JP7385095B2 - Nucleic acid adsorbent - Google Patents
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Description
特許法第３０条第２項適用 高分子学会予稿集６７巻２号［２０１８］（公益社団法人高分子学会）ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｏｕｄ．ｄｙｎａｃｏｍ．ｃｏ．ｊｐ／ｔｏｈｒｏｎ２０１８／ｌｏｇｉｎ．ｐｈｐ？ｉｄ＝１Ｌ１８＆ｐｌａｃｅ＿ｎｕｍ＝１Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act Proceedings of the Society of Polymer Science, Volume 67, No. 2 [2018] (Public Interest Incorporated Association) https://cloud. dynacom. co. jp/tohron2018/login. php? id=1L18&place_num=1
本発明は、核酸吸着材、及びこの核酸吸着材を用いた核酸吸着方法に関する。 The present invention relates to a nucleic acid adsorbent and a nucleic acid adsorption method using this nucleic acid adsorbent.
細胞培養や微生物培養により酵素、抗体、サイトカインなどの有用物質を生産する際、目的の有用物質を含む培養液中には、細胞や微生物、目的物質の他に、核酸や、培養液成分である糖、塩のような低分子化合物が含まれる。従って、目的物質以外の夾雑成分を除去して製品とする必要がある。
特に、核酸は培養液の粘度を上昇させるため、有用物質の分離及び精製の効率を低下させる原因となる。目的物質は、糖タンパク質を含むタンパク質である場合が多いため、タンパク質を除去せずに、核酸を選択的に除去する技術が求められている。
When producing useful substances such as enzymes, antibodies, and cytokines by cell culture or microbial culture, the culture solution containing the desired useful substances contains not only cells, microorganisms, and the target substance, but also nucleic acids and culture solution components. Contains low molecular weight compounds such as sugars and salts. Therefore, it is necessary to remove contaminant components other than the target substance to prepare the product.
In particular, nucleic acids increase the viscosity of the culture solution, which causes a decrease in the efficiency of separation and purification of useful substances. Since target substances are often proteins including glycoproteins, there is a need for a technique that selectively removes nucleic acids without removing proteins.
例えば、特許文献１は、タンパク質溶液から核酸又はエンドトキシンを除去するために低分子キトサンを用いることを開示している。
また、特許文献２は、タンパク質溶液から核酸又はエンドトキシンを除去するためにＮ-アルキル化したキトサンからなる二分子膜を固定化した担体を用いることを開示している。
For example, Patent Document 1 discloses the use of low molecular weight chitosan to remove nucleic acids or endotoxins from protein solutions.
Furthermore, Patent Document 2 discloses the use of a carrier on which a bilayer membrane made of N-alkylated chitosan is immobilized in order to remove nucleic acids or endotoxins from protein solutions.
本発明は、タンパク質、核酸などを含む溶液中の核酸を選択的に吸着することができる核酸吸着材、及びタンパク質、核酸などを含む溶液中の核酸を選択的に吸着できる核酸吸着方法を提供することを課題とする。 The present invention provides a nucleic acid adsorbent that can selectively adsorb nucleic acids in solutions containing proteins, nucleic acids, etc., and a nucleic acid adsorption method that can selectively adsorb nucleic acids in solutions containing proteins, nucleic acids, etc. That is the issue.
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーは、核酸を強く吸着し、また処理対象液の液性を調整することにより、タンパク質を吸着せずに核酸を選択的に吸着できることを見出した。 In order to solve the above problems, the present inventors have conducted repeated research, and found that cellulose nanofibers with cationic groups containing nitrogen atoms strongly adsorb nucleic acids and can also absorb proteins by adjusting the liquid properties of the liquid to be treated. We have discovered that nucleic acids can be selectively adsorbed without adsorption.
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下の〔１〕～〔１１〕を提供する。
〔１〕 窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーを備える、核酸吸着材。
〔２〕 窒素原子を含むカチオン性基が、多価アミンに由来する官能基、及び／又は第４級アンモニウム基である、〔１〕に記載の核酸吸着材。
〔３〕 窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーの陰イオン交換容量が０．０１～５ｍｅｑ／ｄｒｙ－ｇとなるように、セルロースナノファイバーが窒素原子を含むカチオン性基を有する、〔１〕又は〔２〕に記載の核酸吸着材。
〔４〕 セルロースナノファイバーが、１ｎｍ～１０００ｎｍの平均繊維径を有する、〔１〕～〔３〕の何れかに記載の核酸吸着材。
〔５〕 〔１〕～〔４〕の何れかに記載の核酸吸着材が充填された核酸吸着用カラム。
〔６〕 セルロースナノファイバーに窒素原子を含むカチオン性基を導入する工程を含む、〔１〕～〔４〕の何れかに記載の核酸吸着材を製造する方法。
〔７〕 〔１〕～〔４〕の何れかに記載の核酸吸着材と核酸を含有する液体とを接触させる工程を含む、核酸が除去された液体の製造方法。
〔８〕 〔１〕～〔４〕の何れかに記載の核酸吸着材と、目的物質及び核酸を含有する液体とを接触させる工程を含む、核酸が除去された目的物質を含有する液体の製造方法。
〔９〕 目的物質がタンパク質である、〔８〕に記載の方法。
〔１０〕 目的物質が細胞生産物又は微生物生産物である、〔８〕又は〔９〕に記載の方法。
〔１１〕 〔１〕～〔４〕の何れかに記載の核酸吸着材と核酸を含有する液体とを接触させる工程と、核酸吸着材に吸着した核酸を核酸吸着材から離脱させる工程を含む核酸精製方法。
The present invention has been completed based on the above findings, and provides the following [1] to [11].
[1] A nucleic acid adsorbent comprising cellulose nanofibers having a cationic group containing a nitrogen atom.
[2] The nucleic acid adsorbent according to [1], wherein the cationic group containing a nitrogen atom is a functional group derived from a polyvalent amine and/or a quaternary ammonium group.
[3] The cellulose nanofibers have a cationic group containing a nitrogen atom such that the anion exchange capacity of the cellulose nanofibers has a cationic group containing a nitrogen atom is 0.01 to 5 meq/dry-g. 1] or the nucleic acid adsorbent according to [2].
[4] The nucleic acid adsorbent according to any one of [1] to [3], wherein the cellulose nanofibers have an average fiber diameter of 1 nm to 1000 nm.
[5] A column for nucleic acid adsorption filled with the nucleic acid adsorbent according to any one of [1] to [4].
[6] The method for producing the nucleic acid adsorbent according to any one of [1] to [4], which includes a step of introducing a cationic group containing a nitrogen atom into cellulose nanofibers.
[7] A method for producing a liquid from which nucleic acid has been removed, the method comprising the step of bringing the nucleic acid adsorbent according to any one of [1] to [4] into contact with a liquid containing nucleic acid.
[8] Production of a liquid containing a target substance from which nucleic acid has been removed, including a step of bringing the nucleic acid adsorbent according to any one of [1] to [4] into contact with a liquid containing a target substance and a nucleic acid. Method.
[9] The method according to [8], wherein the target substance is a protein.
[10] The method according to [8] or [9], wherein the target substance is a cell product or a microbial product.
[11] A nucleic acid comprising the step of bringing the nucleic acid adsorbent according to any one of [1] to [4] into contact with a liquid containing nucleic acid, and the step of releasing the nucleic acid adsorbed to the nucleic acid adsorbent from the nucleic acid adsorbent. Purification method.
本発明の核酸吸着材は、ＤＮＡなどの核酸を強く吸着する。窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーを備える本発明の核酸吸着材は、同様の官能基を有するセルロース粒子に比べて、格段に核酸吸着容量が高い。 The nucleic acid adsorbent of the present invention strongly adsorbs nucleic acids such as DNA. The nucleic acid adsorbent of the present invention comprising cellulose nanofibers having a cationic group containing a nitrogen atom has a much higher nucleic acid adsorption capacity than cellulose particles having similar functional groups.
また、処理対象である核酸含有液の液性を調整することにより、タンパク質を吸着せずに核酸を選択的に吸着することができる。微生物培養や細胞培養により酵素、抗体、サイトカインなどの有用物質を生産する際の有用物質は、糖タンパク質を含むタンパク質である場合が多い。従って、タンパク質を吸着せずに核酸を選択的に吸着する本発明の核酸吸着材を用いれば、有用物質の回収率を低下させずに核酸を吸着除去することができる。
また、核酸は酸性を示すことから、酸性タンパク質との分離が特に難しいが、本発明の核酸吸着材は、酸性タンパク質を吸着しない条件で核酸を強く吸着することができる。
Furthermore, by adjusting the liquid properties of the nucleic acid-containing liquid to be treated, it is possible to selectively adsorb nucleic acids without adsorbing proteins. When producing useful substances such as enzymes, antibodies, and cytokines by microbial culture or cell culture, useful substances are often proteins including glycoproteins. Therefore, by using the nucleic acid adsorbent of the present invention that selectively adsorbs nucleic acids without adsorbing proteins, nucleic acids can be adsorbed and removed without reducing the recovery rate of useful substances.
Further, since nucleic acids exhibit acidity, it is particularly difficult to separate them from acidic proteins, but the nucleic acid adsorbent of the present invention can strongly adsorb nucleic acids under conditions that do not adsorb acidic proteins.
また、遺伝子治療薬や研究ツールなどとして有用な核酸は、簡単に大量精製する技術が求められている。即ち、タンパク質などの生体由来成分から核酸を分離精製する技術が求められている。この点、本発明の核酸吸着材は、タンパク質を吸着せずに核酸を特異的に吸着でき、さらに核酸を吸着した核酸吸着材に所定の液性を有する溶出液を接触させることにより、吸着した核酸を高い溶出率で溶出させ回収することができる。従って、核酸精製にも有用である。 Furthermore, there is a need for technology to easily purify large amounts of nucleic acids, which are useful as gene therapy drugs and research tools. That is, there is a need for a technology for separating and purifying nucleic acids from biological components such as proteins. In this regard, the nucleic acid adsorbent of the present invention can specifically adsorb nucleic acids without adsorbing proteins, and furthermore, by contacting the nucleic acid adsorbent that has adsorbed nucleic acids with an eluate having a predetermined liquid property, the nucleic acid adsorbent can adsorb nucleic acids. Nucleic acids can be eluted and recovered at a high elution rate. Therefore, it is also useful for nucleic acid purification.
また、本発明の核酸吸着材は、幅広いｐＨ範囲で核酸を吸着することができるため、広範囲の核酸含有液を処理対象にすることができる。 Further, since the nucleic acid adsorbent of the present invention can adsorb nucleic acids in a wide pH range, a wide range of nucleic acid-containing liquids can be treated.
また、セルロースは医薬品や食品の賦形剤などとして汎用されており、また、セルロースナノファイバーは化粧品成分として用いられていることから分かるように、セルロースナノファイバーは安全性が確立されている。従って、本発明の核酸吸着材は、安全性が高く、医薬品などの生産工程で好適に使用できる。 Furthermore, cellulose nanofibers are widely used as excipients for pharmaceuticals and foods, and cellulose nanofibers are used as cosmetic ingredients, so the safety of cellulose nanofibers has been established. Therefore, the nucleic acid adsorbent of the present invention is highly safe and can be suitably used in the production process of pharmaceuticals and the like.
