JP7316765B2 - Feed for producing non-alcoholic steatohepatitis model animal without administration of drug and method for producing non-alcoholic steatohepatitis model animal - Google Patents
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Description
本発明は、非アルコール性脂肪肝炎誘発実験動物用飼料およびその製造方法、並びに非アルコール性脂肪肝炎モデル動物の作出方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a feed for non-alcoholic steatohepatitis-induced experimental animals, a method for producing the same, and a method for producing non-alcoholic steatohepatitis model animals.
近年、アルコールの摂取量が基準値以下であっても発症する肝臓病である、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の患者数が急増しており注目されている。ＮＡＦＬＤには、予後が比較的良好である非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、および進行性疾患である非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）が含まれる。
ＮＡＳＨを発症すると、肝細胞が破壊され、線維化を起こし、その後肝硬変に進行し、その一部において、肝がんが発生する。ＮＡＳＨの発症には、肥満、糖尿病、脂質異常症、高血圧症などが関連すると考えられているが、発症および進行のメカニズムは解明されておらず、そのメカニズム解明のためにはＮＡＳＨを誘発する実験動物が必要である。
In recent years, the number of patients with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), which is a liver disease that develops even when the amount of alcohol intake is below the standard value, is rapidly increasing and attracting attention. NAFLD includes nonalcoholic fatty liver (NAFL), which has a relatively favorable prognosis, and nonalcoholic steatohepatitis (NASH), a progressive disease.
When NASH develops, hepatocytes are destroyed, causing fibrosis, which then progresses to liver cirrhosis and, in some cases, liver cancer. The onset of NASH is thought to be related to obesity, diabetes, dyslipidemia, hypertension, etc., but the mechanism of onset and progression has not been elucidated. I need an animal.
ＮＡＳＨ誘発実験動物としては、遺伝子欠損動物や薬剤誘導性の実験動物が開発されているが（例えば、特許文献１および非特許文献１参照）、これらはＮＡＳＨの病態を必ずしも反映したものではないという問題がある。 As NASH-induced experimental animals, gene-deficient animals and drug-induced experimental animals have been developed (see, for example, Patent Document 1 and Non-Patent Document 1), but these do not necessarily reflect the pathology of NASH. There's a problem.
したがって、遺伝子欠損や薬剤を用いることなく、ＮＡＳＨの病態により近い病態を示すＮＡＳＨ誘発実験動物を作出するための飼料であって、且つ実験動物の使用目的やその生育に悪影響を与えない、ＮＡＳＨ誘発実験動物用飼料およびその製造方法、並びにＮＡＳＨ誘発実験動物の製造方法の開発が求められている。 Therefore, a NASH-induced experimental animal that is a feed for producing a NASH-induced experimental animal that exhibits a pathological condition closer to that of NASH without using genetic defects or drugs and that does not adversely affect the purpose of use and growth of the experimental animal There is a need for the development of laboratory animal diets and methods for their production, as well as methods for producing NASH-induced laboratory animals.
本発明は、このような要望に応え、現状を打破し、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、遺伝子欠損や薬剤を用いることなく、非アルコール性脂肪肝炎（以下、単に「ＮＡＳＨ」と称することがある）の病態により近い病態を示すＮＡＳＨ誘発実験動物を作出するための飼料であって、且つ実験動物の使用目的やその生育に悪影響を与えない、ＮＡＳＨ誘発実験動物用飼料およびその製造方法、並びにＮＡＳＨモデル動物の作出方法を提供することを目的とする。なお、本明細書において、「実験動物の使用目的やその生育に悪影響を与えない」および「実験動物に悪影響を与えない」とは、ＮＡＳＨおよびこれに関連する病態を発症する以外には、飼料として嗜好性に問題がなく実験動物が摂食し、体重が落ち込むことがなく生育し、ＮＡＳＨおよびこれに関連する病態の動物モデルとして適合することを意味する。 In response to such demands, the present invention overcomes the current situation, solves the above-mentioned conventional problems, and aims to achieve the following objects. That is, the present invention provides a feed for producing NASH-induced experimental animals exhibiting pathological conditions closer to those of non-alcoholic steatohepatitis (hereinafter sometimes simply referred to as "NASH") without using genetic defects or drugs. The object of the present invention is to provide a feed for NASH-induced laboratory animals, a method for producing the same, and a method for producing a NASH model animal, which do not adversely affect the intended use and growth of laboratory animals. It should be noted that, as used herein, the phrases "does not adversely affect the purpose of use of experimental animals or their growth" and "does not adversely affect experimental animals" mean that feeds other than causing NASH and pathological conditions related thereto. This means that it is suitable as an animal model for NASH and pathological conditions related thereto because it can be eaten by experimental animals without any problem of palatability, and grows without losing weight.
本発明者らは、前記目的を達成するべく鋭意努力した結果、実験動物用飼料において、栄養成分やその配合を調整することにより、遺伝子欠損や薬剤を用いることなく、ＮＡＳＨの病態により近い病態を示すＮＡＳＨ誘発実験動物を作出するための飼料であって、且つ実験動物に悪影響を与えない、ＮＡＳＨ誘発実験動物用飼料となることを知見した。 As a result of diligent efforts to achieve the above object, the present inventors have found that by adjusting the nutritional components and their composition in feeds for experimental animals, a pathology closer to that of NASH can be achieved without the use of genetic defects or drugs. The present inventors have found that the NASH-induced experimental animal feed is a feed for producing the NASH-induced experimental animal shown and does not adversely affect the experimental animal.
