JP7461015B2 - Methods and reagents for predicting coronary events - Patents.com - Google Patents
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Description
本発明は、冠動脈イベントの予測のための方法、及び該方法に用いる検出試薬に関する。本発明は特に、心筋梗塞治療後の患者における冠動脈二次イベントの有無の予測のための方法に関する。 The present invention relates to a method for predicting coronary events and detection reagents used in the method. The present invention particularly relates to a method for predicting the presence or absence of a secondary coronary event in a patient after myocardial infarction treatment.
急性冠症候群（acute coronary syndrome, ACS）は、冠動脈中での血栓形成による血流の減少又は途絶により生じる疾患である。臨床的には狭心症、心筋梗塞、心臓性突然死等を含み、世界的に疾患による死亡原因の上位に位置するものである。ACSの危険因子としては、喫煙、糖尿病、高血圧、高コレステロール血症等が知られている。 Acute coronary syndrome (ACS) is a disease caused by reduced or interrupted blood flow due to thrombus formation in the coronary arteries. Clinically, it includes angina pectoris, myocardial infarction, sudden cardiac death, etc., and ranks among the top causes of death from diseases worldwide. Smoking, diabetes, hypertension, hypercholesterolemia, etc. are known risk factors for ACS.
ACSの治療としては、抗血小板薬、抗血栓薬、β遮断薬等による薬物療法に加えて、経皮的冠動脈インターベンション（percutaneous coronary intervention, PCI）や冠動脈バイパス術等の手術が行われており、特にPCIは、過去数十年の間、心筋梗塞患者の予後を大きく改善してきた。PCIでは、ステント留置後に治療部位での再狭窄が生じる問題があったが、こうした再狭窄は、薬物溶出性ステント（drug eluting stent, DES）の使用により低減している。更に、高用量のスタチンの経口投与によって、二次的な心血管系イベントが低減することが示されている。 ACS is treated with pharmacotherapy using antiplatelet drugs, antithrombotic drugs, and β-blockers, as well as surgery such as percutaneous coronary intervention (PCI) and coronary artery bypass grafting. PCI in particular has significantly improved the prognosis of patients with myocardial infarction over the past few decades. PCI has been associated with the problem of restenosis at the treatment site after stent placement, but this has been reduced by the use of drug eluting stents (DES). Furthermore, it has been shown that oral administration of high doses of statins reduces secondary cardiovascular events.
しかしながら、薬物溶出性ステントを使用した場合であっても治療部位での再狭窄が生じる残余リスクがあることが知られており、また治療部位とは異なる箇所で新たな病変が生じる場合もある。従って、PCI後の患者の継続的なモニタリングが必要とされている。 However, even when drug-eluting stents are used, it is known that there is a residual risk of restenosis at the treatment site, and new lesions may also occur at locations other than the treatment site. Therefore, continuous monitoring of patients after PCI is required.
これまで、心筋梗塞等の冠動脈イベントの発症を予測するためのバイオマーカーとして、血清中のサイトカインや可溶性タンパク質のレベルを用い得る可能性について報告されている（非特許文献１－９）。また、末梢血単核球中のマイクロRNAが予測のためのマーカーとなり得ることも報告されている（非特許文献１０－１１）。 So far, it has been reported that the levels of cytokines and soluble proteins in serum can be used as biomarkers for predicting the onset of coronary events such as myocardial infarction (Non-patent Documents 1-9). It has also been reported that microRNA in peripheral blood mononuclear cells can serve as a marker for prediction (Non-Patent Documents 10-11).
一方、ビリベルジンレダクターゼＢ（biliverdin reductase B、BLVRB）は、ヘモグロビン等に含まれるヘムの生分解産物中間体であって、緑色のテトラピロール化合物であるビリベルジンの2番目と3番目のピロールの間の二重結合を単結合にすることにより、ビリルビンに変換する酸化還元酵素である。ビリベルジンやビリルビンは単なるヘム分解産物であると考えられていたが、近年、ペルオキシラジカル等の超酸化物を消去する作用を有していることが知られるようになっている。しかしながら、ビリベルジンやBLVRBと冠動脈イベントとの関連については知られていない。 On the other hand, biliverdin reductase B (BLVRB) is a biodegradation product intermediate of heme contained in hemoglobin, etc., and is a compound between the second and third pyrrole of biliverdin, a green tetrapyrrole compound. It is an oxidoreductase that converts heavy bonds into single bonds, converting them into bilirubin. Biliverdin and bilirubin were thought to be mere heme decomposition products, but in recent years it has become known that they have the ability to scavenge superoxides such as peroxy radicals. However, the association between biliverdin and BLVRB and coronary events is unknown.
しかしながら、冠動脈イベントの発症の予測を目的として30種類のバイオマーカーを検討し、これらを古典的リスクファクターに追加しても、識別能力を有意に向上させなかったとの報告もされている（Circulation 2010; 121: 2388-2397）。
また、長期予後（冠動脈二次イベントの有無）を予測するACSのマーカーは未だに確立されていない。
However, a study investigating 30 biomarkers for predicting the onset of coronary events reported that adding these to classical risk factors did not significantly improve discriminatory ability (Circulation 2010; 121: 2388-2397).
In addition, ACS markers that predict long-term prognosis (presence or absence of secondary coronary events) have not yet been established.
本発明者等は、急性冠症候群患者由来のヒト血清中に存在する様々なタンパク質について、発現の包括的な解析のために、5年間のコホート試験を実施し、血清中におけるそれらの存在量と、冠動脈二次イベントの有無との相関性を検討した。 The inventors conducted a 5-year cohort study to comprehensively analyze the expression of various proteins present in human serum from patients with acute coronary syndrome, and examined the correlation between their abundance in serum and the presence or absence of secondary coronary events.