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）核酸吸着材
本発明の核酸吸着材は、窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーを備える核酸吸着材である。
The present invention will be explained in detail below.
(1) Nucleic acid adsorbent
The nucleic acid adsorbent of the present invention is a nucleic acid adsorbent comprising cellulose nanofibers having a cationic group containing a nitrogen atom.
セルロースナノファイバー
「セルロースナノファイバー」とは、ナノメートルオーダーの平均繊維径を有する繊維状のセルロースをいう。
平均繊維径は、１ｎｍ～１０００ｎｍ程度であればよい。また、３ｎｍ以上、５ｎｍ以上、１０ｎｍ以上、２０ｎｍ以上、又は３０ｎｍ以上で、１０００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、９０ｎｍ以下、８０ｎｍ以下、７０ｎｍ以下、６０ｎｍ以下、又は５０ｎｍ以下とすることができ、また、これらの組み合わせとすることができる。例えば、３ｎｍ～５００ｎｍ、５ｎｍ～３００ｎｍ、又は１０ｎｍ～２００ｎｍの範囲が挙げられる。
また、セルロースナノファイバーは、繊維径について高い均一性を有することが好ましい。セルロースナノファイバーの繊維径分布の標準偏差は、１００ｎｍ以下、７０ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、又は２０ｎｍ以下が好ましい。
Cellulose nanofiber "cellulose nanofiber" refers to fibrous cellulose having an average fiber diameter on the order of nanometers.
The average fiber diameter may be about 1 nm to 1000 nm. Also, 3 nm or more, 5 nm or more, 10 nm or more, 20 nm or more, or 30 nm or more, but 1000 nm or less, 500 nm or less, 300 nm or less, 200 nm or less, 150 nm or less, 100 nm or less, 90 nm or less, 80 nm or less, 70 nm or less, 60 nm or less, or The thickness can be 50 nm or less, or a combination thereof can be used. For example, the range is 3 nm to 500 nm, 5 nm to 300 nm, or 10 nm to 200 nm.
Moreover, it is preferable that the cellulose nanofibers have high uniformity in fiber diameter. The standard deviation of the fiber diameter distribution of cellulose nanofibers is preferably 100 nm or less, 70 nm or less, 50 nm or less, 40 nm or less, 30 nm or less, or 20 nm or less.
セルロースナノファイバーの平均繊維長は、例えば、５μｍ以上、１０μｍ以上、５０μｍ以上、１００μｍ以上、２００μｍ以上、３００μｍ以上、５００μｍ以上、又は１０００μｍ以上とすることができ、１０００００μｍ以下、１００００μｍ以下、３０００μｍ以下、２５００μｍ以下、２０００μｍ以下、１５００μｍ以下、又は１２００μｍ以下とすることができ、また、これらの組み合わせとすることができる。例えば、１０μｍ～３０００μｍ、１００μｍ～２５００μｍ、２００μｍ～２０００μｍ、３００μｍ～１５００μｍ、又は５００μｍ～１２００μｍが挙げられる。 The average fiber length of the cellulose nanofibers can be, for example, 5 μm or more, 10 μm or more, 50 μm or more, 100 μm or more, 200 μm or more, 300 μm or more, 500 μm or more, or 1000 μm or more, and 100000 μm or less, 10000 μm or less, 3000 μm or less, It can be 2500 μm or less, 2000 μm or less, 1500 μm or less, or 1200 μm or less, or a combination thereof. Examples include 10 μm to 3000 μm, 100 μm to 2500 μm, 200 μm to 2000 μm, 300 μm to 1500 μm, or 500 μm to 1200 μm.
セルロースナノファイバーの平均アスペクト比は、例えば、１００以上、５００以上、１０００以上、２０００以上、３０００以上、５０００以上、１００００以上、又は２００００以上で、１０００００以下、８００００以下、５００００以下、４００００以下、又は３５０００以下とすることができ、また、それらの組み合わせとすることができる。例えば、２０００～１０００００、３０００～８００００、５０００～５００００、１００００～４００００、又は２００００～３５０００が挙げられる。
「平均アスペクト比」とは、平均繊維径に対する平均繊維長の比（平均繊維長／平均繊維径）をいう。
The average aspect ratio of the cellulose nanofibers is, for example, 100 or more, 500 or more, 1000 or more, 2000 or more, 3000 or more, 5000 or more, 10000 or more, or 20000 or more, and 100000 or less, 80000 or less, 50000 or less, 40000 or less, or It can be 35,000 or less, or a combination thereof. For example, 2000-100000, 3000-80000, 5000-50000, 10000-40000, or 20000-35000.
"Average aspect ratio" refers to the ratio of average fiber length to average fiber diameter (average fiber length/average fiber diameter).
平均繊維径、繊維径分布の標準偏差、平均繊維長、及び平均アスペクト比は、電子顕微鏡を用いて少なくとも２０本のランダムに選択されたセルロースナノファイバーの寸法を測定した結果から算出した値である。 The average fiber diameter, standard deviation of fiber diameter distribution, average fiber length, and average aspect ratio are values calculated from the results of measuring the dimensions of at least 20 randomly selected cellulose nanofibers using an electron microscope. .
平均繊維径、繊維径分布の標準偏差、平均繊維長、及び平均アスペクト比は、セルロースナノファイバーに窒素原子を含むカチオン性基を導入する前のセルロースナノファイバーの平均繊維径、繊維径分布の標準偏差、平均繊維長、及び平均アスペクト比を意味する。窒素原子を含むカチオン性基を導入した後のセルロースナノファイバーの平均繊維径、繊維径分布の標準偏差、平均繊維長、及び平均アスペクト比は、窒素原子を含むカチオン性基導入前のセルロースナノファイバーと同程度であるが、セルロースナノファイバーに窒素原子を含むカチオン性基を導入することにより、セルロースナノファイバーが膨潤し得るため、例えば、窒素原子を含むカチオン性基導入後のセルロースナノファイバーの平均繊維径は、セルロースナノファイバーの平均繊維径よりも大きくなり得る。 The average fiber diameter, standard deviation of fiber diameter distribution, average fiber length, and average aspect ratio are the average fiber diameter and standard deviation of fiber diameter distribution of cellulose nanofibers before introducing cationic groups containing nitrogen atoms into cellulose nanofibers. Means deviation, average fiber length, and average aspect ratio. The average fiber diameter, standard deviation of fiber diameter distribution, average fiber length, and average aspect ratio of cellulose nanofibers after introduction of cationic groups containing nitrogen atoms are the same as those of cellulose nanofibers before introduction of cationic groups containing nitrogen atoms. However, by introducing a cationic group containing a nitrogen atom into the cellulose nanofiber, the cellulose nanofiber can swell. The fiber diameter can be larger than the average fiber diameter of cellulose nanofibers.
セルロースナノファイバーを製造するための原料繊維の由来は特に制限されない。原料繊維としては、高等植物由来のセルロース繊維、動物由来のセルロース繊維、藻類由来のセルロース繊維、細菌由来のセルロース繊維、化学的に合成されたセルロース繊維、及びそれらの誘導体などが挙げられる。高等植物由来のセルロース繊維としては、針葉樹や広葉樹由来の木材パルプ等の木材繊維；コットンリンター、ボンバックス綿、カポック等の種子毛繊維；麻、コウゾ、ミツマタ等の靭皮繊維；マニラ麻、サイザル麻、ニュージーランド麻等の葉脈繊維；竹繊維；サトウキビ繊維などが挙げられる。動物由来のセルロース繊維としては、ホヤセルロースなどが挙げられる。藻類由来のセルロース繊維としては、バロニアセルロースなどが挙げられる。細菌由来のセルロース繊維としては、酢酸菌により製造されるセルロースなどが挙げられる。化学的に合成されたセルロース繊維としては、メチルセルロースやエチルセルロースのようなアルキルセルロースなどが挙げられる。
誘導体としては、官能基が導入されたセルロース繊維が挙げられる。即ち、本発明において、「セルロース」という用語は、そのような官能基を有するものを包含する。導入し得る官能基については後述する。
The origin of the raw material fibers for producing cellulose nanofibers is not particularly limited. Examples of raw material fibers include cellulose fibers derived from higher plants, cellulose fibers derived from animals, cellulose fibers derived from algae, cellulose fibers derived from bacteria, chemically synthesized cellulose fibers, and derivatives thereof. Cellulose fibers derived from higher plants include wood fibers such as wood pulp derived from coniferous trees and broad-leaved trees; seed wool fibers such as cotton linters, bombax cotton, and kapok; bast fibers such as hemp, paper mulberry, and mitsumata; Manila hemp and sisal hemp. , leaf vein fibers such as New Zealand hemp; bamboo fibers; and sugarcane fibers. Examples of cellulose fibers derived from animals include ascidian cellulose. Examples of cellulose fibers derived from algae include valonia cellulose. Examples of cellulose fibers derived from bacteria include cellulose produced by acetic acid bacteria. Examples of chemically synthesized cellulose fibers include alkyl celluloses such as methyl cellulose and ethyl cellulose.
Examples of derivatives include cellulose fibers into which functional groups have been introduced. That is, in the present invention, the term "cellulose" includes those having such functional groups. Functional groups that can be introduced will be described later.
原料繊維からセルロースナノファイバーを製造する方法としては、原料繊維をリファイナー、ホモジナイザー、媒体撹拌ミル、石臼、グラインダー等の破砕装置を用いてミクロフィブリル化することによりセルロースナノファイバーを製造する方法（特開２０１１-０２６７６０）、原料繊維と機能性粒子とを混合し、加圧条件化で混練することによりセルロースナノファイバーを製造する方法（特開２００７-２６２５９４）、原料繊維を湿式で離解した後、予備的に解繊し、蒸煮処理し、破砕装置を用いてミクロフィブリル化することによりセルロースナノファイバーを製造する方法であって、酵素を併用する方法（特開２００８-０７５２１４）、原料繊維を湿式で離解した後、予備的に解繊し、超音波処理によりミクロフィブリル化することによりセルロースナノファイバーを製造する方法であって、酵素を併用する方法（特開２００８-１６９４９７）が挙げられる。
また、セルロースナノファイバーは、例えば、セルロースのイオン液体溶液やセルロースの有機溶媒溶液から紡糸することによっても製造できる（特開２０１５-００４１５１）。
As a method for producing cellulose nanofibers from raw material fibers, cellulose nanofibers are produced by microfibrillating raw material fibers using a crushing device such as a refiner, homogenizer, media stirring mill, stone mill, grinder, etc. 2011-026760), a method for producing cellulose nanofibers by mixing raw material fibers and functional particles and kneading them under pressure conditions (JP 2007-262594), after disintegrating raw material fibers in a wet manner, A method for producing cellulose nanofibers by defibrating the fibers, steaming them, and microfibrillating them using a crushing device, which method uses enzymes in combination (Japanese Patent Application Laid-open No. 2008-075214). A method for producing cellulose nanofibers by disintegrating, preliminarily defibrating, and microfibrillating by ultrasonication, including a method in which enzymes are used in combination (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-169497).
Furthermore, cellulose nanofibers can also be produced, for example, by spinning from an ionic liquid solution of cellulose or an organic solvent solution of cellulose (Japanese Patent Laid-Open No. 2015-004151).