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 炭水化物源３５～６０質量％、アミノ酸源１０～２５質量％、油脂類１５～３５質量％、並びにミネラル類および／または金属塩類３～８質量％を含有する非アルコール性脂肪肝炎誘発実験動物用飼料において、（ｉ）前記アミノ酸源として、メチオニン０．０５～０．４質量％を含有し、（ｉｉ）コリン類の含有量が０．０１質量％以下であり、（ｉｉｉ）前記ミネラル類および／または金属塩類として、鉄化合物０．０５～０．５質量％を含有することを特徴とする実験動物用飼料である。
＜２＞ 前記炭水化物源として、α化澱粉１５質量％以上を含有する前記＜１＞に記載の実験動物用飼料である。
＜３＞ 前記実験動物がげっ歯類である前記＜１＞または＜２＞に記載の実験動物用飼料である。
＜４＞ 前記油脂類として、コーン油、パーム油、大豆油、ラード、牛脂、菜種油およびサフラワー油から選択される少なくとも１種の食用油脂を主として含有する前記＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の実験動物用飼料である。
＜５＞ 前記アミノ酸源がカゼインベースである前記＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の実験動物用飼料である。
＜６＞ 炭水化物源３５～６０質量％、アミノ酸源１０～２５質量％、油脂類１５～３５質量％、並びにミネラル類および／または金属塩類３～８質量％を含有する非アルコール性脂肪肝炎誘発実験動物用飼料の製造方法において、（ｉ）前記アミノ酸源として、メチオニン０．０５～０．４質量％を配合し、（ｉｉ）コリン類の含有量を０．０１質量％以下に調節し、（ｉｉｉ）前記ミネラル類および／または金属塩類として、鉄化合物０．０５～０．５質量％を配合する工程を含むことを特徴とする実験動物用飼料の製造方法である。
＜７＞ 前記＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の実験動物用飼料を実験動物に摂取させる工程を含むことを特徴とする非アルコール性脂肪肝炎モデル動物の作出方法である。
The present invention is based on the findings of the present inventors, and means for solving the above problems are as follows. Namely
<1> Nonalcoholic steatohepatitis induction experiment containing 35 to 60% by mass of carbohydrate source, 10 to 25% by mass of amino acid source, 15 to 35% by mass of fats and oils, and 3 to 8% by mass of minerals and/or metal salts The animal feed (i) contains 0.05 to 0.4% by mass of methionine as the amino acid source, (ii) has a choline content of 0.01% by mass or less, and (iii) the minerals A feed for experimental animals characterized by containing 0.05 to 0.5% by mass of an iron compound as an iron compound and/or metal salts.
<2> The feed for laboratory animals according to <1> above, containing 15% by mass or more of pregelatinized starch as the carbohydrate source.
<3> The experimental animal feed according to <1> or <2>, wherein the experimental animal is a rodent.
<4> Any one of the above <1> to <3>, which mainly contains at least one edible oil selected from corn oil, palm oil, soybean oil, lard, beef tallow, rapeseed oil and safflower oil as the oils and fats It is a feed for experimental animals described in .
<5> The feed for laboratory animals according to any one of <1> to <4>, wherein the amino acid source is casein-based.
<6> Nonalcoholic steatohepatitis induction experiment containing 35-60% by mass of carbohydrate source, 10-25% by mass of amino acid source, 15-35% by mass of fats and oils, and 3-8% by mass of minerals and/or metal salts In the method for producing an animal feed, (i) 0.05 to 0.4% by mass of methionine is blended as the amino acid source, (ii) the content of cholines is adjusted to 0.01% by mass or less, ( iii) A method for producing a feed for laboratory animals, characterized by including a step of adding 0.05 to 0.5% by mass of an iron compound as the minerals and/or metal salts.
<7> A method for producing a non-alcoholic steatohepatitis model animal, comprising the step of allowing the experimental animal to ingest the feed for experimental animals according to any one of <1> to <5>.
本発明によると、従来における前記諸問題を解決することができ、遺伝子欠損や薬剤を用いることなく、ＮＡＳＨの病態により近い病態を示すＮＡＳＨ誘発実験動物を作出するための飼料であって、且つ実験動物の使用目的やその生育に悪影響を与えない、ＮＡＳＨ誘発実験動物用飼料およびその製造方法、並びにＮＡＳＨ誘発実験動物の製造方法を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to solve the above-mentioned problems in the past, and provide a feed for producing NASH-induced experimental animals that exhibit a pathological condition closer to that of NASH without using genetic defects or drugs, and It is possible to provide a feed for NASH-induced experimental animals, a method for producing the same, and a method for producing NASH-induced experimental animals, which do not adversely affect the intended use and growth of animals.
（実験動物用飼料）
本発明の実験動物用飼料（以下、「飼料」と称することがある）は、炭水化物源と、アミノ酸源と、油脂類と、ミネラル類および／または金属塩類とを少なくとも含み、必要に応じてさらにその他の成分を含む。
(Laboratory animal feed)
The feed for experimental animals of the present invention (hereinafter sometimes referred to as "feed") contains at least a carbohydrate source, an amino acid source, fats and oils, minerals and/or metal salts, and if necessary Contains other ingredients.
＜炭水化物源＞
前記炭水化物源としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、糖類、澱粉類などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
<Carbohydrate source>
The carbohydrate source is not particularly limited and can be appropriately selected, and examples thereof include saccharides and starches. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
前記炭水化物源の前記飼料における含有量としては、３５～６０質量％であれば特に制限はなく、適宜選択することができるが、ＮＡＳＨ誘発性、栄養のバランス等の点で、４０～６０質量％が好ましい。 The content of the carbohydrate source in the feed is not particularly limited as long as it is 35 to 60% by mass, and can be appropriately selected. is preferred.
－糖類－
前記糖類としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、スクロース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、ラクトースなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記糖類は、公知の方法により調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
-Saccharides-
The sugars are not particularly limited and can be selected as appropriate. Examples include sucrose, glucose, galactose, fructose, maltose, and lactose. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
As the saccharides, those prepared by a known method may be used, or commercially available products may be used.
前記糖類の前記飼料における含有量としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、嗜好性、栄養のバランス等の点で、３～２５質量％が好ましく、５～２０質量％がより好ましい。 The content of the saccharides in the feed is not particularly limited and can be selected as appropriate. preferable.
－澱粉類－
前記澱粉類としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、コーンスターチ、ワキシーコーンスターチ、小麦澱粉、馬鈴薯澱粉、タピオカ澱粉、米澱粉、サゴ澱粉などが挙げられる。前記澱粉類は、α化澱粉であってもよいし、未α化澱粉であってもよい。また、酸処理澱粉、架橋澱粉、エーテル化澱粉、エステル化澱粉などの加工がされた加工澱粉であってもよい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
-Starch-
The starches are not particularly limited and can be appropriately selected, and examples thereof include corn starch, waxy corn starch, wheat starch, potato starch, tapioca starch, rice starch, sago starch and the like. The starches may be pregelatinized starch or non-pregelatinized starch. Also, processed starch such as acid-treated starch, crosslinked starch, etherified starch, and esterified starch may be used. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
前記澱粉類の前記飼料における含有量としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、嗜好性、栄養のバランス等の点で、２０～５５質量％が好ましく、２５～５０質量％がより好ましい。 The content of the starches in the feed is not particularly limited and can be selected as appropriate. more preferred.
前記α化澱粉の前記飼料における含有量としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、前記飼料の成型性・保型性に優れる点で、１５質量％以上が好ましく、２５質量％以上がより好ましく、３０質量％以上がさらに好ましい。 The content of the pregelatinized starch in the feed is not particularly limited and can be appropriately selected. The above is more preferable, and 30% by mass or more is even more preferable.
