JP7533087B2 - Copolymer, method for producing the copolymer, cell cryopreservation material and cell cryopreservation solution - Google Patents
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Description
本発明は、共重合体、共重合体の製造方法等に関するものであり、特に、細胞凍結保存材、及び、細胞凍結保存液の成分として好適に用いられる共重合体等に関する。 The present invention relates to a copolymer, a method for producing the copolymer, and the like, and in particular to a copolymer that is suitable for use as a cell cryopreservation material and as a component of a cell cryopreservation solution.
近年、再生医療分野の進歩に伴い、採取した細胞だけでなくスフェロイドや細胞シートをはじめとする細胞集塊の凍結保存が重要視されている。細胞の凍結保存を行う場合において細胞凍結保存液を用いないと、凍結－融解の操作後にはほとんどの細胞が死滅してしまうことが知られている。その原因としては、細胞内外での氷晶の形成による細胞膜への物理的なダメージが挙げられる。 In recent years, with advances in the field of regenerative medicine, the cryopreservation of not only harvested cells but also cell aggregates such as spheroids and cell sheets has become important. It is known that if a cell cryopreservation solution is not used when cryopreserving cells, most cells will die after the freezing and thawing process. One of the reasons for this is said to be physical damage to the cell membrane caused by the formation of ice crystals inside and outside the cells.
これまでに最も一般的な細胞を凍結保存する技術としては、細胞凍結保存材としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を培地に混合し、凍結する方法がある。ＤＭＳＯの凍結保護効果のメカニズムは、細胞内まで浸透することで細胞内を脱水し、氷晶の形成を抑制するものである。
しかしながら、ＤＭＳＯは低分子であるために細胞、細胞集塊の解凍後にも細胞内外や集塊内に残存し、毒性や未分化細胞の望まない分化誘導を引き起こすことが知られている。
The most common cell cryopreservation technique to date is to mix dimethyl sulfoxide (DMSO) as a cell cryopreservation agent into culture medium and then freeze the medium. The mechanism of the cryoprotective effect of DMSO is that it penetrates into cells, dehydrating them and suppressing the formation of ice crystals.
However, since DMSO is a low molecular weight substance, it remains inside or outside the cells or cell clusters even after the cells or cell clusters are thawed, and is known to cause toxicity and induce undesired differentiation of undifferentiated cells.
ＤＭＳＯの欠点を克服する材料として、特許文献１（ＷＯ２００９／１５７２０９Ａ１）には、下記式（８）に示すようなカルボキシル化ポリリジン（ＰＬＬ－ＣＯＯＨ）を培地に混合させると、凍結-融解後も細胞の生存率が高いことが開示されている。このような高分子型の細胞凍結保存材は、細胞内へは浸透せず、細胞の外から細胞内を脱水し、細胞内に氷晶が形成しにくくなる効果のほか、融解時の氷の再結晶を防止する効果も持ち合わせている。
しかし、ＰＬＬ－ＣＯＯＨの主鎖はペプチド結合でつながっているため、水溶液中で加水分解されるほか、細胞の放出する分解酵素などで分解し、十分に効果を発揮できない可能性がある。
However, since the main chain of PLL-COOH is connected by peptide bonds, it is subject to hydrolysis in aqueous solution and may also be decomposed by degradative enzymes released by cells, potentially preventing it from exerting its full effectiveness.
次に、水溶液中での加水分解や分解酵素による分解を受けにくい高分子型の細胞凍結保存材として、非特許文献１（Ｊ． Ｂｉｏｍａｔｅｒ． Ｓｃｉ．， Ｐｏｌｙｍ． Ｅｄ． ２０１３， ２４ （１５），１７６７－１７８０）には、下記式（９）に示すようなポリＮ，Ｎ‘－ジメチルアミノエチルメタクリレート―メタクリル酸共重合体（ｐ（ＤＭＡＥＭＡ―ＭＡＡ））も凍結-融解後も細胞の生存率が高いことが開示されている。
しかし、ｐ（ＤＭＡＥＭＡ―ＭＡＡ）は、カチオンとしてアンモニウム基を有しているが、水への親和性が低いために細胞外から細胞内の脱水効率が悪く、凍結効果が十分に発揮されない恐れがある。
However, although p(DMAEMA-MAA) has an ammonium group as a cation, it has a low affinity for water, which means that it is less efficient at dehydrating from the outside to the inside of the cell, and there is a risk that the freezing effect will not be fully exerted.
非特許文献２（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１９， ２０， ９０４－９１５）には、三級スルホニウム基とカルボキシル基を有する両性イオンポリマーであるｐｏｌｙ（Ａ－Ｍｅｔ（Ｓ＋）－ＯＨ（１０））について開示されている。
しかし、非特許文献２に記載のポリマーは、カチオンモノマーとアニオンモノマーの共重合体であるポリアンフォライトではなく、同一モノマー内にカチオンとアニオンの両方を有するモノマーのポリマー、すなわち両性イオンポリマーである。両性イオンポリマーは、電荷バランスの調節ができないために、細胞膜の周辺にとどまることができず、結果として細胞外から細胞内の脱水効率が悪くなり、凍結効果が得られなくなる。さらに、非特許文献２において、上記ポリマーの細胞凍結保存効果については記載されていない。
However, the polymer described in Non-Patent Document 2 is not a polyampholyte, which is a copolymer of a cationic monomer and an anionic monomer, but a polymer of a monomer having both a cation and an anion in the same monomer, i.e., a zwitterionic polymer. Since the charge balance of the zwitterionic polymer cannot be adjusted, the zwitterionic polymer cannot remain around the cell membrane, resulting in poor dehydration efficiency from the outside of the cell to the inside of the cell, and the freezing effect cannot be obtained. Furthermore, Non-Patent Document 2 does not describe the cell cryopreservation effect of the above polymer.
以上のように、水との親和性が高い構造を有しており、さらに電荷の調節が可能であり、かつ加水分解や酵素分解性に耐性がある高分子型の細胞凍結保存材等は、これまでに知られていない。 As described above, no polymeric cell cryopreservation material has been known to date that has a structure with high affinity for water, allows for the adjustment of charge, and is resistant to hydrolysis and enzymatic degradation.
本発明の課題は、水との親和性が高い構造を有しており、さらに電荷の調節が可能であり、かつ加水分解や酵素分解性に耐性がある高分子である共重合体、およびその共重合体の製造方法、並びにその共重合体を含有する細胞凍結保存材等を提供することである。 The object of the present invention is to provide a copolymer that has a structure with high affinity for water, has adjustable charge, and is resistant to hydrolysis and enzymatic degradation, a method for producing the copolymer, and a cell cryopreservation material containing the copolymer.
本発明者らは、上述の目的を達成するべく鋭意研究を重ねた結果、水との親和性が高い三級スルホニウム基とカルボキシル基を有しており、さらに電荷の調節が可能なポリアンフォライトである共重合体、及び、そのような共重合体を含み、かつ加水分解や酵素分解性に耐性がある高分子型の細胞凍結保存材等が、上述の課題を解決できることを見出した。 As a result of intensive research conducted by the inventors to achieve the above-mentioned object, they have found that the above-mentioned problems can be solved by a copolymer that is a polyampholyte having a tertiary sulfonium group and a carboxyl group that have high affinity for water and further has an adjustable charge, and a polymeric cell cryopreservation material that contains such a copolymer and is resistant to hydrolysis and enzymatic degradation.
すなわち、本発明は、少なくとも下記の［１］～［１１］を提供する。
［１］
少なくとも下記式（１）で表されるカチオン性繰り返し配列Ａと下記式（２）で表されるアニオン性繰り返し配列Ｂを有する共重合体であり、前記カチオン性繰り返し配列Ａとアニオン性繰り返し配列Ｂとのモル比について、０．２≦Ａ／（Ａ＋Ｂ）≦０．８の関係にあり、分子量が１，０００から１，０００，０００である共重合体。
また、上記式（２）中、Ａは、単結合、エステル結合、アミド結合、エーテル結合から選択される。Ｒ３は水素原子もしくはメチル基を表し、ｑは０～６の整数である。
［２］
上記式（１）中、Ｒ１、及びＲ２が水素原子であり、Ｒ３がメチル基でありｐ＝２であり、上記式（２）中、Ａは単結合、エステル結合、アミド結合、エーテル結合から選択され、Ｒ３は水素原子もしくはメチル基を表し、ｑは０～６の整数である、上記［１］に記載の共重合体。
［２’］
上記式（１）中、Ｒ１、及びＲ２は、それぞれ独立に水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分、岐、もしくは環状アルキル基、炭素数が６～２０の芳香族基、あるいは、Ｒ１とＲ２とが互いに連結された炭素数１～６のアルキレン基から選択され、Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基であり、
上記式（２）中、Ａは、単結合、エステル結合、アミド結合、エーテル結合から選択され、Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表し、ｑは０～６の整数である、
上記［１］に記載の共重合体。
［３］
上記式（１）中、Ｒ１、及びＲ２は、それぞれ独立に水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、炭素数が６～２０の芳香族基、あるいは、Ｒ１とＲ２とが互いに連結された炭素数１～６のアルキレン基から選択され、Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基であり、前記式（２）中、Ａが単結合でありＲ３がメチル基であり、ｑが０である、上記［１］に記載の共重合体。
［３’］
上記式（１）中、Ｒ１、及びＲ２が水素原子であり、Ｒ３がメチル基であり、ｐ＝２であり、
上記式（２）中、Ａが、単結合であり、Ｒ３がメチル基であり、ｑが０である、
上記［２’］に記載の共重合体。
［４］
前記共重合体がランダムコポリマーである、上記［１］～［３］のいずれかに記載の共重合体。
That is, the present invention provides at least the following [1] to [11].
[1]
A copolymer having at least a cationic repeating sequence A represented by the following formula (1) and an anionic repeating sequence B represented by the following formula (2), wherein the molar ratio of the cationic repeating sequence A to the anionic repeating sequence B satisfies the relationship of 0.2≦A/(A+B)≦0.8, and the copolymer has a molecular weight of 1,000 to 1,000,000.
In the formula (2), A is selected from a single bond, an ester bond, an amide bond, and an ether bond, R3 represents a hydrogen atom or a methyl group, and q is an integer of 0 to 6.
[2]
The copolymer according to the above-mentioned [1], wherein in the above-mentioned formula (1), R 1 and R 2 are hydrogen atoms, R 3 is a methyl group, and p=2; in the above-mentioned formula (2), A is selected from a single bond, an ester bond, an amide bond, and an ether bond, R 3 represents a hydrogen atom or a methyl group, and q is an integer of 0 to 6.
[2']
In the above formula (1), R 1 and R 2 are each independently selected from a hydrogen atom, a linear, branched, or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aromatic group having 6 to 20 carbon atoms, or an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms in which R 1 and R 2 are linked to each other; R 3 is a hydrogen atom or a methyl group;
In the above formula (2), A is selected from a single bond, an ester bond, an amide bond, and an ether bond, R3 represents a hydrogen atom or a methyl group, and q is an integer of 0 to 6.
The copolymer according to the above [1].
[3]
In the above formula (1), R 1 and R 2 are each independently selected from a hydrogen atom, a linear, branched, or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aromatic group having 6 to 20 carbon atoms, or an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms in which R 1 and R 2 are bonded to each other; R 3 is a hydrogen atom or a methyl group; in the above formula (2), A is a single bond, R 3 is a methyl group, and q is 0. The copolymer according to the above [1].
[3']
In the above formula (1), R 1 and R 2 are hydrogen atoms, R 3 is a methyl group, and p=2;
In the above formula (2), A is a single bond, R3 is a methyl group, and q is 0.
The copolymer according to the above item [2'].
[4]
The copolymer according to any one of the above [1] to [3], wherein the copolymer is a random copolymer.