セルロースナノファイバーの市販品としては、ダイセルファインケム株式会社製のセリッシュ（登録商標）やＫｅｌｃｏ社製のＣｅｌｌｕｌｏｎ（登録商標）が挙げられる。セリッシュとしては、ろか名人、ＰＣ１１０Ｔ、ＰＣ１１０Ａ、ＰＣ１１０Ｂ、ＰＣ１１０Ｓ、ＫＹ１００Ｓ、ＫＹ１００Ｇが挙げられる。 Commercially available cellulose nanofibers include Cellish (registered trademark) manufactured by Daicel FineChem Co., Ltd. and Cellulon (registered trademark) manufactured by Kelco. Examples of the selish include Roka Meijin, PC110T, PC110A, PC110B, PC110S, KY100S, and KY100G.
窒素原子を含むカチオン性基
窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーは、本来的に窒素原子を含むカチオン性基を有するものであってもよく、窒素原子を含むカチオン性基をセルロースナノファイバーに導入したものであっても良い。
Cationic group containing a nitrogen atom Cellulose nanofibers having a cationic group containing a nitrogen atom may inherently have a cationic group containing a nitrogen atom. It may be introduced into a fiber.
窒素原子を含むカチオン性基としては、例えば、アミノ基（１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基）、４級アンモニウム基、イミノ基、アミジン基、グアニジノ基、イミダゾール基、４級イミダゾリウム基、ピリジル基、４級ピリジニウム基などが挙げられる。アミノ基は、アンモニアから水素原子１つを除去した官能基（－ＮＨ２）、第１級アミンから水素原子１つを除去した官能基（－ＮＨＲ）、第２級アミンから水素原子１つを除去した官能基（－ＮＲＲ´）の何れであってもよい。
窒素原子を含むカチオン性基は非環状であってもよく、環状であってもよい。
Examples of the cationic group containing a nitrogen atom include an amino group (primary amino group, secondary amino group, tertiary amino group), quaternary ammonium group, imino group, amidine group, guanidino group, imidazole group, quaternary Examples include an imidazolium group, a pyridyl group, and a quaternary pyridinium group. The amino group is a functional group obtained by removing one hydrogen atom from ammonia (-NH 2 ), a functional group obtained by removing one hydrogen atom from a primary amine (-NHR), and a functional group obtained by removing one hydrogen atom from a secondary amine (-NH 2 ). It may be any of the removed functional groups (-NRR').
The cationic group containing a nitrogen atom may be acyclic or cyclic.
窒素原子を含むカチオン性基は、例えば、セルロースの水酸基に導入することができる。窒素原子を含むカチオン性基を導入する方法としては、セルロースの水酸基を活性化剤で活性化し、次いで、窒素原子を含むカチオン性化合物と反応させる方法が挙げられる。窒素原子を含むカチオン性基がそれ自体反応性基を有する場合は、活性化剤での前処理は必ずしも要さない。 A cationic group containing a nitrogen atom can be introduced into a hydroxyl group of cellulose, for example. Examples of the method for introducing a cationic group containing a nitrogen atom include a method of activating the hydroxyl group of cellulose with an activator and then reacting it with a cationic compound containing a nitrogen atom. If the cationic group containing a nitrogen atom itself has a reactive group, pretreatment with an activator is not necessarily required.
活性化剤としては、例えば、クロロメチルオキシラン（エピクロロヒドリン）、メタクリル酸グリジシル、アクリル酸グリシジル、ジグリシジルエーテル、エピブロモヒドリン、エチレングリコールジグリシジルエーテルのようなエポキシ基供与体、ｐ－トルエンスルホン酸クロリド、２－フルオロ－１－メチルピリジニウム、クロロアセチルクロリド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ｍ－キシレンジイソシアネート、トルエン－２，４－ジイソシアネートなどが挙げられる。
活性化剤としては、エポキシ基供与体が好ましく、クロロメチルオキシラン（エピクロロヒドリン）がより好ましい。
活性化剤は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
Examples of activators include epoxy group donors such as chloromethyloxirane (epichlorohydrin), glycidyl methacrylate, glycidyl acrylate, diglycidyl ether, epibromohydrin, ethylene glycol diglycidyl ether, p- Examples include toluenesulfonic acid chloride, 2-fluoro-1-methylpyridinium, chloroacetyl chloride, hexamethylene diisocyanate, m-xylene diisocyanate, and toluene-2,4-diisocyanate.
As the activator, an epoxy group donor is preferred, and chloromethyloxirane (epichlorohydrin) is more preferred.
The activators can be used alone or in combination of two or more.
窒素原子を含むカチオン性基の供与体である、窒素原子を含むカチオン性化合物としては、アンモニア、アミジン、１価アミン、多価アミン、第４級アンモニウム塩、第４級イミダゾリウム塩、第４級ピリジニウム塩などが挙げられる。
１価アミンとしては、脂肪族アミン類、特にアルキルアミン（メチルアミン、エチルアミンのような第１級アミン；ジメチルアミン、ジエチルアミンのような第２級アミン；トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンのような第３級アミン）；芳香族アミン類（アニリン、トルイジンのような第１級アミンなど）；複素環式アミン類（ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、イミダゾールのような第２級アミン；ピリジン、２，４，６－トリメチルピリジン（コリジン）、２，６－ルチジン、キノリン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－エチルモルホリンのような第３級アミンなど）；アルカノールアミン又はアミノアルコール（モノメタノールアミン、モノエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、３－アミノ－１，２－プロパンジオール、３－ジメチルアミノ－１，２－プロパンジオール、トリス(ヒドロキシメチルアミノ)メタンのような第１級アミン；ジエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、Ｎ－メチルエタノールアミン、Ｎ－エチルエタノールアミンのような第２級アミン；トリエタノールアミン、トリイソプロパノールアミン、Ｎ－ジメチルアミノエタノール、Ｎ－ジエチルアミノエタノールのような第３級アミン）などが挙げられる。
Examples of cationic compounds containing a nitrogen atom that are donors of a cationic group containing a nitrogen atom include ammonia, amidine, monovalent amine, polyvalent amine, quaternary ammonium salt, quaternary imidazolium salt, and quaternary imidazolium salt. Examples include class pyridinium salts.
Monovalent amines include aliphatic amines, especially alkylamines (primary amines such as methylamine and ethylamine; secondary amines such as dimethylamine and diethylamine; trimethylamine, triethylamine, tripropylamine, tributylamine, tertiary amines such as diisopropylethylamine); aromatic amines (primary amines such as aniline, toluidine); heterocyclic amines (secondary amines such as pyrrolidine, piperidine, morpholine, imidazole); tertiary amines such as pyridine, 2,4,6-trimethylpyridine (collidine), 2,6-lutidine, quinoline, N-methylmorpholine, N-ethylmorpholine); alkanolamines or amino alcohols (monomethanolamine); , monoethanolamine, monoisopropanolamine, 2-amino-2-methyl-1-propanol, 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol, 3-amino-1,2-propanediol, 3-dimethyl Primary amines such as amino-1,2-propanediol, tris(hydroxymethylamino)methane; secondary amines such as diethanolamine, diisopropanolamine, N-methylethanolamine, N-ethylethanolamine; Examples include tertiary amines such as ethanolamine, triisopropanolamine, N-dimethylaminoethanol, and N-diethylaminoethanol.
多価アミンとしては、エチレンジアミン、テトラメチルエチレンジアミン、テトラメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミンのような脂肪族ジアミン；４，４′－ジアミノ－３，３′ジメチルジシクロヘキシルメタン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－１，６－ジアミノヘキサン、ジアミンシクロヘキサン、イソホロンジアミンのような脂環族ジアミン；フェニレンジアミン、ジアミノナフタレン、キシリレンジアミンのような芳香族ジアミン；ピペラジンのような複素環式ジアミン；ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、ヘキサエチレンペンタミン、トリス（２－アミノエチル）アミン、トリス（３－アミノプロピル）アミン、グアニジンのような３価以上の脂肪族アミン；メラミンのような３価以上の芳香族アミンなどが挙げられる。
また、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、アミノ酸(中でも、リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン、トリプトファンのような塩基性アミノ酸)、アミノ酸の重合体（中でも、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリトリプトファンのような塩基性アミノ酸の重合体）、ポリクレアチニンなどのアミノ基を有するポリマーも挙げられる。ポリマーは、直鎖状、分岐状の何れであってもよい。ポリマーの数平均分子量は、例えば、５０以上、１００以上、又は１５０以上であってよく、１，０００，０００以下、１００，０００以下、１０，０００以下、５，０００以下、２，０００以下、又は１，０００以下であってよい。ポリマーの数平均分子量としては、例えば、５０～１，０００，０００、５０～１００，０００、５０～１０，０００、５０～５，０００、５０～２，０００、５０～１，０００、１００～１，０００，０００、１００～１００，０００、１００～１０，０００、１００～５，０００、１００～２，０００、１００～１，０００、１５０～１，０００，０００、１５０～１００，０００、１５０～１０，０００、１５０～５，０００、１５０～２，０００、１５０～１，０００が挙げられる。
Polyvalent amines include aliphatic diamines such as ethylenediamine, tetramethylethylenediamine, tetramethylenediamine, and hexamethylenediamine; 4,4'-diamino-3,3'dimethyldicyclohexylmethane, N,N,N',N' -Alicyclic diamines such as tetramethyl-1,6-diaminohexane, diamine cyclohexane, isophorone diamine; aromatic diamines such as phenylene diamine, diaminonaphthalene, xylylene diamine; heterocyclic diamines such as piperazine; diethylene triamine , triethylenetetramine, tetraethylenepentamine, pentaethylenehexamine, hexaethylenepentamine, tris(2-aminoethyl)amine, tris(3-aminopropyl)amine, guanidine; melamine; Examples include aromatic amines having a valence of 3 or more.
In addition, polyethyleneimine, polyvinylamine, polyallylamine, amino acids (especially basic amino acids such as lysine, arginine, histidine, ornithine, and tryptophan), amino acid polymers (among others, polylysine, polyarginine, polyhistidine, polyornithine, Examples include polymers of basic amino acids such as polytryptophan) and polymers having amino groups such as polycreatinine. The polymer may be either linear or branched. The number average molecular weight of the polymer may be, for example, 50 or more, 100 or more, or 150 or more, and 1,000,000 or less, 100,000 or less, 10,000 or less, 5,000 or less, 2,000 or less, Or it may be 1,000 or less. The number average molecular weight of the polymer is, for example, 50 to 1,000,000, 50 to 100,000, 50 to 10,000, 50 to 5,000, 50 to 2,000, 50 to 1,000, 100 to 1,000,000, 100-100,000, 100-10,000, 100-5,000, 100-2,000, 100-1,000, 150-1,000,000, 150-100,000, Examples include 150 to 10,000, 150 to 5,000, 150 to 2,000, and 150 to 1,000.
