JP7420339B2 - Mutant norovirus particles and their production method - Google Patents
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Description
本発明は、ワクチンに関する発明であり、さらに具体的には、生ワクチンとしての優れた免疫付与能を有しながらも新生ウイルスを産生せず、少なくともノロウイルスに対する免疫付与能を有し、さらに他の病原体に対する免疫付与能を与えることが可能な弱毒化生ウイルスワクチン、その有効成分、及びその有効成分の生産方法についての発明である。 The present invention relates to vaccines, and more specifically, although it has excellent immunizing ability as a live vaccine, it does not produce new viruses, has the ability to immunize at least against norovirus, and This invention relates to an attenuated live virus vaccine capable of conferring immunity against pathogens, an active ingredient thereof, and a method for producing the active ingredient.
エドワード・ジェンナーの天然痘ワクチンの発明と、ルイ・パスツールによる理論的な裏付けがなされて以来、様々な感染症に対するワクチンが提供されている。 Since Edward Jenner's invention of the smallpox vaccine and its theoretical support by Louis Pasteur, vaccines against a variety of infectious diseases have been available.
ワクチンは、毒性を弱めたウイルス等の病原微生物を免疫原として用いる「生ワクチン」、殺傷した病原微生物の全部又は一部を免疫原として用いる「不活化ワクチン」、変性させた病原体の産生する毒素を免疫原として用いる「トキソイド」、に大別されている。 Vaccines include "live vaccines" that use pathogenic microorganisms such as viruses with weakened virulence as immunogens, "inactivated vaccines" that use all or part of killed pathogenic microorganisms as immunogens, and toxins produced by denatured pathogens. They are broadly classified into "toxoids," which are used as immunogens.
これらの中でも生ワクチンは、液性免疫と共に、強い細胞性免疫を誘導することが可能であり、かつ、一般的に免疫も長期にわたり保持されることが知られている。しかしながら、生ワクチンは、弱毒化されているとはいえ自己増殖可能な生きた微生物を使用するので、極めて稀であっても、突然変異や強毒株との遺伝子組換えにより毒力が強い微生物に先祖返りする(強毒復帰)可能性がある。従って、生ワクチンに使用される微生物は安定で、強毒復帰しない性質を持っているものが求められる。特にウイルスの生ワクチンの場合は、宿主細胞内でウイルスが複製増殖する過程で、遺伝子変異、遺伝子組換えが起き、強毒復帰する。現在、生ワクチンは、ＢＣＧ、麻疹・風疹混合（ＭＲ）、麻疹（はしか）、風疹、水痘、流行性耳下腺炎（おたふくかぜ）、ロタウイルス、黄熱等、限定された範囲で用いられている。さらに生ワクチンは、強毒復帰しなくても、ヒトの個体差によって、ワクチンとして用いた微生物が毒力を発揮する場合があり、その接種には慎重な対応が求められている。 Among these, live vaccines are capable of inducing strong cellular immunity as well as humoral immunity, and are generally known to maintain immunity for a long period of time. However, live vaccines use living microorganisms that are attenuated but capable of self-replication, so even if it is extremely rare, microorganisms that are highly virulent due to mutation or genetic recombination with highly virulent strains. There is a possibility of a relapse (highly toxic reversion). Therefore, microorganisms used in live vaccines are required to be stable and have the property of not reverting to virulent virulence. In particular, in the case of live virus vaccines, genetic mutations and genetic recombination occur during the replication and propagation process of the virus within host cells, resulting in reversion to virulent virulence. Currently, live vaccines are used in a limited number of cases, including BCG, measles-rubella (MR), measles, rubella, chickenpox, mumps, rotavirus, and yellow fever. ing. Furthermore, even if live vaccines do not return to high toxicity, the microorganisms used as vaccines may exhibit virulence depending on individual differences among humans, so careful handling is required when administering live vaccines.
これらの事項は、非特許文献１等に記載されている。
These matters are described in
上記のように、生ワクチンは優れた免疫誘導作用を有する反面、その性質上必然的ともいえる問題点が存在する。本発明は、新生ウイルスを産生不可能な弱毒変異の導入により、この問題点を抜本的に解決する手段を、少なくともノロウイルスを対象として、提供する発明である。 As mentioned above, although live vaccines have excellent immunity-inducing effects, they also have problems that are inevitable due to their nature. The present invention provides a means for fundamentally solving this problem, targeting at least norovirus, by introducing an attenuated mutation that makes it impossible to produce a new virus.
ノロウイルスは、カリシウイルス科ノロウイルス属ノーウォークウイルス種のウイルスであり、直径約３８ｎｍの正二十面体構造を有する球形のＲＮＡウイルスである。ノロウイルスには、５つの遺伝子グループが知られており、ＧＩ（９種類）、ＧＩＩ（１９種類）、ＧＩＶ（１種類）がヒトに感染するノロウイルスである。ノロウイルスは宿主特異性が高く、ヒトに感染するウイルスはヒト以外に感染できず、ネズミなど動物に感染するノロウイルスはヒトに感染できない。 Norovirus is a virus of the Norwalk virus species in the Caliciviridae family, Norovirus genus, and is a spherical RNA virus having a regular icosahedral structure with a diameter of about 38 nm. Five gene groups are known for noroviruses, and GI (9 types), GII (19 types), and GIV (1 type) are noroviruses that infect humans. Noroviruses are highly host-specific; viruses that infect humans cannot infect anyone other than humans, and noroviruses that infect animals such as mice cannot infect humans.
ノロウイルスゲノムは、７５００－８０００塩基のsingle stranded positive sense ＲＮＡであり、３つのＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を有しており（ネズミノロウイルスの場合、４つのＯＲＦを有している。ＯＲＦ４は、ＶＦ１という非構造タンパク質をコードしている）、ＯＲＦ１にプロテアーゼやポリメラーゼ等の非構造タンパク質がコードされており、ＯＲＦ２、３に構造タンパク質がコードされている。ＯＲＦ２がコードする構造タンパク質はＶＰ１であり、ＯＲＦ２を発現させると、ＶＰ１が１８０個集まったウイルス様中空粒子（ＶＬＰ）が形成される。これに対してＯＲＦ３がコードするＶＰ２は分子量２２．４ｋＤａ程度で、ウイルス粒子中に複数個存在し、ウイルス粒子の安定性に寄与すると考えられているが、その詳細は分かっていない。 The norovirus genome is a single stranded positive sense RNA of 7,500 to 8,000 bases and has three ORFs (open reading frames) (in the case of murine norovirus, it has four ORFs. ORF4 is called VF1). ORF1 encodes nonstructural proteins such as protease and polymerase, and ORF2 and ORF3 encode structural proteins. The structural protein encoded by ORF2 is VP1, and when ORF2 is expressed, a virus-like hollow particle (VLP) containing 180 VP1 molecules is formed. On the other hand, VP2 encoded by ORF3 has a molecular weight of about 22.4 kDa, exists in multiple numbers in a virus particle, and is thought to contribute to the stability of the virus particle, but the details are not known.
本発明者らは、このＯＲＦ３ないしＶＰ２の機能の検討を行った。この機能の検討の内容は後述するが、結論としては、ノロウイルスゲノム上のＯＲＦ３（ＶＰ２コード領域）の３’側 の塩基配列には、ゲノムの複製に必須な塩基配列があることを明らかにした。さらに、ＯＲＦ３は、核酸配列として必須な領域の直前まで（（ＯＲＦ３を三等分すると、ＯＲＦ３の開始コドンから約２／３の領域）は、その全てを欠損させたり、ＶＰ２タンパク質（以下、特に断らない限り、ＶＰ２と略記する）を供給できなくなるような変異を導入したり、外来性遺伝子に置き換えた遺伝子改変ノロウイルスゲノムであっても、ＶＰ２を細胞内に別途供給すれば、遺伝子改変ノロウイルスゲノムを内包した新生ウイルス粒子を産生可能であることを見出した。 The present inventors investigated the functions of ORF3 to VP2. The details of the study on this function will be described later, but the conclusion is that the nucleotide sequence on the 3' side of ORF3 (VP2 coding region) on the norovirus genome contains a nucleotide sequence that is essential for genome replication. . Furthermore, ORF3 can be completely deleted up to just before the essential region as a nucleic acid sequence ((about 2/3 region from the start codon of ORF3 if ORF3 is divided into three equal parts), or the VP2 protein (hereinafter, especially Even if a genetically modified norovirus genome has been introduced with a mutation that makes it unable to supply VP2 (unless otherwise specified, it will be abbreviated as VP2) or has been replaced with a foreign gene, if VP2 is separately supplied into cells, the genetically modified norovirus genome can be used. We discovered that it is possible to produce new virus particles containing .
