JP7407193B2 - 可変の複製多重ｐｃｒを使用した配列決定方法 - Google Patents

可変の複製多重ｐｃｒを使用した配列決定方法 Download PDF

Info

Publication number
JP7407193B2
JP7407193B2 JP2021531204A JP2021531204A JP7407193B2 JP 7407193 B2 JP7407193 B2 JP 7407193B2 JP 2021531204 A JP2021531204 A JP 2021531204A JP 2021531204 A JP2021531204 A JP 2021531204A JP 7407193 B2 JP7407193 B2 JP 7407193B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sequence
sample
reactions
variation
patient
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2021531204A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2022513173A (ja
JPWO2020031048A5 (ja
Inventor
プラノル，ヴィンセント
フォーシュー，ティム
ウッドハウス，サミュエル
ローソン，アンドリュー
スミス，マシュー
Original Assignee
イニヴァータ リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by イニヴァータ リミテッド filed Critical イニヴァータ リミテッド
Publication of JP2022513173A publication Critical patent/JP2022513173A/ja
Publication of JPWO2020031048A5 publication Critical patent/JPWO2020031048A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7407193B2 publication Critical patent/JP7407193B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06F—ELECTRIC DIGITAL DATA PROCESSING
    • G06F17/00—Digital computing or data processing equipment or methods, specially adapted for specific functions
    • G06F17/10—Complex mathematical operations
    • G06F17/18—Complex mathematical operations for evaluating statistical data, e.g. average values, frequency distributions, probability functions, regression analysis
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B50/00—ICT programming tools or database systems specially adapted for bioinformatics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pure & Applied Mathematics (AREA)
  • Computational Mathematics (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Mathematical Analysis (AREA)
  • Mathematical Optimization (AREA)
  • Mathematical Physics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Operations Research (AREA)
  • Probability & Statistics with Applications (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Algebra (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