その結果、従来冠動脈イベントとの関連が全く報告されていなかったBLVRBの血清中濃度が、イベントのあった群となかった群とで有意に異なることが見出された。この知見に基づいて、本発明者等は、心筋梗塞治療後の再狭窄、及び新たな病変等の冠動脈二次イベントを予測できるマーカーとしてのBLVRBの有用性を見出すに到った。 As a result, it was found that the serum concentration of BLVRB, which had not previously been reported to be associated with coronary artery events, was significantly different between the group that had an event and the group that did not. Based on this knowledge, the present inventors have discovered the usefulness of BLVRB as a marker capable of predicting restenosis after myocardial infarction treatment and secondary coronary events such as new lesions.
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．被験体の血液サンプル中のビリベルジンレダクターゼＢ（biliverdin reductase B、BLVRB）の発現量若しくは活性を指標として該被験体における冠動脈イベントの有無を検出する、及び／又は冠動脈イベントの有無を予測するためのデータを提供する方法であって、基準値と比較してBLVRBの発現量若しくは活性の低下が検出された場合に冠動脈イベントが生じていることが示される、又は冠動脈イベントが生じる可能性があることが予測される、上記方法。
２．冠動脈イベントが新規病変である、上記１記載の方法。
３．冠動脈イベントが心筋梗塞治療部位の再狭窄である、上記１記載の方法。
４．血液サンプルが、全血、血漿又は血清由来のサンプルである、上記１～３のいずれか記載の方法。
５．血液サンプル中のBLVRBの発現量が、BLVRBタンパク質の量である、上記１～４のいずれか記載の方法。
６．BLVRBタンパク質と特異的に結合する試薬を用いて血液サンプル中のBLVRBタンパク質の量を測定する、上記５記載の方法。
７．血液サンプル中のBLVRBタンパク質を質量分析によって検出する、上記５記載の方法。
８．上記１～７のいずれか記載の方法に使用するための検出試薬であって、BLVRBの発現量の検出を可能とする、上記試薬。
９．血液サンプル中のBLVRBタンパク質との特異的結合のための抗体又はアプタマーである、上記８記載の検出試薬。
１０．上記８又は９に示される検出試薬を含む、冠動脈イベントを検出及び／又は予測するために使用されるキット。
That is, the present invention provides the following.
1. A method for detecting the presence or absence of a coronary event in a subject using the expression level or activity of biliverdin reductase B (BLVRB) in a blood sample from the subject as an index and/or providing data for predicting the presence or absence of a coronary event, wherein the occurrence of a coronary event is indicated or the possibility of the occurrence of a coronary event is predicted when a decrease in the expression level or activity of BLVRB is detected as compared to a reference value.
2. The method according to claim 1, wherein the coronary event is a new lesion.
3. The method according to the above 1, wherein the coronary event is restenosis at the site of myocardial infarction treatment.
4. The method according to any one of 1 to 3 above, wherein the blood sample is a sample derived from whole blood, plasma or serum.
5. The method according to any one of 1 to 4 above, wherein the expression level of BLVRB in a blood sample is the amount of BLVRB protein.
6. The method according to 5 above, wherein the amount of BLVRB protein in a blood sample is measured using a reagent that specifically binds to the BLVRB protein.
7. The method according to claim 5, wherein the BLVRB protein in the blood sample is detected by mass spectrometry.
8. A detection reagent for use in the method according to any one of 1 to 7 above, which enables detection of the expression level of BLVRB.
9. The detection reagent according to claim 8, which is an antibody or an aptamer for specific binding to a BLVRB protein in a blood sample.
10. A kit for use in detecting and/or predicting a coronary event, comprising the detection reagent as set forth in 8 or 9 above.
本発明により、冠動脈イベントを検出及び予測するために利用可能な新たな検出試薬及び方法が提供される。本発明において検出するマーカーは、従来報告されてきたACSのリスク因子と独立したリスク因子である可能性が高い。ACSは早期の対応が非常に重要な疾患であるため、特にPCI治療後の患者の長期予後の予測を可能とする本発明の方法は、非常に有益なものとなり得る。 The present invention provides new detection reagents and methods that can be used to detect and predict coronary events. The marker detected in the present invention is likely to be a risk factor independent of previously reported risk factors for ACS. Since ACS is a disease for which early treatment is very important, the method of the present invention, which makes it possible to predict the long-term prognosis of patients, especially after PCI treatment, can be extremely beneficial.
本発明は、第1の実施形態として、被験体の血液サンプル中のビリベルジンレダクターゼＢ（biliverdin reductase B、BLVRB）の発現量若しくは活性を指標として該被験体における冠動脈イベントの有無を検出する、及び／又は冠動脈イベントの有無を予測するためのデータを提供する方法であって、基準値と比較してBLVRBの発現量若しくは活性の低下が検出された場合に冠動脈イベントが生じていることが示される、又は冠動脈イベントが生じる可能性があることが予測される、上記方法を提供する。 As a first embodiment, the present invention provides a method for detecting the presence or absence of a coronary artery event in a subject using the expression level or activity of biliverdin reductase B (BLVRB) in a blood sample from the subject as an index, and/or providing data for predicting the presence or absence of a coronary artery event, in which the occurrence of a coronary artery event is indicated or the possibility of the occurrence of a coronary artery event is predicted when a decrease in the expression level or activity of BLVRB is detected compared to a reference value.
「冠動脈イベント」との用語は、当分野において通常使用される用語であり、当業者であれば容易に理解することができる。本明細書において、「冠動脈イベント」とは、特に冠動脈の狭窄、心臓性突然死、致死性及び非致死性心筋梗塞、不安定狭心症等の冠動脈の狭窄及び閉塞、及びそれによって生じる症状を含むことが意図される。 The term "coronary event" is a term commonly used in the art and can be easily understood by those skilled in the art. In this specification, "coronary event" is intended to include, in particular, coronary artery stenosis, sudden cardiac death, fatal and nonfatal myocardial infarction, unstable angina, and other coronary artery stenosis and occlusion, and symptoms resulting therefrom.
また、「（冠動脈）二次イベント」とは、心筋梗塞等の治療から数カ月～数年後に発生するイベントであって、当分野において、治療部位での再狭窄等のイベント、及び治療部位とは異なる部位で発生する狭窄等のイベントの双方を含むものとして理解されている。 In addition, a "secondary (coronary) event" is an event that occurs several months to several years after treatment for a myocardial infarction or the like, and is understood in the art to include both events such as restenosis at the treatment site, and events such as stenosis that occur at a site other than the treatment site.