［５］
下記〔工程Ａ〕、及び〔工程Ｂ〕をこの順で行うことを特徴とする、上記［１］に記載の共重合体の製造方法。
〔工程Ａ〕
下記式（４）で表されるスルフィドモノマーと下記式（５）で表されるカルボン酸モノマーをラジカル重合により共重合する工程。
また、上記式（５）中、Ａは単結合、エステル結合、アミド結合、エーテル結合から選択される。Ｒ３は水素原子もしくはメチル基を表し、ｑは０～６の整数である。
〔工程Ｂ〕
前記〔工程Ａ〕で得られたスルフィド含有共重合体と、下記式（６）で表されるスルフィド反応性化合物とを反応させる工程。
［６］
前記〔工程Ａ〕における、重合温度が４０～９０℃であり、重合時間が２～４８時間である、上記［５］に記載の共重合体の製造方法。
［７］
前記〔工程Ｂ〕における、反応温度が－２０～１００℃であり、反応時間が１～７２時間である、上記［５］又は［６］に記載の共重合体の製造方法。
［８］
下記式（７）で表されるカチオン性モノマーと下記式（５）で表されるアニオン性モノマーとをラジカル重合により共重合することを特徴とする上記［１］に記載の共重合体の製造方法。
また、上記式（５）中、Ａは単結合、エステル結合、アミド結合、エーテル結合から選択される。Ｒ３は水素原子もしくはメチル基を表し、ｑは０～６の整数である。
［９］
前記共重合体がランダムコポリマーである、上記［５］～［８］のいずれかに記載の共重合体の製造方法。
[5]
A method for producing the copolymer according to the above item [1], characterized in that the following [Step A] and [Step B] are carried out in this order:
[Step A]
A step of copolymerizing a sulfide monomer represented by the following formula (4) and a carboxylic acid monomer represented by the following formula (5) by radical polymerization:
In the formula (5), A is selected from a single bond, an ester bond, an amide bond, and an ether bond, R3 represents a hydrogen atom or a methyl group, and q is an integer of 0 to 6.
[Step B]
A step of reacting the sulfide-containing copolymer obtained in the above [Step A] with a sulfide-reactive compound represented by the following formula (6):
[6]
The method for producing a copolymer according to the above-mentioned [5], wherein the polymerization temperature in the above-mentioned [Step A] is 40 to 90° C., and the polymerization time is 2 to 48 hours.
[7]
The method for producing a copolymer according to the above-mentioned [5] or [6], wherein in the above-mentioned [Step B], the reaction temperature is −20 to 100° C., and the reaction time is 1 to 72 hours.
[8]
A method for producing the copolymer according to the above [1], characterized in that a cationic monomer represented by the following formula (7) and an anionic monomer represented by the following formula (5) are copolymerized by radical polymerization:
In the formula (5), A is selected from a single bond, an ester bond, an amide bond, and an ether bond, R3 represents a hydrogen atom or a methyl group, and q is an integer of 0 to 6.
[9]
The method for producing a copolymer according to any one of the above [5] to [8], wherein the copolymer is a random copolymer.
［１０］
上記［１］～［４］のいずれかに記載の共重合体を含有することを特徴とする細胞凍結保存材。
［１１］
上記［１］～［４］のいずれかに記載の共重合体を１～３０重量％の濃度で含有することを特徴とする細胞凍結保存液。
[10]
A cell cryopreservation material comprising the copolymer according to any one of the above [1] to [4].
[11]
A cell cryopreservation solution comprising the copolymer according to any one of the above [1] to [4] in a concentration of 1 to 30% by weight.
本発明によれば、水との親和性が高い構造を有しており、さらに電荷の調節が可能であり、かつ加水分解や酵素分解性に耐性がある高分子である共重合体、およびその共重合体の製造方法、並びにその共重合体を含有する細胞凍結保存材を提供することできる。 The present invention provides a copolymer that has a structure with high affinity for water, has adjustable charge, and is resistant to hydrolysis and enzymatic degradation, as well as a method for producing the copolymer and a cell cryopreservation material that contains the copolymer.
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。 A preferred embodiment of the present invention is described in detail below.
［１．共重合体］
＜共重合体の構造＞
本発明における共重合体は、少なくとも下記式（１）で表されるカチオン性繰り返し配列（カチオン性繰り返し単位）Ａと、下記式（２）で表されるアニオン性繰り返し配列（アニオン性繰り返し単位）Ｂとを有している。
上記式（２）中、Ａは、単結合、エステル結合、アミド結合、エーテル結合から選択される。Ｒ３は水素原子もしくはメチル基を表し、ｑは０～６の整数である。
[1. Copolymer]
<Copolymer Structure>
The copolymer in the present invention has at least a cationic repeating sequence (cationic repeating unit) A represented by the following formula (1) and an anionic repeating sequence (anionic repeating unit) B represented by the following formula (2).
In the above formula (2), A is selected from a single bond, an ester bond, an amide bond, and an ether bond, R3 represents a hydrogen atom or a methyl group, and q is an integer of 0 to 6.
上記式（１）で表されるカチオン性繰り返し配列Ａ中、炭素数が１～６の直鎖アルキル基とは、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基であり、炭素数が１～６の分岐アルキル基とは、例えば、イソプロピル基、２－ブチル基であり、炭素数が１～６の環状アルキル基とは、例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基である。
これらのアルキル基の炭素数は、好ましくは１～４であり、より好ましくは１～３である。
式（１）における炭素数６～２０の芳香族基とは、例えば、フェニル基、ｐ－ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。芳香族基の炭素数は、好ましくは６～１２であり、より好ましくは６～１０である。
式（１）における炭素数１～６のアルキレン基の炭素数は、好ましくは１～５の製数であり、より好ましくは２～４の整数であり、例えば２である。
In the cationic repeating sequence A represented by the above formula (1), the linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is, for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an n-butyl group, a pentyl group, or a hexyl group; the branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is, for example, an isopropyl group or a 2-butyl group; and the cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is, for example, a cyclopentyl group or a cyclohexyl group.
These alkyl groups preferably have 1 to 4 carbon atoms, and more preferably 1 to 3 carbon atoms.
The aromatic group having 6 to 20 carbon atoms in the formula (1) is, for example, a phenyl group, a p-nitrophenyl group, a bromophenyl group, a phenylboronic acid group, a hydroxyphenyl group, a dihydroxyphenyl group, or a trihydroxyphenyl group. The number of carbon atoms in the aromatic group is preferably 6 to 12, and more preferably 6 to 10.
The number of carbon atoms in the alkylene group having 1 to 6 carbon atoms in the formula (1) is preferably an integer of 1 to 5, more preferably an integer of 2 to 4, for example, 2.
式（１）において、Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表す。 In formula (1), R3 represents a hydrogen atom or a methyl group.
上記式（１）で表されるカチオン性繰り返し配列Ａとしては、例えば、Ｒ１、Ｒ２が共に水素原子であり、Ｒ３がメチル基であるカチオン性繰り返し配列Ａ、Ｒ１がプロピル基、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３がメチルであるカチオン性繰り返し配列Ａ、Ｒ１がベンジル基、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３がメチル基であるカチオン性繰り返し配列Ａが挙げられるが、合成の容易さから、Ｒ１、Ｒ２が共に水素原子であり、Ｒ３がメチル基であるカチオン性繰り返し配列Ａが好ましい。 Examples of the cationic repeating sequence A represented by the above formula (1) include a cationic repeating sequence A in which R 1 and R 2 are both hydrogen atoms and R 3 is a methyl group, a cationic repeating sequence A in which R 1 is a propyl group, R 2 is a hydrogen atom and R 3 is a methyl group, and a cationic repeating sequence A in which R 1 is a benzyl group, R 2 is a hydrogen atom and R 3 is a methyl group. From the viewpoint of ease of synthesis, the cationic repeating sequence A in which R 1 and R 2 are both hydrogen atoms and R 3 is a methyl group is preferred.
下記式（２）で表されるアニオン性繰り返し配列Ｂにおいて、Ａは単結合、エステル結合、アミド結合、エーテル結合から選択される。
ここで、エステル結合とは、－（Ｃ（＝Ｏ）Ｏ）－で表される結合部位であり、－（Ｃ（＝Ｏ）Ｏ）－の左側が、式（２）のポリマーの主鎖側であっても、－（ＣＨ２）ｑ－のアルキレン基側であってもよい。
アミド結合とは、－（ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ））－で表される結合部位であり、－（ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ））－のの左側が、式（２）のポリマーの主鎖側であっても、－（ＣＨ２）ｑ－のアルキレン基側であってもよい。
また、エーテル結合とは、－Ｏ－で表される結合部位である。
また、下記式（２）において、ｑは０～６の整数であり、好ましくは１～５の製数であり、より好ましくは２～４の整数であり、例えば２である。
Here, the ester bond is a bonding site represented by -(C(=O)O)-, and the left side of -(C(=O)O)- may be the main chain side of the polymer of formula (2) or the alkylene group side of -(CH 2 )q-.
An amide bond is a bonding site represented by -(NH-C(=O))-, and the left side of -(NH-C(=O))- may be on the main chain side of the polymer of formula (2) or on the alkylene group side of -(CH 2 )q-.
In addition, an ether bond is a bonding site represented by --O--.
In the following formula (2), q is an integer of 0 to 6, preferably an integer of 1 to 5, more preferably an integer of 2 to 4, for example, 2.
Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表す。 R3 represents a hydrogen atom or a methyl group.
上記式（２）で表されるアニオン性繰り返し配列Ｂとしては、例えば、Ａが単結合でありｑ＝０、Ｒ３がメチル基であるアニオン性繰り返し配列Ｂ、Ａがエステル結合であり、ｑ＝２であり、Ｒ３がメチル基であるアニオン性繰り返し配列Ｂが挙げられるが、合成の容易さからＡが単結合でありｑ＝０、Ｒ３がメチル基であるアニオン性繰り返し配列Ｂが好ましい。 Examples of the anionic repeating sequence B represented by the above formula (2) include an anionic repeating sequence B in which A is a single bond, q = 0, and R3 is a methyl group, and an anionic repeating sequence B in which A is an ester bond, q = 2, and R3 is a methyl group. From the viewpoint of ease of synthesis, the anionic repeating sequence B in which A is a single bond, q = 0, and R3 is a methyl group is preferred.
少なくとも上記式（１）で表されるカチオン性繰り返し配列Ａと上記式（２）で表されるアニオン性繰り返し配列Ｂを有する共重合体としては、他のモノマーとの共重合体であってもよい。
上記他のモノマーとしては用途によって適宜選択可能であり、例えば、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、グリセロール（メタ）アクリレート、（メタ）アクリロイルオキシエチルホスフェート、（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、Ｎ-メチルカルボキシベタイン（メタ）アクリレート、Ｎ－メチルスルホベタイン（メタ）アクリレート、メチル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、２－メトキシエチル（メタ）アクリレート等の各種（メタ）アクリル酸エステル；メチルビニルエーテル等の各種ビニルエーテル；その他、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ‘－ジメチルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、アリルアルコール、アクリロニトリル、アクロレイン、酢酸ビニル、ビニルスルホン酸ナトリウム、スチレン、クロロスチレン、ビニルフェノール、ビニルシンナメート、塩化ビニル、ビニルブロミド、ブタジエン、ビニレンカーボネート、イタコン酸、イタコン酸エステル、フマル酸、フマル酸エステル、マレイン酸、マレイン酸エステル等の各種ラジカル重合性モノマーが挙げられるが、少なくとも上記式（１）で表されるカチオン性繰り返し配列Ａと上記式（２）で表されるアニオン性繰り返し配列Ｂを有する共重合体を細胞凍結保存材として用いる場合、溶媒への溶解性の観点からのバランスから他のモノマーとしてはＮ，Ｎ‘－ジメチルアクリルアミド、ｎ－ブチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレートが好ましい。また、他のモノマーの配合量は任意であり、適宜選択できるが、上記共重合体の性能を十分に引き出すためには、配合される上記他のモノマーが、全モノマー中、３０モル％以下であることが好ましく、２０モル％以下であることがより好ましく、１０モル％以下であることがさらに好ましい。
The copolymer having at least the cationic repeating sequence A represented by the above formula (1) and the anionic repeating sequence B represented by the above formula (2) may be a copolymer with other monomers.