相互参照
本出願は、２０１８年８月８日に出願された米国仮特許出願第６２／７１６，０８２号の利益を主張するものであり、その出願は参照により本明細書に組み込まれる。
多くの疾患は、遺伝的変異、例えば、体細胞突然変異によって引き起こされる。遺伝的変異は、しばしば、身体内の細胞の一部にのみ生じるため、それらは、次世代配列決定（ＮＧＳ）によって検出することが困難であり得る。１つの問題は、全てのライブラリ調製方法および配列決定プラットフォームが、エラー、例えば、ＰＣＲエラーおよび配列決定エラーを含有する配列リードをもたらすことである。系統的エラー（例えば、配列決定サイクル数、鎖、配列コンテキスト、および塩基置換確率を含む既知のパラメータと相関するもの）を修正することが可能であることがあるが、配列中の変異がエラーによって引き起こされるのか、またはそれが「実際の」遺伝的変異であるかどうかを確実に把握することは不可能である場合が多い。この問題は、試料の量が限定され、突然変異含有ポリヌクレオチドが、典型的には、血液から単離された無細胞ＤＮＡの場合と同様に、試料中の比較的低いレベル（例えば、５％未満）でのみ存在する場合に悪化する。例えば、試料が、それらが変異を含有しないことを除き、それ以外の場合、突然変異含有ポリヌクレオチドと同一である１００個のポリヌクレオチドのバックグラウンドにおいて１つのコピーのみの突然変異含有ポリヌクレオチドを含有する場合、それらのポリヌクレオチドが配列決定された後、その変異（配列リードの約１／１００でのみ観察され得る）が増幅または配列決定中に生じたエラーであるかどうかを判断することができない場合が多い。したがって、疾患を引き起こす体細胞突然変異の検出は、確実に検出することが極めて困難であり得る。
低頻度の配列変異、例えば、血液からの無細胞ＤＮＡの同定を容易にするワークフローが、以下に説明される。いくつかの実施形態において、本方法は、ＰＣＲ反応を分析することを含み得、各々、同じ試料の異なる部分を含有し、プライマー対のうちの少なくともいくつかは、１つを超えるＰＣＲ反応において存在し、ＰＣＲ反応のうちの少なくとも１つは、他の反応（複数可）のプライマー対のうちのいくつかを含有するが、全てを含有しない。この方法では、いくつかのプライマー対は、多くの因子に応じて、他の反応よりも多くの反応において存在する。
本開示は以下の［１］から［２１］を含む。
［１］配列分析のための方法であって、
（ａ）多重ＰＣＲ反応に適合する複数のプライマー対を得ることと、
（ｂ）各々、同じ試料の異なる部分を含む、少なくとも２つの多重ＰＣＲ反応を設定することであって、上記プライマー対のうちの少なくともいくつかが、複数ＰＣＲ反応において存在し、上記ＰＣＲ反応のうちの少なくとも１つが、他の反応（複数可）の上記プライマー対のうちのいくつかを含有するが、全てを含有しない、設定することと、
（ｃ）複数の複製アンプリコンを生成するために、上記多重ＰＣＲ反応を熱循環させることと、
（ｄ）配列リードを生成するために、上記アンプリコンを配列決定することと、
（ｅ）選択された配列変異についてのスコアを生成するために、上記選択された配列変異について複製アンプリコンからの上記配列リードを分析することであって、上記スコアが、
ｉ．カットオフを上回る頻度を有する配列変異を含む複製アンプリコンの数に基づいている、または
ｉｉ．上記複製物にわたる上記配列変異のための組み合わせられた証拠の強度を示す、分析することと、
（ｆ）上記スコアに基づいて遺伝的変異として上記配列変異を呼び出すことと、を含む、方法。
［２］上記プライマー対のうちの少なくともいくつかについて、選択されたプライマー対を含む反応の数が、
ｉ．上記選択されたプライマー対によって増幅された上記アンプリコンに見出される１つまたは複数の遺伝的変異の予期される頻度、
ｉｉ．上記試料が得られた患者の癌の種類、
ｉｉｉ．上記試料が得られた上記患者の治療歴、
ｉｖ．上記選択されたプライマー対によって増幅された上記アンプリコン中に見出されると予期される遺伝的変異の臨床的有意性、
ｖ．上記試料が得られた上記患者が受けたこれまでの試験、
ｖｉ．上記選択されたプライマー対によって増幅された上記アンプリコン中に見出されると予期される１つまたは複数の遺伝子変異のエラープロファイル、および／もしくは
ｖｉｉ上記選択されたプライマー対によって増幅された上記アンプリコンの長さ、
またはこれらの任意の組み合わせに応じて異なる、上記［１］に記載の方法。
［３］遺伝的変異を含有する可能性がより高いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対が、遺伝的変異を含有する可能性がより低いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対よりも多くの反応において存在し、
対象となる特定の癌に関連する遺伝的変異を含有する可能性がより高いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対が、対象となる上記特定の癌に関連する遺伝的変異を含有する可能性がより低いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対よりも多くの反応において存在し、
患者が療法に対して耐性を示す遺伝的変異を含有する可能性がより高いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対が、患者が上記療法に対して耐性を示す遺伝的変異を含有する可能性がより低いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対よりも多くの反応において存在し、
臨床的に作用可能な遺伝的変異を含有する可能性がより高いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対が、臨床的に作用可能な遺伝的変異を含有する可能性がより低いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対よりも多くの反応において存在し、
高いバックグラウンドの遺伝的変異を含有する可能性がより高いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対が、低いバックグラウンドの遺伝的変異を含有する可能性がより低いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対よりも多くの反応において存在し、
より長いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対が、より短いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対よりも多くの反応において存在する、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］ステップ（ｆ）において、上記呼び出しが、上記スコアを閾値と比較することによって行われ、上記閾値または閾値超で遺伝的変異を呼び出すことができる、上記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］上記閾値が、
（ｉ）カットオフ頻度を上回る上記選択された配列変異を有する複製の数、および／または
（ｉｉ）複数の複製にわたる上記配列変異のための上記組み合わせられた証拠の必要な強度を示す値である、上記［４］に記載の方法。
［６］上記カットオフが、配列変異が増幅および／または配列決定エラーによってどのくらいの頻度で生成されるかを示すエラー分布に基づいている、上記［４］または［５］に記載の方法。
［７］上記エラー分布が、配列決定制御試料によって推定される、上記［６］に記載の方法。
［８］上記方法が、
ｉ．上記選択されたプライマー対によって増幅された上記アンプリコンに見出される１つまたは複数の遺伝的変異の予期される頻度、
ｉｉ．上記試料が得られた上記患者の上記癌の種類、
ｉｉｉ．上記試料が得られた上記患者の治療歴、
ｉｖ．上記選択されたプライマー対によって増幅された上記アンプリコン中に見出されると予期される遺伝的変異の臨床的有意性、
ｖ．上記試料が得られた上記患者が受けたこれまでの試験、
ｖｉ．上記選択されたプライマー対によって増幅された上記アンプリコン中に見出されると予期される遺伝子変異の上記エラープロファイル、
ｖｉ．上記試料中に見出される他の遺伝的変異、および／もしくは
ｖｉｉ上記配列決定の全体的なエラー率、
またはこれらの任意の組み合わせに基づいて、上記閾値または上記カットオフを増加または減少させることを含む、上記［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］（ｂ）において設定された各反応が、少なくとも５つのプライマー対を含有する、上記［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］ステップ（ｂ）が、少なくとも３つおよび１０未満の多重ＰＣＲ反応を設定することを含む、上記［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］上記配列変異が、複数の変異体の置換、挿入、欠失、再配列、または組み合わせである、上記［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］上記試料が、ｃｆＤＮＡである、上記［１］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］上記複製アンプリコンが、増幅中に複製識別子でタグ付けされ、上記方法が、配列決定の前に異なる増幅反応をプールすることを含む、上記［１］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］各アンプリコンの長さが、独立して、５０ｂｐ～５００ｂｐの範囲内である、上記［１］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］上記配列変異のための上記組み合わせられた証拠が、尤度値を使用して要約され、上記閾値が、尤度閾値である、上記［１］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］上記配列変異のための上記組み合わせられた証拠が、ベイズ統計を使用して要約され、上記閾値が、事前分布によって変化し得るベイズ因子である、上記［１］～［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］上記閾値が、機械学習を使用して確立される、上記［１］～［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］上記試料が、ｃｆＤＮＡであり、上記方法が、同じ対象からのｃｆＲＮＡを分析することをさらに含む、上記［１］～［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］上記試料が、ｃｆＤＮＡであり、上記方法が、上記同じ対象からの白血球ＤＮＡを分析することをさらに含む、上記［１］～［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］上記配列変異が、特定の疾患、状態、または治療を示す、上記［１］～［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］（ｇ）上記配列変異に関する情報を含む報告書を第三者に転送することをさらに含む、上記［１］～［２０］のいずれかに記載の方法。
いくつかの実施形態において、本方法は、
（ａ）多重ＰＣＲ反応に適合する複数のプライマー対を得ることと、
（ｂ）少なくとも２つの多重ＰＣＲ反応を設定することであって、各々、同じ試料の異なる部分を含有し、プライマー対のうちの少なくともいくつかが、１つを超えるＰＣＲ反応において存在し、ＰＣＲ反応のうちの少なくとも１つが、他の反応（複数可）のプライマー対のうちのいくつかを含有するが、全てを含有せず、全てのＰＣＲ反応において存在しないプライマー対の少なくともいくつかについては、プライマー対を含む反応の数が、プライマー対によって増幅されたアンプリコンにおいて予期される１つ以上の配列変異の認識された重要性、尤度、および／または種類に応じて異なる、設定することと、
（ｃ）複数の複製アンプリコンを生成するために、多重ＰＣＲ反応を熱循環させることと、
（ｄ）配列リードを生成するために、アンプリコンを配列決定することと、
（ｅ）選択された配列変異についてのスコアを生成するために、選択された配列変異について複製アンプリコンからの配列リードを分析することであって、スコアが、ｉ．カットオフを上回る頻度を有する配列変異を含む複製アンプリコンの数に基づいている、またはｉｉ．複製物にわたる配列変異のために組み合わせられた証拠の強度を示す、分析することと
（ｆ）スコアに基づいて配列変異を呼び出すことと、を含み得る。
いかに方法が実装されるかに応じて、本方法は、従来の方法よりもある特定の利点を有し得る。例えば、本方法は、単に多重ＰＣＲ反応の数を増加させることなく、方法のユーザによってより重要と見なされる遺伝的変異を同定するより高い確率を提供することができる。
当業者は、以下に記載される図面が例示目的のみのためのものであることを理解するであろう。図面は、いずれの方法においても、本教示の範囲を限定するものではない。
特許請求の範囲の方法で生成することができる一連の多重ＰＣＲ反応の例を概略的に例示する。この例は、方法の原理のいくつかを単に例示しており、いずれの方法においても、方法を制限するべきではない。 カットオフ頻度を上回る選択された配列変異を有する複製物の数を使用して、いかに遺伝的変異を呼び出すことができるかを例示する。 複数の複製物にわたる遺伝的変異のために組み合わせられた証拠を使用することによって、いかに遺伝的変異を呼び出すことができるかを例示する。
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。さらに、参照を明確かつ容易にするために、ある特定の要素が、定義される。
本明細書で使用される核酸化学、生化学、遺伝学、および分子生物学の用語および記号は、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７５）、Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９）、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）、Ｇａｉｔ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４）などの当該分野における標準的な論文およびテキストの用語および記号に従う。
「ヌクレオチド」という用語は、既知のプリンおよびピリミジン塩基だけでなく、修飾された他の複素環式塩基も含有する部分を含むことが意図されている。そのような修飾は、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、アルキル化リボースまたは他の複素環を含む。加えて、「ヌクレオチド」という用語は、ハプテンまたは蛍光標識を含有する部分を含み、従来のリボースおよびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も含有し得る。例えば、ヒドロキシル基のうちの１つ以上がハロゲン原子もしくは脂肪族基で置き換えられるか、またはエーテル、アミンなどとして官能化される場合、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドもまた、糖部分に修飾を含む。
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では互換的に使用して、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる、任意の長さ、例えば、約２塩基を超える、約１０塩基を超える、約１００塩基を超える、約５００塩基を超える、１０００塩基を超える、１０，０００塩基を超える、１００，０００塩基を超える、約１，０００，０００、最大約１０１０またはそれ以上の塩基のポリマーを記載し、これは、酵素によってまたは合成によって生成することができ（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号およびその中に引用された参照文献中に記載されたＰＮＡ）、２つの天然に存在する核酸のものに類似する配列特異的な様式で天然に存在する核酸にハイブリダイズすることができ、例えば、ワトソン－クリック塩基対形成相互作用に関与することができる。天然に存在するヌクレオチドには、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、ウラシル（それぞれ、Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｔ、およびＵ）が含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡは、それぞれ、デオキシリボースおよびリボース糖骨格を有し、一方で、ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって連結された反復Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン単位からなる。ＰＮＡでは、様々なプリンおよびピリミジン塩基は、メチレンカルボニル結合によってその骨格に連結されている。ロックド核酸（ＬＮＡ）は、しばしばアクセス制限（ｉｎａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）ＲＮＡと称され、それは修飾されたＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素と４’炭素を接続する追加の架橋により修飾されている。この架橋が、しばしばＡ型二本鎖に見られる３’－エンド（Ｎｏｒｔｈ）構造のリボースを「ロック」する。ＬＮＡヌクレオチドは、所望であればいつでも、オリゴヌクレオチド中のＤＮＡまたはＲＮＡ残基と混合することができる。「非構造化核酸」または「ＵＮＡ」という用語は、低い安定性で互いに結合する非天然ヌクレオチドを含有する核酸である。例えば、非構造化核酸は、Ｇ’残基およびＣ’残基を含有することができ、これらの残基は、低い安定性で互いに塩基対を形成するが、天然に存在するＣおよびＧの残基とそれぞれ塩基対を形成する能力を保持する、ＧおよびＣの天然に存在しない形、すなわち類似体に対応する。非構造化核酸は、ＵＳ２００５０２３３３４０に記載されており、これは、ＵＮＡの開示のために参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される「核酸試料」という用語は、核酸を含有する試料を示す。本明細書で使用される核酸試料は、それらが配列を含有する複数の異なる分子を含有するという点において複合体であってもよい。哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）からのゲノムＤＮＡ試料は、複合試料の種類である。複合試料は、約１０４、１０５、１０６もしくは１０７、１０８、１０９、または１０１０個を超える異なる核酸分子を有し得る。核酸、例えば、組織培養細胞からのゲノムＤＮＡを含有する任意の試料、または組織試料が、本明細書で採用され得る。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、約２～２００ヌクレオチド、最大５００ヌクレオチド長のヌクレオチドの一本鎖多量体を示す。オリゴヌクレオチドは、合成であってもよいか、または酵素的に作製されてもよく、いくつかの実施形態において、３０～１５０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマーを含有してもよいか（すなわち、オリゴリボヌクレオチドであってもよく）、またはデオキシリボヌクレオチドモノマー、またはリボヌクレオチドモノマーおよびデオキシリボヌクレオチドモノマーの両方を含有してもよい。オリゴヌクレオチドは、例えば、１０～２０、２１～３０、３１～４０、４１～５０、５１～６０、６１～７０、７１～８０、８０～１００、１００～１５０、または１５０～２００ヌクレオチド長であり得る。
