JP7436075B2 - Ｒｎａヘアピンループを標的にする治療剤の構造ベースの設計 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下で、２０１９年１１月１９日出願の同時係属中の共有に係る米国仮特許出願第６２／９３７，６５７号（発明の名称「ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ－ＢＡＳＥＤ ＤＥＳＩＧＮ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＲＮＡ ＨＡＩＲＰＩＮ ＬＯＯＰＳ」）に基づく利益を主張している。この出願は、本明細書に参考として援用される。

政府支援の陳述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによって授与された助成金番号１６１６２６５の下で政府支援を得て行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

技術分野
本発明は、ＲＮＡヘアピンループの三次元構造を決定するために有用な方法および材料に関する。

発明の背景
ＲＮＡ分子は、多くの疾患（例えば、がんおよびＲＮＡウイルス感染症）の発生にとって極めて重要である。この理由から、ＲＮＡ分子は、優れた治療標的である。この文脈において、ほぼ全てのＲＮＡは、それらの機能にとって極めて重要なヘアピン二次構造を形成する。結論として、これらの構造の理解は、これらの分子を標的にする治療剤の同定および設計を促進するために必要である。しかし、ＲＮＡを調べる従来の方法（例えば、ＲＮＡ干渉およびアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、制限されており、強い構造を回避する。従来の技術は、ＲＮＡ構造に関するある種の情報を提供し得るが、これらの技術における制限から、ＲＮＡヘアピンループは、治療用インヒビター設計の正当に評価されない標的になっている。

ＲＮＡヘアピンループの三次元構造に関する情報を得るために有用な新たな方法および材料のための技術の強いニーズが、当該分野に存在する。

発明の要旨
以下で詳細に記載されるように、本発明者らは、ＲＮＡヘアピンループの三次元構造に関する情報を得るために有用な新規な足場指向性結晶学方法を開発した。本明細書で開示されるＲＮＡ結晶学足場および関連方法は、ＲＮＡヘアピンループの三次元構造、他の薬剤（例えば、阻害剤）とのそれらの関連も同様に、容易にかつ迅速に決定するために使用され得る。本発明の方法において使用される特異的足場ＲＮＡは、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓに由来するＹｄａＯタイプｃ－ジ－ＡＭＰリボスイッチ（直径６０Åを超える大きな空洞を有する結晶を容易に形成することが発見されたＲＮＡ）である。以下で詳細に考察されるように、本発明者らは、上記ヘアピンが上記空洞の中に収容されるように、目的のＲＮＡがこの足場ＲＮＡのＰ２ステムへと操作され得ることを決定した。次いで、その得られる融合ＲＮＡは、足場単独を結晶化するためのものに類似のまたは関連しないかいずれかの条件下で結晶化され得る。次いで、このような分子（例えば、これらの分子単独および／または他の薬剤と会合して）の三次元構造は、Ｘ線または電子結晶学の技術等を使用して決定され得る。

本明細書で開示されるＲＮＡ結晶学足場および関連方法は、標的ＲＮＡ分子と高い親和性および特異性で相互作用する、天然のおよび化学的に改変されたオリゴヌクレオチド、ならびに低分子薬物のような化合物を同定するために使用され得る。これは、このような化合物とＲＮＡヘアピンループとの間の相互作用が、がんおよびＲＮＡウイルス感染症のような病理において、インビボでそれらの活性を調節し得る様式で、これらの分子の生物学的活性に影響を及ぼし得ることから重要である。さらに、ＲＮＡは、生物学および疾患のほぼあらゆる局面に関与することから、本明細書で開示される方法は、ほとんど任意の標的ＲＮＡを特異的に調節する方法に関する情報を提供し得る広く適用可能な手順である。結論として、本明細書で開示される方法は、特異的ＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドアナログのような薬剤（広く種々の生物学的プロセス（例えば、ウイルス複製（例えば、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２、Ｃ型肝炎ウイルスおよびＺｉｋａジカウイルスのような病原体の複製）に関与するプロセス、がんまたは神経変性疾患のような病的状態に関与するプロセス、ならびにタンパク質コード遺伝子を調節するためのｍｉｃｒｏＲＮＡの生成に関与するプロセスなど）において機能するものが挙げられる）の観察および評価を可能にする。

本明細書で開示される発明は、多くの実施形態を有する。本発明の１つの実施形態は、ＧＧＵＵＧＣＣＧＡＡＵＣＣＧＡＡＡＧＧＵＡＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵＵＧＧＧＧＵＵＡＡＵＣＵＧＣＡＧＵＧＡＡＧＣＵＧＣＡＧＵＡＧＧＧＡＵＡＣＣＵＵＣＵＧＵＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＣＡＧＣＵＡＡＣＵＣＣＧＧＡＧＧＣＡＡＵＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧ（配列番号１）と少なくとも９０％の配列同一性を有するリボ核酸を含む物質の組成物である。代表的には、上記ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を含む。この組成物において、リボ核酸の配列番号１の残基１４～１７（ＧＡＡＡ）は、長さが４～３３ヌクレオチドの間である核酸の異種セグメントで置き換えられる（上記で注記した少なくとも９０％の配列同一性は、残基１４～１７においてこのリボ核酸に挿入され得る核酸の異種セグメントを含まない）。これらの組成物において、上記核酸の異種セグメントは、代表的には、天然に存在するＲＮＡ分子においてループ構造を形成するものである。本発明のある特定の実施形態において、上記核酸の異種セグメントは、天然に存在するＲＮＡ分子において完全なループ構造、および必要に応じて、０～５塩基対の間のステム構造を含む。必要に応じてこれらの組成物は、リボ核酸に結合する薬剤、例えば、上記リボ核酸にハイブリダイズするポリヌクレオチドをさらに含み得る。

本発明の別の実施形態は、ＧＧＵＵＧＣＣＧＡＡＵＣＣＧＡＡＡＧＧＵＡＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵＵＧＧＧＧＵＵＡＡＵＣＵＧＣＡＧＵＧＡＡＧＣＵＧＣＡＧＵＡＧＧＧＡＵＡＣＣＵＵＣＵＧＵＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＣＡＧＣＵＡＡＣＵＣＣＧＧＡＧＧＣＡＡＵＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧ（配列番号１）と少なくとも９０％（および必要に応じて１００％未満）の同一性を有するリボ核酸をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドを含むＲＮＡ構造を観察するためのシステムまたはキットである。ある特定の実施形態において、上記プラスミドは、上記リボ核酸を発現もしくは転写するためのプロモーターをさらに含む、および／または上記システムもしくはキットは、ＲＮＡポリメラーゼをさらに含む。必要に応じて上記システムまたはキットは、上記プラスミド中の核酸のストレッチにハイブリダイズする１またはこれより多くのプライマーをさらに含む。

本発明のさらに別の実施形態は、リボ核酸の構造に関する情報を得る方法である。この方法は、配列番号１の残基１４～１７（ＧＡＡＡ）（または配列番号１と少なくとも９０％を有するリボ核酸）を、融合リボ核酸分子を形成するように、長さが４～３３ヌクレオチドの間の核酸の異種セグメントで置換する工程、上記融合ＲＮＡを結晶化する工程、上記融合リボ核酸分子に対してＸ線または電子結晶学の技術を行う工程、および次いで、その結果（例えば、Ｘ線または電子結晶学の技術の電子密度マップ）を観察して、上記核酸の異種セグメントの三次元構造に関する情報を得る工程を包含する。これらの方法のある特定の実施形態において、上記融合リボ核酸分子は、結晶学の分析の前に、上記リボ核酸に結合する薬剤（例えば、上記リボ核酸にハイブリダイズするポリヌクレオチド）と合わされ、その結果、上記ＲＮＡ／薬剤複合体の構造が観察され得る。代表的には、これらの方法において、上記結晶学の分析は、リボ核酸に結合する薬剤を欠くコントロールサンプルとの比較を包含する。必要に応じてこれらの方法において、複数の融合リボ核酸分子は、Ｘ線または電子結晶学の技術の前に、（例えば、ハイスループットスクリーニングにおいて）上記リボ核酸に結合する複数の薬剤と合わされる。本発明のいくつかの実施形態において、少なくとも２つの薬剤が、上記融合リボ核酸分子と合わされる。

本発明の例証的な作業実施形態において、本発明者らは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡヘアピンループの９つの構造を調べた。これらの試験から、長さ４～８ヌクレオチドのループが、以前に考えられていたよりも多く構造化され、これらのおよび中程度により長いループを、治療剤の優れた標的にすることが決定された。本発明の実施形態において、標的ループは、特定の長さのものである必要はなく、利用可能な例より長い可能性も短い可能性もある。この認識および本発明者らの新規な構造決定法は、当業者が、リードオリゴヌクレオチド化合物を同定し、構造ベースの精密化の反復回数を迅速かつコスト効果的に経ることを可能にする。本発明の方法は、広い適用を有する。なぜならそれらは、感染性疾患およびがん、加齢に関連する病理および神経変性疾患、ならびに遺伝的障害（例えば、ディジョージ症候群など）と戦うために重要なプロセスを標的にするからである。

本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から当業者に明らかになる。しかし、詳細な説明および具体例が、本発明のいくつかの実施形態を示す一方で、例証であって限定ではない方法で示されることは、理解されるべきである。本発明の範囲内の多くの変更および改変は、その趣旨から逸脱することなく行われ得、本発明は、全てのこのような改変を包含する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ＧＧＵＵＧＣＣＧＡＡＵＣＣＧＡＡＡＧＧＵＡＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵＵＧＧＧＧＵＵＡＡＵＣＵＧＣＡＧＵＧＡＡＧＣＵＧＣＡＧＵＡＧＧＧＡＵＡＣＣＵＵＣＵＧＵＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＣＡＧＣＵＡＡＣＵＣＣＧＧＡＧＧＣＡＡＵＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧ（配列番号１）と少なくとも９０％の配列同一性を有するリボ核酸を含む組成物であって、ここで前記リボ核酸の残基１４～１７（ＧＡＡＡ）は、長さが４～３３ヌクレオチドの間である核酸の異種セグメントで置き換えられる、組成物。
（項目２）
前記リボ核酸に結合する薬剤をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記薬剤は、前記リボ核酸にハイブリダイズするポリヌクレオチドである、項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記核酸の異種セグメントは、天然に存在するＲＮＡ分子においてループ構造を形成する、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記核酸の異種セグメントは、必要に応じて、天然に存在するＲＮＡ分子中のステム構造の０～５塩基対の間で完全なループ構造を含む、項目４に記載の組成物。
（項目６）
ＲＮＡ構造を観察するためのシステム／キットであって、
ＧＧＵＵＧＣＣＧＡＡＵＣＣＧＡＡＡＧＧＵＡＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵＵＧＧＧＧＵＵＡＡＵＣＵＧＣＡＧＵＧＡＡＧＣＵＧＣＡＧＵＡＧＧＧＡＵＡＣＣＵＵＣＵＧＵＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＣＡＧＣＵＡＡＣＵＣＣＧＧＡＧＧＣＡＡＵＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧ（配列番号１）と少なくとも９０％の同一性を有するリボ核酸をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミド、
を含む、システム／キット。
（項目７）
前記リボ核酸を発現させるためのプロモーターをさらに含む、項目６に記載のシステム／キット。
（項目８）
ＲＮＡポリメラーゼをさらに含む、項目７に記載のシステム／キット。
（項目９）
前記プラスミド中の核酸のストレッチにハイブリダイズする１またはこれより多くのプライマーをさらに含む、項目６に記載のシステム／キット。
（項目１０）
リボ核酸の構造に関する情報を得る方法であって、前記方法は、
配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するリボ核酸を得る工程；
配列番号１におけるループ残基１４～１７（ＧＡＡＡ）に対応する残基を、融合リボ核酸分子を形成するように、長さが４～３３ヌクレオチドの間である核酸の異種セグメントで置換する工程；
前記融合リボ核酸分子を結晶化する工程；
Ｘ線または電子結晶学の技術を前記融合リボ核酸分子に対して行う工程；および
前記核酸の異種セグメントの構造に関する情報が得られるように、前記Ｘ線または電子結晶学の技術の結果を観察する工程、
を包含する方法。
（項目１１）
前記融合リボ核酸分子は、前記結晶学の分析の前に、前記リボ核酸に結合する薬剤と合わされる、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記薬剤は、前記リボ核酸にハイブリダイズするポリヌクレオチドである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記結晶学の分析は、前記リボ核酸に結合する薬剤を欠くコントロールサンプルとの比較を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
複数の融合リボ核酸分子は、前記Ｘ線または電子結晶学の技術の前に、前記リボ核酸に結合する複数の薬剤と合わされる、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
少なくとも２種の薬剤が、前記融合リボ核酸分子と合わされる、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
ポリヌクレオチドに対して結晶学の分析を行う方法であって、前記方法は、
（ａ）第１のポリヌクレオチドを選択する工程であって、ここで前記第１のポリヌクレオチドは、第１のｍｉＲＮＡのポリヌクレオチド配列を含む工程；
（ｂ）前記第１のｍｉＲＮＡにおける第１のループ領域を形成するポリヌクレオチドのセグメントを同定する工程；
（ｃ）第２のポリヌクレオチドを選択する工程であって、ここで前記第２のポリヌクレオチドは、第２のｍｉＲＮＡのポリヌクレオチド配列を含む工程；
（ｄ）前記第２のｍｉＲＮＡにおける第１のループ領域を形成するポリヌクレオチドのセグメントを同定する工程；
（ｅ）前記第１のポリヌクレオチド上の前記第１のループ領域を含む前記ポリヌクレオチドのセグメントが、前記第２のポリヌクレオチド上の前記第１のループ領域を含む前記ポリヌクレオチドのセグメントで置換されるように構築された融合ポリヌクレオチドを形成する工程；および
（ｆ）前記融合ポリヌクレオチドの三次元構造を観察するために、前記融合ポリヌクレオチドを結晶学的に分析する工程；
を包含し、その結果、前記ポリヌクレオチドの結晶学の分析が行われる、方法。
（項目１７）
前記第１のｍｉＲＮＡは、ＧＧＵＵＧＣＣＧＡＡＵＣＣＧＡＡＡＧＧＵＡＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵＵＧＧＧＧＵＵＡＡＵＣＵＧＣＡＧＵＧＡＡＧＣＵＧＣＡＧＵＡＧＧＧＡＵＡＣＣＵＵＣＵＧＵＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＣＡＧＣＵＡＡＣＵＣＣＧＧＡＧＧＣＡＡＵＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧ（配列番号１）と少なくとも９０％の配列同一性を有するｍｉＲＮＡであり、ここで前記リボ核酸の残基１４～１７（ＧＡＡＡ）は、長さが４～３３ヌクレオチドの間である前記第２のポリヌクレオチド上の前記第１のループ領域を含む核酸の異種セグメントで置き換えられる、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を含む；および／または
前記第２のｍｉＲＮＡは、ヒトｍｉＲＮＡを含む、
項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記結晶学の分析は、Ｘ線または電子結晶学の技術である、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記結晶学の分析は、前記融合ポリヌクレオチドに結合する薬剤の存在下で行われる、項目１７に記載の方法。