＜アミノ酸源＞
前記アミノ酸源としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、カゼインベースのアミノ酸源、卵白ベースのアミノ酸源、大豆蛋白ベースのアミノ酸源などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、ＮＡＳＨ誘発性、栄養のバランス等の点で、カゼインベースのアミノ酸源が好ましい。
本発明において、カゼインベースのアミノ酸源とは、カゼインのアミノ酸成分と同様の組成となるように配合したアミノ酸源である。
前記アミノ酸源は、公知の方法により調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
<Amino acid source>
The amino acid source is not particularly limited and can be appropriately selected. Examples thereof include casein-based amino acid sources, egg white-based amino acid sources, soybean protein-based amino acid sources, and the like. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
Among these, casein-based amino acid sources are preferred in terms of NASH inducibility, nutritional balance, and the like.
In the present invention, a casein-based amino acid source is an amino acid source formulated to have a composition similar to that of casein.
The amino acid source may be prepared by a known method, or may be a commercially available product.
前記アミノ酸源の前記飼料における含有量としては、１０～２５質量％であれば特に制限はなく、適宜選択することができるが、ＮＡＳＨ誘発性、栄養のバランス等の点で、１５～２０質量％が好ましい。 The content of the amino acid source in the feed is not particularly limited as long as it is 10 to 25% by mass, and can be appropriately selected. is preferred.
メチオニンの前記飼料における含有量としては、０．０５～０．４質量％であれば特に制限はなく、適宜選択することができるが、ＮＡＳＨ誘発性および実験動物に悪影響を与えない点で、０．０７～０．３質量％が好ましい。 The content of methionine in the feed is not particularly limited as long as it is 0.05 to 0.4% by mass, and can be appropriately selected. 0.07 to 0.3 mass % is preferred.
＜油脂類＞
前記油脂類としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、大豆油、コーン油、菜種油、米油、綿実油、ゴマ油、ヒマワリ油、パーム油、ヤシ油、落花生油、サフラワー油、ココナッツ油、カカオバター等の植物性油脂、ラード、牛脂等の動物性油脂などが挙げられるが、嗜好性、栄養のバランス等の点で、コーン油、パーム油、大豆油、菜種油、サフラワー油、ラードおよび牛脂から選択される少なくとも１種の食用油脂を主として含有することが好ましい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記油脂は、公知の方法により調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
<Oils and fats>
The oils and fats are not particularly limited and can be appropriately selected. , Coconut oil, vegetable oils such as cacao butter, animal oils such as lard and beef tallow. It preferably contains mainly at least one edible fat selected from oil, lard and beef tallow. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
As the fats and oils, those prepared by a known method may be used, or commercially available products may be used.
本発明において、コーン油、パーム油、大豆油、菜種油、サフラワー油、ラードおよび牛脂から選択される少なくとも１種の食用油脂を主として含有するとは、前記飼料において、コーン油、パーム油、大豆油、菜種油、サフラワー油、ラードおよび牛脂から選択される少なくとも１種が最も配合量の多い油脂類であることを意味する。 In the present invention, containing mainly at least one edible oil selected from corn oil, palm oil, soybean oil, rapeseed oil, safflower oil, lard and beef tallow means that the feed contains corn oil, palm oil and soybean oil. , rapeseed oil, safflower oil, lard and beef tallow.
前記油脂の前記飼料における含有量としては、１５～３５質量％であれば特に制限はなく、適宜選択することができるが、嗜好性や栄養のバランスだけでなく、ＮＡＳＨ誘発性および実験動物に悪影響を与えない点で、２０～３０質量％が好ましい。 The content of the fat in the feed is not particularly limited as long as it is 15 to 35% by mass, and can be appropriately selected. 20 to 30% by mass is preferable in terms of not giving
さらに、前記油脂類としてコレステロールを含有してもよい。
前記コレステロールの前記飼料における含有量としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、配合する場合は通常は０．１～５質量％の範囲である。
Furthermore, cholesterol may be contained as the fats and oils.
The content of the cholesterol in the feed is not particularly limited and can be appropriately selected.
＜ミネラル類および／または金属塩類＞
前記ミネラル類および／または金属塩類としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、鉄、銅、亜鉛、マンガン、モリブデン、セレン、シリコン、クロム、ニッケル、リチウム、バナジウム、ヨウ素、フッ素、ホウ素、塩素、硫酸根（ＳＯ４）、硫黄（無機）、食塩等のミネラル類、鉄化合物、銅化合物、亜鉛化合物、マンガン化合物、コバルト化合物、クロム化合物、カルシウム化合物、マグネシウム化合物等の金属塩類などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記鉄化合物としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、クエン酸鉄、クエン酸鉄アンモニウム、塩化鉄、塩化第二鉄、炭酸鉄、酸化鉄、硫酸鉄などが挙げられるが、ＮＡＳＨ誘発性および実験動物に悪影響を与えない点で、酸化鉄、硫酸鉄、およびクエン酸鉄から選択される少なくとも一種が好ましい。
<Minerals and/or metal salts>
The minerals and/or metal salts are not particularly limited and can be appropriately selected. Examples include calcium, phosphorus, magnesium, sodium, potassium, iron, copper, zinc, manganese, molybdenum, selenium, silicon, and chromium. , nickel, lithium, vanadium, iodine, fluorine, boron, chlorine, sulfate group ( SO4 ), sulfur (inorganic), minerals such as salt, iron compounds, copper compounds, zinc compounds, manganese compounds, cobalt compounds, chromium compounds , calcium compounds, magnesium compounds and the like. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
The iron compound is not particularly limited and can be appropriately selected. Examples include iron citrate, ferric ammonium citrate, iron chloride, ferric chloride, iron carbonate, iron oxide, and iron sulfate. , NASH inducibility and no adverse effects on experimental animals, at least one selected from iron oxide, iron sulfate, and iron citrate is preferred.
前記ミネラル類および／または金属塩類は、公知の方法により調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
前記ミネラル類および／または金属塩類の前記飼料における含有量としては、３～８質量％であれば特に制限はなく、適宜選択することができるが、栄養のバランスや実験動物に悪影響を与えない等の点で、４～７質量％が好ましい。
The minerals and/or metal salts may be those prepared by known methods or commercially available products.
The content of the minerals and/or metal salts in the feed is not particularly limited as long as it is 3 to 8% by mass, and can be appropriately selected. 4 to 7% by mass is preferable.