「プライマー」とは、ポリヌクレオチド鋳型と二本鎖を形成するとき、核酸合成の開始地点として作用することができ、伸長した二本鎖が形成されるように鋳型に沿ってその３’末端から伸長することができる、天然のまたは合成されたオリゴヌクレオチドを意味する。伸長プロセス中に加えられるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは、一般に、プライマー伸長生成物の合成におけるそれらの使用に適合する長さであり、通常、８～２００ヌクレオチド長、例えば１０～１００ヌクレオチド長または１５～８０ヌクレオチド長の範囲内である。プライマーは、鋳型にハイブリダイズしない５’尾部を含有してよい。
プライマーは、通常、増幅における最大効率のために一本鎖であるが、代替的に、二本鎖または部分的に二本鎖であり得る。Ｚｈａｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１２ ４：２０８－２１４）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、トーホールド交換プライマーも、この定義中に含まれる。
したがって、「プライマー」は、鋳型に相補的であり、鋳型との水素結合またはハイブリダイゼーションによって複合体を形成して、ポリメラーゼによる合成の開始のためにプライマー／鋳型複合体を与え、それはＤＮＡ合成プロセスで鋳型に相補的なその３’末端に連結している共有結合した塩基の添加によって伸長する。
「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」という用語は、正常なハイブリダイゼーション条件下で核酸鎖の領域が第２の相補的な核酸鎖にアニールして、ホモ二本鎖またはヘテロ二本鎖のいずれかの安定した二本鎖を形成し、無関係な核酸分子とは同じ正常なハイブリダイゼーション条件下で安定した二本鎖を形成しないプロセスを指す。二本鎖の形成は、ハイブリダイゼーション反応における２つの相補的核酸鎖領域をアニールすることによって達成される。ハイブリダイゼーション反応は、２本の核酸鎖が、実質的にまたは完全に相補的である特定の配列の特定数のヌクレオチドを含有しない限り、２本の核酸鎖が安定した二本鎖、例えば正常なストリンジェンシー条件下で二本鎖形成の領域を保持する二本鎖を形成しないように、そのハイブリダイゼーション反応が起こる下でのハイブリダイゼーション条件の調節によって高度に特異的に行うことができる。「正常なハイブリダイゼーションまたは正常なストリンジェンシー条件」は、任意の所与のハイブリダイゼーション反応のために容易に判定される。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」または「ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」という用語は、核酸の鎖が塩基対形成を通して相補鎖と結合する任意のプロセスを指す。
核酸は、２つの配列が中等度から高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で互いに特異的にハイブリダイズする場合、参照核酸配列に「選択的にハイブリダイゼーション可能」であると考えられる。中等度および高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が既知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９５およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。
本明細書で使用される「二本鎖」または「二本鎖化」という用語は、塩基対形成した、すなわち、一緒にハイブリダイズした２つの相補的ポリヌクレオチド領域を記載する。
ゲノムまたは標的ポリヌクレオチドに関する「遺伝学的遺伝子座」、「遺伝子座」、「対象となる遺伝子座」、「領域」、または「セグメント」は、そのゲノムまたは標的ポリヌクレオチドの連続的なサブ領域またはセグメントを意味する。本明細書で使用される場合、遺伝学的遺伝子座、遺伝子座、または対象となる遺伝子座は、ゲノムにおけるヌクレオチド、遺伝子、または一部の遺伝子の位置を指し得るか、またはそれが、遺伝子内に存在する、もしくはそれに関連しているかどうかにかかわらず、ゲノム配列の任意の連続的な部分、例えば、コード配列を指し得る。遺伝学的遺伝子座、遺伝子座、または対象となる遺伝子座は、単一のヌクレオチドから、長さが数百個または数千個のヌクレオチド長またはそれ以上のセグメントに由来し得る。一般に、対象となる遺伝子座は、それと関連した参照配列を有する（以下の「参照配列」の説明を参照されたい）。
本明細書で使用される「参照配列」という用語は、既知のヌクレオチド配列、例えば、その配列がＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースまたは他のデータベースに堆積される染色体領域を指す。参照配列は、野生型配列であり得る。
「大多数」、「集団」、および「収集物」という用語は、少なくとも２人のメンバーを含有するものを指すために互換的に使用される。ある特定の場合において、大多数、集団、または収集物は、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、または少なくとも１０９、またはそれ以上のメンバーを有し得る。
「試料識別子配列」、「試料インデックス」、「多重識別子」、または「ＭＩＤ」という用語は、標的ポリヌクレオチドに付加されるヌクレオチドの配列であり、配列は、標的ポリヌクレオチド（すなわち、標的ポリヌクレオチドが由来する試料からの試料）の供給源を同定する。使用中、各試料は、異なる試料識別子配列でタグ付けされ（例えば、１つの配列が各試料に付加され、異なる試料が異なる配列に付加される）、タグ付けされた試料がプールされる。プールした試料を配列決定した後、試料識別子配列を使用して、配列の源を同定することができる。試料識別子配列は、ポリヌクレオチドの５’末端またはポリヌクレオチドの３’末端に加えられ得る。ある特定の場合において、試料識別子配列のいくつかは、ポリヌクレオチドの５’末端であり得、試料識別子配列の残りは、ポリヌクレオチドの３’末端であり得る。試料識別子の要素が各末端で配列を有する場合、３’および５’試料識別子配列は、一緒に試料を同定する。多くの例では、試料識別子配列は、標的オリゴヌクレオチドに付加される塩基のサブセットのみである。
「複製識別子配列」という用語は、異なる複製物からの配列リードを互いに区別することを可能にする付加配列を指す。複製識別子配列は、異なる試料ではなく、試料の複製物上で使用されることを除いて、上述の試料識別子配列と同じように機能する。
「可変」という用語は、可変である２つ以上の核酸配列の文脈において、互いに異なるヌクレオチド配列を有する２つ以上の核酸を指す。換言すれば、集団のポリヌクレオチドが可変配列を有する場合、集団のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、分子によって異なり得る。「可変」という用語は、集団内の全ての分子が、集団内の他の分子と異なる配列を有することを必要とするように読み取られるべきではない。
「実質的に」という用語は、ハミング距離、レーベンシュタイン距離、ジャカード距離、コサイン距離などを含むが、これらに限定されない、相似関数によって測定されるほぼ二重鎖である配列を指す（一般に、Ｋｅｍｅｎａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００９ ２５：２４５５－６５を参照されたい）。正確な閾値は、分析を実施するために使用される試料調製および配列決定のエラー率によって異なり、より高いエラー率は、より低い類似閾値を必要とする。ある特定の場合において、実質的に同一の配列は、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
本明細書で使用される「配列変異」という用語は、試料中の他の分子と比較して５０％未満の頻度で存在する変異体であり、試料中の他の分子は、配列変異を含有する分子と実質的に同一である。場合によっては、特定の配列変異は、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、または０．５％未満の頻度で試料中に存在し得る。
「核酸鋳型」という用語は、増幅中にコピーされる初期核酸分子を指すよう意図されている。この文脈におけるコピーは、特定の一本鎖核酸の相補体の形成を含むことができる。「初期」核酸は、既に処理されている核酸、例えば、アダプタで増幅、伸長、標識されている核酸などを含むことができる。
「尾部」という用語は、尾部プライマーまたは５’尾部を有するプライマーの文脈において、プライマーの３’末端と同じ標的物にハイブリダイズしない、または部分的にハイブリダイズしない領域（例えば、少なくとも１２～５０ヌクレオチドの領域）をその５’末端で有するプライマーを指す。
「初期鋳型」という用語は、増幅される標的配列を含有する試料を指す。本明細書で使用される「増幅する」という用語は、標的核酸を鋳型として使用して、１つ以上のコピーの標的核酸を生成することを指す。
本明細書で使用される「アンプリコン」という用語は、ＰＣＲ反応における特定のプライマー対によって増幅された生成物（または「バンド」）を指す。
本明細書で使用される「複製アンプリコン」は、試料の異なる部分を使用して増幅された同じアンプリコンを指す。典型的な複製アンプリコンは、鋳型における配列変異、ＰＣＲエラー、および各複製物に使用されるプライマーの配列の違い（例えば、複製識別子配列などのプライマーの５’末端の違いなど）を除いて、ほぼ同一の配列を有する。
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、１つ以上の配列特異的プライマー対を使用して特異的鋳型ＤＮＡを増幅する酵素反応である。
「ＰＣＲ条件」は、当該技術分野で既知であるように、ＰＣＲが実施される条件であり、試薬（例えば、ヌクレオチド、緩衝液、ポリメラーゼなど）、ならびに温度サイクル（例えば、変性、再飽和、および伸長に好適な温度のサイクルを通して）の存在を含む。
「多重ポリメラーゼ連鎖反応」または「多重ＰＣＲ」は、異なる標的鋳型に対して２つ以上のプライマー対を採用する酵素反応である。標的鋳型が反応中に存在する場合、多重ポリメラーゼ連鎖反応は、対応する数の配列特異的プライマー対を使用して単一反応で共増幅される２つ以上の増幅ＤＮＡ生成物をもたらす。
本明細書で使用される「配列特異的プライマー」という用語は、研究中で、試料中で独自の部位にのみ結合し、それで伸長するプライマーを指す。ある特定の実施形態において、「配列特異的」オリゴヌクレオチドは、研究中で、試料中で独自である相補的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る。
「次世代配列決定」という用語は、核酸配列決定を実施する、いわゆる高度に並列化された方法を指し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｒｏｃｈｅなどによって現在採用されている合成による配列決定またはライゲーションプラットフォームによる配列決定を含む。次世代配列決定方法には、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅによって提供されるようなナノ細孔配列決定方法、またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって商品化されたＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術などの電子検出ベースの方法も含まれ得るが、これらに限定されない。
「配列リード」という用語は、シーケンサーの出力を指す。配列リードは、典型的には、５０～１０００塩基以上の長さのＧ、Ａ、Ｔ、およびＣの文字列を含有し、多くの場合、配列リードの各塩基は、塩基コールの質を示すスコアと関連し得る。
「の存在を評価すること（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」および「の存在を評価すること（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」という用語は、要素が存在するかどうかを判定することと、要素の量を推定することと、を含む、任意の形態の測定を含む。「判定すること」、「測定すること」、「評価すること（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価すること（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、および「アッセイすること」という用語は、互換的に使用され、定量的および定質的な判定を含む。評価することは、相対的または絶対的であり得る。「の存在を評価すること」は、存在するものの量を判定すること、および／またはそれが存在するか否かを判定することを含む。
２つの核酸が「相補的」である場合、それらは高ストリンジェンシー条件下で互いにハイブリダイズする。「完全に相補的」という用語は、核酸塩基のうちの１つの各塩基が他の核酸中の相補的ヌクレオチドと対合する二本鎖を説明するために使用される。多くの場合、相補的である２つの配列は、少なくとも１０、例えば、少なくとも１２または１５ヌクレオチドの相補性を有する。
「オリゴヌクレオチド結合部位」は、オリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチド中でハイブリダイズする部位を指す。オリゴヌクレオチドがプライマーの結合部位を「提供する」場合、プライマーはそのオリゴヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズし得る。
本明細書で使用される「鎖」という用語は、共有結合、例えば、ホスホジエステル結合によって一緒に共有連結されたヌクレオチドからなる核酸を指す。細胞において、ＤＮＡは通常、二本鎖形態で存在し、したがって、本明細書において「上部」および「底部」鎖と称される２本の核酸の相補鎖を有する。ある特定の場合において、染色体領域の相補鎖は、「プラス」および「マイナス」鎖、「第１の」および「第２の」鎖、「コード化」および「非コード化」鎖、「ワトソン」および「クリック」鎖、または「センス」および「アンチセンス」鎖と称され得る。上部または底部鎖としての鎖の割り当ては任意であり、いずれの特定の配向、機能、または構造を暗示するものではない。いくつかの例示的な哺乳動物染色体領域（例えば、ＢＡＣ、アセンブリ、染色体など）の第１の鎖のヌクレオチド配列は既知であり、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースに見出され得る。
本明細書で使用される「伸長」という用語は、ポリメラーゼを使用したヌクレオチドの付加によってプライマーの伸長を指す。核酸にアニーリングするプライマーが伸長する場合、核酸は伸長反応の鋳型として作用する。
本明細書で使用される「配列決定」という用語は、ポリヌクレオチドの少なくとも１０個の連続するヌクレオチドの同一性（例えば、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、または少なくとも２００個以上の連続するヌクレオチドの同一性）を得る方法を指す。
本明細書で使用される「プールすること」という用語は、これらの試料または複製物内の分子が溶液中で互いに散在するように、２つ以上の試料または試料の複製物を組み合わせること、例えば混合することを指す。