図面の簡単な説明は、以下の本文中に見出される。

図１Ａ～１Ｅ。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ末端ループの分析および潜在的結晶化足場の検索。図１（ａ）：ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端ループ長の分布を示す。図１（ｂ）：各ＲＮＡ結晶構造に存在する最大の球状空洞（半径Ｒ_ｍａｘを有する）の、上記構造の回折解像度に対する比較を示す。非対称ユニットの中に単一分子を有する結晶形態を、緑の十字として示し、全ての他のものを黒の点として示す。図１（ｃ）：ＲＮＡの構造を示す。図１（ｄ）：ＹｄａＯタイプｃｉ－ジ－ＡＭＰリボスイッチの二次構造を示す。図１（ｅ）：上記リボスイッチの結晶充填を示す（ＰＤＢ ＩＤ ４ＱＫ８）。大きな中心チャネル（ｃ－軸に対して平行）の周りの分子は、グレーの色を付けており、３１Åの半径を有する青の球は、そのサイズを図示するために、上記チャネルに配置される。上記チャネルの内部で終わるＬ２ステムループは、緑色である。図１（ｆ）：野生型ＹｄａＯおよび上記ステムからの０～３塩基対を有するｐｒｉ－ｍｉＲ－９－１末端ループとの融合物のネイティブゲル分析を示す。

図２Ａ～２Ｆ。 足場指向性結晶学によって決定される長さが８～６ｎｔのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ末端ループの原子構造。図全体を通じて、足場Ｐ２ステムの最後の塩基対は、グレーの色を付けている。図２Ａおよび２Ｄ～２Ｆは、立体図で示される。挿入図は、ループの二次構造を示す。２Ｆｏ－Ｆｃ電子密度マップは、各パネルにおいて示されるレベルで輪郭が描かれる。図２（ａ）は、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３７８ａ（３７８ａ ＋ ０ｂｐ）を示す。図２（ｂ）は、ステムからの１塩基対を有するｐｒｉ－ｍｉＲ－３７８ａループ（３７８ａ ＋ １ｂｐ）を示す。図２（ｃ）は、３７８ａ＋１ｂｐ構造および電子密度を示す。図２（ｄ）は、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３４０（３４０ ＋ １ｂｐ）を示す。図２（ｅ）は、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３００（３００ ＋ ０ｂｐ）を示す。ｐｒｉ－ｍｉＲ－３００において隣接する標準的な対は、上記足場における対と同一のＣ－Ｇである。従って、その構造は、必須の３００ ＋ １ｂｐである。図２（ｆ）は、ｐｒｉ－ｍｉＲ－２０２（２０２ ＋ １ｂｐ）を示す。

図３Ａ～３Ｄ。 より短い（４～５ｎｔ）ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡループの構造。配色は図２のものと同一である。図３（ａ）は、ｐｒｉ－ｍｉＲ－２０８ａ（２０８ａ ＋ １ｂｐ）を示す。図３（ｂ）は、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３２０ｂ－２（３２０ｂ－２ ＋ １ｂｐ）を示す。図３（ｃ）は、ｐｒｉ－ｍｉＲ－４４９ｃ（４４９ｃ ＋ １ｂｐ）を示す。図３（ｄ）は、ｐｒｉ－ｍｉＲ－１９ｂ－２（１９ｂ－２ ＋ １ｂｐ）を示す。

図４Ａ～４Ｅ。 ヒトｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端接合部およびループの構造コンセンサス、非標準的な対、および非対称的可撓性。図４（ａ）は、図２および図３に示される全８個のループの構造アラインメントを示す。上記構造の大部分または全ての中で十分に整列する位置が、表示される。図４（ｂ）は、５０ｍＭ ＮａＣｌで測定した８個のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端接合部およびループの折りたたみΔＧ値のプロットを示す。エラーバーは、４～６回反復から得られた標準偏差を表す。各ＲＮＡは、５個の共通する塩基対とともに、尖端ループおよびステムから直ぐ隣の塩基対を含む（ＲＮＡ二次構造に関しては図８ａを、および詳細な熱力学的パラメーターに関しては表２を参照のこと）。図４（ｃ）は、示される尖端ループ－閉鎖残基対とともに、ヒトｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの実測数および予測数を示す。予測数は、５’および３’ループ残基の存在量に基づいて概算される。図４（ｄ）は、全てのループを同じスケールでプロットして、残基あたりの平均原子変位パラメーター（ＡＤＰ）を示す。５’末端および３’末端は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡステムループの末端塩基対を表す。ＡＤＰ分布を図示する構造図は、図１０に示される。図４（ｅ）は、分子動力学法によって各残基に関して決定される平均二乗変動（ｒｏｏｔ－ｍｅａｎ－ｓｑｕａｒｅ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）（ＲＭＳＦ，Å）を示す。記号および配色は、図４（ｄ）におけるものと同じである。

図５Ａ～５Ｋ。 ＤＧＣＲ８ Ｒｈｅｄドメインとｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端接合部との会合。図５（ａ）～５（ｈ） ゲルシフトアッセイの定量（代表的なゲル画像は図１１に示される）。データ点は、３回の反復実験からの結合した平均画分±標準誤差（ＳＥ）を表す。データをＨｉｌｌの式とフィットさせると、解離定数（Ｋ_ｄ）（±ＳＥ）が示される。図５（ｉ）は、ｍｆｏｌｄによって推測されるように、末端ループの長さに対するＲｈｅｄ結合の自由エネルギー（ＲＴｌｎ（Ｋ_ｄ））の比較を示す。図５（ｊ）は、ループ長が、排除される非標準的な対に関与する塩基で調節されることを除いて、図５（ｉ）と同じことを示す。

図６Ａ～６Ｃ。 ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端接合部のいくつかの結晶構造において本発明者らが観察したＵ－Ｕ対の体系的変異誘発からの結果（Ｕ－Ｕ対は、最良のプロセシングされたｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ改変体の中にある）。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端ループにおける末端残基は、ｍｉＲＮＡ生成を微細に調整する。図６（Ａ）は、哺乳動物細胞におけるｍｉＲＮＡ成熟効率を測定するための二重－ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物の模式図を示す。各ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡフラグメントは、ヘアピンおよび各側に約３０－ｎｔの隣接配列を含み、合計約１５０ｎｔである。ｐｒｉ－ｍｉＲ－９－１フラグメントは、荷電しておらず、正規化のために使用される。３’ ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡフラグメントの末端ループ残基は、変異誘発に供される。両方の成熟ｍｉＲＮＡの存在量は、定量的ＲＴ－ＰＣＲを使用して測定される。図６（Ｂ）は、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３４０改変体の成熟効率（ｍｉＲ－３４０／ｍｉＲ－９比）を示す。図６（Ｃ）は、ｐｒｉ－ｍｉＲ－１９３ｂ改変体の成熟効率を示す。これらの散布図では、個々のデータ点が、グレーのドットとして示される。バーは、平均および標準偏差を示す。

図７Ａ～７Ｉ。 全てのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡループに関して計算した、シミュレートしたアニーリングコンポジットオミットマップ。配色は、図２および３と同じである。全てのマップは、１．１σに対して輪郭が描かれる。個々のマップの計算に関する詳細については、方法の節を参照のこと。図７Ａは、３７８ａ ＋ ０ｂｐを示す。図７Ｂは、３７８ａ ＋ １ｂｐを示す。図７Ｃは、３４０ ＋ １ｂｐを示す。図７Ｄは、３００ ＋ ０ｂｐを示す。図７Ｅは、２０２ ＋ １ｂｐを示す。図７Ｆは、２０８ ＋ １ｂｐを示す。図７Ｇは、４４９ｃ ＋ １ｂｐを示す。図７Ｈは、３２０ｂ－２ ＋ １ｂｐを示す。図７Ｉは、１９ｂ－２ ＋ １ｂｐを示す。

図８Ａ～８Ｉ。 融解および結合アッセイのために使用されるＲＮＡ構築物。図８（ａ）は、光学的融解アッセイのために使用される短いＲＮＡオリゴを示す。共通する５－ｂｐ螺旋セグメントを、全てのヘアピンのステムとして使用した（グレーの塩基対）。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端接合部およびループヌクレオチドは、黒である。図８（ｂ）～８（ｉ）は、Ｒｈｅｄ結合アッセイにおいて使用される全てのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡフラグメントの二次構造推定を示す。転写を増強するためにステムの基部に付加されるさらなるＧ－Ｃ対は、黄色で強調される。ボックスは、結晶構造を決定するために使用される尖端ループの配列およびステムの末端塩基対を示す。

図９Ａ～９Ｂ。 ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ末端ループ構造の、ＰＤＢにおいて見出される類似のＲＮＡ折りたたみに対する比較。図９Ａは、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３７８ａの８－ｎｔループ（３７８ａ＋１， 左）の漫画表示を示し、図９Ｂは、ＲＮａｓｅ Ｐ（２）、グアニジン－Ｉリボスイッチ（３）、およびｔＲＮＡ^Ｐｈｅ（４）の別個の構造に由来する類似のループを示す。

図１０Ａ～１０Ｈ。 原子変位パラメーター（ＡＤＰｓ）での尖端ループの可撓性の予測。図１０（ａ）～図１０（ｈ）に示される各構造は、青色で最低のＡＤＰから赤色で最高のものまで着色されている。挿入図は、プロットしたＡＤＰの範囲を示す。

図１１Ａ～１１Ｈ。 Ｒｈｅｄに結合する各ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡフラグメントのゲルシフトアッセイの例。ｐｒｅ ｍｉＲＮＡフラグメントは、各ゲルの上で同定され、遊離ＲＮＡおよびタンパク質結合種を、ゲル中で標識する。結合反応において使用されるＲｈｅｄダイマー濃度（μＭ）は、ゲルの下に示される。

図１２Ａ～１２ｂ。 以前に報告されたハイスループット変異誘発およびプロセシングアッセイ（５）からのｐｒｉ－ｍｉＲ－２２３尖端ループ配列決定データの分析。図１２（ａ）は、ｐｒｉ－ｍｉＲ－２２３ヘアピンの上の方の領域の推定される二次構造を示す。塩基の配色は、このＲＮＡのＲｆａｍ登録（Ｒｆａｍアクセッション： ＲＦ００６４）における進化的保存のレベルを反映する。３ｐアームからの主なｍｉＲＮＡ生成物は、青色で強調される。赤色の文字は、ＷＴ配列に対する変異を示す。挿入図に示される代替の二次構造と比較すると、このモデルは、優勢なコンホメーションである可能性が高い。なぜならそれは、Ｄｒｏｓｈａ切断部位の上に約２３－ｂｐの最適なステム長を生じ、ステム内部の進化的に保存された残基およびバルジループ（ｂｕｌｇｅ ｌｏｏｐ）中のあまり保存されていない位置を配置するからである。図１２（ｂ）は、９－ｎｔ ｐｒｉ－ｍｉＲ－２２３ループ配列決定データ中のＣ－Ａ対の頻度を示すヒートマップを示す。左下の対角線のマトリクスは、入力ライブラリーにおけるパーセント頻度を示し、右上の対角線のマトリクスは、プロセシングされたＲＮＡにおける頻度を示す。参考までに、野生型ループ配列は、対角線に沿って示される。Ｃ－Ａ対は、入力において２２％に対して、プロセシングされた画分において６９％へと富化される。

