JP7417220B2

JP7417220B2 - Imaging device and imaging method

Info

Publication number: JP7417220B2
Application number: JP2019097873A
Authority: JP
Inventors: 慶恵原田; 雄治波多野; 尚史多田隈; 睦子波多野; 孝之岩崎
Original assignee: Osaka University NUC; Tokyo Institute of Technology NUC
Current assignee: Osaka University NUC; Tokyo Institute of Technology NUC
Priority date: 2019-05-24
Filing date: 2019-05-24
Publication date: 2024-01-18
Anticipated expiration: 2039-05-24
Also published as: JP2020193819A

Description

本発明は、撮像装置および撮像方法に関する。 The present invention relates to an imaging device and an imaging method.

ダイヤモンドに含まれる窒素－空孔複合体中心（ＮＶ中心）に緑色励起光（波長：５３２ｎｍ程度）を照射すると、赤色蛍光（波長：６３８～８００ｎｍ程度）が放射される。このとき、前記ＮＶ中心にマイクロ波を照射し、その周波数を掃引すると（周波数：約２．７～約３．０ＧＨｚの範囲）、ＮＶ中心の周囲の磁場の強さに対応した特定の周波数において、赤色蛍光が減弱する現象が知られている。この現象を利用して磁場を検出する技術が、光検出磁気共鳴である（Optically Detected Magnetic Resonance；ＯＤＭＲ）。 When the nitrogen-vacancy complex center (NV center) contained in diamond is irradiated with green excitation light (wavelength: approximately 532 nm), red fluorescence (wavelength: approximately 638 to 800 nm) is emitted. At this time, when microwaves are irradiated to the NV center and the frequency is swept (frequency: range of about 2.7 to about 3.0 GHz), at a specific frequency corresponding to the strength of the magnetic field around the NV center. The phenomenon of attenuation of red fluorescence is known. A technique for detecting magnetic fields using this phenomenon is optically detected magnetic resonance (ODMR).

ＯＤＭＲを応用して、生物に由来する磁場を観測する技術が報告されている。例えば、非特許文献１は、磁性バクテリアに由来する磁場を観測したことを報告している。同文献に開示されている光学系は、ＮＶ中心層を含むダイヤモンド基板の底面から励起光を照射し、当該ダイヤモンド基板の上面と培養液との界面において、励起光を全反射させる構成である。そして、ＮＶ中心層から放射される蛍光を、ダイヤモンド基板の上面から観測している。 A technique has been reported that applies ODMR to observe magnetic fields originating from living organisms. For example, Non-Patent Document 1 reports that a magnetic field originating from magnetic bacteria was observed. The optical system disclosed in this document has a configuration in which excitation light is irradiated from the bottom surface of a diamond substrate including the NV center layer, and the excitation light is totally reflected at the interface between the top surface of the diamond substrate and the culture solution. Fluorescence emitted from the NV central layer is then observed from the top surface of the diamond substrate.

また、非特許文献２は、神経軸索を流れる神経電流によって生じる磁場を観測したことを報告している。同文献に開示されている光学系は、ダイヤモンド基板と神経軸索との間に金属層を設け、この金属層によって、ダイヤモンド基板の底面から入射してＮＶ中心層に照射される励起光を反射させている。また、前記の金属層は、ＮＶ中心層にマイクロ波を照射するマイクロ波電極の機能も果たしている。 Furthermore, Non-Patent Document 2 reports that a magnetic field generated by a nerve current flowing through a nerve axon was observed. The optical system disclosed in this document includes a metal layer provided between a diamond substrate and a nerve axon, and this metal layer reflects excitation light that enters from the bottom of the diamond substrate and irradiates the NV central layer. I'm letting you do it. Further, the metal layer also functions as a microwave electrode that irradiates the NV center layer with microwaves.

その他、生体に由来する磁場を観測する技術とは異なるが、反射膜を備えるケースにダイヤモンドセンサを格納し、励起光および蛍光をケース内に閉じ込める技術も公開されている（特許文献１）。 In addition, although different from the technology for observing magnetic fields originating from living organisms, a technology has also been disclosed in which a diamond sensor is housed in a case provided with a reflective film and excitation light and fluorescence are confined within the case (Patent Document 1).

特開２０１７－１４６１５８号公報JP 2017-146158 Publication

LeSage et al., "Optical magnetic imaging of living cells." 486 NATURE VOL496 25 APRIL 2013.LeSage et al., "Optical magnetic imaging of living cells." 486 NATURE VOL496 25 APRIL 2013. Barry et al., "Optical magnetic detection of single-neuron action potentials using quantum defects in diamond" E6730 PNAS August 8, 2017 vol.114 no.32.Barry et al., "Optical magnetic detection of single-neuron action potentials using quantum defects in diamond" E6730 PNAS August 8, 2017 vol.114 no.32.

しかしながら、前述のような従来技術には、励起光を曝露されることによって観察対象（検体）が受けるダメージを軽減したり、検体から生じる磁場の強度を高い位置解像度で検出したりする点において、改善の余地が残されていた。具体的には、下記の通りである。 However, the above-mentioned conventional techniques have problems in reducing damage to the observation target (specimen) caused by exposure to excitation light and in detecting the strength of the magnetic field generated from the specimen with high positional resolution. There was still room for improvement. Specifically, it is as follows.

まず、図７の（ａ）を参照しながら、非特許文献１に開示されている撮像装置について検討する。この撮像装置では、励起光Ｌ１を、第２表面Ｓ２に浅い角度で入射させる。その結果、第２表面Ｓ２と検体保持部１５（水中にある）との界面で全反射が生じ、励起光Ｌ１は第１表面Ｓ１側に反射する。しかし、第２表面Ｓ２近傍（１００ｎｍ程度）では、励起光Ｌ１が滲み出してエバネセント光Ｅが生じている。 First, with reference to FIG. 7(a), the imaging device disclosed in Non-Patent Document 1 will be considered. In this imaging device, the excitation light L1 is made incident on the second surface S2 at a shallow angle. As a result, total reflection occurs at the interface between the second surface S2 and the specimen holding section 15 (in water), and the excitation light L1 is reflected toward the first surface S1. However, near the second surface S2 (approximately 100 nm), the excitation light L1 leaks out and evanescent light E is generated.

検体１８が細胞やタンパク質である場合、エバネセント光Ｅに長時間暴露された検体１８はダメージを受けてしまう（光障害）。例えば、非特許文献１によると、１時間程度の観察により、磁性バクテリアが光障害を受けるとされている。 If the specimen 18 is a cell or protein, the specimen 18 exposed to evanescent light E for a long time will be damaged (photodamage). For example, according to Non-Patent Document 1, magnetic bacteria are said to be photodamaged by observation for about one hour.

また、非特許文献１に開示されている撮像装置は、励起光Ｌ１を全反射させるので、励起光Ｌ１を浅い角度で第２表面Ｓ２に入射させる必要がある。そのため、光学系が大型化する傾向にある。 Furthermore, since the imaging device disclosed in Non-Patent Document 1 totally reflects the excitation light L1, it is necessary to make the excitation light L1 enter the second surface S2 at a shallow angle. Therefore, there is a tendency for optical systems to become larger.

次に、図７の（ｂ）および（ｃ）を参照しながら、非特許文献２に開示されている撮像装置について検討する。これらの撮像装置は、金属層がマイクロ波の侵入長に比べて充分に厚い点に特徴がある（１３μｍまたは２５μｍ）。また、これらの金属層は、励起光が検体に直接照射されることを防止する遮蔽層の機能と、マイクロ波電極としての機能とを果たしている。 Next, the imaging device disclosed in Non-Patent Document 2 will be discussed with reference to FIGS. 7(b) and 7(c). These imaging devices are characterized in that the metal layer is sufficiently thick (13 μm or 25 μm) compared to the penetration length of microwaves. Furthermore, these metal layers function as a shielding layer that prevents the excitation light from being directly irradiated onto the specimen, and as a microwave electrode.

このような厚みをもった金属層では、マイクロ波をほとんど通過させることはできない。また、金属層の厚みの分だけ、検体と第１領域との距離が離れてしまい、磁場の二次元的な位置解像度が低下してしまう。それゆえ、図７の（ｂ）および（ｃ）に例示される撮像装置では、μｍオーダーの対象（細胞、タンパク質など）の発生させる磁場を二次元的に検出するためには、適切であるとは言えない。 With such a thick metal layer, almost no microwave can pass through it. Further, the distance between the specimen and the first region increases by the thickness of the metal layer, and the two-dimensional positional resolution of the magnetic field decreases. Therefore, the imaging devices illustrated in FIGS. 7(b) and 7(c) are considered to be suitable for two-dimensionally detecting the magnetic field generated by μm-order objects (cells, proteins, etc.). I can't say that.

次に、図７の（ｄ）を参照しながら、特許文献１に開示されているダイヤモンドセンサ２００ａおよびダイヤモンドセンサケース２００ｂについて検討する。特許文献１に記載されている技術は、ダイヤモンドセンサケース２００ｂに反射領域３００を設ける構成となっている。この技術は、ダイヤモンドセンサケース２００ｂ内にて励起光および蛍光を反射させることによって、ダイヤモンドセンサ２００ａから取り出される蛍光の強度を高め、これによって、ダイヤモンドセンサ２００ａによる磁場の検出感度を高める技術である。つまり、前記技術は、ダイヤモンドセンサ２００ａの体積全体で平均的に検出される磁場の検出感度を高める技術であって、検体の磁場の二次元的な分布を提供するものではない。また、ダイヤモンドセンサ２００ａとダイヤモンドセンサケース２００ｂとの間にゴミなどが入り込むこともあるため、近接する検体を高感度で計測することに適していているとは言えない。 Next, with reference to FIG. 7(d), the diamond sensor 200a and diamond sensor case 200b disclosed in Patent Document 1 will be discussed. The technique described in Patent Document 1 has a configuration in which a reflective region 300 is provided in the diamond sensor case 200b. This technique is a technique that increases the intensity of the fluorescence extracted from the diamond sensor 200a by reflecting excitation light and fluorescence within the diamond sensor case 200b, thereby increasing the detection sensitivity of the magnetic field by the diamond sensor 200a. In other words, the technique described above is a technique that increases the detection sensitivity of the magnetic field detected on the average over the entire volume of the diamond sensor 200a, and does not provide a two-dimensional distribution of the magnetic field of the specimen. Further, since dust or the like may enter between the diamond sensor 200a and the diamond sensor case 200b, it cannot be said that it is suitable for measuring a nearby specimen with high sensitivity.