本明細書で使用される「プールした試料」という用語は、プールした生成物を指す。
本明細書で使用される「部分」という用語は、同じ試料の異なる部分の文脈において、試料のアリコートまたはその一部を指す。例えば、１００ｕｌの試料の１マイクロリットルが、１０個の異なるＰＣＲ反応の各々に加えられる場合、それらの反応は、各々、同じ試料の異なる部分を含有する。
本明細書で使用される場合、「血流からの無細胞ＤＮＡ」、「循環無細胞ＤＮＡ」、および無細胞ＤＮＡ」（「ｃｆＤＮＡ」）という用語は、患者の末梢血中で循環しているＤＮＡを指す。無細胞ＤＮＡ中のＤＮＡ分子は、１ｋｂ未満の中央値サイズ（例えば、５０ｂｐ～５００ｂｐ、８０ｂｐ～４００ｂｐ、または１００～１，０００ｂｐの範囲内）を有し得るが、この範囲外の中央値サイズを有する断片が存在し得る。無細胞ＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、すなわち、癌患者の血液中で自由に循環する腫瘍ＤＮＡまたは循環胎児ＤＮＡ（対象が妊娠中の女性である場合）を含有し得る。ｃｆＤＮＡは、全血を遠心分離して、全ての細胞を除去し、次いで残りの血漿または血清からＤＮＡを単離することによって得ることができる。そのような方法は、周知である（例えば、Ｌｏ ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９９８；６２：７６８－７５を参照されたい）。循環無細胞ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。この用語は、血流中で循環している遊離ＤＮＡ分子、および血流中で循環している細胞外小胞（エクソソームなど）中に存在するＤＮＡ分子を包含することが意図されている。
本明細書で使用される場合、「循環腫瘍ＤＮＡ」（または「ｃｔＤＮＡ」）という用語は、患者の末梢血中で循環している腫瘍由来ＤＮＡである。ｃｔＤＮＡは、腫瘍起源のものであり、腫瘍または循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）から直接由来し、これらは、原発性腫瘍から流出し、血流またはリンパ系に入る生存可能で無傷の腫瘍細胞である。ｃｔＤＮＡ放出の正確な機構は不明であるが、それは、死亡細胞からのアポトーシスおよび壊死、または生存腫瘍細胞からの活性放出を伴うと仮定される。ｃｔＤＮＡは、高度に断片化され得、場合によっては、約１００～２５０ｂｐ、例えば、１５０～２００ｂｐの長さの平均断片サイズを有し得る。癌患者から単離された循環無細胞ＤＮＡの試料中のｃｔＤＮＡの量は大きく異なる：典型的な試料は、１０％未満のｃｔＤＮＡを含有するが、多くの試料は、１％未満のｃｔＤＮＡを有し、一部の試料は、１０％を超えるｃｔＤＮＡを有する。ｃｔＤＮＡの分子は、腫瘍発生性突然変異を含有するため、しばしば、同定することができる。
本明細書で使用される場合、「血流からの無細胞ＲＮＡ」、「循環無細胞ＲＮＡ」、および無細胞ＲＮＡ」（「ｃｆＲＮＡ」）という用語は、患者の末梢血中で循環しているＲＮＡを指す。無細胞ＲＮＡは、循環腫瘍ＲＮＡ（ｃｔＲＮＡ）、すなわち、癌患者の血液中で自由に循環する腫瘍ＲＮＡまたは循環胎児ＲＮＡ（対象が妊娠中の女性である場合）を含有し得る。この用語は、血流中で循環している遊離ＲＮＡ分子、および血流中で循環している細胞外小胞（エクソソームなど）中に存在するＲＮＡ分子を包含することが意図されている。
本明細書で使用される場合、「配列変異」という用語は、配列変異の位置および種類の組み合わせを指す。例えば、配列変異は、変異の位置によって、どの種類の置換（例えば、ＧからＡ、ＧからＴ、ＧからＣ、ＡからＧなど、またはＧ、Ａ、Ｔ、もしくはＣなどの挿入／欠失）がその位置に存在するかによって称され得る。配列変異は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、または再配列であり得る。本方法の文脈おいて、配列変異は、例えば、ＰＣＲエラー、配列決定エラー、または遺伝子変異によって生成され得る。
本明細書で使用される場合、「遺伝子変異」という用語は、核酸試料中に存在するか、または存在する可能性が高いと見なされる変異（例えば、ヌクレオチド置換、インデル、または再配列）を指す。遺伝的変異は、任意の供給源からのものであり得る。例えば、遺伝的変異は、突然変異（例えば、体細胞突然変異）、臓器移植、または妊娠によって生成され得る。配列変異が、遺伝的変異と呼ばれる場合、呼び出しは、試料が変異を含有する可能性が高いことを示し、場合によっては「呼び出し」が不正確であり得る。多くの場合、「遺伝子変異」という用語は、「突然変異」という用語に置き換えることができる。例えば、本方法を使用して、癌または変異によって引き起こされる他の疾患に関連する配列変異を検出する場合、「遺伝的変異」は、「突然変異」という用語に置き換えることができる。
本明細書で使用される場合、「呼び出すこと」という用語は、特定の配列変異が試料中に存在するかどうかを示すことを意味する。これは、例えば、配列変異を含有する配列を提供すること、および／または配列変異を有する配列に注釈を付けること、配列が特定の位置でＡからＴへの変異を有することを示すことを伴い得る。
本明細書で使用される場合、「閾値」という用語は、呼び出しを行うために必要とされる証拠のレベルを指す。閾値ｉ．は、ある配列変異から別の配列変異に変化させることができ、ｉｉ．は、場合によっては、様々な因子に応じて、所望に応じて、他の閾値とは独立して増加または減少し得る。
本明細書で使用される場合、「カットオフ」という用語は、複製物が、対照に基づく配列変異を含有する可能性が統計的に高いと同定され得る頻度でまたは頻度を上回る配列リードの頻度を指す。以下により詳細に説明されるように、少数の分子中に存在する配列変異を含有するＰＣＲ生成物を配列決定する際に、配列リードのいくつかは、変異体分子からのものとなり、他のものはそうではない（例えば、「野生型」配列からのものとなる）。変異体分子からのものであるリードの頻度は、例えば、変異体分子からのリードの数をリードの総数で除算することによって計算され得る。カットオフ頻度は、いくつかの対照試料（例えば、配列変異を含有しない試料）を配列決定することによって確立することができる。カットオフｉ．は、ある配列変異から別の配列変異に変化することができ、ｉｉ．は、場合によっては、様々な因子に応じて、所望に応じて、他のカットオフとは独立して増加または減少し得る。
本明細書で使用される場合、「値」という用語は、証拠の強度を示すことができる数値、文字、単語（例えば、「高」、「中」、もしくは「低」）、または記述子（例えば、「＋＋＋」または「＋＋」）を指す。値は、値がどのように分析されるかに応じて、１つの構成要素（例えば、単数）または１つを超える構成要素を含有することができる。
用語の他の定義は、明細書全体を通して現れ得る。特許請求の範囲は、あらゆる任意の要素を除外するように作成され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連する「単に」、「のみ」などの排他的な用語の使用、または「否定的」な限定の使用の先行詞としての役割を果たすことが意図されている。
本発明がより詳細に説明される前に、本発明は、記載された特定の実施形態に限定されるものではなく、当然のことながら変わり得ることが理解されるべきである。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される専門用語も特定の実施形態のみを記述する目的のためのものであり、限定することを意図するものではないということも理解されるべきである。
数値範囲が提供されている場合、文脈が明らかに別途指示がない限り、下限の単位の１／１０まで、その範囲の上限と下限との間のそれぞれ介在する数値および規定された範囲にある他のいかなる規定値または介在する値は本発明に包含されるものと理解される。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと類似または等価のいかなる方法および材料も本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれから記載する。
本明細書に引用されているあらゆる刊行物および特許文書は、あたかも各個々の刊行物または特許文書が、参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれ、引用されている刊行物と関連する方法および／または材料を開示し説明するために参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示に関するものであり、本発明が、従来の発明に関してこのような刊行物に先行する資格がないことの承認であると解釈されるべきではない。さらに、提供されている刊行物の日付は、実際の刊行物の日付とは異なる場合があり、独立して確認される必要があり得る。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により明らかにそうではないと指示されない限り、複数対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は、あらゆる任意の要素を除外するように作成され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連する「単に」、「のみ」などの排他的な用語の使用、または「否定的」な限定の使用の先行詞としての役割を果たすことが意図されている。
本開示を読めば当業者に明らかとなるように、本明細書において記載および例示される個々の実施形態の各々は、個別の構成要素および特徴を有し、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に区別または組み合わせることができる。引用される任意の方法は、引用される事象の順序、または論理的に可能な任意の他の順序で実行することができる。
多重ＰＣＲ反応に適合する複数のプライマー対を採用する配列分析のための方法が、本明細書に提供される。この文脈において、「適合性」プライマーを含有する多重ＰＣＲ反応は、プライマーに対して適切な鋳型を用いた適切な熱循環条件下で反応に供されるときに、ＰＣＲプライマー対に対応するアンプリコンを生成する対象となる領域を特異的に増幅し、プライマー二量体の生成を最小限に抑えるように設計されるものである。典型的には、必ずしもそうではないが、各プライマー対は、多重ＰＣＲ反応において対象となる単一領域を増幅する。多重ＰＣＲおよび適合性プライマーを設計するためのプログラムを実施するための条件は、周知である（例えば、Ｓｉｎｔ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｃｏｌ Ｅｖｏｌ．２０１２ ３：８９８－９０およびＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１０ １１：１４３を参照されたい）。適合性プライマー対は、多重ＰＣＲ法のためのプライマー対を設計するように特異的に設計されたいくつかの異なるプログラムのいずれか１つを使用して設計され得る。例えば、プライマー対は、例えば、Ｙａｍａｄａら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００６ ３４：Ｗ６６５－９）、Ｌｅｅら（Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００６ ５：９９－１０９）、Ｖａｌｌｏｎｅら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００４ ３７：２２６－３１）、Ｒａｃｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００５ ６：１０２、またはＧｏｒｅｌｅｎｋｏｖら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００１ ３１：１３２６－３０）の方法を使用して設計され得る。いくつかの実施形態において、本方法は、少なくとも５対の適合性プライマー、例えば、少なくとも１０対、少なくとも５０対、少なくとも１００対、または少なくとも１，０００対の適合性プライマーを採用してもよい。いくつかの実施形態において、本方法は、少なくとも１０個および最大５０，０００個のプライマー対、少なくとも１０個および最大１０，０００個のプライマー対、少なくとも１０個および最大５，０００個のプライマー対、少なくとも１０個および最大１，０００個のプライマー対、または少なくとも１０個および最大５００個のプライマー対を採用してもよく、各プライマー対は、異なるアンプリコンを増幅するように設計されている。増幅されたアンプリコンは、任意の好適な長さのものであり得、長さは変化してもよい。いくつかの実施形態において、各アンプリコンの長さは、独立して、５０ｂｐ～５００ｂｐの範囲内であってもよいが、いくつかの実装において、より長いまたはより短いアンプリコンを使用してもよい。
プライマー対が得られた後、本方法は、各々、同じ試料の異なる部分（すなわち、同じ試料の異なるアリコート）を含有し、少なくとも２つの多重ＰＣＲ反応（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の多重ＰＣＲ反応などの最大１０個の多重ＰＣＲ反応）を設定することを含み得る。このステップでは、いくつかのプライマー対が全ての反応において存在し得る一方で、他のプライマー対が１つまたはいくつか（全てではないが）の反応においてのみ存在するという点で、多重ＰＣＲ反応は、互いに同一ではない。例えば、３つの多重ＰＣＲ反応が存在する場合、いくつかのプライマー対は、単一反応において存在してもよく、いくつかのプライマー対は、２つの反応において存在してもよく、いくつかのプライマー対は、３つ全ての反応において存在してもよい。同様に、４つの多重ＰＣＲ反応が存在する場合、いくつかのプライマー対は、単一反応において存在してもよく、いくつかのプライマー対は、２つの反応において存在してもよく、いくつかのプライマー対は、３つの反応において存在してもよく、いくつかのプライマー対は、４つ全ての反応において存在してもよい。これらの実施形態において、プライマー対のうちの少なくともいくつかは、１つを超えるＰＣＲ反応において存在し、ＰＣＲ反応のうちの少なくとも１つが、他の反応（複数可）のプライマー対のうちのいくつかを含有するが、全てを含有しない。特定のプライマー対を含有するＰＣＲ反応の数は、ｉ．選択されたプライマー対によって増幅されたアンプリコンにおける遺伝的変異を見出す可能性、ｉｉ．選択されたプライマー対によって増幅されたアンプリコンにおける対象となる特定の癌と相関する遺伝的変異を見出す可能性、ｉｉｉ．試料が得られた患者の治療歴、ｉｖ．選択されたプライマー対によって増幅されたアンプリコンにおける臨床的に有意な遺伝的変異を見出す可能性、ｖ．試料が得られた患者が受けたこれまでの試験、ｖｉ．選択されたプライマー対によって増幅されたアンプリコンにおいて見出されると予期される遺伝的変異のエラープロファイル（「エラープロファイル」という用語は、特定の変異が遺伝的変異に起因しない頻度を示す）、および／もしくはｖｉｉ．選択されたプライマー対によって増幅されたアンプリコンの長さ、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、様々な因子によって判定される。
例えば、選択されたプライマー対によって増幅されたアンプリコンにおける遺伝的変異を検出する可能性が、他のプライマー対によって増幅されたアンプリコンと比較して高い場合（以前のおよび進行中の実験によって予測されるように）、そのプライマー対は、より多くの反応（例えば、全ての反応）において存在し得る。逆に、選択されたプライマー対によって増幅されたアンプリコンにおける遺伝的変異を検出する可能性が、他のプライマー対によって増幅されたアンプリコンと比較して低い場合（以前のおよび進行中の実験によって予測されるように）、そのプライマー対は、より少ない反応（例えば、１つまたは２つの反応）において存在し得る。別の例では、特定の疾患または状態（例えば、対象となる癌）と相関する遺伝的変異を見出す可能性が、他のアンプリコンと比較して１つのアンプリコンにおいて高い場合、プライマー対は、より多くの反応（例えば、全ての反応）において存在し得る。例えば、非小細胞肺癌に関連する突然変異の試験により関心がある場合、それらの突然変異を潜在的に含有する配列を増幅するプライマー対は、より多くの反応において存在し得る。逆に、研究者に関心がない疾患または状態と相関する遺伝的変異を潜在的に含有する断片を増幅するプライマー対は、より少ない反応（例えば、１つまたは２つの反応）において存在し得る。別の例では、試料が得られた患者の治療歴を使用して、反応が特定のプライマー対を含有する数を判定し得る。この例では、治療に対する耐性に関連する遺伝的変異を有することができる配列を増幅するプライマー対は、より多くの反応（例えば、全ての反応）において存在し得る一方で、治療に対する耐性に関連しない遺伝的変異を有することができる配列を増幅するプライマー対は、より少ない反応、例えば、１つまたは２つの反応において存在し得る。別の例では、臨床的に作用可能な遺伝的変異（すなわち、成功した治療と相関する遺伝的変異）を有することができる配列を増幅するプライマー対は、より多くの反応（例えば、全ての反応）において存在し得る一方で、臨床的に作用可能な遺伝的変異を有しない配列を増幅するプライマー対は、より少ない反応（例えば、１つまたは２つの反応）において存在し得る。別の例では、特定のプライマー対を含有する反応の数は、試料が得られた患者が受けたこれまでの試験によって判定され得る。例えば、患者が特定の遺伝的変異を有することが既に知られている場合、その遺伝的変異を潜在的に含有するアンプリコンを増幅するプライマー対は、より多くの（例えば、全ての）反応において存在し得、遺伝的変異を潜在的に含有するアンプリコンを増幅しないプライマー対は、より少ない（例えば、１つまたは２つの）反応において存在し得る。別の例では、特定のプライマー対を含有する反応の数は、プライマー対によって増幅されたアンプリコンに見出される遺伝的変異の種類によって判定され得る。ある特定の種類の配列変異（例えば、インデルおよび再配列）は、ＰＣＲおよび／または配列決定エラーによって生成される可能性は低く、したがって、インデルを標的とするプライマー対は、より少ない反応（例えば、１つまたは２つの反応）において存在し得る。より高いバックグラウンド（例えば、ヌクレオチド置換）を有する変異を標的とするプライマー対は、より多くの反応（例えば、全ての反応）において存在し得る。別の例では、対象となるＤＮＡが無細胞ＤＮＡの場合のように断片化されるとき、より長い生成物を増幅するプライマー対は、より短い生成物を増幅するプライマー対よりも利用可能なＤＮＡをさらに頻繁に増幅することできないため、より長い生成物を増幅するプライマー対は、より短い生成物を増幅するプライマー対よりも多くの反応において存在し得る。