上記の通り、ビリベルジンレダクターゼＢは、ビリベルジンをビリルビンに変換する酸化還元酵素である。本明細書において、ビリベルジンレダクターゼＢについて、簡略化のために「BLVRB」と記載する。BLVRB遺伝子（Gene ID: 645）は、ヒトにおいて第19番染色体（19q13.1-13.2、NC_000019.10）に位置する。BLVRBのmRNAの塩基配列及びアミノ酸配列は、NCBIデータベースにそれぞれNCBI参照配列：NM_000713.3及びNP_000704.1として、UniProtデータベースにP30043として登録されている。当業者であれば、これらの情報を容易に入手することができる。 As mentioned above, biliverdin reductase B is an oxidoreductase that converts biliverdin to bilirubin. In this specification, biliverdin reductase B is referred to as "BLVRB" for the sake of simplicity. The BLVRB gene (Gene ID: 645) is located on chromosome 19 (19q13.1-13.2, NC_000019.10) in humans. The BLVRB mRNA nucleotide sequence and amino acid sequence are registered in the NCBI database as NCBI reference sequences: NM_000713.3 and NP_000704.1, and in the UniProt database as P30043. Those skilled in the art can easily obtain this information.
本明細書において、「被験体」とは、冠動脈イベントを発症する可能性のあるヒト被験体である。好ましくは、被験体は、心筋梗塞等のACSを発症した患者であり、特に急性心筋梗塞患者であり得る。あるいは、被験体は、ACSを発症したことのないヒト被験体であり得る。 As used herein, a "subject" is a human subject who may develop a coronary event. Preferably, the subject is a patient who has developed an ACS, such as a myocardial infarction, and in particular, an acute myocardial infarction patient. Alternatively, the subject may be a human subject who has not developed an ACS.
「血液サンプル」とは、被験体から採取された全血、血漿又は血清、又はこれらに抗凝固剤、希釈剤等を添加したサンプルであり、被験体が心筋梗塞患者の場合、採取は、薬剤投与、及び経皮的冠動脈インターベンション（PCI）等の治療前であることが好ましい。 "Blood sample" refers to whole blood, plasma, or serum collected from a subject, or a sample in which an anticoagulant, diluent, etc. It is preferable that the treatment be performed before administration and treatment such as percutaneous coronary intervention (PCI).
本明細書において、「遺伝子」とは、当分野において一般的に理解されているように、タンパク質をコードするポリヌクレオチド、すなわちDNA又はRNAを意味するものであるが、これに加えて、必ずしもタンパク質をコードしなくても、生体内でRNAに転写され得るポリヌクレオチドを含めるものとする。 As used herein, the term "gene" refers to a polynucleotide that codes for a protein, i.e., DNA or RNA, as is generally understood in the art, but also includes polynucleotides that can be transcribed into RNA in vivo, even if they do not necessarily code for a protein.
本明細書において、「発現」とは、遺伝子と相補的なRNA（転写産物）の発現、及び遺伝子がコードするタンパク質（翻訳産物）の発現の双方を含めるものとする。従って、本明細書において、「発現量（発現レベル）」とは、転写産物又は翻訳産物の発現量又は発現強度をいう。発現量は通常、遺伝子に対応する転写産物の産生量、又はその翻訳産物の産生量、翻訳産物であるタンパク質の活性等により解析することができる。 As used herein, "expression" includes both expression of RNA (transcription product) complementary to a gene and expression of protein (translation product) encoded by the gene. Therefore, in this specification, "expression amount (expression level)" refers to the expression amount or expression intensity of a transcription product or translation product. The expression level can usually be analyzed based on the production amount of the transcription product corresponding to the gene, the production amount of its translation product, the activity of the protein that is the translation product, etc.
従って、BLVRBの「発現」とは、BLVRB遺伝子からのBLVRB mRNAの転写、及びBLVRBタンパク質への翻訳のいずれも含み得る。
「血液サンプル中のBLVRBの発現量若しくは活性」とは、血液サンプル中のBLVRBタンパク質の量、BLVRB mRNAの量、又はBLVRB酵素活性であり得る。
Therefore, "expression" of BLVRB can include both transcription of BLVRB mRNA from the BLVRB gene and translation into BLVRB protein.
"The expression level or activity of BLVRB in a blood sample" may be the amount of BLVRB protein, the amount of BLVRB mRNA, or BLVRB enzyme activity in a blood sample.
すなわち、本発明の方法において、血液サンプル中のBLVRBの発現量若しくは活性を指標とする検出は、血液サンプル、例えば全血、血漿又は血清中のBLVRBタンパク質量の検出、又は酵素としてのBLVRBの活性、すなわちビリベルジンを基質としたビリルビンへの還元反応の活性の検出であり得る。あるいは、検出は、血液サンプル、例えば全血中のBLVRB mRNAの検出であり得る。 That is, in the method of the present invention, detection using the expression level or activity of BLVRB in a blood sample as an index is detection of the amount of BLVRB protein in a blood sample, for example, whole blood, plasma, or serum, or detection of the activity of BLVRB as an enzyme. That is, it can be a detection of the activity of the reduction reaction to bilirubin using biliverdin as a substrate. Alternatively, the detection can be of BLVRB mRNA in a blood sample, eg, whole blood.
本発明の方法の一態様は、BLVRBタンパク質と特異的に結合する試薬を用いて血液サンプル中のBLVRBタンパク質の量を測定する方法であり得る。
また、本発明の方法の別の態様は、血液サンプル中のBLVRBタンパク質を質量分析によって検出する方法であり得る。質量分析は、特に限定するものではないが、例えば液体クロマトグラフィー質量分析法（LC/MS/MS）を用いることが好適である。
One embodiment of the method of the present invention may be a method for measuring the amount of BLVRB protein in a blood sample using a reagent that specifically binds to the BLVRB protein.
