JP7315964B2 - Aβ protein-specific production inhibitor - Google Patents
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Description
本発明は、Ａβタンパク質特異的産生抑制剤に関する。 The present invention relates to Aβ protein-specific production inhibitors.
認知症は８５歳以上の日本人口の約２５％が発症するcommon diseaseであるが、アルツハイマー病(Alzheimer's disease)がそのうち約半数を占めている。アルツハイマー病は、認知機能低下や人格の変化を主な症状とする認知症の一種である。現在の日本には３００万人を超えるアルツハイマー病患者が推計され、今後の高齢化に従い患者数は増加の一途を辿る。 Dementia is a common disease that affects about 25% of the Japanese population aged 85 and over, and Alzheimer's disease accounts for about half of them. Alzheimer's disease is a type of dementia whose main symptoms are cognitive decline and personality changes. Alzheimer's disease patients are estimated to exceed 3 million in Japan at present, and the number of patients will continue to increase as the population ages in the future.
アルツハイマー病の発症のメカニズムとしてアミロイドカスケード説が提唱されている。アミロイドカスケードとは、加齢に伴うアミロイド蓄積が引き金となり、炎症反応、異常蛋白であるタウの神経細胞内蓄積、最終的には神経細胞の機能不全や変性（細胞死）に至る複雑な経路の呼称である。即ち、非特許文献１及び非特許文献２に記載されるように、Ａβタンパク質は、細胞膜貫通タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（以下、本明細書にてＡＰＰと称することがある。）がβセクレターゼによって切断された細胞膜貫通タンパク質であるβＣＴＦ（Ｃ９９）が、更にγセクレターゼにて切断されて細胞膜から遊離し、脳内にて蓄積するものと考えられている。 An amyloid cascade theory has been proposed as a mechanism of onset of Alzheimer's disease. The amyloid cascade is a complex pathway triggered by age-related amyloid accumulation, leading to inflammatory reactions, abnormal protein tau accumulation in neurons, and ultimately neuronal dysfunction and degeneration (cell death). It is a designation. That is, as described in Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2, Aβ protein is a cell transmembrane protein, amyloid precursor protein (hereinafter sometimes referred to as APP in this specification), which is β-secretase. βCTF (C99), a cell transmembrane protein cleaved by γ-secretase, is further cleaved by γ-secretase, released from the cell membrane, and accumulated in the brain.
γセクレターゼにて切断されたＣ９９はＡβタンパク質と、ＡＩＣＤとに分けられることが知られており、ＡＰＰがβセクレターゼによって切断されることにより、ｓＡＰＰβが遊離することも知られている（図１）。 C99 cleaved by γ-secretase is known to be divided into Aβ protein and AICD, and it is also known that sAPPβ is released by APP being cleaved by β-secretase (Fig. 1). .
以上のことから、βセクレターゼの阻害剤及びγセクレターゼの阻害剤は、アルツハイマー病の原因タンパク質である、Ａβタンパク質の蓄積を抑制する効果を発揮する剤として考えられる。 Based on the above, β-secretase inhibitors and γ-secretase inhibitors are considered to be agents that exhibit the effect of suppressing the accumulation of Aβ protein, which is the causative protein of Alzheimer's disease.
ところが、それぞれ膜貫通タンパク質であるＰｅｎ－２、プレセニリン、ニカストリン、及びＡｐｈ－１を含む複合体として知られるγセクレターゼは、アスパラギン酸プロテアーゼに属し、上述のＡＰＰのみならずＡＰＬＰ１、ＡＰＬＰ２、Ｎｏｔｃｈ、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｅｌｔａ１、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＣＤ４４、ＥｒｂＢ４、Ｎｅｃｔｉｎ１、ＬＲＰ１等といった膜貫通タンパク質、レセプター等も基質とするプロテアーゼである。 However, γ-secretase, known as a complex containing the transmembrane proteins Pen-2, presenilin, nicastrin, and Aph-1, belongs to the aspartic protease family and includes not only the above-mentioned APP, but also APLP1, APLP2, Notch, and Jagged2. , Delta1, E-cadherin, N-cadherin, CD44, ErbB4, Nectin1, LRP1, and other transmembrane proteins and receptors as substrates.