前記ミネラル類の具体例としては、例えば、米国国立栄養研究所（ＡＩＮ）が発表したマウス・ラットを用いた栄養研究のための標準精製飼料におけるミネラル混合であるＡＩＮ－７６ミネラル混合（１９７７年発表）、ＡＩＮ－９３Ｇミネラル混合（１９９３年発表）などが挙げられる。 Specific examples of the minerals include, for example, AIN-76 Mineral Mix (published in 1977), which is a mineral mix in standard purified feed for nutritional research using mice and rats announced by the National Institute of Nutrition (AIN). ), AIN-93G mineral mixture (announced in 1993), and the like.
前記ミネラル混合の代表例として、ＡＩＮ－９３Ｇミネラル混合を添加した飼料１００ｇ中の前記ミネラル混合由来のミネラルの組成を以下に示す。
・ カルシウム ・・・ ５００（ｍｇ）
・ リン ・・・ １５０（ｍｇ）
・ マグネシウム ・・・ ５０（ｍｇ）
・ ナトリウム ・・・ １００（ｍｇ）
・ カリウム ・・・ ３６０（ｍｇ）
・ 鉄 ・・・ ３．５（ｍｇ）
・ 銅 ・・・ ０．６（ｍｇ）
・ 亜鉛 ・・・ ３．０（ｍｇ）
・ マンガン ・・・ １．０（ｍｇ）
・ モリブデン ・・・ ０．０１５（ｍｇ）
・ セレン ・・・ ０．０１５（ｍｇ）
・ シリコン ・・・ ０．５（ｍｇ）
・ クロム ・・・ ０．１（ｍｇ）
・ ニッケル ・・・ ０．０５（ｍｇ）
・ リチウム ・・・ ０．０１（ｍｇ）
・ バナジウム ・・・ ０．０１（ｍｇ）
・ ヨウ素 ・・・ ０．０２（ｍｇ）
・ フッ素 ・・・ ０．１（ｍｇ）
・ ホウ素 ・・・ ０．０５（ｍｇ）
・ 塩素 ・・・ １６０（ｍｇ）
・ 硫黄（無機） ・・・ ３０（ｍｇ）
As a representative example of the mineral mixture, the composition of minerals derived from the mineral mixture in 100 g of feed to which the AIN-93G mineral mixture was added is shown below.
・ Calcium ・・・ 500 (mg)
・ Phosphorus ... 150 (mg)
・ Magnesium ... 50 (mg)
・ Sodium ... 100 (mg)
・ Potassium ... 360 (mg)
・ Iron ... 3.5 (mg)
・ Copper ... 0.6 (mg)
・ Zinc ... 3.0 (mg)
・ Manganese ・・・ 1.0 (mg)
・ Molybdenum ... 0.015 (mg)
・ Selenium ... 0.015 (mg)
・ Silicon ... 0.5 (mg)
・ Chromium ... 0.1 (mg)
・ Nickel ... 0.05 (mg)
・ Lithium ・・・ 0.01 (mg)
・ Vanadium ... 0.01 (mg)
・ Iodine ... 0.02 (mg)
・ Fluorine ... 0.1 (mg)
・ Boron ... 0.05 (mg)
・ Chlorine ... 160 (mg)
・ Sulfur (inorganic) ... 30 (mg)
前記鉄化合物の前記飼料における含有量としては、０．０５～０．５質量％であれば特に制限はなく、適宜選択することができるが、栄養のバランスや実験動物に悪影響を与えない等の点で、０．０７～０．４質量％が好ましい。 The content of the iron compound in the feed is not particularly limited as long as it is 0.05 to 0.5% by mass, and can be appropriately selected. 0.07 to 0.4% by mass is preferable in terms of the point.
＜コリン類＞
前記コリン類としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、塩化コリン、重酒石酸コリン、クエン酸水素コリン、クエン酸二水素コリン、アセチルコリン、塩化アセチルコリン、ホスファチジルコリン、コリン酒石酸水素塩などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
<Cholines>
The choline is not particularly limited and can be appropriately selected. is mentioned. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
前記コリン類の前記飼料における含有量としては、０．０１質量％以下であれば特に制限はなく、適宜選択することができるが、ＮＡＳＨ誘発性の点で、０．００１質量％以下が好ましく、０％がより好ましい。 The content of the choline in the feed is not particularly limited as long as it is 0.01% by mass or less, and can be appropriately selected. 0% is more preferred.
＜その他の成分＞
前記飼料におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、ビタミン類、セルロース、第三ブチルヒドロキノン等の精製飼料用原料、汎用されている一般的飼料原料などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記その他の成分は、公知の方法により調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
前記その他の成分の前記飼料における含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、適宜選択することができる。
<Other ingredients>
Other ingredients in the feed are not particularly limited as long as they do not impair the effects of the present invention, and can be appropriately selected. general feed ingredients that are These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
As the other components, those prepared by known methods or commercially available products may be used.
The content of the other ingredients in the feed is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and can be appropriately selected.
－ビタミン類－
前記ビタミン類としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、ビタミンＫ３、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビオチン、葉酸、パントテン酸カルシウム、パラアミノ安息香酸、ニコチン酸、イノシトール、重酒石酸コリン、塩化コリンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記ビタミン類は、公知の方法により調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
前記ビタミン類の前記飼料における含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、適宜選択することができる。
-Vitamins-
The vitamins are not particularly limited and can be appropriately selected. Examples include vitamin A, vitamin D3 , vitamin E, vitamin K1 , vitamin K3 , vitamin B1 , vitamin B2 , vitamin B6 , Vitamin B 12 , vitamin C, biotin, folic acid, calcium pantothenate, para-aminobenzoic acid, nicotinic acid, inositol, choline bitartrate, choline chloride and the like. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
As the vitamins, those prepared by a known method may be used, or commercially available products may be used.
The content of the vitamins in the feed is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and can be appropriately selected.
前記ビタミン類の具体例としては、例えば、米国国立栄養研究所（ＡＩＮ）が発表したマウス・ラットを用いた栄養研究のための標準精製飼料におけるビタミン混合であるＡＩＮ－７６ビタミン混合（１９７７年発表）、ＡＩＮ－９３ビタミン混合（１９９３年発表）などが挙げられる。 Specific examples of the vitamins include, for example, AIN-76 vitamin mixture (announced in 1977, ), AIN-93 vitamin mixture (announced in 1993), and the like.