Another embodiment of the method of the present invention may be a method for detecting BLVRB protein in a blood sample by mass spectrometry. The mass spectrometry is not particularly limited, but is preferably, for example, liquid chromatography mass spectrometry (LC/MS/MS).
「基準値」とは、本発明の方法において発現の上昇又は低下を判定するための基準となり得る数値であり、例えば非ACS被験体、例えば健常人での発現の平均値、あるいはACS発症患者で二次イベントを発症しなかった被験体における発現の平均値等であり得る。「基準値」は、血液サンプル中におけるBLVRBタンパク質の量、BLVRBの酵素活性、BLVRB mRNA量の非ACS被験体における平均値であり得、予め取得することができる。
また、「発現の平均値」とは、サンプル中のBLVRBタンパク質又はBLVRB mRNAの存在量の平均値であり得る。あるいはまた、サンプル中のBLVRB活性を指標として「発現の平均値」とすることもできる。
The "reference value" is a numerical value that can serve as a standard for determining an increase or decrease in expression in the method of the present invention, and can be, for example, the average expression value in non-ACS subjects, such as healthy individuals, or the average expression value in ACS patients who have not developed secondary events. The "reference value" can be the average value of the amount of BLVRB protein, BLVRB enzyme activity, or BLVRB mRNA amount in a blood sample in non-ACS subjects, and can be obtained in advance.
The "average expression value" may be the average amount of BLVRB protein or BLVRB mRNA present in a sample. Alternatively, the "average expression value" may be determined using BLVRB activity in a sample as an index.
BLVRBタンパク質の検出は、BLVRBタンパク質に対して特異的に結合する試薬を用いて行うことができる。BLVRBタンパク質に対して特異的に結合する試薬としては、限定するものではないが、例えば、抗体又はアプタマーが挙げられる。 Detection of BLVRB protein can be performed using a reagent that specifically binds to BLVRB protein. Examples of reagents that specifically bind to BLVRB protein include, but are not limited to, antibodies or aptamers.
BLVRBタンパク質の検出のための抗体は公知の方法により、作製することができる。あるいはまた、抗体は、例えばInvitrogen社、Santa Cruz Biotechnology社、Sigma-Aldrich社等からヒトBLVRBに対する反応性を有するものが提供されており、これらを適宜入手して使用することができる。検出のための抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても良い。 Antibodies for detecting BLVRB protein can be produced by known methods. Alternatively, antibodies reactive to human BLVRB are provided by, for example, Invitrogen, Santa Cruz Biotechnology, Sigma-Aldrich, etc., and these can be obtained and used as appropriate. Antibodies for detection may be polyclonal or monoclonal antibodies.
抗体を用いたタンパク質の検出は、限定するものではないが、例えばウェスタンブロッティング、ELISA、フローサイトメトリー等によって行うことができる。抗体は、蛍光標識、放射性標識、酵素、ビオチン等による標識をすることができ、また、そのように標識された検出のための二次抗体を使用することもできる。タンパク質の検出のための市販されているキットを適宜使用しても良い。 Detection of proteins using antibodies can be performed by, for example, but not limited to, Western blotting, ELISA, flow cytometry, and the like. The antibody can be labeled with a fluorescent label, a radioactive label, an enzyme, biotin, etc., and a secondary antibody labeled in such a manner can also be used for detection. Commercially available kits for protein detection may be used as appropriate.
アプタマーは、DNA又はRNA等の核酸分子、あるいはペプチドであり得る。アプタマーを用いたタンパク質の検出は、限定するものではないが、アプタマーとタンパク質との結合を、抗体と同様に複数のアプタマーを用いるサンドイッチアッセイ等のイムノアッセイ、結合若しくは結合によるアプタマーの構造変化を電気化学センサー等のセンサーを利用してアッセイすること等で行うことができる。アプタマーは、抗体と同様に蛍光標識、放射性標識、酵素、ビオチン等による標識をすることができ、また、例えば核酸分子であるアプタマーとハイブリダイズし得る第２の核酸分子をそのように標識して検出のために用いても良い。 The aptamer may be a nucleic acid molecule such as DNA or RNA, or a peptide. Detection of a protein using an aptamer can be performed, without limitation, by an immunoassay such as a sandwich assay using multiple aptamers as with an antibody to detect the binding between the aptamer and the protein, or by assaying the binding or the structural change of the aptamer due to binding using a sensor such as an electrochemical sensor. The aptamer can be labeled with a fluorescent label, a radioactive label, an enzyme, biotin, or the like as with an antibody, and a second nucleic acid molecule capable of hybridizing with the aptamer, which is a nucleic acid molecule, may be labeled in this way and used for detection.
BLVRBタンパク質に対して特異的に結合し得るアプタマーは、例えばSELEX法等を用いたスクリーニングによってBLVRBタンパク質に対して特異的に結合するものを取得することができる。あるいは、アプタマーは、そのようなスクリーニングの実施を業者に委託して取得することもできる。 Aptamers capable of specifically binding to BLVRB protein can be obtained by screening using, for example, the SELEX method. Alternatively, aptamers can be obtained by outsourcing such screening to a contractor.
あるいはまた、BLVRBタンパク質の検出は、例えば液体クロマトグラフィー質量分析法（LC/MS/MS）等の質量分析により行うこともできる。質量分析では、検出対象のタンパク質を予めトリプシン等の酵素によって消化して得られたペプチドの有無及び量を検出することができる。BLVRBタンパク質の存在を質量分析によって検出する場合、限定するものではないが、例えば配列番号１のアミノ酸配列（VISKHDLGHFMLR）を有するペプチドを用いて好適に検出することができる。 Alternatively, BLVRB protein can be detected by mass spectrometry, such as liquid chromatography mass spectrometry (LC/MS/MS). In mass spectrometry, it is possible to detect the presence or absence and amount of a peptide obtained by previously digesting a protein to be detected with an enzyme such as trypsin. When detecting the presence of BLVRB protein by mass spectrometry, it can be suitably detected using, for example, a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (VISKHDLGHFMLR), although it is not limited thereto.
