JP7473937B2 - How to test for premature ovarian failure - Google Patents
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Description
本発明は、早発卵巣不全を検査する方法等に関する。 The present invention relates to a method for testing for premature ovarian failure.
早発卵巣不全（本明細書において、「POI」（primary ovarian insufficiency）と示すこともある。）は、40 歳未満の性腺機能低下症を指し、発生頻度は女性100人に1人とされる。一旦成立すると排卵や月経の再開は困難であり、難治性不妊症や早発閉経に至る疾患である。現在本邦の初産年齢は30歳超でありさらに上昇傾向である。このため今後は、挙児前にPOIを発症する症例が増加すると予測される。従ってそのリスクを事前に知ることは、患者のリプロダクティブヘルスの向上に役立つだけでなく、少子化対策の一端となる可能性がある。しかし現時点では、確立されたPOIの予測マーカーはない。 Premature ovarian insufficiency (hereinafter sometimes referred to as "POI" (primary ovarian insufficiency)) refers to hypogonadism in women under the age of 40, and occurs in 1 in 100 women. Once the condition develops, it is difficult to resume ovulation or menstruation, and it is a disease that can lead to intractable infertility and premature menopause. Currently, the average age at first birth in Japan is over 30 years old and is on the rise. For this reason, it is predicted that the number of cases of POI that develop before having a child will increase in the future. Therefore, knowing the risk in advance will not only help improve the reproductive health of patients, but may also be part of measures to combat the declining birthrate. However, at present, there are no established predictive markers for POI.
POTEタンパク質は、前立腺、卵巣、胎盤、及び前立腺がんに発現することが報告されている。しかし、POTEタンパク質とPOIとの関連性については報告されていない。 POTE protein has been reported to be expressed in the prostate, ovary, placenta, and prostate cancer. However, no association between POTE protein and POI has been reported.
本発明は、早発卵巣不全のバイオマーカー及びその利用方法を提供することを課題とする。 The objective of the present invention is to provide a biomarker for premature ovarian failure and a method for using the same.
本発明者は、上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、被検体から採取された生体試料における抗POTEF抗体及び抗POTEE抗体からなる群より選択される少なくとも1種の抗体をバイオマーカーとして使用することにより、早発卵巣不全を検査できることを見出した。本発明者は、この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。 As a result of intensive research conducted in light of the above problems, the present inventors have found that premature ovarian failure can be tested for by using, as a biomarker, at least one antibody selected from the group consisting of anti-POTEF antibodies and anti-POTEE antibodies in a biological sample collected from a subject. Based on this finding, the present inventors have conducted further research and have completed the present invention. That is, the present invention encompasses the following aspects.
項１． （1）被検体から採取された生体試料における抗POTEF抗体及び抗POTEE抗体からなる群より選択される少なくとも1種の抗体を検出する工程を含む、早発卵巣不全を検査する方法。 Item 1. (1) A method for testing for premature ovarian failure, comprising the step of detecting at least one antibody selected from the group consisting of anti-POTEF antibodies and anti-POTEE antibodies in a biological sample collected from a subject.
項２． 前記工程（1）が、
（1a）POTEFタンパク質、POTEEタンパク質、及びそれらの断片からなる群より選択される少なくとも1種の抗原と、前記生体試料とを接触させる工程、並びに
（1b）前記抗原に結合した抗体の量を測定する工程、
を含む、項１に記載の方法。
Item 2. The step (1) is
(1a) contacting the biological sample with at least one antigen selected from the group consisting of a POTEF protein, a POTEE protein, and fragments thereof; and (1b) measuring the amount of an antibody bound to the antigen.
Item 1. The method according to item 1, comprising:
項３． （1）被検体から採取された生体試料における抗POTEF抗体及び抗POTEE抗体からなる群より選択される少なくとも1種の抗体を検出する工程、及び
（2）前記工程（1）で検出された前記抗体の量又は濃度に基づいて、前記被検体が早発卵巣不全である否か、及び前記被検体が早発卵巣不全を将来発症するか否かを判定する工程、
からなる、早発卵巣不全を判定する方法。
Item 3. (1) A step of detecting at least one antibody selected from the group consisting of an anti-POTEF antibody and an anti-POTEE antibody in a biological sample collected from a subject; and
(2) determining whether the subject has premature ovarian failure and whether the subject will develop premature ovarian failure in the future based on the amount or concentration of the antibody detected in the step (1);
A method for determining premature ovarian failure comprising :
項４． 前記工程（2）が、
（2a）前記工程（1）で検出された前記抗体の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が早発卵巣不全である、及び／又は前期被検体が早発卵巣不全を将来発症すると判定する工程、
を含む、項３に記載の方法。
Item 4. The step (2) is
(2a) determining that the subject suffers from premature ovarian failure and/or that the subject will develop premature ovarian failure in the future, when the amount or concentration of the antibody detected in the step (1) is equal to or greater than a cutoff value;
Item 4. The method according to item 3, comprising:
項５． 前記カットオフ値が、早発卵巣不全ではない被検体から採取された生体試料における前記抗体の量又は濃度の平均値、パーセンタイル値、又は最小値である、項４に記載の方法。 Item 5. The method according to Item 4, wherein the cutoff value is the average value, percentile value, or minimum value of the amount or concentration of the antibody in a biological sample collected from a subject who does not have premature ovarian failure.
項６． 前記抗体が抗POTEF抗体である、項１～５のいずれかに記載の方法。 Item 6. The method according to any one of items 1 to 5, wherein the antibody is an anti-POTEF antibody.
項７． 前記生体試料が体液又は体液由来の試料である、項１～６のいずれかに記載の方法。 Item 7. The method according to any one of items 1 to 6, wherein the biological sample is a body fluid or a sample derived from a body fluid.
項８． 前記体液が全血、血清、及び血漿からなる群より選択される少なくとも1種である、項７に記載の方法。 Item 8. The method according to Item 7, wherein the body fluid is at least one selected from the group consisting of whole blood, serum, and plasma.
項９． 前記被検体がヒトである、項１～８のいずれかに記載の方法。 Item 9. The method according to any one of items 1 to 8, wherein the subject is a human.
項１０． POTEFタンパク質、POTEEタンパク質、及びそれらの断片からなる群より選択される少なくとも1種の抗原を含む、早発卵巣不全の検査薬。 Item 10. A test agent for premature ovarian failure, comprising at least one antigen selected from the group consisting of POTEF protein, POTEE protein, and fragments thereof.
本発明によれば、早発卵巣不全のバイオマーカーを提供することができる。該バイオマーカーを利用することにより、早発卵巣不全の検査等が可能になる。 The present invention provides a biomarker for premature ovarian failure. By using this biomarker, it becomes possible to test for premature ovarian failure.
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。 In this specification, the expressions "contain" and "include" include the concepts of "contain," "include," "consist essentially of," and "consist only of."
本明細書中において、アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS， Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264－2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high－scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873－7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。 In this specification, the "identity" of an amino acid sequence refers to the degree of agreement between two or more comparable amino acid sequences. Thus, the higher the identity between two amino acid sequences, the higher the identity or similarity between those sequences. The level of identity of an amino acid sequence can be determined, for example, using the sequence analysis tool FASTA with default parameters. Alternatively, it can be determined using the BLAST algorithm by Karlin and Altschul (Karlin S, Altschul SF. "Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes" Proc Natl Acad Sci USA. 87: 2264-2268 (1990), Karlin S, Altschul SF. "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences." Proc Natl Acad Sci USA. 90: 5873-7 (1993)). A program called BLASTX based on such a BLAST algorithm has been developed. The specific techniques for these analysis methods are publicly known and can be found on the National Center of Biotechnology Information (NCBI) website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). The "identity" of base sequences is also defined in the same manner as above.