The other monomers can be appropriately selected depending on the application, and examples thereof include various (meth)acrylic acid esters such as diethylaminoethyl (meth)acrylate, polyethylene glycol mono(meth)acrylate, glycerol (meth)acrylate, (meth)acryloyloxyethyl phosphate, (meth)acryloyloxyethyl phosphorylcholine, N-methylcarboxybetaine (meth)acrylate, N-methylsulfobetaine (meth)acrylate, methyl (meth)acrylate, glycidyl (meth)acrylate, dimethylaminoethyl (meth)acrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, and 2-methoxyethyl (meth)acrylate; various vinyl ethers such as methyl vinyl ether; and others such as acrylamide, N,N'-dimethylacrylamide, N-isopropyl (meth)acrylate, etc. Examples of radical polymerizable monomers include acrylamide, (meth)acrylic acid, allyl alcohol, acrylonitrile, acrolein, vinyl acetate, sodium vinyl sulfonate, styrene, chlorostyrene, vinylphenol, vinyl cinnamate, vinyl chloride, vinyl bromide, butadiene, vinylene carbonate, itaconic acid, itaconic acid esters, fumaric acid, fumaric acid esters, maleic acid, and maleic acid esters. When a copolymer having at least the cationic repeating sequence A represented by the above formula (1) and the anionic repeating sequence B represented by the above formula (2) is used as a cell cryopreservation material, the other monomers are preferably N,N'-dimethylacrylamide, n-butyl (meth)acrylate, and polyethylene glycol mono(meth)acrylate in terms of balance from the viewpoint of solubility in a solvent. The amount of the other monomers to be blended is arbitrary and can be selected appropriately, but in order to fully bring out the performance of the copolymer, the amount of the other monomers to be blended is preferably 30 mol% or less, more preferably 20 mol% or less, and even more preferably 10 mol% or less of the total monomers.
上記共重合体は、ランダムコポリマーとブロックコポリマーを含むが、上記共重合体の性能を引き出すためには、ランダムコポリマーであることが好ましい。共重合体は、少なくともランダムコポリマーを含む混合物、例えばランダムコポリマーとブロックコポリマーとの混合物であってもよいが、ランダムコポリマーのみからなることがより好ましい。すなわち、本発明の共重合体は、上記式（１）で表されるカチオン性繰り返し配列Ａ同士の連結された部位と、上記式（２）で表されるアニオン性繰り返し配列Ｂ同士の連結された部位とを含むブロック共重合体を包含するものの、好ましくは、カチオン性繰り返し配列Ａとアニオン性繰り返し配列Ｂとが交互に連結された部位を少なくとも含み、カチオン性繰り返し配列Ａとアニオン性繰り返し配列Ｂとがランダムに連結されたランダムコポリマーである。
また、上記共重合体のモル比としては、要求される機能が発揮されるように適宜決定できるが、細胞凍結保存効果の観点からは上記カチオン性繰り返し配列Ａとアニオン性繰り返し配列Ｂがモル比（モル数）について、０．２≦Ａ／（Ａ＋Ｂ）≦０．８の範囲にあることが好ましい。より好ましくは、カチオン性繰り返し配列Ａのモル数と、アニオン性繰り返し配列Ｂのモル数の比であるモル比に関して、０．４≦Ａ／（Ａ＋Ｂ）≦０．８の範囲内にあるという関係が満たされ、０．６≦Ａ／（Ａ＋Ｂ）≦０．８の範囲内にあるという関係が満たされることが特に好ましい。
The copolymer includes random copolymer and block copolymer, but in order to bring out the performance of the copolymer, it is preferable that the copolymer is a random copolymer. The copolymer may be a mixture containing at least a random copolymer, for example, a mixture of a random copolymer and a block copolymer, but it is more preferable that the copolymer is composed of only a random copolymer. That is, the copolymer of the present invention includes a block copolymer containing a portion where the cationic repeating sequence A represented by the above formula (1) is linked to each other and a portion where the anionic repeating sequence B represented by the above formula (2) is linked to each other, but is preferably a random copolymer that contains at least a portion where the cationic repeating sequence A and the anionic repeating sequence B are linked alternately, and where the cationic repeating sequence A and the anionic repeating sequence B are linked randomly.
From the viewpoint of cell cryopreservation effects, the molar ratio (number of moles) of the cationic repeating sequence A and the anionic repeating sequence B is preferably in the range of 0.2≦A/(A+B)≦0.8. More preferably, the molar ratio, which is the ratio of the number of moles of the cationic repeating sequence A to the number of moles of the anionic repeating sequence B, satisfies the relationship of 0.4≦A/(A+B)≦0.8, and particularly preferably satisfies the relationship of 0.6≦A/(A+B)≦0.8.
上記共重合体の分子量としては、要求される性能が発揮しうるように重合条件等を調製して適宜決定できるが、通常、数平均分子量で１，０００～１，０００，０００程度であり、上記ランダムポリマーを細胞凍結保存材として用いる場合には、水への溶解性の観点から３，０００～８０，０００が好ましく、５，０００～５０，０００がより好ましい。
また、共重合体の分子量分布は、４．０以下であることが好ましく、３．０以下であることがより好ましく、２．７以下、例えば２．０以下や１．５以下であることがさらに好ましい。
The molecular weight of the copolymer can be appropriately determined by adjusting the polymerization conditions, etc. so that the required performance can be exhibited, but is usually about 1,000 to 1,000,000 in number average molecular weight. When the random polymer is used as a cell cryopreservation material, it is preferably 3,000 to 80,000, more preferably 5,000 to 50,000 from the viewpoint of solubility in water.
The molecular weight distribution of the copolymer is preferably 4.0 or less, more preferably 3.0 or less, and even more preferably 2.7 or less, for example 2.0 or less or 1.5 or less.
＜ポリアンフォライト＞
本発明の共重合体は、ポリアンフォライトであり、ポリアンフォライトとは、少なくともカチオン性モノマーとアニオン性モノマーの両方を含む共重合体である。ポリアンフォライトは、カチオン部位とアニオンの両方を有するモノマーの共重合体である両性イオンポリマーに比べて、細胞凍結保存材に用いた場合に、脱水効率、凍結効果等に優れる。
<Polyampholyte>
The copolymer of the present invention is a polyampholite, which is a copolymer containing at least both cationic monomers and anionic monomers. When used as a cell cryopreservation material, polyampholite is superior in dehydration efficiency, freezing effect, etc. to zwitterionic polymers, which are copolymers of monomers having both cationic and anionic moieties.
［２．共重合体の製造方法］
＜共重合体の合成１＞
本発明の好ましくはランダムコポリマーである共重合体は、下記の〔工程Ａ］、〔工程Ｂ〕を少なくともこの順で含む製造方法により製造できる。
〔工程Ａ〕
工程Ａは、下記式（４）で表されるスルフィドモノマーと下記式（５）で表されるカルボン酸モノマーをラジカル重合により共重合する工程である。式（４）及び式（５）におけるＲ１～Ｒ３、ｐ、Ａ及びｑの定義については、上記式（１）及び（２）におけるＲ１～Ｒ３、ｐ、Ａ及びｑとそれぞれ同義たり得るが、具体的には、以下の通りである。
また、上記式（５）中、Ａは単結合、エステル結合、アミド結合、エーテル結合から選択される。Ｒ３は水素原子もしくはメチル基を表し、ｑは０～６の整数である。
[2. Method for producing copolymer]
<Synthesis of copolymer 1>
The copolymer of the present invention, which is preferably a random copolymer, can be produced by a production method including at least the following [Step A] and [Step B] in this order.
[Step A]
Step A is a step of copolymerizing a sulfide monomer represented by the following formula (4) with a carboxylic acid monomer represented by the following formula (5) by radical polymerization. The definitions of R 1 to R 3 , p, A, and q in formulas (4) and (5) may be the same as those of R 1 to R 3 , p, A, and q in formulas (1) and (2), respectively, but are specifically as follows:
In the formula (5), A is selected from a single bond, an ester bond, an amide bond, and an ether bond, R3 represents a hydrogen atom or a methyl group, and q is an integer of 0 to 6.
上記式（４）中、Ｒ１はそれぞれ独立した置換基であり、特に限定されないが、水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分岐、環状アルキル基、あるいは芳香族置換基から選択される。
炭素数が１～６の直鎖アルキル基とは、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ｎ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等であり、分岐アルキル基とは、具体的にはイソプロピル基、２－ブチル基等であり、環状アルキル基とは、具体的にはシクロペンチル基、シクロヘキシル基等であり、芳香族置換基とは、具体的にはフェニル基、ｐ－ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。
タンパク質安定化剤として用いるにはポリマーの水への親和性を向上させるという観点から、Ｒ１は水素原子、メチル基、エチル基、及び、プロピル基のいずれかであることが好ましい。
In the above formula (4), R 1 is each independently a substituent, and is not particularly limited, selected from a hydrogen atom, a linear, branched or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an aromatic substituent.
Specific examples of the linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an n-butyl group, a pentyl group, and a hexyl group. Specific examples of the branched alkyl group include an isopropyl group and a 2-butyl group. Specific examples of the cyclic alkyl group include a cyclopentyl group and a cyclohexyl group. Specific examples of the aromatic substituent include a phenyl group, a p-nitrophenyl group, a bromophenyl group, a phenylboronic acid group, a hydroxyphenyl group, a dihydroxyphenyl group, and a trihydroxyphenyl group.
For use as a protein stabilizer, from the viewpoint of improving the affinity of the polymer for water, R 1 is preferably any one of a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, and a propyl group.
上記式（４）中、Ｒ３は水素原子もしくはメチル基を表す。 In the above formula (4), R3 represents a hydrogen atom or a methyl group.
上記式（４）で表されるスルフィドモノマーとしては、例えば、Ｒ１が共に水素原子であり、Ｒ３がメチル基であるスルフィドモノマー、Ｒ１がブチル基、Ｒ３がメチル基であるスルフィドモノマー、Ｒ１がベンジル基、Ｒ３がメチル基であるスルフィドモノマーが挙げられるが、合成のし易さからＲ１が水素原子であり、Ｒ３がメチル基であるスルフィドモノマーが好ましい。 Examples of the sulfide monomer represented by the above formula (4) include a sulfide monomer in which both R 1 are hydrogen atoms and R 3 is a methyl group, a sulfide monomer in which R 1 is a butyl group and R 3 is a methyl group, and a sulfide monomer in which R 1 is a benzyl group and R 3 is a methyl group. From the viewpoint of ease of synthesis, the sulfide monomer in which R 1 is a hydrogen atom and R 3 is a methyl group is preferred.
上記式（５）中、Ａは、単結合、エステル結合、アミド結合、エーテル結合から選択され、ｑは０～６の整数である。 In the above formula (5), A is selected from a single bond, an ester bond, an amide bond, and an ether bond, and q is an integer from 0 to 6.
Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表す。 R3 represents a hydrogen atom or a methyl group.
上記式（５）で表されるカルボン酸モノマーとしては、例えば、Ａが単結合、ｑ＝０、Ｒ３がメチル基であるカルボン酸モノマー、Ａがエステル結合、ｑ＝２であり、Ｒ３がメチル基であるカルボン酸モノマーが挙げられるが、合成の容易さからＡが単結合、ｑ＝０、Ｒ３がメチル基であるカルボン酸モノマーが好ましい。 Examples of the carboxylic acid monomer represented by the above formula (5) include a carboxylic acid monomer in which A is a single bond, q = 0, and R3 is a methyl group, and a carboxylic acid monomer in which A is an ester bond, q = 2, and R3 is a methyl group. From the viewpoint of ease of synthesis, the carboxylic acid monomer in which A is a single bond, q = 0, and R3 is a methyl group is preferred.
上記式（４）で表されるスルフィドモノマーと、上記式（５）で表されるカルボン酸モノマーをラジカル重合することにより得られる上記スルフィド含有共重合体ポリマーの分子量は特に限定されず、後続の［工程Ｂ］後、共重合体として要求される性能が発揮しうるように重合条件等を調製して適宜決定できるが、通常、数平均分子量で１，０００～１，０００，０００程度であり、上記共重合体を細胞凍結保存材として用いる場合には、水への溶解性の観点から３，０００～８０，０００が好ましく、５，０００～５０，０００がさらに好ましい。 The molecular weight of the sulfide-containing copolymer obtained by radical polymerization of the sulfide monomer represented by the above formula (4) and the carboxylic acid monomer represented by the above formula (5) is not particularly limited, and can be appropriately determined by adjusting the polymerization conditions, etc. so that the copolymer can exhibit the required performance after the subsequent [Step B]. However, the number average molecular weight is usually about 1,000 to 1,000,000. When the copolymer is used as a cell cryopreservation material, from the viewpoint of solubility in water, a number average molecular weight of 3,000 to 80,000 is preferable, and a number average molecular weight of 5,000 to 50,000 is even more preferable.