BLVRBタンパク質の検出はまた、血液サンプル中におけるBLVRBの酵素活性を測定することで行うこともできる。BLVRBは、上記のように、ビリベルジンを基質として、NADPHの存在下でビリルビンに還元する反応を触媒する。従って、これらの基質及び補酵素の存在下、適切な条件下で酵素反応の進行を検出することができる。しかしながら、当業者であれば、BLVRB活性の測定のために適した他の反応系を構築することもできる。 BLVRB protein can also be detected by measuring the enzyme activity of BLVRB in a blood sample. As described above, BLVRB catalyzes the reaction of reducing biliverdin as a substrate to bilirubin in the presence of NADPH. Therefore, in the presence of these substrates and coenzymes, the progress of the enzyme reaction can be detected under appropriate conditions. However, a person skilled in the art can also construct other reaction systems suitable for measuring BLVRB activity.
本発明の方法はまた、血液サンプル中、例えば全血中のBLVRB mRNAの検出により行っても良い。mRNAの代わりに、mRNAから逆転写されて得られるcDNAの検出であっても良い。 The method of the present invention may also be carried out by detecting BLVRB mRNA in a blood sample, for example in whole blood. Instead of mRNA, detection of cDNA obtained by reverse transcription from the mRNA may also be performed.
BLVRB mRNAの発現量の測定は、例えばBLVRB mRNAの塩基配列の全部又は一部を含むヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして用いてサンプル中の遺伝子発現の程度を測定すればよく、例えばマイクロアレイ（マイクロチップ）を用いた方法、ノーザンブロット法、定量的PCR法等で測定することが可能である。定量的PCR法としては、アガロースゲル電気泳動法、蛍光プローブ法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、ATAC-PCR法(Kato,K.et al.,Nucl.Acids Res.,25,4694-4696,1997)、Taqman PCR法（SYBR（登録商標）グリーン法）（Schmittgen TD,Methods25,383-385,2001）、Body Map法(Gene,174,151-158(1996))、Serial analysis of gene expression(SAGE)法（米国特許第527,154号、第544,861号、欧州特許公開第0761822号）、MAGE法(Micro-analysis of Gene Expression)（特開2000-232888号）等が知られており、これらを適宜使用することができる。これらの方法を用いて、mRNAの量を、該mRNAにハイブリダイズするヌクレオチドプローブ又はプライマーの使用により測定することができる。測定に用いるプローブ又はプライマーの塩基長は、10～50bp、好ましくは15～25bpである。これらのプローブ及びプライマーの塩基配列は、目的のmRNAの塩基配列等に基づいて、当業者が適宜設計することができ、場合によっては市販品を利用することもできる。 To measure the expression level of BLVRB mRNA, the degree of gene expression in a sample may be measured using, for example, a nucleotide containing all or part of the base sequence of BLVRB mRNA as a probe or primer. It can be measured by the method used, Northern blotting, quantitative PCR, etc. Quantitative PCR methods include agarose gel electrophoresis, fluorescent probe method, RT-PCR method, real-time PCR method, and ATAC-PCR method (Kato, K. et al., Nucl. Acids Res., 25, 4694-4696 , 1997), Taqman PCR method (SYBR (registered trademark) green method) (Schmittgen TD, Methods 25, 383-385, 2001), Body Map method (Gene, 174, 151-158 (1996)), Serial analysis of gene expression (SAGE ) method (U.S. Patent No. 527,154, No. 544,861, European Patent Publication No. 0761822), MAGE method (Micro-analysis of Gene Expression) (Japanese Patent Application Laid-open No. 2000-232888), etc. are known, and these methods can be used as appropriate. can do. Using these methods, the amount of mRNA can be measured through the use of nucleotide probes or primers that hybridize to the mRNA. The base length of the probe or primer used for measurement is 10 to 50 bp, preferably 15 to 25 bp. The base sequences of these probes and primers can be appropriately designed by those skilled in the art based on the target mRNA base sequence, etc., and commercially available products can also be used in some cases.
本発明の方法では、BLVRBの発現に加えて、他の遺伝子の発現を同時に検出しても良い。他の遺伝子としては、冠動脈イベントとの関連が報告されているものであっても良く、また他の疾患についてのマーカー遺伝子であっても良い。 In the method of the present invention, in addition to the expression of BLVRB, the expression of other genes may be detected simultaneously. Other genes may be genes that have been reported to be associated with coronary artery events, or may be marker genes for other diseases.
複数の遺伝子の発現を同時に測定する場合には、DNAマイクロアレイを用いることが好適である。少なくとも１個の遺伝子又はその断片を基板に固相化してDNAマイクロアレイを作製し、該DNAマイクロアレイと蛍光物質で標識した被験体由来のmRNAまたはcDNAを接触させ、ハイブリダイズさせ、DNAマイクロアレイ上の蛍光強度を測定することにより、mRNAの種類と量を決定することができる。 When measuring the expression of multiple genes simultaneously, it is preferable to use a DNA microarray. At least one gene or a fragment thereof is immobilized on a substrate to prepare a DNA microarray, and the DNA microarray is contacted with mRNA or cDNA derived from a subject that has been labeled with a fluorescent substance, hybridized, and the fluorescence intensity on the DNA microarray is measured, thereby determining the type and amount of mRNA.
DNAマイクロアレイを用いる場合、目的のmRNAを含む被験体由来のサンプルと上記対照サンプルとを同時にマイクロアレイにハイブリダイズさせることができる。それにより、対照サンプルと比較して被験体由来のサンプルにおいて発現が変動している遺伝子の発現レベルを相対的な発現変化として得ることができる。被験体由来のmRNA、及び場合によって対照サンプル由来のmRNAは標識することができ、標識は、特に限定するものではないが、市販の蛍光物質、例えば、Cy3、Cy5等を用いることができる。 When using a DNA microarray, a sample derived from a subject containing the mRNA of interest and the control sample described above can be simultaneously hybridized to the microarray. Thereby, the expression level of a gene whose expression changes in a sample derived from a subject compared to a control sample can be obtained as a relative expression change. The mRNA derived from the subject and, if necessary, the mRNA derived from the control sample can be labeled, and the label is not particularly limited, but commercially available fluorescent substances such as Cy3, Cy5, etc. can be used as the label.
