JP7440729B2

JP7440729B2 - 粘膜免疫原性を調節する方法

Info

Publication number: JP7440729B2
Application number: JP2021555819A
Authority: JP
Inventors: ユ－シェンスー，; ミンイチャン，; ス－ウェイカン，
Original assignee: Advagene Biopharma Co Ltd
Current assignee: Advagene Biopharma Co Ltd
Priority date: 2019-03-20
Filing date: 2020-03-18
Publication date: 2024-02-29
Anticipated expiration: 2040-03-18
Also published as: AU2020242717A1; JP2022525363A; KR20210141623A; EP3941520A4; CN113660948A; BR112021018542A2; US20220143177A1; CA3133718A1; TW202102259A; EP3941520A1; TWI764111B; WO2020187255A1

Description

［相互参照］
本出願は、２０１９年３月２０日出願の米国仮出願第６２／８２０，９６６号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

［発明の分野］
本発明は、粘膜免疫付与の分野に関し、特に、免疫付与のために異なる粘膜部位に抗原および免疫調節剤を送達することに関する。

［発明の背景］
ワクチンの免疫原性を増強するための一般的な実施は、抗原をアジュバントなどの免疫調節剤と同時投与することを含む。組換え、精製またはスプリット抗原などの非生ワクチンのほとんどの抗原は、免疫原性が低いことが多く、免疫原性を高めるためにアジュバントに依存する。ワクチン接種のためのアジュバントは免疫調節剤に属し、それらの機構は、注射部位でのデポー形成、サイトカインおよびケモカインの誘導、常在ランゲルハンス細胞の活性化、抗原提示食細胞（ＡＰＣ）の動員、およびリンパ節をドレーンするための抗原提示細胞のホーミングの促進などを含むが、これらに限定されない。現在のアジュバント化ワクチンでは、アジュバントおよび抗原は予め混合され、同時に投与される。アジュバントの分子特性および反応性ＡＰＣの性質に依存して、アジュバントは免疫の質および量を調節する。それにもかかわらず、別々におよび／または異なる時点で投与される免疫調節剤は、アジュバントとはみなされない（ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ／ＶＷＰ／２４４８９４／２００６）。アジュバントは、抗原に対する免疫反応を増強するように設計される。免疫調節剤は、より全身性の方法で抗原の免疫性を改変する。

粘膜表面は、病原体攻撃を最も受けやすい部位である。粘膜ワクチン接種は、効果的なワクチン接種のための集中的に研究されたワクチン接種経路であり、粘膜経路を介した感染に対する防御の第一線を提供するために推奨される。筋肉内（ＩＭ）または皮下（ＳＣ）免疫付与と比較して、粘膜免疫付与は、非侵襲性、病原体に対する交差反応性ＩｇＡ、低コスト、および血液由来疾患の伝染リスクの低減を含むが、これらに限定されない、顕著な公衆衛生の利点を提供する。

粘膜上皮は、環境攻撃から身体を保護するが、粘膜ワクチン接種に対する障害である。（ワクチン用の）有効な粘膜免疫調節剤またはアジュバントを設計するためには、上皮バリアに入るかまたはバイパスし、抗原の取り込みを促進し、抗原提示樹状細胞（ＤＣ）を活性化する能力が必須である。ランゲルハンス細胞（未成熟ＤＣ）は、上皮に共通して存在する。ＤＣは、表面受容体を介して環境をサンプリングするために、層状扁平上皮と粘膜表面までの間に延在する樹状突起様仮足を産生する。このサンプリング機構は、粘膜免疫調節剤および抗原のための効率的な経路を提供し、ランゲルハンス細胞によるその後の取り込みを容易にする。今日では、ほんの一握りの粘膜ワクチンがヒトに利用可能であるが、これは主に安全で有効な粘膜アジュバントの不足による。

細菌成分、毒素およびトキソイドは免疫応答を調節し、アジュバントとして適している。大腸菌不安定性毒素（ＬＴ）は、免疫原性を増強する際のその顕著な有効性のために最も研究された粘膜アジュバントの１つである。

一般的なワクチン接種の実施において、抗原は、アジュバントと予め混合され、同時投与される。抗原媒介リンパ球活性化のプロセスは、簡潔には、抗原を未成熟ＡＰＣに曝露すること、抗原をＡＰＣに取り込んで成熟ＡＰＣにすること、ＡＰＣがサイトカインを分泌するように誘導すること、免疫細胞を動員すること、成熟ＡＰＣを近位リンパ節（ＬＮ）にホーミングすること、リンパ球とＡＰＣとの間のクロストーク、およびリンパ球を活性化することを含む。アジュバントを抗原と予め混合する理論的根拠は、抗原単独ではＡＰＣを最適化してリンパ球活性化を完了させるには不十分であるという仮定に基づいており、これはまた、アジュバントによる抗原の同時刺激がＡＰＣを調整し、その後のリンパ球活性化におけるその役割を規定し得ることを示唆する。

インフルエンザワクチン接種は、インフルエンザウイルス感染およびその潜在的に重篤な合併症を予防するための最も有効な方法である。ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質は、このような感染に必要とされ、インフルエンザビリオンの主要な表面糖タンパク質を表す。インフルエンザウイルスは、ＨＡおよびＮＡ上で頻繁に抗原変化（すなわち、抗原連続変異）を受けるので、ワクチン接種が推奨される人は、目下流行しているインフルエンザウイルスに対する毎年のワクチン接種を受けなければならない。

現在のインフルエンザワクチン接種は、抗ウイルス特異的ＩｇＧを増強するが、粘膜ＩｇＡへの増幅を欠く。最初のインフルエンザワクチンは１９３８年に開発された。それ以来、筋肉内または皮下投与がワクチン接種の主要な経路であった。しかしながら、いずれも粘膜保護を提供しない。経鼻スプレーによる弱毒化季節性インフルエンザワクチン接種が現在利用可能であり、粘膜保護の増強をもたらすが、いくつかの制限および安全性の懸念を伴う。高齢レシピエントに対する低い有効性は、現在のインフルエンザワクチン接種に対する別の公衆衛生上の問題である。満たされていない医学的ニーズを満たすために、高用量抗原またはアジュバント添加ワクチンが国際的に承認されている。