第４級アンモニウム塩としては、グリシジルトリメチルアンモニウム塩（塩酸塩、臭化水素酸塩など）などが挙げられる。また、例えば、上記例示した第３級アミンのアルキル化により第４級化した四級アミンも使用できる。
第４級イミダゾリウム塩としては、１－デシル－３－メチルイミダゾリウム塩、１－メチル－３－オクチルイミダゾリウム塩、１－メチル－ベンゾイミダゾリウム塩（塩酸塩、臭化水素酸塩など）などが挙げられる。
第４級ピリジニウム塩としては、ブチルピリジニウム塩、ドデシルピリジニウム塩（塩酸塩、臭化水素酸塩など）などが挙げられる。
Examples of the quaternary ammonium salt include glycidyltrimethylammonium salt (hydrochloride, hydrobromide, etc.). Furthermore, for example, quaternary amines obtained by quaternizing the above-mentioned tertiary amines by alkylation can also be used.
Examples of quaternary imidazolium salts include 1-decyl-3-methylimidazolium salt, 1-methyl-3-octylimidazolium salt, 1-methyl-benzimidazolium salt (hydrochloride, hydrobromide, etc.) Examples include.
Examples of the quaternary pyridinium salt include butylpyridinium salt, dodecylpyridinium salt (hydrochloride, hydrobromide, etc.).
窒素原子を含むカチオン性化合物としては、多価アミン、１価アミン、第４級アンモニウム塩が好ましく、多価アミン、第４級アンモニウム塩がより好ましく、エチレンジアミン、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミンがさらにより好ましい。
窒素原子を含むカチオン性化合物は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
２種以上のカチオン性化合物を使用する場合、各カチオン性化合物を導入したセルロースナノファイバーを混合して使用してもよく、或いは、２種以上のカチオン性化合物を導入したセルロースナノファイバーを使用してもよい。
As the cationic compound containing a nitrogen atom, polyvalent amines, monovalent amines, and quaternary ammonium salts are preferable, polyvalent amines and quaternary ammonium salts are more preferable, and ethylenediamine, polyallylamine, and polyethyleneimine are even more preferable. .
The cationic compounds containing a nitrogen atom can be used alone or in combination of two or more.
When using two or more types of cationic compounds, cellulose nanofibers into which each cationic compound has been introduced may be used in combination, or cellulose nanofibers into which two or more types of cationic compounds have been introduced may be used. It's okay.
また、セルロースナノファイバーを窒素原子を含むカチオン性化合物と反応させた後に、さらに修飾を施すことによってカチオン性を高めることができる。カチオン性を高めるためにアミノ基を第４級化させる化合物としては、例えば、クロロメチルオキシラン（エピクロロヒドリン）、ヨードメタン、ヨードエタンなどが挙げられる。カチオン性を高めるために窒素原子を含むカチオン性基を追加して導入する方法としては、導入したカチオン性基を活性化剤で活性化し、次いで、既に導入したカチオン性基と同じ又はこれとは異なる、窒素原子を含むカチオン性化合物と反応させる方法が挙げられる。活性化剤、窒素原子を含むカチオン性化合物としては上記例示したものを使用できる。
カチオン性を高めるために反応させる化合物は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
Further, the cationic properties can be increased by further modifying the cellulose nanofibers after reacting them with a cationic compound containing a nitrogen atom. Examples of compounds that quaternize amino groups to increase cationicity include chloromethyloxirane (epichlorohydrin), iodomethane, and iodoethane. A method for additionally introducing a cationic group containing a nitrogen atom in order to increase cationic property is to activate the introduced cationic group with an activator, and then to activate the introduced cationic group with an activator, and then to Examples include a method of reacting with a different cationic compound containing a nitrogen atom. As the activator and the cationic compound containing a nitrogen atom, those exemplified above can be used.
The compounds to be reacted to increase cationicity can be used alone or in combination of two or more.
セルロースナノファイバー又は活性化セルロースナノファイバーと窒素原子を含むカチオン性化合物との反応は、例えば、約１０～１００℃で、約０．１～２４時間行えばよい。
溶媒としては、通常、水を用いればよいが、メタノール、エタノール、２－プロパノール、エチレングリコールモノメチルエーテル（２－メトキシエタノール）のようなアルコール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性極性溶媒も用いることができる。溶媒は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
The reaction between cellulose nanofibers or activated cellulose nanofibers and a cationic compound containing a nitrogen atom may be carried out, for example, at about 10 to 100° C. for about 0.1 to 24 hours.
Water is usually used as the solvent, but aprotic polar solvents such as methanol, ethanol, 2-propanol, alcohols such as ethylene glycol monomethyl ether (2-methoxyethanol), dimethylformamide, and dimethyl sulfoxide may also be used. be able to. One type of solvent can be used alone or two or more types can be used in combination.
上記のようにして得られる、窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーは、窒素原子を含むカチオン性化合物がセルロースナノファイバーに結合したもの、又は窒素原子を含むカチオン性化合物が橋架け剤を介してセルロースナノファイバーに結合したものであってよい。 Cellulose nanofibers having a cationic group containing a nitrogen atom obtained as described above are those in which a cationic compound containing a nitrogen atom is bonded to cellulose nanofibers, or a cationic compound containing a nitrogen atom is used as a crosslinking agent. It may be bonded to cellulose nanofibers via.
窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーの特性
窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーにおける、窒素原子を含むカチオン性基の含有量は、窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーの陰イオン交換容量（Anion Exchange Capacity；ＡＥＣ）が、例えば０．０１ｍｅｑ／ｄｒｙ・ｇ以上、好ましくは０．１ｍｅｑ／ｄｒｙ・ｇ以上、より好ましくは０．４ｍｅｑ／ｄｒｙ・ｇ以上、さらに好ましくは０．９ｍｅｑ／ｄｒｙ・ｇ以上となる量であればよい。この範囲であれば、核酸を十分に吸着することができる。
また、窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーの陰イオン交換容量（ＡＥＣ）が、例えば５ｍｅｑ／ｄｒｙ・ｇ以下、好ましくは３ｍｅｑ／ｄｒｙ・ｇ以下、より好ましくは１．２ ｍｅｑ／ｄｒｙ・ｇ以下となる量であればよい。この範囲であれば、処理対象試料中に酸性物質（例えば、酸性タンパク質）などのマイナスチャージを有する物質が存在する場合にそのマイナスチャージを有する物質の非特定的吸着を抑えつつ、核酸を効率よく吸着することができる。
Characteristics of cellulose nanofibers having cationic groups containing nitrogen atoms The content of cationic groups containing nitrogen atoms in cellulose nanofibers having cationic groups containing nitrogen atoms is as follows: The anion exchange capacity (AEC) of the nanofiber is, for example, 0.01 meq/dry g or more, preferably 0.1 meq/dry g or more, more preferably 0.4 meq/dry g or more, and Preferably, the amount may be 0.9 meq/dry·g or more. Within this range, nucleic acids can be sufficiently adsorbed.
Further, the anion exchange capacity (AEC) of cellulose nanofibers having a cationic group containing a nitrogen atom is, for example, 5 meq/dry·g or less, preferably 3 meq/dry·g or less, more preferably 1.2 meq/dry・It is sufficient if the amount is less than g. Within this range, if there is a negatively charged substance such as an acidic substance (e.g. acidic protein) in the sample to be processed, non-specific adsorption of the negatively charged substance can be suppressed while efficiently removing nucleic acids. Can be adsorbed.
窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーは、本発明の効果を妨げない範囲で、窒素原子を含むカチオン性基以外のカチオン性基を有することができる。窒素原子を含むカチオン性基以外のカチオン性基の含有量は、陰イオン交換容量（ＡＥＣ）として、５ｍｅｑ／ｄｒｙ・ｇ以下とすればよい。窒素原子を含むカチオン性基以外の陰イオン交換基は含まないことができる。この範囲であれば、処理対象試料中に酸性物質（例えば、酸性タンパク質）などのマイナスチャージを有する物質が存在する場合にそのマイナスチャージを有する物質の非特定的吸着を抑えつつ、核酸を効率よく吸着することができる。 Cellulose nanofibers having a cationic group containing a nitrogen atom can have a cationic group other than the cationic group containing a nitrogen atom, as long as the effects of the present invention are not impaired. The content of cationic groups other than cationic groups containing nitrogen atoms may be 5 meq/dry·g or less in terms of anion exchange capacity (AEC). Anion exchange groups other than cationic groups containing nitrogen atoms may not be included. Within this range, if there is a negatively charged substance such as an acidic substance (e.g. acidic protein) in the sample to be processed, non-specific adsorption of the negatively charged substance can be suppressed while efficiently removing nucleic acids. Can be adsorbed.
また、窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーは、本発明の効果を妨げない範囲で、カチオン性基以外の官能基を有することができる。カチオン性基以外の官能基としては、アルキル基、アルコキシ基、エポキシ基、カルボキシル基、水酸基、リン酸基、硫酸基、ホルミル基、アセチル基、水素、ハロゲン原子などが挙げられる。 Moreover, the cellulose nanofibers having a cationic group containing a nitrogen atom can have a functional group other than the cationic group within a range that does not impede the effects of the present invention. Examples of functional groups other than cationic groups include alkyl groups, alkoxy groups, epoxy groups, carboxyl groups, hydroxyl groups, phosphoric acid groups, sulfuric acid groups, formyl groups, acetyl groups, hydrogen, and halogen atoms.
本発明において、イオン交換容量は、ｐＨ滴定法で測定した値であり、具体的には、実施例に記載の方法で測定した値である。 In the present invention, the ion exchange capacity is a value measured by a pH titration method, specifically, a value measured by the method described in Examples.
本発明の窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーのカラム法による核酸吸着容量は、１ｍＬカラム当り１ｍｇ以上、３ｍｇ以上、１０ｍg以上、４０ｍg以上、又は５０ｍg以上であり得る。また、カラム法による核酸吸着容量の上限値は１ｍＬカラム当り３００ｍg程度であり得る。 The nucleic acid adsorption capacity of cellulose nanofibers having a cationic group containing a nitrogen atom according to the present invention by a column method may be 1 mg or more, 3 mg or more, 10 mg or more, 40 mg or more, or 50 mg or more per 1 mL column. Further, the upper limit of the nucleic acid adsorption capacity by the column method may be about 300 mg per 1 mL column.
核酸吸着材
本発明の対象となる核酸の種類は限定されず、ＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。また、プラスミドのように環状核酸であってもよく、直鎖状核酸であってもよい。また、１本鎖、２本鎖、多重鎖の何れの核酸も対象にすることができる。さらに、リン酸化、アデニル化、アジド化、コレステロール化、ヘキシニル化、ビオチン化、チオール化、フルオロ化、ヘキサンジオール化、蛍光色素の結合などの化学修飾を施した核酸も対象にすることができる。核酸のサイズも限定されず、数塩基又は数塩基対程度のオリゴヌクレオチドから、１０，０００塩基又は１０，０００塩基対程度のポリヌクレオチドまで対象にすることができる。
Nucleic Acid Adsorbent The type of nucleic acid to which the present invention is applied is not limited, and includes DNA and RNA. Further, it may be a circular nucleic acid like a plasmid, or a linear nucleic acid. Further, any single-stranded, double-stranded, or multi-stranded nucleic acid can be targeted. Furthermore, nucleic acids that have undergone chemical modifications such as phosphorylation, adenylation, azidation, cholesterolization, hexynylation, biotinylation, thiolation, fluorination, hexanediolization, and binding of fluorescent dyes can also be targeted. The size of the nucleic acid is also not limited, and can range from oligonucleotides of a few bases or base pairs to polynucleotides of about 10,000 bases or 10,000 base pairs.