上記の原理に従って設定された４つの多重ＰＣＲ反応（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４）の概略図を、図１に示す。この例では、アンプリコンＡ１は、他のアンプリコンと比較して遺伝的変異を含有する可能性が高く、したがって、このアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対は全ての反応において存在し、アンプリコンＡ２は、他のアンプリコンと比較して遺伝的変異を含有する可能性が低く、したがって、このアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対は２つの反応において存在し、アンプリコンＡ３は、他のアンプリコンと比較して、対象となる特定の癌、例えば非小細胞肺癌と関連する遺伝的変異を含有する可能性が高く、したがって、このアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対は全ての反応において存在し、アンプリコンＡ４は、他のアンプリコンと比較して、対象となる特定の癌に関連する遺伝的変異を含有する可能性が低く、したがって、このアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対は２つのアンプリコンにおいて存在し、アンプリコンＡ５は、臨床的に作用可能な遺伝的変異を含有する可能性がより高く、したがって、このアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対は全ての反応において存在し、アンプリコンＡ６は、臨床的に作用可能な遺伝的変異を含有する可能性がより低く、したがって、このアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対はわずか３つの反応において存在し、アンプリコンＡ７は、高いバックグラウンド遺伝的変異を含有する可能性がより高く、したがって、このアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対は全ての反応において存在し、アンプリコンＡ８は、低いバックグラウンド遺伝的変異（例えば、インデルまたは転座）を含有する可能性がより高く、したがって、このアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対は２つの反応において存在する。いくつかの実施形態において、より少ない反応において存在するＰＣＲプライマー対は、多重ＰＣＲ反応の各々がほぼ同じ数のプライマー対を含有するように反応の間に広がり得る。
いくつかの実施形態において、遺伝的変異を含有する可能性がより高いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対は、遺伝的変異を含有する可能性がより低いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対よりも多くの反応において存在し得、対象となる特定の癌に関連する遺伝的変異を含有する可能性がより高いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対は、対象となる特定の癌に関連する遺伝的変異を含有する可能性がより低いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対よりも多くの反応において存在し得、患者が療法に耐性を示す遺伝的変異を含有する可能性がより高いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対は、患者が療法に耐性を示す遺伝的変異を含有する可能性がより低いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対よりも多くの反応において存在し得、臨床的に作用可能な遺伝的変異を含有する可能性がより高いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対は、臨床的に作用可能な遺伝的変異を含有する可能性がより低いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対よりも多くの反応において存在し得、および／または高いバックグラウンド遺伝的変異を含有する可能性がより高いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対は、低いバックグラウンド遺伝的変異を含有する可能性がより高いアンプリコンを生成するＰＣＲプライマー対よりも多くの反応において存在し得る。
反応が設定された後、本方法は、複数の複製アンプリコンを生成するために増幅に好適な条件（例えば、熱循環）下で多重ＰＣＲ反応を配置することを含み、「複製」アンプリコンは、２つ以上の反応において同じプライマーによって増幅されるアンプリコンである。複製アンプリコンは、一般に、同じ配列を有する（ＰＣＲエラー、試料中の遺伝的変異に対応する変異、およびＰＣＲプライマー中の任意の変異を除く）。例によって例示すると、図１に示される全てのアンプリコンは、複製物を有し、アンプリコンＡ１は、４つの複製物を有し、アンプリコンＡ２は、２つの複製物を有し、アンプリコンＡ３は、４つの複製物を有するなどである。次いで、アンプリコンは、配列リードを生成するために、配列決定される。
アンプリコンの配列決定において、各異なる多重ＰＣＲ反応に由来するアンプリコンは、互いに別個に配列決定されてもよいか、またはアンプリコンは、複製識別子でバーコード化され、次いで、配列決定の前にプールされてもよい。いくつかの実施形態において、多重ＰＣＲ反応におけるプライマーは、複製識別子を含有する５’尾部を有し得、そのため、ＰＣＲ反応が完了した後、プライマーの５’尾部の配列がアンプリコン中に存在する。他の実施形態において、複製識別子を含有する５’尾部を有するプライマーを使用せずに、多重ＰＣＲ反応を行うことができる。これらの実施形態において、ＰＣＲ生成物は、複製識別子を含有する５’尾部を有するＰＣＲプライマーを使用する第２ラウンドの増幅において、複製識別子でバーコード化されてもよい。いずれにせよ、アンプリコンは、特定の配列決定プラットフォームとの適合性を提供する５’尾部を有するプライマーを使用して、配列決定の前に増幅されてもよい。ある特定の実施形態において、複製識別子に加えて、このステップにおいて使用されるプライマーのうちの１つ以上は、試料識別子を追加的に含有し得る。プライマーが試料識別子を有する場合、異なる試料由来の生成物は、配列決定の前にプールすることができる。いくつかの実施形態において、標的特異的プライマーは、５’から３’までの普遍的な「タグ付け」配列、任意選択の複製バーコード配列、続いて対象となる標的に設計された配列を含有する。初期多重体をさらに増幅するために使用されるプライマーは、特定の配列決定プラットフォームとの適合性を提供する５’から３’の尾部、試料バーコード、および任意選択的に複製バーコード、ならびに標的特異的プライマー上に存在するタグ付け配列の逆相補体のいずれかの部分または全てに結合することができる配列を含有する。典型的には、順方向および逆方向プライマーは、異なるタグ付け配列を有する。
増幅ステップのために使用されるプライマーは、プライマー伸長が使用される任意の次世代配列決定プラットフォーム、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａの可逆的ターミネーター法、Ｒｏｃｈｅのパイロシーケンシング法（４５４）、ライゲーションによるＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの配列決定（ＳＯＬｉＤプラットフォーム）、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔプラットフォーム、またはＰｉｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの蛍光塩基開裂法での使用と適合し得る。そのような方法の例は、以下の参考文献：Ｍａｒｇｕｌｉｅｓら（Ｎａｔｕｒｅ ２００５ ４３７：３７６－８０）、Ｒｏｎａｇｈｉら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６ ２４２：８４－９）、Ｓｈｅｎｄｕｒｅ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００５ ３０９：１７２８）、Ｉｍｅｌｆｏｒｔら（Ｂｒｉｅｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２００９ １０：６０９－１８）、Ｆｏｘら（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５５３：７９－１０８）、Ａｐｐｌｅｂｙら（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５１３：１９－３９） Ｅｎｇｌｉｓｈ（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２ ７：ｅ４７７６８）、およびＭｏｒｏｚｏｖａ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００８ ９２：２５５－６４）に記載されており、これらは、ステップの各々における全ての出発生成物、試薬、および最終生成物を含む、方法の一般的な説明および方法の特定のステップについて参照により組み込まれる。
配列決定ステップは、任意の都合の良い次世代配列決定方法を使用して行われ得、少なくとも１０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも１Ｍ、少なくとも１０Ｍ、少なくとも１００Ｍ、少なくとも１Ｂ、または少なくとも１０Ｂの配列リードをもたらし得る。場合によっては、このリードはペアエンドリードであり得る。
次いで、配列リードを計算的に処理する。初期処理ステップは、バーコード（試料識別子または複製識別子配列を含む）の同定、および低品質またはアダプタ配列を除去するために、リードをトリミングすることを含み得る。加えて、データセットが許容できる品質であることを保証するために、品質評価メトリックを実行することができる。
配列リードが初期処理を受けた後、それらを分析して、遺伝的変異を同定する。変異体配列は、一般に少数（例えば、配列の１０％未満）であるため、無細胞ＤＮＡにおける遺伝的変異の呼び出しは、困難であり得る。したがって、アンプリコン配列決定戦略が採用される場合、各アンプリコンについての配列は、ほとんどが野生型配列であり得る。配列の１０％未満で表され得る少数の変異体は、アーチファクト、例えば、配列決定および／ＰＣＲエラーと区別することが困難である。本方法では、アンプリコンは、各配列変異について、ＰＣＲエラーまたは配列決定アーチファクトとは対照的に、配列変異が遺伝的変異（例えば、試料中のＤＮＡにおける突然変異）を表す可能性が高いかどうかを示すスコアを生成するために分析される。これらの実施形態において、本方法は、選択された配列変異についてのスコアを生成するために、選択された配列変異について複製アンプリコンからの配列リードを分析することを含み得る。これらの実施形態において、スコアは、カットオフを上回る頻度を有する配列変異を含む複製アンプリコンの数に基づき得るか、または複製物にわたる配列変異のために組み合わせられた証拠の強度を示し得る。配列変異は、スコアに基づいて遺伝的変異として呼び出され得る。いくつかの実施形態において、遺伝的変異は、スコアを閾値と比較することによって呼び出され得る。スコアが閾値以上である場合、遺伝的変異を呼び出すことができる。
スコアが、カットオフを上回る頻度を有する配列変異を含む複製アンプリコンの数に基づいている実施形態において、カットオフは、配列変異が増幅および／または配列決定エラーによって生成される頻度を示すエラー分布に基づき得る。このエラー分布は、遺伝的変異を有し得るか否かの対照試料を使用して確立され得る。いくつかの実施形態において、カットオフは、対照試料の配列決定に基づいて、二項式、過剰分散二項式、ベータ、正常、指数関数式、またはガンマ確率分布モデルを使用して決定され得る。いくつかの実施形態において、エラー分布は、どのくらいの頻度で増幅および／または配列決定エラーが異なる配列決定深さで発生するかを示し得る。このようなエラー分布の例を、図２に示す。図２に示される例では、アンプリコンの各位置における配列変異の頻度（すなわち、その位置の配列リードの総数に対する位置に配列変異を含有する配列リードの数）は、各位置に関する配列変異のバックグラウンドレベルを確立するために、いくつかの対照試料の配列決定深さ（すなわち、配列リードの総数）に対してプロットすることができる（そのバックグラウンドは、遺伝子変異ではなく、配列決定アーチファクトに起因すると推定される）。この例では、「カットオフ」は、統計的にバックグラウンドである可能性が低い変異を同定するためのベースラインを確立する。これらの実施形態において、カットオフを上回る頻度を有する配列変異を含む複製アンプリコンの数は、変異が遺伝的変異であるかどうかを判定するために使用することができるスコアを提供する。例えば、図２に示す例では、変異体の頻度は、４つの複製のうちの３つにおいてカットオフを上回る。この実施例では、スコアは、「３／４」、０．７５、または単に「３」であり得、変異が３つの複製において正に同定されたことを示す。次いで、このスコアは、変異が遺伝的変異の結果である可能性が高いかどうかを判定するために閾値と比較される。この閾値は、位置ごとに変化させることができ、すべての潜在的な遺伝的変異において同じである必要はない。例えば、図２に示す例では、閾値は、例えば、２または３であり得、この場合、データを図２に示す変異体は、変異が見出される複製物の数がカットオフ以上であるため、遺伝的変異に起因する可能性が高い。この実施例で閾値が４である場合、スコアが閾値未満であるため、変異を遺伝的変異として呼び出すことはできない。理解され得るように、閾値は、いくつのアンプリコンの複製物が配列決定され、いくつかの他の因子に応じて増加または減少し得る。カットオフはまた、いくつかの因子に基づいて増加または減少し得る。いくつかの実施形態において、この方法は、（ｉ）特定のアンプリコンの各ヌクレオチド位置について、異なる配列決定深さで増幅および／または配列決定エラーがどのくらいの頻度で発生するかを示すエラー分布を判定する、例えば、プロット化することと、（ｉｉ）配列の各位置についての分布に基づいて、各異なる配列決定深さに対して、遺伝的変異を検出することができるカットオフでまたはカットオフを上回るカットオフを判定することと、（ｉｉｉ）同じ試料から複数の複製アンプリコンを配列決定して、複製アンプリコンについて複数のリードを得ることと、（ｉｖ）アンプリコンの各位置について、配列リードにおける配列変異の頻度がカットオフを上回るか、または下回るかを判定することと、を含み得る。カットオフで、またはそれを上回るのアンプリコンの数が、スコアを提供する。これらの実施形態において、「プロット化」という用語は、計算上行われ得、したがって、この方法は、グラフを物理的に描くことなく行われ得る。
スコアが複製物にわたる配列変異についての組み合わせられた証拠の強度を示す実施形態において、データは、頻度論またはベイジアンのいずれかの統計的手順に供され得、変異についての証拠は、ベイズ分析の文脈において、尤度値、または代替的にベイズ因子もしくは事後確率として要約され得る。これらの実施形態において、この統計的スコアは、それが蓄積されるにつれて他のデータによって変更され得る。例えば、配列変異についての組み合わせられた証拠（その証拠は、例えば、変異を有する配列リードが同定された複製物の数、および各アンプリコンについて、ｉ．変異を有する配列リードの数、ｉｉ．アンプリコンについての配列リードの総数、ｉｉｉ．配列リードにおける遺伝的変異の頻度、ならびにｉｖ他の指標を含み得る）は、スコア（例えば、Ｐ値など）として要約することができ、スコアを閾値と比較して、変異を遺伝的変異として呼び出すことができるかどうかを判定することができる。例えば、組み合わせた証拠を要約するスコアが０．９１であり、遺伝的変異を呼び出す尤度閾値が０．９５である場合、遺伝的変異を呼び出すことはできない。他方では、組み合わせた証拠を要約するスコアが０．９８であり、遺伝的変異を呼び出す尤度閾値が０．９５である場合、遺伝的変異を呼び出すべきである。これらの分析方法ならびに閾値は、必要に応じて、機械学習によって行うことができる。