本発明の一態様は、（i）励起光を暴露されることによって検体が受けるダメージを低減し、（ii）検体から生じる磁場の強度を高い位置解像度で測定する撮像装置を提供することにある。 One aspect of the present invention is to provide an imaging device that (i) reduces damage to a specimen due to exposure to excitation light, and (ii) measures the strength of a magnetic field generated from the specimen with high positional resolution. .

前記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る撮像装置は、窒素－空孔複合体中心を含有する第１領域を備えるダイヤモンド基板と；前記ダイヤモンド基板の第１表面側から該ダイヤモンド基板の前記第１領域に励起光を照射する光源部と；前記ダイヤモンド基板の第１表面と対向する第２表面側に検体を保持する検体保持部と；前記励起光を照射された前記第１領域から生じる蛍光であって、前記検体から生じる磁場の強度に応じて変化する蛍光の強度の二次元的な分布を蛍光画像として取得する蛍光画像取得部と；所定の周波数のマイクロ波を、前記第１領域に照射するマイクロ波部と、を備え；前記ダイヤモンド基板は、前記励起光を反射する反射領域をさらに備え；前記反射領域は、（i）前記第１領域と前記第２表面との間に設けられており、（ii）前記第２表面から前記検体保持部に保持されている前記検体に到達する前記励起光の光量を、第１割合以下に減衰させ、（iii）前記マイクロ波部から前記第２表面を経て前記第１領域に照射される前記マイクロ波を、第２割合以上通過させる。 In order to solve the above problems, an imaging device according to one aspect of the present invention includes: a diamond substrate including a first region containing a nitrogen-vacancy complex center; a light source unit that irradiates the first region of the substrate with excitation light; a specimen holding unit that holds the specimen on a second surface side opposite to the first surface of the diamond substrate; a fluorescence image acquisition unit that acquires, as a fluorescence image, a two-dimensional distribution of the intensity of fluorescence generated from the region and that changes depending on the strength of the magnetic field generated from the specimen; a microwave section that irradiates the first region; the diamond substrate further includes a reflection region that reflects the excitation light; (ii) attenuates the amount of the excitation light that reaches the sample held in the sample holding unit from the second surface to a first ratio or less; A second proportion or more of the microwave irradiated from the portion to the first region via the second surface is allowed to pass through the microwave.

また、本発明の一態様に係る撮像方法は、窒素－空孔複合体中心を含有する第１領域を備えるダイヤモンド基板に、検体を設置する設置工程と；前記第１領域に励起光を照射する光照射工程と；前記第１領域に、マイクロ波部からマイクロ波を照射するマイクロ波照射工程と；前記励起光を照射された前記第１領域から生じる蛍光であって、前記検体から生じる磁場の強度に応じて変化する蛍光の強度の二次元的な分布を蛍光画像として取得する蛍光画像取得工程と；を含み、前記ダイヤモンド基板は、前記励起光が入射する第１表面と、前記検体が設置される第２表面とを有しており、該第１表面と該第２表面とは対向しており；前記第１領域と前記第２表面との間には、前記励起光を反射する反射領域が設けられており；前記反射領域は、（i）前記第２表面から前記検体に到達する前記励起光の光量を、第１割合以下に減衰させ、（ii）前記マイクロ波部から前記第２表面を経て前記第１領域に照射される前記マイクロ波を、第２割合以上通過させる。 Further, the imaging method according to one aspect of the present invention includes the steps of: installing a specimen on a diamond substrate having a first region containing a nitrogen-vacancy complex center; and irradiating the first region with excitation light. a light irradiation step; a microwave irradiation step of irradiating the first region with microwaves from a microwave unit; and fluorescence generated from the first region irradiated with the excitation light, which is generated by a magnetic field generated from the specimen. a fluorescence image acquisition step of acquiring a two-dimensional distribution of fluorescence intensity that changes depending on the intensity as a fluorescence image; the diamond substrate has a first surface on which the excitation light is incident and a surface on which the specimen is placed; the first surface and the second surface are opposite to each other; between the first region and the second surface there is a reflective surface that reflects the excitation light; a region is provided; the reflective region (i) attenuates the amount of the excitation light reaching the specimen from the second surface to a first percentage or less; A second proportion or more of the microwaves irradiated onto the first region through two surfaces are allowed to pass through.

本発明の一態様によれば、（i）励起光を暴露されることによって検体が受けるダメージを低減し、（ii）検体から生じる磁場の強度を高い位置解像度で測定する撮像装置が提供される。 According to one aspect of the present invention, an imaging device is provided that (i) reduces damage to a specimen due to exposure to excitation light, and (ii) measures the strength of a magnetic field generated from the specimen with high positional resolution. .

本発明の一態様に係る撮像装置の概要を説明する模式図である。1 is a schematic diagram illustrating an overview of an imaging device according to one embodiment of the present invention. 本発明の一態様に係る撮像装置の全体構成を表す模式図である。1 is a schematic diagram showing the overall configuration of an imaging device according to one embodiment of the present invention. 本発明の一態様に係る撮像装置の主要部の構成を表す模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of main parts of an imaging device according to one embodiment of the present invention. 本発明の一実施形態において、反射領域内に設けられた基準位置領域を表す模式図である。FIG. 2 is a schematic diagram showing a reference position area provided within a reflective area in an embodiment of the present invention. 本発明の一態様に係る撮像方法を表すフローチャートである。3 is a flowchart illustrating an imaging method according to one aspect of the present invention. 本発明の一態様に係る撮像装置によって超常磁性粒子を観察した磁場分布画像および明視野像である。2 is a magnetic field distribution image and a bright field image obtained by observing superparamagnetic particles using an imaging device according to one embodiment of the present invention. （ａ）は、非特許文献１に開示されている撮像装置の概要を説明する模式図である。（ｂ）および（ｃ）は、非特許文献２に開示されている撮像装置の概要を説明する模式図である。（ｄ）は、特許文献１に開示されているダイヤモンドセンサおよびダイヤモンドセンサケースを表す図である。(a) is a schematic diagram illustrating an overview of the imaging device disclosed in Non-Patent Document 1. (b) and (c) are schematic diagrams illustrating an overview of the imaging device disclosed in Non-Patent Document 2. (d) is a diagram showing a diamond sensor and a diamond sensor case disclosed in Patent Document 1.

以下、本発明の実施の形態の一例について詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されない。 Hereinafter, an example of an embodiment of the present invention will be described in detail, but the present invention is not limited thereto.

本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。 Unless otherwise specified herein, the numerical range "A to B" means "A or more and B or less".

〔ダイヤモンド基板および反射層〕
まず、本発明の一実施形態に係る撮像装置に用いられるダイヤモンド基板について、特に反射層の構成の差異に着目しながら説明する。図１は、本発明の一実施形態に係る撮像装置１００の概要を説明する模式図である。 [Diamond substrate and reflective layer]
First, a diamond substrate used in an imaging device according to an embodiment of the present invention will be described, focusing in particular on differences in the structure of the reflective layer. FIG. 1 is a schematic diagram illustrating an overview of an imaging device 100 according to an embodiment of the present invention.

撮像装置１００において、ダイヤモンド基板１０は、第１領域１１および反射領域１２を備えている。また、ダイヤモンド基板１０の第２表面Ｓ２には、検体保持部１５が設けられている。検体保持部１５は、検体１８を保持する箇所であり、その周囲を培養液などで満たされていてもよい。ダイヤモンド基板１０の第１表面Ｓ１側から入射された励起光Ｌ１は、反射領域１２で反射し、反射光Ｌ１’として再び第１表面Ｓ１側に戻ってくる。第１領域１１で発生した蛍光Ｌ２も、第１表面Ｓ１側から観測する。 In the imaging device 100, the diamond substrate 10 includes a first region 11 and a reflective region 12. Further, a specimen holding portion 15 is provided on the second surface S2 of the diamond substrate 10. The specimen holding unit 15 is a part that holds the specimen 18, and the periphery thereof may be filled with a culture solution or the like. Excitation light L1 incident from the first surface S1 side of the diamond substrate 10 is reflected by the reflection region 12 and returns to the first surface S1 side as reflected light L1'. The fluorescence L2 generated in the first region 11 is also observed from the first surface S1 side.

本発明の一実施形態に係る撮像装置１００においては、第１表面Ｓ１側から入射された励起光Ｌ１の大部分は、反射領域１２で反射して、反射光Ｌ１’として第１表面Ｓ１側に戻ってくる。反射領域１２を通過して第２表面Ｓ２の外部に漏洩する励起光Ｌ１は、エバネセント光Ｅよりも遥かに小さい。それゆえ、長時間（例えば、１時間～数日間）の観察を続けても、検体１８が受けるダメージを低減することができる。 In the imaging device 100 according to an embodiment of the present invention, most of the excitation light L1 incident from the first surface S1 side is reflected by the reflection region 12 and is reflected as reflected light L1' onto the first surface S1 side. come back. The excitation light L1 that passes through the reflection region 12 and leaks to the outside of the second surface S2 is much smaller than the evanescent light E. Therefore, even if observation is continued for a long time (for example, from one hour to several days), damage to the specimen 18 can be reduced.

また、反射領域１２における反射は、屈折率の違いにより生じる全反射ではないので、励起光Ｌ１の入射角は、比較的自由に選択できる。その結果、光学系をより小型化する余地が生まれる。例えば、励起光Ｌ１を、通常の落射式照明により入射させることもできる。 Further, since the reflection in the reflection region 12 is not total reflection caused by a difference in refractive index, the incident angle of the excitation light L1 can be selected relatively freely. As a result, there is room for further miniaturization of the optical system. For example, the excitation light L1 can also be made incident through normal epi-illumination.

さらに、撮像装置１００におけるダイヤモンド基板１０の反射領域１２は、厚みが非常に薄く、ダイヤモンド基板１０上に直接設けられている。それゆえ、従来技術よりも高い位置解像度で検体の磁場を検出することができる。 Furthermore, the reflective region 12 of the diamond substrate 10 in the imaging device 100 is very thin and is provided directly on the diamond substrate 10 . Therefore, the magnetic field of the specimen can be detected with higher positional resolution than in the prior art.

