JP7355335B2 - 小分子重炭酸イオンチャネルを用いた嚢胞性線維症の遺伝子型非依存性救済 - Google Patents

小分子重炭酸イオンチャネルを用いた嚢胞性線維症の遺伝子型非依存性救済 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１０月１１日出願の米国仮特許出願第６２／５７０，７９５号に対する優先権の利益を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
政府の支援
本発明は、米国国立衛生研究所によって承認された認可番号第ＧＭ１１８１８５のもとで政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
嚢胞性線維症は、罹患者の寿命を大幅に短縮する常染色体劣性遺伝子疾患である。この疾患は、出生数３，０００人に対して１人の割合で発症し、脊椎動物における膜発現陰イオンチャネルタンパク質である嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードするＣＦＴＲ遺伝子における突然変異を原因とする。この疾患は、ほとんどの場合、慢性的で致命的な呼吸器感染症を特徴とし、嚢胞性線維症のほとんどの患者では、対症療法のみ利用可能である。患者の生存期間の中央値は僅か３３年である。
ＣＦＴＲは、上皮細胞膜を横断してクロライドイオンと重炭酸イオンを伝導するＡＢＣ輸送体（トランスポーター）クラスのイオンチャネルである。クロライドおよび重炭酸イオンチャネルの機能に影響を及ぼすＣＦＴＲ遺伝子の突然変異は、気道表面液（ＡＳＬ）のｐＨ、ならびに肺、膵臓およびその他の臓器の上皮の流体輸送の調節異常を引き起こし、結果的に嚢胞性線維症を生じる。合併症には、ＡＳＬのｐＨの低下、ＡＳＬ粘度の上昇、ＡＳＬ抗菌活性の低下、頻繁な呼吸器感染を伴う肺の粘稠な粘液、ならびに栄養失調および糖尿病を生じさせる膵機能不全が含まれる。これらの状態は、慢性障害をもたらし、また平均余命を短くする。男性患者では、異常な管腔内分泌に起因して、発達中の精管および精巣上体の進行性の閉塞および破壊が生じると思われ、精管の先天性無形成および男性不妊を引き起こす。
ＣＦＴＲは、ｃＡＭＰ活性化ＡＴＰ依存性陰イオンチャネルとしての役割を担い、特定の陰イオン（例えばＣｌ－や重炭酸イオン）がそれらの電気化学的勾配に従って流れるようにコンダクタンスを高める。ＣＦＴＲにおけるＡＴＰ駆動性の構造変化は、ゲートを開閉して、電気化学的勾配に従う陰イオンの膜透過の流れを可能にする。この機能は、ＡＴＰ駆動性の構造変化によって細胞膜を横断する上り方向の基質輸送が刺激される他のＡＢＣタンパク質とは対照的である。本質的に、ＣＦＴＲは、開構造のときに漏れる「破損」したＡＢＣ輸送体として進化したイオンチャネルである。
陰イオンチャネル機能に影響を及ぼすＣＦＴＲ遺伝子の突然変異は、肺において、上皮のイオンおよび流体輸送の調節異常、粘稠な粘液、および頻繁な呼吸器感染を引き起こし、主として嚢胞性線維症に関連する寿命短縮病態生理を引き起こす。ＣＦＴＲは、肺、肝臓、膵臓、消化管、生殖器官、および皮膚などの多くの臓器の上皮細胞に見られる。肺では、タンパク質イオンチャネルは、重炭酸イオンおよびクロライドイオンを上皮細胞内から頂端気道表面液（ＡＳＬ）に移動させる。これは、適切なＡＳＬのｐＨ、粘度、およびｐＨ感受性抗菌性タンパク質の活性を維持する。ＣＦＴＲ機能障害によるＡＳＬの変化は、細菌のクリアランスおよび殺菌を損なわせ、病的状態および死亡への主要な牽引となる慢性気道感染症に患者をかかりやすくする。
ＣＦ患者には約２０００のＣＦＴＲ変異が見られ、そのうちの数百が機能喪失の少なくとも５つの異なるメカニズムを介して疾患を引き起こすことが確認されている（特許文献１）（１）。遺伝子型特異的小分子薬は、ＣＦＴＲの特定の変異型の活性を高めることができる。しかしながら、ほとんどのＣＦ患者は、現在利用可能な治療法に不応答性であるかまたは最小応答性の変異を有する（非特許文献２）（２）。ＣＦの遺伝子治療を開発するための広範な努力は、まだ実質的な臨床的影響をもたらしていない（１）。したがって、ＣＴＦＲ変異の遺伝子型に依存しない（非依存性の）嚢胞性線維症の有効な治療に対する切実な必要性が存在する。
特定の変異を有するＣＦＴＲチャネルを介した陰イオン分泌を回復すると、ＣＦ患者の気道宿主防御および肺機能が改善される（非特許文献１、３および４）（１、２７、３８）。しかしながら、すべてのＣＦＴＲ変異が、欠陥タンパク質を標的とする薬剤に適しているわけではない（非特許文献５）（３９）。陰イオンの分泌を促進する小分子イオンチャネルは、これらの制限を回避することができる。多数の研究により、ペプチドまたは小分子イオンチャネル、輸送体、またはキャリアが、ＣＦＴＲ欠損細胞におけるクロライド輸送および／またはＣＦＴＲ欠損上皮における短絡電流または電位の変化を促進できることが示されている（非特許文献６～１０）（３７、１１－１３、４０）。しかしながら、このアプローチが気道の宿主防御を回復できるかどうかは不明のままであった。
F. Ratjen et al., Cystic fibrosis. Nature Reviews Disease Primers 1, 15010 (2015) B. P. Trivedi, Cystic fibrosis foundation opens drug discovery lab. Science 353, 1194-1195 (2016) B. W. Ramsey et al., A CFTR Potentiator in Patients with Cystic Fibrosis and the G551D Mutation. New England Journal of Medicine 365, 1663-1672 (2011) Wainwright, C. E. et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. New England Journal of Medicine 373, 220-231, doi:doi:10.1056/NEJMoa1409547 (2015) Oliver, K. E., Han, S. T., Sorscher, E. J. & Cutting, G. R. Transformative therapies for rare CFTR missense alleles. Curr Opin Pharmacol 34, 76-82, doi:10.1016/j.coph.2017.09.018 (2017) Wallace, D. P. et al. A synthetic channel-forming peptide induces Cl(-) secretion: modulation by Ca(2+)-dependent K(+) channels. Biochim Biophys Acta 1464, 69-82 (2000) B. Shen, et al., A synthetic chloride channel restores chloride conductance in human cystic fibrosis epithelial cells. PLoS One 7, e34694 (2012). A. V. Koulov et al., Chloride transport across vesicle and cell membranes by steroid-based receptors. Angew Chem Int Ed Engl 42, 4931-4933 (2003). C. Jiang et al., Partial correction of defective Cl(-) secretion in cystic fibrosis epithelial cells by an analog of squalamine. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 281, L1164-1172 (2001). Poulsen, J. H., Fischer, H., Illek, B. & Machen, T. E. Bicarbonate conductance and pH regulatory capability of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91, 5340-5344 (1994)
ある態様では、本発明は、嚢胞性線維症を治療する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の（ｉ）アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、および（ｉｉ）ステロールまたはその薬学的に許容される塩を併せて（conjointly）投与し、それにより嚢胞性線維症を治療することを含む方法を提供する。
また本明細書では、嚢胞性線維症の患者の気道表面液のｐＨを高める方法であって、嚢胞性線維症の患者に、治療有効量の（ｉ）アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、および（ｉｉ）ステロールまたはその薬学的に許容される塩を投与し、それにより嚢胞性線維症の患者の気道表面液のｐＨを高めることを含む方法も提供する。
本明細書ではさらに、嚢胞性線維症の患者の気道表面液の粘度を低下させる方法であって、嚢胞性線維症を有する患者に、治療有効量の（ｉ）アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、および（ｉｉ）ステロールまたはその薬学的に許容される塩を投与し、それにより嚢胞性線維症の患者の気道表面液の粘度を低下させることを含む方法を提供する。
本明細書ではさらに、嚢胞性線維症の患者の気道表面液の抗菌活性を高める方法であって、嚢胞性線維症の患者に、治療有効量の（ｉ）アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、および（ｉｉ）ステロールまたはその薬学的に許容される塩を投与し、それにより嚢胞性線維症の患者の気道表面液の抗菌活性を高めることを含む方法を提供する。
本明細書で提供される方法のある実施形態では、ＡｍＢとステロールの併用投与（cojoint administration）は、医薬品アムビゾーム（ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標））（すなわち、水と、ＡｍＢと、水素添加大豆ホスファチジルコリン、コレステロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、α－トコフェロール、スクロースおよびコハク酸二ナトリウム六水和物からなるリポソーム膜とから本質的になる組成物）の投与により達成される。
図１はパネルＡ～Ｆからなり、一般に、ＣＦの遺伝子型非依存性救済（genotype-agnostic rescue）のためのモデルおよび小分子プローブを示す。パネルＡは、正常な気道上皮細胞における経上皮重炭酸イオン輸送の概略図を示す。赤い球は重炭酸イオンを表す。緑と紫の球はそれぞれ、ナトリウムイオンとカリウムイオンを表す。パネルＢでは、重炭酸イオンの大きな経頂端膜勾配がＣＦＴＲ重炭酸イオンチャンネルを欠くＣＦ上皮で予測されている。パネルＣは、小分子ベースのチャネルがこの経頂端膜勾配を利用してＡＳＬへの重炭酸イオンの分泌を促進し、それによりＣＦ肺上皮の生理機能を回復することが予測されることを示す。 図１－１の続き。パネルＤは、アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）およびチャネル不活性化誘導体Ｃ３５－デオキシアムホテリシンＢ（Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ）の構造を示す。パネルＥおよびＦは、Ｈ１３ＣＯ３を搭載したＰＯＰＣ／１０％コレステロールリポソームの１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示し、ＡｍＢの添加後に外部溶液中に重炭酸イオン１３Ｃ共鳴の出現を示すが、Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢまたはＤＭＳＯ対照では出現せず、ＡｍＢが経膜重炭酸イオン流出を促進できることを実証する。パネルＦでは、少なくとも３つの独立した実験からの代表的なグラフを示す。 図２はパネルＡ～Ｆからなり、一般に、ＡｍＢが嚢胞性線維症の培養気道上皮におけるＡＳＬのｐＨを高めることを示す。パネルＡでは、正常培養気道上皮（ＮｕＬｉ）と比較して、ＣＦ培養気道上皮（ＣｕＦｉ－１）において細胞内ｐＨが上昇している（ｎ＝１２）。パネルＢは、正常培養気道上皮（ＮｕＬｉ）と比較して、ＣＦ培養気道上皮（ＣｕＦｉ－１）でＡＳＬのｐＨが低下していることを示す（ｎ＝８～３１）。パネルＣは、ＡｍＢ（２μΜ）が、未処理のＣｕＦｉ－１対照と比較して、２時間にわたりＡＳＬのｐＨを高め、少なくとも４８時間持続することを示す（ｎ＝６～２８）グラフである。パネルＤは、Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ（２μΜ）、ＡｍＢ（２μＭ）の側底添加（側底ＡｍＢ）、またはイバカフトール（ｉｖａｃａｆｔｏｒ）／フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）（Ｉｖａ／Ｆｓｋ）（１０μＭ）で処理したＣｕＦｉ－１単層では、ＡＳＬのｐＨの上昇は観察されなかったことを示す（ｎ＝６～１４）。パネルＥは、ＡｍＢが低濃度ではＣｕＦｉ－１単層におけるＡＳＬのｐＨを高めるが、高濃度では高めないことを示す。ＡｍＢとコレステロールとの複合体形成により、有効範囲が少なくとも１００μＭまで拡大する（ｎ＝９～３１）。パネルＦは、ＡｍＢ（２μΜ）とイバカフトール／フォルスコリン（１０μΜ）の両方がＣｕＦｉ－４（Ｇ５５１Ｄ／ΔＦ５０８）単層におけるＡＳＬのｐＨを高めることを示す。パネルＡ～Ｆにおいて、グラフは平均±ＳＥＭを示す；ＮＳは有意ではない；＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 図３は、パネルＡ～Ｅからなり、一般に、ＡＳＬのｐＨのＡｍＢ媒介性上昇が重炭酸イオン依存性でありかつＮａ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅ依存性であることを示す。パネルＡでは、ＮｕＬｉおよびＣｕＦｉ－１単層でのｐＨスタット滴定により、側底側に重炭酸イオンが存在する場合はＡｍＢ処理によるＡＳＬのｐＨの用量依存的な上昇が示されたが、側底側に重炭酸イオンが不在の場合は示されなかった（ｎ＝４～２３）。パネルＢは、ＣｕＦｉ－１単層におけるＨ１４ＣＯ３ －の側底側から頂端側への輸送の定量化を示し、ＡｍＢ（２μＭ）は正常な重炭酸イオン輸送を回復したが、Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ（２μΜ）、ＡｍＢの側底添加（２μΜ）、またはイバカフトール／フォルスコリン（Ｉｖａ／Ｆｓｋ）（１０μΜ）は回復しなかったことを示す（ｎ＝４～３８）。パネルＣは、ＡｍＢ（２μΜ）とイバカフトール／フォルスコリン（１０μΜ）の両方が、ＣｕＦｉ－４（Ｇ５５１Ｄ／ΔＦ５０８）上皮におけるＨ１４ＣＯ３ －の経上皮輸送を増加させることを示す（ｎ＝１０～１６）。パネルＤおよびＥのグラフは、経上皮重炭酸イオン輸送およびＡＳＬのｐＨのＡｍＢ媒介性の上昇が、ウアバイン（ｏｕａｂａｉｎ）（１０ｍＭ）によるＮａ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅの化学的ブロックによって無効になることを示す（ｎ＝６）。パネルＡ～Ｅにおいて、グラフは平均±ＳＥＭを示す；ＮＳは有意ではない；＊*Ｐ≦０．０１；＊＊*Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 図４はパネルＡ～Ｅからなり、一般に、ＡｍＢが、広範なＣＦＴＲ遺伝子型のＣＦ患者に由来する初代培養ヒト肺上皮のＡＳＬの生理機能を回復させることを示す。パネルＡ～Ｅは、ＡｍＢがＣＦの遺伝的に多様なヒトに由来する初代培養気道上皮における宿主防御を改善したことを一般的に示す。パネルＡは、患者ドナーの遺伝子型と変異クラスを列挙した表である。ＡｍＢの頂端添加（２μΜ；４８時間）処理ありまたはなしで、広範囲のＣＦＴＲ変異を有する９名のＣＦのヒト由来の初代培養気道上皮において、広範囲のＣＦＴＲ遺伝子型にわたりＡＳＬのｐＨの上昇を観察した（ｎ＝９）。パネルＢは、平均して、ＡｍＢ（２μΜ）はＡＳＬのｐＨを高めたが、Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ（２μΜ）および側底側へのＡｍＢ（２μΜ）の添加はＡＳＬのｐＨを高めなかったことを示すグラフである（ｎ＝３～９）。パネルＣは、ＡｍＢ（２μΜ）の頂端添加によるＡＳＬのｐＨの平均差を時間の関数として示す（ｎ＝３～９）。パネルＤは拡散によるＦＩＴＣ－デキストランの蛍光回復により測定されたＡＳＬ粘度（τＡＳＬ／τ生理食塩水）（ｎ＝６）を示す。パネルＥは、ＡＳＬへの曝露後に死んだ黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の割合（％）により測定したＡＳＬの抗菌活性を示す（ｎ＝８）。パネルＥは、ＡｍＢの頂端添加（２μＭ、４８時間）がある場合とない場合の初代ＣＦ上皮を示す。すべての化合物はＦＣ－７２中において投与された。パネルＡ、ＣおよびＥでは、各データポイントまたはデータポイントのペアは、異なるヒトの上皮の平均（ｎ＝１～３）を表し、黒いバーは平均±ＳＥＭを示す。すべてのパネルで、統計的有意性を評価するのに適切な場合は、ウェルチ補正ありまたはなしの両側の対応のないスチューデントのｔ検定を使用した。パネル３ｂにおいて、＊はビヒクル対照と比較した統計的な差を示す；＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１。パネルＡ、Ｄ、およびＥでは、測定値は別個のサンプルから取得した。パネルＣでは、各ドナーの同じサンプルを経時的に繰り返し測定した。 図５は、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）の投与による気道表面液のｐＨの用量依存的な変化を示すグラフである（ＮＳは有意ではない；＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）。 図６は、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）の投与後の経時的な気道表面液のｐＨの変化を示すグラフである（ＮＳは有意ではない；＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）。 図７Ａ～７Ｉは、一般に、ＡｍＢが、培養ＣＦ気道上皮におけるＨ１４ＣＯ３ －分泌を増加させ、さらにＡＳＬのｐＨを高めたことを示す。パネルＡ～Ｉは、イバカフトール／フォルスコリン（Ｉｖａ／Ｆｓｋ）（１０μＭ、２時間）および頂端へのＡｍＢ（２μＭ；４８時間）添加の効果を示す。図７Ａは、ＣｕＦｉ－４（Ｇ５５１Ｄ／ΔＦ５０８）上皮におけるＡＳＬのｐＨを示すグラフである（ｎ＝１０～１６）。図７Ｂは、ビヒクル処理されたＣｕＦｉ－４上皮に対して正規化された１０分間にわたる側底側から頂端側へのＨ１４ＣＯ３ －分泌の比率を示すグラフである（ｎ＝１０～１６）。図７Ｃは、ビヒクル（ＦＣ－７２）、イバカフトール／フォルスコリン（１０μΜ；２時間）、Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ（２μＭ；４８時間）の添加、またはＡｍＢの側底添加（２μＭ；４８時間）の４８時間後のＮｕＬｉ（ＣＦＴＲ＋／＋）上皮またはＣｕＦｉ－１（ΔＦ５０８／ΔＦ５０８）上皮におけるＡＳＬのｐＨを示すグラフである（ｎ＝６～１４）。図７Ｄは、ビヒクル（ＦＣ－７２）、イバカフトール／フォルスコリン（１０μＭ、２時間）、Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ（２μＭ；４８時間）の頂端添加、またはＡｍＢの側底添加（２μＭ；４８時間）の後のＮｕＬｉ上皮またはＣｕＦｉ－１上皮における１０分間にわたるＨ１４ＣＯ３ －分泌の比率を示すグラフである（ｎ＝４～３８）。値は、ビヒクル処理されたＣｕＦｉ－１上皮に対して正規化した。図７Ｅは、ＮｕＬｉ（ＣＦＴＲ＋／＋）上皮におけるＡＳＬのｐＨに対するＡｍＢ（２μＭ；４８時間）の効果を示すグラフである（ｎ＝６～１４）。図７Ｆは、ＡｍＢ（２μＭ）の頂端添加ありとなしでのＣｕＦｉ－１上皮におけるＡＳＬのｐＨの差を時間の関数として示すグラフである（ｎ＝６～２８）。図７Ｇは、ＡｍＢまたはＣ３５ｄｅＯＡｍＢ（０．５μＭ；４８時間）の頂端添加後あるいはブメタニド（５００μΜ）の側底添加後のＮｕＬｉ（ＣＦＴＲ＋／＋）上皮またはＣｕＦｉ－１上皮における共焦点顕微鏡で定量化したＡＳＬの高さを示すグラフである（ｎ＝６～２１）。図７Ｈは、ＡＳＬのｐＨおよびＨ１４ＣＯ３ －分泌を示すグラフである。図７Ｉは、ビヒクル（ＦＣ－７２）の添加、ＡｍＢの頂端添加（２μＭ；４８時間）、またはＡｍＢの頂端添加（２μＭ、４８時間）およびウアバイン（１０ｍＭ）の側底添加後のＣｕＦｉ－１上皮を示すグラフである（ｎ＝６）。すべての化合物はＦＣ－７２中において投与した。すべての図において、測定値は別個のサンプルから取得し、グラフは平均±ＳＥＭを示す。ウェルチ補正ありまたはなしの両側の対応のないスチューデントのｔ検定およびＡＮＯＶＡを使用して、統計的有意性を評価した。パネル２ｄにおいて、＊はビヒクル対照と比較した統計的差異を示す；ＮＳは有意ではない；＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 図８Ａ～８Ｄは、一般に、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）が、培養ＣＦ気道上皮およびＣＦＴＲ-/-ブタにおいて、ＡＳＬのｐＨを高めたことを示す。図８Ａは、ＣｕＦｉ－１（ΔＦ５０８／ΔＦ５０８）上皮のＡＳＬのｐＨに対するＡｍＢまたは事前に形成されたＡｍＢ：コレステロール複合体の濃度依存的効果を示すグラフである（ｎ＝９～３１）。図８ＢはＣｕＦｉ－１（ΔＦ５０８／ΔＦ５０８）のＡＳＬのｐＨに対するＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）（ＦＣ－７２中１ｍｇ／ｍＬ）の効果を時間の関数として示すグラフである（ｎ＝９）。図８Ｃは、２時間後のＨ１４ＣＯ３ －分泌を示すグラフである（ｎ＝２０）。図８Ｄは、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）（ＦＣ－７２中１ｍｇ／ｍＬ）で少なくとも１時間処置したＣＦＴＲ－／－ブタのＡＳＬのｐＨをベースラインと比較して示すグラフである（ｎ＝４）。