アレルギーは、免疫系の障害であり、ダニ、花粉または他の植物成分、粉塵、カビまたは真菌、食物、添加物、ラテックス、輸血反応、動物または鳥の鱗屑、昆虫毒、放射線造影剤、薬物または化学物質を含むが、これらに限定されない多種多様な供給源に存在し得る、通常は無害な環境物質に対するアレルギー反応の発生を特徴とする。

イエダニ抽出物（ＨＤＭ）は、イエダニからの抽出物であり、ＨＤＭ特異的気道アレルギーのためのアレルゲン免疫療法（ＡＩＴ）において使用される。ＨＤＭは、筋肉内（ＩＭ）または舌下（ＳＬ）経路のいずれかによって投与することができる。しかしながら、ＨＤＭの免疫原性は乏しい。ＳＬ経路では、アレルギー症状を完全に緩和するために、３年以上にわたって１年あたり３－５ヶ月間毎日投与することがしばしば必要とされる。現在、治療効果の至適基準は、アレルゲン特異的ＩｇＧ４の力価である。多くの研究は、アレルゲン特異的ＩｇＧ４の力価が気道アレルギーと負に相関することを実証している。齧歯類はＩｇＧ４を有さず、その役割は他のＩｇＧサブタイプで代用されている。

本発明では、ＬＴｈ（αＫ）のような免疫調節剤が、該抗原が送達される部位とは異なる解剖学上の粘膜部位に送達されると、該抗原特異的免疫応答が有意に増強されることが見出された。本発明は、免疫調節剤としての粘膜免疫におけるＬＴｈ（αＫ）などの、免疫調節剤の使用、ならびに粘膜ワクチンおよび気道アレルギーの治療の開発におけるその適用を拡大する。

［発明の概要］
本開示は、抗原および免疫調節剤を異なる粘膜部位に投与することによって、抗原の免疫原性を調節することができ、望ましい免疫応答を誘発することができるという発見に関する。したがって、本開示は、必要とする対象の粘膜部位に抗原を投与することと、前記対象の異なる解剖学的粘膜部位に免疫調節剤を投与することとを含む、粘膜免疫応答を調節するための新規方法を提供する。

好ましい実施形態では、抗原は、ヒトなどの哺乳動物に対する外来タンパク質である。特に、抗原は、臨床要求に対して不十分な免疫原性を示した。好ましい態様において、抗原は粘膜免疫応答を誘導する。より好ましくは、抗原は病原性応答に関与する。好ましい実施形態では、抗原は、ウイルスタンパク質、花粉、カビ、昆虫タンパク質（ＨＤＭ、ハチ毒、ゴキブリなど）、動物の鱗屑、粉塵、化学物質、植物などからなる。好ましい態様において、抗原は生物学的である。

一実施形態では、免疫調節剤は、粘膜上皮を通してシグナル伝達することができる。好ましくは、免疫調節剤は毒素またはトキソイドであり、より好ましくは、免疫調節剤は細菌起源の毒素またはトキソイドである。好ましい実施形態では、免疫調節剤は、解毒されたＬＴ、ＬＴｈ（αＫ）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストもしくはアンタゴニスト、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ、またはパターン認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストもしくはアンタゴニストである。さらに好ましい態様において、免疫調節剤はＬＴｈ（αＫ）である。ＬＴｈ（αＫ）は、米国特許第２００８１０２０７８号に開示されているＬＴＳ６１Ｋに対応し、これは米国特許第２００８１０２０７８号に開示されているように、配列番号５の位置６１に対応する位置にリジン置換を有する無毒化大腸菌ＬＴホロトキシンである。さらに好ましい実施形態では、免疫調節剤は、上皮細胞、ランゲルハンス細胞、常在単核細胞、および神経細胞を含む接触している細胞からのサイトカインＩＬ６産生を誘導しない。

一実施形態では、粘膜部位は、任意の解剖学的粘膜であり得る。好ましい実施形態では、粘膜部位は、舌下粘膜、鼻腔内粘膜、気道粘膜、口腔粘膜、膣粘膜、直腸粘膜、または他の解剖学的粘膜である。さらに好ましい実施形態では、抗原は舌下粘膜に投与される。さらに好ましい実施形態では、免疫調節剤は、咽頭まで広がり得る鼻腔内粘膜に投与される。

好ましい実施形態において、免疫応答は、抗原特異的ＩｇＧおよびそのサブクラス、抗原特異的ＩｇＡおよびそのサブクラス、抗原特異的ＩｇＭおよびそのサブクラス、または細胞媒介性免疫の産生を含む。より好ましくは、免疫応答は治療的利益を提供する。さらに好ましい態様において、免疫応答は、免疫成分のアップレギュレーションを含む。別の好ましい実施形態において、免疫応答は、免疫成分のダウンレギュレーションを含む。さらに好ましい態様において、免疫応答は、抗原に対する免疫グロブリンの産生を含む。

好ましい実施形態では、抗原は、免疫調節剤と連続的にまたは組み合わせて、ただし異なる粘膜部位に対して、投与される。さらに好ましい実施形態において、抗原および免疫調節剤は、同時に投与される。さらに好ましい態様において、抗原および免疫調節剤は別々に投与される。より好ましくは、抗原の投与と免疫調節剤の投与との間隔は、１分、２分、３分、５分、１０分、２０分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日または５日以内である。