しかしながら、配列分析ステップが実装されると、使用される閾値またはカットオフ自体は、データが蓄積されるおよび／または他の因子に応じて、各変異について増加または減少させることができる。例えば、閾値および／またはカットオフ自体は、上述のものと類似の因子を使用して増加または減少させることができる。例えば、閾値および／またはカットオフは、癌患者における特定の遺伝的変異の予期される頻度（この場合、閾値および／またはカットオフは、より一般的な突然変異においてより低くなり得る）、試料が得られた患者の癌の種類（この場合、閾値および／またはカットオフは、非小細胞肺癌などの目的の癌に関連する突然変異においてより低くなり得る）、試料が得られた患者の治療歴（この場合、閾値および／またはカットオフは、治療に対する耐性に関連する遺伝的変異においてより低くなり得る）、遺伝的変異の臨床的有意性（この場合、閾値および／またはカットオフは、癌の治療に関連する遺伝的変異においてより低くなり得る）、患者が受けたこれまでの試験（この場合、閾値および／またはカットオフは、患者において既に同定されている遺伝的変異においてより低くなり得る）、変異のエラープロファイル（この場合、閾値および／またはカットオフは、より低いエラー率を有する遺伝的変異においてより低くなり得る）、試料中に見出される他の遺伝的変異（この場合、閾値および／またはカットオフは、試料中で一般的には共に見出されない遺伝的変異においてより低くなり得る）、ならびに／または配列決定の全体的なエラー率に基づいて増加または減少させることができる。
いくつかの実施形態において、試料はｃｆＤＮＡであってもよく、本方法は、（ＲＴ－ＰＣＲを介して）同じ対象からのｃｆＲＮＡを使用して増幅された同じ領域の少なくともいくつかを配列決定することをさらに含んでもよい。これは、同じアンプリコンまたは異なるアンプリコンのいずれかを使用して実施することができる。この実装において、本方法は、ｃｆＤＮＡを使用して呼び出される遺伝的変異と、ｃｆＲＮＡを使用して呼び出される遺伝的変異とを比較することを含み得る。両方の試料において変異が同定される場合、それはより高い信頼性を有する遺伝的変異であると同定され得る。
いくつかの実施形態において、試料はｃｆＤＮＡであってもよく、本方法は、同じ対象からの白血球ＤＮＡから増幅された同じアンプリコンのうちの少なくともいくつかを配列決定することをさらに含んでもよい。これらの実施形態において、方法は、ｃｆＤＮＡを使用して呼び出される遺伝的変異と、白血球ＤＮＡを使用して呼び出される遺伝的変異とを比較することを含み得る。両方の試料において変異が同定される場合、それはより低い信頼性を有する、または信頼性を有さない遺伝的変異であると同定され得る。この実施形態は、未確定の潜在能を持つクローン造血（ＣＨＩＰ）に起因する可能性があり得るか（一般に、Ｆｕｎａｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ２０１６ １２８：３１７６およびＨｅｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｄｔｓｃｈ Ａｒｚｔｅｂｌ Ｉｎｔ．２０１６ １１３：３１７－３２２を参照されたい）、または例えば、生殖細胞株変異体であり得る変異体を同定する方法を提供する。
代替の実施形態において、方法は、変異を増幅する複製ＰＣＲ反応の数を変化させることなく、特定の配列変異の閾値および／またはカットオフを増加または減少させることによって実施され得る。これらの実施形態は、（ａ）多重ＰＣＲ反応において適合する複数のプライマー対を得ることと、（ｂ）少なくとも２つの多重ＰＣＲ反応を設定することであって、各々、同じ試料の異なる部分を含有し、異なる反応が同じプライマーを含有する、設定することと、（ｃ）複数の複製アンプリコンを生成するために、多重ＰＣＲ反応を熱循環させることと、（ｄ）配列リードを生成するために、アンプリコンを配列決定することと、（ｅ）選択された配列変異についてのスコアを生成するために、選択された配列変異について複製アンプリコンからの配列リードを分析することであって、スコアが、ｉ．カットオフを上回る頻度を有する配列変異を含む複製アンプリコンの数に基づいている、またはｉｉ．複製にわたる配列変異のために組み合わせられた証拠の強度を示す、分析することと、（ｆ）スコアに基づいて遺伝的変異として配列変異を呼び出すことであって、各選択された配列変位に使用されるスコアおよび／またはカットオフは、部分的に、ｉ．遺伝的変異の予期される頻度、ｉｉ．試料が得られた患者の癌の種類、ｉｉｉ．試料が得られた患者の治療歴、ｉｖ．遺伝的変異の臨床的有意性、ｖ．試料が得られた患者が受けたこれまでの試験、ｖｉ．遺伝的変異のエラープロファイル、ｖｉ．試料中に見出された他の遺伝的変異、および／またはｖｉｉ配列決定の全体的なエラー率、またはこれらの任意の組み合わせに基づいている、呼び出すことと、を含み得る。この代替方法がどのように実施され得るかの詳細は、本開示の他の部分から適合され得る。
いくつかの実施形態において、本方法は、試料中に遺伝的変異があるかどうか、遺伝的変異の種類、および／または遺伝的変異によって引き起こされるアミノ酸置換を示す報告書を提供することを含み得る。いくつかの実施形態において、報告書は、試料中で同定される遺伝的変異に関連する癌に対する承認された（例えば、ＦＤＡ承認された）療法をさらに列記し得る。この情報は、疾患（例えば、患者が癌を有するかどうか）および／または医師によってなされた治療法の決定を診断するのに役立ち得る。
いくつかの実施形態において、報告書は、電子的形態であってもよく、本方法は、報告書を遠隔場所に、例えば、医師または他の医療専門家に転送して、好適な行動経過を同定する、例えば、対象を診断する、または対象に好適な療法を同定するのを支援することを含む。報告書は、例えば、対象が療法の影響を受けやすいかどうかを判定するために、他の指標とともに使用されてもよい。
任意の実施形態において、報告書は、「遠隔場所」に転送することができ、「遠隔場所」は、配列が分析される場所以外の場所を意味する。例えば、遠隔場所は、同じ都市内の別の場所（例えば、オフィス、研究室など）、異なる都市内の別の場所、異なる州内の別の場所、異なる国内の別の場所などであり得る。したがって、ある項目が別の項目から「遠隔」であると示される場合、意味するのは、２つの項目が、同じ部屋にあるが、離れている、または少なくとも異なる部屋もしくは異なる建物にあることができ、少なくとも１マイル、１０マイル、または少なくとも１００マイル離れていることができることである。「通信」情報は、好適な通信チャネル（例えば、プライベートまたはパブリックネットワーク）を介して電気信号としてその情報を表すデータを送信することを指す。項目を「転送する」とは、その項目を物理的に輸送するか否かにかかわらず（それが可能な場合）、その項目をある場所から次の場所に取得する任意の手段を指し、少なくともデータの場合、データを運ぶ媒体を物理的に輸送するか、またはデータを通信することを含む。通信媒体の例は、無線または赤外線送信チャネル、ならびに別のコンピュータまたはネットワークデバイスへのネットワーク接続、ならびに電子メール送信およびウェブサイトに記録された情報などを含むインターネットを含む。ある特定の実施形態において、報告書は、ＭＤまたは他の適格な医療専門家によって分析され得、配列の分析の結果に基づいた報告書は、試料が得られた患者に転送され得る。
いくつかの実施形態において、生物学的試料は、患者から得られ得、試料は、方法を使用して分析され得る。特定の実施形態において、本方法は、ゲノム遺伝子座の野生型コピーおよびゲノム遺伝子座の変異体コピーの両方を含有する生物学的試料中にあるゲノム遺伝子座の変異体コピーの量を同定および／または推定するために採用され得、変異体コピーは、ゲノム遺伝子座の野生型コピーに対して配列変異を有する。この実施例において、試料は、ゲノム遺伝子座の変異体コピーよりも少なくとも２倍（例えば、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも５，０００倍、または少なくとも１０，０００倍）多くのゲノム遺伝子座の野生型コピーを含有してもよい。
いくつかの実施形態において、本方法は、ショットガンによる濃縮されていない／増幅されていない試料のショットガン配列決定、または全エクソンの配列決定を伴わない。むしろ、配列決定は、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＳＲ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＥＴ、ＭＹＣ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、ＲＯＳ１、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、およびＵ２ＡＦ１のコード配列、ならびに他の遺伝子のコード配列、または非小細胞肺癌に関連する突然変異に焦点を当てて、最大２００、例えば、最大１００または最大５０個の遺伝子のコード配列の少なくとも一部を標的にするより大きな配列決定努力の一部として行われ得る。代替の実施形態において、本方法は、乳癌、黒色腫、腎臓癌、子宮内膜癌、卵巣癌、膵臓癌、白血病、結腸直腸癌、前立腺癌、中皮腫、神経膠腫、髄芽腫、多細胞血症、リンパ腫、肉腫、または多発性骨髄腫と関連付けられ得る、例えば、ＰＩＫ３ＣＡ、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＪＡＫ２、ＨＲＡＳ、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ１、ＥＧＦＲ、ＣＤＫ４、ＢＲＡＦ、ＲＥＴ、ＰＧＤＦＲＡ、ＫＩＴ、またはＥＲＢＢ２における発癌変異を検出するために使用され得る（例えば、Ｃｈｉａｌ ２００８ Ｐｒｏｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ｔｏ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ １：１を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、試料は、第１の場所、例えば、病院または医師のオフィスなどの臨床環境において患者から収集され得、試料は、第２の場所、例えば、試料が処理され、上記の方法が実施されて、報告書を生成する実験室に転送され得る。本明細書に記載の「報告書」は、試料中の少数の変異体（複数可）の存在および／または量を示し得る試験結果を提供する報告要素を含む、電子的または有形の文書である。生成されると、報告書は、臨床決定の一部として、医療専門家（例えば、臨床医、臨床検査技師、または腫瘍学者、外科医、病理学者、もしくはウイルス学者などの医師）によって解釈され得る別の場所（第１の場所と同じ場所であってもよい）に転送され得る。
この方法によって同定される遺伝的変異は、診断的、予後的、または治療的であり得る。
いくつかの実施形態において、本方法は、治療法の決定を導くために使用してもよい。これらの実施形態において、本方法は、上記の方法を実施すること、または実施したこと、および作用可能な治療が同定される場合に患者に治療を投与することを含む治療方法であり得る。作用可能な突然変異には、ＥＧＦＲおよびＢＲＡＦの活性化突然変異、例えば、ＥＧＦＲにおけるＧ７１９Ｘ、エクソン１９欠失、Ｖ７６５Ａ、Ｔ７８３Ａ、Ｖ７７４Ａ、Ｓ７８４Ｐ、Ｌ８５８Ｒ、Ｓ７６８Ｉ、およびＬ８６１Ｘ、ならびにＢＲＡＦにおけるＶ６００Ｅ；Ｌ６０１Ｇ；Ｋ６０１Ｅ；Ｌ５９７Ｖ／Ｑ／Ｒ、およびＧ４６９Ｖ／Ｓ／Ｒ／Ｅ／Ａが含まれるが、これらに限定されない。作用可能な突然変異はまた、ＡＬＫおよびＲＯＳ１における再配列、例えば、ＥＭＬ４－ＡＬＫ、ＴＦＧ－ＡＬＫ、ＳＴＲＮ－ＡＬＫ、ＫＩＦ５Ｂ－ＡＬＫ、ＣＤ７４－ＲＯＳ１、ＳＬＣ３４Ａ２－ＲＯＳ１、ＳＤＣ４－ＲＯＳ１、およびＥＺＲ－ＲＯＳ１融合物も含む。例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、アファチニブ（Ｇｉｌｏｔｒｉｆ）、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、またはオシメルチニブ（Ｔａｇｒｉｓｓｏ）は、ＥＧＦＲにおける活性化突然変異を有する患者に投与してもよく、クリゾチニブ（Ｘａｌｋｏｒｉ）、セリチニブ（Ｚｙｋａｄｉａ）、アレクチニブ（Ａｌｅｃｅｎｓａ）、またはブリガチニブ（Ａｌｕｎｂｒｉｇ）は、ＡＬＫ融合物を有する患者に投与してもよく、クリゾチニブ（Ｘａｌｋｏｒｉ）、エンテクチニブ（ＲＸＤＸ－１０１）、ロラチニブ（ＰＦ－０６４６３９２２）、クリゾチニブ（Ｘａｌｋｏｒｉ）、エンテクチニブ（ＲＸＤＸ－１０１）、ロルラチニブ（ＰＦ－０６４６３９２２）、ロポトレクチニブ（ＴＰＸ－０００５）、ＤＳ－６０５１ｂ、セリチニブ、エンサルチニブ、またはカボザンチニブは、ＲＯＳ１融合物を有する患者に投与してもよく、ダブラフェニブ（Ｔａｆｉｎｌａｒ）またはトラメチニブ（Ｍｅｋｉｎｉｓｔ）は、ＢＲＡＦにおける活性化突然変異を有する患者に投与してもよい。免疫チェックポイント阻害剤による患者の治療を誘導するために使用することができる突然変異を含む、多くの他の作用可能な突然変異もまた知られている。
他の実施形態において、本方法は、治療をモニタリングするために使用してもよい。例えば、本方法は、本方法を使用して第１の時点で得られた試料を分析することと、本方法によって第２の時点で得られた試料を分析することと、結果を比較することと、すなわち、試料中でどの変異が呼び出されるかおよびその対立遺伝子頻度を比較することと、を含んでもよい。第１および第２の時点は、治療前および治療後であっても、治療後の２つの時点であってもよい。例えば、ある時点から得られた結果を別の時点から得られた結果と比較することによって、本方法は、治療の経過中に現れた新しい変異（例えば、突然変異）を同定するか、または治療の経過中に以前に同定された変異が対象にもはや存在しないかどうかを判定するために使用することができる。本方法は、治療の過程中に任意の突然変異の対立遺伝子頻度が変化（増加または減少）したかどうかを判定するために使用することができる。治療法に対する患者の応答は、突然変異の対立遺伝子頻度または突然変異の存在下でのいずれかの変化を検出することによってモニタリングすることができる。複数の突然変異が存在する場合、対立遺伝子頻度および対立遺伝子頻度変化は、異なる突然変異を組み合わせることによって判定することができ、それらを等しくまたは代替的に、例えば、可能性の高いクローン性、臨床的有意性、生殖細胞株またはＣＨＩＰとは対照的に癌内で体細胞変化である確率およびアクション可能性に基づいて重み付けすることができる。患者が治療法に応答する可能性が高いと判定された場合、患者はその治療法を継続してもよく、応答しない可能性が高いと判定された場合、代替療法に変更することができる。
この方法はまた、対象が無疾患であるか、または疾患が再発しているかどうかを判定するためにも使用してもよい。
いくつかの実施形態において、本方法は、最小限の残存疾患の分析のために使用してもよい。これらの実施形態において、本方法で使用されるプライマー対は、腫瘍物質、より早い時点でのｃｆＤＮＡ、または別の好適な試料の配列決定のいずれかを介して、患者の腫瘍において以前に同定された変異を含有する配列を増幅するように設計され得る。各プライマー対を含有する反応の数は、例えば、変異体がドライバー突然変異であると予測されるかどうか、変異体が癌において同定された信頼性、変異体が癌においてクローンまたはサブクローンであると予期されるかどうか、変異体が、典型的には配列にノイズがある塩基に位置するかどうか、変異体が、多かれ少なかれ断片化されると予測されるゲノム領域（例えば、オープンクロマチンまたはクローズドクロマチン）にあるかどうか、変異体が、ＣＨＩＰまたは生殖細胞株変化ではなく癌内に存在する体細胞変化であるという信頼度、変異体の種類が点変異またはインデルである場合、および短いまたは長い場合にインデルである場合に応じて変化し得る。いくつかの実施形態において、各変異体を呼び出すための閾値は、例えば、変異体がドライバー突然変異であると予測されるかどうか、変異体が癌においてクローン型またはサブクローン型であると予測されるかどうか、変異体が典型的に配列にノイズがある塩基に位置するかどうかに基づいて増加または減少され得る。いくつかの実施形態において、全ての患者特異的変異に対する証拠を組み合わせて、患者が依然として残存疾患を有するか、または無疾患であり得るかどうかを判定することができる。各変異体の重要性は、上記のように調整することができる。
容易に理解されるように、方法の多くのステップ、例えば、配列処理ステップ、および遺伝的変異を示す報告書の生成は、コンピュータ上に実装され得る。したがって、いくつかの実施形態において、本方法は、配列リードの分析に基づいて患者が遺伝的変異を有するかどうかの可能性を計算するアルゴリズムを実行することと、その可能性を出力することと、を含み得る。いくつかの実施形態において、この方法は、配列をコンピュータに入力することと、入力測定値を使用して可能性を計算することができるアルゴリズムを実行することと、を含み得る。
明らかであろうように、記載される計算ステップは、コンピュータ実装され得、したがって、ステップを実施するための命令は、好適な物理コンピュータ可読記憶媒体に記録され得るプログラミングとして記載され得る。配列決定リードは、計算的に分析され得る。
本明細書に記載の方法の任意の実施形態は、亜硫酸水素塩処理ＤＮＡの分析に適合され得る。例えば、本方法は、遺伝的変異ではなく、亜硫酸水素塩配列決定を通じてエピジェネティック変異を検出するように適合され得る。そのような実施形態において、亜硫酸水素塩処理ＤＮＡを複製して分析し得る。ＰＣＲプライマーは、対象となるＣｐＧ含有部位の範囲を増幅するように設計され得る。異なるＣｐＧ部位を含有する各アンプリコンについての複製物の数は、特定のＣｐＧ部位が対象となる試料中で過メチル化または低メチル化されると予期される頻度、かかる低メチル化または高メチル化の有意性、および特定のＣｐＧ部位を読み取るときに予期されるノイズレベルなどの多くの基準に基づいて優先され得る。再び、変異体呼び出しと同様に、ＣｐＧ部位をメチル化または非メチル化のいずれかと呼び出し、ＤＮＡメチル化の程度を判定するために、これらのような因子に基づいて各ＣｐＧ部位について閾値およびカットオフを調整することもできる。