すべての図で、グラフは平均±ＳＥＭを示し、両側の対応のないスチューデントのｔ検定を使用して統計的有意性を評価した。図８Ａにおいて、＊は、ＡｍＢ処理上皮とＡｍＢ：コレステロール処理上皮との間の有意差を示す。図８Ｃにおいて、＊は、ビヒクル対照と比較した統計的差異を示す。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１。図８Ａ～８Ｃでは、測定値は別個のサンプルから得た。図８Ｄでは、同じブタを繰り返し測定した。 図９Ａ～９Ｉは、一般に、ＡｍＢが、脂質膜を通過してカリウム、ナトリウム、クロライド、プロトンおよびＨＣＯ３ －を輸送できることを示す。トレースは、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ添加後の最大イオン流出に対するパーセントを示す。図９Ａは、１：１０００のＡｍＢ：脂質に相当する［ＡｍＢ］またはＤＭＳＯビヒクルの添加後の、カリウム勾配の存在下でのＰＯＰＣ／１０％コレステロールリポソームからのカリウム流出を示すグラフである。図９Ｂは、１：１０００のＡｍＢ：脂質に相当する［ＡｍＢ］またはＤＭＳＯビヒクルの添加後の、ナトリウム勾配の存在下でのＰＯＰＣ／１０％コレステロールリポソームからのナトリウム流出を示すグラフである。図９Ｃは、１：１０００のＡｍＢ：脂質に相当する［ＡｍＢ］またはＤＭＳＯビヒクルの添加後の、クロライド勾配の存在下でのＰＯＰＣ／１０％コレステロールコレステロールリポソームからのクロライド流出を示すグラフである。図９Ｄは、１：１０００のＡｍＢ：脂質に相当する［ＡｍＢ］またはＤＭＳＯビヒクルの添加後の、ｐＨ勾配の存在下でのＰＯＰＣ／１０％コレステロールリポソームからのプロトン流出を示すグラフである。図９Ｅは１３Ｃ－ＮＭＲ実験の概略図である。図９Ｆは、ＡｍＢ、Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ、またはＤＭＳＯで処理したＨ１３ＣＯ３ －装填ＰＯＰＣ／１０％コレステロールリポソームの１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示すグラフである。ＮａＨ１３ＣＯ３ －はリポソーム内部に装填され、小胞内溶液はｐＨ７．５に緩衝され、一方小胞外溶液はｐＨ７．３に緩衝された。このｐＨの違いにより、小胞内ＨＣＯ３ －は、小胞外ＨＣＯ３ －と比べてより低磁場の化学シフトを示す。ＡｍＢ（１：１，０００のＡｍＢ：ＰＯＰＣ）の添加により小胞外ＨＣＯ３ －に対応する高磁場側の１３Ｃ信号が生成されるが、Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢまたはＤＭＳＯビヒクルの添加では生成されず、ＡｍＢがＨＣＯ３ －の流出を促進できることを実証する。図９Ｇは、高磁場信号が小胞外ＨＣＯ３ －に対応することを確認するスペクトルであり、ＨＣＯ３ －に結合して常磁性緩和促進（ＰＲＥ）を介して観測１３Ｃ信号をクエンチするＭｎ２＋を小胞外溶液に添加した。Ｍｎ２＋は、ＰＯＰＣ二重層に不透過性であるため、Ｍｎ２＋はリポソーム外部のＨＣＯ３ －に対応する信号のみに影響を及ぼすことができる。Ｍｎ２＋の添加は、ＡｍＢの添加により生成された高磁場信号を消滅させたが、小胞内ＨＣＯ３ －に対応する信号は消滅させず、ＡｍＢがＨＣＯ３ －の流出を引き起こすことを確認した。図９Ｈは、広い低磁場信号が小胞内ＨＣＯ３ －に対応することの確認を示すスペクトルであり、実験の終わりに、ＰＯＰＣリポソームをトリトンＸで溶解させた。図９Ｉは、ＡｍＢ媒介性のＨＣＯ３ －流出の代表的な時間経過を示すスペクトルである。各実行のデータを、０～１００％の全イオン放出に対するパーセントに正規化した。リポソーム懸濁液の溶解後、１３Ｃグルコース標準の積分と比較した小胞外ＨＣＯ３ －に対応する信号の積分を、１００％流出に対応するようにスケーリングした。ＡｍＢを添加した各実験の実行に関して、小胞外ＨＣＯ３ －に対応する信号を、各ＦＩＤの１３Ｃグルコース標準と比較して積分し、パーセント流出を時間の関数としてプロットした。図９Ａ～９Ｉでは、少なくとも３つの独立した実験からの代表的なスペクトルまたはグラフを示す。すべての図面において、測定値は別個のサンプルから取得した。 図１０Ａ～１０Ｅは、一般に、ＡｍＢ媒介性のｐＨ変化がＨＣＯ３ －依存性であり、ＡＳＬにおける主要陽イオン濃度を変化させないことを示す。図１０Ａは、ｐＨスタット滴定によって測定した、［ＡｍＢ］を高めて急性添加した後２０分間にわたるＣｕＦｉ－１（ΔＦ５０８／ΔＦ５０８）上皮における塩基分泌および酸吸収速度を示すグラフである（ｎ＝５～２３）。頂端側のｐＨを６．０の目的ｐＨに滴定した。スチューデントのｔ検定を使用して統計的有意性を評価した。図１０Ｂは、ＩＣＰ－ＭＳにより測定した、ＣｕＦｉ－１（ΔＦ５０８／ΔＦ５０８）のＡＳＬのＮａ＋濃度に対するＡｍＢ（２μＭ）またはＦＣ－７２ビヒクルの４８時間後の効果を示すグラフである（ｎ＝１６）。図１０Ｃは、ＩＣＰ－ＭＳで測定した、ＣｕＦｉ－１（ΔＦ５０８／ΔＦ５０８）のＡＳＬのＫ＋濃度に対するＡｍＢ（２μΜ）またはＦＣ－７２ビヒクルの４８時間後の効果を示すグラフである（ｎ＝１６）。図１０Ｄは、ＩＣＰ－ＭＳで測定した、ＣｕＦｉ－１（ΔＦ５０８／ΔＦ５０８）のＡＳＬの２４Ｍｇ２＋濃度に対するＡｍＢ（２μＭ）またはＦＣ－７２ビヒクルの４８時間後の効果を示すグラフである（ｎ＝１６）。図１０Ｅは、ＩＣＰ－ＭＳで測定した、ＣｕＦｉ－１（ΔＦ５０８／ΔＦ５０８）のＡＳＬのＣａ２＋濃度に対するＡｍＢ（２μＭ）またはＦＣ－７２ビヒクルの４８時間後の効果を示すグラフである（ｎ＝１６）。統計的有意性を評価するのに適切な場合は、ウェルチ補正ありまたはなしの両側の対応のないスチューデントのｔ検定およびＡＮＯＶＡを使用した。グラフは平均±ＳＥＭを示す。ＮＳは有意ではない；＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。すべての図面において、測定値は別個のサンプルから取得した。 １１Ａ～１１Ｋは、一般に、ＡｍＢ処理が持続し、野生型には効果がなく、ＣＦＴＲ活性の増大によるものではなく、膜の完全性を妨げず、かつ無毒性であることを示すグラフである。図１１Ａは、ＦＣ－７２ビヒクル添加に対して正規化された、放射性標識添加後１０分間にわたるＨ１４ＣＯ３ －の側底側緩衝液からＡＳＬへの移動に対する、ＣｕＦｉ－１（ΔＦ５０８／ΔＦ５０８）上皮の表面上に７日間放置されたＡｍＢ（２μΜ）またはＦＣ－７２ビヒクルの効果を示すグラフである（ｎ＝６～９）。図１１Ｂは、ＦＣ－７２ビヒクル添加に対して正規化された、放射性標識添加後１０分間にわたるＨ１４ＣＯ３ －の側底側緩衝液からＡＳＬへの移動に対する、ＣｕＦｉ－１（ΔＦ５０８／ΔＦ５０８）上皮の表面上に１４日間放置されたＡｍＢ（２μΜ）またはＦＣ－７２ビヒクルの効果を示すグラフである（ｎ＝６～９）。図１１Ｃは、ＦＣ－７２ビヒクル添加に対して正規化された、放射性標識添加後１０分間にわたるＨ１４ＣＯ３ －の側底側緩衝液からＡＳＬへの移動に対する、ＣｕＦｉ－１（ΔＦ５０８／ΔＦ５０８）上皮の表面上に２８日間放置されたＡｍＢ（２μΜ）またはＦＣ－７２ビヒクルの効果を示すグラフである（ｎ＝６～９）。図１１Ｄと１１Ｇは、ＮｕＬｉ（ＣＦＴＲ＋／＋）上皮において、１０μΜフォルスコリン／１００μΜ ＩＢＭＸ（ＦＩ）で処理してＣＦＴＲを活性化し、さらに１μΜのＣＦＴＲｉｎｈ－１７２で処理してＣＦＴＲを阻害した後の短絡電流（Ｉｓｃ）の変化を示すグラフとスペクトルである（ｎ＝６）。図１１Ｅと１１Ｈは、ＣｕＦｉ－１（ΔＦ５０８／ΔＦ５０８）上皮において、１０μΜフォルスコリン／１００μΜ ＩＢＭＸ（ＦＩ）でＣＦＴＲを活性化し、さらに１μΜのＣＦＴＲｉｎｈ－１７２でＣＦＴＲを阻害した後の短絡電流（Ｉｓｃ）の変化を示すグラフとスペクトルである（ｎ＝６）。図１１Ｆと１１Ｉは、ＡｍＢ（２μΜ；４８時間）で処理したＣｕＦｉ－１上皮において、１０μＭフォルスコリン／１００μΜ ＩＢＭＸ（ＦＩ）でＣＦＴＲを活性化し、さらに１μΜのＣＦＴＲｉｎｈ－１７２で処理してＣＦＴＲを阻害した後の短絡電流（Ｉｓｃ）の変化を示すグラフとスペクトルである（ｎ＝６）。図１１Ｊは、ＣｕＦｉ－１上皮における経上皮電気抵抗（Ｒｔ）が、ビヒクルでの処理または用量を高めたＡｍＢでの処理の間で、単回処理の後の増加期間にわたり相違しなかったことを示すグラフである（ｎ＝９）。図１１Ｋは、単回のＡｍＢまたはビヒクルでの処理後の増加期間にわたりＣｕＦｉ－１上皮におけるラクターゼデヒドロゲナーゼの検出によって測定した細胞毒性を示すグラフであり、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘによる全細胞溶解に対するパーセントとして表される。ビヒクルと比較して、ＡｍＢ処理は細胞毒性を高めなかった（ｎ＝９～１２）。図１１Ａ～１１Ｃでは、両側の対応のないスチューデントのｔ検定を使用して統計的有意性を評価した。図１１Ｈ～１１Ｊでは、少なくとも３つの独立した実験からの代表的なグラフを示す。図１１Ａ～１１Ｆ、１１Ｊおよび１１Ｋは、平均±ＳＥＭを表わす。ＮＳは有意ではない；＊＊＊ビヒクル対照に対してｐ≦０．００１。すべての図面において、測定値は別個のサンプルから取得した。 図１２Ａ～１２Ｅは、一般に、ＡｍＢがＡＳＬの高さを高めることを示す。図１２Ａは、ＮｕＬｉ（ＣＦＴＲ＋／＋）上皮における、共焦点顕微鏡によって画像化されたＡＳＬの高さを示す画像である。図１２Ｂは、ＣｕＦｉ－１上皮における、共焦点顕微鏡によって画像化されたＡＳＬの高さを示す画像である。図１２Ｃは、ＡｍＢを頂端添加したＣｕＦｉ－１上皮における、共焦点顕微鏡によって画像化されたＡＳＬの高さを示す画像である。図１２Ｄは、ブメタニド（５００μＭ）を側底添加したＮｕＬｉ上皮における、共焦点顕微鏡によって画像化されたＡＳＬの高さを示す画像である。図１２Ｅは、ブメタニド（５００μΜ）を側底添加したＡｍＢ処理ＣｕＦｉ－１上皮における、共焦点顕微鏡により画像化されたＡＳＬの高さを示す画像である。少なくとも８つの独立した実験からの代表的な画像を示す。すべての図面において、測定値は別個のサンプルから取得した。スケールバーは１０μｍを表す。 図１３Ａ～１３Ｇは、一般に、ＡｍＢが、ＣＦのドナーからの初代ヒト気道上皮のＡＳＬのｐＨおよび抗菌活性を回復することを示す。図１３Ａは、ＡＳＬのｐＨアッセイにおける、患者ドナーの遺伝子型とΔｐＨ測定値を示す表である。図１３Ｂは、異なるＣＦＴＲ変異を有するＣＦのヒトに由来する初代培養気道上皮のＡＳＬの平均ｐＨに対する、ＡｍＢ（２μＭ；４８時間）、Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ（２μΜ；４８時間）、およびＡｍＢ（２μΜ；４８時間）の側底添加の効果を示すグラフである（ｎ＝３～９）。図１３Ｃは、非ＣＦ上皮のＡＳＬのｐＨに対するＡｍＢ（２μＭ；４８時間）の効果を示すグラフである（ｎ＝７）。図１３Ｄは、ＡＳＬの粘度アッセイにおける患者ドナーの遺伝子型を示す表である。図１３Ｅは、ＡＳＬの抗菌活性アッセイにおける患者ドナーの遺伝子型を示す表である。図１３Ｆは、広範囲のＣＦＴＲ変異を有するＣＦのヒト由来の初代培養気道上皮の平均ＡＳＬ抗菌活性に対するＡｍＢ（２μＭ；４８時間）およびＣ３５ｄｅＯＡｍＢ（２μΜ；４８時間）の効果を示すグラフである（ｎ＝５～８）。抗菌活性は、ＡＳＬへの曝露後に殺された黄色ブドウ球菌の割合（％）によって測定する。図１３Ｇは、生理食塩水と比較して、ＡｍＢ（２μΜ）単独で黄色ブドウ球菌を殺す能力を示すグラフである（ｎ＝３６）。図１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｆおよび１３Ｇにおいて、ウェルチ補正ありまたはなしの両側の対応のないスチューデントのｔ検定およびＡＮＯＶＡを使用して、統計的有意性を評価した。グラフは平均±ＳＥＭを示す。ＮＳは有意ではない；＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。すべての図面において、測定値は別個のサンプルから取得した。 図１４Ａ～１４Ｃは、一般に、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）が、経上皮Ｈ１４ＣＯ３ －分泌およびＡＳＬのｐＨを時間および用量依存的に高めることを示す。図１４Ａは、ＰＯＰＣ／１０％コレステロール脂質膜を横断するＨ１３ＣＯ３ －輸送に対する、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）（１：１０００のＡｍＢ：脂質比）、ＡｍＢ：Ｃｈｏｌ（ＤＭＳＯ中１：１０００のＡｍＢ：脂質比）、および滅菌水またはＤＭＳＯビヒクルの効果を示すグラフである。図１４Ｂは、ＦＣ－７２ビヒクル添加に対して正規化された、ＣｕＦｉ－１（ΔＦ５０８／ΔＦ５０８）における、放射性標識添加後１０分間にわたるＨ１４ＣＯ３ －の側底側緩衝液からＡＳＬへの移動に対する、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）（１ｍｇ／ｍＬ；４８時間）またはＦＣ－７２ビヒクルの効果を示すグラフである（ｎ＝１６）。図１４Ｃは、ビヒクル対照と比較した、ＣｕＦｉ－１上皮のＡＳＬのｐＨに対する、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）（１ｍｇ／ｍＬ；４８時間）の濃度増加の効果を示すグラフである（ｎ＝６～９）。図１４Ａでは、少なくとも３つの独立した実験からの代表的なグラフを示す。図１４Ｂおよび１４Ｃにおいて、両側の対応のないスチューデントのｔ検定およびＡＮＯＶＡを使用して統計的有意性を評価した。グラフは平均±ＳＥＭを示す。ビヒクル対照に対して、ＮＳは有意ではない；＊Ｐ≦０．０５；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。図１４Ｃでは、Δおよび統計は、ＦＣ－７２ビヒクル対照と比較する。図１４Ｂ～１４Ｃにおいて、測定値は別個のサンプルから取得した。図１４Ａでは、各実験について同じサンプルを経時的に繰り返し測定した。
気道表面液（ＡＳＬ）のｐＨの維持は、肺の生理学的機能に不可欠であり、非胃型Ｈ＋／Ｋ＋アデノシントリホスファターゼＡＴＰ１２Ａを介したプロトン排出とＣＦＴＲを介した重炭酸イオン分泌とのバランスを必要とする（３、４）。緑膿菌などの呼吸器病原体も、モノカルボン酸乳酸－Ｈ＋共輸送体を介してプロトンを分泌することにより、ＡＳＬの酸性化に寄与することができ、そのプロセスは、正常な気道では重炭酸イオン分泌によって相殺されるがＣＦではそうではない（５）。したがって、ＣＦＴＲの損失は、ｐＨの低下を引き起こし、それによってＡＳＬ粘度が上昇し、ｐＨ感受性抗菌タンパク質の活性が低下し（３、６）、ＣＦ患者の罹患率と死亡率の原因となる慢性気道感染症に寄与する（４、７）。エアロゾル化した重炭酸イオンまたは緩衝液をＣＦ上皮に投与すると、ＡＳＬをアルカリ化し、粘度および抗菌活性を正常化することができる。しかしながら、これらの効果は一時的であり、ｐＨは１時間以内にベースライン値に戻る（３、８）。
Ｎａ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅを含む側底膜上のポンプおよびチャネルの堅牢なネットワークは、通常、経上皮重炭酸イオン輸送を駆動します（図１、パネルＡ）。ＣＦＴＲが存在しない場合、重炭酸イオンは側底膜を通って細胞内に送り込まれ続けるが、頂端放出は低減され、アルカリ化された細胞内ｐＨをもたらす（９、１０）。これにより、頂端膜を挟んで大きなｐＨ勾配が生じる（図１、パネルＢ）。本発明者らは、驚くべきことに、重炭酸イオンに対する頂端膜の小分子媒介性の透過化が、ＣＦ上皮のＡＳＬのｐＨを高めることを発見した。さらに、本発明者らは、この透過化が、経上皮重炭酸イオン輸送を駆動および調節する堅牢なタンパク質ネットワークと機能的に統合され、それによってＣＦＴＲの無秩序で比較的非選択的な代替物によるＡＳＬの生理機能の実質的な回復を可能にすることを特定した（図１、パネルＣ）。
したがって、一部の実施形態では、ＣＦ上皮に導入された小分子イオンチャネルは、プロトン吸収、重炭酸イオン分泌、またはその両方を介して、ＣＦ肺上皮のＡＳＬの生理学的特徴を回復することができる。このような分子補綴アプローチは、ＣＦ遺伝子型に依存せず、すなわちＣＦにおけるＣＦＴＲ発現の低下またはＣＦＴＲ機能の低下の根底にある遺伝子変異の正確な性質とは無関係である。
アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）は、酵母細胞などの真核細胞をカリウムや他のイオンに対して透過性にすることができる。Ermishkin LN et al. (1977) Biochim Biophys Acta 470(3): 357-367。ＡｍＢは酵母に対して非常に毒性でもあり、この毒性はその膜透過化と密接に関連していると考えられていた。しかしながら、Ｃ３５の単一酸素原子を欠くＡｍＢの合成誘導体（Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ）はイオンチャネルを形成せず、それでも強力な抗真菌活性を維持することが分かった。Gray KC et al. (2012) Proc Natl Acad Sci USA 109(7): 2234-2239。さらなる研究により、ＡｍＢが主にステロールに結合してそれを膜から抜き取ることにより酵母を殺し、ＡｍＢの量がエルゴステロールの量を超えた場合にのみ細胞毒性を示すことが明らかになった。Anderson TM et al. (2014) Nat Chem Biol 10(5): 400-406。チャネル形成は必要とされない。これにより、低用量での投与および／またはステロールとの事前の複合体化(pre-complexation)により、ＡｍＢのイオンチャネル活性をその殺細胞活性と分離することが可能となった。ＡｍＢは、タンパク質イオンチャネル欠損酵母の成長を回復させることができる。成長の救済が観察される用量範囲は、ＡｍＢを、酵母の主要なステロールであるエルゴステロールと事前に複合体化させた場合に、１桁以上拡大させることができる。非チャネル形成バリアントＣ３５ｄｅＯＡｍＢは、試験したいずれの濃度でも酵母の成長を救済できなかった。
一部の実施形態では、ＡｍＢおよびステロールでの処置は、ＣＦ由来の初代肺上皮においてＡＳＬのｐＨ、粘度、および抗菌活性のうちの１つ以上を救済する。
ここで詳細に説明するように、ヒト気道において経上皮重炭酸イオン輸送を駆動する細胞メカニズムは、ＣＦＴＲの不完全な模倣物を、遺伝子型非依存的な様式でＡＳＬの生理機能の重要な側面を回復させるのに十分なものにすることができる。小分子チャネルは、この堅牢なタンパク質ベースの重炭酸イオン輸送経路に機能的に統合され、ＡｍＢチャネルとＮａ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅとの特定の交差は、欠損タンパク質の小分子代替物が真核細胞における堅牢な自己調節メカニズムと連携できる例の増大するリストを増やす（２０、２３）。本明細書に記載の実験は、他のイオン輸送体の調節（３４、３５）を含めて、ＡｍＢによって複製されないＣＦＴＲの代替活性が、ＡＳＬのｐＨ、粘度、および抗菌特性の維持に必要とされないことを示す。この結果は、これらの代替活性が重要である可能性が高いことを示す以前の報告（３４、３５）に照らして、驚くべきことである。総合的に、これらの結果は、頂端膜の重炭酸イオン透過化を促進する小分子を使用して、ＣＦの遺伝子型非依存性の救済のロードマップを示唆する。ＡｍＢがエアロゾル化形態で肺に安全に送達される臨床的に承認された薬物であること（３２）、ＡｍＢｉｓｏｍｅが、アムホテリシン、コレステロール、および他の脂質と塩を含む臨床的に承認された混合物であること、そしてその天然物の合成誘導体化が対応イオンチャネルのコンダクタンスおよび選択性を変更することが最近示されたこと（３３）は注目に値する。
したがって、ある実施形態では、ＡｍＢとステロールは一緒に、例えばＡｍＢとステロールとで事前に形成された複合体は、ＣＦ患者の肺におけるＡＳＬのｐＨを高め、それによりこれら患者の気道抗菌活性および気道防御を改善するのに有効である。ある実施形態では、ＡｍＢ：ステロールのモル比は、１：１～約１：１５の範囲である。
ある実施形態において、本発明の方法は、ＡｍＢの点滴静注用の滅菌凍結乾燥製剤である注射用ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）(Ａｓｔｅｌｌａｓ Ｐｈａｒｍａ ＵＳ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｔｈｂｒｏｏｋ，ＩＬ)を利用する。各バイアルは、およそ２１３ｍｇの水素添加大豆ホスファチジルコリン；５２ｍｇのコレステロール、８４ｍｇのジステアロイルホスファチジルグリセロール；０．６４ｍｇのα－トコフェロールからなるリポローム膜中に挿入された５０ｍｇのアムホテリシンＢを、９００ｍｇのスクロース、および緩衝剤としての２７ｍｇのコハク酸二ナトリウム六水和物と共に含む。この製品におけるＡｍＢのコレステロールに対するモル比は約１：２．５である。
発明の方法
一態様では、嚢胞性線維症を治療する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の（ｉ）アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、および（ｉｉ）ステロールまたはその薬学的に許容される塩を併せて投与し、それにより嚢胞性線維症を治療することを含む方法を本明細書で提供する。
本明細書で用いられる場合、用語「治療する」および「治療」とは、（ａ）状態または疾患を発症するリスクを有するまたは状態または疾患に罹患する素因を有するがまだ状態または疾患に罹患しているとは診断されていない対象において、状態または疾患が生じることを予防する；（ｂ）例えばその発症を遅延または停止させるなど、状態または疾患を抑制する；または、（ｃ）例えば状態または疾患の退縮を生じるなど、状態または疾患を軽減または改善する；といった結果をもたらす介入を行うことを指す。一実施形態では、用語「治療する」および「治療」は、（ａ）例えばその発症を遅延または停止させるなど、状態または疾患を抑制する；または、（ｂ）例えば状態または疾患の退縮を生じるなど、状態または疾患を軽減または改善する；といった結果をもたらす介入を行うことを指す。
本明細書で用いられる場合、「患者」とは、生きた哺乳動物を指す。さまざまな実施形態において、患者は非ヒト哺乳動物であり、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、ウシ、または非ヒト霊長類を含むがそれらに限定はされない。ある実施形態では、患者はヒトである。
本明細書で用いられる場合、語句「有効量」は、所望の生物学的効果を達成するのに十分な任意の量を意味する。
本明細書で用いられる場合、語句「治療有効量」は、例えば、嚢胞性線維症を治療するなど、所望の治療効果を達成するのに十分な任意の量を意味する。