前記ビタミン混合の代表例として、ＡＩＮ－９３ビタミン混合のビタミンの組成を以下に示す。
・ ニコチン酸 ・・・ ０．３０％
・ パントテン酸Ｃａ ・・・ ０．１６％
・ ビタミンＢ６ ・・・ ０．０７％
・ ビタミンＢ１ ・・・ ０．０６％
・ ビタミンＢ２ ・・・ ０．０６％
・ 葉酸 ・・・ ０．０２％
・ Ｄ－ビオチン（２％） ・・・ ０．１０％
・ ビタミンＢ１２（０．１％） ・・・ ０．２５％
・ ビタミンＥ（５０％） ・・・ １．５０％
・ ビタミンＡ（１００万ＩＵ／ｇ） ・・・ ０．０４％
・ ビタミンＤ３（５０万ＩＵ／ｇ） ・・・ ０．０２％
・ ビタミンＫ１（ｐｈｙｌｌｏｑｕｉｎｏｎｅ）・・・ ０．０１％
・ グラニュー糖 ・・・ ９７．４１％
As a representative example of the vitamin mixture, the vitamin composition of the AIN-93 vitamin mixture is shown below.
・ Nicotinic acid ・・・ 0.30%
・ Calcium pantothenate ... 0.16%
・Vitamin B 6 0.07%
・ Vitamin B 1 ... 0.06%
・ Vitamin B 2 0.06%
・ Folic acid ・・・ 0.02%
・ D-biotin (2%) ・・・ 0.10%
・Vitamin B12 (0.1%) ・・・ 0.25%
・Vitamin E (50%) ・・・ 1.50%
・Vitamin A (1 million IU/g): 0.04%
・Vitamin D3 (500,000 IU/g): 0.02%
・Vitamin K 1 (phylloquinone) 0.01%
・ Granulated sugar ・・・ 97.41%
－セルロース－
前記セルロースは、公知の方法により調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
前記セルロースの前記飼料における含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、適宜選択することができるが、１０質量％以下が好ましく、５質量％以下がより好ましい。
-cellulose-
As the cellulose, one prepared by a known method or a commercially available product may be used.
The content of the cellulose in the feed is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and can be appropriately selected.
－汎用されている一般的飼料原料－
前記汎用されている一般的飼料原料としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、コーンフラワー、小麦粉、大豆粕、米ぬか、ふすま、大麦粉、魚粉、肉粉、脱脂粉乳などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記汎用されている一般的飼料原料は、公知の方法により調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
前記汎用されている一般的飼料原料の前記飼料における含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、適宜選択することができる。
-Common feed ingredients that are widely used-
The general feed ingredients that are commonly used are not particularly limited and can be appropriately selected. be done. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
As for the general feed ingredients that are widely used, those prepared by a known method may be used, or commercially available products may be used.
The content of the commonly used general feed ingredients in the feed is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and can be appropriately selected.
前記飼料の形状、構造、大きさ、硬さとしては、特に制限はなく、実験動物に応じて適宜選択することができる。 The shape, structure, size and hardness of the feed are not particularly limited and can be appropriately selected according to the experimental animal.
前記飼料は、必要に応じて滅菌処理を行ってもよい。
前記滅菌処理としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、γ線照射による滅菌処理、オートクレーブによる滅菌処理などが挙げられる。
The feed may be sterilized as necessary.
The sterilization treatment is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected. Examples thereof include sterilization treatment by γ-ray irradiation and sterilization treatment by autoclaving.
＜対象＞
前記飼料の対象となる実験動物としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ等のげっ歯類の他にミニブタ、ビーグル犬、サルなどが挙げられるが、げっ歯類が好ましい。
<Target>
Experimental animals to be used as feeds are not particularly limited and can be appropriately selected. Examples include rodents such as mice, rats, hamsters, guinea pigs and rabbits, as well as minipigs, beagle dogs and monkeys. Rodents are preferred.
前記飼料の製造方法としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、後述する本発明の実験動物用飼料の製造方法により、好適に製造することができる。 The method for producing the feed is not particularly limited, and can be appropriately selected.
（実験動物用飼料の製造方法）
本発明の実験動物用飼料の製造方法は、上記した前記飼料を製造する方法である（以下、「飼料の製造方法」と称することがある）。
(Method for producing feed for experimental animals)
The method for producing a feed for laboratory animals of the present invention is a method for producing the above-described feed (hereinafter sometimes referred to as a "method for producing a feed").
前記飼料の製造方法は、炭水化物源３５～６０質量％、アミノ酸源１０～２５質量％、油脂類１５～３５質量％、並びにミネラル類および／または金属塩類３～８質量％を含有する実験動物用飼料の製造方法であって、（ｉ）前記アミノ酸源として、メチオニン０．０５～０．４質量％を配合し、（ｉｉ）コリン類の含有量を０．０１質量％以下に調節し、且つ（ｉｉｉ）前記ミネラル類および／または金属塩類として、鉄化合物０．０５～０．５質量％を配合する工程を含む限り、特に制限はなく、一般的な方法を適宜選択することができる。 The method for producing the feed contains 35 to 60% by mass of carbohydrate source, 10 to 25% by mass of amino acid source, 15 to 35% by mass of fats and oils, and 3 to 8% by mass of minerals and/or metal salts. A method for producing a feed, wherein (i) 0.05 to 0.4% by mass of methionine is blended as the amino acid source, (ii) the content of cholines is adjusted to 0.01% by mass or less, and (iii) As long as it includes the step of adding 0.05 to 0.5% by mass of an iron compound as the minerals and/or metal salts, there is no particular limitation, and general methods can be appropriately selected.
例えば、ペレット状固型飼料とする場合には、上記原料を混合後、アジテーターまたはコンディショナーにて、水および蒸気を用いて原料水分が１０～２５質量％程度となるように調製する。次いで、ペレットミル、エクストルーダー等の押出造粒機に投入してダイの孔より押し出し、所望の長さとしたペレットを固定刃または回転刃で切断し、その後乾燥する方法などが挙げられる。
ペレットの径および長さとしては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、径３～１５ｍｍ程度、長さは前記径の１～１．５倍以上とするなどが挙げられる。
前記乾燥の方法としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、通常の通風乾燥などを用い、８０～１４０℃程度の加熱により乾燥する方法などが挙げられる。
For example, in the case of pelletized solid feed, after mixing the above raw materials, water and steam are used in an agitator or conditioner to adjust the water content of the raw materials to about 10 to 25% by mass. Then, it is put into an extrusion granulator such as a pellet mill or an extruder, extruded through a hole in a die, cut into pellets having a desired length with a fixed blade or a rotary blade, and then dried.
The diameter and length of the pellet are not particularly limited and can be appropriately selected.
The drying method is not particularly limited and can be appropriately selected. Examples thereof include a method of drying by heating at about 80 to 140° C. using ordinary ventilation drying.
