JP7316912B2 - 細胞シート評価方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞シートの評価方法に関するものである。

再生医療は、幹細胞等から分化した細胞を移植することで、傷ついたり、機能低下したりした組織を修復し、正常な組織に回復させる治療法である。代表的な移植形態の一つに、細胞－細胞間及び細胞－細胞外マトリクス間が結合した細胞シートがある。細胞シートは皮膚、角膜、心臓、軟骨、食道等の幅広い部位の治療を対象としており、実用化に向けた研究が加速し一部製品化されている。

培養細胞の品質評価には、一般的には、細胞を固定する組織学的解析が用いられ、移植用の細胞自体を評価することは困難であった。角膜や皮膚の治療に用いられる上皮系細胞シートにおいては、タイトジャンクションの形成を利用し、培養状態のまま測定できる経上皮電気抵抗を利用した品質評価手法が提案され（非特許文献１、特許文献１参照）、複数の企業より測定装置が製品化されている。また上皮系に限らず細胞シートに適応可能な品質評価手法として、細胞シートを透過した光強度を測定することによって、シート化状態を判定する手法も提案されている（特許文献２参照）。

J. Wegener et al., "Automated multi-well device to measure transepithelial electrical resistances under physiological conditions", BioTechniques, vol.37, No.4 (2004), p.590 E. O. Potma et al., "Detection of single lipid bilayers with coherent anti‐Stokes Raman scattering (CARS) microscopy", J Raman Spectrosc, vol.34, No.9 (2003), p.642

特開２００９－２７９２８号公報 特開２０１２－１５２１８９号公報

本発明は、新規な細胞シート評価方法を提供することを目的とする。

本発明の一実施態様は、細胞シートの顕微観察画像から、前記細胞シートを構成する細胞の形態の均一性を表す特徴を解析する工程と、前記解析の結果に基づき、前記細胞シートにおける細胞間の結合状態を評価する工程と、を含む細胞シート評価方法である。前記特徴は空間周波数であってもよく、フーリエ変換を用いて、前記空間周波数が解析されてもよい。また、前記特徴は細胞シートを構成する細胞の粒径分布または形状分布であってもよい。細胞間の結合状態を評価する工程が、適正であることが明らかになっている前記細胞シートの標準サンプルの前記特徴を解析する第１の工程と、前記標準サンプルの前記特徴と前記細胞シートの前記特徴を比較する第２の工程と、第２の工程において比較した結果から、前記細胞シートにおける細胞間の結合状態を評価する第３の工程と、を含んでもよい。

本発明によって、新規な細胞シート評価方法を提供することが可能となった。

本発明の一実施形態にかかる評価システムの全体図である。 本発明の一実施形態にかかる評価システムのユーザーインターフェースの例である。 本発明の一実施形態にかかるフローチャートである。 本発明の一実施例における（Ａ）細胞シートの位相差顕微鏡像（Ｂ）二次元フーリエ変換による空間周波数解析と経上皮電気抵抗値（ＴＥＲ値）との相関関係、を示す図である。

以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

＝＝細胞シート評価システムの構成＝＝
図１は本明細書に開示される細胞シート評価システムの一例を示す模式図である。この評価システムは、培養細胞シート１０１を観察し、画像データを作製するための細胞観察装置１０２と、観察画像を解析するための評価装置１０３と、ユーザーインターフェースを備える表示装置１０７と、データベース１０６とを備える。データベース１０６は、評価装置１０３内にあっても、評価装置１０３とは別の記憶装置内にあってもかまわない。ユーザーインターフェースの一例を図２に示す。観察条件及び解析条件の設定や判定結果が表示される。例えば、インターフェース上のパワースペクトルグラフにおいて評価帯域２０１を変更し、選択周波数帯域での再構成像を参照しながら、データに用いる観察画像を決定することができる。選択基準としては、細胞シート構成細胞のサイズの情報等、評価に必要な情報を用いることができる。