ある実施形態では、ステロールは、コレステロール、カンペステロール、β－シトステロール、２４－イソプロピルコレステロール、ニカステロール、ラノステロール、７－デヒドロコレステロール、デスモステロール、４－メチルコレスタン－８（１４），２４－ジエン－３β－オール、ゴルゴステロール、ジノステロール、２４Ｓ－ヒドロキシコレステロール、５α－コレスタン－ヘキサオール、シクロアルテノール、スチグマステロール、フコステロール、エルゴステロール、アントロステロール、サリンゴステロール、シトステロール、コプロスタノール、アベナステロール、ジヒドロコレステロール、スチグマスタノール、カンペスタノール、ブラシカステロール、およびルペオールからなる群より選択される。
ある実施形態では、ステロールはコレステロールではなく、ＡｍＢとステロールは、約１：１～約１：１５の範囲のモル比で投与される。
ある実施形態では、ステロールはコレステロールではなく、ＡｍＢとステロールは、約１：１～約１：１２の範囲のモル比で投与される。ある実施形態では、ＡｍＢとステロールは、約１：１～約１：１０の範囲のモル比で投与される。
ある実施形態では、ステロールはコレステロールではなく、ＡｍＢとステロールのモル比は約１：１～約１：１４である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：１３である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：１１である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：９である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：８である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：７である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：６である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：５である。ステロールがコレステロールではないある実施形態では、モル比は約１：２～約１：１２である。このようなある実施形態では、モル比は約１：２～約１：１０である。このようなある実施形態では、モル比は約１：２～約１：９である。このようなある実施形態では、モル比は約１：２～約１：８である。このようなある実施形態では、モル比は約１：２～約１：７である。このようなある実施形態では、モル比は約１：２～約１：６である。そのようなある実施形態では、モル比は約１：２～約１：５である。
ある実施形態では、ステロールはコレステロールではなく、ＡｍＢとステロールは、約１：１～約１：５の範囲のモル比で投与される。このようなある実施形態では、ステロールはコレステロールではなく、ＡｍＢとステロールは、約１：３～約１：５の範囲のモル比で投与される。
あるいは、他の実施形態では、ステロールはコレステロールである。
ステロールがコレステロールであるいくつかの実施形態では、ＡｍＢとステロールは、約１：１～約１：２．５の範囲のモル比、好ましくは約１：２．５のモル比で投与される。
ある実施形態では、ステロールはエルゴステロールではない。
ステロールがエルゴステロールであるいくつかの実施形態では、ＡｍＢとステロールは、約１：１～約１：２．５の範囲のモル比で投与され、好ましくは、モル比は約１：２．５である。
ある実施形態では、ＡｍＢとステロールは、別個の医薬組成物として投与される。
ＡｍＢとステロールの別個の医薬組成物は同時に投与してもよい。
あるいは、ＡｍＢとステロールの別個の医薬組成物は異なる時に投与してもよい。例えば、一部の実施形態では、ステロールは、ＡｍＢの前または後の約５分以内～約１６８時間以内に投与される。
他の実施形態では、ＡｍＢとステロールは、単一の医薬組成物で投与され、すなわち、ＡｍＢとステロールは単一の医薬組成物中に処方される。
ある実施形態では、ＡｍＢとステロールは複合体として存在する。
ある実施形態では、ＡｍＢおよびステロールは全身投与される。
ある実施形態では、ＡｍＢおよびステロールは静脈内投与される。
ある実施形態では、組成物は対象の気道に投与される。例えば、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）によってまたはエアロゾルによって、組成物を対象の気道に投与することができる。本明細書で用いられる場合、「対象の気道」とは、以下の肺構造のいずれかまたはすべてを指す：気管、気管支、細気管支、肺胞。ある実施形態では、対象の気道は、いわゆる誘導気道（conducting airway）、すなわち以下の肺構造のいずれかまたはすべてを指す：気管、気管支、および細気管支。
ある実施形態では、ＡｍＢおよびステロールは、対象の気道にエアロゾルとして投与される。
ＣＦ患者において１９００を超える異なるＣＦＴＲ変異が見いだされ、そのうち数百は、少なくとも５つの異なる機能損失メカニズムを介して疾患を引き起こすことが確認されている。ＣＦＴＲの特定の変異型に結合しそれによってその活性を高める遺伝子型特異的小分子薬剤の開発に最近重要な進歩があった。しかしながら、全ＣＦ患者のほぼ半数は、現在の小分子治療に応答しないＣＦＴＲ遺伝子型を有する。これらには、機能的ＣＦＴＲタンパク質の完全な欠如をもたらす主要なトランケーション、および機能欠損の機構的基礎が不明である非常に稀な変異が含まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の任意の方法は、クラスＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、Ｕ、およびそれらの組合せからなる群より選択される嚢胞性線維症の変異クラスを治療する。一部の実施形態では、変異クラスは、Ｉ／Ｉ、ＩＩ／ＩＩ、ＩＩ／Ｕ、およびＵ／ＩＩＩからなる群より選択される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかは遺伝子型に依存しない治療である。
本明細書で使用される場合、「遺伝子型に依存しない（genotype-independent）」または「遺伝子型非依存性（genotype-agnostic）」という語句は、ＣＦにおけるＣＦＴＲ発現の低下またはＣＦＴＲ機能の低下の根底にある遺伝的変異の正確な性質とは無関係の任意の治療を指す。
ある実施形態では、患者は、ＣＴＦＲ陰イオンチャネルに２つの変異を有し、その２つの変異は、それぞれ独立して表１から選択される。
Figure 0007355335000001
Figure 0007355335000002
Figure 0007355335000003
ある実施形態では、患者は、ＣＴＦＲ陰イオンチャネルに２つの変異を有し、その２つの変異は、それぞれ独立して、２１８４ｄｅｌＡ、Ｆ５０８ｄｅｌ、Ｖ５２０Ｆ、１７１７－１Ｇ－＞Ａ、Ｅ６０Ｘ、Ｇ５５１Ｄ、Ｒ５５３Ｘ、およびＤ２５９Ｇから選択される。
ある実施形態では、患者は、Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｆ５０８ｄｅｌ、Ｇ５５１Ｄ／Ｆ５０８ｄｅｌ、Ｒ５５３Ｘ／Ｅ６０Ｘ、Ｆ５０８ｄｅｌ／１７１７－１Ｇ－＞Ａ、Ｆ５０８ｄｅｌ／２１８４ｄｅｌＡ、およびＤ２５９Ｇ／Ｖ５２０Ｆから選択される一対のＣＴＦＲ変異を有する。
ある実施形態では、患者は、Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｆ５０８ｄｅｌ、Ｒ５５３Ｘ／Ｅ６０Ｘ、Ｆ５０８ｄｅｌ／１７１７－１Ｇ－＞Ａ、Ｆ５０８ｄｅｌ／２１８４ｄｅｌＡ、およびＤ２５９Ｇ／Ｖ５２０Ｆから選択される一対のＣＴＦＲ変異を有する。
ある実施形態では、本発明の方法は、従来のＣＦ治療薬による治療に対して典型的に不応答性（non-responsive）または最小応答性（minimally-responsive）である様々なＣＦ遺伝子型の治療において有用である。例えば、ＣＴＦＲ変異のＤ２５９Ｇ／Ｖ５２０Ｆペアを有する患者のＶ５２０Ｆ対立遺伝子は、イバカフトールによる治療に不応性（refractory）である。
したがって、ある実施形態では、本明細書に記載の嚢胞性線維症を治療する方法は、ＣＦ遺伝子型にとらわれない。
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法のいずれかは、不応性または抵抗性の嚢胞性線維症を治療する。一部の実施形態では、嚢胞性線維症は、１つ以上の嚢胞性線維症治療に対して不応性または抵抗性である。
ある実施形態では、嚢胞性線維症はイバカフトールによる治療に不応性である。
一部の実施形態では、嚢胞性線維症を治療する方法は、治療有効量の抗生物質を患者に投与することをさらに含む。
ある態様では、嚢胞性線維症の患者の気道表面液のｐＨを高める方法であって、嚢胞性線維症の患者に、治療有効量の（ｉ）アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）またはその薬学的に許容される塩もしくはその水和物、および（ｉｉ）ステロールまたはその薬学的に許容される塩を投与し、それにより嚢胞性線維症の患者の気道表面液のｐＨを高めることを含む方法を本明細書において提供する。
対象における気道表面液（ＡＳＬ）のｐＨは、当業者に知られている任意の技術を用いて測定することができる。例えば、気道ｐＨは、気管表面に平面ｐＨ感受性プローブを設置することによって測定することができる。Pezzulo AA et al. (2012) Nature 487: 109-113。
対象におけるＡＳＬのｐＨは、非処置対象のＡＳＬのｐＨよりも測定可能な程度高い場合に高められたという。一実施形態では、対象におけるＡＳＬのｐＨは、本発明の方法による処置の前または処置から一定期間おいて測定された同じ対象のＡＳＬのｐＨよりも測定可能な程度高い場合に高められたという。
気道表面液のｐＨを高めるそのような方法は実施例２に記載されている。驚くべきことに、ＡＳＬのｐＨの救済は、広範囲のＡｍＢ：ステロール濃度で観察される。したがって、本明細書に記載のＡＳＬのｐＨを高める方法は、臨床応用に重要な意義を有する。
ある実施形態では、ｐＨの上昇は０．０１ｐＨ単位～２．０ｐＨ単位であってよい。ある実施形態では、ｐＨの上昇は０．０１ｐＨ単位～１．０ｐＨ単位であってよい。ある実施形態では、ｐＨの上昇は０．０１ｐＨ単位～０．５ｐＨ単位であってよい。ある実施形態では、ｐＨの上昇は０．０１ｐＨ単位～０．４ｐＨ単位であってよい。ある実施形態では、ｐＨの上昇は０．０１ｐＨ単位～０．３ｐＨ単位であってよい。ある実施形態では、ｐＨの上昇は０．０１ｐＨ単位～０．２ｐＨ単位であってよい。ある実施形態では、ｐＨの上昇は０．０１ｐＨ単位～０．１ｐＨ単位であってよい。
一部の実施形態では、ｐＨの上昇は、本明細書に記載の組成物のいずれか１つの頂端添加による。
一部の実施形態では、ＡＳＬのｐＨの上昇は、頂端溶液のアルカリ化に相関する。一部の実施形態では、頂端溶液のアルカリ化は重炭酸イオン依存性である。一部の実施形態では、頂端チャンバのアルカリ化の増進は、側底の重炭酸イオンの存在下で生じる。
一部の実施形態では、ＡＳＬのｐＨの上昇は、ＣＦＴＲ活性／表面へのトラフィッキング（輸送）を高めるまたは膜の完全性を破壊することによるものではない。
ある実施形態では、ステロールは、コレステロール、カンペステロール、β－シトステロール、２４－イソプロピルコレステロール、ニカステロール、ラノステロール、７－デヒドロコレステロール、デスモステロール、４－メチルコレスタン－８（１４），２４－ジエン－３β－オール、ゴルゴステロール、ジノステロール、２４Ｓ－ヒドロキシコレステロール、５α－コレスタン－ヘキサオール、シクロアルテノール、スチグマステロール、フコステロール、エルゴステロール、アントロステロール、サリンゴステロール、シトステロール、コプロスタノール、アベナステロール、ジヒドロコレステロール、スチグマスタノール、カンペスタノール、ブラシカステロール、およびルペオールからなる群より選択される。
ある実施形態では、ステロールはコレステロールではなく、ＡｍＢとステロールは約１：１～約１：１５の範囲のモル比で投与される。
ある実施形態では、ステロールはコレステロールではなく、ＡｍＢとステロールは約１：１～約１：１２の範囲のモル比で投与される。ある実施形態では、ＡｍＢとステロールは約１：１～約１：１０の範囲のモル比で投与される。
ある実施形態では、ステロールはコレステロールではなく、ＡｍＢとステロールのモル比は約１：１～約１：１４である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：１３である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：１１である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：９である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：８である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：７である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：６である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：５である。ステロールがコレステロールではないある実施形態では、モル比は約１：２～約１：１２である。このようなある実施形態では、モル比は約１：２～約１：１０である。このようなある実施形態では、モル比は約１：２～約１：９である。このようなある実施形態では、モル比は約１：２～約１：８である。そのようなある実施形態では、モル比は約１：２～約１：７である。このようなある実施形態では、モル比は約１：２～約１：６である。そのようなある実施形態では、モル比は約１：２～約１：５である。
ある実施形態では、ステロールはコレステロールではなく、ＡｍＢとステロールは、約１：１～約１：５の範囲のモル比で投与される。このようなある実施形態では、ステロールはコレステロールではなく、ＡｍＢとステロールは、約１：３～約１：５の範囲のモル比で投与される。
あるいは、他の実施形態では、ステロールはコレステロールである。
ステロールがコレステロールであるいくつかの実施形態では、ＡｍＢとステロールは、約１：１～約１：２．５の範囲のモル比、好ましくは約１：２．５のモル比で投与される。
ある実施形態では、ステロールはエルゴステロールではない。
ステロールがエルゴステロールであるいくつかの実施形態では、ＡｍＢとステロールは、約１：１～約１：２．５の範囲のモル比、好ましくは約１：２．５のモル比で投与される。
ある実施形態では、ＡｍＢとステロールは、別個の医薬組成物として投与される。
ＡｍＢとステロールの別個の医薬組成物は同時に投与してもよい。
あるいは、ＡｍＢとステロールの別個の医薬組成物は異なる時に投与してもよい。例えば、一部の実施形態では、ステロールは、ＡｍＢの前または後の約５分以内～約１６８時間以内に投与される。
他の実施形態では、ＡｍＢとステロールは、単一の医薬組成物で投与される、すなわち、ＡｍＢとステロールは単一の医薬組成物中に処方される。
ある実施形態では、ＡｍＢとステロールは複合体として存在する。
ある実施形態では、ＡｍＢおよびステロールは全身投与される。
ある実施形態では、ＡｍＢおよびステロールは静脈内投与される。
ある実施形態では、ＡｍＢおよびステロールは対象の気道に投与される。例えば、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）によってまたはエアロゾルによって、対象の気道に組成物を投与することができる。本明細書で使用される場合、「対象の気道」とは、以下の肺構造のいずれかまたはすべてを指す：気管、気管支、細気管支、肺胞。ある実施形態では、対象の気道は、いわゆる誘導気道、すなわち、以下の肺構造のいずれかまたはすべてを指す：気管、気管支、および細気管支。
ある実施形態では、ＡｍＢおよびステロールは、対象の気道にエアロゾルとして投与される。
ある実施形態では、患者は、ＣＴＦＲ陰イオンチャネルに２つの変異を有し、２つの変異は、それぞれ独立して上記の表１から選択される。
ある実施形態では、患者は、ＣＴＦＲ陰イオンチャネルに２つの変異を有し、その２つの変異は、それぞれ独立して、２１８４ｄｅｌＡ、Ｆ５０８ｄｅｌ、Ｖ５２０Ｆ、１７１７－１Ｇ－＞Ａ、Ｅ６０Ｘ、Ｇ５５１Ｄ、Ｒ５５３Ｘ、およびＤ２５９Ｇから選択される。
ある実施形態では、患者は、Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｆ５０８ｄｅｌ、Ｇ５５１Ｄ／Ｆ５０８ｄｅｌ、Ｒ５５３Ｘ／Ｅ６０Ｘ、Ｆ５０８ｄｅｌ／１７１７－１Ｇ－＞Ａ、Ｆ５０８ｄｅｌ／２１８４ｄｅｌＡ、およびＤ２５９Ｇ／Ｖ５２０Ｆから選択される一対のＣＴＦＲ変異を有する。
ある実施形態では、患者は、Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｆ５０８ｄｅｌ、Ｒ５５３Ｘ／Ｅ６０Ｘ、Ｆ５０８ｄｅｌ／１７１７－１Ｇ－＞Ａ、Ｆ５０８ｄｅｌ／２１８４ｄｅｌＡ、およびＤ２５９Ｇ／Ｖ５２０Ｆから選択される一対のＣＴＦＲ変異を有する。
ある実施形態では、本発明の方法は、従来のＣＦ治療薬による治療に対して典型的に不応答性または最小応答性である様々なＣＦ遺伝子型のいずれか１つを有する患者の気道表面液のｐＨを高めるのに有用である。
したがって、ある実施形態では、本明細書に記載のＡＳＬのｐＨを高める方法は、患者のＣＦ遺伝子型にとらわれない。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかは、不応性または抵抗性の嚢胞性線維症の患者のＡＳＬのｐＨを高める。一部の実施形態では、嚢胞性線維症は、イバカフトールなどの１つまたは複数の嚢胞性線維症治療薬に対して不応性または抵抗性である。
一部の実施形態では、その方法は、治療有効量の抗生物質を患者に投与することをさらに含む。
ある態様では、嚢胞性線維症の患者の気道表面液の粘度を低下させる方法であって、嚢胞性線維症の患者に、治療有効量の（ｉ）アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、および（ｉｉ）ステロールまたはその薬学的に許容される塩を投与し、それにより嚢胞性線維症の患者の気道表面液の粘度を低下させることを含む方法を本明細書で提供する。
ある実施形態では、ステロールは、コレステロール、カンペステロール、β－シトステロール、２４－イソプロピルコレステロール、ニカステロール、ラノステロール、７－デヒドロコレステロール、デスモステロール、４－メチルコレスタン－８（１４），２４－ジエン－３β－オール、ゴルゴステロール、ジノステロール、２４Ｓ－ヒドロキシコレステロール、５α－コレスタン－ヘキサオール、シクロアルテノール、スチグマステロール、フコステロール、エルゴステロール、アントロステロール、サリンゴステロール、シトステロール、コプロスタノール、アベナステロール、ジヒドロコレステロール、スチグマスタノール、カンペスタノール、ブラシカステロール、およびルペオールからなる群より選択される。
ある実施形態では、ステロールはコレステロールではなく、ＡｍＢとステロールは、約１：１～約１：１５の範囲のモル比で投与される。
ある実施形態では、ステロールはコレステロールではなく、ＡｍＢとステロールは約１：１～約１：１２の範囲のモル比で投与される。ある実施形態では、ＡｍＢとステロールは約１：１～約１：１０の範囲のモル比で投与される。
ある実施形態では、ステロールはコレステロールではなく、ＡｍＢとステロールのモル比は約１：１～約１：１４である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：１３である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：１１である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：９である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：８である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：７である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：６である。このようなある実施形態では、モル比は約１：１～約１：５である。ステロールがコレステロールではないある実施形態では、モル比は約１：２～約１：１２である。このようなある実施形態では、モル比は約１：２～約１：１０である。このようなある実施形態では、モル比は約１：２～約１：９である。このようなある実施形態では、モル比は約１：２～約１：８である。このようなある実施形態では、モル比は約１：２～約１：７である。このようなある実施形態では、モル比は約１：２～約１：６である。このようなある実施形態では、モル比は約１：２～約１：５である。
ある実施形態では、ステロールはコレステロールではなく、ＡｍＢとステロールは、約１：１～約１：５の範囲のモル比で投与される。このようなある実施形態では、ステロールはコレステロールではなく、ＡｍＢとステロールは約１：３～約１：５の範囲のモル比で投与される。
あるいは、他の実施形態では、ステロールはコレステロールである。
ステロールがコレステロールであるいくつかの実施形態では、ＡｍＢとステロールは、約１：１～約１：２．５の範囲のモル比、好ましくは約１：２．５のモル比で投与される。
ある実施形態では、ステロールはエルゴステロールではない。
ステロールがエルゴステロールであるいくつかの実施形態では、ＡｍＢとステロールは、約１：１～約１：２．５の範囲のモル比、好ましくは約１：２．５のモル比で投与される。
ある実施形態では、ＡｍＢとステロールは、別個の医薬組成物として投与される。
ＡｍＢとステロールの別個の医薬組成物は同時に投与してもよい。
あるいは、ＡｍＢとステロールの別個の医薬組成物は、異なる時に投与してもよい。例えば、一部の実施形態では、ステロールは、ＡｍＢの前または後の約５分以内～約１６８時間以内に投与される。
他の実施形態では、ＡｍＢとステロールは、単一の医薬組成物で投与され、すなわち、ＡｍＢとステロールは単一の医薬組成物中に処方される。
ある実施形態では、ＡｍＢとステロールは複合体として存在する。
ある実施形態では、ＡｍＢおよびステロールは全身投与される。
ある実施形態では、ＡｍＢおよびステロールは静脈内投与される。
ある実施形態では、ＡｍＢおよびステロールは対象の気道に投与される。例えば、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）によってまたはエアロゾルによって、組成物を対象の気道に投与することができる。本明細書で使用される場合、「対象の気道」とは、以下の肺構造のいずれかまたはすべてを指す：気管、気管支、細気管支、肺胞。ある実施形態では、対象の気道は、いわゆる誘導気道、すなわち、以下の肺構造のいずれかまたはすべてを指す：気管、気管支、および細気管支。