以下、本発明を詳細に説明する。本発明の他の特徴、目的及び利点は、本発明の詳細な説明及び特許請求の範囲に容易に見出すことができる。

図１Ａ～Ｆは、鼻腔内送達されたＬＴｈ（αＫ）と組み合わせた、または組み合わせない、舌下ワクチン接種されたスプリットＢ型インフルエンザワクチン（Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８様ウイルス）からの抗原特異性免疫原性効果を示す。マウスから血清（Ａ－Ｄ）および鼻洗浄液（Ｅ，Ｆ）を免疫付与後１４日目に収集し、Ｂ型インフルエンザＩｇＧ（Ａ，Ｂ）およびＩｇＡ（Ｃ－Ｆ）への力価を分析した。Ｘ軸は、各免疫付与におけるＦｌｕＢのＨＡ抗原及びＬＴｈ（αＫ）の投与量を示す。Ｃ５７ＢＬ／６（Ａ、ＣおよびＥ）およびＢａｌｂ／ｃ（Ｂ、ＤおよびＦ）系統の両方をこの研究に供した。全ての動物に３週間投与した。血清抗Ｂ型インフルエンザ免疫グロブリンＧおよび鼻洗浄液抗Ｂ型インフルエンザ免疫グロブリンＡは、ＬＴｈ（αＫ）の鼻腔内投与と組み合わせたＢ型インフルエンザ抗原の舌下投与後に増強された。図１Ａ～Ｆは、鼻腔内送達されたＬＴｈ（αＫ）と組み合わせた、または組み合わせない、舌下ワクチン接種されたスプリットＢ型インフルエンザワクチン（Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８様ウイルス）からの抗原特異性免疫原性効果を示す。マウスから血清（Ａ－Ｄ）および鼻洗浄液（Ｅ，Ｆ）を免疫付与後１４日目に収集し、Ｂ型インフルエンザＩｇＧ（Ａ，Ｂ）およびＩｇＡ（Ｃ－Ｆ）への力価を分析した。Ｘ軸は、各免疫付与におけるＦｌｕＢのＨＡ抗原及びＬＴｈ（αＫ）の投与量を示す。Ｃ５７ＢＬ／６（Ａ、ＣおよびＥ）およびＢａｌｂ／ｃ（Ｂ、ＤおよびＦ）系統の両方をこの研究に供した。全ての動物に３週間投与した。血清抗Ｂ型インフルエンザ免疫グロブリンＧおよび鼻洗浄液抗Ｂ型インフルエンザ免疫グロブリンＡは、ＬＴｈ（αＫ）の鼻腔内投与と組み合わせたＢ型インフルエンザ抗原の舌下投与後に増強された。図１Ａ～Ｆは、鼻腔内送達されたＬＴｈ（αＫ）と組み合わせた、または組み合わせない、舌下ワクチン接種されたスプリットＢ型インフルエンザワクチン（Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８様ウイルス）からの抗原特異性免疫原性効果を示す。マウスから血清（Ａ－Ｄ）および鼻洗浄液（Ｅ，Ｆ）を免疫付与後１４日目に収集し、Ｂ型インフルエンザＩｇＧ（Ａ，Ｂ）およびＩｇＡ（Ｃ－Ｆ）への力価を分析した。Ｘ軸は、各免疫付与におけるＦｌｕＢのＨＡ抗原及びＬＴｈ（αＫ）の投与量を示す。Ｃ５７ＢＬ／６（Ａ、ＣおよびＥ）およびＢａｌｂ／ｃ（Ｂ、ＤおよびＦ）系統の両方をこの研究に供した。全ての動物に３週間投与した。血清抗Ｂ型インフルエンザ免疫グロブリンＧおよび鼻洗浄液抗Ｂ型インフルエンザ免疫グロブリンＡは、ＬＴｈ（αＫ）の鼻腔内投与と組み合わせたＢ型インフルエンザ抗原の舌下投与後に増強された。図１Ａ～Ｆは、鼻腔内送達されたＬＴｈ（αＫ）と組み合わせた、または組み合わせない、舌下ワクチン接種されたスプリットＢ型インフルエンザワクチン（Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８様ウイルス）からの抗原特異性免疫原性効果を示す。マウスから血清（Ａ－Ｄ）および鼻洗浄液（Ｅ，Ｆ）を免疫付与後１４日目に収集し、Ｂ型インフルエンザＩｇＧ（Ａ，Ｂ）およびＩｇＡ（Ｃ－Ｆ）への力価を分析した。Ｘ軸は、各免疫付与におけるＦｌｕＢのＨＡ抗原及びＬＴｈ（αＫ）の投与量を示す。Ｃ５７ＢＬ／６（Ａ、ＣおよびＥ）およびＢａｌｂ／ｃ（Ｂ、ＤおよびＦ）系統の両方をこの研究に供した。全ての動物に３週間投与した。血清抗Ｂ型インフルエンザ免疫グロブリンＧおよび鼻洗浄液抗Ｂ型インフルエンザ免疫グロブリンＡは、ＬＴｈ（αＫ）の鼻腔内投与と組み合わせたＢ型インフルエンザ抗原の舌下投与後に増強された。図１Ａ～Ｆは、鼻腔内送達されたＬＴｈ（αＫ）と組み合わせた、または組み合わせない、舌下ワクチン接種されたスプリットＢ型インフルエンザワクチン（Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８様ウイルス）からの抗原特異性免疫原性効果を示す。マウスから血清（Ａ－Ｄ）および鼻洗浄液（Ｅ，Ｆ）を免疫付与後１４日目に収集し、Ｂ型インフルエンザＩｇＧ（Ａ，Ｂ）およびＩｇＡ（Ｃ－Ｆ）への力価を分析した。Ｘ軸は、各免疫付与におけるＦｌｕＢのＨＡ抗原及びＬＴｈ（αＫ）の投与量を示す。Ｃ５７ＢＬ／６（Ａ、ＣおよびＥ）およびＢａｌｂ／ｃ（Ｂ、ＤおよびＦ）系統の両方をこの研究に供した。全ての動物に３週間投与した。血清抗Ｂ型インフルエンザ免疫グロブリンＧおよび鼻洗浄液抗Ｂ型インフルエンザ免疫グロブリンＡは、ＬＴｈ（αＫ）の鼻腔内投与と組み合わせたＢ型インフルエンザ抗原の舌下投与後に増強された。