従って、Ａβタンパク質の産生抑制作用を得るために、Ｌ－６８５，４５８、ＤＡＰＴ、ＬＹ－４１１，５７５等といったγセクレターゼの活性阻害剤を使用すれば、上述のＣ９９以外のタンパク質に対するγセクレターゼのプロテアーゼとしての酵素活性までもが抑制されてしまい、かかる阻害剤をそのまま薬剤として用いれば、副作用が生じるといった可能性が危惧されている。 Therefore, if a γ-secretase activity inhibitor such as L-685,458, DAPT, or LY-411,575 is used in order to suppress the production of Aβ protein, the protease of γ-secretase against proteins other than C99 can be used. Even the enzymatic activity of the inhibitor is suppressed, and if such inhibitor is used as a drug as it is, there is a concern that side effects may occur.
例えば、γセクレターゼの阻害剤の１つであるＬＹ－４１１，５７５は、胸腺を萎縮させることや脾臓における成熟Ｂ細胞の細胞数を減少させること等が報告されており、このような阻害剤をそのまま医薬組成物とした場合、免疫等の点で副作用を引き起こす可能性が示唆されている（非特許文献３）。さらに、γセクレターゼの酵素活性そのものを低下させると、皮膚の異常、扁平上皮ガン、脾臓の肥大等を引き起こすことも報告されている（非特許文献４）。 For example, LY-411,575, one of the inhibitors of γ-secretase, has been reported to atrophy the thymus and reduce the number of mature B cells in the spleen. It has been suggested that when it is used as a pharmaceutical composition as it is, it may cause side effects in terms of immunity and the like (Non-Patent Document 3). Furthermore, it has also been reported that reduction of the γ-secretase enzymatic activity itself causes skin abnormalities, squamous cell carcinoma, splenic hypertrophy, and the like (Non-Patent Document 4).
非ステロイド性抗炎症薬（以下、本明細書でＮＳＡＩＤｓと称することがある。）がＡβタンパク質の産生抑制剤として有効であるといった知見が存在するが、いくつかの家族性アルツハイマー病（例えば、プレセニリンの変異を有する場合。）には、効果がないことが知られている（非特許文献５）。さらに軽度認知障害やアルツハイマー病患者から分離したγセクレターゼは活性が変化しており、Ａβ４２を低下させるγセクレターゼモヂュレーターの効果が低いことがわかった（非特許文献６）。 Although there are findings that non-steroidal anti-inflammatory drugs (hereinafter sometimes referred to as NSAIDs in this specification) are effective as Aβ protein production inhibitors, some familial Alzheimer's disease (e.g., presenilin is known to have no effect (non-patent document 5). Furthermore, it was found that the activity of γ-secretase isolated from patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease is altered, and that γ-secretase modulators that lower Aβ42 are less effective (Non-Patent Document 6).
また、βＣＴＦの細胞外領域であるＮ末端にＦＬＡＧタグを付して発現させた場合、抗ＦＬＡＧ抗体の存在下では、γセクレターゼによる分解が見られない（非特許文献７）。 Moreover, when βCTF is expressed with a FLAG tag attached to the N-terminus, which is the extracellular domain, γ-secretase degradation is not observed in the presence of an anti-FLAG antibody (Non-Patent Document 7).