Claims (15)

  1. 最小限の残存疾患の分析のための方法であって、
    （ａ）腫瘍物質を配列決定することを介して患者の腫瘍において以前に同定された配列変異を含有する配列を増幅するように設計され、多重ＰＣＲ反応に適合する複数のプライマー対を得るステップと、
    （ｂ）各々、（ａ）の患者由来のｃｆＤＮＡの試料の異なるアリコートを含む、少なくとも２つの複製多重ＰＣＲ反応を設定するステップと、
    （ｃ）複数の複製アンプリコンを生成するために、前記複製多重ＰＣＲ反応を熱循環させるステップと、
    （ｄ）配列リードを生成するために、前記アンプリコンを配列決定するステップと、
    （ｅ）前記患者の腫瘍に以前に同定された選択された配列変異についてのスコアを生成するために、前記選択された配列変異について複製アンプリコンからの前記配列リードを分析するステップであって、前記スコアが、
    ｉ．カットオフを上回る頻度を有する配列変異を含む複製アンプリコンの数に基づいている、または
    ｉｉ．前記複製アンプリコンにわたる前記患者特異的配列変異のための組み合わせられた証拠の強度を示す、分析するステップと、
    （ｆ）前記スコアに基づいて遺伝的変異として前記配列変異を呼び出すステップと、を含む、方法。
  2. 前記プライマー対のうちの少なくともいくつかが、１より多いＰＣＲ反応中にあり、前記ＰＣＲ反応の少なくとも１つが、いくつかではあるが全部ではない他の反応のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 異なる反応が同じプライマーを含む、請求項１に記載の方法。
  4. （ｂ）のｃｆＤＮＡの前記試料が、処置後の患者から収集されたものである、請求項１に記載の方法。
  5. （ｂ）のｃｆＤＮＡの前記試料が、癌治療後の患者から収集されたものである、請求項４に記載の方法。
  6. ステップ（ｂ）から（ｆ）が、同じ患者から異なる時間に収集されたｃｆＤＮＡの第１および第２の試料に対して行われる、請求項１に記載の方法。
  7. ステップ（ｂ）において、前記試料が、３または４つの複製多重ＰＣＲ反応に分割される、請求項１に記載の方法。
  8. （ｂ）の前記多重ＰＣＲ反応の各々が、少なくとも５つのプライマー対を含む、請求項１に記載の方法。
  9. （ｃ）の各アンプリコンの長さが、独立して５０ｂｐから５００ｂｐの範囲内にある、請求項１に記載の方法。
  10. ステップ（ｆ）において、前記呼び出しが、前記スコアを閾値と比較することによって行われ、前記閾値または閾値超で遺伝的変異を呼び出すことができる、請求項１に記載の方法。
  11. 前記カットオフが、配列変異が増幅および／または配列決定エラーによってどのくらいの頻度で生成されるかを示すエラー分布に基づいている、請求項１に記載の方法。
  12. 前記エラー分布が、配列決定制御試料によって推定される、請求項１１に記載の方法。
  13. （ｅ）ｉｉの前記配列変異のための前記組み合わせられた証拠が、尤度値を使用して要約され、前記閾値が、尤度閾値である、請求項１０に記載の方法。
  14. （ｅ）ｉｉの前記配列変異のための前記組み合わせられた証拠が、ベイズ統計を使用して要約され、前記閾値が、事前分布によって変化し得るベイズ因子である、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記配列変異に関する情報を含む報告書を第三者に転送することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