ある実施形態では、ＡｍＢおよびステロールは、対象の気道にエアロゾルとして投与される。
ある実施形態では、患者は、ＣＴＦＲ陰イオンチャネルに２つの変異を有し、その２つの変異は、それぞれ独立して上記の表１から選択される。
ある実施形態では、患者は、ＣＴＦＲ陰イオンチャネルに２つの変異を有し、その２つの変異は、それぞれ独立して、２１８４ｄｅｌＡ、Ｆ５０８ｄｅｌ、Ｖ５２０Ｆ、１７１７－１Ｇ－＞Ａ、Ｅ６０Ｘ、Ｇ５５１Ｄ、Ｒ５５３Ｘ、およびＤ２５９Ｇから選択される。
ある実施形態では、患者は、Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｆ５０８ｄｅｌ、Ｇ５５１Ｄ／Ｆ５０８ｄｅｌ、Ｒ５５３Ｘ／Ｅ６０Ｘ、Ｆ５０８ｄｅｌ／１７１７－１Ｇ－＞Ａ、Ｆ５０８ｄｅｌ／２１８４ｄｅｌＡ、およびＤ２５９Ｇ／Ｖ５２０ＦＦから選択される一対のＣＴＦＲ変異を有する。
ある実施形態では、患者は、Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｆ５０８ｄｅｌ、Ｒ５５３Ｘ／Ｅ６０Ｘ、Ｆ５０８ｄｅｌ／１７１７－１Ｇ－＞Ａ、Ｆ５０８ｄｅｌ／２１８４ｄｅｌＡ、およびＤ２５９Ｇ／Ｖ５２０Ｆから選択される一対のＣＴＦＲ変異を有する。
ある実施形態では、本発明の方法は、従来のＣＦ治療薬による治療に対して典型的に不応答性または最小応答性である様々なＣＦ遺伝子型のいずれか１つを有する患者の気道表面液の粘度を低下させるのに有用である。
したがって、ある実施形態では、本明細書に記載のＡＳＬ粘度を低下させる方法は、患者のＣＦ遺伝子型にとらわれない。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかは、不応性または抵抗性の嚢胞性線維症の患者のＡＳＬ粘度を低下させる。一部の実施形態では、嚢胞性線維症は、イバカフトールなどの１つまたは複数の嚢胞性線維症治療薬に対して不応性または抵抗性である。
一部の実施形態では、その方法は、治療有効量の抗生物質を患者に投与することをさらに含む。
前述の各実施形態によれば、ある実施形態では、患者はヒトである。
前述の各実施形態によれば、ある実施形態では、患者は１２歳未満である。
前述の各実施形態によれば、ある実施形態では、患者は１２歳以上である。例えば、ある実施形態では、患者は少なくとも１２歳～約１６歳である。ある他の実施形態では、患者は約１６歳～約２４歳である。ある他の実施形態では、患者は約２４歳～約３０歳である。ある他の実施形態では、患者は約３０歳～約４０歳である。他のある実施形態では、患者は約４０歳～約５０歳である。ある他の実施形態では、患者は約５０歳～約６０歳である。ある他の実施形態では、患者は約６０～約７０歳である。ある他の実施形態では、患者は約７０歳～約８０歳である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかは、頂端膜を透過性にする。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかは、プロトンに対して頂端膜を透過性にする。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかは、重炭酸陰イオンに対して頂端膜を透過性にする。
製剤
本発明で使用される製剤は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性のある担体、アジュバント、および任意選択で他の治療成分を通常含みうる薬学的に許容される溶液中において投与してよい。
アムホテリシンＢは、デオキシコール酸ベースの製剤や脂質ベース（リポソームを含む）の製剤など、多くの製剤で市販されている。本発明の目的のために、ＡｍＢは、ステロールと共に製剤化される。ある実施形態では、そのような製剤は、ＡｍＢとステロールとの間で形成された複合体を含む。
治療での使用に関して、有効量の本発明の活性化合物または組成物を、所望の場所または表面に化合物または組成物を送達する任意の用法で対象に投与することができる。本発明の医薬組成物の投与は、当業者に知られている任意の手段によって達成することができる。投与経路には、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、直接注入（例えば、腫瘍または膿瘍内）、粘膜、吸入、および局所が含まれるが、これらに限定されない。
ある好ましい実施形態では、化合物または組成物は全身投与される。ある好ましい実施形態では、化合物または組成物は静脈内投与される。
ある好ましい実施形態では、化合物または組成物は気道に投与される。ある好ましい実施形態では、化合物または組成物はエアロゾルとして気道に投与される。
凍結乾燥製剤は、通常、投与の直前に、例えば滅菌水または生理食塩水などの適切な水溶液中に再構成される。
経口投与の場合、活性化合物を当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって、化合物（すなわち、本発明の化合物、および他の治療剤）を容易に製剤化することができる。そのような担体は、本発明の化合物を、治療対象による経口摂取のために、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化することを可能にする。経口用途のための医薬調製物は、固体の賦形剤として得ることができ、任意選択で、必要に応じて適切な助剤を加えた後、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠のコアを得る。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖類などの充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物などである。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えばアルギン酸ナトリウム）などの崩壊剤を加えてもよい。任意選択で、経口製剤は、生理食塩水、または例えば内部の酸性状態を中和するためのＥＤＴＡなどの緩衝液中に製剤化してよく、あるいはいずれの担体も使用せずに投与してもよい。
上記の１つ以上の成分の経口剤形も具体的に企図されている。１つ以上の成分を、誘導体の経口送達が有効になるように化学的に修飾してもよい。一般に、考えられる化学的修飾は、成分分子自体への少なくとも１つの部分の付加であり、その部分は、（ａ）酸加水分解の阻害；および（ｂ）胃または腸から血流への取り込みを可能にする。１つ以上の成分の全体的な安定性の向上、および体内における循環時間の増加もまた所望される。このような部分の例には、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリンなどが含まれる。Abuchowski and Davis, “Soluble Polymer-Enzyme Adducts”, In: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, N.Y., pp. 367-383 (1981); Newmark et al., J Appl Biochem 4:185-9 (1982)。使用可能な他のポリマーは、ポリ－１，３－ジオキソランおよびポリ－１，３，６－チオキソカンである。上記のように、医薬用途に好ましいものはポリエチレングである。
成分（または誘導体）について、放出場所は、胃、小腸（十二指腸、空腸、または回腸）、または大腸であってよい。当業者は、胃内では溶解しないで、十二指腸または腸の他の場所において物質を放出する利用可能な製剤を有する。好ましくは、放出は、本発明の化合物（または誘導体）の保護によるか、あるいは例えば腸におけるなど胃内環境を過ぎてからの生物活性物質の放出によるかのいずれかにより、胃内環境の有害な影響を回避する。
十分な胃耐性を確保するためには、少なくともｐＨ５．０に対して非浸透性のコーティングが不可欠である。腸溶性コーティングとして用いられるより一般的な不活性成分の例は、セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ ５０、ＨＰＭＣＰ ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、オイラギット（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）Ｌ３０Ｄ、アクアテリック（Ａｑｕａｔｅｒｉｃ）、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、オイラギットＬ、オイラギットＳ、およびシェラックである。これらのコーティングは、混合膜として使用してもよい。
コーティングまたはコーティング混合物は、胃からの保護を目的としていない錠剤でも使用できる。このコーティングには、糖衣、あるいは錠剤を飲み込み易くするコーティングが含まれていてよい。カプセルは、乾燥治療薬（例えば粉末）の送達用の硬質シェル（ゼラチンなど）で構成されていてもよい；液体形態では、軟質ゼラチンシェルを使用してもよい。カシェ剤のシェル材料は、濃デンプンまたは他の食用紙であってよい。丸薬、トローチ剤、成形錠剤または粉薬錠剤については、湿式塊化法（moist massing techniques）を使用することができる。
治療薬は、粒径約１ｍｍの顆粒またはペレットの形態の細かい多微粒子として、製剤中に含めてもよい。カプセル投与用の材料の製剤は、粉末、軽度に圧縮されたプラグ（lightly compressed plugs）、または錠剤であってもよい。治療薬は圧縮によって調製することができる。
着色剤および香味剤はすべて含めてよい。例えば、本発明の化合物（または誘導体）を（リポソームまたはマイクロスフェアのカプセル化などにより）製剤化し、次いで、着色剤および香味剤を含有する冷蔵飲料などの可食製品内にさらに含めてよい。
不活性物質を用いて、治療薬を希釈しまたはその容積を増加させてもよい。これらの希釈剤には、特に、マンニトール、α－ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、改質デキストランおよびデンプンなどの炭水化物が含まれる。例えば三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムなどを含む、特定の無機塩を充填剤として使用してもよい。幾つかの市販の希釈剤としては、ファスト－フロ（Ｆａｓｔ－Ｆｒｏ）、エムデックス（Ｅｍｄｅｘ）、ＳＴＡ－Ｒｘ １５００、エンコンプレス（Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ）およびアビセル（Ａｖｉｃｅｌｌ）がある。
治療薬を固体剤形に製剤化する際に崩壊剤を含めてもよい。崩壊剤として使用される材料には、限定はされないが、デンプンベースの市販の崩壊剤であるエキスプロタブ（Ｅｘｐｌｏｔａｂ）などのデンプンが含まれる。デンプングリコール酸ナトリウム、アンバーライト（ＡｍＢｅｒｌｉｔｅ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸型カルボキシメチルセルロース、天然のスポンジ、およびベントナイトをすべて使用できる。崩壊剤の別の形態は、不溶性陽イオン交換樹脂である。粉末状ガムは、崩壊剤としておよび結合剤として使用することができ、寒天、カラヤまたはトラガカントなどの粉末状ガムが含まれる。アルギン酸およびそのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。
治療剤を一緒に保持して硬質の錠剤を形成するために結合剤を使用してもよく、結合剤には、アカシア、トラガカント、デンプンおよびゼラチンなどの天然物由来の材料が含まれる。他には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などが含まれる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は両方とも、治療薬を粒状にするためにアルコール溶液中において使用することができる。
減摩剤（anti-frictional agent）は、製剤プロセス中の粘着を防止するために治療薬の製剤中に含めてよい。潤滑剤は、治療薬とダイ壁との間の層として使用してよく、これらには、ステアリン酸ならびにそのマグネシウムおよびカルシウム塩、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油およびワックスが含まれるが、これらに限定はされない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、さまざまな分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ ４０００および６０００などの可溶性潤滑剤も使用してよい。
製剤化中の薬物の流動特性を改善し、圧縮中の再配置を補助しうる流動促進剤(glidant)を添加してもよい。流動促進剤には、デンプン、タルク、焼成シリカおよびケイ酸アルミニウム水和物（hydrated silicoaluminate）が含まれる。
水性環境中への治療薬の溶解を補助するために、サーファクタントを湿潤剤として添加してもよい。サーファクタントには、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤が含まれる。使用可能な陽イオン性界面活性剤としては、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムが挙げられる。製剤にサーファクタントとして含まれるうる非イオン性界面活性剤としては、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセリル、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。これらのサーファクタントは、本発明の化合物または誘導体の製剤中に、単独でまたはさまざまな比率の混合物として存在することができる。
経口で用いることができる医薬製剤には、ゼラチンで作られた押し込み式（push-fit）カプセル、ならびにゼラチン、およびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤で作られた軟質の密封カプセルが含まれる。押し込み式カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／または、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、ならびに任意選択で安定剤と混合して、活性成分を含むことができる。軟質カプセルでは、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与用に製剤化されたマイクロスフェアも使用してよい。このようなマイクロスフェアは、当技術分野で十分に定義されている。経口投与用のすべての製剤は、そのような投与に適した用量である。
口腔内投与用に、組成物は、従来のやり方で製剤化された錠剤またはトローチ剤の形態をとることもできる。
吸入による投与の場合、本発明に従う使用のための化合物および組成物は、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスなどの適切な噴射剤を使用して、加圧パックまたはネブライザーから、エアロゾルスプレーの形態で都合よく送達させることができる。加圧エアロゾルの場合には、投薬単位は、定量を送達するためのバルブを設けることによって決定することができる。吸入器または吹送器（insufflator）で使用するための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含めて作成することができる。
本発明の化合物（またはその誘導体）の肺送達も本明細書において企図されている。本発明の化合物（または誘導体）は、吸入中に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮の内膜を横切って血流へと移動する。吸入分子の他の報告として、Adjei et al., Pharm Res 7:565-569(1990)；Adjei et al., Int J Pharmaceutics 63:135-144(1990)（酢酸リュープロリド）；Braquet et al., J Cardiovasc Pharmacol 13(suppl. 5):143-146(1989)（エンドセリン－１）；Hubbard et al., Annal Int Med 3:206-212(1989)（α１－アンチトリプシン）；Smith et al., 1989, J Clin Invest 84:1145-1146（ａ－１－プロテイナーゼ）；Oswein et al., 1990, “Aerozolization of proteins”, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Derivery II, Keystone, Colorado, March（組換えヒト成長ホルモン）；Debs et al., 1988, J Immunol 140:3482-3488（インターフェロン－γおよび腫瘍壊死因子α）、および、Ｐｌａｔｚらの米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）が挙げられる。全身作用のための薬物の肺送達の方法および組成物は、１９９５年９月１９日に発行されたＷｏｎｇらの米国特許第５，４５１，５６９号（参照により取り込まれる）に記載されている。
ネブライザー、定量吸入器、および粉末吸入器を含むがこれらに限定されない、治療薬品の肺送達用に設計された広範な機械装置が、本発明の実施での使用に企図されており、それらのすべてが当業者によく知られている。
本発明の実施に適した市販の装置の幾つかの具体例としては、米国ミズーリ州セントルイス所在のＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．のＵｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー；米国コロラド州エングルウッド所在のＭａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ ＰｒｏｄｕｃｔｓのＡｃｏｒｎ ＩＩネブライザー；米国ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク所在のＧｌａｘｏ Ｉｎｃ．のＶｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器；および、米国マサチューセッツ州ベッドフォード所在のＦｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．のＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器がある。
このような装置はすべて、本発明の化合物（または誘導体）の投薬に適した製剤の使用を必要とする。典型的には、各製剤は、用いられる装置の種類に固有であり、治療に有用な通常の希釈剤、アジュバント、および／または担体に加えて、適切な噴射剤物質の使用も含んでいてよい。また、リポソーム、マイクロカプセルまたはマイクロスフェア、包接複合体、または他の種類の担体の使用も企図されている。化学修飾された本発明の化合物もまた、化学修飾の種類または用いられる装置の種類に応じて、さまざまな製剤に調製することができる。
ジェット式または超音波式のネブライザーとともに使用するのに適した製剤は、典型的には、溶液１ｍＬあたり約０．１～２５ｍｇの生物学的に活性な本発明の化合物の濃度で水に溶解した本発明の化合物（または誘導体）を含む。製剤はまた、緩衝剤および単糖も含んでいてよい（例えば本発明の化合物の安定化および浸透圧の調節のため）。ネブライザー製剤はまた、エアロゾルを形成する際に溶液の噴霧化により生じる本発明の化合物の表面誘導性凝集を低減または防ぐために、サーファクタントを含んでいてよい。
定量吸入デバイスで使用する製剤は、一般に、サーファクタントの助けを借りて噴射剤に懸濁された本発明の化合物（または誘導体）を含む微細化粉末を含む。噴射剤は、クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、もしくは、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２－テトラフルオロエタン、またはそれらの組合せを含む炭化水素など、この目的に用いられる通常の材料であってよい。適切なサーファクタントには、ソルビタントリオレエートおよび大豆レシチンが含まれる。オレイン酸もまた、サーファクタントとして有用である。
粉末吸入器から投薬するための製剤は、本発明の化合物（または誘導体）を含む微細化乾燥粉末を含み、ラクトース、ソルビトール、スクロース、またはマンニトールなどの増量剤も、例えば製剤の５０～９０質量％など、装置からの粉末の分散を促進する量で含んでいてよい。本発明の化合物（または誘導体）は、有利には、肺深部への最も効果的な送達のために、１０マイクロメートル（μｍ）未満、最も好ましくは０．５～５μｍの平均粒径を有する微粒子形態に調製される。
本発明の医薬組成物の経鼻送達も企図されている。経鼻送達は、肺に薬品を堆積させる必要なしに、鼻への治療薬品の投与後直接、血流への本発明の医薬組成物の通過を可能にする。経鼻送達用の製剤には、デキストランまたはシクロデキストランを用いたものが含まれる。
経鼻投与の場合、有用な装置は、定量噴霧器が取り付けられた小さい硬質のボトルである。一実施形態では、溶液中の本発明の医薬組成物を規定容量のチャンバ内に引き込むことによって定量が送達され、このチャンバは、チャンバ内の液体が圧縮されたときにスプレーを形成することによってエアロゾル製剤をエアロゾル化するように寸法設定された開口部を有する。チャンバは圧縮されて本発明の医薬組成物を投与する。特定の実施形態では、チャンバはピストン構成である。このような装置は市販されている。
あるいは、スクイズされたときにスプレーを形成することによってエアロゾル製剤をエアロゾル化するように寸法設定された開口部または開口を備えたプラスチック製のスクイズボトルが用いられる。開口部は、通常、ボトルの上端部に設けられ、この上端部は、エアロゾル製剤の効率的な投与のために、鼻道に部分的に適合するように略テーパ状になっている。好ましくは、鼻吸入器は、薬物の定量投与のために、計量された量のエアロゾル製剤を供給する。