この遺伝子改変ノロウイルスゲノムを内包した新生ノロウイルス粒子（ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｇｅｎｙ ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ：ＭＰＮＶ）は、野生型ノロウイルスと同様の感染力は保持されるが、一旦通常の標的細胞に感染して細胞内に遺伝子改変ゲノムを放出すると、ＶＰ２を除くウイルスタンパク質の翻訳、遺伝子改変ノロウイルスゲノムの複製は起きるが、新生ウイルスを産生する能力を持たず、一度だけ感染可能な弱毒化ウイルス（いわば半生ウイルス）であることが明らかになった。つまり、感受性細胞、自然宿主内標的細胞に感染することができ、自然感染と同様のウイルス抗原（ＶＰ２を除く）を発現し、あらゆる免疫を誘導可能であるが、新生ウイルスを産生して感染と増殖を繰り返すことはなく、病原性を発揮しない、極めて高度に弱毒化されたウイルスである。更に、外来性遺伝子を導入したのであれば、それに対する免疫賦活能力も有する弱毒化生混合ワクチン（多価ワクチン）となり得ることを明らかにした。 The new norovirus particles (mutant progeny norovirus: MPNV) containing this genetically modified norovirus genome maintain the same infectivity as wild-type norovirus, but once they infect normal target cells, they do not carry the genetically modified genome into the cells. When released, translation of viral proteins except VP2 and replication of the genetically modified norovirus genome occur, but it is clear that it is an attenuated virus (semi-living virus) that does not have the ability to produce new viruses and can be infected only once. became. In other words, it can infect susceptible cells and target cells in the natural host, express the same viral antigens as in natural infection (except for VP2), and be able to induce all kinds of immunity, but it can produce new viruses and prevent infection. It is an extremely highly attenuated virus that does not reproduce and is not pathogenic. Furthermore, it was revealed that if a foreign gene is introduced, it can be used as an attenuated live combination vaccine (multivalent vaccine) that also has the ability to stimulate immunity against the foreign gene.
すなわち本発明は、完全なＶＰ２タンパク質を産生できなくする変異が導入されたノロウイルスゲノム、を保有するノロウイルス粒子であって、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを産生しないノロウイルス粒子（ＭＰＮＶ）、を有効成分として含有する、ノロウイルス用の弱毒化生ワクチン（以下、本発明の生ワクチンともいう）を提供する発明である。 In other words, the present invention provides a norovirus particle (MPNV) that has a norovirus genome into which a mutation that makes it unable to produce a complete VP2 protein has been introduced, and that does not produce a new virus while retaining the ability to infect once. This invention provides an attenuated live vaccine for norovirus (hereinafter also referred to as the live vaccine of the present invention) containing as an active ingredient.
上記の通りに、当該ＭＰＮＶは、本発明の生ワクチンの有効成分である。本発明は、この有効成分も提供する。 As mentioned above, the MPNV is the active ingredient of the live vaccine of the present invention. The present invention also provides this active ingredient.
本発明の生ワクチンにおける、「完全なＶＰ２タンパク質を産生できなくするゲノムの変異」は、例えば、ノロウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム３（ＯＲＦ３）の開始コドンからＯＲＦ３の約２／３以内の領域であって、当該領域の欠損を含むノロウイルス粒子は、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを産生しないゲノム領域；
の全てが欠損しているか、又は、当該ゲノム領域にＶＰ２を実質的に産生できなくなる変異である。
In the live vaccine of the present invention, the "genome mutation that makes it impossible to produce the complete VP2 protein" is, for example, a region within about two-thirds of ORF3 from the start codon of open reading frame 3 (ORF3) of the norovirus genome. Therefore, norovirus particles containing a deletion in this region have a genomic region that does not produce new viruses while retaining the ability to infect once;
Either all of these are deleted, or there is a mutation in the genome region that makes it substantially impossible to produce VP2.
以下、上記の「ノロウイルスゲノムのＯＲＦ３の開始コドンからＯＲＦ３の約２／３以内の領域であって、当該領域の欠損を含むノロウイルス粒子は、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを産生しない」ゲノム領域を、「ＯＲＦ３特定領域」ともいう。 Hereinafter, we will discuss the above-mentioned "region within approximately two-thirds of ORF3 from the start codon of ORF3 in the norovirus genome, and norovirus particles that contain deletions in this region will not produce new viruses while retaining one-time infectivity." ” genome region is also referred to as “ORF3 specific region”.
上記の「ＯＲＦ３特定領域に導入されたＶＰ２を実質的に産生できなくなる変異」において、「ＶＰ２を実質的に産生できなくなる」とは、ＶＰ２を全く産生できないことを含む。そしてさらに、ＶＰ２を外形上産生できても、当該ＶＰ２は導入された変異によってＶＰ２本来の働きをすることができないこと、すなわち、当該変異ＶＰ２を産生するノロウイルスは、感染能力を保持しつつ新生ウイルスを産生しないことも含まれる。そのようなＯＲＦ３特定領域における変異は、ＯＲＦ３特定領域の欠損、ＯＲＦ３特定領域の開始コドンの欠損変異、ＯＲＦ３特定領域の開始コドン下流における一箇所又は二箇所以上、好ましくは近接した二箇所以上のストップコドンの導入、又は、１５塩基以上のＯＲＦ特定領域の部分欠損である。当該部分欠損は、１８塩基以上であることが好ましい。ストップコドンの導入に関し、「近接した二箇所以上のストップコドン」は、当該個数のストップコドンを連続させて設けるか、ストップコドン同士の間に１－３個、好ましくは１個の他のコドンを挟み込むこと等が例示される。 In the above-mentioned "mutation introduced into the ORF3 specific region that makes it substantially incapable of producing VP2", "incapable of substantially producing VP2" includes being unable to produce VP2 at all. Furthermore, even if VP2 can be produced in appearance, the VP2 cannot function as VP2 due to the introduced mutation. In other words, the norovirus that produces the mutated VP2 can be used as a new virus while retaining its infectivity. This also includes not producing. Such mutations in the ORF3 specific region include deletion of the ORF3 specific region, deletion mutation of the start codon of the ORF3 specific region, stop at one or more locations downstream of the start codon of the ORF3 specific region, preferably at two or more adjacent locations. This is the introduction of a codon or a partial deletion of a specific ORF region of 15 bases or more. The partial deletion is preferably 18 bases or more. Regarding the introduction of stop codons, "two or more stop codons in close proximity" means that the relevant number of stop codons are provided consecutively, or that 1-3, preferably one other codon is inserted between the stop codons. An example is pinching.
さらに、ＯＲＦ３特定領域に、ノロウイルス以外のウイルス（以下、外来ウイルスともいう）の１種又は２種以上のタンパク質をコードする遺伝子を１種又は２種以上組み込むことも可能である。外来ウイルスのタンパク質は、構造タンパク質であっても、非構造タンパク質であってもよい。また、外来ウイルスの種類は特に限定されないが、ノロウイルスと同じく腸管感染性のウイルスであることが好ましい。このような外来ウイルスのタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだＯＲＦ３を有するＭＰＮＶは、ノロウイルスに対する免疫と共に、上記外来ウイルスに対する免疫を付与することのできる、多価の弱毒化生ワクチンの有効成分である。 Furthermore, it is also possible to incorporate one or more genes encoding one or more proteins of viruses other than norovirus (hereinafter also referred to as foreign viruses) into the ORF3 specific region. The protein of the foreign virus may be a structural protein or a non-structural protein. Further, the type of foreign virus is not particularly limited, but it is preferably a virus that infects the intestinal tract, like norovirus. MPNV, which has ORF3 that incorporates a gene encoding a protein of such a foreign virus, is an active ingredient of a multivalent live attenuated vaccine that can confer immunity against norovirus as well as the above-mentioned foreign viruses.
加えて本発明は、本発明の生ワクチンの有効成分であるＭＰＮＶの生産方法を提供する。 In addition, the present invention provides a method for producing MPNV, which is the active ingredient of the live vaccine of the present invention.
すなわち本発明は、下記（１）及び（２）をノロウイルス感受性細胞中に共発現させ、当該共発現により生成したノロウイルス粒子を回収する、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを生成しない、変異ノロウイルス粒子の生産方法（以下、本発明の生産方法ともいう）を提供する。
（１）ノロウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム３（ＯＲＦ３）の開始コドンからＯＲＦ３の約２／３以内の領域であって、当該領域の欠損を含むノロウイルス粒子は、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを産生しない、
の全てが欠損しているか、又は、当該ゲノム領域にＶＰ２を実質的に産生できなくなる変異が導入されている、改変ＯＲＦ３を含むノロウイルスゲノム；
（２）ＶＰ２をコードする遺伝子。
That is, the present invention co-expresses the following (1) and (2) in norovirus-susceptible cells, collects the norovirus particles generated by the co-expression, maintains one-time infection ability and does not generate new viruses, A method for producing mutant norovirus particles (hereinafter also referred to as the production method of the present invention) is provided.
(1) A region within approximately two-thirds of ORF3 from the start codon of open reading frame 3 (ORF3) of the norovirus genome, and norovirus particles that contain deletions in this region retain the ability to infect one-time while reproducing. does not produce viruses,
Norovirus genome containing a modified ORF3 in which all of the above are deleted or a mutation has been introduced into the genomic region that makes it substantially unable to produce VP2;
(2) Gene encoding VP2.