特許文献１と２には、γセクレターゼが切断するたんぱく質の特性（長さ）に着目し、γセクレターゼがＡβのもととなるたんぱく質（Ｃ９９）の先端部分を捕らえて切断することにより、Ａβを産生することに着目し、そして、Ｃ９９の先端部分に結合するベプチド試薬（Ｃ９９結合ペプチド）を開発し、その効果を検討したところ、γセクレターゼがＣ９９の先端部分を捕らえることができず、切断できないことが記載されている。 Patent Documents 1 and 2 focus on the properties (length) of the protein cleaved by γ-secretase, and γ-secretase captures and cleaves the tip portion of the protein (C99) that is the source of Aβ, thereby cutting Aβ. A peptide reagent (C99-binding peptide) that binds to the tip of C99 was developed and its effect was investigated. is stated.
本発明は、Ａβタンパク質の産生を特異的に阻害し、アルツハイマー病に対する治療及び／又は予防の為の薬剤の有効成分となる化合物を開発することを目的とする。 An object of the present invention is to develop a compound that specifically inhibits the production of Aβ protein and serves as an active ingredient of a drug for treating and/or preventing Alzheimer's disease.
本発明にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、配列番号２に記載されているＳ４ペプチド(FGBTWDYWVYR、ＢはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)のＮ末側及び／又はＣ末側に、一つ又は複数のＲを付加したＳ４’ペプチド、又は、該Ｓ４’ペプチドのアミノ酸配列においてＶ又は該ＶのＣ末側のＹが欠失又は置換されているアミノ酸配列からなるＳ４’’ペプチドを含み、βセクレターゼ及び／又はγセクレターゼの活性を阻害することを特徴とする。 The Aβ protein-specific production inhibitor according to the present invention is the N-terminal and/or C-terminal of the S4 peptide (FGBTWDYWVYR, where B is an L-4,4'biphenylalanine residue) described in SEQ ID NO: 2. S4' peptide with one or more R added on the side, or S4' consisting of an amino acid sequence in which V or Y on the C-terminal side of V is deleted or substituted in the amino acid sequence of said S4' peptide ' comprising a peptide, characterized by inhibiting the activity of β-secretase and/or γ-secretase.
本発明にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、βセクレターゼ及びγセクレターゼの双方の活性を阻害することを特徴とする。 The Aβ protein-specific production inhibitor according to the present invention contains a peptide (FGBTWDYWVYRRR, where B is an L-4,4'biphenylalanine residue) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, β-secretase and It is characterized by inhibiting both activities of γ-secretase.
本発明にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、βセクレターゼの活性を阻害することを特徴とする。 The Aβ protein-specific production inhibitor according to the present invention contains a peptide (FGBTWDYWVYRRR, where B is an L-4,4'biphenylalanine residue) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and It is characterized by inhibiting activity.
本発明にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、γセクレターゼの活性を阻害することを特徴とする。 The Aβ protein-specific production inhibitor according to the present invention contains a peptide (FGBTWDYWVYRRR, where B is an L-4,4'biphenylalanine residue) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and It is characterized by inhibiting activity.
本発明にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、配列番号３に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、βセクレターゼ及び／又はγセクレターゼの双方の活性を阻害することを特徴とする。 The Aβ protein-specific production inhibitor according to the present invention contains a peptide (FGBTWDYWVYRR, where B is an L-4,4'biphenylalanine residue) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, β-secretase and / or characterized by inhibiting both activities of γ-secretase.
本発明にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(RFGBTWDYWVYR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、βセクレターゼ及び／又はγセクレターゼの双方の活性を阻害することを特徴とする。 The Aβ protein-specific production inhibitor according to the present invention contains a peptide (RFGBTWDYWVYR, where B is an L-4,4'biphenylalanine residue) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, β-secretase and / or characterized by inhibiting both activities of γ-secretase.
本発明にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、配列番号６に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、βセクレターゼ及び／又はγセクレターゼの双方の活性を阻害することを特徴とする。 The Aβ protein-specific production inhibitor according to the present invention contains a peptide (FGBTWDYWYRRR, where B is an L-4,4'biphenylalanine residue) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, β-secretase and / or characterized by inhibiting both activities of γ-secretase.