化合物は、全身送達が望ましい場合には、例えばボーラス注射または持続注入などの注入による非経口投与用に製剤化してもよい。注入用製剤は、例えば、保存剤が添加された、アンプルまたは多回投与用容器などの単位投薬形態で提供してもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションなどの形態であってよく、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤化剤（formulatory agents）を含んでいてもよい。
非経口投与用の医薬製剤には、水溶性形態の活性化合物の水溶液が含まれる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射用懸濁液として調製してもよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、あるいはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、あるいはリポソームが含まれる。水性注射用懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁液の粘性を高める物質も含んでいてよい。任意選択で、懸濁液は、化合物の溶解性を高めて高濃縮溶液の調製を可能にする適切な安定剤または薬剤も含んでいてもよい。
あるいは、活性化合物は、使用前に、例えば滅菌した発熱物質を含まない水などの適切なビヒクルで再構成するための粉末の形態であってもよい。
化合物はまた、例えばカカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含む、坐剤または停留浣腸などの直腸または膣用組成物に製剤化してもよい。
上記の製剤に加えて、化合物はデポー製剤として製剤化してもよい。このような長時間作用型の製剤は、適切なポリマー性または疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは例えば難溶性塩などの難溶性誘導体として、製剤化することができる。
医薬組成物はまた、適切な固体またはゲル相担体または賦形剤も含んでいてよい。このような担体または賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、さまざまな糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
適切な液体または固体の医薬製剤の形態は、例えば、吸入用の水溶液または生理食塩水、マイクロカプセル化形態、渦巻形内包化（encochleated）形態、微細な金粒子上に被覆された形態、リポソームに内包された形態、霧化形態、エアロゾル、皮膚への移植用ペレット、または皮膚を引っ掻くための鋭器上の乾燥形態などである。医薬組成物には、顆粒、粉末、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、エマルション、懸濁液、クリーム、点滴剤、または、活性化合物が持続放出される製剤も含まれ、これら製剤において、賦形剤および添加剤、および／または、例えば崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、潤滑剤、香味剤、甘味剤または可溶化剤などの助剤が、上述したように慣用的に用いられる。医薬組成物は、さまざまな薬物送達システムにおける使用に適している。薬物送達のための方法の簡単なレビューについては、参照によってこの中に組み込まれるLanger R, Science 249:1527-33(1990)を参照されたい。
本発明の化合物および任意選択で他の治療薬は、それ自体（そのまま）で、または薬学的に許容される塩の形態で投与することができる。医薬に用いられる場合、塩は薬学的に許容されるものであるが、薬学的に許容されない塩は、それらの薬学的に許容される塩の調製に都合よく使用することができる。このような塩には、以下の酸から調製されるものが含まれるが、これらに限られない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ－トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン－２－スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、このような塩は、カルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩など、アルカリ金属またはアルカリ土類塩として調製することもできる。
適切な緩衝剤には、酢酸および塩（１～２％ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１～３％ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５～２．５％ｗ／ｖ）；ならびにリン酸および塩（０．８～２％ｗ／ｖ）が含まれる。適切な保存剤には、塩化ベンザルコニウム（０．００３～０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３～０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１～０．２５％ｗ／ｖ）およびチメロサール（０．００４～０．０２％ｗ／ｖ）が含まれる。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体中に含まれる、有効量の本発明の化合物、および任意選択で他の治療剤を含む。用語「薬学的に許容される担体」とは、ヒトまたは他の脊椎動物への投与に適した１つまたは複数の適合性のある固体または液体の充填剤、希釈剤または封入剤を意味する。用語「担体」は、適用を容易にするために活性成分と組み合わされる天然または合成の有機または無機の成分を意味する。医薬組成物の成分はまた、本発明の化合物と、および互いに、実質的に所望の薬剤効率を損なうような相互作用がない態様で混合可能である。
特に本発明の化合物を含むがそれに限定されない治療剤を粒子で提供してもよい。本明細書で用いられる粒子は、ナノ粒子またはマイクロ粒子（または、場合によっては、より大きい粒子）を意味し、該粒子は、その全部または一部が本明細書に記載の本発明の化合物または他の治療剤で構成されていてよい。粒子は、コーティングによって取り囲まれたコア内に治療剤を含んでいてよく、そのようなコーティングには腸溶性コーティングが含まれるがそれらに限定されない。治療剤は粒子全体に分散されていてもよい。治療剤はまた、粒子に吸着されていてもよい。粒子は、ゼロ次放出、一次放出、二次放出、遅延放出、持続放出（徐放）、即時放出、およびそれらの任意の組合せ等を含む、任意の次数の放出速度論を示しうる。粒子は、治療剤に加えて、薬学および医学の分野で日常的に使用される材料のいずれも含んでいてよく、そのような材料には、浸食性（erodible）、非浸食性、生分解性、または非生分解性の材料またはそれらの組合せが含まれるがそれらに限定されない。粒子は、本発明の化合物を溶液または半固体状態で含むマイクロカプセルであってもよい。粒子は、実質的に任意の形状であってよい。
非生分解性および生分解性の両方のポリマー材料を、治療剤の送達のための粒子の製造に使用することができる。このようなポリマーは、天然のポリマーであっても合成のポリマーであってもよい。ポリマーは、望ましい放出期間に基づいて選択される。特に注目される生体接着性ポリマーとして、Sawhney H S et al. (1993) Macromolecules 26:581-7に記載される生体内分解性のハイドロゲルが挙げられ、その教示が本明細書に組み込まれる。これらには、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、およびポリ（アクリル酸オクタデシル）が含まれる。
治療剤は、制御放出システム内に含まれていてもよい。用語「制御放出」は、製剤からの薬物放出の態様およびプロファイルが制御された、任意の薬物含有製剤を指すことが意図されている。これは、即時放出製剤および非即時放出製剤を指し、非即時放出製剤には、徐放性製剤および遅延放出製剤が含まれるが、これらに限定されない。用語「徐放性」（「持続放出」とも称される）は、通常の意味で用いられ、長期間にわたり薬物の逐次放出をもたらし、好ましくは、必ずというわけではないが、長期間にわたり薬物の実質的に一定の血中レベルをもたらす薬物製剤を指す。用語「遅延放出」は、通常の意味で用いられ、製剤の投与と製剤からの薬物の放出との間に時間的遅延が存在する薬物製剤を指す。「遅延放出」は、長期間にわたる薬物の逐次放出を含んでも含まなくてもよく、したがって、「徐放性」であってもなくてもよい。
長期徐放性インプラントの使用は、慢性的な状態の治療に特に適するであろう。「長期」放出は、本明細書で用いられる場合、インプラントが、少なくとも７日間、好ましくは３０～６０日間、治療レベルの活性成分を送達するように構成および配置されることを意味する。長期徐放性インプラントは、当業者に広く知られており、上記の放出システムのいくつかを含む。
投薬（Dosing）
上記のように、「有効量」とは、所望の生物学的効果を達成するのに十分な任意の量を指す。本明細書で提供される教示とあわせて、さまざまな活性化合物の中から選択し、さらに効力、相対的バイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の重症度、および、好ましい投与方式などの因子に重み付けすることによって、有効な予防的または治療的治療レジメンを、実質的に望ましくない毒性を生じさせずになお特定の対象を治療するのに有効となるように計画することができる。特定の適用のための有効量は、治療される疾患または状態、投与される本発明の特定化合物、対象のサイズ、あるいは疾患または状態の重症度などの因子に応じて変動しうる。当業者は、本発明の特定化合物および／または他の治療剤の有効量を、過度の実験を必要とすることなく、経験的に決定することができる。一般的に、最大用量、すなわち何らかの医学的判断に従った最高安全用量が用いられることが好ましい。化合物の適切な全身レベルを達成するために、１日当たり複数回の投与が予定されてもよい。適切な全身レベルは、例えば、患者における薬物のピークまたは持続血漿レベルの測定によって決定することができる。「用量」および「投薬量」は本明細書において交換可能に用いられる。
一般に、ＡｍＢについて測定した１日用量は、ヒト対象について、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ～１日当たり１０００ｍｇ／ｋｇになる。１日当たり１回または数回の投与で、０．５～５０ｍｇ／ｋｇの範囲の経口用量が所望の結果をもたらすと期待される。投薬量は、投与形態に応じて、局所または全身の所望の薬物濃度を達成するように適切に調整することができる。例えば、静脈内投与は、１桁から数桁少ない１日当たりの用量であることが予想される。このような用量で対象における応答が不十分な場合には、さらに高い用量（または、異なるより局所的な送達経路による、有効なより高い用量）を、患者の耐容性が許容する程度まで用いてもよい。化合物の適切な全身濃度を達成するために、１日当たり複数回の投与も企図される。
一実施形態において、本発明の組成物の静脈内投与は、典型的には、ＡｍＢについて測定して、０．１ｍｇ／ｋｇ／日～２０ｍｇ／ｋｇ／日となりうる。従って、静脈内投与量は、ＡｍＢの最大耐量と同様であるか、または有利にはＡｍＢの最大耐量を超えてもよい。
本明細書に記載の任意の化合物または組成物に関して、治療有効量は、最初に動物モデルから特定することができる。治療有効用量はまた、ヒトで試験された本発明の化合物についてのヒトデータ、および他の関連活性薬剤などの同様の薬理学的活性を示すことが知られている化合物についてのヒトデータから決定してもよい。非経口投与には、より高い用量が必要とされるであろう。適用される用量は、投与される化合物の相対的バイオアベイラビリティおよび効力に基づいて調整することができる。上記の方法および当技術分野で周知の他の方法に基づき最大効果を達成するように用量を調整することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
本明細書に記載の組成物および方法に対する他の適切な変更および適合は、当業者に既知の情報を考慮して、本明細書に含まれる本発明の説明から容易に明らかとなり、さらに本発明またはその任意の実施形態の範囲を逸脱することなく行うことができることは関連分野の当業者に理解されるであろう。
本発明を詳細に説明したが、これは、以下の実施例を参照することにより、より明確に理解されるであろう。これらの実施例は、例示のみを目的としてここに含まれ、本発明を限定することを意図しない。
細胞株および成長条件
ＮｕＬｉ、ＣｕＦｉ－１、およびＣｕＦｉ－４細胞（１５）（アイオワ大学、Ｗｅｌｓｈ研究室）は、最初に凍結ストックから、それぞれ１．５ｘ１０４細胞／ｃｍ２、１ｘ１０３細胞／ｃｍ２、および１ｘ１０４細胞／ｃｍ２で播種して、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＢｉｏＬｉｔｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｒｅａｔｅｄ ７５ｃｍ２フラスコで成長させた。これらのフラスコは、事前に３ｍＬの６０μｇ／ｍＬのヒト胎盤ＶＩ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて室温で最低１８時間コーティングし、ＰＢＳで２回すすいだ後、播種前に乾燥させた。細胞は、１２ｍＬの気管支上皮細胞増殖培地（ＢＥＧＭ）ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ ＣＣ－３１７０）で培養し、その培地には、基本培地と８つのＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓのサプリメント（ＢＰＥ、２ｍＬ；ヒドロコルチゾン、０．５ｍＬ；ｈＥＧＦ、０．５ｍＬ；エピネフリン、０．５ｍＬ；トランスフェリン、０．５ｍＬ；インスリン、０．５ｍＬ；レチノイン酸、０．５ｍＬ；トリヨードサイロニン、０．５ｍＬ）が含まれる。ゲンタマイシン－アムホテリシンＢアリコートは捨てて、代わりに培地に５０μｇ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ）、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｇ１３９７）、および２μｇ／ｍＬのフルコナゾール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補足した。
２日ごとに培地を交換して３７℃、５％ＣＯ２で細胞を９０％コンフルエンスまで増殖させた後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む４ｍＬの標準０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ ２５２００－０５６）でトリプシン処理した。１％仔ウシ血清を添加した１０ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（Ｌｏｎｚａ ＣＣ－５０２４）でトリプシンを不活化した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４３０ Ｒにおいて１５００ｒｐｍで５分間遠心して細胞を沈降させ、継代のためにＢＥＧＭ培地に再懸濁させた。
分化のために膜支持体上で培養するために、遠心分離後に細胞をＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ培地に再懸濁させた。この培地は、１：１の比率のＤＭＥＭ：２％Ｖ／ＶのＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ（Ｃｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を補足したＨａｍ Ｆ－１２で構成される。使用した膜支持体は、候補イオノフォアのウッシング（Ｕｓｓｉｎｇ）チャンバ研究用のＭｉｌｌｉｃｅｌｌ ０．４μｍ ＰＣＦインサート（０．６ｃｍ２）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰＩＨＰ０１２５０）、ｐＨスタット研究用の６ウェルコンパニオンプレート（Ｆｉｓｈｅｒ ０８－７７１－２４）内に０．４μｍの透明ＰＥＴメンブレン（４．６７ｃｍ２）（Ｆｉｓｈｅｒ ０８－７７１）を有する６ウェルプレート用のＦａｌｃｏｎ（登録商標）パーミアブルサポート、および他のすべての研究用のＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ０．４μｍ ２４ウェルプレート トランズウェルクリアーポリエステルメンブレンインサート（０．３３ｃｍ２）（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３４７０）である。これらの膜を上述したフラスコと同じ方法でコラーゲンによりコーティングした。Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌインサートにはそれぞれ２００，０００細胞を播種し、Ｆａｌｃｏｎインサートにはそれぞれ５００，０００細胞を播種し、またトランズウェルインサートにはそれぞれ１１５，０００細胞を播種した。Ｕｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ培地を１日おきに交換して、これらの膜を最低１４日間気液界面で成熟させて完全な分化に到達させた（７５、５２）。完全に成熟すると、培地を７日ごとに交換した。共変量対照（covariate control）について、実験で使用した膜は年齢および成熟度が可能な限り近いものであった。
気道上皮の初代培養
気道上皮細胞は、死後標本として、または移植に適さないと見なされた組織から、アイオワドナーネットワーク（Ｉｏｗａ Ｄｏｎｏｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ）から得られたＣＦおよび非ＣＦ標本のヒト気管および気管支から得た。研究は、アイオワ大学の治験審査委員会によって承認された。プロナーゼ酵素消化後、コラーゲンコーティング半透膜（０．３３～１．１２ｃｍ２、Ｃｏｒｎｉｎｇ ３４７０ポリエステル、３４６０ポリエステル、３４１３ポリカーボネート）に細胞を播種し、気液界面で成長させた（５２）。気道上皮細胞培養物は、それらが分化した後でかつ播種後少なくとも１４日後に分析した。
統計
除外されたデータはない。データはすべて、最低６生物学的反復での平均値±ＳＥＭを表す。ダゴスティーノ・ピアソン（ＤＡｇｏｓｔｉｎｏ＆Ｐｅａｒｓｏｎ）正規性検定を使用して、データの正規分布を確認した。統計分析は、必要に応じて、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）、あるいは両側の対応のないまたは対応のあるスチューデントのｔ検定から得られた、Ｐ値を表す。比較群間で分散が均一でない場合は、分散の違いを明らかにするために、ウェルチ補正を使用したパラメトリックｔ検定を行った。ＮＳは有意ではない。特に明記しない限り、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１である。パイロット実験に基づき、群間の結果の違いを検出するために、各実験を適切に強化するサンプルサイズを選択した。サンプルサイズを事前に決定するのに統計的手法は使用しなかった。上皮サンプルを無作為に各実験の対照群と実験群に手動で割り当てた。動物はそれら自身の対照となる。
実施例１．分化ヒト肺上皮の頂端膜を重炭酸イオンに対して透過性にする小分子の発見
リポソーム、細胞、および／またはマウスの鼻上皮を陰イオンに対して透過性にすることが以前報告されている一連の天然物および合成化合物（１１－１４）を、Ｕｓｓｉｎｇチャンバ、および最も一般的なΔＦ５０８／ΔＦ５０８遺伝子型（ＣｕＦｉ－１）のＣＦ患者からの不死化気道上皮細胞株に由来する気道上皮の分化培養物（１５）を使用して試験した。臨床的に承認された抗真菌天然物アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）（図１、パネルＤ）（１６）は、短絡電流の変化を引き起こすのに非常に効果的であった。試験した他の化合物のいずれを用いても、これら同じ上皮の透過化はほとんどまたはまったく観察されなかった。それら化合物には、ＡｍＢの単原子欠損合成誘導体（Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ）が含まれ、それはイオンチャネル活性を欠くことが以前示されており（１７）、したがってこの誘導体は優れた陰性対照になる。ＡｍＢおよびＣ３５ｄｅＯＡｍＢがコレステロール含有ＰＯＰＣリポソームを横断して重炭酸イオンを輸送する能力を、適応させた１３Ｃ ＭＭＲベースアッセイ（１８）を使用して試験した。ＡｍＢで処理したリポソームから１３Ｃ標識重炭酸イオンの強力かつ迅速な放出が観察されたが、Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢで処理したものからは観察されなかった（図１、パネルＥ、Ｆ）。
ＡｍＢは真核細胞に毒性となる可能性があり、長い間この毒性は主に膜透過化に起因するとされてきた。このモデルに反して、最近、ＡｍＢは単にステロールに結合することによって主に細胞を殺し；チャネル形成は必要ないことが特定された（７７、１９）。これにより、低用量での投与および／またはステロールとの事前の複合体化により、ＡｍＢのイオンチャネル活性をその殺細胞効果から分離することができた。これらアプローチの両方を利用して、最近、ＡｍＢがタンパク質イオンチャネル欠損酵母の成長を回復できることが分かった（１９、２０）。非チャネル形成バリアントＣ３５ｄｅＯＡｍＢは、試験したどの濃度でも酵母の成長を救済することができなかった（７７、２０）。また、ＡｍＢがエルゴステロールと事前に複合体化されている場合、酵母の成長の救済が観察される用量の範囲を１桁以上拡大できることも分かった（１９、２０）。
実施例２．ＡＳＬのｐＨの変化の検査
この有望な小分子プローブのペアを用いて、正常な肺上皮と比較してＣＦ肺上皮において頂端膜をはさんだｐＨ勾配の利用可能な増大があるという予測（図１、パネルＡ、Ｂ）について試験した。蛍光ｐＨ色素（３、４、２１）により、正常個体に由来する分化上皮単層（ＮｕＬｉ）（１５）と比較して、ＣｕＦｉ－１上皮が細胞内ｐＨの上昇（図２、パネルＡ）およびＡＳＬのｐＨの低下（図２、パネルＢ）を有することが確認された。ＣｕＦｉ－１上皮の頂端膜に低濃度のＡｍＢ（２μＭ）を添加すると、２時間にわたりｐＨの漸進的な上昇が生じた（図２、パネルＣ）。驚くべきことに、その後、同じｐＨ上昇が少なくとも４８時間持続した。これは、エアロゾル化された重炭酸緩衝液によって引き起こされるＡＳＬのｐＨへの一時的効果（３、８）とは大きく異なる。非チャネル形成バリアントＣ３５ｄｅＯＡｍＢの頂端添加またはＡｍＢの側底膜への添加（側底添加）では、ｐＨの上昇は全く見られなかった（図２、パネルＤ）。ＡｍＢで処理したＣｕＦｉ－１単層は、フォルスコリン／ＩＢＭＸに応答した短絡電流の増加を示さず、ＡＳＬのｐＨのＡｍＢ媒介性の上昇は、ＣＦＴＲ活性／表面へのトラフィッキングを高めることによるものではないことを示す。ＡｍＢの添加は、膜の完全性も破壊しなかった。