図１３。 尖端接合部におけるＵ－Ｇ対および隣り合う５’ Ｇ残基のスタッキングを示す、ｐｒｉ－ｍｉＲ－２０ｂのＮＭＲアンサンブル（６）。

図１４Ａおよび１４Ｂ。 ＲＮＡ構築物。図１４Ａは、ＨＣＶ ｃｉｓ作用性複製エレメントの二次構造を示す；図１４Ｂは、ＨＣＶ ＩＲＥＳドメインＩＩＩｂを示す（例えば、Ｑｕａｄｅら， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｖｏｌｕｍｅ ６， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： ７６４６ （２０１５）を参照のこと）。 図１４Ａおよび１４Ｂ． ＲＮＡ構築物。図１４Ａは、ＨＣＶ ｃｉｓ作用性複製エレメントの二次構造を示す；図１４Ｂは、ＨＣＶ ＩＲＥＳドメインＩＩＩｂを示す（例えば、Ｑｕａｄｅら， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｖｏｌｕｍｅ ６， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： ７６４６ （２０１５）を参照のこと）。

発明の詳細な説明
本明細書で記載されるかまたは言及される技術および手順の多くは、十分に理解され、当業者によって従来の方法論を使用して一般に使用される。好ましい実施形態の説明において、その一部を形成し、本発明が実施され得る具体的実施形態を例証することによって示される添付の図面に対して言及がなされ得る。他の実施形態が利用され得、構造的な変更が本発明の範囲から逸脱することなく行われ得ることは、理解されるべきである。

別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語、表記および他の科学用語または用語法は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有することが意図される。いくらかの場合には、一般に理解される意味を有する用語が、明瞭性のためにおよび／または容易な参照のために本明細書で定義され、本明細書中のこのような定義の包含は、当該分野で一般に理解されているものに対する実質的な差異を表すと必ずしも解釈されるべきではない。

後生動物のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、プロセシングの間にマイクロプロセッサ複合体によって認識される特徴的なヘアピン構造へと折りたたまれる。この認識に必須であるのは、ヘアピンステムおよびループを繋ぐ尖端接合部が、ＤＧＣＲ８ ＲＮＡ結合ヘムドメイン（Ｒｈｅｄ）を、そのヘアピンの尖端に指向することである。ここで本発明者らは、足場指向性結晶学方法を記載し、多くのヒトｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端接合部およびループの構造を報告する。これらの構造は、非標準的な塩基対および少なくとも１個の５’ループ残基が、ヘアピンステムの頂部にスタックするコンセンサスを明らかにする。上記非標準的な対は、溶液中の熱力学的安定性に寄与する。Ｕ－Ｕ対およびＧ－Ａ対は、ヒトｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの尖端接合部において高度に富化される。本発明者らはまた、Ｒｈｅｄがより長いループをよりきつく結合することを見出し、より短いループを有するｐｒｉ－ｍｉＲＮＡがしばしば不十分にプロセシングされる理由を生化学的に説明する。本発明者らの開示は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡ成熟の関連する分子機序を理解するための構造的基礎を提供する。

以下で考察されるように、本発明者らは、ｍｉＲＮＡ成熟および調節におけるそれらの重要な役割に関して、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端接合部およびループの三次元構造を決定するために有用な方法および材料を開発した（７－１０）。これらの部分は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの両方に存在し、それによって、それらの構造がＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒ切断工程の両方に影響を及ぼす（８）。尖端接合部およびループはまた、創薬の標的である（１１）。今日まで、２個のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端ステム－ループのみが、ＮＭＲ分光法を使用してリガンドがない状態（ｌｉｇａｎｄ－ｆｒｅｅ ｓｔａｔｅ）において構造的に特徴づけられている（６， １１， １２）。上記１３－ｎｔ ｐｒｅ－ｍｉＲ－２０ｂ尖端ループは、十分に定義された強固な構造へと折りたたまれる（６）のに対して、弱いシグナルは、１４－ｎｔ ｐｒｉ－ｍｉＲ－２１ループが構造化されていないことを示唆する（１１， １２）。ヒトゲノムは、互いから大きく異なる１，８８１のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡヘアピンをコードする（１３）。多数のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構造を調査するために、本発明者らは、結晶格子からの干渉なしに、ヘアピンループ構造の迅速な決定を可能にする足場指向性結晶化技術を開発した。本発明者らは、８個のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡに由来する９個の尖端接合部およびループ構造、ならびにそれらのＲｈｅｄとの相互作用の生化学的特徴付けを報告する。

本発明の実施形態は、ＧＧＵＵＧＣＣＧＡＡＵＣＣＧＡＡＡＧＧＵＡＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵＵＧＧＧＧＵＵＡＡＵＣＵＧＣＡＧＵＧＡＡＧＣＵＧＣＡＧＵＡＧＧＧＡＵＡＣＣＵＵＣＵＧＵＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＣＡＧＣＵＡＡＣＵＣＣＧＧＡＧＧＣＡＡＵＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧ（配列番号１）と少なくとも９０％の配列同一性を有するリボ核酸を含む物質の組成物を包含する。本発明の実施形態は、好ましくは、配列番号１のポリヌクレオチドと少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示す。パーセント同一性は、ポリヌクレオチド改変体の配列と、配列番号１の全長ポリヌクレオチドの相当する部分とを比較することによって容易に決定され得る（ここで、上記で注記した配列同一性は、残基１４～１７の代わりにこのリボ核酸に挿入され得る核酸の異種セグメントを含まない）。配列比較のためのいくつかの技術は、当業者に周知のコンピューターアルゴリズム（例えば、ＡｌｉｇｎまたはＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１９：５５５－５６５， １９９１； Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９， １９９２））を使用することを含む。デフォルトパラメーターが使用され得る。

代表的には、上記ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を含む。この比較において、上記リボ核酸の配列番号１の残基１４～１７（ＧＡＡＡ）は、長さが４～３３ヌクレオチドの間の核酸の異種セグメントで置き換えられる（上記で注記した少なくとも９０％の配列同一性は、残基１４～１７においてこのリボ核酸に挿入され得る核酸の異種セグメントを含まない）。１つの例証的な実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、ＧＧＵＵＧＣＣＧＡＡＵＣＣＸＧＧＵＡＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵＵＧＧＧＧＵＵＡＡＵＣＵＧＣＡＧＵＧＡＡＧＣＵＧＣＡＧＵＡＧＧＧＡＵＡＣＣＵＵＣＵＧＵＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＣＡＧＣＵＡＡＣＵＣＣＧＧＡＧＧＣＡＡＵＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧ（配列番号２９）を含み、ここでＸは、Ａ、Ｕ、ＧおよびＣから選択される４～３３個の間の異種ヌクレオチド（例えば、天然に存在するＲＮＡ分子（例えば、ヒトｍｉＲＮＡ）中の三次元構造を含むもの）を含む。これらの組成物では、上記核酸の異種セグメントは、代表的には、天然に存在するＲＮＡ分子における三次元構造（例えば、ループ構造）を形成するものである。本発明のある特定の実施形態において、上記核酸の異種セグメントは、完全なループ構造、および必要に応じて上記天然に存在するＲＮＡ分子におけるステム構造の０～５個の間の塩基対を含む。必要に応じてこれらの組成物は、上記リボ核酸に結合する薬剤（例えば、上記リボ核酸にハイブリダイズするポリヌクレオチド）をさらに含み得る。

本発明の別の実施形態は、ＧＧＵＵＧＣＣＧＡＡＵＣＣＧＡＡＡＧＧＵＡＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵＵＧＧＧＧＵＵＡＡＵＣＵＧＣＡＧＵＧＡＡＧＣＵＧＣＡＧＵＡＧＧＧＡＵＡＣＣＵＵＣＵＧＵＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＣＡＧＣＵＡＡＣＵＣＣＧＧＡＧＧＣＡＡＵＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧ（配列番号１）と少なくとも９０％（および必要に応じて１００％未満）の同一性を有するリボ核酸をコードするＤＮＡ配列を含む１またはこれより多くのプラスミドを含むＲＮＡ構造を観察するためのシステムまたはキットである。本発明のいくつかの実施形態において、上記１またはこれより多くのプラスミドは、配列ＧＧＴＴＧＣＣＧＡＡＴＣＣ（配列番号２７）と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列および／または配列ＧＧＴＡＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＴＴＴＴＴＧＧＧＧＴＴＡＡＴＣＴＧＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＡＧＧＧＡＴＡＣＣＴＴＣＴＧＴＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＣＡＧＣＴＡＡＣＴＣＣＧＧＡＧＧＣＡＡＴＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧ（配列番号２８）と少なくとも９０％の同一性を有するポルヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、上記１またはこれより多くのプラスミドは、上記リボ核酸を発現もしくは転写するためのプロモーターをさらに含む、および／または上記システムまたはキットは、ＲＮＡポリメラーゼをさらに含む。必要に応じて、上記システムまたはキットは、上記プラスミド中の核酸のストレッチとハイブリダイズする１もしくはこれより多くのプライマーをさらに含む。

本発明のさらに別の実施形態は、リボ核酸の構造に関する情報を得る方法である。この方法は、融合リボ核酸分子を形成するように、配列番号１（または配列番号１と少なくとも９０％を有するリボ核酸）の残基１４～１７（ＧＡＡＡ）に相同な残基を、長さが４～３３ヌクレオチドの間である核酸の異種セグメント（例えば、長さが３３ヌクレオチドまでの４、５、６、または７ヌクレオチドなどである異種セグメント）で置換する工程、上記融合ＲＮＡを結晶化する工程、上記結晶化した融合リボ核酸分子に対して構造分析（例えば、Ｘ線または電子結晶学の技術を含むもの）を行う工程、および次いで、上記核酸の異種セグメントの三次元構造に関する情報を得るように結果を観察する工程を包含する。これらの方法のある特定の実施形態において、上記融合リボ核酸分子は、結晶学の分析の前に、上記リボ核酸に結合する薬剤（例えば、上記リボ核酸の異種セグメントに結合するポリヌクレオチドまたは他の薬剤）と合わされ、その結果、上記ＲＮＡ／薬剤複合体の構造が観察され得る。代表的には、これらの方法において、上記結晶学の分析は、上記リボ核酸に結合する薬剤を欠くコントロールサンプルに対する比較を包含する。必要に応じてこれらの方法において、複数の融合リボ核酸分子は、構造分析（例えば、Ｘ線または電子結晶学）技術の前に、上記リボ核酸に結合する複数の薬剤（例えば、ハイスループットスクリーニング技術において）と合わされる。本発明のいくつかの実施形態において、少なくとも２種の薬剤が、上記融合リボ核酸分子と合わされる。

本発明の関連する実施形態は、ポリヌクレオチドに対して結晶学の分析を行う方法を包含する。代表的にはこれらの方法は、第１のポリヌクレオチドを選択する工程であって、ここで上記第１のポリヌクレオチドは、第１のｍｉＲＮＡのポリヌクレオチド配列を含む工程；上記第１のｍｉＲＮＡにおいて第１のループ領域を形成するポリヌクレオチドのセグメントを同定する工程；第２のポリヌクレオチドを選択する工程であって、ここで上記第２のポリヌクレオチドは、第２のｍｉＲＮＡのポリヌクレオチド配列を含む工程；上記第２のｍｉＲＮＡにおける第１のループ領域を形成するポリヌクレオチドのセグメントを同定する工程；上記第１のポリヌクレオチド上の上記第１のループ領域を含む上記ポリヌクレオチドのセグメントが、上記第２のポリヌクレオチド上の上記第１のループ領域を含む上記ポリヌクレオチドのセグメントで置換または交換されるように選択された融合ポリヌクレオチドを形成する工程；および次いで、上記融合ポリヌクレオチドの三次元構造を観察するために、上記融合ポリヌクレオチドを結晶学的に分析する工程；
を包含し、その結果、上記ポリヌクレオチドの結晶学の分析が行われる。これらの方法のある特定の実施形態において、上記第１のｍｉＲＮＡは、ＧＧＵＵＧＣＣＧＡＡＵＣＣＧＡＡＡＧＧＵＡＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵＵＧＧＧＧＵＵＡＡＵＣＵＧＣＡＧＵＧＡＡＧＣＵＧＣＡＧＵＡＧＧＧＡＵＡＣＣＵＵＣＵＧＵＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＣＡＧＣＵＡＡＣＵＣＣＧＧＡＧＧＣＡＡＵＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧ（配列番号１）と少なくとも９０％の配列同一性を有するｍｉＲＮＡであり、ここで上記リボ核酸の残基１４～１７（ＧＡＡＡ）は、長さが４～３３ヌクレオチドの間である上記第２のポリヌクレオチド上の前記第１のループ領域を含む核酸の異種セグメントで置き換えられる。本発明のある特定の実施形態において、上記第１のポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を含む；および／または上記第２のｍｉＲＮＡは、ヒトｍｉＲＮＡを含む。代表的には、これらの方法において、上記結晶学の分析は、Ｘ線または電子結晶学の技術である；および／または上記結晶学の分析は、上記融合ポリヌクレオチドに結合する薬剤（例えば、上記第２のポリヌクレオチド上に第１のループ領域を含む核酸のセグメントに対して相同性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド）の存在下で行われる。