上記式（４）で表されるスルフィドモノマーと上記式（５）で表されるカルボン酸モノマーのラジカル重合は、他のモノマーとの共重合が可能な他のモノマーとの混合物を重合することもできる。
上記他のモノマーとしては用途によって適宜選択可能であり、例えば、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、グリセロール（メタ）アクリレート、（メタ）アクリロイルオキシエチルホスフェート、（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、Ｎ-メチルカルボキシベタイン（メタ）アクリレート、Ｎ－メチルスルホベタイン（メタ）アクリレート、メチル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、２－メトキシエチル（メタ）アクリレート等の各種（メタ）アクリル酸エステル；メチルビニルエーテル等の各種ビニルエーテル；その他、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ‘－ジメチルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、アリルアルコール、アクリロニトリル、アクロレイン、酢酸ビニル、ビニルスルホン酸ナトリウム、スチレン、クロロスチレン、ビニルフェノール、ビニルシンナメート、塩化ビニル、ビニルブロミド、ブタジエン、ビニレンカーボネート、イタコン酸、イタコン酸エステル、フマル酸、フマル酸エステル、マレイン酸、マレイン酸エステル等の各種ラジカル重合性モノマーが挙げられるが、上記共重合体を細胞凍結保存材として用いる場合、溶媒への溶解性の観点からのバランスから他のモノマーとしてはＮ，Ｎ‘－ジメチルアクリルアミド、ｎ－ブチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレートが好ましい。また、他のモノマーの配合量は任意であり、適宜選択できるが、上記共重合体の性能を引き出すためには、配合される上記他のモノマーが３０モル％以下で含まれていることが好ましく、２０モル％以下であることがより好ましく、１０モル％以下であることがさらに好ましい。
The radical polymerization of the sulfide monomer represented by the above formula (4) and the carboxylic acid monomer represented by the above formula (5) can also be carried out by polymerizing a mixture with other monomers that are copolymerizable with the other monomers.
The other monomers can be appropriately selected depending on the application, and examples thereof include various (meth)acrylic acid esters such as diethylaminoethyl (meth)acrylate, polyethylene glycol mono(meth)acrylate, glycerol (meth)acrylate, (meth)acryloyloxyethyl phosphate, (meth)acryloyloxyethyl phosphorylcholine, N-methylcarboxybetaine (meth)acrylate, N-methylsulfobetaine (meth)acrylate, methyl (meth)acrylate, glycidyl (meth)acrylate, dimethylaminoethyl (meth)acrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, and 2-methoxyethyl (meth)acrylate; various vinyl ethers such as methyl vinyl ether; and other acrylamide, N,N Examples of the radical polymerizable monomers include various radical polymerizable monomers such as N,N'-dimethylacrylamide, N-isopropyl (meth)acrylamide, (meth)acrylic acid, allyl alcohol, acrylonitrile, acrolein, vinyl acetate, sodium vinyl sulfonate, styrene, chlorostyrene, vinylphenol, vinyl cinnamate, vinyl chloride, vinyl bromide, butadiene, vinylene carbonate, itaconic acid, itaconic acid esters, fumaric acid, fumaric acid esters, maleic acid, and maleic acid esters. When the copolymer is used as a cell cryopreservation material, the other monomers are preferably N,N'-dimethylacrylamide, n-butyl (meth)acrylate, and polyethylene glycol mono(meth)acrylate in terms of balance from the viewpoint of solubility in the solvent. The amount of the other monomers to be blended is arbitrary and can be selected appropriately, but in order to bring out the performance of the copolymer, it is preferable that the other monomers to be blended are contained in an amount of 30 mol% or less, more preferably 20 mol% or less, and even more preferably 10 mol% or less.
上記式（４）で表されるスルフィドモノマーと上記式（５）で表されるカルボン酸モノマーのラジカル重合は、バルク重合も可能であるが、溶媒を加えて重合に供することもできる。また、溶媒としては上記式（４）で表されるスルフィドモノマーと上記式（５）で表されるカルボン酸モノマーが溶解するものであれば特に限定されず、一般的な溶媒が使用可能である。たとえばアセトン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの極性非プロトン性溶媒、メタノールなどの極性プロトン溶媒性溶媒から選択される。 The radical polymerization of the sulfide monomer represented by the above formula (4) and the carboxylic acid monomer represented by the above formula (5) can be carried out as a bulk polymerization, but a solvent can also be added to carry out the polymerization. The solvent is not particularly limited as long as it dissolves the sulfide monomer represented by the above formula (4) and the carboxylic acid monomer represented by the above formula (5), and any common solvent can be used. For example, the solvent is selected from polar aprotic solvents such as acetone, dioxane, dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), and tetrahydrofuran (THF), and polar protic solvents such as methanol.
上記式（４）で表されるスルフィドモノマーと上記式（５）で表されるカルボン酸モノマーのラジカル重合は、熱重合または光重合により行うことができる。上記熱重合は、熱重合開始剤を用いて行うことができる。熱重合開始剤としては、たとえば、過酸化物系ラジカル開始剤（過酸化ベンゾイル、過硫酸アンモニウム等）、または、アゾ系ラジカル開始剤（アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’－アゾビス－ジメチルバレロニトリル（ＡＤＶＮ）等）、２，２’－アゾビスシアノ吉草酸（ＡＣＶＡ）、アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン]二塩酸塩（ＶＡ－０４４）水溶性あるいは油溶性のレドックス系ラジカル開始剤（ジメチルアニリンと過酸化ベンゾイルからなる）が使用できる。ラジカル開始剤の使用量は、上記式（４）で表されるスルフィドモノマーと上記式（５）で表されるカルボン酸モノマーの合計１００質量部に対して通常０．０１から１０質量部が好ましい。重合温度および重合時間はラジカル開始剤の種類や他のモノマーの有無や種類などによって適宜選択して決定することができる。例えば、上記式（４）で表されるスルフィドモノマーと上記式（５）で表されるカルボン酸モノマーのラジカル重合を、ＡＩＢＮを用いて行う場合等において、重合温度は４０～９０℃、重合時間２～４８時間程度が適当である。重合温度は、好ましくは５０～８０℃であり、より好ましくは５５～７０℃である。また、重合時間は、好ましくは６～３０時間であり、より好ましくは、１２～２４時間である。 The radical polymerization of the sulfide monomer represented by the above formula (4) and the carboxylic acid monomer represented by the above formula (5) can be carried out by thermal polymerization or photopolymerization. The thermal polymerization can be carried out using a thermal polymerization initiator. As the thermal polymerization initiator, for example, a peroxide radical initiator (benzoyl peroxide, ammonium persulfate, etc.), an azo radical initiator (azobisisobutyronitrile (AIBN), 2,2'-azobis-dimethylvaleronitrile (ADVN), etc.), 2,2'-azobiscyanovaleric acid (ACVA), azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]dihydrochloride (VA-044), or a water-soluble or oil-soluble redox radical initiator (composed of dimethylaniline and benzoyl peroxide) can be used. The amount of the radical initiator used is usually 0.01 to 10 parts by mass per 100 parts by mass of the total of the sulfide monomer represented by the above formula (4) and the carboxylic acid monomer represented by the above formula (5). The polymerization temperature and polymerization time can be appropriately selected and determined depending on the type of radical initiator, the presence or absence of other monomers, and the types thereof. For example, when radical polymerization of a sulfide monomer represented by the above formula (4) and a carboxylic acid monomer represented by the above formula (5) is carried out using AIBN, the polymerization temperature is preferably 40 to 90°C and the polymerization time is preferably about 2 to 48 hours. The polymerization temperature is preferably 50 to 80°C, and more preferably 55 to 70°C. The polymerization time is preferably 6 to 30 hours, and more preferably 12 to 24 hours.
上述の光重合は、例えば、波長２５４ｎｍの紫外線（ＵＶ）または加速電圧１５０～３００ｋＶの電子線（ＥＢ）照射等により実施することができる。この際、光重合開始剤の使用は任意であるが、反応時間の点からは使用することが好ましい。光重合開始剤としては２－ヒドロキシ－２－メチル－１－フェニル－１－プロパノン、１－ヒドロキシ－シクロヘキシルフェニルケトンなどが挙げられるが、溶解性等の点から２－ヒドロキシ－２－メチル－１－フェニル－１－プロパノンが好ましく挙げられる。 The above-mentioned photopolymerization can be carried out, for example, by irradiation with ultraviolet light (UV) having a wavelength of 254 nm or an electron beam (EB) having an acceleration voltage of 150 to 300 kV. In this case, the use of a photopolymerization initiator is optional, but it is preferable to use one in terms of reaction time. Examples of photopolymerization initiators include 2-hydroxy-2-methyl-1-phenyl-1-propanone and 1-hydroxy-cyclohexyl phenyl ketone, with 2-hydroxy-2-methyl-1-phenyl-1-propanone being preferred in terms of solubility, etc.
上記式（４）で表されるスルフィドモノマーと上記式（５）で表されるカルボン酸モノマーのラジカル重合においては、連鎖移動剤を用いることもできる。上記連鎖移動剤としては２－メルカプトエタノール、１－メルカプト－２－プロパノール、３－メルカプト－１－プロパノール、ｐ－メルカプトフエノール、メルカプト酢酸、２－メルカプトプロピオン酸、３－メルカプトプロピオン酸、２－メルカプトニコチン酸などが挙げられる。 In the radical polymerization of the sulfide monomer represented by formula (4) and the carboxylic acid monomer represented by formula (5), a chain transfer agent can also be used. Examples of the chain transfer agent include 2-mercaptoethanol, 1-mercapto-2-propanol, 3-mercapto-1-propanol, p-mercaptophenol, mercaptoacetic acid, 2-mercaptopropionic acid, 3-mercaptopropionic acid, and 2-mercaptonicotinic acid.
上記式（４）で表されるスルフィドモノマーと上記式（５）で表されるカルボン酸モノマーのラジカル重合は、リビングラジカル重合法により行うことも可能であり、具体的には原子移動ラジカル重合法（ＡＴＲＰ法）、可逆的付加開裂連鎖移動重合法（ＲＡＦＴ重合法）及びニトロキシドを介した重合法（ＮＭＰ法）などが利用可能である。特に、細胞凍結保存材の用途では、金属を使用せず、酵素活性を低下させないといった理由で、可逆的付加開裂連鎖移動重合法（ＲＡＦＴ重合法）が好ましい。
上記ＲＡＦＴ重合の方法としては公知の方法が利用可能であり、例えばＷＯ９９／３１１４４、ＷＯ９８／０１４７８及び米国特許第６，１５３，７０５号に記載されている方法が有効である。ＲＡＦＴ重合を用いて、上記式（４）で表されるスルフィドモノマーと上記式（５）で表されるカルボン酸モノマーのラジカル重合を行う場合、通常のラジカル重合にＲＡＦＴ剤を添加することで行うことができる。上記ＲＡＦＴ剤としては４－シアノペンタン酸ジチオベンゾエート、２－シアノ－２－プロピルベンゾジチオエート、ベンジルベンゾジチオエート、２－フェニル－２－プロピルベンゾジチオエート、メチル２－フェニル－２－（フェニル－カーボノチオイルチオ）アセテート、４－シアノ－４－（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸Ｎ－スクシンイミジルエステル、４－シアノ－４－（ドデシルスルファニル－チオカルボニル）スルファニルペンタン酸、４－シアノ－４－（ドデシルスルファニル－チオカルボニル）スルファニルペンタノール、２－シアノ－２－プロピルドデシルトリチオカーボネート、２－（ドデシルチオカルボニルチオイルチオ）－２－メチルプロピオン酸、４－シアノ－４－（ドデシルスルファニル－チオカルボニル）スルファニルペンタン酸ポリエチレングリコールメチルエーテルエステル、２－（ドデシルチオカルボニルチオイルチオ）－２－メチルプロピオン酸３－アジド－１－プロパノールエステル、ベンジル１Ｈ－ピロール－１－カルボジチオエート、２－シアノプロパン－２－イル－Ｎ－メチル－Ｎ－ピリジン４－イルカルボジチオエート、プロピオン酸エチル－２－エチルザンテートから選択され、例えばＲ１が水酸基でありＲ３がメチル基である上記式（４）で表されるスルフィドモノマーと上記式（５）で表されるカルボン酸モノマーのラジカル重合では重合制御可能なモノマーとＲＡＦＴ剤の組み合わせから、４－シアノペンタン酸ジチオベンゾエート、４－シアノ－４－（ドデシルスルファニル－チオカルボニル）スルファニルペンタン酸が好ましい。
ＲＡＦＴ剤の使用量としては、上記式（４）で表されるスルフィドモノマーと上記式（５）で表されるカルボン酸モノマーの合計１００質量部に対して通常０．０１から２０質量部が好ましい。
The radical polymerization of the sulfide monomer represented by the above formula (4) and the carboxylic acid monomer represented by the above formula (5) can also be carried out by a living radical polymerization method, specifically, an atom transfer radical polymerization method (ATRP method), a reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization method (RAFT polymerization method), a polymerization method via nitroxide (NMP method), etc. In particular, in the application of a cell cryopreservation material, the reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization method (RAFT polymerization method) is preferred because it does not use metals and does not reduce enzyme activity.