第１領域１１は、窒素－空孔複合体中心（ＮＶ中心）を含有している領域である。第１領域１１に励起光Ｌ１を照射することにより、第１領域１１から蛍光Ｌ２が放射される。第１領域１１の厚さは、検体１８の厚さと同程度以下にすることが好ましい（例えば、１０μｍ以下とすることができる）。このような厚みであれば、第１領域１１に到達する磁場の減衰（距離の３乗に比例）を抑えつつ、第１領域１１に含まれているＮＶ中心の絶対数も充分に確保できる。第１領域１１は、例えば、化学気相成長（Chemical Vapor Deposition；ＣＶＤ）によって作製することができる。 The first region 11 is a region containing a nitrogen-vacancy complex center (NV center). By irradiating the first region 11 with the excitation light L1, the first region 11 emits fluorescence L2. The thickness of the first region 11 is preferably equal to or less than the thickness of the specimen 18 (for example, it can be 10 μm or less). With such a thickness, it is possible to suppress the attenuation of the magnetic field that reaches the first region 11 (proportional to the cube of the distance), and to ensure a sufficient absolute number of NV centers included in the first region 11. The first region 11 can be produced, for example, by chemical vapor deposition (CVD).

反射領域１２は、第１領域１１と第２表面Ｓ２との間に設けられている。反射領域１２と第２表面Ｓ２との間に、他の層を設けてもよい（例えば、生体親和性の膜１３）。 Reflection area 12 is provided between first area 11 and second surface S2. Other layers may be provided between the reflective region 12 and the second surface S2 (for example, a biocompatible film 13).

撮像装置１００において、励起光Ｌ１は、ダイヤモンド基板１０の第１表面Ｓ１側から照射され、反射領域１２にて反射される。それゆえ、第２表面Ｓ２側にある検体保持部１５に到達する励起光Ｌ１の光量は、第１割合以下に減衰する。検体保持部１５に到達する励起光Ｌ１の光量は、小さければ小さいほど好ましい。一例を挙げると、検体保持部１５に到達する励起光Ｌ１の光量は、第１領域１１に照射される励起光Ｌ１の光量の、１０^－３以下であることが好ましく、１０^－３．５以下であることがより好ましく、１０^－４以下であることがさらに好ましい。 In the imaging device 100, the excitation light L1 is irradiated from the first surface S1 side of the diamond substrate 10 and is reflected at the reflection region 12. Therefore, the light amount of the excitation light L1 that reaches the sample holding section 15 on the second surface S2 side is attenuated to the first ratio or less. The smaller the amount of excitation light L1 that reaches the sample holding section 15, the better. For example, the amount of excitation light L1 that reaches the sample holding unit 15 is preferably 10 ⁻³ or less, and 10 ^−3.5 or less of the amount of excitation light L1 that is irradiated onto the first region 11. More preferably, it is 10 ⁻⁴ or less.

なお、前記の説明における「第１割合」とは、「検体保持部１５に到達する励起光Ｌ１の光量／第１領域１１に照射される励起光Ｌ１の光量」の比の値である。「検体保持部１５に到達する励起光Ｌ１の光量」は、反射領域１２内を励起光Ｌ１が通過する際の光路長と、導体中を電磁波が進行する際の減衰率とから、計算することができる。 Note that the "first ratio" in the above description is the value of the ratio of "the amount of excitation light L1 that reaches the sample holding unit 15/the amount of excitation light L1 that is irradiated to the first region 11." The "light amount of the excitation light L1 that reaches the sample holding unit 15" can be calculated from the optical path length when the excitation light L1 passes through the reflection region 12 and the attenuation rate when the electromagnetic wave travels through the conductor. I can do it.

また、反射領域１２は、マイクロ波部４０から照射されるマイクロ波を、第２割合以上通過させる。反射領域１２を通過するマイクロ波は、大きければ大きいほど好ましい。一例を挙げると、反射領域１２を通過するマイクロ波は、マイクロ波部４０から照射されるマイクロ波の、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。 Further, the reflection region 12 allows a second percentage or more of the microwave irradiated from the microwave section 40 to pass therethrough. The larger the microwave passing through the reflection region 12 is, the better. For example, the microwave passing through the reflection region 12 is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and 95% or more of the microwave irradiated from the microwave section 40. It is even more preferable that there be.

なお、前記の説明における「第２割合」とは、第２表面Ｓ２側から反射領域１２にマイクロ波を照射した際における、「反射領域１２を通過した直後のマイクロ波の強さ／反射領域１２を通過する直前のマイクロ波の強さ」の比の値である。この比は、反射領域１２の厚さおよび導電率に基づいて計算することができる。 Note that the "second ratio" in the above description refers to the "intensity of the microwave immediately after passing through the reflection area 12/reflection area 12" when microwaves are irradiated to the reflection area 12 from the second surface S2 side. It is the value of the ratio of the microwave strength just before passing through the microwave. This ratio can be calculated based on the thickness and conductivity of reflective region 12.

ここで、撮像装置１００においては、第１表面Ｓ１側から第１領域１１へとマイクロ波を照射することも可能ではある。しかし、図２、３に示されているような光学系を採用する場合は、油浸対物レンズ２３が第１表面Ｓ１に近接して配置されることになる。すると、第１表面Ｓ１側から照射されるマイクロ波は、油浸対物レンズ２３の金属枠部に吸収されてしまい、強度が小さくなる。このため、前記のような光学系において、第１領域１１に効率よくマイクロ波を照射するためには、第２表面Ｓ２側から第１領域１１へとマイクロ波を照射することが好ましい。 Here, in the imaging device 100, it is also possible to irradiate the first region 11 with microwaves from the first surface S1 side. However, if an optical system such as that shown in FIGS. 2 and 3 is employed, the oil immersion objective lens 23 will be placed close to the first surface S1. Then, the microwave irradiated from the first surface S1 side is absorbed by the metal frame of the oil immersion objective lens 23, and its intensity becomes small. Therefore, in the optical system as described above, in order to efficiently irradiate the first region 11 with microwaves, it is preferable to irradiate the first region 11 with microwaves from the second surface S2 side.

以上に説明したように、反射領域１２は、励起光Ｌ１を第１割合以下に減衰させ、マイクロ波を第２割合以上通過させる。このような構成を達成するためには、反射領域１２の厚さを、所定の範囲に収めることが好ましい。 As explained above, the reflection region 12 attenuates the excitation light L1 to a first percentage or less, and allows the microwave to pass a second percentage or more. In order to achieve such a configuration, it is preferable to keep the thickness of the reflective region 12 within a predetermined range.

一実施形態において、反射領域１２の少なくとも一部の厚さをｄとすると、好ましくは（３×β）＜ｄ＜（α／３）であり、より好ましくは（５×β）＜ｄ＜（α／５）であり、さらに好ましくは（１０×β）＜ｄ＜（α／１０）である。ここで、αは、反射領域１２を形成する物質に対するマイクロ波の侵入長である。βは、反射領域１２を形成する物質に対する励起光Ｌ１の侵入長である。反射領域の厚みが前記の条件を満たすならば、検体保持部１５に到達する励起光Ｌ１の光量を第１割合以下に減衰させ、かつ、第２表面Ｓ２を経て第１領域１１に照射されるマイクロ波を第２割合以上通過させることができる。 In one embodiment, when the thickness of at least a portion of the reflective region 12 is d, preferably (3×β)<d<(α/3), more preferably (5×β)<d<( α/5), and more preferably (10×β)<d<(α/10). Here, α is the penetration length of the microwave into the material forming the reflective region 12. β is the penetration length of the excitation light L1 into the material forming the reflection region 12. If the thickness of the reflective region satisfies the above conditions, the amount of excitation light L1 that reaches the specimen holding section 15 is attenuated to a first ratio or less, and the first region 11 is irradiated via the second surface S2. A second proportion or more of microwaves can be passed through.

なお、侵入長とは、（２ρ／ωμ）^１／２で表される値である（ρは導体の電気抵抗率、ωは電磁波の角周波数（＝２π×周波数）、μは導体の絶対透磁率である）。侵入長とは、電磁波が導体中に侵入できる深さを表している。表面からの深さが侵入長である地点における電流密度は、導体表面の電流密度の１／ｅになる（ｅは自然対数の底）。 Note that the penetration length is a value expressed as (2ρ/ωμ) ^1/2 (ρ is the electrical resistivity of the conductor, ω is the angular frequency of the electromagnetic wave (=2π × frequency), and μ is the absolute transparency of the conductor. magnetic flux). Penetration length refers to the depth at which electromagnetic waves can penetrate into a conductor. The current density at a point where the depth from the surface is the penetration length is 1/e of the current density at the conductor surface (e is the base of the natural logarithm).

他の実施形態において、前記反射領域の少なくとも一部の厚さをｄ１とし、ｄ２＝（α×β）^１／２とすると、好ましくは（１／１０）＜（ｄ１／ｄ２）＜１０であり、より好ましくは（１／５）＜（ｄ１／ｄ２）＜５であり、さらに好ましくは（１／３）＜（ｄ１／ｄ２）＜３である。なお、ｄ２とは、「反射領域１２に対する励起光Ｌ１の侵入長とマイクロ波の侵入長との相乗平均」を表している。 In another embodiment, when the thickness of at least a part of the reflective region is d1 and d2=(α×β) ^1/2 , preferably (1/10)<(d1/d2)<10. , more preferably (1/5)<(d1/d2)<5, still more preferably (1/3)<(d1/d2)<3. Note that d2 represents "the geometric mean of the penetration length of the excitation light L1 and the penetration length of the microwave with respect to the reflection region 12."

以上を鑑みると、反射領域１２の少なくとも一部の厚さは、材質にも左右されるが、９００ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、７００ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、または２００ｎｍ以下とすることができる。同様に反射領域１２の厚さは、１０ｎｍ以上、３０ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、８０ｎｍ以上、または１００ｎｍ以上とすることができる。例えば、反射領域１２をチタン膜で実装する場合には、厚さを１００～９００ｎｍとすることができる。反射領域１２を白金膜で実装する場合には、厚さを５０～４５０ｎｍとすることができる。反射領域１２を金膜で実装する場合には、厚さを２５～２２５ｎｍとすることができる。反射領域１２を銀膜で実装する場合には、厚さを２０～１８０ｎｍとすることができる。反射領域１２を銅膜で実装する場合には、厚さを２０～１８０ｎｍとすることができる。反射領域１２をアルミニウム膜で実装する場合には、厚さを２５～２２５ｎｍとすることができる。 In view of the above, the thickness of at least a portion of the reflective region 12 may be 900 nm or less, 800 nm or less, 700 nm or less, 600 nm or less, 500 nm or less, 400 nm or less, 300 nm or less, or 200 nm or less, although it also depends on the material. can do. Similarly, the thickness of the reflective region 12 can be 10 nm or more, 30 nm or more, 50 nm or more, 80 nm or more, or 100 nm or more. For example, when the reflective region 12 is implemented with a titanium film, the thickness can be set to 100 to 900 nm. When the reflective region 12 is implemented with a platinum film, the thickness can be set to 50 to 450 nm. When the reflective region 12 is implemented with a gold film, the thickness can be 25 to 225 nm. When the reflective region 12 is implemented with a silver film, the thickness can be set to 20 to 180 nm. When the reflective region 12 is implemented with a copper film, the thickness can be set to 20 to 180 nm. When the reflective region 12 is implemented with an aluminum film, the thickness can be set to 25 to 225 nm.