本発明の例証的な作業実施形態において、本発明者らは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡヘアピンループの９個の構造を調べた。これらの研究は、長さ４～８ヌクレオチドのループが、以前に考えられていたより構造化されており、これらのおよび中程度により長いループが、治療剤の優れた標的になることを決定した。本発明の実施形態において、標的ループは、特定の長さのものである必要はなく、利用可能な例より長い可能性も短い可能性もある。この認識および本発明者らの新規な構造決定法は、当業者が、リードオリゴヌクレオチド化合物を同定し、構造ベースの精密化の反復回数を迅速かつコスト効果的に経ることを可能にする。本発明の方法は、広い適用を有する。なぜならそれらは、感染性疾患（例えば、２０１９年のコロナウイルス感染症）およびがん、加齢に関連する病理および神経変性疾患、ならびに遺伝的障害（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ディジョージ症候群など）と戦うために重要なプロセスを標的にするからである。この１つの例証において、本発明の実施形態は、ヒトがん（特に、低分子または抗体阻害を受けつけないそれらがん）の病因と関連する遺伝子を標的にするように設計された新たなアンチセンス治療剤を試験し調べるために使用され得る。

以下で考察されるように、本発明者らは、ｍｉｃｒｏＲＮＡのヒト一次転写物（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）の三次元構造を決定した（１）。簡潔には、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、ＤｒｏｓｈａリボヌクレアーゼおよびそのＲＮＡ結合パートナータンパク質ＤＧＣＲ８を含むマイクロプロセッサ複合体によって核の中で認識され、切断される。Ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端接合部およびループはまた、他のＲＮＡ結合タンパク質およびｍｉｃｒｏＲＮＡ成熟を調節する代謝産物に関する結合部位である。より重要なことには、このようなｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端ループは、次いで、ポリヌクレオチド、低分子などのような薬剤によって標的にされる場合に観察され得る。このようにして、成熟した機能的ｍｉｃｒｏＲＮＡおよびそれらの構造は、例えば、治療可能性を有する薬剤に結合されるかまたは別の方法でその薬剤によって調節される場合に観察され得る。

本発明のさらなる局面および実施形態は、以下の節において考察される。

ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端ループ長の調査
以前の調査から、短い（＜１０ｎｔ）尖端ループを有するｐｒｉ－ｍｉＲＮＡが、マイクロプロセッサによってそれほど効率的にプロセシングされない傾向があることが示された（７）。これのことを考慮し踏まえて、本発明者らは、ｍｆｏｌｄ（１４）およびｍｉＲＢａｓｅによって提供される類似のものを使用して、本発明者らが生成した推定される二次構造に基づくヒトｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端ループ配列のリストを編集した（１３）。それらの大部分（１，８８１個のうちの１，３１４個、すなわち７０％）は、１０ｎｔ長未満であり、最高頻度は、４～６ｎｔの範囲にあった（図１ａ）。ＲＮＡ二次構造推定プログラムは、必ずしも安定ではない比較的長いループの中に塩基対を含む傾向にある（６， １１）。本発明者らは、ヘアピンステムから単離される１個または２個の塩基対を無視することによって、この明らかな偏りに部分的に対処した。リストは、より長いループの数をなお過小評価している可能性はあるが、にもかかわらず、本発明者らの知識の最良のものを反映している。従って、大部分のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ認識事象に関して、Ｒｈｅｄは、尖端接合部にアクセスするために、比較的短い尖端ループと相互作用しなければならない。

足場指向性結晶学
ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端接合部およびループの三次元構造を決定するために、本発明者らは、足場指向性結晶学アプローチを開発した。その概念は、標的（未知）配列を、十分に結晶化することが公知でありかつ利用可能な結晶構造を有する足場分子に融合することである。上記融合物は、足場単独に関するものと類似の条件下で結晶化するはずである。その結晶格子は、標的部分を収容できるはずである。上記足場構造は、上記融合物の構造が分子置き換えを介して決定されることを可能にする。

適切な足場を同定するために、本発明者らは、４つの基準を満たすＲＮＡ結晶をＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋから掘り起こした。各ＲＮＡ構造登録のために、本発明者らは、半径Ｒ_ｍａｘによって特徴づけられるように、格子空洞の中に収容され得る最大の球を最初に同定した（図１ｂ）。本発明者らは、報告された回折解像度を考慮した。その設計を単純化するために、本発明者らは、非対称性ユニット中に１分子を有する登録物に検索を限定した。最後に、本発明者らは、結晶格子を手動で検討して、ＮＡヘアピンが融合され得るように、格子空洞の方を向いているステムループを見出した。数百もの調査した構造の中で、本発明者らは、これらの要件を満たすただ１つのＲＮＡ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓに由来するＹｄａＯタイプｃ－ジ－ＡＭＰリボスイッチ（以降は、ＹｄａＯと省略）を同定した（１５）。

上記ＹｄａＯ結晶格子は、大きな溶媒チャネル

を含み、短いＰ２ステムが、上記チャネル内部に位置し、隣り合う分子から離れている（図１ｃ，ｄ）。上記リボスイッチは、複雑な偽の二回折りたたみの対称的な「クローバーの葉型」の折りたたみ（ｐｓｅｕｄｏ－ｔｗｏ－ｆｏｌｄ ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ‘ｃｌｏｖｅｒｌｅａｆ’ ｆｏｌｄ）を有する（図１ｄ）。本発明者らは、ＹｄａＯ Ｐ２ステム上のＧＡＡＡテトラループを、１４－ｎｔ ｐｒｉ－ｍｉＲ－９－１尖端ループとステムからの０～３個のさらなる塩基対で置き換えた。全４種の融合ＲＮＡは、ｃ－ジ－ＡＭＰリガンドの存在下でのアリーリング後に、単一のバンドとしてネイティブゲル上で移動し（図１ｅ）、操作されたｐｒｉ－ｍｉ－ＲＮＡ配列が、足場折りたたみに干渉しないことを示した。

短いｐｒｉ－ｍｉＲＮＡループの本発明者らの代表的なセットに関して、本発明者らは、ループとステムからの種々の数の塩基対とを含むＹｄａＯ足場との融合物を生成し、結晶化のためにスクリーニングした。本発明者らは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡステムからの０個または１個の塩基対を含む構築物の結晶を得ることに成功した。これらの結晶は、同じ空間群、Ｐ３_１２１に属し、類似の格子乗数（ｃｅｌｌ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）を有する（表１）。本発明者らは、Ｘ線回折データを収集し、それらの構造を、２．７１～３．０８Åの範囲に及ぶ解像度で決定した（表１）。３種のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡに関して、本発明者らはまた、単一波長異常分散（ｓｉｎｇｌｅ－ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）（ＳＡＤ）データを、７９～１１５範囲のリダンダンシーで収集した。これらのＳＡＤデータは、位相整合（ｐｈａｓｉｎｇ）および精緻化に寄与する。その精緻化したネイティブ構造は、足場部分が野生型（ＷＴ）のものと非常に類似であり、Ｃ１’平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）値が、０．２２～１．１８Åの範囲に及ぶことを示した。以下で本発明者らは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ部分を記載する。ＰＤＢ中の大部分のＲＮＡループ構造とは異なり、本発明者らの構造は、リガンドとの結晶接触および相互作用から自由であり、それによって、それら自体の折りたたみ傾向を反映する。

ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端接合部およびループの構造
本発明者らの一連のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡループ構造は、４～８ｎｔの範囲に及ぶヒトにおいて最も頻繁なループ長を網羅する。最長のループは、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３７８ａからの８ｎｔであった（３７８ａ＋０ｂｐと称される。図２ａおよび図７ａ）。ＲＮＡループは、可撓性であり得ることから、それらはしばしば、電子密度では十分に解像されない。驚くべきことに、３７８ａ＋０ｂｐの２Ｆ_ｏ－Ｆ_ｃマップから、全ての残基に関して明確な密度で高度に構造化されたコンホメーションが明らかにされた。上記３７８ａ＋０ｂｐ構造は、ループの最も外側の残基、Ｃ１およびＡ８が、非標準的な対を形成し、ループスタックの残りから塩基が上に積み重なるプラットフォームを作製することを明らかに示す（図２ｂ）。５’末端では、Ｃ２およびＵ３が、Ｃ１の上にスタックする。３’側から、Ａ４、Ｇ５、Ａ６、およびＡ７が、Ａ８の上に４層でスタックする。塩基の２個のスタックを横断して、Ｃ２^Ｏ２－Ａ７^Ｎ６（３．３Å）、Ｕ３^Ｏ４’－Ａ６^Ｎ６（３．１Å）、Ｕ３^Ｎ３－Ａ６^ＯＰ２（２．８Å）、Ｕ３^Ｏ２－Ａ６^Ｎ７（２．６Å）、およびＵ３^２’ＯＨ－Ｇ５^Ｎ７（２．７Å）の間の水素結合は、上記ループをさらに安定化する（図２ｂ）。ｐｒｉ－ｍｉＲ－３７８ａのあらゆるループヌクレオチドは、Ａ４を除くＨ結合によって調整される（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ）。

本発明者らはまた、上記ステムからの１個の塩基対を有するｐｒｉ－ｍｉＲ－３７８ａ尖端ループの構造を改名した（３７８ａ ＋ １ｂｐ， 図２ｃおよび図７ｂ）。両方のループに関するモデルは、ほぼ一致する（ループ中の全ての非水素原子に対して１．４Å ＲＭＳＤ。図２ｃ）。上記３７８ａ ＋ １ｂｐ構造は、非標準的なＣ１－Ａ８対を確認する。興味深いことに、３７８ａ ＋ ０ｂｐおよび３７８ａ ＋ １ｂｐがほぼ同一であるという事実は、ループコンホメーションが、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡステムからの末端Ａ：Ｕ対によって強くは影響されないことを示唆する。

ｐｒｉ－ｍｉＲ－３４０（３４０ ＋ １ｂｐ）およびｐｒｉ－ｍｉＲ－３００（３００ ＋ ０ｂｐ）の構造は、７－ｎｔループを含む。上記３４０ ＋ １ｂｐ構造は、末端Ａ－Ｕ対の存在を確認し、これは、予測外のＵ１－Ｕ７対によってキャップされている（図２ｄおよび図７ｃ）。上記ループの５’末端からのＧ２およびＵ３塩基は、Ｕ－Ｕ対の頂部にスタックする。これは、上記ループの頂部においてより可撓性のコンホメーションの中にちょうど３個の残基（Ｃ４、Ｇ５、およびＵ６）を残す。３００ ＋ ０ｂｐ構造では、上記足場の末端Ｃ－Ｇ対は、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３００ステムの最後の塩基対と同一であるので、この構造は、事実上３００ ＋ １ｂｐである。３７８ａおよび３４０の場合のように、本発明者らは、Ｕ１とＵ７との間の非標準的な対形成を観察する（図２ｅおよび図７ｄ）。同様に、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３およびＡ４の間の一連の塩基スタッキング相互作用は、上記ループの５’末端を調整している（ｏｒｄｅｒ）。Ｕ６は、Ｕ２塩基と水素結合距離内にあり、ほとんど、別の非標準的な対を形成する。Ｃ５は、密度の外側にあり、より可撓性であるようである。

ｐｒｉ－ｍｉＲ－２０２（６－ｎｔループ）の構造において、本発明者らは、非標準的な塩基対を観察しなかった。しかし、他の構造と同様に、ループの５’末端にあるＡ１塩基は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡステムの最後のＧ－Ｃ対にスタックする（図２ｆおよび図７ｅ）。ループの残りは、１σにおいて連続的な電子密度を示すが、本発明者らは、高い信頼性でコンホメーションを決定することはできなかった。全体的に、比較的長い（６～８－ｎｔ）ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡループの構造は、広範囲にわたる塩基スタッキングおよび非標準的な塩基対形成相互作用を明らかにし、これはおそらく、以前に理解されていたよりループを安定化する。結論として、ループ残基が少ないほど、コンホメーション的には可撓性である。

次に、本発明者らは、より短いｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ末端ループの構造を調査した（４～５ｎｔ， 図３）。５－ｎｔループを有するｐｒｉ－ｍｉＲ－２０８ａ（２０８ａ ＋ １ｂｐ）の構造は、ステムからの最後のＧ－Ｃ対の上に位置した予測外のＡ１－Ｕ５フーグスティーン対を明らかにした（図３ａおよび図７ｆ）。ループの中央部の３ｎｔ、Ｕ２、Ｃ４、およびＧ３は、一緒におよびフーグスティーン対の中のＡ１塩基上に塩基スタックする。さらに、３４０＋１ｂｐからの非標準的なＵ－Ｕ対は、ｐｒｉ－ｍｉＲ－４４９ｃの構造中のＵ１とＵ５との間で繰り返される（図３ｂおよび図７ｇ）。位置Ｕ１およびＧ２は、上記末端塩基対の上に一緒にスタックし、Ａ３およびＵ４のみを密度の外側に残す。その２つのペンタループあ、１つのテーマを共有する：最も外側の２つの残基が、非標準的な塩基対を形成するのに対して、中心部の３個の残基が、対形成されず、それらの塩基のうちのいくつかがスタックされる。

上記の２０２＋１ｂｐの構造と同様に、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３２０ｂ－２（５－ｎｔループ）に関して、ループのＡ１残基は、ステムの末端Ａ－Ｕ対の頂部に位置する（図３ｃおよび図７ｈ）。最後に、ｐｒｉ－ｍｉＲ－１９ｂ－２（１９ｂ－２ ＋ １ｂｐ）のテトラループ構造において、５’ループヌクレオチドＵ１は、末端塩基対の上にスタックし、Ｕ１の頂部にＡ２の部分的スタッキング相互作用がある（図３ｄおよび図７ｉ）。Ｕ３およびＧ４は、ほとんど電子密度の外側にあるが、Ｇ４^Ｎ７とＡ２の２’－ＯＨとの間に接触が存在し得る（約２．６Å）。これらの構造は、より長いループ構造中に見られる５’ループ残基の非標準的な対形成および塩基スタッキングがまた、より短いループの折りたたみより優位になることを確認する。

ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端接合部の構造的コンセンサス
本発明者らのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡステム－ループ構造は、末端ループを定義する構造的特徴の共通するセットに向く。これらの特徴をさらに例証するために、本発明者らは、全８個のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡループの構造的アラインメントを生成した（図４ａ）。第１に、本発明者らは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡステムの尖端においてｍｆｏｌｄ推定の標準的塩基対を常に認める（５’－１が３’－１と対形成）、ループは異なるサイズのものであることから、ここで本発明者らは、５’－１を使用して、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列の５’末端からの第１の残基を表し、３’－１を使用して、３’末端からの第１の残基残基を表す。第２に、全ての構造において、ループの５’末端上の第１のヌクレオチドは、末端塩基対と塩基スタックする（５’－２は５’－１／３’－１とスタックする）。第３に、８個のループのうちの５個（３７８ａ、３４０、３００、２０８ａ、４４９ｃ）において、この塩基スタッキングはまた、非標準的な塩基対（５’－２は３’－２と対形成する）が付随し、尖端ループを２個のヌクレオチド程度、推定されるより効果的に短くする。第４に、全８個の構造は、５’側にある塩基スタッキング相互作用のうちの少なくとも１個のさらなるレベルを明らかにする（５’－３は５’－２上にスタックした）。対照的に、２個の構造のみが、３’側での第２層スタッキングを示す。これらの共通する特徴の他に、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡループの他の残基は、極めて異なるコンホメーションをとるようであるか、または可撓性である。

非標準的な塩基対は、熱力学的安定性に寄与する
本発明者らが観察した尖端接合部およびループの構造が、溶液中でのそれらの安定性に寄与するか否かを試験するために、本発明者らは、８個のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列を共通する５－ｂｐラセンセグメントに融合し（図８ａ）、光学的融解を使用してそれらの熱力学的パラメーターを測定した。結晶構造におけるように、各ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列は、尖端ループおよびステムからの直ぐに隣り合う標準的な塩基対を含み、その結果、最小の尖端接合部が含まれる。本発明者らは、標準的なステム塩基対が、３個のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡにおけるＧ－Ｃ対またはＣ－Ｇ対が他のものにおけるＡ－Ｕ対およびＵ－Ａ対より安定であることに伴って、全体的な安定性に差次的に寄与すると予測する。しかし、この差異は、本発明者らが測定した折りたたみの自由エネルギー変化（ΔＧ）を完全には説明しない（表２）。本発明者らは、本発明者らが三次元構造において明らかにした非標準的な対を考慮に入れる場合、傾向が見えてくる。非標準的な対を形成し、末端ステム対としてＧ－ＣまたはＣ－Ｇを有する２個のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉｒ－３００およびｐｒｉ－ｍｉｒ－２０８ａ）は、最も安定であるのに対して、非標準的な塩基対を形成せず、Ａ－ＵまたはＵ－Ａの標準的なステム対を含むもの（ｐｒｉ－ｍｉｒ－３２０ｂ－２およびｐｒｉ－ｍｉｒ－１９ｂ－２）は、安定性が最小である（図４ｂ）。大部分の他のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列（これらは、Ａ－Ｕ／Ｕ－Ａステム対を除いて非標準的な対を含む（ｐｒｉ－ｍｉｒ－３４０およびｐｒｉ－ｍｉｒ－４４９ｃ）、または非標準的な対を形成しないがＧ－Ｃ／Ｃ－Ｇステム対を有する（ｐｒｉ－ｍｉｒ－２０２）かのいずれかである）は、安定性において中間である。ｐｒｉ－ｍｉｒ－３７８ａ尖端接合部／ループは、１個の水素結合によって定義されるＣ－Ａの非標準的な対を含み、それによって、安定性が最小の基に由来するものに類似のΔＧを示す。まとめると、これらのデータは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端接合部における非標準的な対が、溶液中のそれらの構造的安定性に寄与することを示唆する。

ヒトｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、それらの尖端接合部においてＵ－Ｕ対およびＧ－Ａ対を優先する
本発明者らは次に、全てのヒトｐｒｉ－ｍｉＲＮＡループ配列を分析することによって、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端接合部における非標準的な対の存在量を予測した。１，８８１のこのような配列の中で、３４０が、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３４０、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３００、およびｐｒｉ－ｍｉＲ－４４９ｃ構造におけるように対形成する可能性が最も高い５’末端および３’末端の両方でＵ残基を含む（図４ｃ）。Ｕ－Ｕ対は、これらの位置における全ての可能な組み合わせの中で最も存在量が多いのに対して、偶然に予測される存在は、１８１である。この富化は、非常に顕著である。なぜならＵ－Ｕを偶然に３４０回観察するという確率は、１８１回に関するものより３×１０^－２８倍低いからである。第２の最も存在量が豊富な組み合わせは、５’－Ｇおよび３’－Ａであり、２４５回認められ、１３９という最もありそうなカウントのオッズより偶然に起こる可能性が１×１０^－１６倍低い。他の末端組み合わせ（例えば、Ｃ－Ａ（１２２回観察される））のループ配列カウントは、偶然に予測されるものとはそれほど実質的に異ならない（１０９回、Ｐ_１２２／Ｐ_１０９＝０．４２）。従って、本発明者らは、ヒトｐｒｉ－ｍｉＲＮＡが、ヘアピンステムの直ぐ隣のＵ－Ｕ対およびＧ－Ａ対を優先すると結論付ける。

興味深いことに、Ｕ－ＵおよびＧ－Ａは、閉じた対として働く場合に、ヘアピンループを安定化することが公知である（１６）。本発明者らのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡループライブラリーを、Ｕ－Ｕ対およびＧ－Ａ対の安定化効果を考慮している二次構造推定に部分的に基づいて構築した。本発明者らは、この小さなボーナスエネルギー期間が、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端ループにおいて閉じた対としてＵ－ＵおよびＧ－Ａの富化を担うとは考えない。なぜなら大部分のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡに関して、ループ配列は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡヘアピンステムの一部として強い標準的な塩基対によって定義されるからである。さらに、他の非標準的な対（例えば、Ｇ－Ｇ、Ｃ－ＡおよびＡ－Ｃ）はまた、安定化していることが公知である（しかし、わずかに少ない程度まで）が、それらは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端接合部において富化されていない。この結果は、Ｕ－ＵおよびＧ－Ａの非標準的な対が、おそらくそれらの安定化効果および／または特異的な幾何的特徴のために、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端接合部によって優先されることを示唆する。

ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡループは、他のＲＮＡと構造的特徴を共有する
本発明者らは、本発明者が網羅しなかったループコンホメーションが、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡに特有であるか、または他のＲＮＡステム－ループと共有されているかを求めた。この問題に対処するために、本発明者らは、ＰＤＢからのＲＮＡヘアピン配列を、本発明者らのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構造に対してスレッド化し、次いで、そのスレッド化したポーズと元のＰＤＢコンホメーションとの間でＲＭＳＤを計算した（方法の節を参照のこと）。ｐｒｉ－ｍｉＲ－３７８ａに関して、本発明者らは、わずかに短く（６－ｎｔまたは７－ｎｔ）、配列において異なるが、高度に類似の折りたたみを保持する３個のループを同定した（図９）。これらの構造を比較することで、一般化したループモチーフが明らかにされる。これを本発明者らは、３’－プリンリッチスタックと称する（図９ｂ）。３’－プリンリッチスタックにおいて、上記ループの３’側にある４～５個の大部分のプリン塩基が、互いとらせんステムの頂部でスタックする。１個または２個のピリミジンは、ステムから最も遠い位置に見出され得る。ループの５’側に、２または３個のピリミジン残基、最も頻繁にはウリジンが、スタックした残基とステムとの間でリンカーとして働く。これらのリンカーピリミジンは、スタックしたプリンと水素結合を、ときおり、非標準的な塩基対を形成し、これは、全体のループをさらに安定化する。より広く、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３２０ｂ－２構造において、ＵＧＡＡテトラループ中の３個のプリンは、互いとかつ隣り合うＵ－Ａ対の頂部でスタックし、本質的に、３’プリンスタックを形成する。多くのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡおよび他のヘアピンループは、３’プリンスタックと一致する配列を含む。全体的に、これらの観察は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡループ構造が、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡに必ずしも特有ではなく、ＤＧＣＲ８およびＤｒｏｓｈａが多くの他の細胞性ＲＮＡと相互作用するという以前の報告とも一致することを示唆する（１７－２１）。

ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端ループの非対称的なコンホメーションの可撓性
構造的安定性および動力学は、少なくとも２つの理由から、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ接合部およびループにとって重要であるようである。第１に、共通するコンホメーション特徴は、安定であると予測される。第２に、動力学的領域は、プロセシングするタンパク質を結合する際に立体障害を回避し、プロセシングにとって都合のよいコンホメーションをとることをより容易にする。これを調査するために、本発明者らは第１に、原子変位パラメーター（ＡＤＰ（温度因子またはＢ因子としても公知））が構造決定の間に精緻化されることを検討した。驚くことではないが、ループの頂部の残基は、大きなＡＤＰを有する。これは、それらが高度に動力学的であることを示唆する；それに対してステムに近い残基は、共通する構造特徴（例えば、非標準的な対および塩基スタッキング）に関与し、低いＡＤＰを有する傾向にある（図１０）。重要なことには、大部分のループは、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３７８ａを除いて、ループの５’領域においてより高い安定性および３’領域においてより可撓性に向かう傾向を示す。スタックした５’残基は、３’ヌクレオチドより一貫して安定性である。構造間でＡＤＰｓをさらに比較するために、本発明者らは、残基あたりの平均ＡＤＰを計算し、次いで、それらど同じスケールでプロットした（図４ｄ）。ＡＤＰｓにおけるピークは、大部分の構造にわたって、中央付近からループの３’末端に一貫して位置する。効率的プロセシングにとって重要であると以前に同定されたＵＧＵモチーフ（５， １０）が、ループの５’領域に位置することに注意することは、興味深い。

ループ動力学へのより詳細な検討のために、本発明者らは、陽溶媒（ｅｘｐｌｉｃｉｔ ｓｏｌｖｅｎｔ）中でｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ接合部およびループヌクレオチドの分子動力学シミュレーションを行った。単純性のために、そのシミュレーションは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ残基と足場からの２個の塩基対とを含むのみであり、本発明者らは、足場ヌクレオチドの位置を、鎖の巻き戻しを防止するために制限した（詳細に関しては方法の節を参照）。本発明者らは、１μｓに対して３００Ｋにおいてシミュレーションを実行し、各残基に対して平均二乗変動（ＲＭＳＦ）を計算することによって得られる軌跡を分析した（図４ｅ）。これらの統計は、中心部から３’ループ残基が、より広い範囲のコンホメーションをサンプリングするというより明確な傾向を裏付ける。

Ｒｈｅｄ結合親和性と尖端ループ長との間の相関
本発明者らは、ループ長における差異にもかかわらず、Ｒｈｅｄがｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端接合部の全てをどのようにして認識するかを知りたいと思っていた。本発明者らは、尖端ループとステムからのおよそ２０ｂｐを含むｐｒｉ－ｍｉＲＮＡフラグメントに対するＲｈｅｄの親和性を測定することによって、この問題に対処した（図８ｂ－ｉ）。本発明者らは、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用して、各ＲＮＡに対するＲｈｅｄ解離定数（Ｋ_ｄ）を決定した（図１１）。Ｒｈｅｄは、全ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡフラグメントを、１．９～９．２μＭの範囲に及ぶＫ_ｄで結合した（図５ａ～ｈ）。このような差異は、認識にとって、特に、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡがプロセシング機構に関して競合する場合には重要であり得る。本発明者らは、全体的なループ長に対して結合のΔＧをプロットした（図５ｉ）ところ、より長いループのより強固な結合に向かう傾向に気づいた。この傾向は、本発明者らが、本発明者らの３Ｄ構造に基づいてループ長を較正した場合により明らかになった（長さから非標準的な対に関与する残基を引く。図５ｊ）。本発明者らの結果は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡループ長の優先性の生化学的な説明を提供するが、本発明者らは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡステムにおける差異が、Ｒｈｅｄ親和性の範囲にも寄与する可能性を除外できない。本発明者らは、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３４０（これは、ループの５’側にＵＧＵモチーフを含む）が、この配列を欠く他の構築物と類似の親和性（Ｋ_ｄ＝３．５μＭ）でＲｈｅｄを結合することを注記する。

考察
本発明者らは、足場指向性結晶学が、ＲＮＡ構造生物学にとっての強力なツールであり得るという概念実証を示す作業実施形態を提供する。この方法は、一般的な固定アームＭＢＰ融合技術（ここで標的タンパク質は、ＭＢＰに、連続αヘリックスリンカーを介して固定した配向で連結される）に類似であるようである（２２）。しかし、本発明者らの操作アプローチは、標的ＲＮＡを、足場結晶の格子空隙内に特異的に位置づける。このような設計は、以下のいくつかのさらなる利点を生じる：（１）標的部分が、存在する格子接触を破壊しないことから、融合分子は元の条件下で結晶化され得る；（２）広い範囲の条件の再スクリーニングが不要であることから、最小量の精製した融合ＲＮＡが、結晶化に要求される；および（３）標的は、格子の中で隣り合う分子と相互作用せず、それによって、その構造が、溶液中でのコンホメーションを忠実に再現することを可能にする。