As the method of the RAFT polymerization, a known method can be used, and for example, the methods described in WO99/31144, WO98/01478 and U.S. Patent No. 6,153,705 are effective. When radical polymerization of a sulfide monomer represented by the above formula (4) and a carboxylic acid monomer represented by the above formula (5) is carried out using RAFT polymerization, the radical polymerization can be carried out by adding a RAFT agent to a normal radical polymerization. The RAFT agent may be 4-cyanopentanoic acid dithiobenzoate, 2-cyano-2-propyl benzodithioate, benzyl benzodithioate, 2-phenyl-2-propyl benzodithioate, methyl 2-phenyl-2-(phenyl-carbonothioylthio)acetate, 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid N-succinimidyl ester, 4-cyano-4-(dodecylsulfanyl-thiocarbonyl)sulfanylpentanoic acid, 4-cyano-4-(dodecylsulfanyl-thiocarbonyl)sulfanylpentanol, 2-cyano-2-propyl pyridodecyl trithiocarbonate, 2-(dodecylthiocarbonylthioylthio)-2-methylpropionic acid, 4-cyano-4-(dodecylsulfanyl-thiocarbonyl)sulfanylpentanoic acid polyethylene glycol methyl ether ester, 2-(dodecylthiocarbonylthioylthio)-2-methylpropionic acid 3-azido-1-propanol ester, benzyl 1H-pyrrole-1-carbodithioate, 2-cyanopropan-2-yl-N-methyl-N-pyridin 4-ylcarbodithioate, ethyl propionate-2-ethyl xanthate, for example R In the radical polymerization of a sulfide monomer represented by the above formula (4) in which R 1 is a hydroxyl group and R 3 is a methyl group, and a carboxylic acid monomer represented by the above formula (5), 4-cyanopentanoic acid dithiobenzoate and 4-cyano-4-(dodecylsulfanyl-thiocarbonyl)sulfanylpentanoic acid are preferred in terms of the combination of a monomer capable of controlling polymerization and a RAFT agent.
The amount of the RAFT agent used is usually preferably 0.01 to 20 parts by mass per 100 parts by mass of the sulfide monomer represented by the above formula (4) and the carboxylic acid monomer represented by the above formula (5) combined.
上記式（４）で表されるスルフィドモノマーと上記式（５）で表されるカルボン酸モノマーのラジカル重合では、特に限定されないが上記リビングラジカル重合法を用いることでブロックコポリマーを得ることができる。上記式（４）で表されるスルフィドモノマーおよび上記式（５）で表されるカルボン酸モノマー、もしくは上記他のモノマーをリビングラジカル重合法によりブロックＡを製造し、得られたブロックＡをマクロ重合開始剤として、上記式（４）で表されるスルフィドモノマーおよび上記式（５）で表されるカルボン酸モノマー、もしくは上記他のモノマーのうち上記ブロックＡに含有されないモノマーをリビングラジカル重合法により重合して、ブロックＡに繋げてブロックＢを製造することができる。
また、上述のブロックＡ及びＢを形成させずに、上記式（４）で表されるスルフィドモノマーと上記式（５）で表されるカルボン酸モノマーとの混合物を用いるラジカル重合によれば、ランダムコポリマーが製造される。
上記共重合体、特に、ブロックコポリマーを細胞凍結保存材として用いる場合、他のモノマーとしては溶媒への溶解性の観点からｎ－ブチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレートが好ましい。
また、他のモノマーの配合量は任意であり、適宜選択できるが、上記共重合体、特に、ブランダムコポリマーの性能を引き出すためには、配合される上記他のモノマーが３０モル％以下であることが好ましく、２０モル％以下であることがより好ましく、１０モル％以下であることがさらに好ましい。
In the radical polymerization of the sulfide monomer represented by the above formula (4) and the carboxylic acid monomer represented by the above formula (5), although not particularly limited, a block copolymer can be obtained by using the above living radical polymerization method. Block A is produced by the living radical polymerization method of the sulfide monomer represented by the above formula (4) and the carboxylic acid monomer represented by the above formula (5), or the other monomers, and the obtained block A is used as a macropolymerization initiator to polymerize the sulfide monomer represented by the above formula (4) and the carboxylic acid monomer represented by the above formula (5), or a monomer not contained in the block A among the other monomers, by the living radical polymerization method, and linked to block A to produce block B.
Furthermore, by carrying out radical polymerization using a mixture of a sulfide monomer represented by the above formula (4) and a carboxylic acid monomer represented by the above formula (5) without forming the above blocks A and B, a random copolymer is produced.
When the above-mentioned copolymer, particularly the block copolymer, is used as a cell cryopreservation material, the other monomer is preferably n-butyl(meth)acrylate or polyethylene glycol mono(meth)acrylate from the viewpoint of solubility in a solvent.
In addition, the amount of the other monomers to be blended is arbitrary and can be selected appropriately, but in order to bring out the performance of the above-mentioned copolymer, particularly the brandum copolymer, the amount of the other monomers to be blended is preferably 30 mol % or less, more preferably 20 mol % or less, and even more preferably 10 mol % or less.
上記スルフィド含有共重合体は、そのまま未精製で用いられるほか、好ましくは過剰な溶媒の減圧留去、再沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィーや透析などの処理により単離、精製を行うこともできる。 The sulfide-containing copolymer may be used as is without purification, or may be isolated and purified, preferably by distillation under reduced pressure to remove excess solvent, reprecipitation, gel filtration chromatography, dialysis, or other treatments.
〔工程Ｂ〕
上記〔工程Ａ〕で得られたスルフィド含有共重合体と、下記式（６）で表されるスルフィド反応性化合物とを反応させる工程である。
上記式（６）におけるＲ２は、式（１）、式（２）、式（４）及び式（５）におけるＲ２と同義たり得るが、具体的には、以下の通りである。すなわち、上記式（６）中、Ｒ２は、それぞれ独立した置換基であり、特に限定されないが、水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分岐、環状アルキル基、あるいは芳香族置換基から選択される。炭素数が１～６の直鎖アルキル基とは具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ｎ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基であり、分岐アルキル基とは具体的にはイソプロピル基、２－ブチル基であり、環状アルキル基とは具体的にはシクロペンチル基、シクロヘキシル基であり、芳香族置換基とは具体的にはフェニル基、ｐ－ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。
上記共重合体を細胞凍結保存材として用いるにはポリマーの水への親和性を向上させるという観点から、Ｒ２は水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基のいずれかであることが好ましい。
[Step B]
This is a step of reacting the sulfide-containing copolymer obtained in the above [Step A] with a sulfide-reactive compound represented by the following formula (6).
R 2 in the above formula (6) may be synonymous with R 2 in formulas (1), (2), (4) and (5), but is specifically as follows. That is, in the above formula (6), R 2 is each an independent substituent, and is selected from, but is not particularly limited to, a hydrogen atom, a linear, branched or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an aromatic substituent. The linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is specifically a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an n-butyl group, a pentyl group or a hexyl group, the branched alkyl group is specifically an isopropyl group or a 2-butyl group, the cyclic alkyl group is specifically a cyclopentyl group or a cyclohexyl group, and the aromatic substituent is specifically a phenyl group, a p-nitrophenyl group, a bromophenyl group, a phenylboronic acid, a hydroxyphenyl group, a dihydroxyphenyl group or a trihydroxyphenyl group.
In order to use the copolymer as a cell cryopreservation material, from the viewpoint of improving the affinity of the polymer for water, R2 is preferably any one of a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, and a propyl group.
上記式（６）で表されるスルフィド反応性化合物としては、例えば、両性イオンポリマーの水への親水性を維持する観点から、ヨードメタン、ヨードエタン、ヨードプロパン、ヨードブタンが好ましい。 As the sulfide-reactive compound represented by the above formula (6), for example, iodomethane, iodoethane, iodopropane, and iodobutane are preferred from the viewpoint of maintaining the hydrophilicity of the zwitterionic polymer in water.
上記スルフィド含有共重合体と上記式（６）で表されるスルフィド反応性化合物との反応に用いられる溶媒としては、上記スルフィド含有共重合体と上記スルフィド反応性化合物が溶解するものであれば特に限定されず、一般的な溶媒が使用可能である。たとえば、アセトン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの極性非プロトン性溶媒、メタノールなどの極性プロトン溶媒性溶媒から選択される。溶媒の使用量は、上記スルフィド含有共重合体に対して質量比で１～１００倍量、好ましくは１～５０倍量、さらに好ましくは１～３０倍量である。 The solvent used in the reaction of the sulfide-containing copolymer with the sulfide-reactive compound represented by formula (6) is not particularly limited as long as it dissolves the sulfide-containing copolymer and the sulfide-reactive compound, and a general solvent can be used. For example, the solvent is selected from polar aprotic solvents such as acetone, dioxane, dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), and tetrahydrofuran (THF), and polar protic solvents such as methanol. The amount of the solvent used is 1 to 100 times, preferably 1 to 50 times, and more preferably 1 to 30 times, the mass ratio of the sulfide-containing copolymer.
上記式（６）で表されるスルフィド反応性化合物の使用量は、上記スルフィド含有共重合体に対して質量比で０．１～１００倍量、好ましくは０．１～５０倍量、さらに好ましくは０．１～３０倍量である。 The amount of the sulfide-reactive compound represented by the above formula (6) used is 0.1 to 100 times, preferably 0.1 to 50 times, and more preferably 0.1 to 30 times, by mass ratio relative to the amount of the sulfide-containing copolymer.
上記スルフィド含有共重合体と上記式（６）で表されるスルフィド反応性化合物との反応温度は、使用する溶媒にもよるものの、通常－２０～１００℃、好ましくは０～７０℃、さらに好ましくは２０～５０℃の範囲である。反応時間は、反応温度、用いる上記スルフィド含有共重合体の分子量、上記スルフィド反応性化合物の種類により異なるが、通常１～７２時間程度が好ましく、より好ましくは１～２４時間である。 The reaction temperature between the sulfide-containing copolymer and the sulfide-reactive compound represented by formula (6) is usually in the range of -20 to 100°C, preferably 0 to 70°C, and more preferably 20 to 50°C, although it depends on the solvent used. The reaction time varies depending on the reaction temperature, the molecular weight of the sulfide-containing copolymer used, and the type of the sulfide-reactive compound, but is usually preferably about 1 to 72 hours, and more preferably 1 to 24 hours.
以上のように、上記スルフィド含有共重合体と、上記式（６）で表されるスルフィド反応性化合物とを反応させて、上記共重合体を得ることができる。得られた上記共重合体はそのまま未精製で用いられるほか、好ましくは過剰な上記スルフィド反応性化合物の減圧留去、再沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィーや透析などの処理により単離、精製を行うこともできる。 As described above, the above-mentioned sulfide-containing copolymer can be reacted with the sulfide-reactive compound represented by the above formula (6) to obtain the above-mentioned copolymer. The obtained copolymer can be used as is without purification, or it can be isolated and purified, preferably by a process such as vacuum distillation of the excess sulfide-reactive compound, reprecipitation, gel filtration chromatography, or dialysis.
＜共重合体の合成２＞
本発明の共重合体は、また、下記の〔工程Ｃ〕によっても製造できる。
〔工程Ｃ〕
下記式（７）で表されるカチオン性モノマーと、下記式（５）で表されるアニオン性モノマーとをラジカル重合により共重合する工程である。
式（５）におけるＲ１～Ｒ３、Ａ、及びｑの定義についても上述の式（２）等におけるＲ１～Ｒ３、Ａ、及びｑと同義たり得るが、具体的には、以下の通りである。
<Synthesis of copolymer 2>
The copolymer of the present invention can also be produced by the following [Step C].
[Step C]
This is a step of copolymerizing a cationic monomer represented by the following formula (7) with an anionic monomer represented by the following formula (5) by radical polymerization.