培養細胞シート１０１は単層であっても、積層されていて多層になっていてもよい。細胞の種類は特に限定されないが、上皮細胞や実質細胞などで、比較的形状が一様である細胞が好ましい。

細胞観察装置１０２は、培養細胞シート１０１を観察するための観察装置、観察装置で観察した培養細胞シート１０１を撮影し、画像データを生成するための撮影装置、画像データを評価装置に送信するための送信部、ユーザーが観察条件や撮影条件などを入力する観察条件入力部と、を備える。培養細胞シート１０１が多層の場合、観察装置１０２は多層培養細胞シートの任意の層を観察できるように、三次元観察能を有していることが好ましく、共焦点顕微鏡やデジタルホログラフィック顕微鏡が例として挙げられる。単層細胞シートの場合は、位相差顕微鏡、明視野顕微鏡、微分干渉顕微鏡等の三次元観察能を有していない観察装置を用いてもよい。撮影装置は、画像素子を備えたｃｃｄカメラが好ましい。

評価装置１０３は、画像データに含まれる培養細胞シート１０１の観察画像を解析する解析部１０４と、解析結果を判定するための判定部１０５と、細胞観察装置１０２から画像ファイルを受信するための受信部と、観察画像の判定結果を表示装置に出力するための出力部と、ユーザーが解析条件などを入力する解析条件入力部と、を備える。

データベース１０６は、過去に使用された、観察画像を解析するための解析条件や、培養細胞シート１０１の判定基準などを有する。

＝＝細胞シート評価システムを用いた細胞シート評価方法の概略＝＝
図３は、観察条件の設定から培養状態の判定結果出力までの処理を示すフローチャートである。まず、ユーザーが観察条件入力部から観察条件（例えば、観察領域）（Ｓ３０１）や撮影条件（例えば、露光時間）（Ｓ３０２）を入力する。観察条件や撮影条件に従って、観察装置を用いて画像取得を開始し（Ｓ３０３）、撮影装置を用いて露光し、露光位置を移動させながら、全領域をスキャンし（Ｓ３０４～Ｓ３０８）、全領域の画像データを得る。画像データを解析部に送信する（Ｓ３０９）。ユーザーは、解析条件入力部から、表示部に表示される観察画像を参照しながら、解析する細胞シートの層を選択し（Ｓ３１０）、さらに解析手法（Ｓ３１１）と解析条件（Ｓ３１２）を設定する。解析手法や解析条件はユーザーが入力することにより設定してもよいが、解析実績がある培養条件に対してはデータベースから既存の設定を読み込んでもよい。次に、ユーザーは、データベースから培養状態の判定基準を読み込む（Ｓ３１３）。すべての設定が終わったところで解析を開始する（Ｓ３１４）。解析完了後、判定結果が表示される（Ｓ３１５）。

判定結果については、評価に用いた観察画像に対し単一の結果を表示してもよいが、図２に示すように、判定結果図において、適正な細胞シート状態と対応する周波数領域２０２として表示してもよい。この場合、解析結果が周波数領域２０２に含まれれば、評価した細胞シートは適正な細胞シートとなっていると判定される。あるいは画像を区分し、各領域に対し非適正判定２０３または適正判定２０４を表示してもよい。

＝＝細胞シートの解析方法 その１ 解析工程＝＝
上述したような細胞シート評価方法の中で用いられる細胞シートを解析するための解析方法においては、細胞シートの観察画像から、細胞シートを構成する細胞の形態の均一性を表す特徴が解析され、その解析結果に基づき、細胞シートにおける細胞間の結合状態を評価する工程を含む。