この技術を、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ認識の問題に適用すると、８個のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端接合部およびループ構造の原子レベル調査が提供される。これらのループは、ヒトｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの中で最も頻度の高いループ長を網羅する。これらの構造は、尖端ループを閉じる非標準的な塩基対および５’末端におけるさらなる塩基スタッキングが関わる構造的コンセンサスをまとめて明らかにする。このコンセンサスは、ｐｒｅ－ｍｉＲ－２０ｂの以前に報告されたＮＭＲ構造によって裏付けられる（６）。ｐｒｅ－ｍｉＲ－２０ｂステムは、Ｇ－Ｕ対で終結し、隣り合う５’ループヌクレオチド（Ｇ）は、その対の頂部にスタックする（図１３）。上位２０のＮＭＲソリューションの比較から、これらが分子の安定な特徴であることが確認される。ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１のＮＭＲ研究から、尖端接合部における２個のタンデムＵ－Ｇ／Ｇ－Ｕ対に相当する弱いシグナルが明らかにされ、１４－ｎｔ尖端ループが他の点で組織だっていないことが示唆された（１１）。尖端接合部以外に、本発明者らのおよびＮＭＲ構造における尖端ループは、三次元コンホメーションにおいて異なる。これは、それらのコンホメーションが、直接的な特異性決定因子でないことを示唆する。これらのコンホメーションは、それらの個々の機能に関連する。例えば、ｐｒｉ－ｍｉＲ－１２５ａループは、葉酸を結合するためのアプタマードメインとして機能し得る（２３）。

ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端接合部における非標準的な対の観察は、それ自体としては、重要な構造的意味および機能的意味を有する。本発明者らの光学的融解実験は、これらの対形成が溶液中のＲＮＡの熱力学的安定性に寄与することを示す（図４ｂ）。特に、Ｕ－Ｕ対およびＧ－Ａ対は、ヒトｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの尖端接合部において高度に富化されている（図４ｃ）。これらの対はしばしば、保存される。例えば、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３４０のＵ－Ｕ対は、ほぼ完全に保存されているのに対して、全ての他の位置ではヌクレオチドバリエーションが起こる。Ｕ－Ｕ対の唯一のバリエーションは、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ａｌｅｃｔｏにおけるＵ－Ｇ対による置換である。従って、尖端接合部のこれらの非標準的な対は、ｍｉＲＮＡ成熟にとって重要である可能性があるが、それらの正確な機能は、未だ決定されていない。マイクロプロセッサは、そのステムを両方の末端において固定することによって、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡヘアピンを認識する（２４， ２５）。最適なｐｒｉ－ｍｉＲＮＡヘアピンステム長は、内部の非標準的な対を参入すれば、３５±１ｂｐであると予測される（１０）。本発明者らの研究は、尖端接合部の末端非標準的な対が、考慮されるべきであることを示唆する。ｐｒｉ－ｍｉＲ－１６－１の以前のハイスループット変異誘発は、その最適より長いステム長に起因すること、およびステムの尖端の標準的な対の破壊が、マイクロプロセッサ切断効率を増大させることを示す（１０）。ｐｒｉ－ｍｉＲ－１６－１では、Ｇ－Ａ対が形成し、ヘアピンステムの末端においてスタックすると予測される。このようなシナリオでは、Ｇ－Ａ対は、隣り合う標準的な対とともに破壊される必要がある。このような阻害効果は、ＲＮＡ結合タンパク質よびＲＮＡヘリカーゼによるｍｉＲＮＡ成熟の活性化を可能にする（２６）。逆に、本発明者らは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡらせんステムが最適より短い場合には、非標準的な対が、マイクロプロセッサ複合体の中でヘアピンがフィットするのを助けるのではないかと考える。

尖端接合部のコンホメーションはまた、マイクロプロセッサによって優先的に認識され得る。実際に、マイクロプロセッサは、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３０ａステムの（塩基接合部から数えて）３５番目のｂｐ位置において、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対よりＵ－Ｇ対を好む（１０）。本発明者らは、別のハイスループット変異誘発データ（５）を再度分析したところ、Ｃ－Ａ対が、マイクロプロセッサ切断生成物の中で、尖端接合部において高度に富化されていることを見出した（図１２）。さらに、５’ループ残基がスタックし、３’ループ部分がより可撓性である傾向は、ＵＧＵモチーフが配置され、プロセシング機構による認識のために曝されることを可能にする。さらなる研究が、この考えを試験するために必要とされる。

本発明者らのヒトｐｒｉ－ｍｉＲＮＡループ配列の分析は、それらのうちの大部分が、最適な≧１０－ｎｔより短いことを示唆する。４～８ｎｔの間のループ長を有する上記８個のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの中で、本発明者らは、上記ループ長と、Ｒｈｅｄとの結合の自由エネルギー変化との間に相関を認める（図５ｉ）。この相関は、非標準的な対に関与する残基が、ループ長の計算から排除される場合に改善される（図５ｊ）。Ｒｈｅｄへの優先的結合は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡをプロセシングのための有利な位置に保ち、それによって、≧１０ｎｔという最適なループ長に関する生化学的な説明を提供する（７）。Ｒｈｅｄに対するΔＧ_結合の差異は、１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内である。本発明者らは、このような中程度の差異が、実質的な生物学的および病理的結論を、特に、マイクロプロセッサが制限される場合に（例えば、多くのがん細胞において）有し得ると考える。マイクロプロセッサへの優先的結合は、尖端接合部とＲｈｅｄとの相互作用によって代表されるように、ここで、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの中でプロセシングのヒエラルキーを生成する可能性があり、ｍｉＲＮＡ発現プロフィールを決定するために役立つ。

尖端接合部およびループはまた、細胞質へと輸出されかつｍｉＲＮＡ成熟経路においてＤｉｃｅｒリボヌクレアーゼによって切断されるｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの一部である。以前の研究は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのステムおよびループ長が、ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒ両方の切断効率に影響を及ぼし得ることを示した（８）。さらなる研究が、尖端接合部およびループ構造が、どのようにしてＤｉｃｅｒプロセシング工程に寄与するかを理解するために必要とされる。さらに、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびウイルスＲＮＡヘアピンループを標的にする潜在的な治療剤を開発するという実質的な目的が存在する（１１， ２６， ２７）。本発明者らの構造は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡループが、予測されるより多くの構造を含み、これは、結合のエントロピーペナルティーを低減することを示す。本発明者らの結晶化方法は、インヒビターの構造ベースの設計を可能にするはずである。

方法
Ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端ループ分析
尖端ループのおおよそのサイズを判断するために、本発明者らは、ｍｉＲＢａｓｅ（リリース２１）から、全ての註釈付きヒト「ヘアピン」配列およびそれらのゲノム座標をダウンロードした。ｍｉＲＢａｓｅヘアピンは、代表的には、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ部分を、基部ステム（ｂａｓａｌ ｓｔｅｍ）から種々の数のさらなる塩基対とともに含む。各ヘアピンに関して、本発明者らは、そのゲノム配列を使用して、上記ＲＮＡを、５’末端および３’末端において等しい数のヌクレオチド程度、全長が１５０ｎｔに等しくなるまで延ばした。この１５０－ｎｔの範囲は、完全なｐｒｉ－ｍｉＲＮＡヘアピンと、その基部接合部のいずれかの側にいくらかの１本鎖ＲＮＡとを含んだ。次いで、本発明者らは、全てのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡヘアピンに関してＭＦＯＬＤ（１４）を使用して推定二次構造を生成し、概して、上位のスコアの構造（すなわち、推定される折りたたみの自由エネルギーが最も低い）を保持した。本発明者らは、全ての推定を手動で検討して、それらが、予測されるヘアピン構造を、ステムの片方の鎖または両方の鎖に由来する成熟ｍｉＲＮＡ配列とともに反映することを確実にした；ｍｆｏｌｄが代替のコンホメーションを推定した場合には、本発明者らは、およそ３個のヘリックスターンのステム長を含んだ最低の自由エネルギーを有する構造を選択した。本発明者らは、上記二次構造を、ｍｉＲＢａｓｅからのものと手動で比較し、上記ステムから単離され、それによって不安定とみなされるヘアピンにおける１～２個の塩基対も排除した。

ＹｄａＯ結晶化足場のＰＤＢ掘り起こしおよび同定
本発明者らは第１に、ＰＤＢをフィルタリングして、ＲＮＡ分子のみ（タンパク質もＤＮＡもなし）を含むＸ線構造を得た。結晶格子中の空隙を同定するために、本発明者らは、以下の工程においてグリッドサーチアルゴリズムを実行するＰｙＭＯＬスクリプトを書いた。（１）ユニットセルの３×３×３ブロック（すなわち、２７コピーのユニットセル）を生成する。このブロックの中心にあるユニットセルは、ユニットセルの内部またはユニットセル間のいずれかに、全ての可能な格子空隙を認める。（２）ユニットセル軸の各々に沿った３個の単位ベクトル（すなわち、長さ１Åのａ、ｂ、およびｃベクトル）を使用して、それぞれのユニットセルの辺の長さを５で除算したものより小さいｉ，ｊ，ｋの整数値に関しては、形態５＊ｉ＊ａ ＋ ５＊ｊ＊ｂ ＋ ５＊ｋ＊ｃのグリッド点を反復して生成する。これは、グリッド点に５Åの空間を与える。（３）各グリッド点に関して、スーパーセルにおいて全てのＣ１’原子までの距離を計算し、最短をＲ_{ｌｏｃａｌ}として同定する。各構造に関して、最大のＲ_{ｌｏｃａｌ}をＲ_ｍａｘとして有するグリッド点を同定する。

適切な足場を見出すために、本発明者らは、次いで、大きなＲ_ｍａｘ値および非対称ユニットの単一分子を有する構造を手動で検討した。本発明者らは、格子中の空洞へと突出する任意のステム－ループを探すチェーンを追跡した。検討した数百もの候補の中で、ＹｄａＯリボスイッチ（ＰＤＢ ＩＤ： ４ＱＫ８）のＰ２ステム－ループのみが、この条件を満たした（１５）。

ＹｄａＯ ＷＴおよびｐｒｉ－ｍｉＲ－９－１融合ＲＮＡの調製ならびにネイティブゲル電気泳動
本発明者らは最初に、隣接するＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限部位とともに、５’末端にＴ７プロモーター配列を、および３’側にＨＤＶリボザイムを含むように、Ｗ．Ｔ． ＹｄａＯ構築物を設計した。このフラグメントを、遺伝子ブロック（ＩＤＴ）として合成し、二重消化し、ｐＵＣ１９プラスミドへとクローニングした。そのクローンを、Ｓａｎｇｅｒ配列決定法によって検証した。Ｐ２ループヌクレオチドをｐｒｉ－ｍｉＲＮＡステム－ループで置き換えるために、本発明者らは、２回のＰＣＲプロトコールを使用した。全ての反応を、Ｑ５高信頼性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で、製造業者が推奨した反応工程およびサイクリング条件に従って行った。全ての反応は、同じ逆方向プライマーを含み、これは、ＨＤＶの３’末端にアニールし、ＢａｍＨＩ部位

を含んだ。第１のＰＣＲに関しては、正方向プライマーは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列と足場上のおよそ２０ｎｔ上流および下流とを含んだ。ｐｒｉ－ｍｉＲ－９－１融合物の正方向プライマーは、以下であった：

このＰＣＲ生成物をゲル精製し、１μＬを第２回のＰＣＲのテンプレートとして使用した。全ての反応は、同じ逆方向プライマーおよび正方向プライマー

を含んだ。これらは、共通する足場残基（太字）にアニールし、Ｔ７－プロモーター（斜体）およびＥｃｏＲＩ部位（下線）を付加した。第２回のＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＵＣ１９へとライゲーションした。所望の挿入物を含むクローンを、配列決定して検証した。

ＷＴ ＹｄａＯおよびｐｒｉ－ｍｉＲ－９－１融合構築物に関して、本発明者らは、マキシプレッププラスミド（ｍａｘｉｐｒｅｐ ｐｌａｓｍｉｄ）を調製し、ＢａｍＨＩで一晩消化することによってそれらを直線状にした。転写反応物は、約４００μｇ 直線化テンプレート、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、４ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ スペルミジン、４０μｇ 無機ピロホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）、０．７ｍｇ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、および３ｍＭ 各ＮＴＰを、総容積５ｍＬ中に含んだ。３７℃で４．５時間のインキュベーション後、最終ＭｇＣｌ_２濃度を４０ｍＭに調節し、その反応物をさらに４５分間インキュベートした。Ｍｇ^２＋ 濃度の上昇にもかかわらず、本発明者らは、ＨＤＶリボザイムによる部分的切断のみを観察した。反応物をエタノール沈殿させ、変性１０％ ポリアクリルアミドスラブゲルで精製した。その所望の生成物を、ＵＶシャドウイング（ＵＶ ｓｈａｄｏｗｉｎｇ）によって可視化し、ゲルから切り出した。ゲル片を砕き、３０ｍＬ ＴＥＮ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で、４℃において一晩抽出した。次いで、本発明者らは、ゲル片を遠心分離し、ＲＮＡを、１０－ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離フィルターユニットで濃縮した。ＲＮＡを、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５へと３回緩衝液交換し、約５０μＬ 最終容積へと濃縮した。