ＣｕＦｉ－１上皮におけるＡＳＬのｐＨのＡｍＢ媒介性の上昇は、２μＭで最大に達し、それより高い濃度では低下する（図２、パネルＥ）。高濃度でのこの活性の喪失は有毒なコレステロール結合活性によるものであり得ると推測し（１７、１９）、この濃度依存性実験では、事前に形成したＡｍＢ：コレステロール複合体を利用した。ＡＳＬのｐＨの同様の上昇が観察され、その後、非常に高濃度のＡｍＢ（１００μＭ）まで持続した（図２、パネルＥ）。同じパターンが、以前にＣＦＴＲタンパク質発現を漸進的に増加させたときに観察された（２２－２４）。次に、臨床的に承認されたリポソーム製剤ＡｍＢｉｓｏｍｅをこの同じアッセイで試験した。ＡｍＢｉｓｏｍｅは、ＡｍＢとコレステロールを１：２．５（ＡｍＢ：コレステロール）の比率で含む。１００μＭまで維持されたＡＳＬのｐＨの優れた回復が観察された（図５および６）。無毒化チャネルの濃度を増々高めてもこのＡＳＬのｐＨが不変であったこと（図２、パネルＥ）、およびＡＳＬのｐＨのＡｍＢ媒介性の上昇が長時間維持されたこと（図２、パネルＣ）は合わせて、この小分子がＡＳＬのｐＨを制御する堅牢な自己調節ネットワーク（robust auto-regulatory network）と連動(interface)している可能性を示唆する。
実施例３．異なるＣＦ遺伝子型の調査
このＡＳＬのｐＨのＡｍＢ媒介性の上昇が遺伝子型非依存性であるかどうかを調べるために、ＡｍＢを使用した結果を、遺伝子型特異的な治療薬であるイバカフトールと比較した。イバカフトールは、ゲーティング欠損を引き起こしかつＣＦ患者の２～４％に存在する特定の変異（Ｇ５５１Ｄ）を有するＣＦＴＲの活性を増強する、臨床的に承認された小分子である。Ｇ５５１Ｄ変異を有する患者由来の初代副鼻腔上皮において、イバカフトールは、未処理の対照と比較して、ＡＳＬのｐＨを０．２０単位上昇させ、粘度を約１．５単位低下させた（２５）。少なくとも１つのＧ５５１Ｄ対立遺伝子を持つＣＦ患者での大規模な臨床試験では、イバカフトールは実質的なプラス効果をもたらし、努力呼気量（forced expiratory volume）が１０％増加し、体重、生活の質、および肺増悪の発生率が大幅に改善された（２、２６、２７）。この化合物は、Ｇ５５１Ｄまたは類似の対立遺伝子を欠くＣＦ上皮では恩恵を示さない。
予想通り、ＣｕＦｉ－１上皮（ΔＦ５０８／ΔＦ５０８）をイバカフトールで処理しても、ＡＳＬのｐＨの上昇を示さなかった（図２、パネルＤ）。前述の臨床データ（２、２６、２７）（２５）と一致して、ＣｕＦｉ－４上皮（Ｇ５５１Ｄ／ΔＦ５０８）（２５）をイバカフトールで処理すると、ＡＳＬのｐＨが０．２単位上昇した（図２、パネルＦ）。これらの遺伝子型特異的な結果とは対照的に、ＡｍＢでの処理は、ＣｕＦｉ－１上皮（図２、パネルＢ）およびＣｕＦｉ－４上皮（図２、パネルＦ）の両方でＡＳＬのｐＨを高めた。直接比較して、ＣＦＴＲの薬理学的活性化とＡｍＢチャネルの頂端膜への添加（頂端添加）が、同じ～０．２単位のＡＳＬのｐＨの上昇をもたらしたことは注目に値する（図２、パネルＦ）。ＣｕＦｉ－１におけるＡＳＬのｐＨのＡｍＢ媒介性の上昇は同様の大きさであった（図２、パネルＢ）。これはさらに、小分子チャネルが、ＣＦＴＲと連動して最高のＡＳＬのｐＨ値を規定する同じ内因性自己調節ネットワークと連動し得ることを示唆する。
実施例４．重炭酸イオンの膜流出の促進におけるＡｍＢの役割
本発明者らは、ＡｍＢが、頂端膜を横切る重炭酸イオンの流出を促進することにより、このＡＳＬのｐＨの上昇を媒介すると仮定した。ＡｍＢはプロトン（Ｈ＋）に対しても透過性であり（２０）、したがってプロトン吸収の促進は代替的または補完的なメカニズムの可能性を示した。
これを調べるために、重炭酸イオンを含むまたは重炭酸イオンを含まない側底溶液の存在下で、大きなＮｕＬｉおよびＣｕＦｉ－１上皮単層においてｐＨスタット実験を行った（図３、パネルＡ）（２８）。予想通り、ＮｕＬｉ上皮と比較してＣｕＦｉ－１においてアルカリ化の速度の低下が観察された。ＡｍＢの添加は、側底の重炭酸イオン（２５ｍＭ）の存在下では、用量依存的にＣｕＦｉ－１上皮の頂端チャンバのアルカリ化の速度を高めた（図３、パネルＡ）。対照的に、重炭酸イオンを含まない側底緩衝液の存在下では、試験したいずれの濃度のＡｍＢでも、頂端アルカリ化の速度に変化は見られなかった（図３、パネルＡ）。これらの結果は、プロトンの流入ではなく重炭酸イオンの流出がＡＳＬのｐＨのＡｍＢ媒介性の上昇の根底にあることに合致する。
ＡｍＢが重炭酸イオンの搬出を促進するかどうかをさらに調査するために、側底緩衝液に１４Ｃ重炭酸イオンを添加し、１０分間でＡＳＬに到達する放射性標識の量を定量化した。予想通り、ＮｕＬｉと比較して、ＣｕＦｉ－１上皮では１４Ｃ重炭酸イオンの輸送が大幅に減少する（図３、パネルＢ）。ＡｍＢの頂端添加により、１４Ｃ重炭酸イオンの割合が増加し、ＮｕＬｉ上皮で観察されたものと一致した（図３、パネルＢ）。チャネル不活化誘導体Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ、およびＡｍＢの側底添加は、ＡＳＬの１４Ｃ重炭酸イオンの増加をもたらさなかった（図３、パネルＢ）。
この重炭酸イオン流出のＡｍＢ媒介性の増加が遺伝子型非依存性であるかどうかを確認するために実験を行った。予想通り、イバカフトールは、ＣｕＦｉ－４では重炭酸イオンの流出速度を高めた（図３、パネルＣ）が、ＣｕＦｉ－１単層では高めなかった（図３、パネルＢ）。対照的に、ＡｍＢは両方の遺伝子型で有効であった（図３、パネルＢおよびＣ）。ＡＳＬのｐＨの結果（図２、パネルＦ）と一致して、ＣＦＴＲの薬理学的活性化とＡｍＢは、ＣｕＦｉ－４上皮において、重炭酸イオンの流出速度の同様の上昇をもたらした（図３、パネルＣ）。これらの結果は合わせて、重炭酸の輸送がＡＳＬのｐＨのＡｍＢ媒介性の上昇の根底にあることを支持し、さらに、小分子チャネルが、通常ＣＦＴＲを含む同じ自己調節ネットワークと連動することを示唆する。
このような自己調節の１つの潜在的なメカニズムは、Ｎａ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅによって作られるナトリウム勾配により主に駆動される、側底膜を介した重炭酸イオンの取込みの速度である。Ｎａ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅの組織特異的活性は、ＦＸＹＤファミリーのタンパク質によって主に制御されており、生理学的刺激に基づいて調節される（２９）。以前の研究は、非ＣＦ上皮細胞と比較して、ＣＦ上皮細胞において、ＦＸＹＤ５は３倍に増加し、Ｎａ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅ活性は２倍に上昇することを示した（２９、３０）。Ｔｒｋ輸送体を介した酵母へのカリウムの流入は、同様にＶ－ＡＴＰａｓｅおよびＰｍａｌによって作られるプロトン勾配により駆動され、Ｔｒｋ欠損酵母におけるＡｍＢ媒介性の成長救済は、Ｖ－ＡＴＰａｓｅまたはＰｍａｌの化学的阻害に高感受性である（２０）。本発明者らは、ＣＦ上皮におけるＡＳＬのｐＨのＡｍＢ媒介性の救済が、Ｎａ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅを化学的に遮断することにより低減されることを特定した。ＣｕＦｉ－１上皮の側底緩衝液にウアバインを添加すると、実際にＡｍＢ媒介性の側底側から頂端側への１４Ｃ重炭酸イオンの輸送速度の上昇およびＡＳＬのｐＨの上昇がなくなった（図３、パネルＤ、Ｅ）。
実施例５．初代ヒト気道上皮への適用
ＡｍＢが遺伝子型非依存的な様式でＡＳＬのｐＨを回復する能力が、初代ヒト気道上皮に転化できるかどうかを確認するために、広範囲の異なるＣＦＴＲ変異を表す９人のＣＦ患者ドナーからサンプルを得た。これらには、最も一般的なΔＦ５０８／ΔＦ５０８遺伝子型、ＣＦＴＲタンパク質が実質的に生成されないダブルヌル遺伝子型（Ｒ５５３Ｘ／Ｅ６０Ｘ、患者６）、まれなスプライス部位対立遺伝子（ΔＦ５０８／１７１７－１Ｇ－＞Ａ、患者７）、およびいくつかのまれな未分類の対立遺伝子（ΔＦ５０８／ｃ．２０５２ｄｕｐＡ、患者８、およびＤ２５９Ｇ／Ｖ５２０Ｆ、患者９）（３７）を有する多様な患者が含まれる。患者９におけるＶ５２０Ｆ対立遺伝子は、Ｇ５５１Ｄと同じ機能カテゴリにあるが、イバカフトールによる治療に不応性である（２６）。
ＡｍＢは広範囲の異なる遺伝子型にわたってＡＳＬのｐＨの上昇を引き起こした（図４、パネルＡ）。平均して、ＡｍＢはＡＳＬのｐＨを０．２ｐＨ単位高め、ＣｕＦｉ－１およびＣｕＦｉ－４上皮における我々の結果（図２）と一致し、またＧ５５１Ｄ対立遺伝子を有するＣＦ患者からの生検気道上皮をイバカフトールで処理した際に観察されたデータ（２５）と一致した。Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ、およびＡｍＢの側底添加は、ＡＳＬのｐＨを上昇させなかった。ＡｍＢ処理は、非ＣＦ初代培養上皮のｐＨには影響を及ぼさず、ＣＦＴＲおよび関連するｐＨ勾配の不在下での選択作用と一致した。このＡｍＢ媒介性のＡＳＬのｐＨの上昇は少なくとも４８時間持続し（図４、パネルＣ）、重炭酸イオン輸送およびｐＨの自己調節が、これらのＡｍＢ処理したＣＦ患者由来初代肺上皮で維持されている可能性が高いことを示唆する。
遺伝的に多様な初代培養ヒトＣＦ上皮を試験して、ＡｍＢでの単回処理が４８時間の時点でＡＳＬの粘度低下をもたらすかどうかを確認した。ＡｍＢは、幅広い患者遺伝子型にわたってＡＳＬの粘度を低下させた（図４、パネルＤ）。粘度低下の平均の大きさ（～１．５単位）は、Ｇ５５１Ｄ対立遺伝子を持つＣＦ患者由来のイバカフトール処理された初代副鼻腔上皮で以前に観察されたもの（２５）と一致する。
同じ４８時間の時点で、遺伝的に多様な初代ＣＦ上皮のＡＳＬの殺菌能力を、ＡｍＢ処理なしまたはありで試験した。これは、ＡｍＢによる直接的な殺菌に非感受性であることが確認された黄色ブドウ球菌でコーティングした金のグリッドでＡＳＬに短時間触れた後、殺された細菌の割合（％）を測定することによって行われた（３）。ＡｍＢでの処理は、最も一般的なΔＦ５０８／ΔＦ５０８遺伝子型、ダブルヌル変異（Ｒ５５３Ｘ／Ｅ６０Ｘ）、およびいくつかのまれな未分類の対立遺伝子（ΔＦ５０８／ｃ．２０５２ｄｕｐＡおよびＤ２５９Ｇ／Ｖ５２０Ｆ）を含む、さまざまな患者遺伝子型について抗菌活性を高めた。平均して、ＡｍＢ処理はＡＳＬの殺菌をほぼ倍増させた（図４、パネルＥ）が、一方、Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢは全く効果がなかった。
次に、ＡｍＢがヒト気道上皮の分化初代培養物において気道宿主防御の重要な特徴を回復できるかどうかを試験した。ＣＦＴＲを生じさせないいくつかのものを含めて、異なるＣＦＴＲ変異を表すＣＦの９名のドナーからの上皮を調べた（図４、パネルＡ、図１３、パネルＡ）。頂端のＡｍＢは、ＡＳＬのｐＨを～０．２ｐＨ単位高め（図４、パネルＡ）、この効果は少なくとも４８時間持続した（図４、パネルＣ）。Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ、および側底のＡｍＢは、ＡＳＬのｐＨを高めなかった（図１３、パネルＢ）。
ＣＦ気道上皮の培養物では、ＡＳＬ粘度が上昇し、抗菌活性が低下した（４、７、４８）。非ＣＦ肺上皮は、生理食塩水の２．５倍の粘度を有することが示されている（４）。遺伝的に多様なＣＦ上皮の初代培養物のパネルへのＡｍＢの頂端添加は、初代ＣＦＴＲ－Ｇ５５１Ｄ副鼻腔上皮においてイバカフトールを用いて観察されたもの（２５）と一致する程度まで、ＡＳＬ粘度を低下させた（図４、パネルＤ、図１３、パネルＤ）。非ＣＦ肺上皮は、暴露された細菌の４５％を殺すことが示されている（４）。ＡｍＢの添加は、ＡＳＬによる殺菌もほぼ２倍に高めた（図４、パネルＥ、図１３、パネルＥ）が、Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢは全く効果がなかった（図１３、パネルＦ）。ＡｍＢ自体は、黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を有していない（図１３、パネルＧ）。
実施例６．ＡｍＢは培養ＣＦ気道上皮におけるＨ１４ＣＯ３ －分泌およびＡＳＬのｐＨを高めた
研究により、ＨＣＯ３ －分泌は、ＡＳＬのｐＨを高め（３、４）、ＡＳＬの粘度を低下させ（４、７、２５）、抗菌因子の活性を高め（４）、ＡＳＬ体積のホメオスタシスを維持し（４１）、緑膿菌による局所環境の酸性化に対抗し（５）、さらにグラム陽性菌およびグラム陰性菌におけるプロトン推進力を消散させる（４２）ことにより、気道の宿主防御を増強することができることが示されている（４、３６、４０）。頂端膜を横切る電気化学的勾配はＨＣＯ３ －分泌を促進する；ＨＣＯ３ －は、Ｎａ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅ（３０）、Ｈ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅ（４）、Ｋ＋チャネル、Ｎａ＋／ＨＣＯ３ －輸送体（ＮＢＣ）、およびＮａ＋／Ｈ＋対向輸送体（アンチポーター）、ならびに炭酸脱水酵素（４３）の統合された活動を通して細胞内に蓄積される。したがって、ＣＦＴＲが開くと、ＨＣＯ３ －はＡＳＬに流れ込み、ＡＳＬのｐＨが上昇する。ＣＦＴＲがない場合、細胞内［ＨＣＯ３ －］が保持され（４４）、ＨＣＯ３ －出口のこの勾配が持続し、さらにＡＳＬにおけるＨＣＯ３ －の減少によりＡＳＬのｐＨが低下するため増加さえする。ＣＦのヒトの上皮における結果として生じるＨＣＯ３ －勾配の部位選択的および方向選択的な構築が、比較的非選択的な小分子ＨＣＯ３ －輸送体でさえ、側底側から頂端側へのＨＣＯ３ －の流れを回復させ、したがってＣＦＴＲ欠損上皮における気道宿主防御を回復させることを可能にすると推論された。最近、非選択的小分子鉄輸送体が、鉄輸送タンパク質を欠く細胞や動物においてヘモグロビン合成（hemoglobinization）を回復するのに十分であることが判明し、この選択性欠如に対する許容性は、欠損タンパク質を通常は提供している膜での部位選択的および方向選択的な鉄勾配の構築に機構的に関連付けられた（２３）。
ＡｍＢは、陰イオンと陽イオンに対して非選択的な一価イオンチャネルを形成する低分子天然物質である。それは抗真菌剤として処方されるが、ヒトにかなりの毒性がある（１６）。最近、その細胞毒性が主に膜からのステロール抽出によるものであり、チャネル形成によるものではないことが判明した（１７、１９）。脂質二重層の存在下で、ＡｍＢは主に、おそらく少量（＜５％）の膜挿入イオンチャネルと動的平衡にある、ステロールを抽出する大きな膜外凝集体を形成する。細胞毒性は、ＡｍＢのモル比が膜ステロールのモル比を超えた場合にのみ生じる（１７、１９）。これらメカニズムの洞察は、イオンチャネルを形成するが有意な量のステロールを抽出しない低濃度のＡｍＢを使用するか、あるいはＡｍＢをステロールと事前に複合体化させることにより、チャネル活性を細胞毒性から合理的に分離することを可能にした（１７、１９、２０）。ＡｍＢは陽イオンと陰イオンの両方に透過性であるイオンチャネルを形成するが、カリウム輸送を回復し、したがってカリウム選択的Ｔｒｋ輸送体を欠く酵母の成長を回復する（２０）。対照的に、イオンチャネル活性を欠く合成単原子欠損誘導体（Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ）はそれらを回復させなかった（１７、２０）。膜横断ＨＣＯ３ －分泌のための好ましい電気化学勾配、および陽イオンの輸送に対抗するための選択的ポンプおよびチャネルの堅牢なネットワークの代替的な文脈で、頂端のＡｍＢチャネルは、ＣＦ上皮にＨＣＯ３ －分泌を回復させ、したがってＡＳＬ宿主防御を回復させると仮定された。
ＡｍＢは一価の陰イオンと陽イオンを輸送することが知られている（図９、パネルＡ～Ｄ）が、ＨＣＯ３ －に対する透過性は試験されていない。ＡｍＢはコレステロール含有ＰＯＰＣリポソームを横切るＨ１３ＣＯ３ －流出を生じさせたが、Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢはそれを生じさせないことが分かった（図９、パネルＥ～Ｈ）。
低濃度のＡｍＢは、ＣｕＦｉ－４（Ｇ５５１Ｄ／ΔＦ５０８）ＣＦ気道上皮においてＡＳＬのｐＨおよびＨ１４ＣＯ３ －分泌を高めた（図７、パネルＡ、Ｂ）。ｐＨスタット実験は、プロトン吸収ではなく、ＨＣＯ３ －分泌が主にＡＳＬのｐＨのＡｍＢ媒介性上昇の根底にあることを示した（図１０、パネルＡ）。比較のためにイバカフトールを試験し、これはＣＦＴＲの開状態の確率を高め（４７）、Ｇ５５１Ｄまたは類似の残存機能変異を有するＣＦ患者においてＦＥＶ１を改善した（２７）。ＡＳＬのｐＨおよびＨ１４ＣＯ３ －分泌に対するイバカフトールの定量的効果は、ＡｍＢの効果と類似していた（図７、パネルＡ、Ｂ）。ＡｍＢは陰イオンと陽イオンの両方を輸送することができるが、カリウムおよびナトリウムのＡＳＬ中の濃度は、ビヒクル処理対照と比較して変わらなかった（図１０、パネルＢ～Ｅ）。これは、気道上皮における陽イオンポンプとチャネルの堅牢なネットワークの補償作用による可能性がある。
イバカフトールは非膜局在化ΔＦ５０８－ＣＦＴＲ欠陥を補正せず（４７）、ＣｕＦｉ－１（ΔＦ５０８／ΔＦ５０８）上皮におけるＡＳＬのｐＨまたはＨ１４ＣＯ３ －分泌を高めることができなかった（図７、パネルＣ、Ｄ）。対照的に、ＣＦＴＲタンパク質とは無関係に作用するＡｍＢはそれらの両方を高めた（図７、パネルＣ、Ｄ）。非ＣＦ（ＮｕＬｉ）上皮へのＡｍＢの頂端添加によりＡＳＬのｐＨの上昇は観察されず（図７、パネルＥ）、これは病態生理学的電気化学勾配の存在への依存を示唆する。本明細書におけるすべての実験について、実験の期間中ＡｍＢは上皮上に残された。ＡｍＢは２時間かけてＡＳＬのｐＨを漸進的に高め、これらｉｎ ｖｉｔｒｏ実験においてその効果は少なくとも４８時間持続した（図７、パネルＦ）。ＣｕＦｉ－１上皮におけるＨ１４ＣＯ３ －分泌のＡｍＢ媒介性の上昇は、少なくとも７日間持続する（図１１、パネルＡ～Ｃ）。これらの結果は、エアロゾル化されたＮａＨＣＯ３によって生じるｐＨの一時的上昇（～１５分）（８）と対照的である。Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ、およびＡｍＢの側底添加は、ＡＳＬのｐＨを上昇させず、またＨ１４ＣＯ３ －分泌も高めず、この効果が頂端に局在するＡｍＢチャネルに特異的であることを示唆する（図７、パネルＣ、Ｄ）。
ＡｍＢで処理したＣｕＦｉ－１上皮は、ＣＦＴＲの化学的活性化に応答しなかったことから、ＡｍＢは、ΔＦ５０８ ＣＦＴＲの頂端膜へのトラフィッキングを促進しなかったことが示唆される（図１１、パネルＤ－Ｉ）。ビヒクル、低用量（２μＭ）または高用量（５０μＭ）のＡｍＢのいずれかで長期間にわたり処理したＣｕＦｉ－１上皮の間で経上皮電気抵抗（Ｒｔ）に差はなく（図１１、パネルＪ）、ＡｍＢを添加しても膜の完全性は損なわれなかった。
ＣＦの別のモデルは、ＡＳＬの高さを病理に関連付ける（４１）。ベースラインにおいて、ＣｕＦｉ－１上皮はＮｕＬｉ上皮と比較してＡＳＬの高さが減少していることが観察された（図７、パネルＧ）。ＡｍＢの頂端添加により、ＣｕＦｉ－１上皮のＡＳＬの高さが増加し、ＮｕＬｉ上皮の高さに一致した（図７、パネルＧ）。ビヒクル、Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ、および側底のＡｍＢは、ＡＳＬの高さを増加させなかった（図７、パネルＧ）。これらの結果は、ＡｍＢベースのチャネルが、そのイオン選択性の欠如にもかかわらず、ＡＳＬ体積のホメオスタシスを回復させることを示唆する。
頂端チャネルを介したイオンの分泌は、電気化学的勾配に依存し、その勾配は大部分が側底膜の輸送タンパク質によって作られる。Ｔｒｋ欠損酵母におけるＡｍＢ媒介性の成長救済は、二次的Ｋ＋流入を駆動するＨ＋ ＡＴＰａｓｅの化学的阻害によって減弱されることが示された（２０）。ある研究では、Ｔ８４細胞単層の頂端膜のペプチドチャネルを介したクロライドイオンの分泌が、側底膜上のカリウムチャネルを遮断することにより低減されることが示された（３７）。ＣＦ気道上皮における側底輸送を阻害すると、ＡｍＢ媒介性の陰イオン分泌も同様に防止できることが予測された。ウアバインで側底のＮａ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅを阻害すると、ＡＳＬのｐＨおよびＨ１４ＣＯ３ －分泌のＡｍＢ媒介性の上昇が無効になった（図７、パネルＨ、Ｉ）。さらに、ブメタニドで側底のＮａ＋／Ｋ＋／２Ｃｌ－輸送体を阻害すると、ＮｕＬｉ上皮のＡＳＬの高さが減少し、またＣｕＦｉ－１上皮で観察されたＡＳＬの高さのＡｍＢ媒介性の増加が無効になった（図７パネルＧ、図１２）。これらの結果は、頂端膜のＡｍＢチャネルが、陰イオン分泌を駆動する内因性の側底膜タンパク質と機能的に連動することを示す。なぜならＡｍＢ媒介性の現象がそれらの活動に依存しているからである。
実施例７．ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）は培養ＣＦ気道上皮およびＣＦＴＲ－／－ブタのＡＳＬのｐＨを高めた
ＣｕＦｉ－１上皮において、ＡｍＢの濃度の漸進的増加に伴い、ＡＳＬのｐＨが上昇し、その後低下することが観察された（図８、パネルＡ）。酵母での研究（１７、１９、２０）に基づき、事前に形成されたＡｍＢ：コレステロール複合体が、ＡｍＢの高濃度での有効性の低下に寄与し得る潜在的なステロール結合媒介性の影響を低減すると仮定した。結果的に、事前に形成されたＡｍＢ：コレステロール（１：５）複合体は、試験したＡｍＢの最高濃度（１００μΜ）まで、ＡＳＬのｐＨを高めたことが分かった（図８、パネルＡ）。
ＡｍＢをｉｎ ｖｉｖｏで試験することを目的に、ＡｍＢとコレステロールを１：２．５の比率で含むＦＤＡ承認のリポソーム製剤であるＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）（４９）を評価した。ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）は、リポソームにおけるＨ１３ＣＯ３ －の流出を増やし（図１４、パネルＡ）、また添加の２時間後および４８時間後に測定したＣｕＦｉ－１上皮におけるＡＳＬのｐＨおよびＨ１４ＣＯ３ －分泌を高めた（図８、パネルＢ、Ｃ、図１４、パネルＢ、Ｃ）。さらに、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）は、０．２５～１００μＭのＡｍＢに相当する６～２４５０μｇ／ｍＬの広範囲のＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）の濃度にわたりＡＳＬのｐＨを高めた（図１４、パネルＣ）。
ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）がｉｎ ｖｉｖｏでＡＳＬのｐＨを回復させる能力を評価するために、ＣＦのブタモデルを使用した（８）。ＣＦＴＲ－／－ブタのＡＳＬのｐＨは、エアロゾル化したＨＣＯ３ －またはトロメタミン緩衝液の介入なしでは上昇せず（８）、非ＣＦブタのＡＳＬのｐＨは約７．２５（４）であることが示されている。６０μＬの１ｍｇ／ｍＬのＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）溶液を気管窓から気道の表面１ｃｍ２に投与すると、ＣＦＴＲ－／－ブタのＡＳＬのｐＨが上昇した（図８、パネルＤ）。
これらの結果は、小分子イオンチャネルが、ＣＦ気道上皮の頂端膜をＨＣＯ３ －に対して透過性にすることができ、さらに気道宿主防御の重要な要素であるＡＳＬのｐＨ、粘度、および抗菌活性を回復させることができることを示す。ＣＦＴＲは陰イオンを選択的に導くが、ＡｍＢチャネルは一価の陰イオンと陽イオンの両方を導く。したがって、ＡｍＢはＣＦＴＲ陰イオンチャネルの不完全な代用物である。しかしながら、陰イオン分泌の電気化学的駆動力を作り出す堅牢なメカニズムは、非選択的チャネルが、ＣＦ気道上皮における基本的な欠陥である陰イオン分泌を支援するのに十分となる設定を確立する。陰イオン交換輸送体および他の頂端膜タンパク質陰イオンチャネルによるＡｍＢ媒介性クロライド分泌のＨＣＯ３ －分泌への連結（５０）など、他のメカニズムも、経上皮ＨＣＯ３ －輸送の観察されたＡｍＢ媒介性の増加に寄与する可能性がある。これらの結果は、ＣＦＴＲをほとんどまたはまったく生成しないナンセンスコドンおよび未成熟終止コドンを有するＣＦ患者を含めて、ＣＦ患者を治療するための、ＣＦＴＲに依存しない、したがって遺伝子型に依存しないアプローチを明らかにする。このメカニズムは他と異なるため、ＣＦＴＲモジュレーターとの相加効果の可能性もある（２７、４７）。さらに、ＡｍＢはすでに臨床的に承認された薬物であり、ＣＦの患者に有益となることができ、さらにＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）は肺に安全に送達され、重大な全身曝露を引き起こすことなく肺の真菌感染症を治療する（４９、５１）。
したがって、非選択的イオンチャネル形成小分子であるアムホテリシンＢ（ＡｍＢ）の頂端添加は、培養ヒトＣＦ気道上皮におけるＨＣＯ３ －分泌を回復させ、ＡＳＬのｐＨを高めた。これらの効果は、側底のＮａ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅを必要とし、これは頂端のＡｍＢチャネルがこの陰イオン分泌のドライバーと機能的に連動したことを示す。ＡｍＢはまた、ＣＦＴＲを生成しない変異を含めて、さまざまな変異により引き起こされるＣＦの人々からの気道上皮の初代培養物におけるＡＳＬのｐＨ、粘度、および抗菌活性を回復させ、さらにｉｎ ｖｉｖｏでＣＦＴＲヌルのブタのＡＳＬのｐＨを高めた。したがって、非選択的小分子イオンチャネルは、ＣＦＴＲに依存しない、したがって遺伝子型に依存しないメカニズムを介して、ＣＦ気道宿主防御を回復することができる。
実施例８．ＰＯＰＣリポソームからのＮａ＋、Ｋ＋、Ｃｌ－およびＨ１３ＣＯ３ －の流出の検討（図９、パネルＡ～Ｄ；図１３、パネルＡ）
一般情報：パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）は、ＣＨＣｌ３中の２５ｍｇ／ｍＬ溶液としてＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）から入手し、乾燥アルゴン雰囲気下において－２０℃で保存し、３か月以内に使用した。コレステロール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）はエタノールからの再結晶により精製した。ＮａＨ１３ＣＯ３は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから白色固体として得た。ナトリウム、カリウムおよびクロライドイオンの測定は、ファラデーケージ内に適切なイオン選択性プローブを備えたＤｅｎｖｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｄｅｎｖｅｒ、ＣＯ）Ｍｏｄｅｌ ２２５ ｐＨメーターを使用して取得した。ナトリウム選択性測定は、Ｏｒｉｏｎマイクロナトリウム電極（Ｔｈｅｒｍｏ ９８１１ＢＮ）を使用して取得した。カリウム選択性測定は、防水ＢＮＣコネクタを備えたＯｒｉｏｎカリウムシュアフロー複合電極（Ｔｈｅｒｍｏ ９７１９ＢＮＷＰ）を用いて取得した。クロライド選択性測定は、Ｏｒｉｏｎクロライド複合型電極（Ｔｈｅｒｍｏ ９６１７ＢＮＷＰ）を使用して取得した。ナトリウム流出実験では、２３℃でインキュベートした７ｍＬバイアル中の磁気攪拌した１．５ｍＬ溶液において測定を行った。クロライドおよびカリウムの流出実験では、２３℃でインキュベートした２０ｍＬバイアル中の磁気攪拌した４ｍＬ溶液において測定を行った。ナトリウム、カリウム、およびクロライドの流出実験に関して、流出実験の過程全体を通して、各イオンの濃度を１０秒ごとにサンプリングした。ＨＣＯ３ －流出実験のための１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ ５ｍｍ ｂｒｏａｄｂａｎｄ ａｕｔｏｘプローブを備えたＶａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ ６００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計で取得した。１３Ｃ周波数は１５０．８３ＭＨｚに設定し、スペクトル幅は３７０３７Ｈｚであった。機器をＤ２Ｏでロックした。実験条件は次のとおりである：取得時間、０．９３秒；３０°パルス幅、３．３μ秒；緩和遅延、０．２秒；スキャン数、２５６；温度２３℃。インバースゲート１３Ｃスペクトルを収集した。
リポソームの調製：脂質フィルムを調製する前に、この溶液を周囲温度に温めて、凝縮による溶液の汚染および脂質フィルムの劣化を防止した。４２ｍｇの固体コレステロールを２０ｍＬのシンチレーションバイアル（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に加え、続いて１４ｍＬのＰＯＰＣ溶液を加えた。穏やかな窒素流で溶媒を除去し、使用前に、得られた脂質フィルムを最低１２時間高真空下で保管した。ナトリウム流出実験では、フィルムを２ｍＬの２５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５で再水和し、約３分間激しくボルテックスして多層小胞（ＭＬＶ）の懸濁液を形成した。カリウム流出実験の場合、フィルムを２ｍＬの２５０ｍＭ ＫＨＣＯ３、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５で再水和した。クロライド流出実験の場合、フィルムを２ｍＬの２５０ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５で再水和した。ＨＣＯ３ －流出実験の場合、フィルムを２ｍＬの２５０ｍＭ ＮａＨ１３ＣＯ３、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５（Ｄ２Ｏ）で再水和した。十分な量の大きな単層小胞（ＬＵＶ）を得るために、少なくとも２つの独立した脂質フィルム調製物を後続のＬＵＶ形成のために一緒にプールした。次に、脂質懸濁液を、Ｈ１３ＣＯ３ －リポソームについて前述したように１５回の凍結融解サイクルにかけた。透析およびその後の流出実験のために、複数の１ｍＬ調製物を一緒にプールした。新たに形成されたＬＵＶは、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ ＭＷＣＯ ３，５００透析カセット、１５ｍＬ容量を使用して透析した。ＬＵＶ懸濁液を６２．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）６００ｍＬに対して３回透析した。最初の２回の透析は２時間であったが、最後の透析は一晩行った。
全リンの測定を適応させた（５３）。ＬＵＶ溶液を、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３（Ｄ２Ｏ）中の８７ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４で４０倍に希釈した。希釈したＬＵＶ懸濁液の３つの１０μＬサンプルを３つの別個の７ｍＬバイアルに添加した。続いて、溶媒をＮ２流で除去した。４５０μＬの８．９Ｍ Ｈ２ＳＯ４を、ブランクとして用いた脂質を含まない第４のバイアルを含めて、各乾燥ＬＵＶフィルムに添加した。４つのサンプルを２２５℃のアルミニウムヒーティングブロックにおいて周囲雰囲気に開放して２５分間インキュベートし、その後で２３℃に移し、室温で５分間冷却した。冷却後、各サンプルに１５０μＬの３０％ｗ／ｖ過酸化水素水溶液を添加し、バイアルを２２５℃のヒーティングブロックに３０分間戻した。次にサンプルを２３℃に移し、室温で５分間冷却した後、３．９ｍＬの水を添加した。次いで、５００μＬの２．５％ｗ／ｖモリブデン酸アンモニウムを各バイアルに添加し、得られた混合物を５回短時間激しくボルテックスした。続いて、５００μＬの１０％ｗ／ｖアスコルビン酸を各バイアルに添加し、得られた混合物を５回短時間激しくボルテックスした。バイアルをＰＴＦＥライニングキャップで封をして、１００℃のアルミニウムヒーティングブロックに７分間置いた。サンプルを２３℃に移し、室温で約１５分間冷却して、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法による分析の前に２３℃にした。全リンは、８２０ｎｍでの吸光度を測定し、この値をこの方法および既知濃度の標準リン溶液で得られた標準曲線と比較することにより決定した。
ＬＵＶからの流出：ナトリウム、カリウムおよびクロライドの流出実験では、プールされたＬＵＶ懸濁液を、６２．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３で７０ｍＭに希釈した。ＬＵＶ懸濁液（ナトリウムの場合は１．５ｍＬ、クロライドとカリウムの場合は４ｍＬ）を７ｍＬまたは２０ｍＬのバイアルに加え、穏やかに攪拌した。適切なプローブを挿入し、ＡｍＢの添加前に１分間データを収集した。ナトリウム流出実験では、１５μＬのビヒクルまたはＡｍＢ（７０μＭの最終濃度、ＤＭＳＯ中の１００倍ストック溶液）を１．５ｍＬのＬＵＶ懸濁液に加え、データを１０分間収集した。完全なイオン放出を行うために、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の３０％ｖ／ｖ溶液１５μＬを添加し、さらに５分間データを収集した。クロライドおよびカリウムの流出実験では、４０μＬのビヒクルまたはＡｍＢ（最終濃度７０μＬ、ＤＭＳＯ中の１００倍ストック溶液）を４ｍＬのＬＵＶ懸濁液に加え、データを１０分間収集した。完全なイオン放出を行うために、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の３０％ｖ／ｖ溶液４０μＬを添加し、さらに５分間データを収集した。ＨＣＯ３ －流出実験では、５μＬのＤＭＳＯまたは滅菌水ビヒクル、ＡｍＢ：Ｃｈｏｌ、またはＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）（７０μＭ ＡｍＢ、ＤＭＳＯまたは滅菌水中の１００倍ストック）を、Ｎｅｗ Ｅｒａ（Ｖｉｎｅｌａｎｄ，ＮＪ）の５ｍｍ ＮＭＲサンプルチューブ中の５００μＬのプールされたＬＵＶ懸濁液に添加し、６０分間連続してＦＩＤを取得した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の３０％ｖ／ｖ溶液５μＬを添加して、完全なイオン放出を行った。
各実行からの流出データを、０～１００％の総イオン放出に対するパーセントに正規化した。ＨＣＯ３ －流出実験では、リポソーム懸濁液の溶解後、１３Ｃグルコース標準の積分と比較した小胞外ＨＣＯ３ －に対応する信号の積分を、１００％流出に対応するようにスケーリングした。ＡｍＢを添加した各実験の実行について、小胞外ＨＣＯ３ －に対応する信号を、各ＦＩＤの１３Ｃ内部標準と比較して積分した。スケーリング係数Ｓは、次の関係式を用いて各実験について計算した。
Figure 0007355335000004
 次に、各データポイントにＳを掛けてから、時間の関数としてプロットした。
実施例９．ＰＯＰＣリポソームからのＨ＋流出の検討（図９、パネルＤ）
ＰＯＰＣ／１０％コレステロールリポソームからのプロトン流出を上記のように決定した（３３）。
実施例１０．ＰＯＰＣリポソームからのＨ１３ＣＯ３ －流出の１３Ｃ ＮＭＲでの検討（図９、パネルＥ～Ｈ）
コレステロール含有ＰＯＰＣ脂質フィルムを上記のように調製し、使用前に最低１２時間高真空下で保管した。次に、フィルムを、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５（Ｄ２Ｏ）中の２５０ｍＭ ＮａＨ１３ＣＯ３２ｍLで水和し、約３分間激しくボルテックスして、多層小胞（ＭＬＶ）の懸濁液を形成した。次に、脂質懸濁液を１５回の凍結融解サイクル（懸濁液を交互に、液体窒素浴で凍結させ、その後５０℃の水浴で解凍させる）にかけた。得られた脂質懸濁液をＨａｍｉｌｔｏｎ（Ｒｅｎｏ、ＮＶ）の１ｍＬの気密シリンジに引き込み、シリンジをアバンティポーラーリピッド社のミニ押出機（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｍｉｎｉ－Ｅｘｔｒｕｄｅｒ）に入れた。次に、脂質溶液を５．００μｍのＭｉｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）ポリカーボネートフィルターに３５回通し、新たに形成されたＬＵＶ懸濁液を、ＭＬＶの元の懸濁液を含まないシリンジに収集して、ＭＬＶがＬＵＶ溶液に入り込むのを防いだ。十分な量のＬＵＶを得るために、２つの独立した１ｍＬの調製物を一緒にプールして透析およびその後の流出実験に使用した。新たに形成されたＬＵＶを、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ ＭＷＣＯ ３，５００透析カセット（３ｍＬ容量）を使用して透析した。ＬＵＶ懸濁液を、攪拌しながら、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３（Ｈ２Ｏ）中の８７ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４溶液３００ｍＬに対して１０回透析した。最初の透析は４時間であったが、その後の９回の透析は１時間行った。リン含有量の決定は上記のように行った。
プールしたＬＵＶ溶液を、８７ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３（Ｄ２Ｏ）で７０ｍＭに希釈し、さらに０．０２５％（ｗ／ｖ）１３Ｃ Ｄ－グルコース（１－１３Ｃ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を内部標準として添加した。１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、５ｍｍ ＢＢＦＯ ＣｒｙｏＰｒｏｂｅを搭載したＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ＨＤ ５００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計で取得した。１３Ｃ周波数は１２５．８３ＭＨｚに設定し、スペクトル幅は３１，５１２Ｈｚであった。機器をＤ２Ｏでロックした。実験条件は次のとおりである：取得時間、０．９３秒；３０°パルス幅、３．３μ秒；
緩和遅延、０．２秒；スキャン数、２５６；温度２３℃。
各実験で、１．４μＬのビヒクル、ＡｍＢ、またはＣ３５ｄｅＯＡｍＢ（最終濃度１７．５μＭ、ストック溶液はＤＭＳＯ中１００倍濃縮）を１４０μＬのリポソーム懸濁液に添加した。リポソーム懸濁液を直ちにＮｅｗ Ｅｒａ（Ｖｉｎｅｌａｎｄ，ＮＪ）のマイクロＮＭＲサンプルチューブ（３ｍｍ下部／５ｍｍ上部）に移し、８つの連続した自由誘導減衰（ＦＩＤ）を上記のように取得した。ＭｎＣｌ２を使用した実験では、ＡｍＢの添加後に５μＬの５０ｍＭ ＭｎＣｌ２溶液を添加した。完全なイオン放出を行うために、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の３０％（ｖ／ｖ）溶液１０μＬをリポソーム懸濁液に添加した後にデータを取得した（１５、５４－５６）。
実施例１１．細胞株および気道上皮の初代培養物におけるＡＳＬのｐＨの測定（図７、パネルＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇ；図４、パネルＡ、Ｃ、Ｅ；図８、パネルＡ、Ｂ；図１１、パネルＤ；図１３、パネルＣ；図１４、パネルＢ、Ｃ）
この実験には、小径のＮｕＬｉ、ＣｕＦｉ、および初代培養上皮を使用した（０．３３ｃｍ２）。レシオメトリックｐＨインジケーターＳＮＡＲＦ結合デキストラン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用してＡＳＬのｐＨを測定した。ＳＮＡＲＦ粉末を、超音波処理を介してパーフルオロカーボン（ＦＣ－７２、Ｓｉｇｍａ）中に懸濁させ、頂端表面に分配させた。ＡＳＬのｐＨを２時間後に測定した（３、４、２５）。細胞株培養物については、４０倍水浸レンズでＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ８００顕微鏡を使用し、また初代培養物についてはＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０顕微鏡を使用して、ＳＮＡＲＦを４８８ｎｍで励起し、５８０ｎｍおよび６４０ｎｍで発光を記録した。ｐＨ測定の標準曲線を作成するために、ＳＮＡＲＦを無色のｐＨ標準物に溶解し、蛍光比をｐＨに変換した。
このアッセイで試験する薬剤は、最初に粉末に凍結乾燥し、次いで適切な体積のパーフルオロカーボン（ＦＣ－７２、Ｓｉｇｍａ）中に懸濁し、１分間超音波処理して懸濁させた。ＡｍＢｉｓｏｍｅは超音波処理すべきではない；代わりに、微粉末をボルテックスで懸濁させた。この懸濁液２０μＬを、懸濁液中の以下のおおよその濃度で培養気道上皮（０．３３ｃｍ２）の表面に投与した：
アムホテリシンＢ：０．２５～１００μΜ
アムホテリシンＢ－コレステロール複合体：０．５～１００μΜ
Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ：２μΜ（１７）
１０ｍＭウアバイン（Ｎａ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅの阻害）（９）
１０μΜフォルスコリン／１０μΜイバカフトール（２５）
ＡｍＢｉｓｏｍｅ：０．２５～２４５０μｇ／ｍＬ
すべての実験において、化合物で処理した上皮のＡＳＬのｐＨを測定し、結果をビヒクルで処理した上皮と比較した。
頂端ＡｍＢ投与では、培養気道上皮を３７℃で３０分～４８時間インキュベートした後、ＡＳＬのｐＨを測定した。ＡｍＢ－コレステロール複合体およびＣ３５ｄｅＯＡｍＢ投与では、培養気道上皮を３７℃で４８時間培養した後、ＡＳＬのｐＨを測定した。Ｎａ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅ阻害の効果を試験するために、ＡｍＢを投与した４７時間後に１０ｍＭウアバインを添加し、培養気道上皮を３７℃でさらに１時間インキュベートした後、ＡＳＬのｐＨを測定した。１０μＭイバカフトール／１０μＭフォルスコリンの投与の場合、培養気道上皮を３７℃で２時間インキュベートした後、ＡＳＬのｐＨを測定した（２５）。側底ＡｍＢ投与では、ＤＭＳＯ中の２ｍＭのＡｍＢストックをＵＳＧ培地で最終濃度２μＭまで１０００倍に希釈した。培養気道上皮の側底側の培地をＡｍＢ含有ＵＳＧ培地で置き換え、３７℃で４８時間インキュベートした後、ＡＳＬのｐＨを測定した。
実施例１２．ＮｕＬｉおよびＣｕＦｉ単層のｐＨスタット滴定（図４、パネルＡ）
この実験には、大径のＮｕＬｉおよびＣｕＦｉ－１培養上皮を使用した（４．６７ｃｍ２）。これらの培養物を、トランズウェルアダプター用の培養カップインサート、２４ｍｍ（Ｕ９９２４Ｔ－２４）を使用して、デュアルチャネルＵｓｓｉｎｇチャンバ（Ｗａｒｎｅｒ Ｕ２５００）に取り付けた。頂端側には緩衝剤を含まない溶液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣ１、２ｍＭ ＣａＣｌ２、および１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍＭデキストロース、空気でガス処理）を用い、側底側にはＨＣＯ３ －緩衝液（１２０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、５ｍＭ ＫＣ１、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１３．７５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５．６ｍＭデキストロース、ｐＨを７．０に調整）またはＨＣＯ３ －を含まない緩衝液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭデキストロース、ｐＨ７．０に調整）を用いて、３７℃で膜を浸した。微小径のｐＨ電極（８９２３１－５９０）および温度プローブ（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔ２０１ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｓｅｎｓｏｒ，Ｅ５１Ｍ００１）、およびＨａｃｈ ΤＩΜ８５６ ＮＢ ｐＨ／ＥＰ／Ｓｔａｔ ｐＨ－ＳＴＡＴ Ｔｉｔｒａｔｏｒ（Ｒ４１Ｔ０２８）に取り付けられた滴定ビュレットを頂端チャンバに挿入した。ガス交換を防ぐために、側底チャンバをチャンバの蓋で覆った。次に、既知のｐＨ溶液（Ｈａｃｈ、Ｓ１１Ｍ００２、Ｓ１１Ｍ００４、Ｓ１１Ｍ００７）を使用して、ｐＨ電極を校正した。