本発明により、ノロウイルスに対する弱毒化生ワクチンが提供される。当該弱毒化生ワクチンは、対ノロウイルス以外のウイルスに対しても免疫を付与することが可能な、多価ワクチンとして用いることも可能である。また、本発明は、当該弱毒化生ワクチンの有効成分となる遺伝子改変ノロウイルスゲノムを内包した新生ノロウイルス粒子（ＭＰＮＶ）の生産方法を提供する。 The present invention provides a live attenuated vaccine against norovirus. The attenuated live vaccine can also be used as a multivalent vaccine that can confer immunity to viruses other than norovirus. The present invention also provides a method for producing a new norovirus particle (MPNV) containing a genetically modified norovirus genome, which is an active ingredient of the attenuated live vaccine.
本発明の生ワクチンは、ヒトが主要な対象であり、その他基礎試験用としてマウス等が挙げられる。 The main target for the live vaccine of the present invention is humans, and other animals such as mice can be used for basic testing.
本発明の生ワクチンをヒトに用いる場合には、ノロウイルスもヒトノロウイルスを用いることが必要である。しかしながら、ＯＲＦ３の構造と機能はヒトもマウスも共通するものであり、マウスノロウイルスのＯＲＦ３特定領域における知見をヒトノロウイルスのＯＲＦ３特定領域に対応させることにより、ヒトノロウイルスのＯＲＦ３特定領域における「ＶＰ２を実質的に産生できなくなる」遺伝子改変の内容を類推することが可能である。 When using the live vaccine of the present invention in humans, it is necessary to use human norovirus as the norovirus. However, the structure and function of ORF3 are common to both humans and mice, and by correlating the findings in the ORF3 specific region of mouse norovirus to the ORF3 specific region of human norovirus, it was found that VP2 in the ORF3 specific region of human norovirus is essentially It is possible to analogize the nature of genetic modification that results in the inability to produce biologically.
本発明の生ワクチンを多価ワクチンとして用いる場合に、ＯＲＦ３特定領域に組み込むノロウイルス由来のタンパク質以外の微生物タンパク質（他の微生物タンパク質ともいう）の出所となる微生物は、ワクチンの有効成分となるタンパク質を保有する微生物であれば特に限定されず、ウイルス、細菌等が例示できる。 When the live vaccine of the present invention is used as a multivalent vaccine, the microorganism that is the source of microbial proteins (also referred to as other microbial proteins) other than the norovirus-derived proteins incorporated into the ORF3 specific region must contain the proteins that are the active ingredients of the vaccine. It is not particularly limited as long as it is a microorganism that it possesses, and examples include viruses and bacteria.
上記ウイルスは特に限定されず、ＤＮＡウイルスであっても、ＲＮＡウイルスであっても、レトロウイルスであってもよい。例えば、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス（ムンプスウイルス）、水痘ウイルス、黄熱病ウイルス、ロタウイルス、帯状疱疹ウイルス（ヘルペスウイルス）、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、日本脳炎ウイルス、肝炎ウイルス（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎等）、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、エボラウイルス等の現在ワクチンが提供されている感染症の病原ウイルスだけではなく、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）等のワクチンが提供されていない感染症の病原ウイルスも含めて挙げられる。これらのウイルスの構造タンパク質又は非構造タンパク質の全部又は一部を選択して「他の微生物タンパク質」として、それをコードする遺伝子をＯＲＦ３特定領域に組み込むことにより、ノロウイルスに対する免疫と共に、所望の他のウイルスの免疫を行うことが可能な多価ワクチンの有効成分としてのＭＰＮＶとすることができる。これらの他のウイルスの中でも、ノロウイルスと同じ腸管感染性のウイルスとすることが好適である。具体的には、ロタウイルス、サポウイルス、アストロウイルス等が例示できる。 The above-mentioned virus is not particularly limited, and may be a DNA virus, an RNA virus, or a retrovirus. For example, poliovirus, measles virus, rubella virus, mumps virus, varicella virus, yellow fever virus, rotavirus, herpes zoster virus, influenza virus, rabies virus, Japanese encephalitis virus. , hepatitis viruses (hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, etc.), human papillomavirus, HIV, Ebola virus, and other infectious diseases for which vaccines are currently available, as well as respiratory syncytial virus (RSV), etc. This includes viruses that cause infectious diseases for which no vaccines are available. By selecting all or part of the structural or non-structural proteins of these viruses and incorporating the gene encoding them into the ORF3 specific region, we can provide immunity against norovirus as well as other desired proteins. MPNV can be used as an active ingredient of a multivalent vaccine capable of immunizing against viruses. Among these other viruses, it is preferable to use a virus that infects the intestinal tract like norovirus. Specific examples include rotavirus, sapovirus, and astrovirus.
上記細菌は特に限定されず、結核菌、百日咳菌、ジフテリア菌、破傷風菌、肺炎双球菌、肺炎球菌、インフルエンザ菌ｂ型、髄膜炎菌、腸チフス菌、コレラ菌等が挙げられる。これらの菌体の構成タンパク質の全部又は一部を選択して「他の微生物タンパク質」として、それをコードする遺伝子をＯＲＦ３特定領域に組み込むことにより、ノロウイルスに対する免疫と共に、所望の細菌の免疫を行うことが可能な多価ワクチンの有効成分としてのＭＰＮＶとすることができる。 The above-mentioned bacteria are not particularly limited, and include Mycobacterium tuberculosis, Bordetella pertussis, Bordetella diphtheriae, Clostridium tetani, Diptococcus pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae type b, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, and the like. By selecting all or part of the constituent proteins of these bacterial cells and incorporating the genes encoding them into the ORF3 specific region as "other microbial proteins," immunization against norovirus and desired bacteria can be achieved. MPNV can be used as an active ingredient of a multivalent vaccine that can be used as a multivalent vaccine.
本発明の生ワクチンは、ＶＰ２をコードするＯＲＦ３特定領域に所定の変異を導入したノロウイルスを、ノロウイルス感受性細胞に感染させて、これを培養してノロウイルス粒子を抗原液として取得して、その有効成分とすることができる。これに必要に応じて、緩衝剤、安定剤、保存剤、アジュバント等を添加して、生ワクチンとすることができる。これをバイアル、アンプル、シリンジ等の容器に無菌充填される。その際、必要に応じて凍結乾燥処理を行うことも可能である。 The live vaccine of the present invention is produced by infecting norovirus-susceptible cells with a norovirus in which a predetermined mutation has been introduced into the specific region of ORF3 that encodes VP2, culturing the cells, and obtaining norovirus particles as an antigen solution. It can be done. A live vaccine can be prepared by adding a buffer, a stabilizer, a preservative, an adjuvant, etc., as necessary. This is aseptically filled into containers such as vials, ampoules, and syringes. At that time, it is also possible to perform freeze-drying treatment if necessary.
上述したノロウイルスのＯＲＦ３にコードされるＶＰ２の機能解析を実施するにあたり、ノロウイルスゲノムのうちゲノムの複製と粒子への内包に必要な核酸配列を決定するため、リバースジェネティックスの手法（核酸からウイルスを作り出す技術）を用いて検討を行った。ノロウイルスとしては、ネズミノロウイルス（ｍｕｒｉｎｅ ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ； ＭＮＶ）を用いた。 In carrying out the functional analysis of VP2 encoded by ORF3 of norovirus mentioned above, we used a reverse genetics method (separation of virus from nucleic acid) to determine the nucleic acid sequence of the norovirus genome that is necessary for genome replication and inclusion into particles. We conducted an investigation using the following technology. Murine norovirus (MNV) was used as the norovirus.
ＶＰ２の機能を調べる場合、ＭＮＶの感染性クローンであるプラスミドｐＭＮＶ－Ｆ（完全長の野生型ＭＮＶの遺伝子配列のｃＤＮＡを持ち、細胞内に導入すると野生型ＭＮＶの新生ウイルスを産生可能）のＶＰ２コード領域であるＯＲＦ３に単純に変異を導入することで検討を行った。 When investigating the function of VP2, VP2 of plasmid pMNV-F (contains the cDNA of the full-length wild-type MNV gene sequence and can produce a new wild-type MNV virus when introduced into cells), which is an infectious clone of MNV, is used. The study was conducted by simply introducing mutations into the coding region ORF3.