本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。 In this specification, "conservative substitution" means that an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. For example, substitution between amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine, and histidine is a conservative substitution. Other conservative substitutions include substitution between amino acid residues having acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid; amino acid residues having non-charged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, and cysteine; amino acid residues having non-polar side chains such as alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, and tryptophan; amino acid residues having β-branched side chains such as threonine, valine, and isoleucine; and amino acid residues having aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan, and histidine.
1．早発卵巣不全を検査する方法
本発明は、その一態様において、（1）被検体から採取された生体試料における抗POTEF抗体及び抗POTEE抗体からなる群より選択される少なくとも1種の抗体（本明細書において、「対象抗体」と示すこともある。）を検出する工程を含む、早発卵巣不全を検査する方法（本明細書において、「本発明の検査方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
1. Method for testing for premature ovarian failure In one aspect, the present invention relates to a method for testing for premature ovarian failure (sometimes referred to as the "testing method of the present invention" herein) comprising the step of (1) detecting at least one antibody selected from the group consisting of anti-POTEF antibody and anti-POTEE antibody in a biological sample collected from a subject (sometimes referred to as the "target antibody" herein). This will be described below.
1-1．工程（1）
検査対象である早発卵巣不全は、特に制限されず、あらゆる種類、ステージなどの早発卵巣不全を包含する。なお、早発卵巣不全とは、40歳未満で卵巣の正常な機能が保てなくなる疾患であり、例えば無月経、月経不順等の症状を呈し、ほてり、のぼせ、動悸等の更年期症状を呈することもある。一般的には、（1）一定期間以上（例えば6ヶ月以上）の無月経、（2）FSH（卵胞刺激ホルモン）が高レベル（例えば40mIU/mL以上）である等が診断基準とされている。
1-1. Step (1)
The premature ovarian failure to be examined is not particularly limited, and includes premature ovarian failure of any type or stage. Premature ovarian failure is defined as a condition in which the ovaries are unable to maintain normal function in women under the age of 40. It is a disease that disappears after a period of time, such as amenorrhea and menstrual irregularities, and may also cause menopausal symptoms such as hot flashes, palpitations, etc. The diagnostic criteria include (1) amenorrhea, and (2) high levels of FSH (follicle-stimulating hormone) (e.g., 40 mIU/mL or higher).
被検体は、本発明の検査方法の対象生物であり、その生物種は特に制限されない。被検体の生物種としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられ、好ましくはヒトが挙げられる。 The subject is a target organism for the testing method of the present invention, and the organism species is not particularly limited. Examples of the organism species of the subject include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits, and preferably humans.
被検体の状態は、特に制限されない。被検体としては、例えば将来の早発卵巣不全発症可能性を調べることが望ましい検体、早発卵巣不全に罹患しているかどうか不明な検体、早発卵巣不全に罹患していると既に別の方法により判定されている検体、早発卵巣不全に罹患していないと既に別の方法により判定されている検体、早発卵巣不全の治療中の検体等が挙げられる。 The condition of the subject is not particularly limited. Examples of the subject include a specimen for which it is desirable to examine the possibility of future onset of premature ovarian failure, a specimen for which it is unknown whether it is affected by premature ovarian failure, a specimen that has already been determined by another method to be affected by premature ovarian failure, a specimen that has already been determined by another method to not be affected by premature ovarian failure, a specimen undergoing treatment for premature ovarian failure, etc.
生体試料は、対象抗体を含有し得るものであれば特に制限されない。生体試料としては、例えば全血、血清、血漿、卵胞液、経血、唾液、髄液、関節液、尿、組織液、汗、涙、唾液などの体液や、これらの体液由来の試料が挙げられる。体液由来の試料としては、体液から調製される試料である限り特に制限されず、例えば体液から、該体液に含まれる抗体（好ましくは対象抗体）を濃縮、精製などして得られる試料などが挙げられる。体液としては、好ましくは全血、血清、血漿などが挙げられる。生体試料は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。 The biological sample is not particularly limited as long as it can contain the target antibody. Examples of biological samples include body fluids such as whole blood, serum, plasma, follicular fluid, menstrual blood, saliva, cerebrospinal fluid, synovial fluid, urine, tissue fluid, sweat, tears, and saliva, as well as samples derived from these body fluids. Examples of samples derived from body fluids are not particularly limited as long as they are samples prepared from body fluids, and include samples obtained by concentrating and purifying antibodies (preferably the target antibodies) contained in the body fluids. Examples of body fluids include preferably whole blood, serum, and plasma. One type of biological sample may be used alone, or two or more types may be used in combination.
生体試料は、当業者に公知の方法で被検体から採取することができる。例えば、全血は、注射器などを用いた採血によって採取することができる。なお、採血は、医師、看護師などの医療従事者が行うことが望ましい。血清は、血液から血球及び特定の血液凝固因子を除去した部分であり、例えば、血液を凝固させた後の上澄みとして得ることができる。血漿は、血液から血球を除去した部分であり、例えば、血液を凝固させない条件下で遠心分離に供した際の上澄みとして得ることができる。 Biological samples can be collected from subjects by methods known to those skilled in the art. For example, whole blood can be collected by drawing blood using a syringe or the like. It is preferable that blood be drawn by a medical professional such as a doctor or nurse. Serum is a portion of blood from which blood cells and specific blood clotting factors have been removed, and can be obtained, for example, as the supernatant after blood has been allowed to clot. Plasma is a portion of blood from which blood cells have been removed, and can be obtained, for example, as the supernatant when blood is centrifuged under conditions that do not cause blood to clot.
工程（1）の検出対象は、抗POTEF抗体及び抗POTEE抗体からなる群より選択される少なくとも1種の抗体（対象抗体）である。これらの中でも、抗POTEF抗体が好ましい。 The detection target in step (1) is at least one antibody (target antibody) selected from the group consisting of anti-POTEF antibody and anti-POTEE antibody. Among these, anti-POTEF antibody is preferred.
抗POTEF抗体は、POTEFタンパク質に結合（好ましくは特異的に結合）することができる抗体である。また、抗POTEE抗体は、POTEEタンパク質に結合（好ましくは特異的に結合）することができる抗体である。 An anti-POTEF antibody is an antibody that can bind (preferably specifically bind) to a POTEF protein. An anti-POTEE antibody is an antibody that can bind (preferably specifically bind) to a POTEE protein.
POTEFタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、ヒトの場合であれば、例えばNCBI Accession Number: NP_001093241.1のアミノ酸配列（配列番号1）が挙げられる。POTEEタンパク質のアミノ酸配列も公知であり、ヒトの場合であれば、例えばNCBI Accession Number: NP_001077007.1のアミノ酸配列（配列番号2）が挙げられる。 The amino acid sequence of the POTEF protein is known, and in the case of humans, for example, the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of NCBI Accession Number: NP_001093241.1 can be cited. The amino acid sequence of the POTEE protein is also known, and in the case of humans, for example, the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of NCBI Accession Number: NP_001077007.1 can be cited.