（非アルコール性脂肪肝炎モデル動物の作出方法）
本発明の非アルコール性脂肪肝炎モデル動物の作出方法は、上記した前記飼料を用いた、非アルコール性脂肪肝炎モデル動物を作出する方法である（以下、「モデル動物の作出方法」と称することがある）。
(Method for producing non-alcoholic steatohepatitis animal model)
The method for producing a non-alcoholic steatohepatitis model animal of the present invention is a method for producing a non-alcoholic steatohepatitis model animal using the above-described feed (hereinafter referred to as "method for producing a model animal". be).
前記モデル動物の作出方法は、上記した前記飼料を実験動物に摂取させる工程を含む限り、特に制限はなく、一般的な方法を適宜選択することができる。
例えば、前記飼料を実験動物に摂取させ、飼育する方法などが挙げられる。
The method for producing the model animal is not particularly limited as long as it includes the step of allowing the experimental animal to ingest the feed described above, and a general method can be appropriately selected.
For example, a method of ingesting the feed to experimental animals and breeding them may be used.
前記実験動物としては、前記飼料の対象となる実験動物と同様である。 The experimental animal is the same as the experimental animal that is the subject of the feed.
前記摂取としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、自由摂取、強制経口投与などが挙げられるが、簡便性の点から、自由摂取が好ましい。
前記摂取期間としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、ＮＡＳＨ誘発性の点から、３週間以上が好ましく、９週間以上がより好ましく、１２週間以上がさらに好ましく、２０週間以上が特に好ましい。
The ingestion is not particularly limited and can be appropriately selected. Examples include ad libitum ingestion and forced oral administration, but liberal ingestion is preferred from the viewpoint of convenience.
The ingestion period is not particularly limited and can be appropriately selected, but from the viewpoint of NASH induction, it is preferably 3 weeks or longer, more preferably 9 weeks or longer, even more preferably 12 weeks or longer, and 20 weeks or longer. Especially preferred.
前記飼育としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、２０～２６℃の温度条件下、１２時間点灯および１２時間消灯の照明条件下での飼育が挙げられる。 The breeding is not particularly limited and can be appropriately selected. Examples include breeding under a temperature condition of 20 to 26° C. and lighting conditions of 12 hours light and 12 hours light off.
以下、試験例を示して本発明を説明するが、本発明はこれらの試験例に何ら限定されるものではない。 The present invention will be described below with reference to test examples, but the present invention is not limited to these test examples.
（比較例１）
一般的な実験用の基礎飼料として、ＡＩＮ－９３Ｇ飼料を比較例１の飼料（以下、「飼料１」と称することがある）とした。
飼料１の配合組成は、以下のとおりである。
カゼイン（２０．０％）、シスチン（０．３％）、βコーンスターチ（３９．７％）、αコーンスターチ（１３．２％）、スクロース（１０．０％）、大豆油（７．０％）、セルロースパウダー（５．０％）、ＡＩＮ－９３Ｇミネラル混合（３．５％）、ＡＩＮ－９３ビタミン混合（１．０％）、重酒石酸コリン（０．２５％）、第三ブチルヒドロキノン（０．００１４％）。「ＡＩＮ－９３Ｇミネラル混合」および「ＡＩＮ－９３ビタミン混合」は、米国国立栄養研究所（ＡＩＮ）が１９９３年（ＡＩＮ－９３）に発表したマウス・ラットを用いた栄養研究のための標準精製飼料（ＡＩＮ－９３精製飼料）におけるビタミン混合およびミネラル混合を表す。
(Comparative example 1)
AIN-93G feed was used as a feed of Comparative Example 1 (hereinafter sometimes referred to as "feed 1") as a basic feed for general experiments.
The composition of the feed 1 is as follows.
Casein (20.0%), cystine (0.3%), beta cornstarch (39.7%), alpha cornstarch (13.2%), sucrose (10.0%), soybean oil (7.0%) , cellulose powder (5.0%), AIN-93G mineral blend (3.5%), AIN-93 vitamin blend (1.0%), choline bitartrate (0.25%), tert-butyl hydroquinone (0 .0014%). "AIN-93G Mineral Mix" and "AIN-93 Vitamin Mix" are standard purified diets for nutritional research using mice and rats announced by the National Institute of Nutrition (AIN) in 1993 (AIN-93). (AIN-93 refined feed) represents the vitamin and mineral mixes.
（実施例１～２）
下記表１に記載の原料を混合した後、水を外割４０％に加水して一軸押出し成型機にて、孔径１２ｍｍのダイの孔より押し出して固型飼料を得た。次に、バンド乾燥機で乾燥した後冷却する通常の条件下で、実施例１～２のペレット状固型飼料を得た（実施例１の飼料を「飼料２」、実施例２の飼料を「飼料３」と称することがある）。
下記表２に、カゼインのアミノ酸組成を示した。
(Examples 1 and 2)
After mixing the raw materials shown in Table 1 below, water was added to an outer ratio of 40%, and the mixture was extruded through a die hole having a hole diameter of 12 mm using a single-screw extruder to obtain a solid feed. Next, pelletized solid feeds of Examples 1 and 2 were obtained under normal conditions of drying after drying with a band dryer and cooling (the feed of Example 1 was "feed 2", the feed of Example 2 was Sometimes referred to as "feed 3").
Table 2 below shows the amino acid composition of casein.
（試験例１）
＜非アルコール性脂肪肝炎誘発実験動物の作製＞
４週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスを市販ケージにて、飼料１、２または３と、水とを自由摂取させ、飼育した（２３±２℃、点灯１２時間、消灯１２時間）。
(Test example 1)
<Preparation of non-alcoholic steatohepatitis-induced experimental animals>
4-week-old C57BL/6J male mice were bred in commercially available cages with food 1, 2 or 3 and water ad libitum (23±2° C., lighting for 12 hours, lighting for 12 hours).
＜病態観察＞
飼料２を摂取させたマウスについて、１２週間後（ｎ＝５）、３０週間後（ｎ＝５）、および４０週間後（ｎ＝５）、５４週齢後（ｎ＝５）に安楽死させ、肝臓を摘出し、病態の進行を観察した。摘出した肝臓をデジタルカメラで撮影し、画像を図１に示した。
<Observation of pathology>
Mice fed diet 2 were euthanized after 12 weeks (n=5), 30 weeks (n=5), and 40 weeks (n=5), 54 weeks of age (n=5). , the liver was removed and the progression of the disease was observed. The excised liver was photographed with a digital camera, and the image is shown in FIG.