The definitions of R 1 to R 3 , A, and q in the formula (5) may be the same as those of R 1 to R 3 , A, and q in the above formula (2) etc., and specifically, are as follows.
すなわち、上記式（７）において、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、炭素数が６～２０の芳香族基、あるいは、Ｒ１とＲ２とが互いに連結された炭素数１～６のアルキレン基から選択され、Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表す。また、式（７）中、ｐは１～６の整数である。
上記式（５）において、Ａは単結合、エステル結合、アミド結合、エーテル結合から選択され、Ｒ３は水素原子もしくはメチル基を表し、ｑは０～６の整数である。
That is, in the above formula (7), R 1 and R 2 are each independently selected from a hydrogen atom, a linear, branched, or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aromatic group having 6 to 20 carbon atoms, or an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms in which R 1 and R 2 are linked to each other, and R 3 represents a hydrogen atom or a methyl group. Also, in formula (7), p is an integer of 1 to 6.
In the above formula (5), A is selected from a single bond, an ester bond, an amide bond, and an ether bond; R3 represents a hydrogen atom or a methyl group; and q is an integer of 0 to 6.
［工程Ｃ］においては、上述の［工程Ａ］に準じた反応条件が適用され得る。すなわち、［工程Ｃ］における式（７）のカチオン性モノマーと式（５）のアニオン性モノマーとラジカル重合反応においては、上記式（４）で表されるスルフィドモノマーと上記式（５）で表されるカルボン酸モノマーのラジカル重合反応に関する上述の［工程Ａ］において、式（４）のスルフィドモノマーの代わりに式（７）のカチオン性モノマーを同量、用いる他、［工程Ａ］と共通の反応条件が適用され得る。 In [Step C], reaction conditions similar to those in [Step A] described above can be applied. That is, in the radical polymerization reaction of the cationic monomer of formula (7) and the anionic monomer of formula (5) in [Step C], the same amount of the cationic monomer of formula (7) is used instead of the sulfide monomer of formula (4) in the above-mentioned [Step A] regarding the radical polymerization reaction of the sulfide monomer of formula (4) and the carboxylic acid monomer of formula (5) described above, and the same reaction conditions as in [Step A] can be applied.
［３．細胞凍結保存材及び細胞凍結保存液］
次に、本発明の細胞凍結保存材等について説明する。
＜細胞凍結保存材＞
本発明における細胞凍結保存材とは、動物、植物由来の細胞や細胞集塊、組織の凍結-融解を行った際にダメージを軽減することができる材料のことであり、少なくとも上記共重合体を含む。さらに、通常、共重合体の他にも水や培地を加えて使用し、細胞の凍結-融解後の生存率の更なる向上を目的として添加剤を添加することができる。
[3. Cell cryopreservation materials and cell cryopreservation solutions]
Next, the cell cryopreservation material and the like of the present invention will be described.
<Cell cryopreservation materials>
The cell cryopreservation material in the present invention is a material capable of reducing damage caused to cells, cell clumps, and tissues derived from animals and plants when they are frozen and thawed, and contains at least the copolymer described above. In addition, in addition to the copolymer, water and a culture medium are usually added, and additives can be added to further improve the survival rate of cells after freezing and thawing.
上記水としては、精製水、純水、イオン交換水等が好ましく、また水を含有する各種緩衝液であってもよい。各種緩衝液としては、タンパク質の酵素活性、抗原性等の生理活性を失わせるようなものでなければ、通常この分野で用いられる緩衝液を用いることができる。例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられ、これらを混合して使用してもよい。 Preferably, the water is purified water, pure water, ion-exchanged water, or the like, or may be various buffer solutions containing water. As various buffer solutions, any buffer solution normally used in this field may be used, so long as it does not cause loss of physiological activity, such as enzyme activity or antigenicity, of the protein. Examples of such buffer solutions include phosphate buffer, Tris buffer, Good's buffer, glycine buffer, borate buffer, and the like, and these may be used in combination.
上記培地とは、凍結する細胞に適したものであれば特に限定されず、一般的な細胞培養用培地が利用可能である。たとえば、ダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ）、α－ＭＥＭ培地、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地、Ｆ１２培地、ＴＣ１９９培地、ＧＭＥＭ培地、などが挙げられ、これらを混合したり、必要に応じてウシ胎児血清（ＦＢＳ）やグルタミン、抗生物質といったサプリメントを添加してもよい。 The medium is not particularly limited as long as it is suitable for the cells to be frozen, and general cell culture media can be used. Examples include Dulbecco's Modified Eagle's MEM medium (DMEM), α-MEM medium, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, F12 medium, TC199 medium, and GMEM medium. These may be mixed, and supplements such as fetal bovine serum (FBS), glutamine, and antibiotics may be added as necessary.
上記添加剤としては、細胞の凍結-融解後の生存率の向上を目的として、通常、この分野で用いられるその他の試薬類等であって、例えば、一般的な細胞凍結保存材、糖類、多糖類、タンパク質、塩類、界面活性剤等が挙げられる。 The additives include other reagents that are typically used in this field to improve the survival rate of cells after freezing and thawing, such as common cell cryopreservation materials, sugars, polysaccharides, proteins, salts, surfactants, etc.
上記一般的な細胞凍結保存材としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）等が挙げられる。 Examples of common cell cryopreservation materials include dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol, glycerin, ethylene glycol, propylene glycol, polyvinyl alcohol (PVA), etc.
上記糖類としては、例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース等が挙げられる。 Examples of the sugars include lactose, sucrose, and trehalose.
上記多糖類としては、例えば、アルギン酸、プルラン、キトサン、デキストラン、グルコマンナンなどが挙げられる。 Examples of the polysaccharides include alginic acid, pullulan, chitosan, dextran, and glucomannan.
上記タンパク質としては、例えば、牛胎児血清（ＦＢＳ）、不凍ペプチド、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、カゼイン等が挙げられる。 Examples of the above proteins include fetal bovine serum (FBS), antifreeze peptides, bovine serum albumin, gelatin, casein, etc.
上記塩類としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、ヒスチジン等のアミノ酸およびアミノ酸塩、グリシルグリシン等のペプチド類、リン酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩、トリス塩等の無機塩類、フラビン類、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、グルコン酸などの有機酸および有機酸の塩等が挙げられる。 Examples of the above salts include amino acids and amino acid salts such as glycine, alanine, serine, threonine, glutamic acid, aspartic acid, glutamine, asparagine, lysine, and histidine, peptides such as glycylglycine, inorganic salts such as phosphates, borates, sulfates, and tris salts, flavins, organic acids and organic acid salts such as acetic acid, citric acid, malic acid, maleic acid, and gluconic acid, etc.
上記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｔｗｅｅｎ２０、プルロニック（登録商標）等が挙げられる。 Examples of the above surfactants include polyoxyethylene alkyl ether, Tween 20, and Pluronic (registered trademark).
細胞凍結保存材に含有される上記添加剤は、細胞凍結保存効果があれば特に限定されないが、０．１質量％以上であることが好ましく、１質量％以上がより好ましい。上限値としては、主溶媒である水に溶解する限り特に制限はないが、例えば、３０質量％以下、好ましくは２０質量％以下、より好ましくは１０質量％以下である。これらの範囲であれば、タンパク質安定化剤は有効なタンパク質安定化効果を示すことができる。 The additives contained in the cell cryopreservation material are not particularly limited as long as they have a cell cryopreservation effect, but are preferably 0.1% by mass or more, and more preferably 1% by mass or more. There are no particular limitations on the upper limit as long as they are soluble in the main solvent, water, but for example, they are 30% by mass or less, preferably 20% by mass or less, and more preferably 10% by mass or less. Within these ranges, the protein stabilizer can exhibit an effective protein stabilization effect.
上記細胞としては、培養用樹立細胞、ヒトを含む動物の受精卵および卵細胞を挙げることができる。また、精細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、臍帯血細胞などの幹細胞、肝細胞、神経細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、血球細胞などのヒトを含む動物細胞もしくは植物細胞を挙げることができる。本発明の凍結保存剤を用いて凍結保存が可能な組織・臓器としては、皮膚、神経、血管、軟骨、角膜、肝臓、腎臓、心臓、膵島などを挙げることができる。さらに上記細胞を単独、もしくは混合して凝集させたスフェロイドや細胞シートといった形態も、凍結保存の対象として挙げることができる。 Examples of the above cells include established cells for culture, and fertilized eggs and egg cells of animals, including humans. Other examples include stem cells, such as sperm cells, ES cells, iPS cells, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, and umbilical cord blood cells, as well as animal cells, including humans, or plant cells, such as liver cells, nerve cells, cardiac muscle cells, vascular endothelial cells, vascular smooth muscle cells, and blood cells. Examples of tissues and organs that can be cryopreserved using the cryopreservation agent of the present invention include skin, nerves, blood vessels, cartilage, cornea, liver, kidney, heart, and pancreatic islets. Furthermore, spheroids and cell sheets formed by aggregating the above cells alone or in mixtures can also be included as targets for cryopreservation.
冷却工程においては、１分間に０．５℃ から１０℃の比率で冷却を行うことが好ましい。さらに好ましいのは、１分間に０．５℃ から２℃の冷却速度である。また、保存工程は、例えば、－８０℃以下で可能となるが、より安定な保存の面から液体窒素中または液体窒素蒸気層中で保存することが好ましい。融解工程においては、公知の手段を使用することができる。 In the cooling process, it is preferable to cool at a rate of 0.5°C to 10°C per minute. More preferably, the cooling rate is 0.5°C to 2°C per minute. In addition, the storage process can be performed at temperatures below -80°C, for example, but it is preferable to store the material in liquid nitrogen or in a liquid nitrogen vapor layer for more stable storage. In the melting process, known means can be used.
＜細胞凍結保存液＞
本発明の細胞凍結保存液は、上述の共重合体を１～３０重量％の濃度で含有する。すなわち、細胞凍結保存液は、細胞凍結保存液の全体の重量を基準として、１～３０重量％の共重合体を含むものであり、好ましくは２～２０重量％の共重合体を含み、より好ましくは５～１５重量％の共重合体を含む。
細胞凍結保存液においては、共重合体の他に、＜細胞凍結保存材＞の欄で記載した添加剤等の成分を含めることもできる。
なお、細胞凍結保存液は、上述の各成分を混合させることにより製造される。
<Cell cryopreservation solution>
The cell cryopreservation solution of the present invention contains the above-mentioned copolymer at a concentration of 1 to 30% by weight, i.e., the cell cryopreservation solution contains 1 to 30% by weight of the copolymer, preferably 2 to 20% by weight of the copolymer, and more preferably 5 to 15% by weight of the copolymer, based on the total weight of the cell cryopreservation solution.
In addition to the copolymer, the cell cryopreservation solution may also contain components such as additives described in the section <Cell cryopreservation materials>.
The cell cryopreservation solution is produced by mixing the above-mentioned components.
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。 The present invention will be described in detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
＜実施例１：ポリマーＡの合成＞
次に、反応液にヨードメタン（２ｍＬ）を加え、室温で２０時間反応させた。得られた反応液をメタノール及びイオン交換水で透析（ＭＷＣＯ＝１０００Ｄａ）することで精製し、その後凍結乾燥することでランダムコポリマーＡを得た。
組成比（モル比） ｘ：ｙ＝６７：３３
収量 １．３２ｇ
Example 1: Synthesis of Polymer A
Next, iodomethane (2 mL) was added to the reaction solution, and the mixture was reacted at room temperature for 20 hours. The reaction solution was purified by dialysis (MWCO = 1000 Da) against methanol and ion-exchanged water, and then freeze-dried to obtain random copolymer A.