対象抗体のアイソタイプは、特に制限されない。該アイソタイプとしては、例えばIgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、IgM、IgA、IgD、IgEなどが挙げられる。これらの中でも、好ましくはIgG、IgM、IgA等が挙げられる。 The isotype of the target antibody is not particularly limited. Examples of the isotype include IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD, IgE, etc. Among these, IgG, IgM, IgA, etc. are preferred.
本発明の検査方法に含まれる対象抗体を検出する工程において、対象抗体の検出方法（好ましくは対象交代の量又は濃度を測定する方法）は、該抗体を検出可能な方法である限りにおいて、特に制限されない。該方法としては、例えばイムノアッセイが挙げられる。イムノアッセイは、直接法、間接法、均一法、不均一法、競合法、非競合法などを問わず、広く採用することができる。イムノアッセイとして、より具体的には、例えばELISA（例えば直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法など）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、イムノラジオメトリックアッセイ（IRMA）、エンザイムイムノアッセイ（EIA）、サンドイッチEIA、イムノクロマト、ウェスタンブロット、免疫沈降、スロット或いはドットブロットアッセイ、免疫組織染色、蛍光イムノアッセイ、アビジン－ビオチン又はストレプトアビジン－ビオチン系を用いるイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴（SPR）法を用いるイムノアッセイなどが挙げられる。イムノアッセイにより、具体的には例えば抗原に結合した抗体に対して直接又は間接的に標識抗体を接触させ、結合した標識抗体の標識に由来するシグナルを定量することによって、対象抗体を検出することができる。この際に使用する標識抗体や標識抗体と対象抗体又は抗原とを介在する抗体としては、特に制限されず、例えば抗体定常領域に対する抗体、抗イディオタイプ抗体等が使用できる。 In the step of detecting a target antibody included in the test method of the present invention, the method of detecting the target antibody (preferably a method of measuring the amount or concentration of the target antibody) is not particularly limited as long as it is a method capable of detecting the antibody. Examples of such methods include immunoassays. Immunoassays can be widely adopted regardless of whether they are direct, indirect, homogeneous, heterogeneous, competitive, or non-competitive. More specifically, examples of immunoassays include ELISA (e.g., direct, indirect, sandwich, or competitive), radioimmunoassay (RIA), immunoradiometric assay (IRMA), enzyme immunoassay (EIA), sandwich EIA, immunochromatography, Western blot, immunoprecipitation, slot or dot blot assay, immunohistochemical staining, fluorescent immunoassay, immunoassay using an avidin-biotin or streptavidin-biotin system, and immunoassay using a surface plasmon resonance (SPR) method. Specifically, the target antibody can be detected by immunoassay, for example, by contacting a labeled antibody directly or indirectly with an antibody bound to an antigen and quantifying the signal derived from the label of the bound labeled antibody. The labeled antibody used in this case and the antibody that mediates between the labeled antibody and the target antibody or antigen are not particularly limited, and examples that can be used include antibodies against antibody constant regions and anti-idiotype antibodies.
検出方法は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。 A single detection method may be used, or two or more detection methods may be used in combination.
対象抗体を検出する際に用いられる標識物（例えば標識抗体など）における標識の種類は特に制限されない。標識としては、例えば蛍光物質、発光物質、色素、酵素、金コロイド、放射性同位体などが挙げられる。これらの中でも、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素標識は、安全性、経済性、検出感度などの観点から、好ましい。 The type of label in the label (e.g., labeled antibody, etc.) used to detect the target antibody is not particularly limited. Examples of labels include fluorescent substances, luminescent substances, dyes, enzymes, gold colloids, radioisotopes, etc. Among these, enzyme labels such as peroxidase and alkaline phosphatase are preferred from the standpoints of safety, economy, detection sensitivity, etc.
工程（1）の好ましい一態様においては、好ましくは（1a）POTEFタンパク質、POTEEタンパク質、及びそれらの断片からなる群より選択される少なくとも1種の抗原と、前記生体試料とを接触させる工程、並びに（1b）前記抗原に結合した抗体の量を測定する工程、を含む。 In a preferred embodiment of step (1), the method preferably includes the steps of (1a) contacting the biological sample with at least one antigen selected from the group consisting of POTEF protein, POTEE protein, and fragments thereof, and (1b) measuring the amount of antibody bound to the antigen.
工程（1a）で使用されるPOTEFタンパク質は、被検体の抗POTEF抗体に対する結合性が著しく（例えば、50％以下、30％以下、10％以下に）低減しない限りにおいて、置換、欠失、付加、挿入などのアミノ酸変異を有していてもよい。変異としては、活性がより損なわれ難いという観点から、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換が挙げられる。なお、結合性は、ELISA法により測定することができる。 The POTEF protein used in step (1a) may have amino acid mutations such as substitutions, deletions, additions, and insertions, so long as the binding ability to the test subject's anti-POTEF antibody is not significantly reduced (e.g., 50% or less, 30% or less, 10% or less). From the viewpoint of being less likely to impair activity, preferred mutations include substitutions, and more preferably conservative substitutions. The binding ability can be measured by ELISA.
工程（1a）で使用されるPOTEFタンパク質の好ましい具体例としては、下記（a）に記載するタンパク質及び下記（b）に記載するタンパク質：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ抗POTEF抗体に対する結合性を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
Preferred specific examples of the POTEF protein used in step (1a) include the proteins described in the following (a) and the proteins described in the following (b):
The protein may be at least one selected from the group consisting of: (a) a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; and (b) a protein having an amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having binding ability to an anti-POTEF antibody.
上記（b）において、同一性は、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは98％以上である。 In (b) above, the identity is more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, and even more preferably 98% or more.
上記（b）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（b’）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ抗POTEF抗体に対する結合性を有するタンパク質
が挙げられる。
An example of the protein described in (b) above is (b') a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, added, or inserted relative to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and which has binding affinity to an anti-POTEF antibody.
上記（b’）において、複数個とは、例えば2～20個であり、好ましくは2～10個であり、より好ましくは2～5個であり、よりさらに好ましくは2又は3個である。 In the above (b'), "multiple" means, for example, 2 to 20, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5, and even more preferably 2 or 3.
工程（1a）で使用されるPOTEEタンパク質は、被検体の抗POTEE抗体に対する結合性が著しく（例えば、50％以下、30％以下、10％以下に）低減しない限りにおいて、置換、欠失、付加、挿入などのアミノ酸変異を有していてもよい。変異としては、活性がより損なわれ難いという観点から、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換が挙げられる。なお、結合性は、ELISA法により測定することができる。 The POTEE protein used in step (1a) may have amino acid mutations such as substitutions, deletions, additions, and insertions, so long as the binding ability to the test anti-POTEE antibody is not significantly reduced (e.g., 50% or less, 30% or less, 10% or less). From the viewpoint of being less likely to impair activity, preferred mutations include substitutions, and more preferably conservative substitutions. The binding ability can be measured by ELISA.
工程（1a）で使用されるPOTEEタンパク質の好ましい具体例としては、下記（c）に記載するタンパク質及び下記（d）に記載するタンパク質：
（c）配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（d）配列番号2に示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ抗POTEE抗体に対する結合性を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
Preferred specific examples of the POTEE protein used in step (1a) include the proteins described in the following (c) and the proteins described in the following (d):
(c) a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and (d) a protein having an amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having binding ability to an anti-POTEE antibody.