先ずＯＲＦ３の３'側の領域には、核酸としての機能と、翻訳された後のタンパク質としての機能が重複して存在する可能性が高いため、ＶＰ２の機能とその領域の核酸配列の機能を分けて調べなければならない。ＶＰ２に変異を導入するため、むやみに核酸配列を改変すると、ＶＰ２の機能と核酸配列の機能、どちらの影響で新生ウイルス生成ができなくなるのかを明らかにできない。そこで、ＯＲＦ３に変異を入れた「ｐＭＮＶ－Ｆ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔ」と、野生型のＯＲＦ３だけを発現するベクター「ｐＭＮＶ－ＶＰ２」を調製し、これらをＭＮＶ感受性細胞内に同時導入（コトランスフェクション）して、ｐＭＮＶ－Ｆ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔからＯＲＦ３領域に変異の入ったミュータントＭＮＶゲノムを供給し、同時にｐＭＮＶ－ＶＰ２から野生型のＶＰ２をトランスに供給することで、ＭＰＮＶが作出できるか否かを調べた。さらに、この過程で作出されたＭＰＮＶが、細胞に感染し、再びＭＰＮＶ増殖を行う能力があるのか否かを調べるため、ＶＰ２とＭＮＶレセプターを定常的に発現し続ける細胞株を作出し、それにＭＰＮＶを感染させることで、ウイルスとしての感染増殖能力を検討した。 First, it is highly likely that the 3' region of ORF3 has an overlapping function as a nucleic acid and as a protein after translation. I have to look into it separately. If the nucleic acid sequence is modified indiscriminately to introduce mutations into VP2, it will not be possible to clarify whether the function of VP2 or the function of the nucleic acid sequence is responsible for the inability to generate a new virus. Therefore, we prepared "pMNV-F-ORF3mutant" with a mutation in ORF3 and "pMNV-VP2" which expresses only wild-type ORF3, and introduced them into MNV-susceptible cells simultaneously (co-transfection). We investigated whether MPNV could be produced by supplying a mutant MNV genome with mutations in the ORF3 region from pMNV-F-ORF3mutant and simultaneously supplying wild-type VP2 in trans from pMNV-VP2. Furthermore, in order to investigate whether the MPNV produced in this process has the ability to infect cells and perform MPNV proliferation again, we created a cell line that constantly expresses VP2 and MNV receptor, and By infecting the virus, we examined its ability to infect and reproduce as a virus.
（１）ｐＭＮＶ－Ｆ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔから、ＭＮＶ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔゲノムが転写され、当該遺伝子変異によってＭＮＶ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔゲノムの複製機能が核酸配列レベルで損なわれないのであれば、細胞内にトランスに供給された野生型ＶＰ２の補完によって、当該変異遺伝子を内包したＭＰＮＶが産生される。 (1) If the MNV-ORF3 mutant genome is transcribed from pMNV-F-ORF3 mutant, and the replication function of the MNV-ORF3 mutant genome is not impaired at the nucleic acid sequence level by the gene mutation, the wild By complementation of type VP2, MPNV containing the mutant gene is produced.
（２）ｐＭＮＶ－Ｆ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔから、ＭＮＶ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔゲノムが転写され、当該遺伝子変異によってＭＮＶ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔゲノムの複製機能が核酸配列レベルで損なわれているならば、細胞内にトランスに供給された野生型ＶＰ２が補完されても、当該変異遺伝子を内包したＭＰＮＶは産生されない。 (2) If the MNV-ORF3 mutant genome is transcribed from pMNV-F-ORF3 mutant, and the replication function of the MNV-ORF3 mutant genome is impaired at the nucleic acid sequence level due to the gene mutation, the wild Even if type VP2 is complemented, MPNV containing the mutant gene will not be produced.
（３）さらに（１）で産生されたＭＰＮＶを、ＶＰ２を定常的に発現する、もしくは一過性に発現するＭＮＶ感受性細胞に感染させた場合、再びＭＰＮＶが産生される。 (3) Furthermore, when MPNV produced in (1) is infected with MNV-susceptible cells that constantly or transiently express VP2, MPNV is produced again.
（４）しかし、（１）で産生されたＭＰＮＶを、ＶＰ２を発現していないＭＮＶ感受性細胞に感染させた場合、（１）で産生されたＭＰＮＶは、細胞に感染して侵入し、自身の内包するＭＮＶ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔゲノムを細胞内に放出し、タンパク質を発現するが、機能を有するＶＰ２が存在しないため、自身のＭＮＶ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔゲノムを複製することができず、再びＭＰＮＶが産生されることも無い。つまり、一度だけ感受性細胞内部にＭＮＶ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔゲノムを送り届け、それにコードされるタンパク質を発現させることができるいわば、本発明の生ワクチンの有効成分となり得るのである。 (4) However, when the MPNV produced in (1) is infected with MNV-susceptible cells that do not express VP2, the MPNV produced in (1) infects and invades the cells, and its own The contained MNV-ORF3 mutant genome is released into the cell and the protein is expressed, but since there is no functional VP2, the MNV-ORF3 mutant genome cannot be replicated, and MPNV may be produced again. None. In other words, the MNV-ORF3 mutant genome can be delivered into susceptible cells only once and the protein encoded by it can be expressed, so that it can serve as an active ingredient of the live vaccine of the present invention.
以上（１）－（４）の検討を行うことにより、ＯＲＦ３における欠失変異によるノロウイルスの複製機能における影響を解明し、遺伝子運搬システムもしくは、半生ワクチンの可能性を見出す。 By conducting the above studies (1) to (4), we will elucidate the effect of the deletion mutation in ORF3 on the replication function of norovirus, and discover the possibility of a gene delivery system or a semi-live vaccine.
［試験系の開示］
＜材料＞
１．ＭＮＶ感受性細胞
ＭＮＶ感受性細胞である、Ｈｕｈ７５１細胞は、Ａｐａｔｈ，ＬＬＣ（１１７３Ａ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｖｅｎｕｅ Ｓｕｉｔｅ ３５５ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ１００６５－ＵＳＡ）とＭＴＡ（Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ａｇｒｅｅｍｅｎｔ）を交わして、入手した。この細胞はＨｕｈ７細胞のインターフェロン誘導遺伝子欠損変異を持つ特殊なクローンであるが、ＣＤ３００ｌｆ遺伝子を導入してＭＮＶ感染感受性細胞である「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞」とした場合、ＭＮＶ遺伝子の細胞内での安定性は、Ｈｕｈ７５１細胞がＨｕｈ７細胞を僅かに上回るため、本実施例においては、「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞」を用いた。以下の（１）－（５）に、このＭＮＶ感受性細胞の作製方法について示した。
[Disclosure of test system]
<Materials>
1. MNV-susceptible cells Huh751 cells, which are MNV-susceptible cells, were obtained through an MTA (Material Transfer Agreement) with Apath, LLC (1173A Second Avenue Suite 355 New York, NY10065-USA). . These cells are a special clone of Huh7 cells with an interferon-induced gene deletion mutation, but when the CD300lf gene is introduced to create "Huh751+CD300lf cells" that are susceptible to MNV infection, the intracellular stability of the MNV gene is Since Huh751 cells slightly exceed Huh7 cells, "Huh751+CD300lf cells" were used in this example. The following (1) to (5) show the method for producing MNV-sensitive cells.
（１）マウスのＣＤ３００ｌｆ分子のｃＤＮＡを合成し、レンチウイルスベクターに組み込み、組換えレンチウイルスを作製した。
（２）このＣＤ３００ｌｆ遺伝子を組み込んだ組換えレンチウイルスを、Ｈｕｈ７５１に感染させ、共発現させた薬剤耐性因子により、ＣＤ３００ｌｆを定常的に発現する細胞Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆを得た。
（３）このＨｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆをシングルセルクローニングし、Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ ｃｌｏｎｅ １２－２細胞を得た。
（４）Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ ｃｌｏｎｅ１２－２細胞は、定常的にマウスＣＤ３００ｌｆを発現するＭＮＶ感染感受性細胞であり、通常のＭＮＶでは、１０の９乗個／ミリリットル以上のウイルスタイターのＭＮＶを培養可能な細胞である。
（５）Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ ｃｌｏｎｅ １２－２細胞に、更にＭＮＶ ＶＰ２遺伝子を上記の組換えレンチウイルスシステムを用いて導入し、定常的にＭＮＶ－ＶＰ２を発現する細胞Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ＋ＭＮＶ－ＶＰ２細胞を得た。この細胞をＭＰＮＶ産生などの試験に用いた。
(1) The cDNA of mouse CD300lf molecule was synthesized and inserted into a lentivirus vector to produce a recombinant lentivirus.
(2) Huh751 was infected with the recombinant lentivirus incorporating this CD300lf gene, and cells Huh751+CD300lf constantly expressing CD300lf were obtained by co-expressing the drug resistance factor.
(3) This Huh751+CD300lf was subjected to single cell cloning to obtain Huh751+CD300lf clone 12-2 cells.
(4) Huh751+CD300lf clone12-2 cells are MNV infection-susceptible cells that constantly express mouse CD300lf, and are cells that can culture MNV with a virus titer of 10 to the power of 9 per milliliter or more when using normal MNV. .
(5) The MNV VP2 gene was further introduced into Huh751+CD300lf clone 12-2 cells using the above recombinant lentivirus system to obtain Huh751+CD300lf+MNV-VP2 cells that constantly express MNV-VP2. These cells were used for tests such as MPNV production.