図１Ａ～Ｆは、鼻腔内送達されたＬＴｈ（αＫ）と組み合わせた、または組み合わせない、舌下ワクチン接種されたスプリットＢ型インフルエンザワクチン（Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８様ウイルス）からの抗原特異性免疫原性効果を示す。マウスから血清（Ａ－Ｄ）および鼻洗浄液（Ｅ，Ｆ）を免疫付与後１４日目に収集し、Ｂ型インフルエンザＩｇＧ（Ａ，Ｂ）およびＩｇＡ（Ｃ－Ｆ）への力価を分析した。Ｘ軸は、各免疫付与におけるＦｌｕＢのＨＡ抗原及びＬＴｈ（αＫ）の投与量を示す。Ｃ５７ＢＬ／６（Ａ、ＣおよびＥ）およびＢａｌｂ／ｃ（Ｂ、ＤおよびＦ）系統の両方をこの研究に供した。全ての動物に３週間投与した。血清抗Ｂ型インフルエンザ免疫グロブリンＧおよび鼻洗浄液抗Ｂ型インフルエンザ免疫グロブリンＡは、ＬＴｈ（αＫ）の鼻腔内投与と組み合わせたＢ型インフルエンザ抗原の舌下投与後に増強された。図２Ａ～Ｆは、鼻腔内送達されたＬＴｈ（αＫ）と組み合わせた、または組み合わせない、舌下ワクチン接種されたＡ型インフルエンザ（Ｈ３Ｎ２）ワクチン（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス）からの抗原特異性免疫原性効果を示す。血清（Ａ－Ｄ）および鼻洗浄液（Ｅ，Ｆ）を免疫付与後１４日目に回収し、インフルエンザ－Ｈ３Ｎ２ＩｇＧ（Ａ，Ｂ）およびＩｇＡ（Ｃ－Ｆ）への力価を分析した。Ｘ軸は、各免疫付与におけるＨ３Ｎ２のＨＡ抗原およびＬＴｈ（αＫ）の投与量を示す。Ｃ５７ＢＬ／６（Ａ、ＣおよびＥ）およびＢａｌｂ／ｃ（Ｂ、ＤおよびＦ）系統の両方をこの研究に供した。全ての動物に３週間投与した。血清抗Ｆｌｕ（Ａ／Ｈ３Ｎ２）免疫グロブリンＧ、血清抗Ｆｌｕ（Ａ／Ｈ３Ｎ２）免疫グロブリンＡおよび鼻洗浄液抗Ｆｌｕ（Ａ／Ｈ３Ｎ２）免疫グロブリンＡは、ＬＴｈ（αＫ）の鼻腔内投与と組み合わせたＦｌｕ抗原の舌下投与後に増強された。図２Ａ～Ｆは、鼻腔内送達されたＬＴｈ（αＫ）と組み合わせた、または組み合わせない、舌下ワクチン接種されたＡ型インフルエンザ（Ｈ３Ｎ２）ワクチン（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス）からの抗原特異性免疫原性効果を示す。血清（Ａ－Ｄ）および鼻洗浄液（Ｅ，Ｆ）を免疫付与後１４日目に回収し、インフルエンザ－Ｈ３Ｎ２ＩｇＧ（Ａ，Ｂ）およびＩｇＡ（Ｃ－Ｆ）への力価を分析した。Ｘ軸は、各免疫付与におけるＨ３Ｎ２のＨＡ抗原およびＬＴｈ（αＫ）の投与量を示す。Ｃ５７ＢＬ／６（Ａ、ＣおよびＥ）およびＢａｌｂ／ｃ（Ｂ、ＤおよびＦ）系統の両方をこの研究に供した。全ての動物に３週間投与した。血清抗Ｆｌｕ（Ａ／Ｈ３Ｎ２）免疫グロブリンＧ、血清抗Ｆｌｕ（Ａ／Ｈ３Ｎ２）免疫グロブリンＡおよび鼻洗浄液抗Ｆｌｕ（Ａ／Ｈ３Ｎ２）免疫グロブリンＡは、ＬＴｈ（αＫ）の鼻腔内投与と組み合わせたＦｌｕ抗原の舌下投与後に増強された。図２Ａ～Ｆは、鼻腔内送達されたＬＴｈ（αＫ）と組み合わせた、または組み合わせない、舌下ワクチン接種されたＡ型インフルエンザ（Ｈ３Ｎ２）ワクチン（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス）からの抗原特異性免疫原性効果を示す。血清（Ａ－Ｄ）および鼻洗浄液（Ｅ，Ｆ）を免疫付与後１４日目に回収し、インフルエンザ－Ｈ３Ｎ２ＩｇＧ（Ａ，Ｂ）およびＩｇＡ（Ｃ－Ｆ）への力価を分析した。Ｘ軸は、各免疫付与におけるＨ３Ｎ２のＨＡ抗原およびＬＴｈ（αＫ）の投与量を示す。Ｃ５７ＢＬ／６（Ａ、ＣおよびＥ）およびＢａｌｂ／ｃ（Ｂ、ＤおよびＦ）系統の両方をこの研究に供した。全ての動物に３週間投与した。血清抗Ｆｌｕ（Ａ／Ｈ３Ｎ２）免疫グロブリンＧ、血清抗Ｆｌｕ（Ａ／Ｈ３Ｎ２）免疫グロブリンＡおよび鼻洗浄液抗Ｆｌｕ（Ａ／Ｈ３Ｎ２）免疫グロブリンＡは、ＬＴｈ（αＫ）の鼻腔内投与と組み合わせたＦｌｕ抗原の舌下投与後に増強された。図２Ａ～Ｆは、鼻腔内送達されたＬＴｈ（αＫ）と組み合わせた、または組み合わせない、舌下ワクチン接種されたＡ型インフルエンザ（Ｈ３Ｎ２）ワクチン（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス）からの抗原特異性免疫原性効果を示す。血清（Ａ－Ｄ）および鼻洗浄液（Ｅ，Ｆ）を免疫付与後１４日目に回収し、インフルエンザ－Ｈ３Ｎ２ＩｇＧ（Ａ，Ｂ）およびＩｇＡ（Ｃ－Ｆ）への力価を分析した。Ｘ軸は、各免疫付与におけるＨ３Ｎ２のＨＡ抗原およびＬＴｈ（αＫ）の投与量を示す。Ｃ５７ＢＬ／６（Ａ、ＣおよびＥ）およびＢａｌｂ／ｃ（Ｂ、ＤおよびＦ）系統の両方をこの研究に供した。全ての動物に３週間投与した。血清抗Ｆｌｕ（Ａ／Ｈ３Ｎ２）免疫グロブリンＧ、血清抗Ｆｌｕ（Ａ／Ｈ３Ｎ２）免疫グロブリンＡおよび鼻洗浄液抗Ｆｌｕ（Ａ／Ｈ３Ｎ２）免疫グロブリンＡは、ＬＴｈ（αＫ）の鼻腔内投与と組み合わせたＦｌｕ抗原の舌下投与後に増強された。図２Ａ～Ｆは、鼻腔内送達されたＬＴｈ（αＫ）と組み合わせた、または組み合わせない、舌下ワクチン接種されたＡ型インフルエンザ（Ｈ３Ｎ２）ワクチン（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス）からの抗原特異性免疫原性効果を示す。