上記（d）において、同一性は、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは98％以上である。 In (d) above, the identity is more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, and even more preferably 98% or more.
上記（d）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（d’）配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ抗POTEE抗体に対する結合性を有するタンパク質
が挙げられる。
An example of the protein described in (d) above is (d') a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, added, or inserted relative to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and which has binding affinity to an anti-POTEE antibody.
上記（d’）において、複数個とは、例えば2～20個であり、好ましくは2～10個であり、より好ましくは2～5個であり、よりさらに好ましくは2又は3個である。 In the above (d'), "multiple" means, for example, 2 to 20, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5, and even more preferably 2 or 3.
工程（1a）で使用されるPOTEFタンパク質の断片、POTEEタンパク質の断片は、抗体による認識が可能な程度の長さの断片である限り、特に制限されない。これらの断片のアミノ酸残基の数は、例えば6以上、8以上、12以上、20以上、40以上、100以上、200以上、400以上である。 The POTEF protein fragment and the POTEE protein fragment used in step (1a) are not particularly limited as long as they are fragments of a length that can be recognized by an antibody. The number of amino acid residues of these fragments is, for example, 6 or more, 8 or more, 12 or more, 20 or more, 40 or more, 100 or more, 200 or more, or 400 or more.
工程（1a）で使用されるPOTEFタンパク質、POTEEタンパク質、及びそれらの断片は、被検体の抗POTEF抗体に対する結合性が著しく（例えば、50％以下、30％以下、10％以下に）低減しない限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。 The POTEF protein, POTEE protein, and fragments thereof used in step (1a) may be chemically modified as long as the binding affinity to the subject's anti-POTEF antibody is not significantly reduced (e.g., 50% or less, 30% or less, 10% or less).
工程（1a）で使用されるPOTEFタンパク質、POTEEタンパク質、及びそれらの断片は、C末端がカルボキシル基（－COOH）、カルボキシレート（－COO－）、アミド（－CONH2）またはエステル（－COOR）の何れであってもよい。 The POTEF protein, POTEE protein, and fragments thereof used in step (1a) may have a C-terminus in the form of a carboxyl group (--COOH), a carboxylate (--COO - ), an amide (--CONH 2 ), or an ester (--COOR).
ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n－プロピル、イソプロピル、n－ブチルなどのC1－6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3－8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α－ナフチルなどのC6－12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル－C1－2アルキル基；α－ナフチルメチルなどのα－ナフチル－C1－2アルキル基などのC7－14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。 Here, examples of R in the ester include C1-6 alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, and n-butyl; C3-8 cycloalkyl groups such as cyclopentyl and cyclohexyl; C6-12 aryl groups such as phenyl and α-naphthyl; C1-2 phenyl- C1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl; C7-14 aralkyl groups such as α-naphthyl- C1-2 alkyl groups such as α-naphthylmethyl; and pivaloyloxymethyl groups.
工程（1a）で使用されるPOTEFタンパク質、POTEEタンパク質、及びそれらの断片は、C末端以外のカルボキシル基（またはカルボキシレート）が、アミド化またはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。 The POTEF protein, POTEE protein, and fragments thereof used in step (1a) may have a carboxyl group (or carboxylate) other than that at the C-terminus amidated or esterified. In this case, the ester may be, for example, the C-terminal ester described above.
さらに、工程（1a）で使用されるPOTEFタンパク質、POTEEタンパク質、及びそれらの断片には、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイルなどのC1－6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば－OH、－SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイル基などのC1－6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども包含される。 Furthermore, the POTEF protein, POTEE protein, and fragments thereof used in step (1a) also include those in which the amino group of the N-terminal amino acid residue is protected with a protecting group (e.g., a C1-6 acyl group, such as a formyl group, a C1-6 alkanoyl group, such as an acetyl group), those in which the N-terminal glutamine residue that may be generated by cleavage in the body is pyroglutamated, those in which substituents on the side chains of amino acids in the molecule (e.g., -OH, -SH, amino groups, imidazole groups, indole groups, guanidino groups, etc.) are protected with appropriate protecting groups (e.g., a C1-6 acyl group, such as a formyl group, a C1-6 alkanoyl group, such as an acetyl group), and conjugated proteins such as so-called glycoproteins to which a glycan is bound.
工程（1a）で使用されるPOTEFタンパク質、POTEEタンパク質、及びそれらの断片は、リンカー、エピトープタグ、蛍光タンパク質、精製を容易にするペプチド、切断可能なリンカーペプチドなどが付加されたもの（例えば、融合タンパク質）であってもよい。 The POTEF protein, POTEE protein, and fragments thereof used in step (1a) may be those to which a linker, an epitope tag, a fluorescent protein, a peptide that facilitates purification, a cleavable linker peptide, etc. has been added (e.g., a fusion protein).
工程（1a）で使用されるPOTEFタンパク質、POTEEタンパク質、及びそれらの断片には、塩の形態も包含される。塩は、特に制限されるものではない。該塩としては、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩； 酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、塩基性塩の例としては、ナトリウム塩、及びカリウム塩等のアルカリ金属塩； 並びにカルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩； アンモニアとの塩； モルホリン、ピペリジン、ピロリジン、モノアルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、モノ（ヒドロキシアルキル）アミン、ジ（ヒドロキシアルキル）アミン、トリ（ヒドロキシアルキル）アミン等の有機アミンとの塩等が挙げられる。 The POTEF protein, POTEE protein, and fragments thereof used in step (1a) also include salt forms. The salt is not particularly limited. Both acid salts and basic salts can be used as the salt. Examples of acid salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, and phosphate; organic acid salts such as acetate, propionate, tartrate, fumarate, maleate, malate, citrate, methanesulfonate, and paratoluenesulfonate. Examples of basic salts include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; and alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt; salts with ammonia; and salts with organic amines such as morpholine, piperidine, pyrrolidine, monoalkylamine, dialkylamine, trialkylamine, mono(hydroxyalkyl)amine, di(hydroxyalkyl)amine, and tri(hydroxyalkyl)amine.
工程（1a）で使用されるPOTEFタンパク質、POTEEタンパク質、及びそれらの断片には、溶媒和物の形態も包含される。これらは水和物、溶媒和物とすることもできる。溶媒としては、例えば、有機溶媒（例えばエタノール、グリセロール、酢酸等）等が挙げられる。 The POTEF protein, POTEE protein, and fragments thereof used in step (1a) also include solvates. These may be hydrates or solvates. Examples of solvents include organic solvents (e.g., ethanol, glycerol, acetic acid, etc.).
工程（1a）における接触の態様は、特に制限されず、上述した対象抗体の検出方法（例えば各種イムノアッセイなど）の種類に応じて、適切な態様を選択することができる。接触態様としては、例えば生体試料中の抗体、並びにPOTEFタンパク質、POTEEタンパク質、及びそれらの断片からなる群より選択される少なくとも1種（抗原）のいずれか一方のみを固相に固定した状態で接触させる態様、これらの両方とも固相に固定しない状態で接触させる態様などが挙げられる。これらの中でも、効率性などの観点から、好ましくは抗原のみを固相に固定した状態で接触させる態様が挙げられる。工程（1a）における接触の態様において、生体試料中の抗体及び抗原のいずれか一方のみを固相に固定する場合、固定後に、固相を洗浄することが好ましい。 The contacting mode in step (1a) is not particularly limited, and an appropriate mode can be selected depending on the type of the above-mentioned detection method of the target antibody (e.g., various immunoassays, etc.). Examples of the contacting mode include a mode in which only one of the antibody in the biological sample and at least one (antigen) selected from the group consisting of POTEF protein, POTEE protein, and fragments thereof is contacted while immobilized on a solid phase, and a mode in which neither of them is contacted while immobilized on a solid phase. Among these, from the viewpoint of efficiency, etc., a mode in which only the antigen is contacted while immobilized on a solid phase is preferred. In the contacting mode in step (1a), when only one of the antibody and the antigen in the biological sample is immobilized on a solid phase, it is preferable to wash the solid phase after immobilization.