DNAマイクロアレイは、市販品を適宜使用することもできる。使用可能なDNAマイクロアレイの例として、例えば3D-GeneTM Human Oligo chip 25k（東レ株式会社製）等を挙げることができる。 Commercially available DNA microarrays can also be used as appropriate. Examples of usable DNA microarrays include 3D-Gene ™ Human Oligo chip 25k (manufactured by Toray Industries, Inc.).
DNAマイクロアレイ解析では、個々の遺伝子の発現値が参照RNAの発現（普遍的対照サンプル（universal control）における発現値）に対する比として得られる場合がある。従って、基準値はまた、非ACS被験体、例えば健常人、あるいはACS発症患者で二次イベントを発症しなかった被験体における遺伝子の発現の参照RNAの発現に対する比であり得る。更に、基準値は、得られた比の値を例えばlog2スケール等に変換した値であり得る。 In DNA microarray analysis, the expression values of individual genes may be obtained as a ratio to the expression of a reference RNA (the expression value in a universal control sample). Thus, the reference value may also be the ratio of the expression of a gene to the expression of a reference RNA in a non-ACS subject, such as a healthy person or a subject who has developed ACS and has not developed a secondary event. Further, the reference value may be a value obtained by converting the obtained ratio value to, for example, a log2 scale.
上記のような基準値を、対象となる被験体での発現の検出と同時に対照サンプルでの発現を検出することで取得し、発現の比較を行うことができる。あるいはまた、対照サンプルの発現を予め測定し、標準的な発現レベルとして、場合によっては一定の範囲内の発現レベルとして準備しておくこともできる。 The reference value as described above can be obtained by detecting the expression in a control sample at the same time as the expression in the target subject, and the expression can be compared. Alternatively, the expression of a control sample can be measured in advance and set as a standard expression level, or in some cases, an expression level within a certain range.
発現量は、絶対値で表してもよく、また相対値で表してもよい。従って、「発現の低下」は、基準値に対して低下した発現レベルとして、あるいはまた、発現の「変化倍率（fold-change）」として表すことができる。本発明の方法において、冠動脈イベントの予測のために好適な「発現の低下」における発現の変動は、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上である。従って、「変化倍率」は、発現の低下においては0.80倍以下（未満）であることが好ましい。 The expression level may be expressed as an absolute value or as a relative value. Thus, "decreased expression" can be expressed as a decreased expression level relative to a reference value, or alternatively as a "fold-change" in expression. In the method of the present invention, the variation in expression in "reduction in expression" suitable for predicting coronary artery events is, for example, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more. Therefore, the "fold change" is preferably 0.80 times or less (less than) in reducing expression.
本発明の方法において、予測される冠動脈イベントは新規病変である。
ここで、「新規病変」とは、最初の冠動脈イベントにおける病変、及び最初の冠動脈イベントにおける病変とは異なる部位に生じた二次イベントにおける病変の双方を含むものとする。
また、本発明の方法において、予測される冠動脈イベントは心筋梗塞治療後の再狭窄である。
In the method of the present invention, the predicted coronary events are new lesions.
Here, the term "new lesion" includes both a lesion in a first coronary event and a lesion in a secondary event occurring at a site different from that of the lesion in the first coronary event.
In the method of the present invention, the predicted coronary event is restenosis after treatment for myocardial infarction.
本発明の方法では、基準値と比較して、被験体の血液サンプル中のBLVRBの発現の低下が検出された場合に、冠動脈イベントの徴候が生じている可能性、及び／又は将来的に冠動脈イベントが生じる可能性（リスク）が高いことが示される。
実施例において示すように、術後数年経過後の長期予後についても本発明の方法により予測できることが実証された。冠動脈イベントが生じるリスクが高いことが示された場合には、被験者は、発症を抑えるために予防的な処置を受けることができる。
In the methods of the present invention, detection of decreased expression of BLVRB in a subject's blood sample compared to a reference value indicates a high likelihood of symptoms of a coronary event and/or a high likelihood (risk) of a future coronary event.
As shown in the Examples, it has been demonstrated that the method of the present invention can predict long-term prognosis several years after surgery. If a high risk of coronary events is indicated, the subject can receive preventive treatment to prevent onset.
本発明は、第2の実施形態において、上記の本発明の方法に使用するための検出試薬であって、BLVRBの発現量の検出を可能とする、上記試薬を提供する。 In a second embodiment, the present invention provides a detection reagent for use in the method of the present invention described above, which enables detection of the expression level of BLVRB.
第1の態様において、検出試薬は、サンプル中のBLVRBタンパク質との特異的結合のための試薬、例えば抗体又はアプタマーであり得る。アプタマーは、DNA若しくはRNA等の核酸分子又はペプチドであり得る。検出に用いる抗体及びアプタマーは、当分野において用いられる方法により、安定性向上等のために改変されたものであっても良い。また、検出試薬は、検出のために必要な標識等を適宜施すことができる。 In the first aspect, the detection reagent may be a reagent for specific binding to the BLVRB protein in the sample, such as an antibody or an aptamer. The aptamer may be a nucleic acid molecule such as DNA or RNA, or a peptide. The antibody and aptamer used for detection may be modified by a method used in the art to improve stability, etc. In addition, the detection reagent may be appropriately labeled with a label required for detection.
第2の態様において、検出試薬は、質量分析、例えば液体クロマトグラフィー質量分析法（LC/MS/MS）によるBLVRBタンパク質の検出のための試薬、例えば内部標準等であり得る。
第3の態様において、検出試薬は、サンプル中のBLVRB mRNAとのハイブリダイゼーションのためのDNA又はRNAである。DNA又はRNAは、ハイブリダイゼーションを蛍光標識等で検出し得るプローブである。あるいはまた、DNA又はRNAは、mRNAの増幅に使用可能なプライマーである。
In a second embodiment, the detection reagent may be a reagent for detection of BLVRB protein by mass spectrometry, such as liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS/MS), such as an internal standard.