JP2021531204A 2018-08-08 2019-08-02 可変の複製多重ｐｃｒを使用した配列決定方法 Active JP7407193B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862716082P 2018-08-08 2018-08-08
US62/716,082 2018-08-08
PCT/IB2019/056625 WO2020031048A1 (en) 2018-08-08 2019-08-02 Method of sequencing using variable replicate multiplex pcr

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2022513173A JP2022513173A (ja) 2022-02-07
JPWO2020031048A5 JPWO2020031048A5 (ja) 2022-07-29
JP7407193B2 true JP7407193B2 (ja) 2023-12-28

Family

ID=67953830

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021531204A Active JP7407193B2 (ja) 2018-08-08 2019-08-02 可変の複製多重ｐｃｒを使用した配列決定方法

Country Status (9)

Country Link
US (3) US11566274B2 (ja)
EP (1) EP3833783A1 (ja)
JP (1) JP7407193B2 (ja)
KR (1) KR20210044249A (ja)
CN (1) CN112601824A (ja)
AU (1) AU2019319711A1 (ja)
BR (1) BR112021002189A2 (ja)
CA (1) CA3107376A1 (ja)
WO (1) WO2020031048A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3107376A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Inivata Ltd. Method of sequencing using variable replicate multiplex pcr
WO2023012521A1 (en) * 2021-08-05 2023-02-09 Inivata Limited Highly sensitive method for detecting cancer dna in a sample
WO2022029688A1 (en) * 2020-08-05 2022-02-10 Inivata Ltd. Highly sensitive method for detecting cancer dna in a sample

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015526073A (ja) 2012-07-24 2015-09-10 ナテラ， インコーポレイテッド 高度多重ｐｃｒ法および組成物
US20160369333A1 (en) 2010-05-18 2016-12-22 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US20170204455A1 (en) 2014-07-18 2017-07-20 Cancer Research Technology Limited Method for Detecting a Genetic Variant
WO2018083467A1 (en) 2016-11-02 2018-05-11 Ucl Business Plc Method of detecting tumour recurrence

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5948902A (en) 1997-11-20 1999-09-07 South Alabama Medical Science Foundation Antisense oligonucleotides to human serine/threonine protein phosphatase genes
US7727720B2 (en) 2002-05-08 2010-06-01 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
US20040086892A1 (en) 2002-11-06 2004-05-06 Crothers Donald M. Universal tag assay
US20050233340A1 (en) 2004-04-20 2005-10-20 Barrett Michael T Methods and compositions for assessing CpG methylation
US20060263789A1 (en) 2005-05-19 2006-11-23 Robert Kincaid Unique identifiers for indicating properties associated with entities to which they are attached, and methods for using
US20070020640A1 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Mccloskey Megan L Molecular encoding of nucleic acid templates for PCR and other forms of sequence analysis
US9285297B2 (en) 2005-08-22 2016-03-15 Applied Biosystems, Llc Device, system, and method for depositing processed immiscible-fluid-discrete-volumes
EP2481815B1 (en) 2006-05-11 2016-01-27 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices
AU2008255569A1 (en) 2007-06-01 2008-12-04 Monoquant Pty Ltd A method for DNA breakpoint analysis
WO2010056351A2 (en) * 2008-11-14 2010-05-20 Stc.Unm Gene expression classifiers for relapse free survival and minimal residual disease improve risk classification and out come prediction in pedeatric b-precursor acute lymphoblastic leukemia
US9524369B2 (en) 2009-06-15 2016-12-20 Complete Genomics, Inc. Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data
WO2011140187A2 (en) 2010-05-04 2011-11-10 University Of Rochester Detecting chromosomal rearrangement
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
KR20210131432A (ko) * 2010-12-30 2021-11-02 파운데이션 메디신 인코포레이티드 종양 샘플의 다유전자 분석의 최적화
WO2013036929A1 (en) 2011-09-09 2013-03-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior Methods for obtaining a sequence
GB201301857D0 (en) 2013-02-01 2013-03-20 Selvi Ozan Method
AU2014227883B9 (en) 2013-03-15 2020-09-10 Life Technologies Corporation Classification and actionability indices for lung cancer
EP3795696B1 (en) 2013-03-15 2023-04-26 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Identification and use of circulating nucleic acid tumor markers
US10262755B2 (en) 2014-04-21 2019-04-16 Natera, Inc. Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments
EP3071706B1 (en) 2013-11-21 2018-04-25 Assistance Publique-Hôpitaux de Paris Method for detecting chromosomal rearrangements
ES2822125T3 (es) 2013-12-28 2021-04-29 Guardant Health Inc Métodos y sistemas para detectar variantes genéticas
CN107002123A (zh) * 2014-08-14 2017-08-01 生命技术公司 多重转录组分析
WO2016036553A1 (en) 2014-09-05 2016-03-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. Multiplexed pcr assay for high throughput genotyping
WO2016118883A1 (en) * 2015-01-23 2016-07-28 Washington University Detection of rare sequence variants, methods and compositions therefor
US20160275240A1 (en) 2015-02-18 2016-09-22 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for pooling amplification primers
WO2016201142A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Life Technologies Corporation Methods, systems, compositions, kits, apparatus and computer-readable media for molecular tagging
CA3007426A1 (en) 2015-12-03 2017-06-08 Alfred Health Monitoring treatment or progression of myeloma
CN106282356B (zh) * 2016-08-30 2019-11-26 天津诺禾医学检验所有限公司 一种基于扩增子二代测序点突变检测的方法及装置
GB201615486D0 (en) 2016-09-13 2016-10-26 Inivata Ltd Methods for labelling nucleic acids
CN106834275A (zh) * 2017-02-22 2017-06-13 天津诺禾医学检验所有限公司 ctDNA超低频突变检测文库的构建方法、试剂盒及文库检测数据的分析方法
GB201709675D0 (en) 2017-06-16 2017-08-02 Inivata Ltd Method for detecting genomic rearrangements
US20200347140A1 (en) 2017-08-30 2020-11-05 Symphogen A/S Compositions and methods for treating cancer with anti-egfr antibodies
CN111278993A (zh) * 2017-09-15 2020-06-12 加利福尼亚大学董事会 从无细胞核酸中检测体细胞单核苷酸变体并应用于微小残留病变监测
WO2019090156A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Guardant Health, Inc. Normalizing tumor mutation burden
WO2019099750A1 (en) 2017-11-17 2019-05-23 Research Cancer Institute Of America Compositions, methods, systems and/or kits for preventing and/or treating neoplasms
GB201804641D0 (en) 2018-03-22 2018-05-09 Inivata Ltd Methods of sequencing nucleic acids and error correction of sequence reads
GB201804642D0 (en) 2018-03-22 2018-05-09 Inivata Ltd Methods of labelling nucleic acids
US20210040564A1 (en) 2018-04-23 2021-02-11 Inivata Ltd. Method for predicting and monitoring response to an immune checkpoint inhibitor
WO2019207439A1 (en) 2018-04-23 2019-10-31 Inivata Ltd. Method for predicting and monitoring response to an immune checkpoint inhibitor
US10329627B1 (en) 2018-04-23 2019-06-25 Inivata Ltd. Method for predicting and monitoring response to an immune checkpoint inhibitor
CA3107376A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Inivata Ltd. Method of sequencing using variable replicate multiplex pcr
WO2020049485A1 (en) 2018-09-05 2020-03-12 Inivata Ltd. Method of treating a cancer patient without the need for a tissue biopsy
US20220017970A1 (en) 2018-12-12 2022-01-20 Inivata Ltd. Method for quantifying gene fusion dna
US10533214B2 (en) 2018-12-21 2020-01-14 Inivata Ltd. Method for measuring mutational load
US20230304084A1 (en) 2019-02-28 2023-09-28 Inivata Ltd. Method for quantifying the amount of a target sequence in a sample
WO2021028768A1 (en) 2019-08-13 2021-02-18 Inivata Ltd. METHOD FOR ALTERING THERAPY OF ADVANCED NON-SMALL CELL LUNG CANCER PATIENTS BASED ON ANALYSIS OF ctDNA
WO2022029688A1 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Inivata Ltd. Highly sensitive method for detecting cancer dna in a sample

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160369333A1 (en) 2010-05-18 2016-12-22 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
JP2015526073A (ja) 2012-07-24 2015-09-10 ナテラ， インコーポレイテッド 高度多重ｐｃｒ法および組成物
US20170204455A1 (en) 2014-07-18 2017-07-20 Cancer Research Technology Limited Method for Detecting a Genetic Variant
WO2018083467A1 (en) 2016-11-02 2018-05-11 Ucl Business Plc Method of detecting tumour recurrence

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Int. J. Legal. Med.，2014年，Vol.128，pp.259-267

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022513173A (ja) 2022-02-07
BR112021002189A2 (pt) 2021-05-04
US20240110224A1 (en) 2024-04-04
US20230227890A1 (en) 2023-07-20
KR20210044249A (ko) 2021-04-22
US11788116B2 (en) 2023-10-17
US11566274B2 (en) 2023-01-31
CN112601824A (zh) 2021-04-02
CA3107376A1 (en) 2020-02-13
EP3833783A1 (en) 2021-06-16
WO2020031048A1 (en) 2020-02-13
US20200157604A1 (en) 2020-05-21
AU2019319711A1 (en) 2021-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7119014B2 (ja) まれな変異およびコピー数多型を検出するためのシステムおよび方法
US11959139B2 (en) Methods and systems for detecting genetic variants
US11788116B2 (en) Method for the analysis of minimal residual disease
CN114574581A (zh) 检测稀有突变和拷贝数变异的系统和方法
US20230304084A1 (en) Method for quantifying the amount of a target sequence in a sample
WO2020128868A1 (en) Method for amplifying a genomic sample
WO2022029688A1 (en) Highly sensitive method for detecting cancer dna in a sample
US20240132965A1 (en) Highly sensitive method for detecting cancer dna in a sample
WO2023012521A1 (en) Highly sensitive method for detecting cancer dna in a sample
US20220056508A1 (en) Method for amplifying a genomic sample

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20211122

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220721

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20220721

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20230628

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230718

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231018

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20231205

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20231218

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7407193

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150