反射領域１２の少なくとも一部が前述した程度の厚さであるならば、励起光Ｌ１の大部分を反射し、マイクロ波の大部分を通過させることができる。さらに、反射領域１２が前述した程度の厚さであるならば、検体１８と第１領域１１との距離が充分に小さくなり、検体１８に由来する磁場を充分に透過させられる点においても好ましい。 If at least a portion of the reflection region 12 has the thickness described above, most of the excitation light L1 can be reflected and most of the microwaves can be passed. Furthermore, if the reflective region 12 has the thickness described above, the distance between the specimen 18 and the first region 11 becomes sufficiently small, which is preferable in that the magnetic field originating from the specimen 18 can be sufficiently transmitted.

一実施形態において、反射領域１２の少なくとも一部は、厚みが均一に形成されている。反射領域の厚みが均一であるならば、検体１８から生じる磁場をより高感度で検知することができる。これは、第１領域１１内のＮＶ中心の光検出磁気共鳴特性が、励起光の強度およびマイクロ波磁場の強度によって差異を生じるためである。このような差異が生じると、最適な感度を得る条件に差異が生じてしまう（もっとも、ある程度の差異ならば、視野内の座標点ごとの校正で補正が可能である）。例えば、反射領域１２の少なくとも一部における膜厚の最大値および最小値は、反射領域１２の少なくとも一部の厚さの平均値に対して、±３０％の範囲に収まっていることが好ましく、±２５％の範囲に収まっていることがより好ましく、±２０％の範囲に収まっていることがさらに好ましい。 In one embodiment, at least a portion of the reflective region 12 is formed to have a uniform thickness. If the thickness of the reflective region is uniform, the magnetic field generated from the specimen 18 can be detected with higher sensitivity. This is because the photodetection magnetic resonance characteristics of the NV center in the first region 11 vary depending on the intensity of the excitation light and the intensity of the microwave magnetic field. When such a difference occurs, a difference occurs in the conditions for obtaining the optimum sensitivity (however, if the difference is to a certain extent, it can be corrected by calibrating each coordinate point within the field of view). For example, it is preferable that the maximum and minimum values of the film thickness in at least a portion of the reflective region 12 fall within a range of ±30% with respect to the average value of the thickness of at least a portion of the reflective region 12, It is more preferable that it falls within the range of ±25%, and even more preferably that it falls within the range of ±20%.

なお、前述した反射領域１２の厚さに関する議論において、「反射領域１２の少なくとも一部」とは、例えば、励起光Ｌ１が照射される部分でありうる。あるいは、「反射領域１２の少なくとも一部」とは、基準位置領域１２ａ（後述）以外の部分でありうる。あるいは、「反射領域１２の少なくとも一部」とは、検体保持部１５が設けられる部分でありうる。好ましくは、「反射領域１２の少なくとも一部」とは、油浸対物レンズ２３の視野内に含まれている反射領域１２の一部であって、検体１８の観測範囲の少なくとも一部を包含している。 Note that in the discussion regarding the thickness of the reflective region 12 described above, "at least a portion of the reflective region 12" may be, for example, a portion that is irradiated with the excitation light L1. Alternatively, "at least a portion of the reflection area 12" may be a portion other than the reference position area 12a (described later). Alternatively, "at least a portion of the reflective region 12" may be a portion where the specimen holding section 15 is provided. Preferably, “at least a portion of the reflective region 12” is a portion of the reflective region 12 included within the field of view of the oil immersion objective lens 23, and includes at least a portion of the observation range of the specimen 18. ing.

反射領域１２の材料は、特に限定されない。一実施形態において、反射領域１２は、金属層である。これは、金属は加工性に優れ、均一な膜厚を達成しやすいからである。一実施形態において、反射領域１２は、金、白金、アルミニウムまたはチタンを含む金属層である。他の実施形態において、反射領域１２は、金、白金、アルミニウムまたはチタンからなる金属層である。これらの金属は、生物に対する毒性が低いため、反射領域１２との接触により検体１８に与えられるダメージを軽減できる。なお、後述する生体親和性を有する膜１３を設ける場合には、反射領域１２の材料として、生物に対する毒性が相対的に高い物質（銀、銅など）を用いてもよい。 The material of the reflective region 12 is not particularly limited. In one embodiment, reflective region 12 is a metal layer. This is because metal has excellent workability and can easily achieve a uniform film thickness. In one embodiment, reflective region 12 is a metal layer including gold, platinum, aluminum or titanium. In other embodiments, reflective region 12 is a metal layer consisting of gold, platinum, aluminum or titanium. Since these metals have low toxicity to living organisms, damage to the specimen 18 due to contact with the reflective region 12 can be reduced. Note that in the case of providing a biocompatible film 13 to be described later, a material having relatively high toxicity to living organisms (silver, copper, etc.) may be used as the material for the reflective region 12.

一実施形態において、ダイヤモンド基板１０の第２表面Ｓ２には、生体親和性を有する膜１３が設けられている。このような構成によれば、検体１８は、生体親和性を有する膜１３と接触することになる。それゆえ、ダイヤモンド基板１０（第１領域１１）との接触により検体１８に与えられるダメージを低減することができる。 In one embodiment, the second surface S2 of the diamond substrate 10 is provided with a biocompatible film 13. According to such a configuration, the specimen 18 comes into contact with the biocompatible membrane 13. Therefore, damage caused to the specimen 18 due to contact with the diamond substrate 10 (first region 11) can be reduced.

生体親和性を有する膜１３の材料として利用可能な物質の具体例としては、コラーゲン、ポリリジン、フォトレジストが挙げられる。検体１８から生じる磁場の二次元的な解像度を高めるためには、生体親和性を有する膜１３の厚さは、生体親和性を維持する範囲で薄ければ薄いほどよい。一例を挙げると、生体親和性を有する膜１３の厚さは、１００ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、または１０ｎｍ以下とすることができる。なお、生体親和性を有する膜１３としてコラーゲンを塗布する場合、塗布液が弱酸性になることがあるので、反射領域１２は、酸に比較的強い物質であることが好ましい。具体的には、反射領域１２がチタンおよび金を含む方が、アルミニウムを含むよりも好ましい。 Specific examples of substances that can be used as biocompatible materials for the membrane 13 include collagen, polylysine, and photoresist. In order to increase the two-dimensional resolution of the magnetic field generated from the specimen 18, the thinner the biocompatible film 13 is, the better it is within the range that maintains the biocompatibility. For example, the thickness of the biocompatible film 13 can be 100 nm or less, 50 nm or less, 30 nm or less, or 10 nm or less. Note that when collagen is applied as the biocompatible film 13, the coating liquid may become weakly acidic, so the reflective region 12 is preferably made of a substance that is relatively resistant to acids. Specifically, it is more preferable for the reflective region 12 to contain titanium and gold than to contain aluminum.

ダイヤモンド基板１０全体の厚さは、例えば、０．３ｍｍ程度とすることができる。この程度の厚さならば、ピンセットなどでの取扱が容易であり、かつ、充分な機械的強度を有していると言える。 The overall thickness of the diamond substrate 10 can be, for example, about 0.3 mm. With a thickness of this level, it can be said that it is easy to handle with tweezers and has sufficient mechanical strength.

〔撮像装置〕
次に、撮像装置１００の一実施形態について、図２、３を参照しながら説明する。図２は、本発明の一態様に係る撮像装置１００の全体構成を表す模式図である。図３は、撮像装置１００の主要部（ダイヤモンド基板１０の近傍）を表す模式図である。 [Imaging device]
Next, one embodiment of the imaging device 100 will be described with reference to FIGS. 2 and 3. FIG. 2 is a schematic diagram showing the overall configuration of an imaging device 100 according to one aspect of the present invention. FIG. 3 is a schematic diagram showing the main part of the imaging device 100 (near the diamond substrate 10).

撮像装置１００には、光源部２０と、蛍光画像取得部３０と、マイクロ波部４０が備えられている。撮像装置１００は、任意構成として、明視野画像取得部５０を備えていてもよい。 The imaging device 100 includes a light source section 20, a fluorescence image acquisition section 30, and a microwave section 40. The imaging device 100 may include a bright field image acquisition unit 50 as an optional configuration.

光源部２０は、ダイヤモンド基板１０の第１領域１１に、励起光Ｌ１を照射する。光源部２０は、例えば、波長５３２ｎｍ前後の励起光Ｌ１を放射する、レーザ光源である。光源部２０から照射された励起光Ｌ１は、広視野照明用レンズ２１、ダイクロイックミラー２２、油浸対物レンズ２３を経由して、第１領域１１に照射される。第１領域１１で発生した蛍光Ｌ２は、反射領域１２を超えて第２表面Ｓ２側へは進行できないので、油浸対物レンズ２３、ダイクロイックミラー２２、ノッチフィルタ２４、蛍光フィルタ２５、および結像レンズ２６を経由して、蛍光画像取得部３０に到達する。 The light source section 20 irradiates the first region 11 of the diamond substrate 10 with excitation light L1. The light source unit 20 is, for example, a laser light source that emits excitation light L1 having a wavelength of about 532 nm. The excitation light L1 irradiated from the light source section 20 is irradiated onto the first region 11 via the wide-field illumination lens 21, the dichroic mirror 22, and the oil immersion objective lens 23. Since the fluorescence L2 generated in the first region 11 cannot go beyond the reflection region 12 toward the second surface S2, the oil immersion objective lens 23, the dichroic mirror 22, the notch filter 24, the fluorescence filter 25, and the imaging lens 26, it reaches the fluorescence image acquisition section 30.