ネイティブゲル上での分析のために、５μＭ ＲＮＡストック溶液を、精製ＲＮＡの５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．０への希釈によって調製した。次に、２．５ μＬ ＲＮＡを、等容積の２×アニーリング緩衝液（３５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．０、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および２０μＭ ｃ－ジ－ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）を含む）と混合した。その混合物を、９０℃で１分間加熱し、続いて、氷上で急速冷却し、次いで、３７℃で１５分間のインキュベーションを行った。そのアニールしたＲＮＡを、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０％ （ｖ／ｖ） グリセロールおよびキシレンシアノールを含む２×ローディング色素と混合し、Ｔｒｉｓ－ホウ酸（ＴＢ）泳動緩衝液での１０％ ポリアクリルアミドゲル上で分析した。そのゲルを、Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ ＩＩで染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４１０ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｍｏｄｅ Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でスキャンした。

結晶化のためのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ－ＹｄａＯ融合物の調製
本発明者らがｐｒｉ－ｍｉＲ－９－１融合物に関して観察した不十分なＨＤＶ自己切断効率を考慮して、本発明者らは、ストラテジーを変更することを選択した。リボザイムを使用して均質な３’末端を作製する代わりに、本発明者らは、ＰＣＲを使用して、アンチセンスＤＮＡ鎖上の２個の５’残基を２’－Ｏ－メチル化した転写テンプレートを生成した。上記改変は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによってテンプレート化されていないヌクレオチド付加を低減することが示された（２８）。本発明者らは、３回のＰＣＲアプローチを利用して、転写テンプレートを作製した。以下の全ての反応物は、同じ逆方向プライマー、５’－ｍＣｍＵＣＣＴＴＣＣＴＴＴＡＴＴＧＣＣＴＣＣ－３’（配列番号８）（ここで「ｍ」は、２’－Ｏ－メチル化を示す）を含んだ。第１回のＰＣＲに関しては、本発明者らは、Ｑ５ポリメラーゼとの５０μＬ 反応を設定して、ＹｄａＯの３’フラグメントを正方向プライマー、５’－ＧＧＴＡＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＴＴＴＴＴＧ－３’（配列番号９）で増幅し、３０サイクルの増幅を行った。その生成物をゲル精製し、１μＬを、次の回のためのテンプレートとして使用した。第２回のＰＣＲでは、本発明者らは、第１段階からの３’ ＹｄａＯフラグメントにアニールしたｐｒｉ－ｍｉＲＮＡループおよびステム配列を含む各構築物に対して特有の正方向プライマーを使用した。プライマー配列は、以下であった：

この反応はまた、５０μＬであり、Ｑ５ポリメラーゼを３０サイクル使用した。第２回のＰＣＲからの生成物を、アガロースゲル電気泳動によって分析して、増幅を確認し、反応物のうちの４０μＬを、さらに精製することなく第３回のＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。２ｍＬ ＰＣＲ反応物を、Ｐｈｕｓｉｏｎ高信頼性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）および正方向プライマー
５’－ＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＧＣＣＧＡＡＴＣＣ－３’（配列番号１８）
を使用し、３５サイクル実行した。

第３段階のＰＣＲ生成物を、ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。緩衝液Ａは、１０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５を含んだ；緩衝液Ｂは、２Ｍ ＮａＣｌを有する以外は同一であった。カラムを２０％ 緩衝液Ｂで平衡化し、所望のＤＮＡ生成物を、２ｍｌ／分で１０分間にわたって５０％ Ｂへの直線勾配で溶離した。本発明者らは、アガロースゲルでのピーク画分を分析して、それらが正確なサイズの単一のバンドを含んでいることを確認した。次いで、そのピーク画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎフィルターユニット（１０ｋＤａ ＭＷＣＯ）で濃縮し、次いで、水で洗浄して、過剰な塩を除去した。ＤＮＡテンプレートの濃度（約２００μＬ 最終容積）を、ＵＶ吸光度によって決定した。

転写反応を、１０ｍＬ容積中であることおよび２．８ｆｍｏｌ ＤＮＡテンプレートを含むことを除いて、ｐｒｉ－ｍｉＲ－９－１融合物に関して上記で記載されるとおりに設定した。反応を、３７℃において４時間実行し、続いて、フェノール－クロロホルム抽出を行った。上記転写物をＡｍｉｃｏｎフィルターユニット（１０ｋＤａ ＭＷＣＯ）で濃縮し、０．１Ｍ トリメチルアミン－酢酸（ＴＥＡＡ） ｐＨ ７．０で洗浄した。上記ＲＮＡ（約２ｍＬ）を、５４℃において恒温にしたＷａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（３．５μｍ 粒度， 寸法４．６×１５０ｍｍ）に注入した。ＴＥＡＡおよび１００％ アセトニトリルを移動相として使用した。上記カラムを６％ アセトニトリルで洗浄し、ＲＮＡを、０．４ｍｌ／分において８０分間にわたる１７％ アセトニトリルへの勾配で溶離した。ピーク画分を、変性１０％ ポリアクリルアミドゲルで分析した。純粋画分をプールし、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．０へと、Ａｍｉｃｏｎフィルターユニットを使用して緩衝液交換した。上記ＲＮＡを、＜５０μＬ 最終容積へと濃縮し、その濃度をＵＶ吸光度によって決定した。

結晶化、データ収集、および構造決定
全てのＲＮＡ－ｃ－ジＡＭＰ複合体を、記載されるように調製した（１５）。簡潔には、０．５ｍＭ ＲＮＡ、１ｍＭ ｃ－ジ－ＡＭＰ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．０を含む溶液を、９０℃へと１分間加熱し、氷上で急速冷却し、結晶化する直前に、１５分間、３７℃において平衡化した。スクリーニングを、０．５ｍＬ ウェル溶液を含む２４ウェルプレートの中で行った；ハンギングドロップは、１μＬ ＲＮＡ＋１μＬ ウェル溶液からなった。プレートを室温でインキュベートし、結晶を、１週間以内に十分なサイズ（１００μｍ～２００μｍ超）へと全体的に成長させた。１９ｂ－２ ＋ １ｂｐに関しては、上記ウェル溶液は、１．７Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．２Ｍ Ｌｉ_２ＳＯ_４、および０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．１を含んだ。２０２ ＋ １ｂｐ、２０８ａ ＋ １ｂｐ、および３２０ｂ－２ ＋ １ｂｐに関しては、ウェルは、１．９Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．２Ｍ Ｌｉ_２ＳＯ_４、および０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４を含んだ。３７８ａ ＋ ０ｂｐのウェル溶液は、１．７Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．２Ｍ Ｌｉ_２ＳＯ_４、および０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４を含んだ。残りの構築物に関しては、結晶化を、０．４μＬ ＲＮＡ ＋ ０．４μＬ ウェル溶液からなるハンギングドロップで９６ウェルプレートの中で行った。３００ ＋ １ｂｐに関しては、ウェル溶液は、１．８８Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．２４８Ｍ Ｌｉ_２ＳＯ_４、および０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４を含み、３００ ＋ ０ｂｐに関しては、ウェル溶液は、１．９０Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１５８Ｍ Ｌｉ_２ＳＯ_４、および０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４を保持していた。構築物３４０ ＋ １ｂｐは、１．８９Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．２１４Ｍ Ｌｉ_２ＳＯ_４、および０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４を含むウェル溶液から結晶化した。構築物３７８ａ ＋ １ｂｐは、１．６３Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．２７２ Ｍ Ｌｉ_２ＳＯ_４、および０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４から結晶化した。構築物４４９ｃ ＋ １ｂｐに関しては、上記ウェルは、１．８９Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１２８Ｍ Ｌｉ_２ＳＯ_４、および０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４を含んだ。

全ての結晶を、２０％ （ｗ／ｖ） ＰＥＧ ３３５０、２０％ （ｖ／ｖ） グリセロール、０．２Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．２Ｍ Ｌｉ_２ＳＯ_４、および０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．３を含む凍結保護溶液中に短時間浸漬し、液体窒素中で急速凍結した。データを、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｂｅａｍｌｉｎｅ ２４－ＩＤ－ＣまたはＡｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ Ｂｅａｍｌｉｎｅ ８．３．１において１００Ｋで収集した。全ての構築物に関して、本発明者らは、波長 約１Åにおいてネイティブデータセットを収集した。３２０ｂ－２＋１ｂｐ、３７８ａ＋０ｂｐ、および４４９ｃ＋１ｂｐに関しては、本発明者らは、それぞれ、１個、２個または３個の結晶から１．９Åにおいてさらなる高リダンダンシーデータセットを収集することによって、リンの異常散乱を測定した。データをインデックス化し、統合し、ＸＤＳを使用してスケールを付けた（２９）。

異常データが利用可能である場合、本発明者らは、分子置き換え／単一異常分散アプローチ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ／ｓｉｎｇｌｅ ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈ）の組み合わせ（ＭＲ－ＳＡＤ）を使用して、部分的実験相を生成した。上記分子置き換えモデルは、ＹｄａＯ ｃ－ジ－ＡＭＰリボスイッチ構造（ＰＤＢ ＩＤ： ４ＱＫ８）と、上記モデルから除去されたＰ２ステム上のＧＡＡＡテトラループからなった。相を、ＰｈｅｎｉｘのＰｈａｓｅｒ－ＭＲプロトコールにおけるデフォルト設定を使用して得た（３０）。

全ての構築物に関して、本発明者らは、Ｐｈｅｎｉｘを使用してデータへのＭＲモデル（上記）のリジッドボディーフィット（ｒｉｇｉｄ ｂｏｄｙ ｆｉｔ）を行うことによって、最初の回答を得た（利用可能な場合には、実験相拘束（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐｈａｓｅ ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓ）を含む）。これは、Ｒ_ｗｏｒｋ＜３０％を有する優れた初期モデルを生成した。次いで、本発明者らは、Ｐ２ステムの領域において電子密度マップを精査した。全てのＲＮＡに関して、失われている塩基対およびループについてのさらなる密度を、２Ｆ_ｏ－Ｆ_ｃおよび差異マップ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｐ）において明らかに見ることができた。次いで、本発明者らは、Ｃｏｏｔにおいて失われている残基をモデル化した（３１）。密度が不明確な場合には、本発明者らは、不完全なループでのモデル化を中止し、Ｐｈｅｎｉｘでさらなる回数の座標、ＡＤＰ、およびＴＬＳパラメーター精緻化を行った。これは、代表的には、失われている残基のさらなる密度を明らかにした。ループがいったん完全にモデル化された後、本発明者らは、上記のように、合理的なＲ因子およびモデル形状が得られるまで精緻化のさらなるラウンドおよび手動での調節を行った。

シミュレートしたアニーリングコンポジットオミットマップ（ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｏｍｉｔ ｍａｐ）を、Ｐｈｅｎｉｘにおいて計算した（図７）。１９ｂ－２ ＋ １ｂｐ、２０２ ＋ １ｂｐ、３２０ｂ－２ ＋ １ｂｐ、３４０ ＋ １ｂｐ、および３７８ａ ＋ １ｂｐの場合には、標準的アニーリング温度（５０００℃）および他のデフォルトパラメーターは、合理的なマップを生成した。しかし、３００ ＋ ０ｂｐ、３００ ＋ １ｂｐおよび３７８ａ ＋ ０ｂｐに関しては、上記デフォルト設定は、壊れた密度の領域を有するノイズの多いマップを生成した。マップの質を改善するために、本発明者らは、アニーリング温度を１０００℃へと低減し、省略した領域からバルク溶媒マスクを排除した。このタイプのコンポジットオミットマップは、Ｐｏｌｄｅｒマップとして公知であり、溶媒マスクがより弱い密度を不明瞭にすることから防止する（３２）。

ＰＤＢにおける既知のＲＮＡループ構造との比較
本発明者らのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡループモデルに対して構造的類似性を有するＰＤＢの中のＲＮＡループを同定するために、本発明者らは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ尖端接合部およびループの座標を最初に抽出した。検索ツールは、上記の足場結晶化を同定するために使用されるＲＮＡ構造の同じセットであった。ＰＤＢセットからの各構造に関して、本発明者らは、ＤＳＳＲを使用して、全てのヘアピンループを同定した。本発明者らは、ＲＮＡ配列を各ヘアピンループから抽出し、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列より短いループを排除した。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡより長いループに関しては、本発明者らは、同じ長さを有するループの全てのフラグメントを得るために、スライディングウインドウを使用した。次いで、各ループ配列を、Ｒｏｓｅｔｔａ（３３）において「ｒｎａ＿ｔｈｒｅａｄ」ルーチンを使用して、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡモデルに対してスレッド化した。ＰｙＭＯＬスクリプトを使用して、本発明者らは、得られたスレッド化モデルを元のヘアピンループに整列させ、その２つのモデルの間でＲＭＳＤを計算した。本発明者らは、全てのＰＤＢ構造からＲＭＳＤデータを集計およびソートして、小さなＲＭＳＤを有するループを手動で精査して、構造的類似性を有するヒットを見出した。

光学的融解
光学的融解実験のためのＲＮＡを、合成ＤＮＡテンプレートからインビトロで転写した（ＩＤＴ）。使用したオリゴヌクレオチドテンプレート配列は、以下であった：

（Ｔ７プロモーターを斜体で、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ接合部／ループセグメントを太字で示す）。
テンプレートを、Ｔ７プロモーターに相補的な第２鎖とアニールし、上記に記載されるとおりの大規模（１０ｍＬ）転写反応に添加した。反応物をエタノール沈殿させ、２０％ ポリアクリルアミド変性ゲルで精製した。その所望のバンドを、ＵＶシャドウイングによって回収した。ゲル抽出後、サンプルを、水へと緩衝液交換し、Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターデバイスで濃縮した。