細胞の形態の均一性を表す特徴は、空間周波数であることが好ましいが、空間周波数の解析方法は、特に限定されない。例えば、構成細胞の周期性に着目した二次元フーリエ変換を用いてもよい。また、単一方向の周期性のみ評価する一次元フーリエ変換を用いてもよく、細胞シートを構成する細胞が円形に近く、周期性に方向依存性が無い場合は、二次元フーリエ変換と同等の結果を低計算コストで得られることが期待できる。解析に用いる周波数帯域は、細胞種、培養方法、観察方法などに従って、適宜選択すればよい。また、細胞シートを構成する各単一細胞の粒径や形状分布を解析し、その均一性を評価してもよい。例えば、任意の図形で細胞形状を近似して粒径分布を導出し、最頻値の割合が一定以上の時に適正な細胞シートと判定することが考えられる。

＝＝細胞シートの解析方法 その２ 解析の前処理＝＝
本明細書に開示の細胞シートの解析方法は、細胞シートを構成する細胞の均一性を利用しているため、解析精度を向上するためには、細胞境界を明瞭化することが有用であると考えられる。そこで、上述した解析を実施する前処理として、種々の微分フィルタを用いたエッジ検出や、２値化とモルフォロジー処理の組み合わせ等を行ってもよい。

あるいは、ラマン分光、吸収分光、または自発蛍光観察などの分光計測により、細胞と光との波長特異的な相互作用を検出し、特定の物質の分布情報を得ることができる。例えば、ラマン分光法にて生体物質の脂質膜を可視化できることが報告されている。この分布情報を、観察画像と重ね合わせることで細胞シートを構成する細胞の境界がより明瞭になると考えられる。ここで、可視化する物質として、細胞膜やタイトジャンクションに特異
的に存在する物質が例示できる。

このように観察画像に前処理を施し、細胞境界を明瞭にすることで、高解像度に細胞シート構成細胞の均一性を評価できることが期待される。特に、積層化に伴い、中間層で明瞭な観察画像が得られない場合などに効果があると考えられる。

＝＝細胞シートの評価方法＝＝
評価対象の細胞シートのサンプルにおいて細胞間の結合状態を評価する工程は、適正であることが明らかになっている１以上の、細胞シートの標準サンプルの特徴を解析する第１の工程と、得られた標準サンプルの特徴と評価対象のサンプルの特徴を比較する第２の工程と、比較した結果から、評価対象のサンプルにおける細胞間の結合状態を評価する第３の工程と、を含む。

第１の工程では、評価対象のサンプルの特徴を解析するのと同じ方法によって、１以上の標準サンプルの特徴を解析する。同時に、適正でないことが明らかになっている１以上の、細胞シートの非標準サンプルの特徴を解析することが好ましい。複数の標準サンプルの特徴および複数の非標準サンプルの特徴を解析することがより好ましい。適正であるかないかの判断は、外見によって判断してもよく、経上皮電気抵抗値（ＴＥＲ値）などの物理的測定値によって判断してもよく、実際に目的である移植などの行為を行ない、その成否で判断してもよい。

第２の工程では、得られた標準サンプルの特徴と評価対象のサンプルの特徴を比較する。非標準サンプルの特徴が得られている場合は、評価対象のサンプルの特徴を非標準サンプルの特徴とも比較するのが好ましい。標準サンプルや非標準サンプルが複数の場合、その特徴は何らかの値の範囲で得られてもよい。

第３の工程では、評価対象のサンプルの特徴が標準サンプルの特徴を有している場合、そのサンプルは、適正な細胞シートであると評価し、有していない場合、適正な細胞シートでないと評価する。非標準サンプルの特徴が得られている場合は、その特徴も考慮するのが好ましい。例えば、評価対象のサンプルの特徴が標準サンプルの特徴を有し、非標準サンプルの特徴を有しない場合に、適正な細胞シートであると評価し、標準サンプルの特徴を有さず、非標準サンプルの特徴を有している場合に、適正な細胞シートでないと評価する。どちらの特徴も有している場合、あるいはどちらの特徴も有していない場合は、評価しなくてもよい。例えば、標準サンプルや非標準サンプルの特徴が何らかの値の範囲で得られる場合、「特徴を有する」とは、その範囲内に入ることを意味し、「特徴を有しない」とは、その範囲内に入らないことを意味する。ここで、範囲とは、「・・・以上」「・・・以下」「・・・超」「・・・未満」というように、一方の限界だけが決まっている範囲でもよい。あるいは、閾値として、標準サンプルと非標準サンプルの境界が決まっていてもよい。