固相としては、生体試料中の抗体又は抗原を固定可能なものである限り特に制限されない。該固相としては、例えばポリスチレン、ガラス、ニトロセルロースなどを主成分として含むプレート、スライド、膜などが挙げられる。固相は、生体試料中の抗体又は抗原をより容易に固定させるための成分、例えば易反応性化合物（例えば易反応性基を有する化合物、金コロイドなど）でコーティングされたものであってもよい。易反応性基を有する化合物としては、タンパク質と共有結合を形成しうる基であって、例えば、（1H-イミダゾール-1-イル）カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（1H-ベンゾトリアゾール-1-イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、又はハロゲン化カルボニル基（塩化カルボニル基、フッ化カルボニル基、臭化カルボニル基、ヨウ化カルボニル基）等を有する化合物が挙げられる。 The solid phase is not particularly limited as long as it can fix the antibody or antigen in the biological sample. Examples of the solid phase include plates, slides, and membranes containing polystyrene, glass, nitrocellulose, and the like as the main component. The solid phase may be coated with a component for more easily fixing the antibody or antigen in the biological sample, such as an easily reactive compound (e.g., a compound having an easily reactive group, gold colloid, etc.). Examples of the compound having an easily reactive group include a group that can form a covalent bond with a protein, such as a (1H-imidazol-1-yl)carbonyl group, a succinimidyloxycarbonyl group, an epoxy group, an aldehyde group, an amino group, a thiol group, a carboxyl group, an azide group, a cyano group, an active ester group (e.g., 1H-benzotriazol-1-yloxycarbonyl group, a pentafluorophenyloxycarbonyl group, a paranitrophenyloxycarbonyl group, etc.), or a carbonyl halide group (a carbonyl chloride group, a carbonyl fluoride group, a carbonyl bromide group, a carbonyl iodide group), etc.
易反応性基を有する化合物としては、例えば、エポキシシラン、及びポリリジン等が挙げられる。 Examples of compounds having easily reactive groups include epoxysilane and polylysine.
固相は、ウシ血清アルブミン（BSA）緩衝液等を用いてブロッキングすることが好ましい。 The solid phase is preferably blocked using a bovine serum albumin (BSA) buffer solution or the like.
工程（1b）における抗体の量又は濃度の測定の態様は、特に制限されず、上述した対象抗体の検出方法（例えば各種イムノアッセイなど）の種類に応じて、適切な態様を選択することができる。該測定は、例えば用いられた標識物の標識に由来するシグナルを定量することによって行うことができる。より具体的な態様としては、例えば抗原に結合した抗体に対して標識抗体を接触させ、結合した標識抗体の標識に由来するシグナルを定量することによって行うことができる。 The manner of measuring the amount or concentration of the antibody in step (1b) is not particularly limited, and an appropriate manner can be selected depending on the type of detection method for the target antibody described above (e.g., various immunoassays, etc.). The measurement can be performed, for example, by quantifying the signal derived from the label of the label used. In a more specific embodiment, the measurement can be performed, for example, by contacting a labeled antibody with an antibody bound to an antigen and quantifying the signal derived from the label of the bound labeled antibody.
その一例としてELISA法がある。ELISA法によれば、標準抗体を用いて標準曲線を作成し、対象抗体の濃度を定量することができる。標準抗体は、例えば、ビオチン標識抗原とストレプトアビジン-アガロース樹脂とを用いたアフィニティー精製によって、市販の抗体から調製できる。まず、適当なELISA用プレートのウエルを抗原で被覆した後に、BSA緩衝液でブロッキングする。次に、各濃度の標準抗体または検体をウエルに加えて一定時間静置後にウエルを洗浄し、ペルオキシダーゼで標識された二次抗体をウエルに加えて一定時間静置する。その後に、ウエルを洗浄し、ペルオキシダーゼの基質をウエルに加えて一定時間静置して発色させ、硫酸等の反応停止液を加えた後に、プレートリーダーを用いて吸光度を測定する。標準抗体の濃度とその吸光度とに基づいて標準曲線を作成した後、標準曲線に基づいて、検体中の対象抗体の濃度を定量する。 One example is the ELISA method. With the ELISA method, a standard curve can be created using a standard antibody, and the concentration of the target antibody can be quantified. The standard antibody can be prepared from a commercially available antibody, for example, by affinity purification using a biotin-labeled antigen and streptavidin-agarose resin. First, the wells of an appropriate ELISA plate are coated with the antigen, and then blocked with a BSA buffer solution. Next, standard antibodies or samples of various concentrations are added to the wells, left to stand for a certain period of time, and the wells are washed, and a secondary antibody labeled with peroxidase is added to the wells and left to stand for a certain period of time. After that, the wells are washed, a peroxidase substrate is added to the wells, left to stand for a certain period of time to develop color, and a reaction stop solution such as sulfuric acid is added, and the absorbance is measured using a plate reader. After creating a standard curve based on the concentration of the standard antibody and its absorbance, the concentration of the target antibody in the sample is quantified based on the standard curve.
得られたシグナル量に基づいて、対象抗体の量を算出することができる。例えば、非競合法の場合であれば、得られたシグナル量をそのまま対象抗体の量とすることができる。また、別の例として、競合法の場合であれば、得られたシグナル量と対象抗体の量は、反比例の関係にあるので、この関係に基づいて得られたシグナル量から対象抗体の量を算出することができる。 The amount of the target antibody can be calculated based on the amount of signal obtained. For example, in the case of a non-competitive method, the amount of signal obtained can be used as the amount of the target antibody. As another example, in the case of a competitive method, the amount of signal obtained and the amount of the target antibody are inversely proportional to each other, so the amount of the target antibody can be calculated from the amount of signal obtained based on this relationship.
また、対象抗体の量を、生体試料の量や、生体試料内の成分量（例えば抗体全量、検出対象の対象抗体と同じアイソタイプの抗体全量など）で除することによって、本発明の対象抗体の濃度を算出することができる。 The concentration of the target antibody of the present invention can also be calculated by dividing the amount of the target antibody by the amount of the biological sample or the amount of a component in the biological sample (e.g., the total amount of antibodies, the total amount of antibodies of the same isotype as the target antibody to be detected, etc.).
工程（1）を含む本発明の検査方法によれば、早発卵巣不全又はその将来発症リスクの検出指標である対象バイオマーカーの量及び／又は濃度を提供することができ、これにより早発卵巣不全の検出などを補助することができる。 The testing method of the present invention, which includes step (1), can provide the amount and/or concentration of a target biomarker that is an indicator for detecting premature ovarian failure or the risk of developing the same in the future, thereby assisting in the detection of premature ovarian failure, etc.