２．ＭＮＶ（マウスノロウイルス）の野生型
本試験で用いた野生型ＭＮＶは、「ＧｅｎＢＡＮＫ番号ＡＢ４３５５１５」として登録された塩基配列のＭＮＶを用いた。
2. Wild type of MNV (mouse norovirus) The wild type MNV used in this test was the MNV with the base sequence registered as "GenBANK number AB435515".
また図１（配列番号１）に、ＭＮＶの全長のｃＤＮＡを持つインフェクシャスクローン（ｐＭＮＶ－Ｆ）の全塩基配列を示した。［図１－１、－２、－３、－４、－５］において、大文字はＭＮＶの全長のｃＤＮＡを示しており、小文字は、ベクターとしての機能を司る部分であり、ＥＦ－１αプロモーターを含んでいる。 Further, FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) shows the entire base sequence of an infectious clone (pMNV-F) having the full-length cDNA of MNV. In [Figures 1-1, -2, -3, -4, -5], uppercase letters indicate the full-length cDNA of MNV, and lowercase letters indicate the part that controls the vector function, and the EF-1α promoter. Contains.
３．ＶＰ２発現ベクターの作製
上記のｐＭＮＶ－Ｆの大文字部分（ＭＮＶの全長ｃＤＮＡ）と、ＡＢ４３５５１５のＯＲＦ３のＶＰ２（配列番号２）をコードする塩基配列（ＤＮＡ）をインフュージョンクローニングによって入れ替え、ＶＰ２発現ベクター（ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２）とした。つまり、上記大文字部分からＯＲＦ１とＯＲＦ２は取り除かれ、ＯＲＦ３が上記ｐＭＮＶ－Ｆの大文字部分と入れ替わって残ったものである。図２に、ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２の概略図を示した。
3. Preparation of VP2 expression vector The uppercase portion of the above pMNV-F (full-length cDNA of MNV) and the base sequence (DNA) encoding VP2 (SEQ ID NO: 2) of ORF3 of AB435515 were replaced by infusion cloning, and the VP2 expression vector ( pKS-MNV VP2). That is, ORF1 and ORF2 are removed from the uppercase part, and ORF3 remains, replacing the uppercase part of pMNV-F. FIG. 2 shows a schematic diagram of pKS-MNV VP2.
４．ＶＰ２欠損ゲノムが組み込まれたベクターの作製
ＯＲＦ３の機能を解析するために、ＶＰ２をコードする遺伝子に種々の欠損変異や、タンパク質への翻訳を阻害する変異を導入した「ＶＰ２欠損ゲノム」を保有し、これを、上記のｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２の「ＶＰ２をコードする部分」に置き換えたベクターを構築した。図３に、これらの変異の概略をアミノ酸配列で示した。図３の各変異断片の横方向の数字は、野生型のＶＰ２のアミノ酸配列の番号である。
4. Creation of a vector incorporating a VP2-deficient genome In order to analyze the function of ORF3, we have created a “VP2-deficient genome” in which various deletion mutations and mutations that inhibit translation into protein have been introduced into the gene encoding VP2. A vector was constructed in which this was replaced with the "VP2-encoding portion" of the above pKS-MNV VP2. FIG. 3 shows an outline of these mutations in the form of amino acid sequences. The numbers next to each mutant fragment in FIG. 3 are the amino acid sequence numbers of wild-type VP2.
図３において、実線部分はタンパク質を発現していることを示しており、点線部分は核酸配列のみ存在する（ストップコドンでタンパク質への翻訳が遮断されている）。Ｓｔｏｐは、７番目と１０番目のアミノ酸残基が、当該アミノ酸残基をコードするコドンを、ストップコドンＴＡＧに置き換えた変異断片であることを示している。ΔＮは、５’末端側の３アミノ酸残基ＭＡＧと１０６番目以降のＳＫＳＤＡＡ以下２０８のアラニン残基までを直結させた変異ＶＰ２（言い換えれば４－１０５番目のアミノ酸残基を欠損した）をコードする変異断片であることを示している。ΔＮｓｔｏｐは、ΔＮと殆ど同じ塩基配列であるが、１０６番目、１０８番目のアミノ酸残基をコードするＳコドン（ＴＣＧ ＡＡＧ ＴＣＧのアンダーライン部分）をストップコドンに置き換えた（ＴＡＧ ＡＡＧ ＴＡＧ）ことにより、ＴＡＧ ＡＡＧ ＴＡＧの最初のストップコドン以降がタンパク質へ翻訳されない、欠損ＶＰ２をコードする変異断片である。以下、同様に、ΔＭは、中盤（５２－１５７番目のアミノ酸残基）が欠損したＶＰ２をコードする変異断片、ΔＭｓｔｏｐは、５'側（７番目と１０番目のアミノ酸残基）のストップコドンへの置き換えにより、殆どの核酸がタンパク質への翻訳が遮断されている変異断片である。ΔＣは、３’末端側（１１４番目以降のアミノ酸残基をコードする塩基配列）の欠損変異であり、ΔＣｓｔｏｐは、これに加えて５’側のストップコドン（７番目と１０番目のアミノ酸残基）のストップコドンへの置き換えにより、殆どの核酸がタンパク質への翻訳が遮断されている変異断片である。ΔはＶＰ２核酸配列、タンパク質配列のほぼ全欠損変異体である。
In FIG. 3, the solid line indicates that the protein is expressed, and the dotted line indicates that only the nucleic acid sequence exists (translation into protein is blocked by a stop codon). Stop indicates that the 7th and 10th amino acid residues are a mutant fragment in which the codons encoding the amino acid residues are replaced with the stop codon TAG. ΔN encodes a mutant VP2 in which the 3 amino acid residues MAG on the 5' terminal side are directly linked to the 208 alanine residues starting from the 106th SKSDAA (in other words, amino acid residues 4 to 105 are deleted). This indicates that it is a mutant fragment. ΔNstop has almost the same base sequence as ΔN, but by replacing the S codon (underlined part of TCG AAG TCG ) encoding the 106th and 108th amino acid residues with a stop codon ( TAG AAG TAG ), TAG AAG This is a mutant fragment encoding a defective VP2 in which the region after the first stop codon of TAG is not translated into protein. Similarly, ΔM is a mutant fragment encoding VP2 with a deletion in the middle (52nd to 157th amino acid residues), and ΔMstop is a mutant fragment encoding VP2 with a deletion in the middle (
以下にこれらの変異断片を含むベクターを、その作製工程の概略と共に記載する。 Vectors containing these mutated fragments will be described below along with an outline of their production steps.
（１）ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ＳＴＯＰ
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ＳＴＯＰは、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列（１番目のメチオニン残基をコードするＡＴＧから、アラニン残基をコードするＧＣＡの下流のストップコドンＴＡＧまで）を、アミノ酸座位７番目と１０番目のコドンをストップコドンＴＡＧに改変した（□で囲った）下記の配列をＤＮＡ合成装置で合成して、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである（図４：配列番号３）。
(1) pMNV-F_VP2 STOP
pMNV-F_VP2 STOP converts the sequence of the ORF3 region of pMNV-F (from ATG encoding the first methionine residue to the stop codon TAG downstream of GCA encoding an alanine residue) to
（２）ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＮ
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＮ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＮ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図５（配列番号４）の配列に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図５において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、実際はＡＴＧ ＧＣＴ ＧＧＴをＡＡＧ ＴＣＧ ＧＡＴに直結させた配列をＤＮＡ合成装置で合成して入れ替えに用いた。
(2) pMNV-F_VP2 deltaN
pMNV-F_VP2 deltaN (pMNV-F_VP2ΔN) is a clone in which the sequence of the ORF3 region of pMNV-F was replaced with the sequence shown in FIG. 5 (SEQ ID NO: 4) by infusion cloning. In Figure 5, the part (-------) is the part where the nucleic acid sequence has been deleted, and in reality, a sequence in which ATG GCT GGT is directly linked to AAG TCG GAT was synthesized using a DNA synthesizer and used for replacement. .
（３）ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＮｓｔｏｐ
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＮｓｔｏｐ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＮｓｔｏｐ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図６（配列番号５）の配列に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図６において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＮの配列と同様に作製した。ただし、１０６、１０８番目のアミノ酸残基に対応するＳコドン（ＴＣＧ ＡＡＧ ＴＣＧのアンダーライン部分）をストップコドンに置き換えた（ＴＡＧ ＡＡＧ ＴＡＧ）。
(3) pMNV-F_VP2 deltaNstop
pMNV-F_VP2 deltaNstop (pMNV-F_VP2ΔNstop) is a clone in which the sequence of the ORF3 region of pMNV-F was replaced with the sequence shown in FIG. 6 (SEQ ID NO: 5) by infusion cloning. In FIG. 6, the part (---) is a part in which the nucleic acid sequence is deleted, and it was prepared in the same manner as the sequence of pMNV-F_VP2ΔN. However, the S codon (underlined part of TCG AAG TCG ) corresponding to the 106th and 108th amino acid residues was replaced with a stop codon ( TAG AAG TAG ).