油浸対物レンズ２３は、開口数（Numerical Aperture；ＮＡ）ができる限り大きいものを用いることが好ましい。開口数が大きければ、蛍光Ｌ２の集光効率が高まり、それゆえ、磁場検出の感度が高くなる。ただし、一般的に、開口数の大きい対物レンズは、作動長（Working Distance；ＷＤ）が短い。市販されている対物レンズの中では、作動長：０．３ｍｍ、開口数：１．３０、倍率：６０倍の対物レンズがバランスに優れていて好ましい。この観点からは、ダイヤモンド基板１０の厚さを０．３ｍｍ以下とすることが好ましい。 It is preferable to use an oil immersion objective lens 23 with a numerical aperture (NA) as large as possible. The larger the numerical aperture, the higher the efficiency of collecting the fluorescence L2 and therefore the higher the sensitivity of magnetic field detection. However, generally, an objective lens with a large numerical aperture has a short working distance (WD). Among commercially available objective lenses, an objective lens with a working length of 0.3 mm, a numerical aperture of 1.30, and a magnification of 60 times is excellent in balance and is preferred. From this point of view, it is preferable that the thickness of the diamond substrate 10 be 0.3 mm or less.

蛍光画像取得部３０は、第１領域１１から生じる蛍光Ｌ２を検知し、蛍光Ｌ２の強度の二次元的な分布を蛍光画像として取得する。第１領域１１にマイクロ波を照射しその周波数を掃引すると、検体１８から生じた磁場の強さに対応した特定の周波数において、蛍光Ｌ２が減弱する。蛍光画像取得部３０は、顕微鏡の視野内の二次元的な位置と、当該位置において蛍光Ｌ２が減弱する特定の周波数とを関連付けたデータ（蛍光画像）を生成する。このようなデータは、例えば、プロセッサ、マイクロ波発信機（マイクロ波部４０）、およびイメージセンサを組み合わせれば、得ることができる。その後、蛍光画像をさらに加工して、他のデータを生成してもよい。このようなデータの例としては、磁場の強さを二次元的に知覚できるようにしたデータが挙げられる（本明細書では、このデータを「磁場分布画像」と称する）。 The fluorescence image acquisition unit 30 detects the fluorescence L2 generated from the first region 11, and acquires a two-dimensional distribution of the intensity of the fluorescence L2 as a fluorescence image. When the first region 11 is irradiated with microwaves and its frequency is swept, the fluorescence L2 is attenuated at a specific frequency corresponding to the strength of the magnetic field generated from the specimen 18. The fluorescence image acquisition unit 30 generates data (fluorescence image) in which a two-dimensional position within the field of view of the microscope is associated with a specific frequency at which the fluorescence L2 is attenuated at the position. Such data can be obtained, for example, by combining a processor, a microwave transmitter (microwave section 40), and an image sensor. The fluorescence image may then be further processed to generate other data. An example of such data is data that allows the strength of a magnetic field to be perceived two-dimensionally (in this specification, this data is referred to as a "magnetic field distribution image").

マイクロ波部４０は、第１領域１１にマイクロ波を照射する。図２、３に示した例では、マイクロ波コイルとして、マイクロ波部を実装している。マイクロ波コイルは、２層プリント基板上に形成されているループコイルであって、当該２層プリント基板に垂直な面内に電流が流れるように構成されている（図３に即すると、上下方向に電流が流れるように構成されている）。その結果、ダイヤモンド基板１０に垂直な方向にマイクロ波が照射される。このとき、マイクロ波は電磁波であるから、ダイヤモンド基板１０の面内方向にマイクロ波の磁場が生成される（図３に即すると、マイクロ波部４０の間に、左右方向にマイクロ波の磁場が生成される）。 The microwave unit 40 irradiates the first region 11 with microwaves. In the examples shown in FIGS. 2 and 3, a microwave section is mounted as a microwave coil. The microwave coil is a loop coil formed on a two-layer printed circuit board, and is configured so that current flows in a plane perpendicular to the two-layer printed circuit board (according to FIG. 3, it flows in the vertical direction). (configured so that current flows through it). As a result, the diamond substrate 10 is irradiated with microwaves in a direction perpendicular to it. At this time, since the microwave is an electromagnetic wave, a microwave magnetic field is generated in the in-plane direction of the diamond substrate 10 (according to FIG. 3, a microwave magnetic field is generated in the left-right direction between the microwave parts 40). generated).

図３のように、マイクロ波部４０をダイヤモンド基板１０の両側面に配する構成とすれば、マイクロ波を第１領域１１の近くから照射できるので、より高感度な測定が可能となる。さらに、図３の構成では、反射領域１２がマイクロ波部４０を兼ねていない。そのため、反射領域１２を薄くすることができ、その結果、第１領域１１と検体１８との距離も近くなる。このことによっても、より高感度な測定が可能となる。 If the microwave section 40 is disposed on both side surfaces of the diamond substrate 10 as shown in FIG. 3, the microwave can be irradiated from near the first region 11, thereby enabling measurement with higher sensitivity. Furthermore, in the configuration of FIG. 3, the reflection region 12 does not also serve as the microwave section 40. Therefore, the reflective region 12 can be made thinner, and as a result, the distance between the first region 11 and the specimen 18 becomes shorter. This also allows for more sensitive measurements.

なお、このようにダイヤモンド基板１０の面内方向にマイクロ波の磁場を生成させる場合は、第１領域１１の表面が（１１１）面となっており、かつ、ＮＶ中心の軸が全て［１１１］方向（すなわち（１１１）面に垂直な方向）に配向しているときに、最も高感度に磁場を検出することができる。このような結晶構造の第１領域１１であれば、ＮＶ中心の軸がマイクロ波の磁場の生成方向と直交する。その結果、磁場の強さに応じた蛍光Ｌ２の変化が大きくなり、磁場の検知感度が上昇する。 In addition, when generating a microwave magnetic field in the in-plane direction of the diamond substrate 10 in this way, the surface of the first region 11 is a (111) plane, and all the axes of the NV center are [111] When the magnetic field is oriented in the direction (that is, the direction perpendicular to the (111) plane), the magnetic field can be detected with the highest sensitivity. In the first region 11 having such a crystal structure, the axis of the NV center is perpendicular to the generation direction of the microwave magnetic field. As a result, the change in fluorescence L2 depending on the strength of the magnetic field increases, and the detection sensitivity of the magnetic field increases.

撮像装置１００は、静磁場コイル４５を備えていてもよい。静磁場コイル４５は、ダイヤモンド基板１０に垂直な方向に静磁場を与える。このような静磁場を与えることにより、検体１８から生じる磁場がより検出しやすくなる。 The imaging device 100 may include a static magnetic field coil 45. The static magnetic field coil 45 applies a static magnetic field in a direction perpendicular to the diamond substrate 10. By applying such a static magnetic field, the magnetic field generated from the specimen 18 becomes easier to detect.

ダイヤモンド基板１０をカバーグラス４３上に固定する際には、ダイヤモンド基板１０の端部のみを接着剤で固定することが好ましい。カバーグラス４３の底面とダイヤモンド基板１０とを接着剤で固定した場合、カバーグラス４３とダイヤモンド基板１０との間に接着剤の層が形成される。接着剤の層が形成されると、油浸対物レンズ２３からダイヤモンド基板１０までの距離が増加し、油浸対物レンズ２３の作動長に第１領域１１を収めきれなくなるおそれがあるため、ダイヤモンド基板１０の端部のみを接着剤で固定することが好ましい。 When fixing the diamond substrate 10 onto the cover glass 43, it is preferable to fix only the ends of the diamond substrate 10 with an adhesive. When the bottom surface of the cover glass 43 and the diamond substrate 10 are fixed with an adhesive, an adhesive layer is formed between the cover glass 43 and the diamond substrate 10. When the adhesive layer is formed, the distance from the oil immersion objective lens 23 to the diamond substrate 10 increases, and there is a possibility that the first region 11 cannot be accommodated within the working length of the oil immersion objective lens 23. Preferably, only the ends of 10 are fixed with adhesive.

図３において、検体１８は、液体４８（培養液など）に液浸した状態になっている。このように液体４８中に検体１８を配置する場合は、液体４８が流出しないように、外壁４７を設ける。また、マイクロ波コイル（マイクロ波部４０）の配線層およびスルーホール（表側配線層と裏側配線層とを接続する構造）は、表面を撥水材で被覆しておくことが好ましい。もちろん、検体１８を、液体中以外（空気中など）に配置してもよい。 In FIG. 3, the specimen 18 is immersed in a liquid 48 (culture solution, etc.). When the specimen 18 is placed in the liquid 48 in this manner, an outer wall 47 is provided to prevent the liquid 48 from flowing out. Further, it is preferable that the surfaces of the wiring layer and the through hole (structure connecting the front side wiring layer and the back side wiring layer) of the microwave coil (microwave section 40) are coated with a water-repellent material. Of course, the specimen 18 may be placed in a location other than the liquid (eg, in the air).

撮像装置１００は、任意構成で、明視野画像取得部５０を備えていてもよい。明視野画像取得部５０は、明視野による検体１８の画像を取得する。明視野画像取得部５０は、例えば、ＣＣＤカメラである。図２の例においては、明視野光源部５１（ＬＥＤなど）から照射された明視野用照明光Ｌ３は、広視野照明用レンズ５２、ダイクロイックミラー５３、および水浸対物レンズ５４を経由して、検体１８に到達する。その後、検体１８により反射されたり散乱されたりした光Ｌ４は、水浸対物レンズ５４、ダイクロイックミラー５３、結像レンズ５５を経由して、明視野画像取得部５０に到達する。明視野画像取得部５０は、検出した光から、明視野画像を生成する。 The imaging device 100 may include a bright field image acquisition unit 50 with an arbitrary configuration. The bright field image acquisition unit 50 acquires a bright field image of the specimen 18. The bright field image acquisition unit 50 is, for example, a CCD camera. In the example of FIG. 2, the bright field illumination light L3 emitted from the bright field light source unit 51 (LED etc.) passes through the wide field illumination lens 52, the dichroic mirror 53, and the water immersion objective lens 54. The specimen 18 is reached. Thereafter, the light L4 reflected or scattered by the specimen 18 reaches the bright field image acquisition section 50 via the water immersion objective lens 54, the dichroic mirror 53, and the imaging lens 55. The bright field image acquisition unit 50 generates a bright field image from the detected light.