各ＲＮＡに関しては、６つの希釈物のセットを、初期吸光度が約１．０～０．１ ＡＵの範囲に及ぶように、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ カコジル酸ナトリウム ｐＨ ７．０中に調製した。上記サンプルを、９５℃へと１分間加熱し、氷上で急速冷却することによってアニールし、続いて、１２℃へと平衡化した。融解測定を、ペルチェ素子タイプ（Ｐｅｌｔｉｅｒ－ｔｙｐｅ）の温度制御サンプルチェンジャーを装備したＣａｒｙ Ｂｉｏ３００ ＵＶ可視分光光度計で行った。ＲＮＡを１２℃から９２℃へと、０．８℃／分の速度で加熱する間に、２６０ｎｍでの吸光度を記録した。融解曲線を、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ， バージョン７）を使用して分析し、以下の式にフィットさせた：

（ここで吸光度（Ａ）は、温度（Ｔ）の関数として近似される。エントロピーの変化（ΔＳ）およびエンタルピーの変化（ΔＨ）を、２本鎖

および１本鎖

の両方の直線状の領域に関する傾き（ｍ）およびｙ切片（ｂ）と同様にフィットさせた）。次いで、３７℃での融解温度および熱力学的パラメーターを、これらのパラメーターから導出した（表２）。

電気泳動移動度シフトアッセイ
ヒトヘム結合Ｒｈｅｄタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて過剰発現させ、以前に記載される（２５）ように、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製した。放射性標識したｐｒｉ－ｍｉＲＮＡステム－ループ（図８ｂ～ｉ）を、インビトロ転写によって調製した。ＤＮＡテンプレートは、所望の配列とＴ７プロモーターを網羅するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなり、センスオリゴとＴ７プロモーター配列とにアニールさせた（３４）。各２０μＬの転写反応物は、５０ｆｍｏｌ テンプレート、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、４ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ スペルミジン、２μｇ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、０．５ｍＭ ＡＴＰ、３ｍＭ ＵＴＰ、ＣＴＰ、およびＧＴＰの各々、ならびに３ｎｍｏｌ α－^３２Ｐ－ＡＴＰ（１０μＣｉ）を含んだ。転写を、３７℃で２時間実行し、そのＲＮＡを変性１５％ ポリアクリルアミドゲルで精製した。そのＲＮＡを４℃において一晩、ＴＥＮ緩衝液中で抽出し、イソプロパノール沈殿させ、４０μＬ 水に再懸濁した。

本発明者らは、近年報告されたＥＭＳＡ手順を採用して、Ｒｈｅｄ－ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ相互作用を調べた（３５）。ＲＮＡを、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０中に希釈し、９０℃において１分間加熱し、続いて、氷上で急速冷却した。アニールしたＲＮＡを、１０％ （ｖ／ｖ） グリセロール、０．１ｍｇ／ｍｌ 酵母ｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、５μｇ／ｍｌ ヘパリン、０．０１％ （ｖ／ｖ） オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０）、０．２５ユニット ＲＮａｓｅ－ＯＵＴリボヌクレアーゼインヒビター、キシレンシアノール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０、および０～２０μＭ Ｒｈｅｄタンパク質を含む結合反応物に添加した。その溶液の最終塩濃度は、１５０ｍＭ ＮａＣｌであった。結合反応物を、室温において３０分間インキュベートし、その後、１０％ ポリアクリルアミドゲルに載せた。ゲルおよび泳動緩衝液の両方が、８０ｍＭ ＮａＣｌ、８９．２ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、および８９．０ｍＭ ホウ酸（最終ｐＨ ８．２）を含んだ。ゲルを、１１０Ｖで４５分間、４℃において泳動させ、次いで乾燥させ、ストレージホスホスクリーン（ｓｔｏｒａｇｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒ ｓｃｒｅｅｎ）に曝した。スクリーンを、引き続いて、Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でスキャンした。遊離ＲＮＡおよび結合ＲＮＡのバンドを、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用して定量し、ＰｒｉｓｍにおいてＨｉｌｌの式とフィットさせた。

分子動力学シミュレーション
ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ残基と足場のＰ２ステムからの２個のＧ－Ｃ対に相当する座標を、各結晶構造から抽出した。水素を、ＧＲＯＭＡＣＳにおけるモデルに追加し（３６）、ＲＮＡを、ＴＩＰ３Ｐ 水分子を有する先端を切った十二面体ボックスの中で溶解した。そのボックスは、ＲＮＡを、それ自体の任意の定期的コピーから少なくとも１ｎｍ離して配置するために十分に大きかった。次に、Ｋ^＋イオンおよびＣｌ^－イオンを、上記システムに添加して、正味の電荷を中和し、最終ＫＣｌ濃度 ０．１Ｍを与えた。ＣＨＡＲＭＭ２７力場、Ｖｅｒｌｅｔカットオフスキーム、および粒子－メッシュエバルト静電気（ｐａｒｔｉｃｌｅ－ｍｅｓｈ Ｅｗａｌｄ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓ）を、全ての計算に使用した。上記システムを、任意の原子に作用する最大の力が９００ｋＪ／ｍｏｌ／ｎｍ未満になるまでエネルギーを最小化した。上記システムの最終の位置エネルギー(ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｅｎｅｒｇｙ)は、－１．３×１０^５ｋＪ／ｍｏｌの範囲にあった。

次に、上記システムを、２工程において、先ずＮＶＴアンサンブル中で、次いで、ＮＰＴアンサンブル中で最初に平衡化した。両方の平衡化シミュレーションを、２－ｆｓ時間工程を使用して、３００Ｋで２ｎｓにわたって実行した。ＮＶＴの間に、温度を、速度リスケーリングによって制御した。ＮＰＴに関しては、Ｐａｒｒｉｎｅｌｌｏ－Ｒａｈｍａｎ圧調節器（ｂａｒｏｓｔａｔ）を使用して、圧力を１バールで維持した。生成ＭＤ実行に関しては、位置拘束を、足場からのＧ－Ｃ対に適用し、全てのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡヌクレオチドを非拘束とした。全ての生成シミュレーションを、ＮＰＴにおいて２－ｆｓ時間工程で合計１μｓにわたって実行した。ＧＲＯＭＡＣＳにおいてｒｍｓｆおよびクラスター化機能を使用して軌跡を分析した。

ｐｒｉ－ｍｉＲ－２２３ハイスループットプロセシングアッセイの再分析
ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ－２２３に関して以前に報告したプロセシングアッセイからの配列決定データを、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅａｄ Ａｒｃｈｉｖｅ（アクセッション番号： ＳＲＡ０５１３２３）からダウンロードした（５）。ｐｒｉ－ｍｉＲ－２２３に相当するリードを、Ｂｏｗｔｉｅ２を使用して整列させた（３７）。未知のヌクレオチドを含む任意のリードを、排除した。入力または選択ライブラリーからのリードを、それらの相当するバーコードによって分離し、Ｐｙｔｈｏｎで計数した。

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37. Langmead, B. and S.L. Salzberg, Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods, 2012. 9: 357-9.

結論
これは、本発明の好ましい実施形態の説明を結論づける。本発明の１またはこれより多くの実施形態の前述の説明は、例証および説明の目艇で示されている。本発明を網羅する、または開示される正確な形態に限定することは意図されない。多くの改変およびバリエーションは、上記の教示に照らして可能である。

本明細書で引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的のためにそれらの全体において本明細書に参考として援用される。

Claims (20)

1. ＧＧＵＵＧＣＣＧＡＡＵＣＣＧＡＡＡＧＧＵＡＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵＵＧＧＧＧＵＵＡＡＵＣＵＧＣＡＧＵＧＡＡＧＣＵＧＣＡＧＵＡＧＧＧＡＵＡＣＣＵＵＣＵＧＵＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＣＡＧＣＵＡＡＣＵＣＣＧＧＡＧＧＣＡＡＵＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧ（配列番号１）と少なくとも９０％の配列同一性を有するリボ核酸を含む、ＲＮＡ構造を観察するための組成物であって、ここで前記リボ核酸の残基１４～１７（ＧＡＡＡ）は、長さが４～３３ヌクレオチドの間である核酸の異種セグメントで置き換えられる、組成物。
2. 前記リボ核酸に結合する薬剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記薬剤は、前記リボ核酸にハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項２に記載の組成物。
4. 前記核酸の異種セグメントは、天然に存在するＲＮＡ分子においてループ構造を形成する、請求項１に記載の組成物。
5. 前記核酸の異種セグメントは、完全なループ構造を含む、請求項４に記載の組成物。
6. ＲＮＡ構造を観察するためのシステム／キットであって、
   ＧＧＵＵＧＣＣＧＡＡＵＣＣＧＡＡＡＧＧＵＡＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵＵＧＧＧＧＵＵＡＡＵＣＵＧＣＡＧＵＧＡＡＧＣＵＧＣＡＧＵＡＧＧＧＡＵＡＣＣＵＵＣＵＧＵＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＣＡＧＣＵＡＡＣＵＣＣＧＧＡＧＧＣＡＡＵＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧ（配列番号１）と少なくとも９０％の同一性を有するリボ核酸をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミド、
   を含む、システム／キット。
7. 前記リボ核酸を発現させるためのプロモーターをさらに含む、請求項６に記載のシステム／キット。
8. ＲＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項７に記載のシステム／キット。
9. 前記プラスミド中の核酸のストレッチにハイブリダイズする１またはこれより多くのプライマーをさらに含む、請求項６に記載のシステム／キット。
10. リボ核酸の構造に関する情報を得る方法であって、前記方法は、
    配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するリボ核酸を得る工程；
    配列番号１におけるループ残基１４～１７（ＧＡＡＡ）に対応する残基を、融合リボ核酸分子を形成するように、長さが４～３３ヌクレオチドの間である核酸の異種セグメントで置換する工程；
    前記融合リボ核酸分子を結晶化する工程；
    Ｘ線または電子結晶学の技術を前記融合リボ核酸分子に対して行う工程；および
    前記核酸の異種セグメントの構造に関する情報が得られるように、前記Ｘ線または電子結晶学の技術の結果を観察する工程、
    を包含する方法。
11. 前記融合リボ核酸分子は、前記結晶学の分析の前に、前記リボ核酸に結合する薬剤と合わされる、請求項１０に記載の方法。
12. 前記薬剤は、前記リボ核酸にハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記結晶学の分析は、前記リボ核酸に結合する薬剤を欠くコントロールサンプルとの比較を含む、請求項１１に記載の方法。
14. 複数の融合リボ核酸分子は、前記Ｘ線または電子結晶学の技術の前に、前記リボ核酸に結合する複数の薬剤と合わされる、請求項１１に記載の方法。
15. 少なくとも２種の薬剤が、前記融合リボ核酸分子と合わされる、請求項１４に記載の方法。
16. ポリヌクレオチドに対して結晶学の分析を行う方法であって、前記方法は、
    （ａ）第１のポリヌクレオチドを選択する工程であって、ここで前記第１のポリヌクレオチドは、第１のｍｉＲＮＡのポリヌクレオチド配列を含む工程；
    （ｂ）前記第１のｍｉＲＮＡにおける第１のループ領域を形成するポリヌクレオチドのセグメントを同定する工程；
    （ｃ）第２のポリヌクレオチドを選択する工程であって、ここで前記第２のポリヌクレオチドは、第２のｍｉＲＮＡのポリヌクレオチド配列を含む工程；
    （ｄ）前記第２のｍｉＲＮＡにおける第１のループ領域を形成するポリヌクレオチドのセグメントを同定する工程；
    （ｅ）前記第１のポリヌクレオチド上の前記第１のループ領域を含む前記ポリヌクレオチドのセグメントが、前記第２のポリヌクレオチド上の前記第１のループ領域を含む前記ポリヌクレオチドのセグメントで置換されるように構築された融合ポリヌクレオチドを形成する工程；および
    （ｆ）前記融合ポリヌクレオチドの三次元構造を観察するために、前記融合ポリヌクレオチドを結晶学的に分析する工程；
    を包含し、その結果、前記ポリヌクレオチドの結晶学の分析が行われ、
    ここで、前記第１のｍｉＲＮＡは、ＧＧＵＵＧＣＣＧＡＡＵＣＣＧＡＡＡＧＧＵＡＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵＵＧＧＧＧＵＵＡＡＵＣＵＧＣＡＧＵＧＡＡＧＣＵＧＣＡＧＵＡＧＧＧＡＵＡＣＣＵＵＣＵＧＵＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＣＡＧＣＵＡＡＣＵＣＣＧＧＡＧＧＣＡＡＵＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧ（配列番号１）と少なくとも９０％の配列同一性を有するｍｉＲＮＡである、方法。
17. 請求項１６に記載の方法であって、ここで前記リボ核酸の残基１４～１７（ＧＡＡＡ）は、長さが４～３３ヌクレオチドの間である前記第２のポリヌクレオチド上の前記第１のループ領域を含む核酸の異種セグメントで置き換えられる、方法。
18. 前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を含む；および／または
    前記第２のｍｉＲＮＡは、ヒトｍｉＲＮＡを含む、
    請求項１７に記載の方法。
19. 前記結晶学の分析は、Ｘ線または電子結晶学の技術である、請求項１７に記載の方法。
20. 前記結晶学の分析は、前記融合ポリヌクレオチドに結合する薬剤の存在下で行われる、請求項１７に記載の方法。
    
    

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