血清（Ａ－Ｄ）および鼻洗浄液（Ｅ，Ｆ）を免疫付与後１４日目に回収し、インフルエンザ－Ｈ３Ｎ２ＩｇＧ（Ａ，Ｂ）およびＩｇＡ（Ｃ－Ｆ）への力価を分析した。Ｘ軸は、各免疫付与におけるＨ３Ｎ２のＨＡ抗原およびＬＴｈ（αＫ）の投与量を示す。Ｃ５７ＢＬ／６（Ａ、ＣおよびＥ）およびＢａｌｂ／ｃ（Ｂ、ＤおよびＦ）系統の両方をこの研究に供した。全ての動物に３週間投与した。血清抗Ｆｌｕ（Ａ／Ｈ３Ｎ２）免疫グロブリンＧ、血清抗Ｆｌｕ（Ａ／Ｈ３Ｎ２）免疫グロブリンＡおよび鼻洗浄液抗Ｆｌｕ（Ａ／Ｈ３Ｎ２）免疫グロブリンＡは、ＬＴｈ（αＫ）の鼻腔内投与と組み合わせたＦｌｕ抗原の舌下投与後に増強された。図２Ａ～Ｆは、鼻腔内送達されたＬＴｈ（αＫ）と組み合わせた、または組み合わせない、舌下ワクチン接種されたＡ型インフルエンザ（Ｈ３Ｎ２）ワクチン（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス）からの抗原特異性免疫原性効果を示す。血清（Ａ－Ｄ）および鼻洗浄液（Ｅ，Ｆ）を免疫付与後１４日目に回収し、インフルエンザ－Ｈ３Ｎ２ＩｇＧ（Ａ，Ｂ）およびＩｇＡ（Ｃ－Ｆ）への力価を分析した。Ｘ軸は、各免疫付与におけるＨ３Ｎ２のＨＡ抗原およびＬＴｈ（αＫ）の投与量を示す。Ｃ５７ＢＬ／６（Ａ、ＣおよびＥ）およびＢａｌｂ／ｃ（Ｂ、ＤおよびＦ）系統の両方をこの研究に供した。全ての動物に３週間投与した。血清抗Ｆｌｕ（Ａ／Ｈ３Ｎ２）免疫グロブリンＧ、血清抗Ｆｌｕ（Ａ／Ｈ３Ｎ２）免疫グロブリンＡおよび鼻洗浄液抗Ｆｌｕ（Ａ／Ｈ３Ｎ２）免疫グロブリンＡは、ＬＴｈ（αＫ）の鼻腔内投与と組み合わせたＦｌｕ抗原の舌下投与後に増強された。図３Ａおよび３Ｂは、追加のＨＤＭチャレンジ後に鼻腔内投与されたＬＴｈ（αＫ）と組み合わせたまたは組み合わせない、舌下投与されたアレルゲン（ＨＤＭ、ＧｒｅｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入、カタログ番号：ＸＰＢ７０Ｄ３Ａ２．５）からの抗原特異性免疫原性効果を示す。血清（Ａ）および鼻洗浄液（Ｂ）を収集し、ＨＤＭに対するＩｇＧ（Ａ）およびＩｇＡ（Ｂ）の力価を分析した。処置は２週間続けた。Ｘ軸は、ＨＤＭおよびＬＴｈ（αＫ）の投与量、ならびに処置の総数を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスをこの研究に供した。図３Ａおよび３Ｂは、追加のＨＤＭチャレンジ後に鼻腔内投与されたＬＴｈ（αＫ）と組み合わせたまたは組み合わせない、舌下投与されたアレルゲン（ＨＤＭ、ＧｒｅｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入、カタログ番号：ＸＰＢ７０Ｄ３Ａ２．５）からの抗原特異性免疫原性効果を示す。血清（Ａ）および鼻洗浄液（Ｂ）を収集し、ＨＤＭに対するＩｇＧ（Ａ）およびＩｇＡ（Ｂ）の力価を分析した。処置は２週間続けた。Ｘ軸は、ＨＤＭおよびＬＴｈ（αＫ）の投与量、ならびに処置の総数を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスをこの研究に供した。図４Ａおよび４Ｂは、鼻腔内経路を介するブタクサチャレンジに続く、鼻腔内送達されたＬＴｈ（αＫ）処置およびさらなるブタクサのみの処置と組み合わせた、または組み合わせない、２ラウンドの舌下送達されたアレルゲン（ブタクサ、ＧｒｅｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入、カタログ番号：ＸＰ５６Ｄ３Ａ２５）からの抗原特異性免疫原性効果を示す。マウス血清を研究の最後に収集し、ブタクサ特異的ＩｇＧ力価を分析した。各処置ラウンドは２週間続いた。Ｘ軸は、ブタクサおよびＬＴｈ（αＫ）の用量、ならびに処置の総数を示す。各処理において、ブタクサまたはＬＴｈ（αＫ）を６回投与した。チャレンジ期において、ブタクサを１日５回投与した。Ｃ５７ＢＬ／６（Ａ）およびＢａｌｂ／ｃ（Ｂ）マウスをこの研究に供した。図４Ａおよび４Ｂは、鼻腔内経路を介するブタクサチャレンジに続く、鼻腔内送達されたＬＴｈ（αＫ）処置およびさらなるブタクサのみの処置と組み合わせた、または組み合わせない、２ラウンドの舌下送達されたアレルゲン（ブタクサ、ＧｒｅｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入、カタログ番号：ＸＰ５６Ｄ３Ａ２５）からの抗原特異性免疫原性効果を示す。マウス血清を研究の最後に収集し、ブタクサ特異的ＩｇＧ力価を分析した。各処置ラウンドは２週間続いた。Ｘ軸は、ブタクサおよびＬＴｈ（αＫ）の用量、ならびに処置の総数を示す。各処理において、ブタクサまたはＬＴｈ（αＫ）を６回投与した。チャレンジ期において、ブタクサを１日５回投与した。Ｃ５７ＢＬ／６（Ａ）およびＢａｌｂ／ｃ（Ｂ）マウスをこの研究に供した。