本発明の核酸吸着材は、核酸を吸着して除去する際は核酸除去材として用いることができ、核酸を吸着して精製する際は核酸精製材として用いることもできる。 The nucleic acid adsorbent of the present invention can be used as a nucleic acid removal material when adsorbing and removing nucleic acids, and can also be used as a nucleic acid purification material when adsorbing and purifying nucleic acids.
窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーは、単独で、或いは他の構成要素と組み合わせて、核酸吸着材として利用できる。即ち、本発明の核酸吸着材は、アミノ基を有するセルロースナノファイバーからなるものであってもよく、さらに他の構成要素を備えるものであってもよい。他の構成要素は、所望の核酸吸着能が得られる限り、特に制限されない。 Cellulose nanofibers having a cationic group containing a nitrogen atom can be used as a nucleic acid adsorbent alone or in combination with other components. That is, the nucleic acid adsorbent of the present invention may be made of cellulose nanofibers having amino groups, or may further include other components. Other components are not particularly limited as long as the desired nucleic acid adsorption ability can be obtained.
窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーは、未加工の状態では、通常、繊維状であるが、膜状、柱状などの任意の形態に加工して用いることができる。成形は、例えば、製紙プロセスによって行うことができる。
また、本発明の核酸吸着材は、カラムに充填して用いることができる。本発明の核酸吸着材が充填されたカラムは、核酸吸着用、核酸除去用、又は核酸精製用のカラムとして用いることができる。
Cellulose nanofibers having a cationic group containing a nitrogen atom are usually fibrous in an unprocessed state, but can be processed into any form such as a film or a column. Shaping can be performed, for example, by a papermaking process.
Furthermore, the nucleic acid adsorbent of the present invention can be used by filling a column. A column filled with the nucleic acid adsorbent of the present invention can be used as a column for nucleic acid adsorption, nucleic acid removal, or nucleic acid purification.
本発明の核酸吸着材は、必要に応じて、核酸フリー化して利用することができる。核酸フリー化は常法により行うことができる。例えば、洗浄液を用いて本発明の核酸吸着材を１回または複数回洗浄することにより行うことができる。洗浄液としては、例えば、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウム エタノール溶液、イオン強度２以上の緩衝液などが挙げられる。洗浄後、遠心や濾過等の固液分離手段により、本発明の核酸吸着材と洗浄液とを分離すればよい。 The nucleic acid adsorbent of the present invention can be used in a nucleic acid-free form, if necessary. Nucleic acid freeing can be performed by a conventional method. For example, this can be carried out by washing the nucleic acid adsorbent of the present invention once or multiple times using a washing solution. Examples of the washing liquid include a sodium hydroxide aqueous solution, a sodium hydroxide ethanol solution, and a buffer solution with an ionic strength of 2 or more. After washing, the nucleic acid adsorbent of the present invention and the washing liquid may be separated by solid-liquid separation means such as centrifugation or filtration.
（２）核酸吸着方法
本発明の核酸吸着材と、核酸吸着対象材料とを接触させることにより、核酸吸着対象材料中の核酸が核酸吸着材に吸着する。
(2) Nucleic acid adsorption method By bringing the nucleic acid adsorbent of the present invention into contact with a nucleic acid adsorption target material, the nucleic acids in the nucleic acid adsorption target material are adsorbed to the nucleic acid adsorbent.
核酸吸着対象材料は、液体状の材料であればよい。液体状は流動状を含む。また、加熱又は加温により液体状とした材料であってもよい。核酸吸着対象材料は、核酸だけを含むものであってよく、核酸以外に１種以上の成分を含むものであってもよい。また、核酸やその他の成分が水やその他の溶媒に溶解又は懸濁したものであってもよい。 The material to which nucleic acid is adsorbed may be any liquid material. Liquid state includes fluid state. Moreover, the material may be made into a liquid state by heating or warming. The material to which nucleic acid is adsorbed may contain only nucleic acids, or may contain one or more components other than nucleic acids. Further, nucleic acids and other components may be dissolved or suspended in water or other solvents.
核酸吸着対象材料としては、例えば、細胞培養液、微生物培養液、それらからタンパク質や核酸などを精製する途中の画分液などが挙げられる。 Examples of materials to which nucleic acids are adsorbed include cell culture fluids, microbial culture fluids, and fractionated fluids in the process of purifying proteins, nucleic acids, and the like therefrom.
本発明の核酸吸着材と接触させる際の核酸吸着対象材料のｐＨは、窒素原子を含むカチオン性基の種類や、核酸吸着対象材料のｐＨ安定性などにより異なるが、例えば、２～１０、特に、３以上、４以上、５以上、又は６以上とすることができ、また、９以下、８以下、又は７以下とすることができる。 The pH of the material to be adsorbed with nucleic acids when brought into contact with the nucleic acid adsorbent of the present invention varies depending on the type of cationic group containing a nitrogen atom, the pH stability of the material to be adsorbed with nucleic acids, and is, for example, 2 to 10, particularly , 3 or more, 4 or more, 5 or more, or 6 or more, and can be 9 or less, 8 or less, or 7 or less.
また、本発明の核酸吸着材と接触させる際の核酸吸着対象材料のイオン強度は、窒素原子を含むカチオン性基の種類や、核酸吸着対象材料のイオン強度安定性などにより異なるが、０．０５以上、又は０．１以上とすることができる。イオン強度が低すぎると、核酸選択性が低下し、例えば、タンパク質も吸着し易くなるが、この範囲であれば良好な核酸選択性が得られる。また、核酸吸着対象材料のイオン強度は、１以下、又は０．４以下とすることができる。イオン強度が高すぎると、アミノ基と反応するイオンの濃度も高くなり、核酸吸着能が低下する場合があるが、この範囲であれば高い核酸吸着能が得られる。 Further, the ionic strength of the material to be adsorbed with nucleic acids when brought into contact with the nucleic acid adsorbent of the present invention varies depending on the type of cationic group containing a nitrogen atom, the ionic strength stability of the material to be adsorbed with nucleic acids, etc., but is 0.05 or more, or 0.1 or more. If the ionic strength is too low, nucleic acid selectivity decreases and, for example, proteins are likely to be adsorbed, but within this range good nucleic acid selectivity can be obtained. Further, the ionic strength of the material to which nucleic acid is adsorbed can be 1 or less, or 0.4 or less. If the ionic strength is too high, the concentration of ions that react with amino groups will also be high, and the ability to adsorb nucleic acids may decrease, but within this range, high ability to adsorb nucleic acids can be obtained.
本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料との接触は、例えば、バッチ法により行うことができる。「バッチ法」は、適当な容器内で本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料とを混合することにより、本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料とを接触させる手法である。バッチ法は、静置して実施してもよく、撹拌や振盪して実施してもよい。接触時間は、核酸吸着対象材料の種類などにより異なるが、例えば、約５分間～１２０時間、約３０分間～２４時間、約１～１２時間、又は約２～４時間とすることができる。また、接触時の温度は、核酸吸着対象材料の種類などにより異なるが、例えば、約５～８０℃、約１５～６５℃、又は約２５～５０℃とすることができる。 Contact between the nucleic acid adsorbent of the present invention and the target material for nucleic acid adsorption can be carried out, for example, by a batch method. The "batch method" is a method in which the nucleic acid adsorbent of the present invention and the material to be adsorbed with nucleic acids are brought into contact with each other by mixing them in an appropriate container. The batch method may be carried out by standing still, or may be carried out by stirring or shaking. The contact time varies depending on the type of material to which nucleic acid is adsorbed, but can be, for example, about 5 minutes to 120 hours, about 30 minutes to 24 hours, about 1 to 12 hours, or about 2 to 4 hours. Further, the temperature at the time of contact varies depending on the type of material to be adsorbed with nucleic acid, but can be, for example, about 5 to 80°C, about 15 to 65°C, or about 25 to 50°C.
また、本発明の核酸吸着材と核酸吸着去対象材料との接触は、例えば、流動的分離法により行うことができる。「流動的分離法」とは、本発明の核酸吸着材に核酸吸着対象材料を通液することにより、本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料とを接触させる手法である。具体的には、例えば、本発明の核酸吸着材をカラムに充填し、このカラムに核酸含有液を通液することにより、本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料とを接触させることができる。また、例えば、本発明の核酸吸着材がフィルター状に成形されている場合は、このフィルターに核酸吸着対象材料を通液することにより、本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料とを接触させることができる。膜としては、メンブランフィルター、中空糸膜、チューブラー膜などの形態が挙げられる。また、本発明の核酸吸着材が柱状などに成形されている場合は、この柱状物などに核酸吸着対象材料を通液することにより、本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料とを接触させることができる。柱状物は、例えば、微小な孔を有する連続した多孔体としてモノリスクロマトグラフィーに供することができる。また、ろ紙上に本発明の核酸吸着材を載せ、そこに核酸吸着対象材料を通液することにより、本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料とを接触させることができる。 Further, the contact between the nucleic acid adsorbent of the present invention and the material to be adsorbed and removed by nucleic acid can be performed, for example, by a fluidic separation method. The "fluidic separation method" is a method in which the nucleic acid adsorbent of the present invention and the material to which nucleic acid is adsorbed are brought into contact by passing a liquid through the nucleic acid adsorbent of the present invention. Specifically, for example, the nucleic acid adsorbent of the present invention and the material to be adsorbed with nucleic acids can be brought into contact by filling a column with the nucleic acid adsorbent of the present invention and passing a nucleic acid-containing liquid through the column. . Furthermore, for example, when the nucleic acid adsorbent of the present invention is formed into a filter shape, the nucleic acid adsorbent of the present invention and the material to be adsorbed with nucleic acids are brought into contact by passing a liquid through the filter. be able to. Examples of the membrane include membrane filters, hollow fiber membranes, and tubular membranes. In addition, when the nucleic acid adsorbent of the present invention is shaped into a columnar shape, etc., the nucleic acid adsorbent of the present invention and the material to be adsorbed with nucleic acids are brought into contact by passing a liquid through the columnar object or the like. be able to. The columnar material can be subjected to monolithic chromatography, for example, as a continuous porous material having minute pores. Further, by placing the nucleic acid adsorbent of the present invention on a filter paper and passing a liquid through the material to which nucleic acid is adsorbed, the nucleic acid adsorbent of the present invention and the material to which nucleic acid is adsorbed can be brought into contact.
本発明の核酸吸着材に核酸を吸着させた後に混合物から本発明の核酸吸着材を、ろ過又は遠心分離などにより分離することができる。 After a nucleic acid is adsorbed onto the nucleic acid adsorbent of the present invention, the nucleic acid adsorbent of the present invention can be separated from the mixture by filtration, centrifugation, or the like.