2．早発卵巣不全を判定する方法
本発明は、一態様として、（1）被検体から採取された生体試料における抗POTEF抗体及び抗POTEE抗体からなる群より選択される少なくとも1種の抗体を検出する工程、及び（2）前記工程（1）で検出された前記抗体の量又は濃度に基づいて、前記被検体が早発卵巣不全である否か、及び／又は前記被検体が早発卵巣不全を将来発症するか否かを判定する工程、を含む、早発卵巣不全を判定する方法（本発明の判定方法）に関する。
2. Method for Diagnosing Premature Ovarian Failure In one aspect, the present invention relates to a method for diagnosing premature ovarian failure (the diagnosing method of the present invention), comprising: (1) detecting at least one antibody selected from the group consisting of an anti-POTEF antibody and an anti-POTEE antibody in a biological sample collected from a subject; and (2) determining whether the subject has premature ovarian failure and/or whether the subject will develop premature ovarian failure in the future based on the amount or concentration of the antibody detected in the step (1) .
該工程（2）を含む本発明の判定方法によれば、現在の早発卵巣不全、及び将来的な早発卵巣不全の発症リスクを判定することができる。 According to the method of the present invention including the step ( 2 ), it is possible to determine the current premature ovarian failure and the future risk of developing premature ovarian failure.
カットオフ値は、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などの観点から当業者が適宜設定することができ、例えば、例えば、早発卵巣不全ではない被検体（例えば、正常月経周期を有する被検体）から採取された生体試料における対象抗体の量及び／又は濃度に基づいて、その都度定められた値、或いは予め定められた値とすることができる。カットオフ値は、早発卵巣不全ではない被検体から採取された生体試料における本発明の対象抗体の量又は濃度の値の平均値、パーセンタイル値、又は最小値とすることができる。より具体的には、例えば、早発卵巣不全の被検体、及び早発卵巣不全ではない被検体から採取された生体試料における、対象抗体の量又は濃度を測定し、該測定値を用いて、受信者操作特性（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲線の解析などに基づいた統計解析（より具体的には、Youden indexを用いた方法が例示される。）を行うことにより、設定することができる。カットオフ値は、例えば、早発卵巣不全ではない被検体から採取された生体試料における対象抗体の量又は濃度の値の、例えば10～90パーセンタイル値、30～70パーセンタイル値、又は40～60パーセンタイル値とすることができる。 The cutoff value can be appropriately set by a person skilled in the art from the viewpoints of sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, etc., and can be a value determined on a case-by-case basis or a predetermined value based on the amount and/or concentration of the target antibody in a biological sample collected from a subject not suffering from premature ovarian failure (e.g., a subject having a normal menstrual cycle). The cutoff value can be the average value, percentile value, or minimum value of the amount or concentration of the target antibody of the present invention in a biological sample collected from a subject not suffering from premature ovarian failure. More specifically, the cutoff value can be set by measuring the amount or concentration of the target antibody in a biological sample collected from a subject suffering from premature ovarian failure and a subject not suffering from premature ovarian failure, and using the measured value to perform a statistical analysis based on a receiver operating characteristic (ROC) curve analysis, etc. (more specifically, a method using the Youden index is exemplified). The cutoff value can be, for example, the 10th to 90th percentile value, the 30th to 70th percentile value, or the 40th to 60th percentile value of the amount or concentration of the target antibody in a biological sample collected from a subject who does not have premature ovarian failure.
3．早発卵巣不全のより高い精度での診断
工程（2）を含む本発明の判定方法により、被検体が早発卵巣不全であると判定された場合、本発明の判定方法に、さらに早発卵巣不全の医師による診断を適用する工程を組み合わせることによって、より高い精度で早発卵巣不全を診断することができる。また、本発明の判定方法はより正確に早発卵巣不全を検出できるので、本発明の判定方法に上記工程を組み合わせることによって、より効率的且つより正確に「早発卵巣不全に罹患している」と診断できる。
3. Diagnosing premature ovarian failure with higher accuracyWhen a subject is diagnosed with premature ovarian failure by the method of the present invention including the step (2), premature ovarian failure can be diagnosed with higher accuracy by combining the method of the present invention with a step of applying a doctor's diagnosis of premature ovarian failure.In addition, since the method of the present invention can detect premature ovarian failure more accurately, by combining the above steps with the method of the present invention , it is possible to more efficiently and more accurately diagnose "suffering from premature ovarian failure."
4．早発卵巣不全の予防、対策、治療
工程（2）を含む本発明の判定方法により被検体が早発卵巣不全である、及び／又は早発卵巣不全を将来発症する可能性があると判定された場合は本発明の判定方法に対してさらに、或いは上記「3．早発卵巣不全のより高い精度での診断」に記載の様に早発卵巣不全に罹患していると診断された場合は本発明の判定方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対してさらに、（3）早発卵巣不全に罹患していると判定又は診断された被検体に対して、該疾患の予防及び／又は治療を行う工程を行うことによって、被検体の該疾患を予防及び／又は治療することが可能となる。また、本発明の判定方法はより正確に早発卵巣不全を検出できるので、本発明の判定方法に対して、或いは本発明の判定方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対して工程3を組み合わせることによって、早発卵巣不全に罹患している被検体をより効率的に、より確実に治療でき、また早発卵巣不全を将来発症する可能性がある被検体に対して、より効率的に、より確実に、予防処置又は対策を施すことができる。
4. Prevention, measures, and treatment of premature ovarian failure When a subject is judged to have premature ovarian failure and/or to have a possibility of developing premature ovarian failure in the future by the judgment method of the present invention including the step (2), or when a subject is diagnosed to have premature ovarian failure as described in the above " 3. Diagnosis of premature ovarian failure with higher accuracy", the judgment method of the present invention and the step of applying a diagnosis by a doctor are further combined to carry out the step (3) of preventing and/or treating the disease in the subject judged or diagnosed to have premature ovarian failure. In addition, since the judgment method of the present invention can detect premature ovarian failure more accurately, by combining the judgment method of the present invention or the combination of the judgment method of the present invention and the step of applying a diagnosis by a doctor with step 3, a subject suffering from premature ovarian failure can be treated more efficiently and more reliably, and a preventive treatment or measure can be more efficiently and more reliably applied to a subject who may develop premature ovarian failure in the future.
早発卵巣不全の予防／治療方法としては、特に制限されないが、例えば投薬治療等が挙げられる。治療方法は1種又は2種以上を組み合わせて用いることができる。投薬治療に用いる医薬としては、特に制限されないが、例えばエストロゲン、プロゲスチン等が挙げられる。医薬は、1種、2種、又は3種以上を組み合わせて用いることができる。 Methods for preventing/treating premature ovarian failure include, but are not limited to, drug therapy. Treatment methods can be used alone or in combination of two or more. Medicines used in drug therapy include, but are not limited to, estrogen, progestin, etc. Medicines can be used alone, two or three or more in combination.
また、早発卵巣不全であると判定された被検体が妊娠を望む場合は、体外受精、受精卵凍結、未受精卵凍結、卵巣組織凍結等の生殖補助医療を提供することができる。また、早発卵巣不全を将来発症する可能性があると判定された被検体に対しては、早発卵巣不全の発症リスクを十分に説明することにより、ライフプランを検討してもらうことができる。 Furthermore, if a subject diagnosed with premature ovarian failure wishes to become pregnant, assisted reproductive medical treatments such as in vitro fertilization, embryo freezing, unfertilized egg freezing, and ovarian tissue freezing can be provided. Furthermore, for subjects who are determined to have the possibility of developing premature ovarian failure in the future, the risks of developing premature ovarian failure can be fully explained so that they can consider their life plans.