本実施例では、本明細書に開示の方法によって、経上皮電気抵抗測定と相関する結果が得られることを示す。

本実施例では、色素網膜上皮の単層の細胞シートを用いた。５枚の色素網膜上皮細胞シートを培養し、ｃｄｃカメラ付きの位相差顕微鏡を用いて、各シートのそれぞれ５か所での観察画像を取得し、評価を行なった。

観察画像の評価には、構成細胞の周期性に着目し、二次元フーリエ変換による空間周波数解析を用いた。解析に用いる周波数帯域は、低周波数帯域と中周波数帯域として２つ選
択した。低周波数帯域として、色素網膜上皮細胞が細胞間結合を形成していない、培養初期の細胞サイズ情報が含まれる周波数帯域（１－１０Ｈｚ）を選択した。中周波数帯域として、細胞が結合し規則的な形態をとっていると視認できる、培養後期の細胞サイズ情報が含まれる周波数帯域（１００－１２０Ｈｚ）を選択した。経上皮電気抵抗値（ＴＥＲ値）が３３７の細胞シートと６９の細胞シートの位相差顕微鏡写真を図５（Ａ）に示す。外見から明らかなように、ＴＥＲ値が３３７の細胞シートの方が、一様で好ましいシート状になっている。そして、各観察画像について、パワースペクトルから導出した各周波数帯域のパワーを２次元プロットしたグラフを図５（Ｂ）に示す。なお、同じプロットマーカは同一細胞シート上の異なる位置での解析結果を示す。このグラフからは、ＴＥＲ値が上昇するにつれ、低周波数域のパワーが減少し、中周波数域のパワーが上昇していることが示されている。

このように、本明細書に開示の方法によって、経上皮電気抵抗測定と相関する結果が得られる。ここで、色素網膜上皮細胞シートにおいては適正な培養状態とされるＴＥＲ値は１００以上である為、図５（Ｂ）の左上の四角形に入る色素網膜上皮細胞シートが適正な培養状態であると判定される。

実際にある培養における色素網膜上皮細胞シートの好適性を判断するには、細胞シートの観察画像を得て、二次元フーリエ変換によって低周波数帯域と中周波数帯域において空間周波数解析を行い、図５の左上の四角形に入る色素網膜上皮細胞シートを適正な細胞シートそして判定すればよい。

１０２ 細胞観察装置
１０３ 評価装置
１０４ 解析部
１０５ 判定部
１０６ データベース
１０７ 表示装置
２０２ 周波数領域
２０３ 非適正判定
２０４ 適正判定

Claims (1)

1. 細胞シートの観察画像から、前記細胞シートを構成する細胞の形態の均一性を表す空間周波数をフーリエ変換を用いて解析する工程と、
   前記解析の結果に基づき、前記細胞シートにおける細胞間の結合状態を評価する工程と、を含む細胞シート評価方法であって、
   前記細胞間の結合状態を評価する工程が、
   適正であることが明らかになっている前記細胞シートの標準サンプルの前記特徴を解析する第１の工程と、
   前記標準サンプルの前記特徴と前記細胞シートの前記特徴を比較する第２の工程と、
   前記細胞シートの前記特徴が前記標準サンプルの前記特徴を有している場合、前記細胞シートは適正な細胞シートであると評価し、前記細胞シートの前記特徴が前記標準サンプルの前記特徴を有していない場合、適正な細胞シートでないと評価する、第３の工程と、
   を含む、細胞シート評価方法。

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