本発明の核酸吸着材と、核酸吸着対象材料とを接触させることにより、核酸吸着対象材料中の核酸が核酸吸着材に吸着し、核酸が除去された材料が得られる。このように、本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料とを接触させる工程を含む核酸吸着方法は、核酸除去方法とすることができる。核酸除去方法は、さらに、核酸が除去された材料と核酸を吸着した核酸吸着材を分離する工程、例えば、本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料との混合物から、核酸が除去された材料を回収する工程を含むことができる。核酸除去方法は、換言すれば、核酸が除去された材料の製造方法である。 By bringing the nucleic acid adsorbent of the present invention into contact with the material to which nucleic acid is adsorbed, the nucleic acids in the material to which nucleic acid is adsorbed are adsorbed to the nucleic acid adsorbent, and a material from which nucleic acids have been removed is obtained. In this way, the nucleic acid adsorption method including the step of bringing the nucleic acid adsorbent of the present invention into contact with the nucleic acid adsorption target material can be used as a nucleic acid removal method. The nucleic acid removal method further includes a step of separating a material from which nucleic acids have been removed and a nucleic acid adsorbent that has adsorbed nucleic acids, for example, separating the material from which nucleic acids have been removed from a mixture of the nucleic acid adsorbent of the present invention and a material to which nucleic acid is adsorbed. The method may include a step of recovering. In other words, the nucleic acid removal method is a method for producing a material from which nucleic acids have been removed.
この核酸除去方法により、処理後の核酸除去対象材料中の核酸濃度又は含有量を、処理前と比較して、例えば、５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、２％以下、又は１％以下に低下させることができる。 By this nucleic acid removal method, the nucleic acid concentration or content in the material to be removed after treatment is reduced to, for example, 50% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less compared to before treatment. , 2% or less, or 1% or less.
核酸が除去されたこと及びその程度は、処理後の核酸対象材料中の核酸を、例えば、必要に応じてＰＣＲなどの核酸増幅法で増幅した後、蛍光インターカレーター、蛍光プローブ、又は電気泳動により検出することで確認できる。 The removal of nucleic acids and the extent thereof can be determined by amplifying the nucleic acids in the treated nucleic acid target material, for example, by a nucleic acid amplification method such as PCR as necessary, and then using a fluorescent intercalator, a fluorescent probe, or electrophoresis. This can be confirmed by detecting it.
また、本発明の核酸吸着材と核酸吸着対象材料とを接触させる工程と、核酸吸着材に吸着した核酸を核酸吸着材から離脱させる工程を含む方法は、核酸精製方法とすることができる。
核酸を変性させずに核酸吸着材から離脱させるには、核酸を吸着した核酸吸着材を、イオン強度１～２程度及び／又はｐＨ ９程度の緩衝液と接触させたり、このような緩衝液を通液すればよい。
Further, a method including a step of bringing the nucleic acid adsorbent of the present invention into contact with a material to be adsorbed with nucleic acid, and a step of separating the nucleic acid adsorbed to the nucleic acid adsorbent from the nucleic acid adsorbent can be used as a nucleic acid purification method.
In order to release nucleic acids from a nucleic acid adsorbent without denaturing them, the nucleic acid adsorbent that has adsorbed nucleic acids is brought into contact with a buffer solution with an ionic strength of about 1 to 2 and/or a pH of about 9, or such a buffer solution is All you have to do is pass the liquid through.
以下、実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）核酸吸着材の製造
エチレンジアミン（ＥＤＡ）固定化セルロースナノファイバー
５００ｍＬセパラブルフラスコに、２０ ｗｅｔ－ｇの湿潤状態のセルロースナノファイバー（セリッシュろか名人；ダイセルファインケム株式会社製）と、５％（ｗ／ｗ） 水酸化ナトリウム水溶液（５ｇの水酸化ナトリウム（特級；ナカライテスク製）を９５ｍＬ水に溶解したもの）を入れ、３０℃水浴中で１時間撹拌した。次いで、セパラブルフラスコに１６０ｍＬのクロロメチルオキシラン（特級；和光純薬工業株式会社製）を加え、さらに３０℃水浴中で２時間撹拌した。撹拌速度は一定とした。反応物を濾布（東レシルク, メッシュサイズ ２０μｍ, 東レ株式会社製）上で吸引ろ過し、固形分（ろ過残渣）としてエポキシ活性化セルロースナノファイバーを得た。得られたエポキシ活性化セルロースナノファイバーと、３０％(ｖ／ｖ) エチレンジアミン（ＥＤＡ）水溶液（３０ｍＬ ＥＤＡ（和光純薬工業株式会社製）と７０ｍＬ水の混合液）をセパラブルフラスコに入れ、４５℃の水浴中で４時間攪拌した。反応物を東レシルク上で超純水を用いて洗浄液のｐＨが中性付近になるまで十分に洗浄し、固形分（ろ過残渣）としてＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーを得た（ＥＤＡ-ＣＮＦ-１）。
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
(1) Production of nucleic acid adsorbent
Ethylenediamine (EDA) immobilized cellulose nanofiber
In a 500 mL separable flask, 20 wet-g of cellulose nanofibers (Selish Roka Meijin; manufactured by Daicel FineChem Co., Ltd.) and a 5% (w/w) aqueous sodium hydroxide solution (5 g of sodium hydroxide (special grade; (manufactured by Nacalai Tesque) dissolved in 95 mL of water was added thereto, and the mixture was stirred for 1 hour in a 30°C water bath. Next, 160 mL of chloromethyl oxirane (special grade; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the separable flask, and the mixture was further stirred in a 30° C. water bath for 2 hours. The stirring speed was kept constant. The reaction product was suction-filtered on a filter cloth (Toray Silk, mesh size 20 μm, manufactured by Toray Industries, Inc.) to obtain epoxy-activated cellulose nanofibers as a solid content (filtration residue). The obtained epoxy-activated cellulose nanofibers and a 30% (v/v) ethylenediamine (EDA) aqueous solution (mixture of 30 mL EDA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 70 mL water) were placed in a separable flask, and The mixture was stirred in a water bath at ℃ for 4 hours. The reaction product was sufficiently washed on Toray Silk with ultrapure water until the pH of the washing solution became near neutral, and EDA-immobilized cellulose nanofibers were obtained as a solid content (filtration residue) (EDA-CNF-1). ).
また、水酸化ナトリウム水溶液の濃度を１０％（ｗ／ｗ）にした他は、ＥＤＡ-ＣＮＦ-１の製造と同様にしてＥＤＡ-ＣＮＦ-２を製造した。 Further, EDA-CNF-2 was produced in the same manner as in the production of EDA-CNF-1, except that the concentration of the sodium hydroxide aqueous solution was changed to 10% (w/w).
反応容器にイオン交換水(ＤＷ)約４ｋｇ、４８ｗ／ｗ％水酸化ナトリウム水溶液約２ｋｇを仕込んだ。セリッシュろ過名人(ダイセルファインケム株式会社製)１ｋｇを追加し、室温で1時間撹拌した。クロロメチルオキシランを約２ｋｇ追加し室温で、終夜撹拌した。固形分を濾取し、ＤＷで十分に洗浄した後、反応容器に戻した。ＤＷ 約４ｋｇを仕込んだ後、エチレンジアミン約０．５ ｋｇを加え終夜撹拌した。固形分を濾取し、ＤＷで十分に洗浄し、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーを得た（ＥＤＡ－ＣＮＦ－３）。 Approximately 4 kg of ion exchange water (DW) and approximately 2 kg of a 48 w/w% aqueous sodium hydroxide solution were charged into a reaction vessel. 1 kg of Selish Filtration Meijin (manufactured by Daicel FineChem Co., Ltd.) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. Approximately 2 kg of chloromethyloxirane was added and stirred at room temperature overnight. The solid content was collected by filtration, thoroughly washed with DW, and then returned to the reaction vessel. After charging about 4 kg of DW, about 0.5 kg of ethylenediamine was added and stirred overnight. The solid content was collected by filtration and thoroughly washed with DW to obtain EDA-immobilized cellulose nanofibers (EDA-CNF-3).
ポリアリルアミン（ＰＡＡ）固定化セルロースナノファイバー
３０％ＥＤＡ水溶液に代えて３０％（ｗ／ｗ）ポリアリルアミン水溶液（平均分子量１，６００）；ニットーボーメディカル株式会社製）を１００ｍＬ添加した他は、ＥＤＡ-ＣＮＦ-１の製造と同様にしてポリアリルアミン（ＰＡＡ）固定化セルロースナノファイバー（ＰＡＡ-ＣＮＦ）を製造した。
EDA- Polyallylamine (PAA)-immobilized cellulose nanofibers (PAA-CNF) were produced in the same manner as in the production of CNF-1.
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）固定化セルロース粒子
５００ｍｌ四ツ口フラスコに、１５ｇのセルロース粒子（ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＧＨ－２５；ＪＮＣ株式会社製）と、２０％（ｗ/ｗ）水酸化カリウム水溶液（４２．４ｇの水酸化カリウム（一級；和光純薬工業株式会社製）を１６９．６ｍｌの水に溶解させたもの）を入れ、３０℃水浴中で１時間撹拌した。次いで、四ツ口フラスコに１１３ｍｌのクロロメチルオキシラン（特級；和光純薬工業株式会社製）を加え、４０℃水浴中で２時間撹拌した。反応物をろ布（ＴＦ－３０１Ｂ；通気度 １０．２ｃｃ／ｃｍ２／ｓｅｃ；東レ株式会社製）上で吸引濾過し、固形分（ろ過残渣）としてエポキシ活性化セルロース粒子（Ｅｐ－ＭＣＣ）を得た。
得られたＥｐ－ＭＣＣを５００ｍｌ四ツ口フラスコに入れ、１３２．４ｍｌの水に分散させた。その後、５０％（ｗ/ｗ）ポリエチレンイミン水溶液（２５．４ｍｌポリエチレンイミン（平均分子量１８００；和光純薬工業株式会社製）と２５．４ｍｌ水の混合液）を滴下し、５０℃の水浴中で２時間撹拌した。反応物をろ布上で吸引濾過し、超純水を用いて洗浄した。得られた固形分（ろ過残渣）を５００ｍｌ四ツ口フラスコに入れ、水２００ｍｌ中で室温で１時間撹拌した。ろ布上で吸引濾過して超純水及びメタノールで洗浄を行い、ポリエチレンイミン固定化セルロース粒子（ＰＥＩ-ビーズ）を得た。
Polyethyleneimine (PEI) immobilized cellulose particles 15g of cellulose particles (CellufineGH-25; manufactured by JNC Corporation) were placed in a 500ml four-neck flask, and 20% (w/w) potassium hydroxide aqueous solution (42.4g of hydroxide Potassium (first class; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dissolved in 169.6 ml of water was added, and the mixture was stirred for 1 hour in a 30°C water bath. Next, 113 ml of chloromethyl oxirane (special grade; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the four-necked flask, and the mixture was stirred in a 40° C. water bath for 2 hours. The reaction product was suction-filtered on a filter cloth (TF-301B; air permeability 10.2 cc/cm 2 /sec; manufactured by Toray Industries, Inc.), and epoxy-activated cellulose particles (Ep-MCC) were added as a solid content (filtration residue). Obtained.
The obtained Ep-MCC was placed in a 500 ml four-necked flask and dispersed in 132.4 ml of water. Then, a 50% (w/w) polyethyleneimine aqueous solution (a mixture of 25.4ml polyethyleneimine (average molecular weight 1800; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 25.4ml water) was added dropwise, and the mixture was placed in a water bath at 50°C. Stirred for 2 hours. The reaction product was suction filtered on a filter cloth and washed with ultrapure water. The obtained solid content (filtration residue) was placed in a 500 ml four-necked flask and stirred in 200 ml of water at room temperature for 1 hour. The mixture was suction-filtered on a filter cloth and washed with ultrapure water and methanol to obtain polyethyleneimine-immobilized cellulose particles (PEI-beads).