（４）ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＭ
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＭ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＭ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図７（配列番号６）の配列に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図７において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、実際はＣＡＡＧＣＣＣＡＧをＴＣＡＧＧＴＧＧＣに直結させた配列をＤＮＡ合成装置で合成して入れ替えに用いた。
(4) pMNV-F_VP2 deltaM
pMNV-F_VP2 deltaM (pMNV-F_VP2ΔM) is a clone in which the sequence of the ORF3 region of pMNV-F was replaced with the sequence shown in FIG. 7 (SEQ ID NO: 6) by infusion cloning. In FIG. 7, the part (-------) is the part where the nucleic acid sequence has been deleted, and in reality, a sequence in which CAAGCCCAG was directly linked to TCAGGTGGC was synthesized using a DNA synthesizer and used for replacement.
（５）ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＭｓｔｏｐ
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＭｓｔｏｐ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＭｓｔｏｐ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図８（配列番号７）の配列に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図８において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、実際はＣＡＡＧＣＣＣＡＧをＴＣＡＧＧＴＧＧＣに直結させた配列である。さらに、アミノ酸座位７番目と１０番目のコドンをストップコドンＴＡＧに置き換えた（□で囲った）。これをＤＮＡ合成装置で合成して入れ替えに用いた。
(5) pMNV-F_VP2 deltaMstop
pMNV-F_VP2 deltaMstop (pMNV-F_VP2ΔMstop) is a clone in which the sequence of the ORF3 region of pMNV-F was replaced with the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 7) by infusion cloning. In FIG. 8, the part marked (---) is the part where the nucleic acid sequence has been deleted, and is actually a sequence in which CAAGCCCAG is directly linked to TCAGGTGGC. Furthermore, the codons at the 7th and 10th amino acid loci were replaced with the stop codon TAG (encircled by □). This was synthesized using a DNA synthesizer and used for replacement.
（６）ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＣ
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＣ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＣ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図９（配列番号８）に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図９において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、実際はＣＧＣＣＴＴＧＣＣをＡＧＣＡＧＧＧＣＡＴＡＧに直結させた配列をＤＮＡ合成装置で合成して入れ替えに用いた。
(6) pMNV-F_VP2 deltaC
pMNV-F_VP2 deltaC (pMNV-F_VP2ΔC) is a clone in which the sequence of the ORF3 region of pMNV-F was replaced with that in FIG. 9 (SEQ ID NO: 8) by infusion cloning. In FIG. 9, the part (-------) is the part where the nucleic acid sequence has been deleted, and in reality, a sequence in which CGCCTTGCC was directly linked to AGCAGGGCATAG was synthesized using a DNA synthesizer and used for replacement.
（７）ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＣｓｔｏｐ
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＣｓｔｏｐ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＣｓｔｏｐ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図１０（配列番号９）の配列に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図１０において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、実際はＣＧＣＣＴＴＧＣＣをＡＧＣＡＧＧＧＣＡＴＡＧに直結させた配列である。さらに、７番目と１０番目のアミノ酸残基のコドンをストップコドンＴＡＧに改変した（□で囲った）に入れ替えた。これをＤＮＡ合成装置で合成して入れ替えに用いた。
(7) pMNV-F_VP2 deltaCstop
pMNV-F_VP2 deltaCstop (pMNV-F_VP2ΔCstop) is a clone in which the sequence of the ORF3 region of pMNV-F was replaced with the sequence shown in FIG. 10 (SEQ ID NO: 9) by infusion cloning. In FIG. 10, the part marked (---) is the part in which the nucleic acid sequence has been deleted, and is actually a sequence in which CGCCTTGCC is directly linked to AGCAGGGCATAG. Furthermore, the codons for the 7th and 10th amino acid residues were replaced with stop codons TAG (encircled by squares). This was synthesized using a DNA synthesizer and used for replacement.
（８）ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａ
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２Δ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図１１（配列番号１０）の配列に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図１１において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、これをＤＮＡ合成装置で合成して入れ替えに用いた。
(8) pMNV-F_VP2 delta
pMNV-F_VP2 delta (pMNV-F_VP2Δ) is a clone in which the sequence of the ORF3 region of pMNV-F was replaced with the sequence shown in FIG. 11 (SEQ ID NO: 10) by infusion cloning. In FIG. 11, the part (-------) is the part in which the nucleic acid sequence has been deleted, which was synthesized using a DNA synthesizer and used for replacement.
＜方法＞
１．ＶＰ２に変異を導入したゲノムを内包する新生ウイルス粒子（ＭＰＮＶ）の調製（図１２）
ＶＰ２を細胞内に一時的に供給して、ＯＲＦ３（ＶＰ２コード領域）に変異を導入したゲノムを内包する新生ウイルス粒子を作出するため、「＜材料＞４．（１）－（８）」に示したＭＮＶ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔゲノム供給用ベクター「ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２」（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ＳＴＯＰ等）それぞれと、ＶＰ２発現用ベクター「ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２」を同時に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして、４８時間のインキュベートの後、上清に含まれるＭＰＮＶを回収した。
<Method>
1. Preparation of a new virus particle (MPNV) containing a genome with mutations introduced into VP2 (Figure 12)
In order to temporarily supply VP2 into cells and create new virus particles containing a genome in which mutations have been introduced into ORF3 (VP2 coding region), the following steps were performed in "<Materials>4.(1)-(8)". Each of the indicated MNV-ORF3 mutant genome supply vectors "pMNV-F_VP2" (pMNV-F_VP2 STOP, etc.) and the VP2 expression vector "pKS-MNV VP2" were simultaneously transfected into HEK293T cells, and incubated for 48 hours. Afterwards, MPNV contained in the supernatant was collected.
２．ＭＰＮＶの感染試験
上記ＭＰＮＶは、ＶＰ２を定常的に発現し、かつＭＮＶレセプターＣＤ３００ｌｆも定常的に発現する「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ＋ＶＰ２ ｃｌｏｎｅ１２－２細胞」に感染させることでＭＰＮＶの複製増殖が可能である。しかし、ＭＮＶレセプターＣＤ３００ｌｆを定常的に発現するＨｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆや、本来の感染感受性細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞は、ＶＰ２の産生能は無く、発現するＶＰ２に欠陥がある、又は、ＶＰ２が発現しないＭＰＮＶは複製増殖することができないのが原則である筈である。
2. MPNV Infection Test The above MPNV can be replicated and propagated by infecting "Huh751+CD300lf+VP2 clone12-2 cells" that constantly express VP2 and also constantly express the MNV receptor CD300lf. However, Huh751+CD300lf, which constantly expresses the MNV receptor CD300lf, and RAW264.7 cells, which are cells that are naturally susceptible to infection, do not have the ability to produce VP2. The general rule is that they cannot reproduce and proliferate.
本感染試験の手順は、下記の通りである。
（１）それぞれの変異がＶＰ２遺伝子に導入されたＭＰＮＶを、「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ＋ＶＰ２ ｃｌｏｎｅ１２－２細胞」に感染させ、４８時間のインキュベートを行い、上清を回収した。
（２）回収した１回目の培養上清に含まれるＭＰＮＶは、再び新たに培養して準備した「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ＋ＶＰ２ ｃｌｏｎｅ１２－２細胞」に感染させ、４８時間のインキュベートを行い、２回目の培養上清を回収した。
（３）回収した２回目の培養上清を「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞」（ＶＰ２は発現していない）に感染させ、４８時間のインキュベートを行い、３回目の培養上清を回収した。
（４）回収した３回目の培養上清を、再び「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞」（ＶＰ２は発現していない）に感染させ、４８時間のインキュベートを行い、３回目の培養上清を回収した。
The procedure for this infection test is as follows.
(1) "Huh751+CD300lf+VP2 clone12-2 cells" were infected with MPNV in which each mutation was introduced into the VP2 gene, incubated for 48 hours, and the supernatant was collected.
(2) The MPNV contained in the collected first culture supernatant was used to infect newly cultured and prepared "Huh751+CD300lf+VP2 clone12-2 cells" and incubated for 48 hours. Recovered.
(3) "Huh751+CD300lf cells" (VP2 not expressed) were infected with the collected second culture supernatant, incubated for 48 hours, and the third culture supernatant was collected.
(4) "Huh751+CD300lf cells" (VP2 not expressed) were infected again with the collected third culture supernatant, incubated for 48 hours, and the third culture supernatant was collected.
細胞のＭＰＮＶの感染は、感染後４８時間のインキュベートを行ったそれぞれの細胞を、パラホルムアルデヒドで固定し、抗ＭＮＶ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ 抗体による免疫染色を実施して確認した。 Infection of cells with MPNV was confirmed by incubating each cell for 48 hours after infection, fixing it with paraformaldehyde, and performing immunostaining with an anti-MNV N-terminal protein antibody.