なお、明視野用照明光Ｌ３は、励起光Ｌ１よりも桁違いに微弱な光である。また、明視野用照明光Ｌ３は、検体１８に対する影響が最小となる波長を選ぶことができる。さらに、明視野用照明光Ｌ３は、観察が必要となる瞬間のみ照射すればよい。それゆえ、通常は、明視野用照明光Ｌ３が検体１８にダメージを及ぼすことはない。 Note that the bright field illumination light L3 is an order of magnitude weaker than the excitation light L1. Moreover, the bright field illumination light L3 can be selected to have a wavelength that has the least influence on the specimen 18. Furthermore, the bright field illumination light L3 may be applied only at the moment when observation is required. Therefore, normally, the bright field illumination light L3 does not damage the specimen 18.

明視野画像取得部５０が取得する明視野画像は、第２表面Ｓ２側の画像を取得することが好ましい。つまり、図２、３の水浸対物レンズ５４のように、明視野画像を取得するための対物レンズは、第２表面Ｓ２側に設置することが好ましい。これは、第２表面Ｓ２側からならば、反射領域１２によって、明視野画像の取得が妨げられないためである。逆に、第１表面Ｓ１側から明視野画像を取得しようとしても、反射領域１２がほとんど光を透過しないため、明視野画像を取得することは難しい。 The bright field image acquired by the bright field image acquisition unit 50 is preferably an image on the second surface S2 side. That is, like the water immersion objective lens 54 in FIGS. 2 and 3, an objective lens for acquiring a bright field image is preferably installed on the second surface S2 side. This is because the reflection region 12 does not prevent the acquisition of a bright field image from the second surface S2 side. Conversely, even if an attempt is made to acquire a bright field image from the first surface S1 side, it is difficult to acquire a bright field image because the reflective region 12 hardly transmits light.

図２、３のように、第１表面Ｓ１側に蛍光画像取得用の対物レンズ（油浸対物レンズ２３）を配置し、第２表面Ｓ２側に明視野画像取得用の対物レンズ（水浸対物レンズ５４）を配置することによって、検体１８の明視野画像と蛍光画像とを同時的に取得できる。 As shown in FIGS. 2 and 3, an objective lens for acquiring a fluorescent image (oil immersion objective lens 23) is placed on the first surface S1 side, and an objective lens for bright field image acquisition (water immersion objective lens 23) is placed on the second surface S2 side. By arranging the lens 54), a bright field image and a fluorescence image of the specimen 18 can be obtained simultaneously.

このように、撮像装置１００に明視野画像取得部５０を設ける場合は、反射領域１２の中に、基準位置領域１２ａを１箇所以上設けることが好ましい（図４を参照）。基準位置領域１２ａは、反射領域１２の中でも、反射領域１２を構成する材料の厚さが他の部分よりも薄く設けられている領域である。このような構成とすると、基準位置領域１２ａにおいては、より多くの励起光Ｌ１が反射領域１２を透過する。したがって、明視野画像取得部５０が取得する明視野画像には、励起光Ｌ１がより多く透過して見える領域が含まれるようになる。明視野画像おける励起光Ｌ１がより多く透過して見える領域は、基準位置領域１２ａに対応しているから、蛍光画像における位置と明視野画像における位置とを容易に対応付けることができる。 In this way, when the bright field image acquisition unit 50 is provided in the imaging device 100, it is preferable to provide one or more reference position regions 12a in the reflection region 12 (see FIG. 4). The reference position area 12a is an area in the reflection area 12 where the thickness of the material forming the reflection area 12 is thinner than in other parts. With such a configuration, more of the excitation light L1 passes through the reflection region 12 in the reference position region 12a. Therefore, the bright field image acquired by the bright field image acquisition unit 50 includes a region through which more of the excitation light L1 is visible. Since the region in the bright field image through which more of the excitation light L1 can be seen corresponds to the reference position region 12a, the position in the fluorescence image and the position in the bright field image can be easily correlated.

なお、蛍光画像における基準位置領域１２ａの位置は、例えば、検体保持部１５に、第２表面Ｓ２側から、位置合わせ用長波長光（蛍光フィルタ２５のカットオフ波長よりも長波長である赤色光）を照射することにより検出できる。位置合わせ用長波長光の照射は、同じ光量の励起光Ｌ１の照射よりは、検体１８に及ぼすダメージは少ない。しかし、基準位置領域１２ａを透過できるだけの光量が必要になるため、明視野用照明光Ｌ３よりは光量が大きい。それゆえ、位置合わせ用長波長光を長時間照射し続けると、やはり、検体１８にダメージを及ぼす場合がある。したがって、位置合わせ用長波長光は、位置合わせ時のみ、短時間だけ照射することが好ましい。この位置合わせは、図１の装置の装着後、一度のみ行えば充分である。位置合わせ用長波長光の光源および光路は、明視野用照明光と共通であってもよい。 Note that the position of the reference position region 12a in the fluorescence image is determined by, for example, applying long wavelength light for alignment (red light having a wavelength longer than the cutoff wavelength of the fluorescence filter 25) to the specimen holding unit 15 from the second surface S2 side. ) can be detected by irradiation. Irradiation with long wavelength light for positioning causes less damage to the specimen 18 than irradiation with the same amount of excitation light L1. However, since a sufficient amount of light is required to pass through the reference position area 12a, the amount of light is larger than the bright field illumination light L3. Therefore, if the long wavelength light for positioning is continuously irradiated for a long time, the specimen 18 may be damaged. Therefore, it is preferable that the long-wavelength light for alignment is applied for a short time only during alignment. It is sufficient to perform this positioning only once after the device of FIG. 1 has been installed. The light source and optical path of the long wavelength light for alignment may be the same as the illumination light for bright field.

〔撮像方法〕
本発明の一態様は、ダイヤモンド基板１０を利用した撮像方法である。以下、図５を参照しながら、前記撮像方法について説明する。 [Imaging method]
One aspect of the present invention is an imaging method using the diamond substrate 10. The imaging method will be described below with reference to FIG.

（Ｓ１０：設置工程）
Ｓ１０では、ダイヤモンド基板１０にある検体保持部１５に、検体１８を設置する。例えば、ダイヤモンド基板１０の上で観察対象となる細胞を培養することにより、設置工程は実施できる。あるいは、単に、検体保持部１５に検体１８を載置してもよい。 (S10: Installation process)
In S10, the specimen 18 is placed on the specimen holding section 15 on the diamond substrate 10. For example, the installation process can be performed by culturing cells to be observed on the diamond substrate 10. Alternatively, the specimen 18 may simply be placed on the specimen holding section 15.

（Ｓ２０：光照射工程）
Ｓ２０では、ダイヤモンド基板１０の第１表面Ｓ１側から、第１領域１１に励起光Ｌ１を照射する。前述した通り、ダイヤモンド基板１０は反射領域１２を備えているので、励起光Ｌ１はほとんど反射され、検体保持部１５には第１割合以下しか到達できない。 (S20: Light irradiation step)
In S20, the first region 11 is irradiated with excitation light L1 from the first surface S1 side of the diamond substrate 10. As described above, since the diamond substrate 10 includes the reflection region 12, most of the excitation light L1 is reflected, and only a first proportion or less can reach the specimen holding section 15.

（Ｓ３０：マイクロ波照射工程）
Ｓ３０では、ダイヤモンド基板１０の第１領域１１に、マイクロ波部４０からマイクロ波を照射する。照射するマイクロ波の周波数を掃引すると、特定の周波数において蛍光Ｌ２が大きく減弱するので、磁場の強さが検出できる。 (S30: Microwave irradiation step)
In S30, the first region 11 of the diamond substrate 10 is irradiated with microwaves from the microwave section 40. When the frequency of the irradiated microwave is swept, the fluorescence L2 is greatly attenuated at a specific frequency, so that the strength of the magnetic field can be detected.

（Ｓ４０：蛍光画像取得工程）
Ｓ４０では、検体１８から生じる磁場の強度に応じて変化する蛍光Ｌ２の強度の二次元的な分布を、蛍光画像として取得する。Ｓ３０においては、マイクロ波をダイヤモンド基板１０の全体に照射しているので、二次元的な蛍光画像が取得できる。なお通常は、Ｓ４０においても、励起光およびマイクロ波は照射されている。 (S40: Fluorescence image acquisition step)
In S40, a two-dimensional distribution of the intensity of the fluorescence L2 that changes depending on the intensity of the magnetic field generated from the specimen 18 is acquired as a fluorescence image. In S30, since the entire diamond substrate 10 is irradiated with microwaves, a two-dimensional fluorescence image can be obtained. Note that normally, excitation light and microwaves are irradiated even in S40.

本発明の一実施形態に係る撮像方法によれば、検体保持部１５に到達する励起光Ｌ１の光量を、従来よりも低減することができる。それゆえ、前記撮像方法は、光によりダメージを受ける検体の撮像に有利である。例えば、撮像対象が、細胞、タンパク質、細胞内小組織、ＤＮＡなどの生物検体である場合に有利である。同様の理由によって、長時間にわたる観察（例えば、１時間以上、１０時間以上、１日以上、場合によっては１週間以上）にも、前記撮像方法は有利に用いられる。 According to the imaging method according to an embodiment of the present invention, the amount of excitation light L1 that reaches the specimen holding section 15 can be reduced compared to the conventional method. Therefore, the imaging method is advantageous for imaging specimens that are damaged by light. For example, it is advantageous when the imaging target is a biological specimen such as a cell, protein, intracellular small tissue, or DNA. For the same reason, the imaging method is also advantageously used for long-term observation (for example, 1 hour or more, 10 hours or more, 1 day or more, in some cases, 1 week or more).

〔まとめ〕
本発明は、以下の構成を包含している。〔summary〕
The present invention includes the following configurations.