ポリアリルアミン（ＰＡＡ）固定化セルロース粒子
ＰＥＩ固定化セルロース粒子の製造と同様にして、Ｅｐ－ＭＣＣを得た。得られたＥｐ－ＭＣＣを５００ｍｌ四ツ口フラスコに入れ、１００ ｍｌの水に分散させた。その後、３０％（ｗ/ｗ）ポリアリルアミン水溶液（５０ｍｌ（平均分子量１，６００）；ニットーボーメディカル社））を滴下し、その後は、ＰＥＩ固定化セルロース粒子の製造と同様にし、ポリアリルアミン固定化セルロース粒子（ＰＡＡ-ビーズ）を得た。
Polyallylamine (PAA)-immobilized cellulose particles Ep-MCC was obtained in the same manner as in the production of PEI-immobilized cellulose particles. The obtained Ep-MCC was placed in a 500 ml four-necked flask and dispersed in 100 ml of water. Thereafter, a 30% (w/w) polyallylamine aqueous solution (50 ml (average molecular weight 1,600); Nitto Bo Medical Co., Ltd.) was added dropwise. Particles (PAA-beads) were obtained.
（２）各種の核酸吸着材のＤＮＡ吸着容量の評価
ＥＤＡ-ＣＮＦ-１、ＥＤＡ-ＣＮＦ-２、ＰＡＡ-ＣＮＦ、ＰＡＡ-ビーズ、及びＰＥＩ-ビーズを、それぞれ、カラム（０．９ｃｍφ×３．０ｃｍ内径、容量１．９ｍＬ）に充填し、５０μg／ｍＬ ＤＮＡ水溶液（サケ精巣由来、分子量３×１０５）の５０～２０００ｍＬを、流速０．１ｍＬ／分で通液しながら、５ｍＬずつ分取して回収した。分取した溶出液に含まれるＤＮＡ濃度をＤＡＰＩを用いた蛍光測定により定量し、ＤＮＡ吸着容量は以下の式により算出した。
ＤＮＡ吸着容量
＝カラムに通液したＤＮＡの総量（５０（μｇ／ｍＬ）×通液量（ｍＬ））－カラムから溶出したＤＮＡの総量（分取した各溶出液のＤＮＡ量（溶出液のＤＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）×５ｍＬ）の合計）
(2) Evaluation of DNA adsorption capacity of various nucleic acid adsorbents 0 cm inner diameter, volume 1.9 mL), and 50 to 2000 mL of a 50 μg/mL DNA aqueous solution (derived from salmon testis, molecular weight 3 x 10 5 ) was collected in 5 mL portions while flowing at a flow rate of 0.1 mL/min. and collected it. The DNA concentration contained in the fractionated eluate was determined by fluorescence measurement using DAPI, and the DNA adsorption capacity was calculated using the following formula.
DNA adsorption capacity = total amount of DNA passed through the column (50 (μg/mL) x amount passed (mL)) - total amount of DNA eluted from the column (DNA amount of each fractionated eluate (DNA amount of concentration (μg/mL) x 5mL)
各吸着材の陰イオン交換容量（ＡＥＣ）とＤＮＡ吸着容量（ｍｇ／ｍＬ カラム）を表１に示す。
（陰イオン交換容量の測定方法）
陰イオン交換容量（Anion Exchange Capacity；ＡＥＣ）は、塩酸を用いた逆滴定法により測定した。手順を以下に示す。
(Method for measuring anion exchange capacity)
Anion exchange capacity (AEC) was measured by a back titration method using hydrochloric acid. The steps are shown below.
アミノ化セルロースナノファイバー、及びアミノ化セルロース粒子を、それぞれ２４時間以上室温で減圧乾燥し、約０．５ｇをスクリュー管に精密秤量した。ファクター既知の０．１ｍｏｌ／ｌ塩酸２０ｍｌを加え、ローラー上で２時間撹拌した。ろ紙を用いて濾過し、ろ液を１０ｍｌ別のスクリュー管に取った。ファクター既知の０．０５ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム水溶液でフェノールフタレインを指示薬として滴定を行った。
以下の式によりＡＥＣを算出した。
ＡＥＣ（ｍＥｑ／ｄｒｙ・ｇ）
＝（０．１×ｆＨＣｌ×２０－０．０５×ｆＮａＯＨ×Ｖ×２０／１０）÷Ｗ
ｆＨＣｌ ： 使用した塩酸のファクター
ｆＮａＯＨ ： 使用した水酸化ナトリウムのファクター
Ｖ ： 滴定量（ｍｌ）
Ｗ ： 粒子の乾燥重量（ｄｒｙ・ｇ）
The aminated cellulose nanofibers and the aminated cellulose particles were each dried under reduced pressure at room temperature for 24 hours or more, and about 0.5 g was accurately weighed into a screw tube. 20 ml of 0.1 mol/l hydrochloric acid with a known factor was added, and the mixture was stirred on a roller for 2 hours. It was filtered using filter paper, and 10 ml of the filtrate was taken into a separate screw tube. Titration was performed with a 0.05 mol/l aqueous sodium hydroxide solution with a known factor using phenolphthalein as an indicator.
AEC was calculated using the following formula.
AEC (mEq/dry・g)
=(0.1×f HCl ×20-0.05×f NaOH ×V×20/10)÷W
f HCl : Factor of hydrochloric acid used f NaOH : Factor V of sodium hydroxide used: Titration amount (ml)
W: Dry weight of particles (dry・g)
（３）プラスミド吸着容量の評価
９，０００塩基対のサイズのプラスミド（終濃度：０．０１～１００，０００ｐｐｂ）とＥＤＡ固定化セルロースナノファイバー（ＥＤＡ-ＣＮＦ-３）（終濃度：１％）を試験管中で混合し、２５℃３００ｒｐｍの条件で１．５時間振盪した。その後、混合物をろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ Φ９０ｍｍ Ｎｏ．１３１）でろ過して、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーを除去した。
(3) Evaluation of plasmid adsorption capacity Plasmid with a size of 9,000 base pairs (final concentration: 0.01 to 100,000 ppb) and EDA-immobilized cellulose nanofiber (EDA-CNF-3) (final concentration: 1%) were mixed in a test tube and shaken at 25° C. and 300 rpm for 1.5 hours. Thereafter, the mixture was filtered through filter paper (ADVANTEC Φ90 mm No. 131) to remove EDA-immobilized cellulose nanofibers.
ろ液に含まれるプラスミドをＰＣＲで検出した。ＰＣＲは、ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑ及び２×ＧＣバッファー（Ｉ）を用いたＰＣＲ反応液１０μＬにより行った。ＰＣＲプライマーとしては、
フォワードプライマー：（５’－ＣＴＣＴＣＧＣＣＧＴＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＴＧＣＴＴＣＣＴＣ－３’）（配列番号１）
リバースプライマー ：（５’－ＣＡＴＧＧＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＧＧＡＡＧＡＣ－３’）（配列番号２）
を用いた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃５分、（９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃２分）を３０サイクル、７２℃５分とした。
ＰＣＲ反応液を１％アガロース電気泳動に供し、色素（Ｍｉｄｏｒｉ Ｇｒｅｅｎ Ｄｉｒｅｃｔ）により可視化した。結果を図１に示す。図１において、Ｍは分子量マーカーを示す。
The plasmid contained in the filtrate was detected by PCR. PCR was performed using 10 μL of a PCR reaction solution using TAKARA LA Taq and 2×GC buffer (I). As a PCR primer,
Forward primer: (5'-CTCTCGCCGTCGGCGTGCAGTTGCTTCCTC-3') (SEQ ID NO: 1)
Reverse primer: (5'-CATGGACGCCCTCCAGGGCACCCGGAAGAC-3') (SEQ ID NO: 2)
was used. The reaction conditions for PCR were 94°C for 5 minutes, 30 cycles of (94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 72°C for 2 minutes), and 72°C for 5 minutes.
The PCR reaction solution was subjected to 1% agarose electrophoresis and visualized with a dye (Midori Green Direct). The results are shown in Figure 1. In FIG. 1, M indicates a molecular weight marker.
プラスミド濃度１００，０００ｐｐｂ（１００ｐｐｍ）以下の場合に、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーを使用しないコントロールに比べて、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーへのプラスミド吸着量が多かった。また、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーは、濃度１０，０００ｐｐｂ（１０ｐｐｍ）以下のプラスミドを完全に吸着した。混合液中のＥＤＡ固定化セルロースナノファイバー濃度は１％であるから、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバー１重量部に対して１／１，０００重量部までのプラスミドを吸着できることが分かる。 When the plasmid concentration was 100,000 ppb (100 ppm) or less, the amount of plasmid adsorbed to EDA-immobilized cellulose nanofibers was greater than the control that did not use EDA-immobilized cellulose nanofibers. Furthermore, EDA-immobilized cellulose nanofibers completely adsorbed plasmid at a concentration of 10,000 ppb (10 ppm) or less. Since the concentration of EDA-immobilized cellulose nanofibers in the mixed solution is 1%, it can be seen that up to 1/1,000 part by weight of plasmid can be adsorbed to 1 part by weight of EDA-immobilized cellulose nanofibers.
（４）プラスミド吸着能に及ぼすｐＨの影響の評価
９，０００塩基対のサイズのプラスミド（終濃度：１０，０００ｐｐｂ）とＥＤＡ固定化セルロースナノファイバー（ＥＤＡ-ＣＮＦ-３）（終濃度：１％）を試験管中で混合し、２５℃３００ｒｐｍの条件で１．５時間振盪した。その後、混合物をろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ Φ９０ｍｍ Ｎｏ．１３１）でろ過して、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーを除去した。混合液として、ｐＨを２.０～１１．０に変化させたものを調製した。
(4) Evaluation of the effect of pH on plasmid adsorption capacity A plasmid with a size of 9,000 base pairs (final concentration: 10,000 ppb) and EDA-immobilized cellulose nanofibers (EDA-CNF-3) (final concentration: 1%) ) were mixed in a test tube and shaken at 25° C. and 300 rpm for 1.5 hours. Thereafter, the mixture was filtered through filter paper (ADVANTEC Φ90 mm No. 131) to remove EDA-immobilized cellulose nanofibers. A mixed solution was prepared with the pH changed from 2.0 to 11.0.
ろ液に含まれる核酸をＰＣＲで検出した。ＰＣＲの条件は「（３）ＤＮＡ吸着容量の評価」の項目に記載した方法と同じである。結果を図２に示す。図２において、Ｍは分子量マーカーを示す。 Nucleic acids contained in the filtrate were detected by PCR. The PCR conditions were the same as the method described in "(3) Evaluation of DNA adsorption capacity". The results are shown in Figure 2. In FIG. 2, M indicates a molecular weight marker.