１２週間後には、１００％のマウスにおいて、脂肪肝、炎症、および線維化が観察された。
３０週間後には、８０％のマウスにおいて、直径２ｍｍ未満の結節が観察され（黒三角）、４０％のマウスにおいて、直径２ｍｍ以上の大型結節が観察された（白三角）。
４０週間後には、６０％のマウスにおいて、直径２ｍｍ以上の大型結節が観察された（白三角）。５４週間後には、１００％のマウスにおいて、肝臓の腫瘍化が観察された。
After 12 weeks, fatty liver, inflammation and fibrosis were observed in 100% of mice.
After 30 weeks, nodules less than 2 mm in diameter were observed in 80% of mice (filled triangles) and large nodules greater than 2 mm in diameter were observed in 40% of mice (open triangles).
After 40 weeks, large nodules with a diameter of 2 mm or more were observed in 60% of the mice (open triangles). After 54 weeks, liver tumorigenesis was observed in 100% of the mice.
飼料３を摂取させたマウスについて、１２週間後（ｎ＝５）、２０週間後（ｎ＝５）、および３０週間後（ｎ＝５）、４０週齢後（ｎ＝５）に安楽死させ、肝臓を摘出し、病態進行を観察した。摘出した肝臓をデジタルカメラで撮影し、画像を図２に示した。 Mice fed diet 3 were euthanized after 12 weeks (n=5), 20 weeks (n=5), and 30 weeks (n=5), 40 weeks of age (n=5). , the liver was removed and the progression of the disease was observed. The excised liver was photographed with a digital camera, and the image is shown in FIG.
１２週間後には、１００％のマウスにおいて、脂肪肝、炎症、および線維化が観察された。
２０週間後には、６０％のマウスにおいて、直径２ｍｍ未満の結節が観察され（黒三角）、４０％のマウスにおいて、直径２ｍｍ以上の大型結節が観察された（白三角）。
３０週間後には、８０％のマウスにおいて、直径２ｍｍ以上の大型結節が観察され（白三角）、肝硬変の疑いが見受けられた。４０週齢後（ｎ＝５）でも、３０週齢と同程度の結果が観察され、４０週間後には、５０％のマウスにおいて、肝臓の腫瘍化が観察された。
After 12 weeks, fatty liver, inflammation and fibrosis were observed in 100% of mice.
After 20 weeks, nodules less than 2 mm in diameter were observed in 60% of mice (filled triangles) and large nodules greater than 2 mm in diameter were observed in 40% of mice (open triangles).
After 30 weeks, large nodules with a diameter of 2 mm or more were observed in 80% of the mice (open triangles), suggesting liver cirrhosis. After 40 weeks of age (n=5), similar results to those of 30 weeks of age were observed, and after 40 weeks, 50% of the mice had tumorigenesis in the liver.
図１および２の結果から、正常マウスに飼料２または３を摂取させることにより、短期間でヒトの非アルコール性脂肪肝炎の病態に類似する病態を示す実験動物が作製できることが分かった。 From the results of FIGS. 1 and 2, it was found that by feeding normal mice Diet 2 or 3, experimental animals exhibiting a pathology similar to that of human non-alcoholic steatohepatitis can be produced in a short period of time.
＜病理評価＞
飼料１を摂取させたマウスについて、３週間後（ｎ＝３）、２０週間後（ｎ＝３）および３０週間後（ｎ＝３）に安楽死させ、肝臓を摘出した。
飼料２を摂取させたマウスについて、３週間後（ｎ＝４）、６週間後（ｎ＝４）、９週間後（ｎ＝５）、１２週間後（ｎ＝５）、２０週間後（ｎ＝５）、および３０週間後（ｎ＝５）に安楽死させ、肝臓を摘出した。摘出した肝臓から常法に従って薄層切片標本を作製した。
<Pathological evaluation>
Mice fed Diet 1 were euthanized after 3 weeks (n=3), 20 weeks (n=3) and 30 weeks (n=3), and the livers were excised.
After 3 weeks (n=4), 6 weeks (n=4), 9 weeks (n=5), 12 weeks (n=5), 20 weeks (n = 5), and after 30 weeks (n = 5) they were euthanized and the liver was removed. A thin slice specimen was prepared from the excised liver according to a conventional method.
－ヘマトキシリンエオシン染色－
前記薄層切片標本をマイヤーのヘマトキシリン液に８分間浸漬させ、水洗後、エオシン液に３分間浸漬させることにより染色し、前記薄層切片を光学顕微鏡で観察した。
飼料１を摂取させたマウスの２０週間後、並びに飼料２を摂取させたマウスの、９週間後および３０週間後の薄層切片の光学顕微鏡写真を図３に示した。
対物レンズ２０倍の視野にて、ＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ）による評価を行なった。ＮＡＳによる評価は、表３の基準に従った。
脂肪沈着の評価結果を図４に示した。
炎症細胞浸潤の評価結果を図５に示した。
ＮＡＳの評価結果を図６に示した。
-Hematoxylin and eosin staining-
The thin-layer section sample was immersed in Mayer's hematoxylin solution for 8 minutes, washed with water, and stained by being immersed in eosin solution for 3 minutes, and the thin-layer section was observed with an optical microscope.
Light micrographs of thin sections of mice fed Diet 1 after 20 weeks and mice fed Diet 2 after 9 and 30 weeks are shown in FIG.
Evaluation was performed by NAS (NAFLD Activity Score) in a field of view of a 20-fold objective lens. Evaluation by NAS followed the criteria in Table 3.
The evaluation results of fat deposition are shown in FIG.
FIG. 5 shows the evaluation results of inflammatory cell infiltration.
FIG. 6 shows the NAS evaluation results.
－－マイヤーのヘマトキシリン液－－
１０００ｍＬの蒸留水に、５０ｇの硫酸カリウムアルミニウムを添加したＡ液と、２０ｍＬのアルコールに、１ｇのヘマトキシリン、０．２ｇのヨウ化ナトリウム、５０ｇの抱水クロラール、３ｍＬの酢酸を添加したＢ液とを混合した。
--Meyer's hematoxylin solution--
Liquid A containing 50 g of potassium aluminum sulfate added to 1000 mL of distilled water, and liquid B containing 1 g of hematoxylin, 0.2 g of sodium iodide, 50 g of chloral hydrate, and 3 mL of acetic acid added to 20 mL of alcohol. were mixed.
－－エオシン液－－
１００ｍＬの蒸留水に、１ｇのエオシンＹおよび０．１ｍＬの酢酸を添加して混合した。
-- Eosin liquid --
To 100 mL of distilled water was added 1 g of Eosin Y and 0.1 mL of acetic acid and mixed.