Composition ratio (molar ratio) x:y=67:33
Yield: 1.32g
得られたポリマーＡの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、検出器に示差屈折率計を用いたゲル浸透クロマトグラフィー測定によりもとめた。ポンプに島津製作所（株）社製 ＬＣ－７２０ＡＤを、検出器（示差屈折率計）に島津製作所（株）社製 ＲＩＤ１０Ａを、検出器（ＵＶ）にＳＰＤ－２０Ａを用いた。カラムには、東ソー（株）社製ＴＳＫＧｅｌ Ｇ３０００ＰＷＸＬとＴＳＫＧｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ（カラムサイズ ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）とを二本連結したものを用いた。展開溶媒は、ｐＨ９．０に調製した５０ｍＭリン酸バッファー／アセトニトリル（９／１ ｖ／ｖ）を用いた。測定条件は、流速 ０．６ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度 ４０℃、サンプル濃度 ２ｍｇ／ｍｌ、注入量 ７０μＬであった。スタンダートとしてポリエチレングリコールを用いた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマーＡの数平均分子量は、１３５，０００、分子量分布は２．６５であった。 The number average molecular weight and molecular weight distribution (weight average molecular weight/number average molecular weight) of the obtained polymer A were determined by gel permeation chromatography using a differential refractometer as a detector. The pump used was LC-720AD manufactured by Shimadzu Corporation, the detector (differential refractometer) was RID10A manufactured by Shimadzu Corporation, and the detector (UV) was SPD-20A. The column used was a combination of two columns, TSKGel G3000P WXL and TSKGel G5000P WXL (column size 4.6 mm x 25 cm) manufactured by Tosoh Corporation. The developing solvent used was 50 mM phosphate buffer/acetonitrile (9/1 v/v) adjusted to pH 9.0. The measurement conditions were a flow rate of 0.6 ml/min, a column temperature of 40°C, a sample concentration of 2 mg/ml, and an injection amount of 70 μL. Polyethylene glycol was used as a standard. As a result of gel permeation chromatography, the number average molecular weight of polymer A was 135,000 and the molecular weight distribution was 2.65.
＜実施例２：ポリマーＢの合成＞
次に、反応液にヨードメタン（２ｍＬ）を加え、室温で２０時間反応させた。得られた反応液をメタノール及びイオン交換水で透析（ＭＷＣＯ＝１０００Ｄａ）することで精製し、その後凍結乾燥することでポリマーＢを得た。
組成比（モル比） ｘ：ｙ＝６７：３３
収量 １．２０ｇ
Example 2: Synthesis of polymer B
Next, iodomethane (2 mL) was added to the reaction solution, and the mixture was reacted at room temperature for 20 hours. The reaction solution was purified by dialysis (MWCO = 1000 Da) against methanol and ion-exchanged water, and then freeze-dried to obtain Polymer B.
Composition ratio (molar ratio) x:y=67:33
Yield: 1.20 g
得られたポリマーＢの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、実施例１と同様にして求めた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマーＢの数平均分子量は１３，０００、分子量分布は１．３２であった。 The number average molecular weight and molecular weight distribution (weight average molecular weight/number average molecular weight) of the obtained polymer B were determined in the same manner as in Example 1. As a result of gel permeation chromatography measurement, the number average molecular weight of polymer B was 13,000 and the molecular weight distribution was 1.32.
＜実施例３：ポリマーＣの合成＞
次に反応液にヨードメタン（２ｍＬ）を加え、室温で２０時間反応させた。得られた反応液をメタノール及びイオン交換水で透析（ＭＷＣＯ＝１０００Ｄａ）することで精製し、その後凍結乾燥することでポリマーＣを得た。
組成比（モル比） ｘ：ｙ＝５２：４８
収量 １．１７ｇ
Example 3: Synthesis of polymer C
Next, iodomethane (2 mL) was added to the reaction solution, and the mixture was reacted at room temperature for 20 hours. The resulting reaction solution was purified by dialysis (MWCO = 1000 Da) against methanol and ion-exchanged water, and then freeze-dried to obtain Polymer C.
Composition ratio (molar ratio) x:y=52:48
Yield: 1.17g
得られたポリマーＣの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、実施例１と同様にして求めた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマーＣの数平均分子量は１２，０００、分子量分布は１．２５であった。 The number average molecular weight and molecular weight distribution (weight average molecular weight/number average molecular weight) of the obtained polymer C were determined in the same manner as in Example 1. As a result of gel permeation chromatography measurement, the number average molecular weight of polymer C was 12,000 and the molecular weight distribution was 1.25.
＜実施例４：ポリマーＤの合成＞
次に、反応液にヨードメタン（２ｍＬ）を加え、室温で２０時間反応させた。得られた反応液をメタノール及びイオン交換水で透析（ＭＷＣＯ＝１０００Ｄａ）することで精製し、その後凍結乾燥することでポリマーＤを得た。
組成比（モル比） ｘ：ｙ＝３２：６８
収量 ０．９１ｇ
Example 4: Synthesis of polymer D
Next, iodomethane (2 mL) was added to the reaction solution, and the mixture was reacted at room temperature for 20 hours. The reaction solution was purified by dialysis (MWCO = 1000 Da) against methanol and ion-exchanged water, and then freeze-dried to obtain polymer D.
Composition ratio (molar ratio) x:y=32:68
Yield: 0.91g
得られたポリマーＤの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、実施例１と同様にして求めた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマーＤの数平均分子量は１２，０００、分子量分布は１．３５であった。 The number average molecular weight and molecular weight distribution (weight average molecular weight/number average molecular weight) of the obtained polymer D were determined in the same manner as in Example 1. As a result of gel permeation chromatography measurement, the number average molecular weight of polymer D was 12,000 and the molecular weight distribution was 1.35.
＜実施例５：ポリマーＥの合成＞
次に、ヨードブタン（３．４ｍＬ）を加え、室温で２０時間反応させた。得られた反応液をメタノール及びイオン交換水で透析（ＭＷＣＯ＝１０００Ｄａ）することで精製し、その後凍結乾燥することでポリマーＥを得た。
組成比（モル比） ｘ：ｙ＝６７：３３
収量 １．２２ｇ
Example 5: Synthesis of polymer E
Next, iodobutane (3.4 mL) was added and reacted at room temperature for 20 hours. The resulting reaction solution was purified by dialysis (MWCO = 1000 Da) against methanol and ion-exchanged water, and then freeze-dried to obtain polymer E.
Composition ratio (molar ratio) x:y=67:33
Yield: 1.22g
得られたポリマーＥの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、実施例１と同様にして求めた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマーＥの数平均分子量は１２，７００、分子量分布は１．２６であった。 The number average molecular weight and molecular weight distribution (weight average molecular weight/number average molecular weight) of the obtained polymer E were determined in the same manner as in Example 1. As a result of gel permeation chromatography measurement, the number average molecular weight of polymer E was 12,700 and the molecular weight distribution was 1.26.
＜実施例６：ポリマーＦの合成＞
次に、ヨードメタン（２ｍＬ）を加え、室温で２０時間反応させた。得られた反応液をメタノール及びイオン交換水で透析（ＭＷＣＯ＝１０００Ｄａ）することで精製し、その後凍結乾燥することでポリマーＦを得た。
組成比（モル比） ｘ：ｙ＝６９：３１
収量 １．４１ｇ
Example 6: Synthesis of polymer F
Next, iodomethane (2 mL) was added and reacted at room temperature for 20 hours. The resulting reaction solution was purified by dialysis (MWCO = 1000 Da) against methanol and ion-exchanged water, and then freeze-dried to obtain Polymer F.
Composition ratio (molar ratio) x:y=69:31
Yield: 1.41g
得られたポリマーＦの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、実施例１と同様にして求めた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマーＦの数平均分子量は１４，０００、分子量分布は１．３０であった。 The number average molecular weight and molecular weight distribution (weight average molecular weight/number average molecular weight) of the obtained polymer F were determined in the same manner as in Example 1. As a result of gel permeation chromatography measurement, the number average molecular weight of polymer F was 14,000 and the molecular weight distribution was 1.30.
＜実施例７：ポリマーＧの合成＞
次に、ヨードメタン（２ｍＬ）を加え、室温で２０時間反応させた。得られた反応液をメタノール及びイオン交換水で透析（ＭＷＣＯ＝１０００Ｄａ）することで精製し、その後凍結乾燥することでポリマーＧを得た。
組成比（モル比） ｘ：ｙ：ｚ＝６１：２９：１０
収量 １．２５ｇ
Example 7: Synthesis of polymer G
Next, iodomethane (2 mL) was added and reacted at room temperature for 20 hours. The resulting reaction solution was purified by dialysis (MWCO = 1000 Da) against methanol and ion-exchanged water, and then freeze-dried to obtain polymer G.
Composition ratio (mole ratio) x:y:z=61:29:10
Yield: 1.25g
得られたポリマーＧの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、実施例１と同様にして求めた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマーＧの数平均分子量は１２，６００、分子量分布は１．３５であった。 The number average molecular weight and molecular weight distribution (weight average molecular weight/number average molecular weight) of the obtained polymer G were determined in the same manner as in Example 1. As a result of gel permeation chromatography measurement, the number average molecular weight of polymer G was 12,600 and the molecular weight distribution was 1.35.
＜実施例８：細胞凍結保存試験＞
（細胞凍結保存液の調製）
実施例２で合成したポリマーＢを、細胞凍結保存材として用い、濃度が１０質量％となるように無血清培地に溶解させて細胞凍結保液を調製した。
Example 8: Cell cryopreservation test
(Preparation of cell cryopreservation solution)
Polymer B synthesized in Example 2 was used as a cell cryopreservation material and was dissolved in a serum-free medium to a concentration of 10% by mass to prepare a cell cryopreservation solution.
（細胞凍結保存試験）
１×１０６個のＨｅＬａ細胞、Ｌ－９２９細胞、ＨＵＶＥＣ、ＨｅｐＧ２、ＭＳＣをクライオバイアル中、上記細胞凍結保存液１ｍＬに懸濁し、－８０℃のフリーザーに入れて、－１℃／ｍｉｎの速度で一晩、緩慢凍結を行った。その後クライオバイアルを取り出し、液体窒素中で保存した。１週間保存後、３７℃の温浴中で急速解凍後、速やかに培地で洗浄したのちトリパンブルー染色にて生死判定を行った。生存率（％）は生細胞数／全細胞数×１００で計算され、生存率が高いほど細胞凍結保存効果が高いことを表す。評価結果を表１に示す。
(Cell cryopreservation test)
1 x 106 HeLa cells, L-929 cells, HUVEC, HepG2, and MSC were suspended in 1 mL of the above cell cryopreservation solution in a cryovial, placed in a -80°C freezer, and slowly frozen overnight at a rate of -1°C/min. The cryovial was then removed and stored in liquid nitrogen. After storage for one week, the cells were rapidly thawed in a 37°C warm bath, quickly washed with medium, and then subjected to a live/dead determination by trypan blue staining. The survival rate (%) was calculated as the number of live cells/total number of cells x 100, and the higher the survival rate, the higher the cell cryopreservation effect. The evaluation results are shown in Table 1.
＜実施例９～１０＞
表１に示す細胞凍結保存材を使用したこと以外は、実施例８と同様にして細胞凍結保存試験を行った。評価結果を表１に示す。
<Examples 9 to 10>
A cell cryopreservation test was carried out in the same manner as in Example 8, except that the cell cryopreservation materials shown in Table 1 were used. The evaluation results are shown in Table 1.
＜実施例１３＞
細胞凍結保存材を０．５重量％で添加した以外は、実施例８と同様にして細胞凍結保存試験を行った。評価結果を表１に示す。
Example 13
A cell cryopreservation test was carried out in the same manner as in Example 8, except that the cell cryopreservation material was added at 0.5% by weight. The evaluation results are shown in Table 1.
＜比較合成例１：ポリマーＨの合成＞
組成比（モル比） ｘ：ｙ＝６７：３３
収量 １．１１ｇ
Comparative Synthesis Example 1: Synthesis of Polymer H
Composition ratio (molar ratio) x:y=67:33
Yield: 1.11g
得られたポリマーＨの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、実施例１と同様にして求めた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマーＩの数平均分子量は１１，５００、分子量分布は１．２０であった。 The number average molecular weight and molecular weight distribution (weight average molecular weight/number average molecular weight) of the obtained polymer H were determined in the same manner as in Example 1. As a result of gel permeation chromatography measurement, the number average molecular weight of polymer I was 11,500 and the molecular weight distribution was 1.20.
＜比較例１＞
細胞凍結保存材としてポリマーＨを用いたこと以外は、実施例８と同様にして細胞凍結保存試験を行った。評価結果を表１に示す。
<Comparative Example 1>
A cell cryopreservation test was carried out in the same manner as in Example 8, except that Polymer H was used as the cell cryopreservation material. The evaluation results are shown in Table 1.
表１に示すとおり、実施例のポリマー、特に、実施例８のポリマーＢおよび実施例９のポリマーＧを細胞凍結保存材として用いた場合、比較例と比較して顕著な細胞凍結保存効果を示していることがわかる。 As shown in Table 1, when the polymers of the examples, particularly polymer B of Example 8 and polymer G of Example 9, were used as cell cryopreservation materials, they showed a significant cell cryopreservation effect compared to the comparative examples.