発明の詳細な説明

本明細書で別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。用語の意味および範囲は明らかである。しかしながら、潜在的な曖昧さがある場合、本明細書で提供される定義は、任意の辞書または外部定義よりも優先する。

本開示に従って利用される場合、以下の用語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。

本明細書で使用される「調節する」および「調節」という用語は、状態、レベル、または量の制御を指す。制御は、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションであり得る。

本明細書で使用される「粘膜免疫応答」という用語は、粘膜で誘導される免疫応答を指す。例えば、粘膜免疫応答としては、抗原特異的免疫グロブリンＧおよびそのサブクラス、免疫グロブリンＡおよびそのサブクラス、免疫グロブリンＭおよびそのサブクラス、ならびに免疫化抗原に対する細胞媒介性免疫が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「粘膜部位」という用語は、粘膜上皮で覆われた任意の解剖学的粘膜を指す。例えば、粘膜部位は、舌下粘膜、鼻腔内粘膜、気道粘膜、口腔粘膜、膣粘膜、直腸粘膜または他の解剖学的粘膜であり得る。

本明細書中で使用される用語「アジュバント」は、「免疫調節剤」と交換可能であり得、そして特定の抗原に対する免疫応答を改変する薬理学的因子または免疫学的因子をいう。例えば、アジュバントは、解毒されたＬＴ、ＬＴｈ（αＫ）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストもしくはアンタゴニスト、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ、またはパターン認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストもしくはアンタゴニストであり得る。

本明細書で使用される「免疫調節剤」という用語は、免疫を修飾し、最終的に特定の抗原／アレルゲンに対する免疫原性の結果を変化させる薬理学的または免疫学的因子を指す。例えば、免疫調節剤は、解毒されたＬＴまたはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストであり得る。

本明細書で使用される「対象」という用語は、動物、特に哺乳動物を意味する。好ましい一実施形態では、用語「対象」はヒトを意味する。

文脈によって別途必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。

本発明の発明者らは、驚くべきことに、特異的免疫応答を増強するためにアジュバントを抗原と混合する従来の方法とは対照的に、免疫調節剤および抗原を異なる粘膜部位に別々に投与することが、所望の粘膜免疫応答を顕著に増強し得ることを見出した。さらに、免疫調節剤および抗原を同時に投与する必要はない。抗原および免疫調節剤は、本明細書に記載されるように、数分～数日以内の間隔で連続的に投与され得る。本発明は、粘膜免疫における免疫調節剤の新規な役割を提供し、従来の手段を超える新規な粘膜ワクチン投与の開発を促進し得る。

本発明を一般的に記載してきたが、粘膜免疫応答を調節する際に本発明の方法を実施するための例示的なプロトコルを提供する以下の実施例を参照することにより、本発明をより容易に理解することができる。実施例は、例示目的のためにのみ提供され、本発明の範囲を限定することを決して意図しない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するための努力がなされたが、いくらかの実験誤差および偏差は、もちろん許容されるべきである。

以下の実施例で使用したマウスは雌であり、ＢｉｏＬＡＳＣＯＴａｉｗａｎＣｏ．，Ｌｔｄ．から購入し、特定病原体除去（ＳＰＦ）条件下で飼育した。研究は８週齢で開始した。舌下投与のために、イソフルランを吸入させることによってマウスを軽く麻酔し、次いで、２５秒間、固定された横臥位で単回の１２μＬ処置で舌下投与した。鼻腔内投与のために、マウスは、各鼻孔に２．５μＬの単回容量の処置を受けた。Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスの両方を実施例１～４で使用した。

実施例１Ｂ型インフルエンザワクチンへの粘膜免疫調節剤ＬＴｈ（αＫ）の免疫原性効果の評価。
図１において、マウスにＦｌｕＢを舌下投与し、一部には、鼻腔内経路を介した共処置としてＬＴｈ（αＫ）を鼻腔内投与した（図１）。第１群では、各マウスに２０μｇのＦｌｕＢを舌下投与した。第２群、３群および４群では、マウスに、５μｇのＬＴｈ（αＫ）の鼻腔内投与と組み合わせて、それぞれ２０μｇ、１０μｇおよび５μｇのＦｌｕＢを舌下経路で投与した。全ての群において、処置は、１週間間隔で、合計３回の処置を与えた。