結果を表１に示す。 The results are shown in Table 1.
（ａ）ｐＭＮＶ－Ｆ（野生型ＭＮＶのインフェクシャスクローン）は、ＶＰ２発現用ベクターとコトランスフェクションせずとも、自らの野生型ゲノムよりＶＰ２を産生するため、野生型ＭＮＶを培養上清に産生する。従って、ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２とのコトランスフェクションでも野生型ＭＮＶを効率良く産生したため、表１（１）が（＋＋＋）であった。同（１）でＭＮＶが効率良く増殖したため、同（２）も（＋＋＋）であった。２回目の感染で増殖した野生型ＭＮＶは、自身がＯＲＦ３にコードするＶＰ２を発現可能であり、自己供給できるため、「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞」（ＶＰ２は発現していない）に感染しても、増殖が可能であり、同（３）で（＋＋＋）を示した。さらに、同（４）でも同様の結果となった。 (a) pMNV-F (infectious clone of wild-type MNV) produces VP2 from its own wild-type genome without co-transfection with a VP2 expression vector, so wild-type MNV is used in the culture supernatant. produce. Therefore, co-transfection with pKS-MNV VP2 also produced wild-type MNV efficiently, so Table 1 (1) was (+++). Since MNV multiplied efficiently in (1), (2) was also (+++). Wild-type MNV that proliferated during the second infection can express VP2 encoded in ORF3 and can self-supply, so even if it infects "Huh751+CD300lf cells" (VP2 is not expressed), it does not proliferate. It is possible, and (+++) was shown in (3). Furthermore, the same result was obtained in (4).
（ｂ）Ｓｔｏｐ、ｄｅｌｔａＮ、ｄｅｌｔａＮｓｔｏｐは、ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２とのコトランスフェクションしたときのみ、ＭＰＮＶを産生し、表１（１）が（＋＋）ないし（＋＋＋）を示した。ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２とコトランスフェクションを行わない場合、ＶＰ２が供給されない状態になるため、ＭＰＮＶは産生されなかった（表示せず）。同（１）と（２）では、「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ＋ＶＰ２ ｃｌｏｎｅ１２－２細胞」を用いたため、この細胞内で定常的に発現しているＶＰ２がトランスに供給され、ＭＰＮＶが増殖培養されたことにより、全て（＋＋＋）を示した。同（３）では、２回目の感染で増殖したＭＰＮＶが培養上清中に存在するため、そのＭＰＮＶが「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞」（ＶＰ２は発現していない）に感染して、変異ゲノムを細胞内に送り込むため、（＋＋＋）を示した。しかし、同（４）では、３回目の培養上清にはＭＰＮＶが産生されないため、持ち越された２回目の培養上清に存在したウイルスが僅かに感染したものの、感染細胞は激しく減少し、僅かに（＋）を示した。表示外であるが、４回目の培養上清をＨｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞（ＶＰ２は発現していない）に感染させた場合は、全て（－）となった。 (b) Stop, deltaN, and deltaNstop produced MPNV only when cotransfected with pKS-MNV VP2, and Table 1 (1) showed (++) to (+++). Without co-transfection with pKS-MNV VP2, no MPNV was produced because VP2 was not supplied (not shown). In (1) and (2), because "Huh751+CD300lf+VP2 clone12-2 cells" were used, VP2 that was constantly expressed in these cells was supplied in trans, and MPNV was cultured to proliferate. +++) was shown. In the same case (3), MPNV that proliferated during the second infection is present in the culture supernatant, so that MPNV infects "Huh751+CD300lf cells" (VP2 is not expressed) and transfers the mutated genome into the cells. (+++) was shown for sending. However, in the same case (4), MPNV was not produced in the third culture supernatant, so although there was a slight infection with the virus present in the second culture supernatant carried over, the number of infected cells decreased drastically and only a slight (+) is shown. Although not shown, when Huh751+CD300lf cells (VP2 is not expressed) were infected with the fourth culture supernatant, all results were (-).
（ｃ）ｄｅｌｔａＭとｄｅｌｔａＭｓｔｏｐは、ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２とのコトランスフェクションしたときのみ、ＭＰＮＶを産生し、表１（１）は（＋）ないし（＋＋）を示した。ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２とコトランスフェクションを行わない場合、ＶＰ２が供給されない状態になるため、ＭＰＮＶは産生されなかった（表示せず）。同（１）と（２）では、「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ＋ＶＰ２ ｃｌｏｎｅ１２－２細胞」を用いたため、この細胞内で定常的に発現しているＶＰ２がトランスに供給され、ＭＰＮＶが増殖培養されたことにより、（＋）ないし（＋＋）を示した。同（３）では、ｄｅｌｔａＭｓｔｏｐのみ２回目の感染で増殖したＭＰＮＶが培養上清中に存在するため、そのＭＰＮＶがＨｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞（ＶＰ２は発現していない）に感染して、変異ゲノムを細胞内に送り込むため、（＋）を示した。しかし、同（４）では、３回目の培養上清にはＭＰＮＶが産生されないため、持ち越された２回目の培養上清に存在したウイルスが僅かに感染した結果、感染細胞は激しく減少し、僅かに（＋）を示したのみであった。表示外であるが、４回目の培養上清をＨｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞（ＶＰ２は発現していない）に感染させた場合、全て（－）となった。一方ｄｅｌｔａＭは、ｄｅｌｔａＭｓｔｏｐよりもＭＰＮＶ産生量が少なく、同（３）以降全て（－）となった。 (c) deltaM and deltaMstop produced MPNV only when cotransfected with pKS-MNV VP2, and Table 1 (1) showed (+) to (++). Without co-transfection with pKS-MNV VP2, no MPNV was produced because VP2 was not supplied (not shown). In (1) and (2), because "Huh751 + CD300lf + VP2 clone 12-2 cells" were used, VP2 constantly expressed in these cells was supplied to the trans, and MPNV was cultured to proliferate (+ ) to (++) are shown. In (3), only deltaMstop has MPNV that proliferated during the second infection in the culture supernatant, so that MPNV infects Huh751+CD300lf cells (VP2 is not expressed) and transfers the mutated genome into the cells. (+) is shown for sending. However, in (4), MPNV was not produced in the third culture supernatant, and as a result of a slight infection with the virus present in the second culture supernatant carried over, the number of infected cells was drastically reduced, and only a small number of cells were infected. (+) was only shown in the figure. Although not shown, when Huh751+CD300lf cells (VP2 is not expressed) were infected with the fourth culture supernatant, all results were (-). On the other hand, deltaM produced less MPNV than deltaMstop, and all values after (3) were (-).
（ｄ）ｄｅｌｔａＣ、ｄｅｌｔａＣｓｔｏｐ、ｄｅｌｔａは、ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２とコトランスフェクションしても、ＭＰＮＶを産生できず、表１（１）から（４）まで全て（－）を示した。 (d) deltaC, deltaCstop, and delta were unable to produce MPNV even when cotransfected with pKS-MNV VP2, and Table 1 (1) to (4) all showed (-).
（ｅ）ネガティブコントロールとして用いた、ｐＭＮＶ－Ｆ（野生型ＭＮＶのインフェクシャスクローン）のＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼの活性中心を欠失させたＲｄＲｐ変異体（ｐＭＮＶ－ＦｄｅｌｔａＲｄＲｐ）は、自ら複製することができず、表１（１）から（４）まで全て（－）を示した。 (e) An RdRp mutant (pMNV-FdeltaRdRp) in which the active center of RNA-dependent RNA polymerase of pMNV-F (infectious clone of wild-type MNV) is deleted (pMNV-FdeltaRdRp) used as a negative control does not replicate by itself. Table 1 (1) to (4) all showed (-).
上記の結果を検討する。特に、ｄｅｌｔａ Ｍにおいて、ＶＰ２がトランス供給される場合はＭＰＮＶの産生が可能となることから、ＯＲＦ３（ＶＰ２）の２０８アミノ酸コード領域のうち、Ｎ末端側４アミノ酸から１５３アミノ酸コード領域までを失った場合でも、ＭＰＮＶ産生能力が保持されていることが分かった（ＯＲＦ３特定領域に該当する）。逆にｄｅｌｔａＣに関する結果から、１５４番目のアミノ酸から２０６番目のアミノ酸をコードするコドンまでの間の核酸配列は、ゲノム遺伝子の複製又はウイルス粒子へのパッケージングに必要な領域であり、核酸配列の欠損が致死的になることが明らかになった。 Consider the above results. In particular, in delta M, MPNV production is possible when VP2 is supplied in trans, so of the 208 amino acid coding region of ORF3 (VP2), the N-terminal 4 to 153 amino acid coding region was lost. It was found that the ability to produce MPNV was retained even in cases where the MPNV production ability was maintained (corresponding to the ORF3 specific region). On the contrary, the results regarding deltaC show that the nucleic acid sequence between the 154th amino acid and the codon encoding the 206th amino acid is a region necessary for genomic gene replication or packaging into virus particles, and that the nucleic acid sequence is a region necessary for genomic gene replication or packaging into virus particles. has been shown to be lethal.