－マッソントリクローム染色－
前記薄層切片を媒染剤で１０～１５分間浸漬させ、水洗後、ワイゲルドの鉄ヘマトキシリン液に５分間浸漬させ、軽く水洗後、１％塩酸７０％アルコールで分別し、１液に２～５分間浸漬させ、軽く水洗後、２液に３０分間以上浸漬させ、軽く水洗後、３液に５分間浸漬させ、軽く水洗後、１％酢酸水に浸漬させることにより染色し、前記薄層切片を光学顕微鏡で観察した。
飼料１を摂取させたマウスの３週間後、並びに飼料２を摂取させたマウスの、３週間後および１２週間後の薄層切片の光学顕微鏡写真を図７に示した。
１２週間後には、１００％のマウスで線維化が観察された。
-Masson's trichrome staining-
The thin section is immersed in a mordant for 10 to 15 minutes, washed with water, immersed in Weigeld's iron hematoxylin solution for 5 minutes, washed lightly with water, separated with 1% hydrochloric acid and 70% alcohol, and immersed in solution 1 for 2 to 5 minutes. lightly washed with water, immersed in liquid 2 for 30 minutes or more, washed lightly with water, immersed in liquid 3 for 5 minutes, washed lightly with water, and then immersed in 1% acetic acid water for staining, and the thin slices are stained with an optical microscope. observed in
Light micrographs of thin sections of mice fed Diet 1 after 3 weeks and mice fed Diet 2 after 3 and 12 weeks are shown in FIG.
Fibrosis was observed in 100% of mice after 12 weeks.
対物レンズ２０倍の視野にて、表４の基準に従い、線維化を評価した。評価結果を図８に示した。 Fibrosis was evaluated according to the criteria in Table 4 with a 20x objective lens. The evaluation results are shown in FIG.
－－媒染剤－－
１０％トリクロル酢酸水溶液と、１０％重クロム酸カリウム水溶液とを当量混合した。
--mordant--
Equivalent amounts of 10% trichloroacetic acid aqueous solution and 10% potassium dichromate aqueous solution were mixed.
－－１液－－
９０ｍＬの１％ビーブリッヒスカーレット、１０ｍＬの１％酸性フクシンおよび１ｍＬの酢酸を混合した。
-- 1 liquid --
90 mL of 1% Biebrich scarlet, 10 mL of 1% acid fuchsin and 1 mL of acetic acid were mixed.
－－２液－－
２００ｍＬの蒸留水に、５ｇのリンモリブデン酸および５ｇのリンタングステン酸を添加して混合した。
-- 2 liquids --
5 g of phosphomolybdic acid and 5 g of phosphotungstic acid were added to 200 mL of distilled water and mixed.
－－３液－－
１００ｍＬの蒸留水に、２．５ｇのアニリン青および２ｍＬの酢酸を添加して混合した。
-- 3 fluids --
2.5 g of aniline blue and 2 mL of acetic acid were added to 100 mL of distilled water and mixed.
図１から図８の結果より、正常マウスに飼料２または３を摂取させることにより、短期間でヒトの非アルコール性脂肪肝炎の病態に類似する病態を示す実験動物が作製できることが分かった。具体的には、３週間で１００％の個体で脂肪沈着、炎症細胞浸潤および線維化が認められ、３０～４０週間で６０～８０％の個体で大型結節認められ、飼料３では４０週間で５０％の個体で、および飼料２では５４週間で１００％の個体で腫瘍化が認められた。 From the results of FIGS. 1 to 8, it was found that experimental animals exhibiting pathological conditions similar to those of human non-alcoholic steatohepatitis can be produced in a short period of time by ingesting diet 2 or 3 to normal mice. Specifically, fat deposition, inflammatory cell infiltration and fibrosis were observed in 100% of individuals after 3 weeks, large nodules were observed in 60-80% of individuals after 30-40 weeks, and 50% of individuals after 40 weeks with feed 3. % of animals, and 100% of animals on diet 2 at 54 weeks.
＜体重＞
飼料１、２または３を給餌してマウスを飼育し、経時でのマウスの体重変化を試験した。体重の測定は、飼育開始から１週間ごとに行った（ｎ＝３－５）。測定結果を図９に示した。
図９の結果より、飼料２または３を給餌して飼育したマウスにおいて、飼料１を給餌して飼育したマウスと同様に、経時的に体重が増加して成長が阻害されないことが分かった。したがって、実験動物の生育に必要な栄養組成を維持していることが確認された。
<Weight>
Mice were fed diets 1, 2 or 3 and tested for weight change over time. Body weight was measured every week from the start of feeding (n=3-5). The measurement results are shown in FIG.
From the results of FIG. 9, it was found that the mice fed with diet 2 or 3 gained weight over time and their growth was not inhibited in the same way as the mice fed with diet 1. Therefore, it was confirmed that the nutritional composition required for the growth of experimental animals was maintained.
Claims (6)
（ｉ）前記アミノ酸源として、メチオニン０．０５～０．４質量％を含有し、
（ｉｉ）コリン類の含有量が０．０１質量％以下であり、
（ｉｉｉ）前記ミネラル類および／または金属塩類として、鉄化合物０．０５～０．５質量％を含有し、
（ｉＶ）前記炭水化物源として、糖類３～２５質量％を含有し、澱粉類２０～５５質量％を含有することを特徴とする、薬剤を投与することなく、非アルコール性脂肪肝炎モデル動物を作出するための飼料。 35 to 60% by mass of carbohydrate source, 10 to 25% by mass of amino acid source, 15 to 35% by mass of fats and oils, and 3 to 8% by mass of minerals and/or metal salts, without administering a drug In feed for producing alcoholic steatohepatitis model animals,
(i) containing 0.05 to 0.4% by mass of methionine as the amino acid source,
(ii) the choline content is 0.01% by mass or less,
(iii) containing 0.05 to 0.5% by mass of an iron compound as the minerals and/or metal salts ,
(iv) a non-alcoholic steatohepatitis model animal containing 3 to 25% by mass of sugars and 20 to 55% by mass of starches as the carbohydrate source without administration of a drug ; Fodder to produce.
薬剤投与工程を含まないことを特徴とする非アルコール性脂肪肝炎モデル動物の作出方法。 A step of allowing the experimental animal to ingest feed for producing a non-alcoholic steatohepatitis model animal without administering the agent according to any one of claims 1 to 5 ,
A method for producing a non-alcoholic steatohepatitis model animal, which does not include a drug administration step.
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| 須藤正幸、松本雅彦、「創薬に向けた新たなＮＡＳＨ動物モデルの開発 肝代謝疾患である非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の創薬アプローチ」、日本薬理学会誌１４４巻２号、６９～７４頁 |
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