In a third embodiment, the detection reagent is DNA or RNA for hybridization with BLVRB mRNA in the sample. DNA or RNA is a probe whose hybridization can be detected with a fluorescent label or the like. Alternatively, DNA or RNA are primers that can be used to amplify mRNA.
本発明は、第3の実施形態において、上記の本発明の検出試薬を含む、冠動脈イベントを検出及び／又は予測するために使用されるキットを提供する。本発明のキットは、検出試薬に加えて、検出のために必要な他の試薬、例えば緩衝剤、各種ヌクレオチド、抗体若しくはアプタマーの結合又はmRNAのハイブリダイゼーションのために必要な他の試薬、LC/MS/MSでの検出のための酵素等を含むことができる。 In a third embodiment, the present invention provides a kit used for detecting and/or predicting a coronary event, comprising the above-described detection reagent of the present invention. In addition to the detection reagent, the kit of the present invention includes other reagents necessary for detection, such as buffers, various nucleotides, binding of antibodies or aptamers, or other reagents necessary for hybridization of mRNA, LC/ It can contain enzymes and the like for detection by MS/MS.
上記の通り、本発明により、冠動脈イベントを発症する可能性の高い被験体では、BLVRBの発現が低下していることが見出されている。従って、このような被験体に、BLVRB遺伝子がコードするタンパク質、あるいはBLVRB遺伝子と同じ塩基配列を有するポリヌクレオチドを適切な形態で、例えば遺伝子がコードするタンパク質を細胞表面抗原として発現する細胞として、あるいは当分野において通常利用されるベクター、例えばウイルスベクター、プラスミドベクター等に組み込んで、治療薬として被験体に投与することで、冠動脈イベントの発症を予防することが可能となり得る。
治療薬の投与方法は、特に限定するものではないが、例えば静脈内投与とすることが好ましい。
As described above, the present invention has found that expression of BLVRB is decreased in subjects who are likely to develop coronary events. Therefore, by administering to such subjects a protein encoded by the BLVRB gene or a polynucleotide having the same nucleotide sequence as the BLVRB gene in an appropriate form, for example, as a cell expressing the protein encoded by the gene as a cell surface antigen, or by incorporating the same into a vector commonly used in the art, such as a viral vector or a plasmid vector, as a therapeutic agent, it may be possible to prevent the onset of coronary events.
The method of administration of the therapeutic agent is not particularly limited, but is preferably, for example, intravenous administration.
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
［実施例１］
金沢大学附属病院、石川県立中央病院、富山県立中央病院の３施設において、急性心筋梗塞を発症し、冠動脈造影検査及び冠動脈形成術を施した30症例について、約5年間（58ヶ月）の追跡調査を行い、イベント（再発）のなかった群、及びイベントのあった群に分けた。追跡期間中、患者はそれぞれ、血圧及びコレステロール値のコントロール等を含む、ガイドラインに沿った治療を継続した。
[Example 1]
Approximately 5 years (58 months) follow-up study of 30 patients who developed acute myocardial infarction and underwent coronary angiography and coronary angioplasty at three facilities: Kanazawa University Hospital, Ishikawa Prefectural Central Hospital, and Toyama Prefectural Central Hospital. The patients were divided into a group with no events (recurrence) and a group with events. During the follow-up period, each patient continued to receive guideline-based treatment, including controlling blood pressure and cholesterol levels.
治療前の患者から採取・保管していた血清（イベントのなかった群及びイベントのあった群の双方）、並びに健常者から採取した血清（コントロール群）について、様々なタンパク質の存在量を液体クロマトグラフィー質量分析法（LC/MS/MS）により解析して、イベントのあった群となかった群とで存在量に相違が見出された60種の候補分子を先ず同定した。 The amount of various proteins present in serum collected and stored from patients before treatment (both groups with and without events) and serum collected from healthy individuals (control group) was analyzed using liquid chromatography mass spectrometry (LC/MS/MS), and 60 candidate molecules whose abundance was found to differ between the groups with and without events were first identified.
次いで、検出された各タンパク質の正規化された存在量を対数変換し、3群間で比較解析を行い、有意差p<0.05で絞り込み、更にクラスター解析を実施して、BLVRBを含む10種の分子を同定した。
尚、BLVRBの検出は、配列番号１のアミノ酸配列（VISKHDLGHFMLR）を有するペプチドを検出することで行った。
測定装置：LC： Paradigm MS4（Michrom Bioresources社）
MS/MS：LTQ OrbiTrap XL質量分析計（Thermo Scientific社）
測定条件：乾燥させたペプチド試料を、水、アセトニトリルおよびギ酸からなる溶媒（体積比98:2:0.1）に溶解し、タンパク質換算で1 μg相当分を LC-MS/MSに供した。
Next, the normalized abundance of each detected protein was log-transformed and a comparative analysis was performed among the three groups. Significant differences of p<0.05 were narrowed down to those with a significance level of p<0.05, and further cluster analysis was performed to identify 10 molecules containing BLVRB.
BLVRB was detected by detecting a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 (VISKHDLGHFMLR).
Measurement equipment: LC: Paradigm MS4 (Michrom Bioresources)
MS/MS: LTQ OrbiTrap XL mass spectrometer (Thermo Scientific)
Measurement conditions: The dried peptide sample was dissolved in a solvent consisting of water, acetonitrile, and formic acid (volume ratio 98:2:0.1), and an amount equivalent to 1 μg of protein was subjected to LC-MS/MS.
配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドの存在を指標として血清サンプルを分析した結果、イベントのなかった群では、イベントのあった群と比較して有意に高いピーク強度が得られた。 When serum samples were analyzed using the presence of a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 as an indicator, the group without events showed significantly higher peak intensity than the group with events.