研究したマウスからの血液および鼻洗浄液を、処置後１４日目に収集した。抗ＦｌｕＢＩｇＧ及びＩｇＡをＥＬＩＳＡによりアッセイした。結果を図１に示す。

鼻腔内経路を介して投与されたＬＴｈ（αＫ）は、舌下投与されたＦｌｕＢワクチンに対する液性免疫および粘膜免疫を増強した（図１Ａ～Ｄ）。ＦｌｕＢは、舌下投与後に低い力価の血清ＦｌｕＢ特異的ＩｇＧおよび最小のＩｇＡを誘導したので、粘膜免疫原として不十分であった（群１、図１Ａ～Ｄ）。鼻腔内経路を介する追加のＬＴｈ（αＫ）は、血清ＦｌｕＢ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ力価を増強した。ＦｌｕＢ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡの増強は、２系統のマウスで明らかになった（図１Ａ～Ｄ）。Ｂａｌｂ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスは、それぞれＴｈ２およびＴｈ１に対する偏った免疫学的応答を示すことが知られている。免疫学的に異なるマウスの上記の結果は、異なる免疫遺伝学的バックグラウンドを有する動物が本発明において適用され得ることを示唆する。

粘膜特異的抗ＦｌｕＢＩｇＡは、ＬＴｈ（αＫ）で共処置した群においてのみ現れた（図１Ｃ～Ｆ）。ＩｇＡは粘膜免疫の顕著な特徴であり、ほとんどの感染に対して防御する最前線である。ＦｌｕＢを舌下経路によって単独で投与した場合、ＦｌｕＢ特異的ＩＧＡは増強されなかった（群１、図１Ｃ～Ｅ）。

結論として、鼻腔内経路によるＬＴｈ（αＫ）の投与は、ＳＬ投与によって誘導されるＦｌｕＢ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ力価を有意に増強した。同じ結果が、Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスの両方で明らかになった。

実施例２：インフルエンザＡワクチンへの粘膜免疫調節剤ＬＴｈ（αＫ）の免疫原性効果の評価。
図２では、マウスにＦｌｕＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）様ウイルスワクチン（ＦｌｕＡ）を舌下投与し、一部には、ＬＴｈ（αＫ）の鼻腔内投与を共処置した（図２）。第１群では、各マウスに２０μｇのＦｌｕＡを舌下投与した。２群、３群および４群では、マウスに、それぞれ２０μｇ、１０μｇおよび５μｇのＦｌｕＡを、５μｇのＬＴｈ（αＫ）と共に舌下経路で鼻腔内投与した。全ての群において、処置は、１週間、別々に、合計３回の処置で与えられた。

研究した動物からの血液および鼻洗浄液を、全てのマウスについて免疫付与後１４日目に収集した。抗ＦｌｕＡＩｇＧ及びＩｇＡをＥＬＩＳＡによってアッセイした。結果を図２に示す。

鼻腔内経路を介して投与されたＬＴｈ（αＫ）は、舌下投与されたＦｌｕＡワクチンに対する液性免疫および粘膜免疫を増強した（図２Ａ～Ｄ）。ＦｌｕＡは、舌下投与後に低い力価の血清ＦｌｕＡ特異的ＩｇＧ及び最小のＩｇＡを誘導したので、粘膜免疫原としては不十分である（群１、図２Ａ～Ｄ）。鼻腔内経路による追加のＬＴｈ（αＫ）は、血清ＦｌｕＡ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡ力価を増強した。ＦｌｕＡ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡの増強は、マウスの両方の系統で明らかにされた（図２Ａ～Ｄ）。Ｂａｌｂ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスは、それぞれＴｈ２およびＴｈ１に対する偏った免疫学的応答を示すことが知られている。免疫学的に異なるマウスの上記の結果は、異なる免疫遺伝学的バックグラウンドを有する動物が本発明において適用され得ることを示唆する。

粘膜特異的抗ＦｌｕＡＩｇＡは、ＬＴｈ（αＫ）で共処置した群においてのみ現れた（図２Ｃ～Ｆ）。ＩｇＡは粘膜免疫の顕著な特徴であり、ほとんどの感染に対して防御する最前線である。ＦｌｕＡを舌下経路によって単独で投与した場合、ＦｌｕＡ特異的ＩＧＡは増強されなかった（群１、図２Ｃ～Ｅ）。
結論として、鼻腔内経路によるＬＴｈ（αＫ）の投与は、ＳＬ投与によって誘導されるＦｌｕＡ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ力価を有意に増強した。同じ結果が、Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスの両方で明らかになった。

実施例３：イエダニ抽出物への粘膜免疫調節剤ＬＴｈ（αＫ）の免疫原性効果の評価。
マウスを、鼻腔内経路による免疫調節剤（ＬＴｈ（αＫ））共処置を用いてまたは用いずに、舌下経路を介して、ＳｔａｌｌｅｒｇｅｎｅｓＧｒｅｅｒ（ＸＰＢ７０Ｄ３Ａ２．５）から購入したＨＤＭ抽出物で前処理した。アレルギー反応をシミュレートするために、前処理後、マウスを気管内に１回感作し、ＨＤＭ抽出物で鼻腔内に５回チャレンジした。血液試料および気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を最終チャレンジの４日後に採取し、ＨＤＭ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡをＥＬＩＳＡによってアッセイした。

結果は、ＬＴｈ（αＫ）の鼻腔内投与が、舌下および鼻腔内投与されたＨＤＭ抽出物に対する液性免疫および粘膜免疫を増強することを示した（図３Ａおよび３Ｂ）。群１は陽性対照群であった。この群のマウスは、事前のＨＤＭ抽出物処置なしで、感作およびチャレンジのために鼻腔内ＨＤＭ抽出物を受けた。群２は健康な対照群であった。この群のマウスは、処置もチャレンジも受けなかった。群３はアレルゲン免疫療法（ＡＩＴ）群であった。この群のマウスは、鼻腔内ＨＤＭ抽出物感作およびチャレンジの２週間前に舌下ＨＤＭ抽出物処置を１０回受けた。群４は、ＬＴｈ（αＫ）対照群であった。この群のマウスは、２週間、鼻腔内経路を介して６回のＬＴｈ（αＫ）処置を受け、その後、鼻腔内ＨＤＭ抽出物感作およびチャレンジを受けた。群５～８は共処置群であった。これらの群のマウスは、ＨＤＭ抽出物およびＬＴｈ（αＫ）の種々の量での共処置を、それぞれ舌下および鼻腔内経路を介して受け、続いて鼻腔内ＨＤＭ抽出物感作およびチャレンジを受けた。結果は、ＬＴｈ（αＫ）の鼻腔内共処置群において、血清中の抗ＨＤＭＩｇＧおよびＢＡＬＦ中のＩｇＡの有意な上昇を実証する。

実施例４：ブタクサ花粉抽出物に対する粘膜免疫調節剤ＬＴｈ（αＫ）の免疫原性効果の評価。
抗花粉ＩｇＧを増強することにおけるＬＴｈ（αＫ）の有効性を実証するために、４つの群のマウスに、鼻腔内ＬＴｈ（αＫ）の共処置を用いてまたは用いずに３回の舌下ラウンドのブタクサ花粉抽出物（ブタクサ）を与え、続いてブタクサによる気道チャレンジをおこなった（図４）。１回目の治療では、群１は、ＬＴｈ（αＫ）を含まない各々４０μｇのブタクサの舌下用量を６回受けた。群２、３および４には、５μｇのＬＴｈ（αＫ）の鼻腔内投与と共に、それぞれ４０、２０および１０μｇの舌下ブタクサを投与した。第１の処置ラウンドの終了の９日後に開始した第２のラウンドにおいて、群１のマウスは、２週間にわたって、各々１０μｇの鼻腔内ブタクサを追加で６回投与した。群２、３および４は、１０μｇのブタクサの舌下投与および５μｇのＬＴｈ（αＫ）の鼻腔内投与の共処置を受けた。第３ラウンドは、第２処理の１１日後に開始した。これはＡＩＴ様処置であり、動物にブタクサのみを６回舌下投与した。図４Ａおよび４Ｂに示すように、群１および２には４０μｇのブタクサを、群３および４には２０および１０μｇのブタクサをそれぞれ投与した。最後のチャレンジは、３回目の処置の１１日後に開始した。チャレンジにおいて、動物には、各々１５μｇのブタクサ鼻腔内投与をし、続いて試料を採集することを、５回反復した。Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスは、それぞれＴｈ２およびＴｈ１に対して偏った免疫学的応答を示すことが知られている。免疫学的に異なるマウスの上記の結果は、異なる免疫遺伝学的バックグラウンドを有する動物が本発明において適用され得ることを示唆する。このような結果に基づいて、Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスの両方における抗ブタクサＩｇＧの量は、ＬＴｈ（αＫ）の共処置によって上昇したと結論付けられる。さらに、アレルゲンに対するＩｇＧ増強は、ＬＴｈ（αＫ）の処置後数週間続いた。

この研究におけるブタクサは、ＳｔａｌｌｅｒｇｅｎｅｓＧｒｅｅｒ（ＸＰＢ５６Ｄ３Ａ２５）から購入した。血液試料を免疫前、ならびに処置後１週間および最終チャレンジから採取した。ブタクサ特異的ＩｇＧをＥＬＩＳＡによってアッセイした。

Claims

粘膜免疫応答を増強することを必要とする対象の粘膜部位に投与される、抗原を含む組成物と、
前記対象の異なる解剖学的粘膜部位に投与される、免疫調節剤を含む組成物と、
を含む、粘膜免疫応答を増強するための医薬品であって、
前記抗原が舌下粘膜又は口腔粘膜に投与され、前記免疫調節剤が鼻腔内粘膜に投与され、
前記免疫調節剤がＬＴｈ（αＫ）である、医薬品。
抗原が免疫原である、請求項１に記載の医薬品。
抗原がワクチンである、請求項２に記載の医薬品。
抗原がアレルゲンである、請求項２に記載の医薬品。
抗原が生物学的である、請求項２に記載の医薬品。
前記免疫調節剤が、接触している細胞からのＩＬ６産生を誘導しない、請求項１に記載の医薬品。
前記免疫応答が、抗原特異的ＩｇＧおよびそのサブクラスの産生を含む、請求項１に記載の医薬品。
前記免疫応答が、抗原特異的ＩｇＭおよびそのサブクラスの産生を含む、請求項１に記載の医薬品。
前記免疫応答が、抗原特異的ＩｇＡおよびそのサブクラスの産生を含む、請求項１に記載の医薬品。
前記免疫応答が、抗原特異的細胞媒介性免疫の産生を含む、請求項１に記載の医薬品。
前記免疫応答が治療的に有効である、請求項１に記載の医薬品。
前記免疫応答が免疫成分のアップレギュレーションを含む、請求項１に記載の医薬品。
前記免疫応答が免疫成分のダウンレギュレーションを含む、請求項１に記載の医薬品。
前記抗原が舌下粘膜に投与される、請求項１に記載の医薬品。
前記ワクチンが季節性インフルエンザワクチンである、請求項３に記載の医薬品。
前記季節性インフルエンザワクチンが、Ａ型インフルエンザウイルス様ワクチン又はＢ型インフルエンザウイルス様ワクチンである、請求項１５に記載の医薬品。
前記アレルゲンが、チリダニ抽出物または花粉抽出物である、請求項４に記載の医薬品。
前記花粉がブタクサ花粉である、請求項１７に記載の医薬品。
前記抗原および前記免疫調節剤が連続的に投与される、請求項１に記載の医薬品。