１ｍＭ ＨＣｌを滴定剤として使用して、頂端ｐＨを目標のｐＨ６．０に滴定した（最小速度０．２５ｍＬ／分、最大速度０．３５ｍＬ／分）（２８、５７－５９）。酸滴定を２０分かけて測定し、培養上皮のベースライン値を確立した（最大速度２ｍＬ／分）。次に、頂端側と側底側の両方の浴溶液を取り除いた。ＤＭＳＯ中のＡｍＢのストック溶液を０．５、１または２μＭの最終濃度まで、緩衝剤を含まない溶液のアリコートに加え、頂端チャンバに添加し、側底チャンバは新鮮なＨＣＯ３ －緩衝液またはＨＣＯ３ －を含まない緩衝液で置き換えた。滴定剤として１ｍＭ ＨＣｌを使用して、頂端側のｐＨを目標のｐＨ６．０に再度滴定した。次に、酸滴定をさらに２０分かけて測定して、頂端溶液におけるＡｍＢ媒介性のｐＨ変化を評価した。
データを１分あたりのＨ＋滴定のｎモルとしてプロットし、この曲線の勾配を培養物の面積（４．６７ｃｍ２）で割って、酸滴定の速度（ｎモルＨ＋／分／ｃｍ２）を得た。
実施例１３．ＣｕＦｉ－１単層におけるＡＳＬのＮａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋の濃度の測定（図１０、パネルＢ～Ｅ）
この実験には、小径のＣｕＦｉ－１培養上皮を使用した（０．３３ｃｍ２）。実験の開始の２４時間前に、すべての培養上皮の頂端側を２００μＬの温かいＰＢＳで３回すすいで過剰な粘液を除去した。新鮮なＵＳＧ培地を側底膜に添加した。ＣｕＦｉ－１上皮を、パーフルオロカーボン（ＦＣ－７２）ビヒクル、またはＦＣ－７２中に懸濁した２μＭのＡｍＢのいずれかで処理し、３７℃で４８時間インキュベートした。０．１μＬ容量のマイクロキャピラリーチューブ（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮＣ１４５３２１４）を２００μＬのピペットチップ（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐ１１２２）に入れた。ＡｍＢ添加の４８時間後、毛細管現象によってＡＳＬで完全に満たされるまで、マイクロキャピラリーチューブを各上皮培養インサートの頂端膜の端の周りにそっと触れさせた。０．１μＬのＡＳＬを収集した後、ｐ２００ピペットを使用して、サンプル全体を１５μＬの分子生物学用グレードの水（Ｃｏｒｎｉｎｇ ４６－０００－ＣＭ）に押し込んだ。次に、サンプルを、５０μＬの分子生物学用グレードの水で３回洗浄することにより、１５ｍＬ容量の円錐バイアルに定量的に移した。
ナトリウム、マグネシウム、カリウム、カルシウムの定量は、酸性化サンプルの誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）を使用して行った。各サンプルを、再蒸留水中の１．０％ＨＮＯ３（ｖ／ｖ）で５ｍＬの最終体積に希釈した。定量標準は、混合した各元素１００μｇ／ｍＬのＮａ、Ｍｇ、Ｋ、およびＣａの標準（Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｂｕｒｇ，ＶＡ，ＵＳＡ）を使用して作成し、これらを組み合わせて１．０％の硝酸（ｖ／ｖ）中の１００ｎｇ／ｍＬの混合元素標準を作成した。
ＩＣＰ－ＭＳは、ＫＥＤモードで動作し、ＥＳＩ ＳＣ－２ＤＸ ＰｒｅｐＦＡＳＴオートサンプラー（Ｏｍａｈａ，ＮＥ，ＵＳＡ）を備えたコンピューター制御（ＱＴＥＧＲＡソフトウェア）Ｔｈｅｒｍｏ ｉＣａｐＱ ＩＣＰ－ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で実行した。内部標準は、ｐｒｅｐＦＡＳＴシステムを使用してインラインで添加され、Ｂｉ、Ｉｎ、６Ｌｉ、Ｓｃ、Ｔｂ、Ｙを含む１ｎｇ／ｍＬの混合元素溶液（Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ＶｅｎｔｕｒｅｓのＩＶ－ＩＣＰＭＳ－７１Ｄ）からなる。オンライン希釈もｐｒｅｐＦＡＳＴシステムによって行われ、５０００、１０００、５００、１００、および５０ｎｇ／ｍＬのＮａ、Ｍｇ、Ｋ、Ｃａで構成される検量線の作成に使用した。各サンプルは、１回の調査実行（１０掃引）と３回のメイン（ピークジャンプ）実行（４０掃引）を使用して取得した。分析のために選択された同位体は、２３Ｎａ、２４Ｍｇ、３９Ｋ、４４Ｃａおよび８９Ｙ（データ補間および機械安定性のための内部標準として選択された）であった。機器の性能は、自動チューニングとそれに続く性能レポートによる検証（製造元の仕様に合格）によって毎日最適化する。
実施例１４．ＮｕＬｉおよびＣｕＦｉ単層を横切るＨ１４ＣＯ３ －輸送（図７、パネルＢ、Ｄ、Ｈ；図４、パネルＤ；図１１、パネルＡ～Ｃ；図１３、パネルＢ）
この実験には、小径のＮｕＬｉおよびＣｕＦｉ培養上皮を使用した（０．３３ｃｍ２）。１４Ｃ標識されたＨＣＯ３ －ナトリウムは、無菌の３５．７ｍＭ水溶液、ｐＨ９．５（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ ０１１７４４１Ｈ）として得た。すべての実験を、播種後２か月未満で実行した。実験の前に、新鮮なＵＳＧ培地を側底側に添加した。頂端膜を、パーフルオロカーボン７２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中の懸濁液として２０μＬのビヒクル、ＡｍＢまたはイバカフトール／フォルスコリンで処理し、培養上皮を５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で４８時間、７日、１４日または２８日間インキュベートした。治療期間の終了後、ＵＳＧ培地中の１．４ｍＭ Ｈ１４ＣＯ３ －ストック溶液５μＬを側底側の培地に加えた。次に、培養上皮を３７℃で１０分間インキュベートした。１０分後、培養上皮の頂端膜を直ちに２００μＬのＰＢＳで洗浄した。ＡＳＬ洗浄液と２００μＬの側底培地のアリコートをシンチレーションカクテルで希釈し、液体シンチレーションカウンティングで分析した（２３）。
実施例１５．ＮｕＬｉおよびＣｕＦｉ単層のＵｓｓｉｎｇチャンバでの検討（図１１、パネルＥ～Ｇ）
膜発現ＣＦＴＲの存在を評価するために、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ０．４μｍ２４ウェルプレート トランズウェルクリアーポリエステルメンブレンインサート上で成長させたＮｕＬｉおよびＣｕＦｉ－１上皮の分化培養物を使用した。ＮｕＬｉおよびＣｕＦｉ－１上皮を、２０μＬのパーフルオロカーボン（ＦＣ－７２、Ｓｉｇｍａ）ビヒクル、または超音波処理してＦＣ－７２中に懸濁させた２μＬのアムホテリシンＢ（ＡｍＢ）で処理した。４８時間のインキュベーション後、トランズウェルアダプター用の培養カップインサート６．５ｍｍ（Ｗａｒｎｅｒ Ｕ９９２４Ｔ－０６）を使用して、上皮をデュアルチャネルＵｓｓｉｎｇチャンバ（Ｗａｒｎｅｒ Ｕ２５００）に取り付け、頂端側と側底側の両方を、３７℃のＨＣＯ３ －溶液（１２０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、５ｍＭ ＫＣ１、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１３．７５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）に浸し、圧縮空気でガス処理した。デキストロースを実験の直前にこの溶液に加えて、最終濃度を５．６ｍＭにした。上皮のナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）とカルシウム活性化クロライドチャネル（ＣａＣＣ）をそれぞれ１μΜのアミロライドと１μΜのＤＩＤＳ（４，４’－ジイソチオシアノスチルベン－２，２’－ジスルホン酸）の頂端添加により阻害して、透過化（permeabilization）のベースラインを樹立した。頂端に添加した１０μΜフォルスコリン／１００μΜ ＩＢＭＸ（３－イソブチル－１－メチルキサンチン）を使用してＣＦＴＲを活性化し、１μΜ ＣＦＴＲｉｎｈ－１７２を使用してＣＦＴＲを阻害した。試薬を連続して添加するたびに、次の試薬を添加する前に約１０分間平衡化させた（１５）。
実施例１６．経上皮電気抵抗（Ｒｔ）の測定（図１１、パネルＨ）
この実験には、小径のＣｕＦｉ－１培養上皮を使用した（０．３３ｃｍ２）。培養上皮を、ＦＣ－７２ビヒクル、パーフルオロカーボン（ＦＣ－７２、Ｓｉｇｍａ）中の２および５０μＭのＡｍＢで４８時間、７日または２８日間処理した。２００μＬの新鮮なＵＳＧ培地を上皮の頂端側に置いた。次に、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）ＥＲＳ－２電圧計を使用して、生物学的複製ごとに２つの技術的複製について蛇行パターンで上皮の頂端側と側底側を横切る経上皮電気抵抗（Ｒｔ）を測定した。
実施例１７．乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイ（図１１、パネルＩ）
この実験には、小径のＣｕＦｉ－１培養上皮を使用した（０．３３ｃｍ２）。ＬＤＨ細胞毒性アッセイキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用して、ＡｍＢがＣｕＦｉ－１気道上皮に毒性があるかどうかを確認した。処理前に、上皮の側底側から培地を除去し、５００μＬの新鮮なＵＳＧ培地と交換した。次に、培養上皮を、ＦＣ－７２ビヒクル、パーフルオロカーボン（ＦＣ－７２、Ｓｉｇｍａ）中の２および５０μＭのＡｍＢで４８時間、７日または２８日間処理した。各実験時間枠の終了の４８時間前に、側底側の培地を再度交換し、２０μＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液を頂端表面に添加して、最大の放出を引き出した。実験当日、キットの指示に従ってアッセイ試薬を調製し、バックグラウンド対照用に５００μＬのＵＳＧ培地を２４ウェルプレートの３つの空のウェルに添加した。培養インサートをウェルから取り外し、２５０μＬのＬＤＨ反応溶液を各ウェルに添加した。次に、プレートをオービタルシェーカーで３０分間、３７℃で穏やかに振盪した。プレートリーダーを使用して、４９０ｎｍで吸光度を読み取った。細胞毒性％は次のように計算した：
Figure 0007355335000005
実施例１８．気道表面液（ＡＳＬ）の高さのアッセイ（図７、パネルＦ、図１２）
ＡＳＬの高さは、確立された蛍光色素アッセイ（６０、６１）を使用して検討した。この実験には、小径のＮｕＬｉおよびＣｕＦｉ－１培養上皮を使用した（０．３３ｃｍ２）。実験開始の２４時間前に、すべての培養上皮の頂端側を温かいＰＢＳで３回すすいで、過剰な粘液を除去した。ＮｕＬｉ上皮は、パーフルオロカーボン（ＦＣ－７２）ビヒクル、または側底側の培地に添加したＤＭＳＯビヒクル中の５００μＭのブメタニドで処理し、ＣｕＦｉ上皮は、側底側の培地に添加したＤＭＳＯビヒクル中の５００μＭのブメタニドありまたはなしで、２０μＬのビヒクル、パーフルオロカーボン（ＦＣ－７２、Ｓｉｇｍａ）中に懸濁させた０．００５、０．５または５０μＭのＡｍＢ、あるいは０．５μＭのＣ３５ｄｅＯＡｍＢで処理し、３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後、ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍＬの７０ｋＤａ Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ－デキストランコンジュゲート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）溶液２．５μＬを上皮の頂端側に添加し、続いて蒸発を防ぐために１００μＬのＦＣ－７７０を添加した。次に、イメージング用の１０ｍｍガラスボトムＦｌｕｏｒｏｄｉｓｈ（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上の１００μＬのＰＢＳの上に培養支持体を置いた。上皮を色素添加直後と２４時間後に再度画像化して、色素吸収を調べた。メンブレンごとに３つのＺスタック画像をＺｅｉｓｓ ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡で４０倍の油浸で撮影した。ＩｍａｇｅＪ（６２）を使用してこれらの画像を解析して、各画像の中央の１３００ピクセルの平均ＡＳＬ高さを決定した。画像を平滑化し、８ビットに変換し、赤い領域を最も正確に表すために閾値処理した。Ａｎａｌｙｚｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓのパラメータは、サイズが１～無限大μｍ２で、真円度が０％～１００％の粒子であった。高さは、ピクセル単位の出力領域を既知の１３００ピクセル幅で割って決定し、既知の倍率（scaling factor）０．４９μｍ／ピクセルを使用してマイクロメートルに変換した。
実施例１９．ＡｍＢで処理した気道上皮初代培養物の粘度（図８、パネルＣ）
気道上皮培養物のＡＳＬの粘度を測定した（７、２５）。この実験には、小直径の初代培養上皮を使用した（０．３３ｃｍ２）。頂端表面は、研究前少なくとも２週間洗浄しなかった。培養上皮を、パーフルオロカーボン（ＦＣ－７２、Ｓｉｇｍａ）中において投与した２μＭのＡｍＢで４８時間処理した。次に、粘度の測定の２時間前に、ＦＩＴＣ－デキストラン（７０ｋＤ、Ｓｉｇｍａ）を乾燥粉末として上皮の頂端表面に投与した。ＦＲＡＰは、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡ顕微鏡を使用して、３７℃の加湿チャンバ内でアッセイした。最大の回復に達するまで画像を取得した。各培養物の異なる場所から少なくとも６つの回復曲線を取得して平均化し、１つの上皮培養物のデータを得た。時定数（τ生理食塩水）は、蛍光回復曲線から回帰分析によって計算した。粘度は、生理食塩水の時定数に対する相対値として表した（τＡＳＬ／τ生理食塩水）。
実施例２０．ＡｍＢで処理した気道上皮初代培養物の抗菌活性（図８、パネルＤ、図１４、パネルＦ～Ｇ）
黄色ブドウ球菌でコーティングされた金グリッドを使用して、気道上皮培養物の抗菌活性を測定した（３、４）。この実験には、小径の初代培養上皮を使用した（０．３３ｃｍ２）。パーフルオロカーボン（ＦＣ－７２、Ｓｉｇｍａ）、２μＭのＡｍＢ、または２μＭのＣ３５ｄｅＯＡｍＢでの４８時間の処理後、気道上皮の頂端表面に、細菌でコーティングされた金ＴＥＭグリッドを１分間置いた。対照として、細菌でコーティングされたグリッドを、生理食塩水または生理食塩水の上に置いたＦＣ－７２中のＡｍＢに入れて、投与方法を１分間模倣した。除去後、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ ＢａｃＬｉｇｈｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してグリッド上の細菌の生存率を評価した。４～６領域で生存率を決定して、死んだ細菌のパーセンテージを決定した。
実施例２１．研究用の動物（図４、パネルＥ）
ＣＦＴＲ遺伝子ＣＦＴＲ－／－の標的破壊を有する雌および雄の新生ブタが研究され、ＣＦＴＲ＋／－ブタの交配から作製された。ブタはＥｘｅｍｐｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓから入手した。アイオワ大学の動物管理使用委員会はすべての動物実験を承認した。
実施例２２．ＣＦＴＲ－／－ブタのＡＳＬのｐＨの測定（図４、パネルＥ）
ＡＳＬのｐＨをブタにおいてｉｎ ｖｉｖｏで測定した（３、８）。ＡｍＢｉｓｏｍｅをブタの気管に投与するために、ブタを最初にケタミン（Ｋｅｔａｊｅｃｔ、Ｐｈｏｅｎｉｘ、２０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内注射）で鎮静させ、プロポフォール（Ｄｉｐｒｉｖａｎ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ、２ｍｇ／ｋｇ、静脈内注射）を使用して麻酔した。気管を外科的に露出させ、前方からアクセスし、気管軟骨輪を切開して小さな前方窓を開けた。生理的状態を模倣するために、１００％加湿チャンバ内で３７℃および一定の５％ＣＯ２でデータを取得した。
第１のＣＦＴＲ－／－ブタでは、ベースラインのＡＳＬのｐＨ測定を約８分間行った後、ＦＣ－７２中の１００μｇ／ｍＬのＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）６０μLを気管窓に投与した。ＡＳＬのｐＨは６０分間継続的に測定した。次に、６０μＬの１ｍｇ／ｍＬのＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）を気管窓に投与し、ｐＨをさらに６０分間継続的に測定した。第２のＣＦＴＲ－／－ブタでは、ベースラインのＡＳＬのｐＨ測定を約８分間行った後、内部対照として６０μＬのＦＣ－７２ビヒクルを気管窓に投与した。ＡＳＬのｐＨをさらに３０分間継続的に測定した。次に、６０μＬの１ｍｇ／ｍＬのＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）を気管窓に投与し、その後連続測定を１０６分間行った。第３と第４のＣＦＴＲ－／－ブタでは、ベースラインＡＳＬのｐＨ測定を約１０分間行った。その後、ＦＣ－７２中の１ｍｇ／ｍＬのＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）６０μＬを気管窓に投与し、連続測定を１２０分間行った。
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参照による組み込み
上記の説明で言及されたすべての特許および公開特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
等価物
理解を明確にするために、例証および例を通して本発明をある程度詳細に説明したが、本発明の範囲またはそれらのいずれかの具体的な実施形態に影響を与えることなく、条件、配合および他のパラメータの広いおよび同等の範囲内で本発明を修正または変更することによっても本発明を実施でき、またこのような修正および変更が添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されていることは当業者に明らかであろう。

Claims (18)

  1. 必要とする患者における嚢胞性線維症を治療するための組み合わせ医薬であって、治療的有効量の（ｉ）アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、および（ｉｉ）コレステロールを含み、
    前記ＡｍＢおよび前記コレステロールがエアロゾルとして患者の気道に投与され、
    前記患者はＣＴＦＲ陰イオンチャネルに２つの変異を有し、ＣＦＴＲ遺伝子の各コピーが前記２つの変異の１つを含み、前記２つの変異がそれぞれ独立して次の表から選択される、組み合わせ医薬。
    Figure 0007355335000006
    Figure 0007355335000007
    Figure 0007355335000008
  2. 嚢胞性線維症の患者の気道表面液のｐＨを高めるため、または嚢胞性線維症の患者の気道表面液の粘度を低下させるため、または嚢胞性線維症の患者の気道表面液の抗菌活性を高めるための組み合わせ医薬であって、治療有効量の（ｉ）アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、および（ｉｉ）コレステロールを含み、
    前記ＡｍＢおよび前記コレステロールがエアロゾルとして患者の気道に投与され、
    前記患者はＣＴＦＲ陰イオンチャネルに２つの変異を有し、ＣＦＴＲ遺伝子の各コピーが前記２つの変異の１つを含み、前記２つの変異がそれぞれ独立して次の表から選択される、組み合わせ医薬。
    Figure 0007355335000009
    Figure 0007355335000010
    Figure 0007355335000011
  3. 前記ＡｍＢと前記コレステロールが約１：１～約１：２．５の範囲のモル比で投与される、請求項１または２に記載の組み合わせ医薬。
  4. 前記ＡｍＢと前記コレステロールが約１：２．５のモル比で投与される、請求項３に記載の組み合わせ医薬。
  5. 前記ＡｍＢと前記コレステロールが、水と、ＡｍＢと、水素添加大豆ホスファチジルコリン、コレステロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、α－トコフェロール、スクロースおよびコハク酸二ナトリウム六水和物からなるリポソーム膜とから本質的になる組成物の形態で一緒に投与される、請求項４に記載の組み合わせ医薬。
  6. 前記ＡｍＢと前記コレステロールが別個の医薬組成物として投与される、請求項１～４のいずれか一項に記載の組み合わせ医薬。
  7. 前記ＡｍＢと前記コレステロールが同時に投与される、請求項６に記載の組み合わせ医薬。
  8. 前記コレステロールが、前記ＡｍＢの前または後の約５分以内～約１６８時間以内に投与される、請求項６に記載の組み合わせ医薬。
  9. 前記ＡｍＢと前記コレステロールが単一の医薬組成物で投与される、請求項１～５のいずれか一項に記載の組み合わせ医薬。
  10. 前記ＡｍＢと前記コレステロールが複合体として存在する、請求項９に記載の組み合わせ医薬。
  11. 前記２つの変異が、それぞれ独立して、２１８４ｄｅｌＡ、Ｆ５０８ｄｅｌ、Ｖ５２０Ｆ、１７１７－１Ｇ－＞Ａ、Ｅ６０Ｘ、Ｇ５５１Ｄ、Ｒ５５３Ｘ、およびＤ２５９Ｇから選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組み合わせ医薬。
  12. 前記患者が、Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｆ５０８ｄｅｌ、Ｇ５５１Ｄ／Ｆ５０８ｄｅｌ、Ｒ５５３Ｘ／Ｅ６０Ｘ、Ｆ５０８ｄｅｌ／１７１７－１Ｇ－＞Ａ、Ｆ５０８ｄｅｌ／２１８４ｄｅｌＡ、およびＤ２５９Ｇ／Ｖ５２０Ｆから選択される一対のＣＴＦＲ変異を有する、請求項１１に記載の組み合わせ医薬。
  13. 前記患者が、Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｆ５０８ｄｅｌ、Ｒ５５３Ｘ／Ｅ６０Ｘ、Ｆ５０８ｄｅｌ／１７１７－１Ｇ－＞Ａ、Ｆ５０８ｄｅｌ／２１８４ｄｅｌＡ、およびＤ２５９Ｇ／Ｖ５２０Ｆから選択される一対のＣＴＦＲ変異を有する、請求項１１に記載の組み合わせ医薬。
  14. 前記嚢胞性線維症がイバカフトールによる治療に不応性である、請求項１３に記載の組み合わせ医薬。
  15. 治療有効量の抗生物質と併用される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組み合わせ医薬。
  16. 前記患者がヒトである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組み合わせ医薬。
  17. 前記ヒトが１２歳未満である、請求項１６に記載の組み合わせ医薬。
  18. 前記ヒトが少なくとも１２歳である、請求項１６に記載の組み合わせ医薬。
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