また、ＭＰＮＶは、ＶＰ２をトランス供給すると細胞内でＶＰ２変異ゲノムを複製し、最終的に当該変異ゲノムをウイルス粒子内にパッケージしてＭＰＮＶを産生することが可能だが、産生されたＭＰＮＶは、ＶＰ２がトランス供給されない細胞、すなわち通常のノロウイルス感受性細胞に対しては一度だけしか感染できず、その後、ＭＰＮＶの産生はなされないことが明らかになった。 Furthermore, when MPNV is supplied with VP2 in trans, it is possible to replicate the VP2 mutant genome within cells and finally package the mutant genome into virus particles to produce MPNV. It has become clear that cells to which norovirus is not supplied in trans, that is, normal norovirus-susceptible cells, can be infected only once, and no MPNV is produced thereafter.
すなわち、所定のＶＰ２変異ゲノムを内包した新生ウイルスＭＰＮＶは、一度だけ感染することで宿主に野生型ウイルスと同じように免疫を惹起できるが、ＭＰＮＶを新たに産生することができない、高度弱毒化生ワクチンの有効成分としての有用性が明らかになった。 In other words, the new virus MPNV, which contains a predetermined VP2 mutant genome, can induce immunity in the host in the same way as the wild-type virus by infecting the host only once, but it is a highly attenuated virus that cannot newly produce MPNV. Its usefulness as an active ingredient in vaccines has been revealed.
３．ＯＲＦ３特定領域に外来性タンパク質遺伝子を組み込んだＭＰＮＶ
次に、ＯＲＦ３特定領域に外来性タンパク質を組み込んだ場合のＭＰＮＶの振る舞いについて検討する。
3. MPNV with a foreign protein gene integrated into the ORF3 specific region
Next, we will examine the behavior of MPNV when a foreign protein is incorporated into the ORF3 specific region.
外来性タンパク質遺伝子として、蛍光タンパク質遺伝子を用いた。蛍光タンパク質遺伝子を組み込んだ領域は、ｄｅｌｔａＮｓｔｏｐの欠損領域（Ｎ末端側４番目のアミノ酸残基から１０５アミノ酸残基のコード領域）、ｄｅｌｔａＭｓｔｏｐの欠損領域（Ｎ末端側４番目のアミノ酸残基から１５６アミノ酸残基のコード領域）で、蛍光タンパク質遺伝子として、ＵｎａＧ［（Cell 153, 1602-1611, June 20, 2013）ニホンウナギ由来の緑色蛍光タンパク質：４１４塩基、１３９アミノ酸］組み込まれたベクター（最初のＡＴＧを除く）を作製した。さらにこれとは別に、ＧＦＰの高輝度変異体であるＶＥＮＵＳ［（生物物理４２（６），３０５－３０８（２００２））７１７塩基、２３９アミノ酸］組み込まれたベクター（最初のＡＴＧを除く）を作製した。 A fluorescent protein gene was used as the foreign protein gene. The regions into which the fluorescent protein gene has been incorporated are the deltaNstop deletion region (coding region of 105 amino acids from the 4th amino acid residue on the N-terminal side) and the deltaMstop deletion region (156 amino acids from the 4th amino acid residue on the N-terminal side). (coding region of residues), and as a fluorescent protein gene, a vector (first ATG ) were created. Separately, we created a vector (excluding the first ATG) in which VENUS [(Biophysics 42 (6), 305-308 (2002)) 717 bases, 239 amino acids], a high-intensity mutant of GFP, was integrated. did.
これらのベクターとｐＫＳ－ＭＮＶ－ＶＰ２を、上記の要領（図１２参照）でコトランスフェクションして、外来性の蛍光タンパク質遺伝子を内包したＭＰＮＶの作製と感染実験を実施した。 These vectors and pKS-MNV-VP2 were co-transfected as described above (see FIG. 12) to produce MPNV containing an exogenous fluorescent protein gene and conduct an infection experiment.
方法は、上記したＭＰＮＶの作製と感染試験と同様である。ただし、組み込んだ遺伝子が蛍光たんぱく質遺伝子であるため、免疫染色は実施せず、蛍光たんぱく質の発色を検出して、結果を検討した。 The method is similar to the MPNV production and infection test described above. However, since the inserted gene is a fluorescent protein gene, immunostaining was not performed, and the results were examined by detecting the color development of the fluorescent protein.
結果としては、２種類の蛍光タンパク質遺伝子を内包したＭＰＮＶの作製は成功し、上記の感染試験と同様に、当該ＭＰＮＶが一度だけノロウイルス感受性細胞に感染可能であり、当該細胞内に組み込んだ蛍光タンパク質を発現させることができることを確認した。 As a result, the production of MPNV containing two types of fluorescent protein genes was successful, and as in the above infection test, the MPNV was able to infect norovirus-susceptible cells only once, and the fluorescent proteins incorporated into the cells It was confirmed that it was possible to express
従って、これらの蛍光タンパク質に代えて、ノロウイルス以外のウイルスタンパク質遺伝子（構造タンパク質であっても、非構造タンパク質であっても良い）をＯＲＦ３特定領域に組み込み、ＭＰＮＶとして産生させると、高度弱毒化多価生ワクチンの有効成分として利用可能であることが示された。 Therefore, instead of these fluorescent proteins, if a virus protein gene other than norovirus (which may be a structural protein or a non-structural protein) is incorporated into the ORF3 specific region and produced as MPNV, highly attenuated polymorphism can be obtained. It was shown that it can be used as an active ingredient in live vaccines.
Claims (6)
ノロウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム３（ＯＲＦ３）の開始コドンからＯＲＦ３の２／３以内の領域であって、当該領域の欠損したゲノムを保有するノロウイルス粒子は、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを産生しないゲノム領域；
の全てが欠損しているか、又は、当該ゲノム領域にＶＰ２タンパク質を実質的に産生できなくなる変異；
が導入されたノロウイルスゲノム、を保有するノロウイルス粒子であって、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを産生しないノロウイルス粒子。 As a mutation that makes it impossible to produce the complete VP2 protein;
A region within two-thirds of ORF3 from the start codon of open reading frame 3 (ORF3) of the norovirus genome, and norovirus particles that have a missing genome in this region retain the ability to infect a new virus while retaining one-time infectivity. Genomic regions that do not produce
All of the above are deleted, or mutations that result in the inability to substantially produce VP2 protein in the relevant genomic region;
A Norovirus particle that possesses a Norovirus genome into which a Norovirus has been introduced, which retains the ability to infect once and does not produce new viruses.
に導入されたＶＰ２タンパク質を実質的に産生できなくなる変異は、ＯＲＦ３の開始コドンの欠損変異、開始コドン下流における一箇所又は二箇所以上のストップコドンの導入、又は、１５塩基以上の部分欠損、である、請求項１に記載のノロウイルス粒子。 Mutations that make it virtually impossible to produce the VP2 protein introduced into the protein are deletion mutations of the start codon of ORF3, introduction of one or more stop codons downstream of the start codon, or partial deletions of 15 bases or more. The norovirus particle according to claim 1.
に、ノロウイルス以外の微生物の１種又は２種以上のタンパク質をコードする遺伝子が１種又は２種以上組み込まれているノロウイルス粒子である、請求項１又は２に記載のノロウイルス粒子。 In the above-mentioned norovirus particles, a region within two-thirds of ORF3 from the start codon of open reading frame 3 (ORF3) of the norovirus genome, and a norovirus particle that contains a deletion in this region, while retaining the ability to infect once only. Genomic regions that do not produce new viruses;
3. The Norovirus particle according to claim 1, wherein the Norovirus particle has one or more genes encoding one or more proteins of a microorganism other than Norovirus incorporated therein.
（１）ノロウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム３（ＯＲＦ３）の開始コドンからＯＲＦ３の２／３以内の領域であって、当該領域の欠損を含むノロウイルス粒子は、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを産生しないゲノム領域、
の全てが欠損しているか、又は、当該ゲノム領域にＶＰ２を実質的に産生できなくなる変異が導入されている、改変ＯＲＦ３を含むノロウイルスゲノム；
（２）ＶＰ２タンパク質をコードする遺伝子。 Production of mutant norovirus particles that retain one-time infection ability and do not generate new viruses by co-expressing (1) and (2) below in norovirus-susceptible cells and collecting the norovirus particles generated by the co-expression. Method:
(1) A region within two-thirds of ORF3 from the start codon of open reading frame 3 (ORF3) of the norovirus genome, and a norovirus particle containing a deletion in this region retains the ability to infect once and is a new virus. genomic regions that do not produce
Norovirus genome containing a modified ORF3 in which all of the above are deleted or a mutation has been introduced into the genomic region that makes it substantially unable to produce VP2;
(2) A gene encoding the VP2 protein.
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