strain.
する微生物が、アドレクラウチア・エクオリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）DSM 19450株である、請求項６に記載の製造方法。 7. The method according to claim 6 , wherein the microorganism belonging to the genus Adlercreutzia equolifaciens is the Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450 strain.
（Lactococcus garvieae）に属する微生物である、請求項４～８のいずれか１項に記載の製造方法。 The method according to any one of claims 4 to 8 , wherein the microorganism belonging to the genus Lactococcus is a microorganism belonging to Lactococcus garvieae.
sp）YY 7918株である、請求項４～９のいずれか１項に記載の製造方法。 The microorganism belonging to the genus Eggerthella is Eggerthella sp.
The method according to any one of claims 4 to 9 , wherein the strain is YY 7918.
工程（ｃ）：グリシチンを含有する溶液において、グリシチンからグリシテインを生成する能力を有する微生物に、グリシチンからグリシテインを生成させる工程 The method according to any one of claims 4 to 10 , further comprising the following step (c) which is carried out in the same system as the steps (a) and (b):
Step (c): A step of allowing a microorganism capable of producing glycitein from glycitein to produce glycitein from glycitein in a solution containing glycitein.
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