5．早発卵巣不全の検査薬
本発明は、その一態様において、POTEFタンパク質、POTEEタンパク質、及びそれらの断片からなる群より選択される少なくとも1種の抗原を含む、早発卵巣不全の検査薬（本明細書において、「本発明の検査薬」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
5. Test Agent for Premature Ovarian Failure In one aspect, the present invention relates to a test agent for premature ovarian failure (sometimes referred to as the "test agent of the present invention" in this specification) that contains at least one antigen selected from the group consisting of POTEF protein, POTEE protein, and fragments thereof. This will be described below.
本発明の検査薬は、早発卵巣不全を検査する薬である。 The test agent of the present invention is a drug for testing for premature ovarian failure.
本発明の検査薬は、抗原を含む組成物の形態であってもよい。該組成物には、必要に応じて他の成分が含まれていてもよい。他の成分としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。 The test agent of the present invention may be in the form of a composition containing an antigen. The composition may contain other components as necessary. Examples of other components include bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, thickeners, moisturizers, colorants, fragrances, chelating agents, etc.
本発明の検査薬は、抗原を含むキットの形態であってもよい。該キットには、本発明の検査方法の実施に用いられ得る器具、試薬などが含まれていてもよい。 The test agent of the present invention may be in the form of a kit containing an antigen. The kit may also contain instruments, reagents, etc. that can be used to carry out the test method of the present invention.
器具としては、例えば試験管、マイクロタイタープレート、アガロース粒子、ラテックス粒子、精製用カラム、エポキシコーティングスライドガラス、金コロイドコーティングスライドガラスなどが挙げられる。 Examples of the apparatus include test tubes, microtiter plates, agarose particles, latex particles, purification columns, epoxy-coated glass slides, and gold colloid-coated glass slides.
試薬としては、例えば標識抗体、標準試料（陽性対照、陰性対照）などが挙げられる。 Reagents include, for example, labeled antibodies, standard samples (positive control, negative control), etc.
標識抗体としては、検出対象である対象抗体のアイソタイプに応じて、各種市販されているものを用いることができる。 As the labeled antibody, various commercially available products can be used depending on the isotype of the target antibody to be detected.
標準試料としては、対象抗体が用いられる。対象抗体は、例えばハイブリドーマ技術を用い、対象抗体を産生するハイブリドーマを取得した後に、その培養上清を精製して得ることができる。 The target antibody is used as the standard sample. The target antibody can be obtained, for example, by using hybridoma technology to obtain a hybridoma that produces the target antibody, and then purifying the culture supernatant.
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be described in detail below based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
試験例1．POIバイオマーカーの探索
早発閉経は古くから、自己免疫疾患との関連が指摘されており、甲状腺疾患との関連の報告も散見される。本発明者はPOI患者の検討から、抗がん剤治療後などの医原性を除いたPOI症例の半数以上で甲状腺自己抗体を認めること、さらに、甲状腺自己抗体陽性の患者では、閉経年齢が低い傾向があることを見出した。このことから、甲状腺自己抗体陽性である自己免疫疾患では、甲状腺自己抗体の他に、抗卵巣抗体が存在し、POI発症の要因となっていると考えられた。そこで、POI患者の血清を抗体として用いた免疫学的検討を行った。
Test Example 1. Search for POI biomarkers Premature menopause has long been associated with autoimmune diseases, and there are also occasional reports of its association with thyroid diseases. The present inventors have found that thyroid autoantibodies are present in more than half of POI cases, excluding iatrogenic cases such as those after anticancer drug treatment, and that patients who are positive for thyroid autoantibodies tend to reach menopause at a younger age. From this, it was thought that in autoimmune diseases in which thyroid autoantibodies are positive, anti-ovarian antibodies exist in addition to thyroid autoantibodies, and are a factor in the development of POI. Therefore, an immunological study was conducted using the serum of POI patients as an antibody.
（1）甲状腺自己抗体陽性POI被検者血清、及び（2）正常月経周期を有する被検者血清を比較することにより、被検者血清中の抗卵巣抗体の抗原分子の探索を行った。具体的には、血清（1）と血清（2）をそれぞれ、（3）ヒト非黄体化顆粒膜細胞株から回収したタンパク質と免疫沈降し、得られたサンプルを質量分析計 (LC/MS/MS) で分析、プロテオーム解析を施行することにより、患者血清中の自己抗体の標的となる抗原分子を同定した。血清（1）とタンパク質（3）で免疫沈降したサンプルで検出され、且つ血清（2）とタンパク質（3）で免疫沈降したサンプルでは検出されなかった抗原分子は68種であった。この中から、POIとの関連性の観点から、性腺に特異的な発現が報告されているPOTEFタンパク質及びPOTEEタンパク質の2分子に着目した。 By comparing (1) the sera of subjects with thyroid autoantibodies positive for POI and (2) the sera of subjects with normal menstrual cycles, we searched for antigen molecules of anti-ovarian antibodies in the sera of the subjects. Specifically, sera (1) and (2) were immunoprecipitated with proteins recovered from a human nonluteinized granulosa cell line (3), and the obtained samples were analyzed by mass spectrometry (LC/MS/MS) and proteome analysis was performed to identify antigen molecules targeted by autoantibodies in the patient sera. There were 68 types of antigen molecules that were detected in the sample immunoprecipitated with serum (1) and protein (3), but not in the sample immunoprecipitated with serum (2) and protein (3). From these, we focused on two molecules, POTEF protein and POTEE protein, which have been reported to be specifically expressed in the gonads, from the viewpoint of their association with POI.
本試験の結果から、抗卵巣抗体である抗POTEF抗体及び抗POTEE抗体をPOIバイオマーカーとして使用し得ることが分かった。 The results of this study demonstrated that the anti-ovarian antibodies anti-POTEF and anti-POTEE can be used as POI biomarkers.
試験例2．POTEFタンパク質及びPOTEEタンパク質の発現解析
POTEFタンパク質及びPOTEEタンパク質の卵巣組織における発現と局在を、免疫染色によって調べた。卵巣組織は、子宮がんの手術時に摘出した（卵巣にがん転移なし）患者検体を使用した。卵巣組織の連続切片を作成し、得られた切片を、一次抗体としてネガティブコントロール: normal rabbit IgG (ab27472)、Anti-POTEE antibody (abcam: ab108190)、又はAnti-POTEF antibody (abcam: ab108204)を使用して免疫染色した。
Test Example 2. Expression analysis of POTEF protein and POTEE protein
The expression and localization of POTEF and POTEE proteins in ovarian tissue were examined by immunostaining. Ovarian tissue samples were obtained from patients who had undergone surgery for uterine cancer (no cancer metastasis to the ovaries). Serial sections of ovarian tissue were prepared and immunostained using the negative control: normal rabbit IgG (ab27472), anti-POTEE antibody (abcam: ab108190), or anti-POTEF antibody (abcam: ab108204) as the primary antibody.
結果を図１に示す。卵巣顆粒膜細胞、卵巣莢膜細胞、卵母細胞において、POTEEタンパク質及びPOTEFタンパク質の染色が認められた。 The results are shown in Figure 1. Staining of POTEE and POTEF proteins was observed in ovarian granulosa cells, ovarian theca cells, and oocytes.