ｐＨ３．０～９．０の場合に、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーを使用しないコントロールに比べて、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーへのプラスミド吸着量が多かった。特に、ｐＨ４．０～９．０の場合に、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーはプラスミドを強く吸着した。窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーによる核酸吸着の最適なｐＨは４．０～９．０であることが分かる。 In the case of pH 3.0 to 9.0, the amount of plasmid adsorbed to EDA-immobilized cellulose nanofibers was greater than the control that did not use EDA-immobilized cellulose nanofibers. In particular, at pH 4.0 to 9.0, EDA-immobilized cellulose nanofibers strongly adsorbed plasmids. It can be seen that the optimum pH for nucleic acid adsorption by cellulose nanofibers having cationic groups containing nitrogen atoms is 4.0 to 9.0.
（５）ＤＮＡ吸着能に及ぼすイオン強度の影響の評価
ＢＳＡ（Bovine serum albumin；ウシ血清アルブミン）とＤＮＡ（サケ精巣由来、分子量３×１０５）との混合液（ＢＳＡ 1mg/ml、ＤＮＡ ５０μｇ／ｍＬ）４ｍＬとＥＤＡ固定化セルロースナノファイバー（ＥＤＡ-ＣＮＦ-２）０．２ ｗｅｔ-ｇを混合し、２５℃の下、２００ｒｐｍで２時間撹拌した。混合液のイオン強度は、リン酸緩衝液濃度を調整することで、０．０５又は０．２とした。また、混合液のｐＨを５～９に変化させたものを調製した。混合物をろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ Φ９０ｍｍ Ｎｏ．１３１）でろ過して、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーを除去した。
(5) Evaluation of the effect of ionic strength on DNA adsorption capacity A mixed solution of BSA (Bovine serum albumin) and DNA (derived from salmon testis, molecular weight 3 x 10 5 ) (BSA 1 mg/ml, DNA 50 μg/ml) mL) and 0.2 wet-g of EDA-immobilized cellulose nanofibers (EDA-CNF-2) were mixed and stirred at 200 rpm for 2 hours at 25°C. The ionic strength of the mixed solution was set to 0.05 or 0.2 by adjusting the phosphate buffer concentration. In addition, mixed solutions were prepared in which the pH was changed from 5 to 9. The mixture was filtered through filter paper (ADVANTEC Φ90mm No. 131) to remove EDA-immobilized cellulose nanofibers.
ろ液に含まれるＤＮＡをＤＡＰＩを用いた蛍光測定により定量し、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーを用いない場合のＤＮＡ量を基準値として、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーへの吸着率（％）を算出した。
また、ろ液に含まれるＢＳＡをＢＣＡキットを用いたＵＶ－Ｖｉｓ測定により定量し、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーを用いない場合のＢＳＡ量を基準値として、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーへの吸着率（％）を算出した。
DNA contained in the filtrate was quantified by fluorescence measurement using DAPI, and the adsorption rate (%) to EDA-immobilized cellulose nanofibers was calculated using the amount of DNA when EDA-immobilized cellulose nanofibers were not used as a reference value. did.
In addition, BSA contained in the filtrate was quantified by UV-Vis measurement using a BCA kit, and the adsorption rate to EDA-immobilized cellulose nanofibers was determined using the amount of BSA when EDA-immobilized cellulose nanofibers were not used as a reference value. (%) was calculated.
結果を図３に示す。
イオン強度０．２の場合、ｐＨ５～９の全範囲で、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーはＤＮＡを完全に吸着し、ＢＳＡを全く吸着しなかった。
一方、イオン強度０．０５の場合、ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーは、ｐＨ５～９の全範囲でＤＮＡを完全に吸着したが、ｐＨ６～７外の範囲でＢＳＡも吸着した。ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバーは、ｐＨ６～７の範囲で核酸を選択的に吸着した。
The results are shown in Figure 3.
At an ionic strength of 0.2, EDA-immobilized cellulose nanofibers completely adsorbed DNA and did not adsorb BSA at all over the entire pH range of 5-9.
On the other hand, when the ionic strength was 0.05, EDA-immobilized cellulose nanofibers completely adsorbed DNA over the entire pH range of 5 to 9, but also adsorbed BSA outside the pH range of 6 to 7. EDA-immobilized cellulose nanofibers selectively adsorbed nucleic acids in the pH range of 6 to 7.
ＢＳＡは酸性タンパク質（ｐＩ＝４．７）であり、酸性を示す核酸との分離が特に難しいタンパク質である。窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーは、イオン強度を調整することで、酸性タンパク質の共存下でも、核酸を選択的に吸着できることが分かる。 BSA is an acidic protein (pI=4.7), and is a protein that is particularly difficult to separate from acidic nucleic acids. It can be seen that cellulose nanofibers having cationic groups containing nitrogen atoms can selectively adsorb nucleic acids even in the presence of acidic proteins by adjusting the ionic strength.
（６）ＤＮＡの吸着・溶出条件の検討
ＥＤＡ固定化セルロースナノファイバー（ＥＤＡ-ＣＮＦ-２）をカラム（０．９ｃｍφ×３．０ｃｍ内径、容量１．９ｍＬ）に充填し、ＢＳＡとＤＮＡ（サケ精巣由来、分子量３×１０５）との混合液 ６０ｍＬ（ＢＳＡ １０００μｇ／ｍＬ、ＤＮＡ５０μｇ／ｍＬ）をアプライした。ＢＳＡとＤＮＡの混合液は、ＰＢＳを用いてｐＨ＝７．０、イオン強度０．２に調製した。
まず、ＰＢＳを用いてｐＨ＝７．０、イオン強度０．２に調製した溶出液を通液した。次いで、トリスバッファーを用いてｐＨ＝９、イオン強度０．２から２へのグラジエントを設けた溶出液を通液した。流速は０．１ｍＬ／分とした。溶離液中のＤＮＡは、ＤＡＰＩを用いた励起波長３４０ｎｍ、蛍光は波長４３０ｎｍでの蛍光測定により検出し、ＢＳＡは、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）を用いた５６０ｎｍでのＵＶ-Ｖｉｓにより検出した。
(6) Examination of DNA adsorption/elution conditions EDA-immobilized cellulose nanofibers (EDA-CNF-2) were packed into a column (0.9 cmφ x 3.0 cm inner diameter, capacity 1.9 mL), and BSA and DNA (salmon 60 mL of a mixed solution (BSA 1000 μg/mL, DNA 50 μg /mL) was applied. A mixed solution of BSA and DNA was adjusted to pH=7.0 and ionic strength of 0.2 using PBS.
First, an eluate prepared using PBS to have a pH of 7.0 and an ionic strength of 0.2 was passed through the tube. Next, an eluate with a pH of 9 and a gradient of ionic strength from 0.2 to 2 using Tris buffer was passed through the tube. The flow rate was 0.1 mL/min. DNA in the eluent was detected by fluorescence measurement using DAPI at an excitation wavelength of 340 nm and fluorescence at a wavelength of 430 nm, and BSA was detected by UV-Vis at 560 nm using BCA (bicinchoninic acid).
結果を図４（Ａ）に示す。
ＤＮＡとＢＳＡの混液をアプライした後、ほとんどＢＳＡは吸着せず、ｐＨ＝７．０、イオン強度０．２の溶出液の通液により、ＢＳＡの９９％以上が溶出した。この間、プラスミドは９９％以上が吸着したままであった。また、ｐＨ＝９、イオン強度０．２から２へのグラジエントを設けた溶出液の通液によりプラスミドの８０％以上が溶出した。
The results are shown in FIG. 4(A).
After the mixture of DNA and BSA was applied, almost no BSA was adsorbed, and more than 99% of the BSA was eluted by passing an eluent having a pH of 7.0 and an ionic strength of 0.2. During this time, more than 99% of the plasmid remained adsorbed. Further, more than 80% of the plasmid was eluted by passing an eluate with a gradient of ionic strength from 0.2 to 2 at pH=9.
また、ＰＡＡ固定化セルロースナノファイバー（ＰＡＡ-ＣＮＦ）をカラム（０．９ｃｍφ×３．０ｃｍ内径、容量１．９ｍＬ）に充填し、ＢＳＡとＤＮＡの混合液（ＢＳＡ １０００μｇ／ｍＬ、ＤＮＡ５０μｇ／ｍＬ）をアプライした。ＢＳＡとＤＮＡの混合液は、ＰＢＳを用いてｐＨ＝７．０、イオン強度０．４に調製した。
まず、ＰＢＳを用いてｐＨ＝７．０、イオン強度０．４に調製した溶出液を通液した。次いで、トリスバッファーを用いてｐＨ＝９、イオン強度０．２から２へのグラジエントを設けた溶出液を通液した。流速は０．１ｍＬ／分とした。
In addition, PAA-immobilized cellulose nanofibers (PAA-CNF) were packed into a column (0.9 cmφ x 3.0 cm inner diameter, volume 1.9 mL), and a mixed solution of BSA and DNA (BSA 1000 μg/mL, DNA 50 μg/mL) was applied. The mixed solution of BSA and DNA was adjusted to pH=7.0 and ionic strength of 0.4 using PBS.
First, an eluate prepared using PBS to have a pH of 7.0 and an ionic strength of 0.4 was passed through the tube. Next, an eluate with a pH of 9 and a gradient of ionic strength from 0.2 to 2 using Tris buffer was passed through the tube. The flow rate was 0.1 mL/min.
結果を図４（Ｂ）に示す。ＤＮＡとＢＳＡの混液をアプライした後、ＢＳＡはほとんど吸着せず、ｐＨ＝７．０、イオン強度０．４の溶出液の通液により、ＢＳＡの９７％が溶出した。この間、ＤＮＡは９９％以上が吸着したままであった。また、ｐＨ＝９、イオン強度０．２から２へのグラジエントを設けた溶出液の通液によりＤＮＡの２６％が溶出した。 The results are shown in FIG. 4(B). After applying the mixture of DNA and BSA, almost no BSA was adsorbed, and 97% of the BSA was eluted by passing an eluent having a pH of 7.0 and an ionic strength of 0.4. During this time, more than 99% of the DNA remained adsorbed. Furthermore, 26% of the DNA was eluted by passing an eluent with a gradient of ionic strength from 0.2 to 2 at pH=9.
窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーは、ｐＨやイオン強度を選択することで、核酸を強く吸着し、またタンパク質と精度良く分離できることが分かる。 It can be seen that cellulose nanofibers, which have cationic groups containing nitrogen atoms, strongly adsorb nucleic acids and can be separated from proteins with high accuracy by selecting pH and ionic strength.
本発明の核酸吸着材は、核酸を強く吸着し、またタンパク質を吸着せずに核酸を選択的に吸着することができる。従って、微生物培養や細胞培養により酵素、抗体、サイトカインなどの有用物質を生産する際、有用物質を吸着せずに、培養液中の核酸を吸着し除去することができる。また、遺伝子治療薬や研究ツールとしての核酸などの製造において、核酸を吸着して精製することができる。 The nucleic acid adsorbent of the present invention strongly adsorbs nucleic acids and can selectively adsorb nucleic acids without adsorbing proteins. Therefore, when producing useful substances such as enzymes, antibodies, and cytokines by microbial culture or cell culture, nucleic acids in the culture solution can be adsorbed and removed without adsorbing the useful substances. Furthermore, in the production of nucleic acids as gene therapy drugs and research tools, nucleic acids can be adsorbed and purified.
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