以上のことから、水との親和性が高い構造を有しており、さらに電荷の調節が可能であり、かつ加水分解や酵素分解性に耐性がある高分子であるポリマーＢおよびポリマーＧ等は高い細胞凍結保存効果を有しており、細胞凍結保存において有用である。 From the above, polymers such as polymer B and polymer G, which have a structure with high affinity for water, can adjust the charge, and are resistant to hydrolysis and enzymatic degradation, have a high cell cryopreservation effect and are useful for cell cryopreservation.
Claims (11)
前記カチオン性繰り返し配列Ａとアニオン性繰り返し配列Ｂとのモル比について、０．２≦Ａ／（Ａ＋Ｂ）≦０．８の関係にあり、
前記共重合体において、前記カチオン性繰り返し配列Ａのモノマーと前記アニオン性繰り返し配列Ｂのモノマーとその他のモノマーの全モノマー中、前記その他のモノマーが３０モル％以下であり、
分子量が１，０００から１，０００，０００である共重合体。
Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、炭素数が６～２０の芳香族基、あるいは、Ｒ１とＲ２とが互いに連結された炭素数１～６のアルキレン基から選択され、
Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表し、ｐは１～６の整数であり、
上記式（２）中、Ａは、単結合、エステル結合、アミド結合、エーテル結合から選択され、
Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表し、
ｑは０～６の整数である。） A copolymer having at least a cationic repeating sequence A represented by the following formula (1) and an anionic repeating sequence B represented by the following formula (2),
a molar ratio of the cationic repeating sequence A to the anionic repeating sequence B satisfies the relationship of 0.2≦A/(A+B)≦0.8;
in the copolymer, the content of the other monomers is 30 mol % or less of the total monomers including the monomers of the cationic repeating sequence A, the monomers of the anionic repeating sequence B, and the other monomers;
A copolymer having a molecular weight of 1,000 to 1,000,000.
R 1 and R 2 are each independently selected from a hydrogen atom, a linear, branched, or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aromatic group having 6 to 20 carbon atoms, or an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms in which R 1 and R 2 are bonded to each other;
R3 represents a hydrogen atom or a methyl group, and p is an integer of 1 to 6.
In the above formula (2), A is selected from a single bond, an ester bond, an amide bond, and an ether bond.
R3 represents a hydrogen atom or a methyl group;
q is an integer from 0 to 6.
Ｒ１、及びＲ２が水素原子であり、Ｒ３がメチル基であり、ｐ＝２であり、
前記式（２）中、
Ａは、単結合、エステル結合、アミド結合、エーテル結合から選択され、Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表し、ｑは０～６の整数である、
請求項１に記載の共重合体。 In the formula (1),
R 1 and R 2 are hydrogen atoms, R 3 is a methyl group, and p=2;
In the formula (2),
A is selected from a single bond, an ester bond, an amide bond, and an ether bond; R 3 represents a hydrogen atom or a methyl group; and q is an integer of 0 to 6.
The copolymer of claim 1.
Ｒ１、及びＲ２は、それぞれ独立に水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、炭素数が６～２０の芳香族基、あるいは、Ｒ１とＲ２とが互いに連結された炭素数１～６のアルキレン基から選択され、Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基であり、
前記式（２）中、
Ａが、単結合であり、Ｒ３がメチル基であり、ｑが０である、
請求項１に記載の共重合体。 In the formula (1),
R 1 and R 2 are each independently selected from a hydrogen atom, a linear, branched, or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aromatic group having 6 to 20 carbon atoms, or an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms in which R 1 and R 2 are bonded to each other; R 3 is a hydrogen atom or a methyl group;
In the formula (2),
A is a single bond, R3 is a methyl group, and q is 0;
The copolymer of claim 1.
前記共重合体が、少なくとも下記式（１）で表されるカチオン性繰り返し配列Ａと下記式（２）で表されるアニオン性繰り返し配列Ｂを有する共重合体であり、
前記カチオン性繰り返し配列Ａとアニオン性繰り返し配列Ｂとのモル比について、０．２≦Ａ／（Ａ＋Ｂ）≦０．８の関係にあり、
分子量が１，０００から１，０００，０００である共重合体であり、
Ｒ １ 、Ｒ ２ は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、炭素数が６～２０の芳香族基、あるいは、Ｒ １ とＲ ２ とが互いに連結された炭素数１～６のアルキレン基から選択され、
Ｒ ３ は、水素原子もしくはメチル基を表し、ｐは１～６の整数であり、
上記式（２）中、Ａは、単結合、エステル結合、アミド結合、エーテル結合から選択され、
Ｒ ３ は、水素原子もしくはメチル基を表し、
ｑは０～６の整数である。）
下記〔工程Ａ〕、及び〔工程Ｂ〕をこの順で行う、製造方法。
〔工程Ａ〕
下記式（４）で表されるスルフィドモノマーと下記式（５）で表されるカルボン酸モノマーをラジカル重合により共重合する工程。
Ｒ１は、水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、あるいは、炭素数が６～２０の芳香族基を表し、
Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表し、
ｐは、１～６の整数である。
上記式（５）中、Ａは、単結合、エステル結合、アミド結合、エーテル結合から選択され、
Ｒ３は水素原子もしくはメチル基を表し、
ｑは０～６の整数である。）
〔工程Ｂ〕
前記〔工程Ａ〕で得られたスルフィド含有共重合体と、下記式（６）で表されるスルフィド反応性化合物とを反応させる工程。
Ｘは、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メシル基（メタンスルフォニル基）、トシル基（ｐ－トルエンスルホニル基）、あるいは、トリフルオロメタンスルホニル基を表し、
Ｒ２は、水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、あるいは、炭素数が６～２０の芳香族基を表す。） A method for producing a copolymer , comprising the steps of:
The copolymer has at least a cationic repeating sequence A represented by the following formula (1) and an anionic repeating sequence B represented by the following formula (2),
a molar ratio of the cationic repeating sequence A to the anionic repeating sequence B satisfies the relationship of 0.2≦A/(A+B)≦0.8;
A copolymer having a molecular weight of 1,000 to 1,000,000;
R 1 and R 2 are each independently selected from a hydrogen atom, a linear, branched, or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aromatic group having 6 to 20 carbon atoms, or an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms in which R 1 and R 2 are bonded to each other;
R3 represents a hydrogen atom or a methyl group, and p is an integer of 1 to 6.
In the above formula (2), A is selected from a single bond, an ester bond, an amide bond, and an ether bond.
R3 represents a hydrogen atom or a methyl group ;
q is an integer from 0 to 6.
A manufacturing method comprising carrying out the following [Step A] and [Step B] in this order.
[Step A]
A step of copolymerizing a sulfide monomer represented by the following formula (4) and a carboxylic acid monomer represented by the following formula (5) by radical polymerization:
R 1 represents a hydrogen atom, a linear, branched, or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an aromatic group having 6 to 20 carbon atoms;
R3 represents a hydrogen atom or a methyl group;
p is an integer from 1 to 6.
In the above formula (5), A is selected from a single bond, an ester bond, an amide bond, and an ether bond.
R3 represents a hydrogen atom or a methyl group;
q is an integer from 0 to 6.
[Step B]
A step of reacting the sulfide-containing copolymer obtained in the above [Step A] with a sulfide-reactive compound represented by the following formula (6):
X represents a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, a mesyl group (methanesulfonyl group), a tosyl group (p-toluenesulfonyl group), or a trifluoromethanesulfonyl group;
R2 represents a hydrogen atom, a linear, branched, or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an aromatic group having 6 to 20 carbon atoms.
Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、炭素数が６～２０の芳香族基、あるいは、Ｒ１とＲ２とが互いに連結された炭素数１～６のアルキレン基から選択され、
Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表し、
ｐは１～６の整数である。
上記式（５）中、Ａは、単結合、エステル結合、アミド結合、エーテル結合から選択され、
Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表し、
ｑは０～６の整数である。） 2. The method for producing the copolymer according to claim 1, comprising copolymerizing a cationic monomer represented by the following formula (7) and an anionic monomer represented by the following formula (5) by radical polymerization:
R 1 and R 2 are each independently selected from a hydrogen atom, a linear, branched, or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aromatic group having 6 to 20 carbon atoms, or an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms in which R 1 and R 2 are bonded to each other;
R3 represents a hydrogen atom or a methyl group;
p is an integer from 1 to 6.
In the above formula (5), A is selected from a single bond, an ester bond, an amide bond, and an ether bond.
R3 represents a hydrogen atom or a methyl group;
q is an integer from 0 to 6.
前記共重合体が、少なくとも下記式（１）で表されるカチオン性繰り返し配列Ａと下記式（２）で表されるアニオン性繰り返し配列Ｂを有する共重合体であり、
前記カチオン性繰り返し配列Ａとアニオン性繰り返し配列Ｂとのモル比について、０．２≦Ａ／（Ａ＋Ｂ）≦０．８の関係にあり、
分子量が１，０００から１，０００，０００である共重合体である、細胞凍結保存材。
Ｒ １ 、Ｒ ２ は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、炭素数が６～２０の芳香族基、あるいは、Ｒ １ とＲ ２ とが互いに連結された炭素数１～６のアルキレン基から選択され、
Ｒ ３ は、水素原子もしくはメチル基を表し、ｐは１～６の整数であり、
上記式（２）中、Ａは、単結合、エステル結合、アミド結合、エーテル結合から選択され、
Ｒ ３ は、水素原子もしくはメチル基を表し、
ｑは０～６の整数である。） A cell cryopreservation material containing a copolymer ,
The copolymer has at least a cationic repeating sequence A represented by the following formula (1) and an anionic repeating sequence B represented by the following formula (2),
a molar ratio of the cationic repeating sequence A to the anionic repeating sequence B satisfies the relationship of 0.2≦A/(A+B)≦0.8;
A cell cryopreservation material which is a copolymer having a molecular weight of 1,000 to 1,000,000.
R 1 and R 2 are each independently selected from a hydrogen atom, a linear, branched, or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aromatic group having 6 to 20 carbon atoms, or an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms in which R 1 and R 2 are bonded to each other;
R3 represents a hydrogen atom or a methyl group, and p is an integer of 1 to 6.
In the above formula (2), A is selected from a single bond, an ester bond, an amide bond, and an ether bond.
R3 represents a hydrogen atom or a methyl group ;
q is an integer from 0 to 6.
前記共重合体が、少なくとも下記式（１）で表されるカチオン性繰り返し配列Ａと下記式（２）で表されるアニオン性繰り返し配列Ｂを有する共重合体であり、
前記カチオン性繰り返し配列Ａとアニオン性繰り返し配列Ｂとのモル比について、０．２≦Ａ／（Ａ＋Ｂ）≦０．８の関係にあり、
分子量が１，０００から１，０００，０００である共重合体である、細胞凍結保存液。
Ｒ １ 、Ｒ ２ は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、炭素数が６～２０の芳香族基、あるいは、Ｒ １ とＲ ２ とが互いに連結された炭素数１～６のアルキレン基から選択され、
Ｒ ３ は、水素原子もしくはメチル基を表し、ｐは１～６の整数であり、
上記式（２）中、Ａは、単結合、エステル結合、アミド結合、エーテル結合から選択され、
Ｒ ３ は、水素原子もしくはメチル基を表し、
ｑは０～６の整数である。） A cell cryopreservation solution containing a copolymer at a concentration of 1 to 30% by weight ,
The copolymer has at least a cationic repeating sequence A represented by the following formula (1) and an anionic repeating sequence B represented by the following formula (2),
a molar ratio of the cationic repeating sequence A to the anionic repeating sequence B satisfies the relationship of 0.2≦A/(A+B)≦0.8;
A cell cryopreservation medium which is a copolymer having a molecular weight of 1,000 to 1,000,000.
R 1 and R 2 are each independently selected from a hydrogen atom, a linear, branched, or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aromatic group having 6 to 20 carbon atoms, or an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms in which R 1 and R 2 are bonded to each other;
R3 represents a hydrogen atom or a methyl group, and p is an integer of 1 to 6.
In the above formula (2), A is selected from a single bond, an ester bond, an amide bond, and an ether bond.
R3 represents a hydrogen atom or a methyl group ;
q is an integer from 0 to 6.
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