試験例3．POIバイオマーカーの性能解析
POI群及びコントロール群の血清中の抗POTEF抗体濃度を、ELISAにより測定した。各群の詳細は以下の通りである。
・POI群：40歳未満且つ6ヶ月以上自然月経のない患者 （除外基準：多嚢胞性卵巣症候群、中枢性無月経など他の無月経の原因を有する患者、医原性の卵巣性無月経の患者）
・正常月経周期を有するコントロール：男性因子による不妊症のため通院中の患者
Test Example 3. Performance analysis of POI biomarkers
The serum anti-POTEF antibody concentrations in the POI and control groups were measured by ELISA. The details of each group are as follows.
POI group: Patients under 40 years of age who have not had a natural menstrual period for 6 months or more (Exclusion criteria: Patients with other causes of amenorrhea such as polycystic ovary syndrome or central amenorrhea, and patients with iatrogenic ovarian amenorrhea)
- Controls with normal menstrual cycles: Patients currently undergoing treatment for male factor infertility
＜試験例3-1．POTEFタンパク質発現細胞の樹立＞
Flasタグ付きPOTEF全長cDNA：POTEF（NM_001099771）Human cDNA ORF Clone（Origene）をEnhanced Episomal Vector, CuO-MCS（#EEV610-A-1）：（System Biosceinces）へ導入した。得られた発現ベクターを293T細胞へ導入し、導入された細胞を、puromysinを使用して選別した。選別された細胞に対して、Cumate Swichシステムを用いてPOTEFタンパク質の発現を誘導した。
<Test Example 3-1. Establishment of POTEF protein expressing cells>
Flas-tagged POTEF full-length cDNA: POTEF (NM_001099771) Human cDNA ORF Clone (Origene) was introduced into Enhanced Episomal Vector, CuO-MCS (#EEV610-A-1): (System Biosceinces). The resulting expression vector was introduced into 293T cells, and the introduced cells were selected using puromysin. The expression of POTEF protein was induced in the selected cells using the Cumate Switch system.
＜試験例3-2．リコンビナントPOTEFタンパク質の精製＞
POTEF発現細胞（試験例3-1）のライセートを回収した。該ライセートから、DDDK-tagged Protein Magnetic Purification Kit（MBLライフサイエンス）を用いて、リコンビナントPOTEFタンパク質を精製した。
<Test Example 3-2. Purification of recombinant POTEF protein>
A lysate was collected from the POTEF-expressing cells (Test Example 3-1). Recombinant POTEF protein was purified from the lysate using a DDDK-tagged Protein Magnetic Purification Kit (MBL Life Sciences).
＜試験例3-3．ELISAによる抗POTEF抗体の測定＞
96穴プレート（Corning #3369）へ1μl/mlのリコンビナントPOTEFタンパク質を1wellあたり100μlずつ入れ、16時間、4℃でincubateした。0.05％ Tween20-PBSで4回洗浄後、1％ BSA-PBSでブロッキングし、使用まで4℃で保存した。2mg/ml BSA-PBSで100倍希釈した測定用の患者血清、50倍から1600倍まで2倍ずつに希釈したコントロール血清を1wellあたり50μlずつ入れ、1時間室温でincubateした。0.05％ Tween20-PBSで1回洗浄後、Goat anti-human IgG・IgA・IgM HRP conjugate solution（Piece #31418）を2mg/ml BSA-PBSで1000倍希釈し、1wellあたり50μlずつ入れ、1時間室温でincubateした。0.05％ Tween20-PBSで2回洗浄後、1wellあたり100μlのTMB liquid（Sigma-Aldrich T0440）を入れ、2分置いた後、0.5M H2SO4を1wellあたり100μlずつ入れた。450/620nmの吸光度を測定した。コントロール血清により標準曲線を作製し、50倍希釈時の濃度を50IU/lとし、濃度を算出した。
<Test Example 3-3. Measurement of anti-POTEF antibodies by ELISA>
100μl of 1μl/ml recombinant POTEF protein was added to each well of a 96-well plate (Corning #3369) and incubated at 4℃ for 16 hours. After washing four times with 0.05% Tween20-PBS, the plate was blocked with 1% BSA-PBS and stored at 4℃ until use. Patient serum for measurement diluted 100-fold with 2mg/ml BSA-PBS and control serum diluted 2-fold from 50-fold to 1600-fold were added 50μl per well and incubated at room temperature for 1 hour. After washing once with 0.05% Tween20-PBS, Goat anti-human IgG・IgA・IgM HRP conjugate solution (Piece #31418) was diluted 1000-fold with 2mg/ml BSA-PBS and added 50μl per well and incubated at room temperature for 1 hour. After washing twice with 0.05% Tween20-PBS, 100 μl of TMB liquid (Sigma-Aldrich T0440) was added per well, and after leaving it for 2 minutes, 100 μl of 0.5MH2SO4 was added per well. The absorbance was measured at 450/620 nm. A standard curve was prepared using control serum, and the concentration was calculated based on the concentration at 50-fold dilution of 50 IU/l.
＜結果＞
測定結果を図２に示す。図２に示されるように、POI群とコントロール群との間に、抗POTEF抗体濃度に有意差があることが分かった。
<Results>
The measurement results are shown in Figure 2. As shown in Figure 2, it was found that there was a significant difference in anti-POTEF antibody concentration between the POI group and the control group.
Claims (8)
（1a）POTEFタンパク質及びその断片からなる群より選択される少なくとも1種の抗原と、前記生体試料とを接触させる工程、並びに
（1b）前記抗原に結合した抗体の量を測定する工程、
を含む、請求項１に記載の方法。 The step (1),
(1a) contacting the biological sample with at least one antigen selected from the group consisting of POTEF protein and fragments thereof; and (1b) measuring the amount of antibody bound to the antigen.
The method of claim 1 , comprising:
（2）前記工程（1）で検出された前記抗POTEF抗体の量又は濃度に基づいて、前記被検体が早発卵巣不全である否か、及び／又は前記被検体が早発卵巣不全を将来発症するか否かを判定する工程、
を含み、
前記工程（2）が、
（2a）前記工程（1）で検出された前記抗POTEF抗体の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が早発卵巣不全である、及び／又は前記被検体が早発卵巣不全を将来発症すると判定する工程、及び
（2b）前記工程（1）で検出された前記抗POTEF抗体の量又は濃度がカットオフ値未満である場合に、前記被検体が早発卵巣不全ではない、及び／又は前記被検体が早発卵巣不全を将来発症しないと判定する工程
からなる、早発卵巣不全を判定する方法。 (1) detecting an anti-POTEF antibody in a biological sample collected from a subject; and (2) determining whether the subject has premature ovarian failure and/or will develop premature ovarian failure in the future based on the amount or concentration of the anti-POTEF antibody detected in the step (1).
Including,
The step (2),
(2a) determining that the subject has premature ovarian failure and/or will develop premature ovarian failure in the future if the amount or concentration of the anti-POTEF antibody detected in the step (1) is equal to or greater than a cutoff value; and
( 2b) determining that the subject does not have premature ovarian failure and/or will not develop premature ovarian failure in the future when the amount or concentration of the anti-POTEF antibody detected in the step (1) is less than a cutoff value.
A method for determining premature ovarian failure comprising :
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