＜１＞
窒素－空孔複合体中心を含有する第１領域１１を備えるダイヤモンド基板１０と、
前記ダイヤモンド基板１０の第１表面Ｓ１側から該ダイヤモンド基板１０の前記第１領域１１に励起光Ｌ１を照射する光源部２０と、
前記ダイヤモンド基板１０の第１表面Ｓ１と対向する第２表面Ｓ２側に検体を保持する検体保持部１５と、
前記励起光Ｌ１を照射された前記第１領域１１から生じる蛍光Ｌ２であって、前記検体１８から生じる磁場の強度に応じて変化する蛍光Ｌ２の強度の二次元的な分布を蛍光画像として取得する蛍光画像取得部３０と、
所定の周波数のマイクロ波を、前記第１領域に照射するマイクロ波部４０と、
を備え、
前記ダイヤモンド基板１０は、前記励起光Ｌ１を反射する反射領域１２をさらに備え、
前記反射領域１２は、
前記第１領域１１と前記第２表面Ｓ２との間に設けられており、
前記第２表面Ｓ２から前記検体保持部１５に保持されている前記検体１８に到達する前記励起光Ｌ１の光量を、第１割合以下に減衰させ、
前記マイクロ波部４０から前記第２表面Ｓ２を経て前記第１領域１１に照射される前記マイクロ波を、第２割合以上通過させる、
ことを特徴とする撮像装置１００。 <1>
a diamond substrate 10 comprising a first region 11 containing a nitrogen-vacancy complex center;
a light source unit 20 that irradiates the first region 11 of the diamond substrate 10 with excitation light L1 from the first surface S1 side of the diamond substrate 10;
a specimen holding section 15 that holds a specimen on a second surface S2 side opposite to the first surface S1 of the diamond substrate 10;
A two-dimensional distribution of the intensity of fluorescence L2 generated from the first region 11 irradiated with the excitation light L1, which changes depending on the intensity of the magnetic field generated from the specimen 18, is obtained as a fluorescence image. A fluorescence image acquisition unit 30;
a microwave unit 40 that irradiates the first region with microwaves of a predetermined frequency;
Equipped with
The diamond substrate 10 further includes a reflection region 12 that reflects the excitation light L1,
The reflective area 12 is
provided between the first region 11 and the second surface S2,
Attenuating the light intensity of the excitation light L1 that reaches the sample 18 held in the sample holding section 15 from the second surface S2 to a first ratio or less,
Allowing a second proportion or more of the microwave irradiated from the microwave section 40 to the first region 11 via the second surface S2 to pass through;
An imaging device 100 characterized by:

前記構成によれば、検体１８に到達する励起光Ｌ１を低減できる。それゆえ、励起光Ｌ１を暴露されることによって検体１８が受けるダメージを低減できる。また、前記構成によれば、第１領域１１へのマイクロ波の到達が妨げられない。それゆえ、充分な強さのマイクロ波が、マイクロ波部４０から第１領域１１に到達できる。したがって、検体１８から生じる磁場の強度に応じて変化する蛍光Ｌ２を、高い位置解像度で測定することができる。 According to the configuration, the excitation light L1 reaching the specimen 18 can be reduced. Therefore, damage to the specimen 18 due to exposure to the excitation light L1 can be reduced. Further, according to the configuration, the microwaves are not prevented from reaching the first region 11. Therefore, microwaves of sufficient strength can reach the first region 11 from the microwave section 40. Therefore, the fluorescence L2, which changes depending on the strength of the magnetic field generated from the specimen 18, can be measured with high positional resolution.

＜２＞
前記反射領域１２の少なくとも一部の厚さをｄとすると、（３×β）＜ｄ＜（α／３）である、
ことを特徴とする＜１＞に記載の撮像装置１００。
（ここで、αは前記反射領域１２を形成する物質に対する前記マイクロ波の侵入長であり；βは前記反射領域１２を形成する物質に対する前記励起光の侵入長である）。 <2>
When the thickness of at least a portion of the reflective region 12 is d, (3×β)<d<(α/3).
The imaging device 100 according to <1>, characterized in that:
(Here, α is the penetration length of the microwave into the material forming the reflection region 12; β is the penetration length of the excitation light into the material forming the reflection region 12).

前記構成によれば、反射領域１２は、検体１８に到達する励起光Ｌ１をより充分に低減する。また、前記構成によれば、反射領域１２は、より充分な強さのマイクロ波を、マイクロ波部４０から第１領域１１に到達させる。 According to the configuration, the reflection region 12 more sufficiently reduces the excitation light L1 reaching the specimen 18. Further, according to the configuration, the reflection region 12 allows microwaves of sufficient strength to reach the first region 11 from the microwave section 40 .

＜３＞
前記反射領域の少なくとも一部の厚さをｄ１とし、ｄ２＝（α×β）^１／２とすると、（１／１０）＜（ｄ１／ｄ２）＜１０である、
ことを特徴とする請求項１または２に記載の撮像装置。 <3>
When the thickness of at least a portion of the reflective area is d1 and d2 = (α x β) ^1/2 , (1/10)<(d1/d2)<10.
The imaging device according to claim 1 or 2, characterized in that:

（ここで、αは前記反射領域を形成する物質に対する前記マイクロ波の侵入長であり；βは前記反射領域を形成する物質に対する前記励起光の侵入長である）。 (Here, α is the penetration length of the microwave into the material forming the reflection region; β is the penetration length of the excitation light into the material forming the reflection region).

前記構成によれば、＜２＞と同様の効果が得られる。 According to the configuration, the same effect as <2> can be obtained.

＜４＞
前記ダイヤモンド基板１０の前記第２表面Ｓ２には、生体親和性を有する膜１３が設けられており、
前記反射領域１２は、前記膜１３を介して前記検体１８と接している、
ことを特徴とする、＜１＞から＜３＞の何れかに記載の撮像装置１００。 <4>
A biocompatible film 13 is provided on the second surface S2 of the diamond substrate 10,
The reflective region 12 is in contact with the specimen 18 via the film 13.
The imaging device 100 according to any one of <1> to <3>, characterized in that:

前記構成によれば、検体１８は、生体親和性を有する膜１３と接触することになる。それゆえ、反射領域１２が生物に対する毒性が相対的に高い物質（銀、銅など）で構成されていたとしても、反射領域１２との接触により検体１８が受けるダメージを低減することができる。 According to the configuration, the specimen 18 comes into contact with the biocompatible membrane 13. Therefore, even if the reflective region 12 is made of a substance (silver, copper, etc.) that is relatively toxic to living things, damage to the specimen 18 due to contact with the reflective region 12 can be reduced.

＜５＞
前記検体１８の明視野画像を取得する明視野画像取得部５０をさらに備える、
ことを特徴とする＜１＞から＜４＞の何れかに記載の撮像装置１００。 <5>
further comprising a bright field image acquisition unit 50 that acquires a bright field image of the specimen 18;
The imaging device 100 according to any one of <1> to <4>, characterized in that:

前記構成によれば、検体１８から生じる磁場の強度を画像化した蛍光画像に加えて、検体１８の明視野画像をも取得することができる。 According to the above configuration, in addition to a fluorescence image that is an image of the intensity of the magnetic field generated from the specimen 18, a bright field image of the specimen 18 can also be acquired.

＜６＞
前記明視野画像取得部５０は、前記ダイヤモンド基板１０の前記第２表面Ｓ２側の明視野画像を取得する、
ことを特徴とする＜５＞に記載の撮像装置１００。 <6>
The bright field image acquisition unit 50 acquires a bright field image of the second surface S2 side of the diamond substrate 10.
The imaging device 100 according to <5>, characterized in that:

前記構成によれば、検体１８から生じる磁場の強度を画像化した蛍光画像と、検体１８の明視野画像とを、同時的に取得することができる。それゆえ、検体１８から生じる磁場の強度の測定と、検体１８の明視野観察とを、同時的に行うことができる。 According to the configuration, it is possible to simultaneously acquire a fluorescence image of the intensity of the magnetic field generated from the specimen 18 and a bright field image of the specimen 18. Therefore, measurement of the strength of the magnetic field generated from the specimen 18 and bright field observation of the specimen 18 can be performed simultaneously.

＜７＞
前記反射領域１２は、厚さが他の部分よりも薄く設けられた基準位置領域１２ａを１つ以上備える、
ことを特徴とする＜６＞に記載の撮像装置１００。 <7>
The reflective area 12 includes one or more reference position areas 12a that are thinner than other parts.
The imaging device 100 according to <6>, characterized in that:

前記構成によれば、基準位置領域１２ａは、励起光Ｌ１をより多く第２表面Ｓ２側に透過させる。同様に、基準位置領域１２ａは、位置合わせ用長波長光をより多く第１表面Ｓ１側に透過させる。それゆえ、基準位置領域１２ａを利用して、検体１８から生じる磁場の強度を画像化した蛍光画像と、検体１８の明視野画像との間の位置合わせが可能になる。 According to the configuration, the reference position region 12a allows more of the excitation light L1 to pass through to the second surface S2 side. Similarly, the reference position region 12a allows more of the long wavelength light for alignment to pass through to the first surface S1 side. Therefore, by using the reference position region 12a, it is possible to align the fluorescent image, which is an image of the intensity of the magnetic field generated from the specimen 18, and the bright field image of the specimen 18.

＜８＞
前記反射領域１２は、金属層である、
ことを特徴とする＜１＞から＜７＞の何れかに記載の撮像装置１００。 <8>
The reflective region 12 is a metal layer.
The imaging device 100 according to any one of <1> to <7>.

前記構成によれば、反射領域１２を容易に形成することができる。 According to the configuration, the reflective region 12 can be easily formed.

＜９＞
前記反射領域１２の少なくとも一部は、厚みが均一に形成されている、
ことを特徴とする＜１＞から＜８＞の何れかに記載の撮像装置１００。 <9>
At least a portion of the reflective region 12 is formed to have a uniform thickness.
The imaging device 100 according to any one of <1> to <8>, characterized in that:

前記構成によれば、検体１８から生じる磁場をより高感度で検知することができる。 According to the configuration, the magnetic field generated from the specimen 18 can be detected with higher sensitivity.