［実施例２］
急性冠症候群に対して冠動脈ステント留置を行った21症例を対象として、発症時に採取され、保管されていた血清中のBLVRB濃度を測定した。測定は、Cloud-clone社のELISAキット（ELISA Kit for Biliverdin Reductase B (BLVRB)、SEJ550Hu）を使用した。
[Example 2]
We measured BLVRB concentrations in serum samples collected at the time of onset and stored in 21 cases in which coronary artery stents were placed for acute coronary syndrome. For the measurement, an ELISA kit (ELISA Kit for Biliverdin Reductase B (BLVRB), SEJ550Hu) from Cloud-clone was used.
その結果、図１に示すように、イベント（再発）なしの患者では、血清中の平均BLVRB濃度が約23 ng/mLであり、平均BLVRB濃度が約9 ng/mLであったイベントありの患者と比較して、血清中のBLVRB濃度が有意に高いことが明らかとなった。 As a result, as shown in Figure 1, in patients without events (recurrence), the average BLVRB concentration in serum was approximately 23 ng/mL, and in patients with events, the average BLVRB concentration was approximately 9 ng/mL. It was revealed that the BLVRB concentration in the serum was significantly higher than that in the serum.
［実施例３］
急性冠症候群に対して薬剤溶出性ステントを留置し、かつ血清保存されていた38症例を対象として、BLVRBの値によりステント内再狭窄ならびに新規病変といった非致死性冠動脈イベント発症に違いがあるか否かを検討した。肝疾患を有する症例、来院時に肝障害や感染症を有する症例を除く22例で検討した。
[Example 3]
We investigated whether there was a difference in the occurrence of nonfatal coronary events such as in-stent restenosis and new lesions depending on the BLVRB value in 38 patients who had drug-eluting stents placed for acute coronary syndrome and whose serum was preserved. We examined 22 patients, excluding those with liver disease and those with liver damage or infection at the time of hospital visit.
追跡調査の平均期間は877日であった。追跡期間中、8名(36%)に非致死性冠動脈イベントが発生した。下記の表１に、イベントのなかった患者群（「ACS」と表記する）14名、及びイベントのあった患者群（「ACS/イベント」と表記する）8名の臨床的ベースライン特性の一部を記載する。 The mean follow-up period was 877 days. Eight patients (36%) experienced nonfatal coronary events during follow-up. Table 1 below lists some of the clinical baseline characteristics of the 14 patients without events (denoted as "ACS") and the eight patients with events (denoted as "ACS/event").
表１に示すように、両群で様々な因子を比較し、非致死性冠動脈イベントに影響する因子についての単変量ロジスティック解析を行った結果、BLVRB濃度、maxCPK、及びアルブミン（ALB）で統計的に有意な差が確認された。尚、BLVRB濃度は実施例２と同様に、ELISAによって測定した。 As shown in Table 1, various factors were compared between the two groups, and univariate logistic analysis was performed on factors influencing nonfatal coronary events, and statistically significant differences were confirmed in BLVRB concentration, maxCPK, and albumin (ALB). Note that BLVRB concentration was measured by ELISA, as in Example 2.
次いで、Cox比例ハザードモデルによる多変量解析を行った結果、maxCPK及びアルブミンでは有意差は認められず、BLVRB濃度が非致死性冠動脈イベント発症に独立して寄与する有意な因子として抽出された(ハザード比 0.89; 95%信頼区間 0.791-0.997, p=0.044)。 Next, as a result of multivariate analysis using the Cox proportional hazards model, no significant differences were observed in maxCPK and albumin, and BLVRB concentration was extracted as a significant factor that independently contributes to the occurrence of non-fatal coronary events (hazard ratio 0.89; 95% confidence interval 0.791-0.997, p=0.044).
非致死性冠動脈イベント予測についての有効性を更に確認するために、BLVRB濃度でROC曲線を作成すると、AUC 0.794(95% CI: 0.603-0.986, P=0.024)となり、カットオフ値は12.9722≒13（ng/mL）と算出された（図２）。 To further confirm the effectiveness in predicting non-fatal coronary events, an ROC curve was created using BLVRB concentration, and the AUC was 0.794 (95% CI: 0.603-0.986, P=0.024), and the cutoff value was 12.9722≒13 (ng/mL) (Figure 2).
［実施例４］
実施例３で検討した22症例について、血清中BLVRB濃度が13ng/mL以上の群と13ng/mL未満の群とで、非致死性冠動脈イベント回避率について比較したKaplan-Meier曲線を作成した。
[Example 4]
For the 22 cases studied in Example 3, a Kaplan-Meier curve was created comparing the non-fatal coronary event avoidance rate between the group with a serum BLVRB concentration of 13 ng/mL or more and the group with a serum BLVRB concentration of less than 13 ng/mL.
その結果、図３に示すように、血清中BLVRB濃度が13 ng/mL以上の群は、13ng/mL未満の群と比較して、非致死性冠動脈イベントの発症率が有意に低値であった（p=0.013, ログランクテスト）。
上記の結果から、被験者の血清中BLVRB濃度を測定することで、長期予後（冠動脈二次イベントの有無）を予測することができることが実証された。
As a result, as shown in Figure 3, the incidence of non-fatal coronary events was significantly lower in the group with a serum BLVRB concentration of 13 ng/mL or higher than in the group with a serum BLVRB concentration of less than 13 ng/mL. (p=0.013, log-rank test).
The above results demonstrated that long-term prognosis (presence or absence of secondary coronary events) can be predicted by measuring the serum BLVRB concentration of subjects.
BLVRBはビリベルジンをビリルビンに変換する酵素であり、BLVRBの高値は、細胞の酸化ストレス、炎症に対して保護的に作用し、冠動脈イベントの抑制に関連している可能性が示唆された。ACSは早期の対応が非常に重要な疾患であるため、特にPCI治療後の患者の長期予後の予測を可能とする本発明の方法は、非常に有益なものとなり得る。 BLVRB is an enzyme that converts biliverdin to bilirubin, and it has been suggested that high levels of BLVRB may have a protective effect against cellular oxidative stress and inflammation, and may be related to the suppression of coronary events. Since early response is extremely important in ACS, the method of the present invention, which makes it possible to predict the long-term prognosis of patients, especially after PCI treatment, may be extremely beneficial.
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