＜１０＞
窒素－空孔複合体中心を含有する第１領域１１を備えるダイヤモンド基板１０に、検体１８を設置する設置工程Ｓ１０と、
前記第１領域１１に励起光Ｌ１を照射する光照射工程Ｓ２０と、
前記第１領域１１に、マイクロ波部４０からマイクロ波を照射するマイクロ波照射工程Ｓ３０と、
前記励起光Ｌ１を照射された前記第１領域１１から生じる蛍光Ｌ２であって、前記検体１８から生じる磁場の強度に応じて変化する蛍光Ｌ２の強度の二次元的な分布を蛍光画像として取得する蛍光画像取得工程Ｓ４０と、
を含み、
前記ダイヤモンド基板１０は、前記励起光Ｌ１が入射する第１表面Ｓ１と、前記検体１８が設置される第２表面Ｓ２とを有しており、該第１表面Ｓ１と該第２表面Ｓ２とは対向しており、
前記第１領域１１と前記第２表面Ｓ２との間には、前記励起光Ｌ１を反射する反射領域１２が設けられており、
前記反射領域１２は、
前記第２表面Ｓ２から前記検体１８に到達する前記励起光Ｌ１の光量を、第１割合以下に減衰させ、
前記マイクロ波部４０から前記第２表面Ｓ２を経て前記第１領域１１に照射される前記マイクロ波を、第２割合以上通過させる、
ことを特徴とする、撮像方法。 <10>
an installation step S10 of installing a specimen 18 on a diamond substrate 10 having a first region 11 containing a nitrogen-vacancy complex center;
a light irradiation step S20 of irradiating the first region 11 with excitation light L1;
a microwave irradiation step S30 of irradiating the first region 11 with microwaves from the microwave section 40;
A two-dimensional distribution of the intensity of fluorescence L2 generated from the first region 11 irradiated with the excitation light L1, which changes depending on the intensity of the magnetic field generated from the specimen 18, is obtained as a fluorescence image. Fluorescence image acquisition step S40,
including;
The diamond substrate 10 has a first surface S1 on which the excitation light L1 is incident, and a second surface S2 on which the specimen 18 is placed, and the first surface S1 and the second surface S2 are It is facing
A reflective region 12 that reflects the excitation light L1 is provided between the first region 11 and the second surface S2,
The reflective area 12 is
Attenuating the light amount of the excitation light L1 reaching the specimen 18 from the second surface S2 to a first ratio or less,
Allowing a second proportion or more of the microwave irradiated from the microwave section 40 to the first region 11 via the second surface S2 to pass through;
An imaging method characterized by:

前記構成によれば、＜１＞と同様の効果が得られる。 According to the above configuration, the same effect as <1> can be obtained.

前記各項目で記載した内容は、他の項目においても適宜援用できる。本発明は前述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。したがって、異なる実施形態にそれぞれ開示されている技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても、本発明の技術的範囲に含まれる。 The contents described in each of the above items can be appropriately used in other items as well. The present invention is not limited to the embodiments described above, and various modifications can be made within the scope of the claims. Therefore, embodiments obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments are also included in the technical scope of the present invention.

本明細書中に記載された学術文献および特許文献のすべてが、本明細書中において参考文献として援用される。 All academic and patent documents mentioned herein are incorporated herein by reference.

本発明の一実施形態に係る撮像装置により、検体から生じる磁場の強度を観測した。具体的には、培養液内に１μｍ径の超常磁性粒子を撤布して、図２に示す構成の撮像装置により磁場分布画像および明視野像を取得した。この磁場分布画像とは、磁場の強度の二次元的な分布を画像化したものであり、蛍光画像を処理して得られる。具体的な処理の方法としては、［Y.Hatano et al.:Phys.Status Solidi A,215,1800254 (2018)］に開示されている方法を採用した。 The intensity of the magnetic field generated from the specimen was observed using an imaging device according to an embodiment of the present invention. Specifically, superparamagnetic particles with a diameter of 1 μm were removed from the culture solution, and a magnetic field distribution image and a bright field image were acquired using an imaging device configured as shown in FIG. This magnetic field distribution image is an image of a two-dimensional distribution of magnetic field strength, and is obtained by processing a fluorescence image. As a specific processing method, the method disclosed in [Y. Hatano et al.: Phys. Status Solidi A, 215, 1800254 (2018)] was adopted.

観測結果を図６に示す。図６の（ａ）～（ｄ）は、それぞれ、観察開始直後、観察開始から３時間後、観察開始から６時間後、観察開始から１２時間後における、磁場分布画像である。また、図６の（ｅ）は、観察開始から８分後における、明視野像（上）および磁場分布画像（下）である。同図において、明視野像において四角い枠で囲った部分が、磁場分布画像の視野に該当する。このように、明視野像および磁場分布像を組み合わせた観察も、本発明の一実施形態に係る撮像装置によれば可能となる。これらの図から、以下のことが示唆される。 The observation results are shown in Figure 6. (a) to (d) in FIG. 6 are magnetic field distribution images immediately after the start of observation, 3 hours after the start of observation, 6 hours after the start of observation, and 12 hours after the start of observation, respectively. Moreover, (e) of FIG. 6 is a bright field image (top) and a magnetic field distribution image (bottom) 8 minutes after the start of observation. In the figure, the area surrounded by a square frame in the bright field image corresponds to the field of view of the magnetic field distribution image. In this way, observation using a combination of a bright field image and a magnetic field distribution image is also possible with the imaging apparatus according to an embodiment of the present invention. These figures suggest the following.

図６の（ａ）～（ｄ）によると、観察開始時においては培養液中に分散していた超常磁性粒子が、時間経過につれて徐々に沈降し、ダイヤモンド基板表面上の磁場としてはっきりと観察されることがわかる。本実施例で使用した反射領域は厚さが薄いため（１００ｎｍのチタン膜）、磁場の強度の二次元的な分布をこのように鮮明に画像化することができる。 According to (a) to (d) in Figure 6, the superparamagnetic particles that were dispersed in the culture medium at the beginning of the observation gradually settled as time passed and were clearly observed as a magnetic field on the surface of the diamond substrate. I understand that. Since the reflective region used in this example is thin (100 nm titanium film), it is possible to clearly image the two-dimensional distribution of magnetic field intensity in this way.

また、図６の（ｅ）上部の明視野像には、励起光がほとんど表れていない。つまり、第１領域に照射された励起光は、反射領域で反射され、検体保持部にはほとんど到達していない。したがって、細胞または細菌を観察対象とした際にも、励起光を曝露されたことに起因するダメージを軽減することが可能である。 Further, in the bright field image in the upper part of FIG. 6(e), almost no excitation light appears. In other words, the excitation light irradiated to the first region is reflected by the reflection region and hardly reaches the sample holding section. Therefore, even when cells or bacteria are observed, it is possible to reduce damage caused by exposure to excitation light.

本実施例で観察しているのは超常磁性粒子であるが、この観察は細胞および細菌などにも応用可能である。例えば、プローブを介して超常磁性粒子を生体分子に結合させれば、当該生体分子の動態を追跡することができる。 Although superparamagnetic particles are observed in this example, this observation can also be applied to cells, bacteria, and the like. For example, if a superparamagnetic particle is bound to a biomolecule via a probe, the dynamics of the biomolecule can be tracked.

１０ダイヤモンド基板
１１第１領域
１２反射領域
１２ａ基準位置領域
１５検体保持部
１８検体
２０光源部
３０蛍光画像取得部
４０マイクロ波部
５０明視野画像取得部
１００撮像装置
Ｌ１励起光
Ｌ２蛍光
Ｓ１第１表面
Ｓ２第２表面
Ｓ１０設置工程
Ｓ２０光照射工程
Ｓ３０マイクロ波照射工程
Ｓ４０蛍光画像取得工程 10 Diamond substrate 11 First region 12 Reflection region 12a Reference position region 15 Sample holding section 18 Sample 20 Light source section 30 Fluorescence image acquisition section 40 Microwave section 50 Bright field image acquisition section 100 Imaging device L1 Excitation light L2 Fluorescence S1 First surface S2 Second surface S10 Installation process S20 Light irradiation process S30 Microwave irradiation process S40 Fluorescence image acquisition process

Claims

An imaging device that obtains a fluorescence image of a specimen by photodetection magnetic resonance and a bright field image of the specimen,
a diamond substrate comprising a first region containing a nitrogen-vacancy complex center;
a light source unit that irradiates the first region of the diamond substrate with excitation light from the first surface side of the diamond substrate;
a specimen holding part that holds the specimen on a second surface side opposite to the first surface of the diamond substrate;
a fluorescence image acquisition unit that acquires, as a fluorescence image, a two-dimensional distribution of the intensity of fluorescence generated from the first region irradiated with the excitation light, which changes in accordance with the intensity of the magnetic field generated from the specimen; ,
a microwave unit that irradiates the first region with microwaves of a predetermined frequency;
a bright-field image acquisition unit that acquires a bright-field image of the second surface side of the diamond substrate of the specimen;
Equipped with
The diamond substrate further includes a reflective region that reflects the excitation light,
The reflective area is provided between the first area and the second surface,
When the thickness of at least a portion of the reflective region is d, (3×β)<d<(α/3) ,
(Here, α is the penetration length of the microwave into the material forming the reflection region; β is the penetration length of the excitation light into the material forming the reflection region)
The reflective area includes one or more reference position areas that are thinner than other parts.
An imaging device characterized by :

When the thickness of at least a portion of the reflective area is d1 and d2 = (α x β) ^1/2 , (1/10)<(d1/d2)<10.
The imaging device according to claim 1, characterized in that:

The reflective area is
When the light intensity of the excitation light reaching the sample holding part is 1, the light intensity of the excitation light irradiated to the first region is attenuated to 10 ⁻³ or less,
When the intensity of the microwave immediately before passing through the reflection area is 100%, the intensity of the microwave immediately after passing through the reflection area is set to be 80% or more.
The imaging device according to claim 1 or 2, characterized in that:

A biocompatible film is provided on the second surface of the diamond substrate, and the reflective region is in contact with the specimen via the film.
The imaging device according to any one of claims 1 to 3, characterized in that:

the reflective area is a metal layer;
The imaging device according to any one of claims 1 to 4 .

At least a portion of the reflective area is formed to have a uniform thickness.
The imaging device according to any one of claims 1 to 5 .

An imaging method for obtaining a fluorescence image of a specimen by photodetection magnetic resonance and a bright field image of the specimen, the method comprising:
a diamond substrate comprising a first region containing a nitrogen-vacancy complex center;Saidan installation process for installing the specimen;
a light irradiation step of irradiating the first region with excitation light;
a microwave irradiation step of irradiating the first region with microwaves from a microwave section;
a fluorescence image acquisition step of acquiring, as a fluorescence image, a two-dimensional distribution of the intensity of fluorescence generated from the first region irradiated with the excitation light, which changes in accordance with the intensity of the magnetic field generated from the specimen; ,
a bright field image acquisition step of acquiring a bright field image of the specimen;
including;
The diamond substrate has a first surface on which the excitation light is incident, and a second surface on which the specimen is placed, the first surface and the second surface facing each other,
In the bright field image acquisition step, a bright field image of the second surface side of the diamond substrate is acquired,
A reflective area that reflects the excitation light is provided between the first area and the second surface,
If the thickness of at least a portion of the reflective area is d, then (3×β)<d<(α/3).can be,
(Here, α is the penetration length of the microwave into the material forming the reflection region; β is the penetration length of the excitation light into the material forming the reflection region)
The reflective area includes one or more reference position areas that are thinner than other parts.
An imaging method characterized by.