本発明にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、配列番号７に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、βセクレターゼ及び／又はγセクレターゼの双方の活性を阻害することを特徴とする。 The Aβ protein-specific production inhibitor according to the present invention contains a peptide (FGBTWDYWVRRR, where B is an L-4,4'biphenylalanine residue) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, β-secretase and / or characterized by inhibiting both activities of γ-secretase.
本発明にかかるアルツハイマー病の予防及び／又は治療剤は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号３に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(RFGBTWDYWVYR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号６に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、又は、配列番号７に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含むことを特徴とする。 The prophylactic and/or therapeutic agent for Alzheimer's disease according to the present invention includes a peptide (FGBTWDYWVYRRR, B is an L-4,4'biphenylalanine residue) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 (FGBTWDYWVYRR, B is L-4,4'biphenylalanine residue) consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 (RFGBTWDYWVYR, B is L-4 , which is a 4'biphenylalanine residue), a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 (FGBTWDYWYRRR, where B is an L-4,4'biphenylalanine residue), or set forth in SEQ ID NO: 7 (FGBTWDYWVRRR, where B is an L-4,4'biphenylalanine residue) consisting of the amino acid sequence described herein.
本発明にかかるペプチドは、配列番号１に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)である。 The peptide according to the present invention is a peptide (FGBTWDYWVYRRR, B is an L-4,4'biphenylalanine residue) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:1.
本発明にかかるペプチドは、配列番号３に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)である。 The peptide according to the present invention is a peptide (FGBTWDYWVYRR, where B is an L-4,4'biphenylalanine residue) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:3.
本発明にかかるペプチドは、配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(RFGBTWDYWVYR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)である。 The peptide according to the present invention is a peptide (RFGBTWDYWVYR, where B is an L-4,4'biphenylalanine residue) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:4.
本発明にかかるペプチドは、配列番号６に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)である。 The peptide according to the present invention is a peptide (FGBTWDYWYRRR, where B is an L-4,4'biphenylalanine residue) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:6.
本発明にかかるペプチドは、配列番号７に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)である。 本発明にかかるペプチドの使用は、アルツハイマー病を治療及び／又は予防するための、医薬の製造のための、配列番号１にて示されるアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号３に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(RFGBTWDYWVYR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号６に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、又は、配列番号７に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)の使用である。 The peptide according to the present invention is a peptide (FGBTWDYWVRRR, B is an L-4,4'biphenylalanine residue) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:7. The use of the peptide according to the present invention is a peptide (FGBTWDYWVYRRR, B is L-4,4 'biphenylalanine residue), a peptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 (FGBTWDYWVYRR, B is an L-4,4' biphenylalanine residue), the amino acid described in SEQ ID NO: 4 A peptide consisting of the sequence (RFGBTWDYWVYR, B is an L-4,4' biphenylalanine residue), a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 (FGBTWDYWYRRR, B is an L-4,4' biphenylalanine residue) or a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 (FGBTWDYWVRRR, where B is an L-4,4'biphenylalanine residue).
本発明にかかるペプチドの使用は、軽度認知障害(MCI)を治療及び／又は予防するための、医薬の製造のための、配列番号１にて示されるアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号３に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(RFGBTWDYWVYR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号６に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、又は、配列番号７に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)の使用である。 The use of the peptide according to the present invention is a peptide (FGBTWDYWVYRRR, B is L -4,4' biphenylalanine residue), a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 (FGBTWDYWVYRR, B is an L-4,4' biphenylalanine residue), set forth in SEQ ID NO: 4 (RFGBTWDYWVYR, B is L-4,4'biphenylalanine residue) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (FGBTWDYWYRRR, B is L-4,4 'biphenylalanine residue), or a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 (FGBTWDYWVRRR, where B is an L-4,4'biphenylalanine residue).
本発明によれば、Ａβタンパク質の産生を特異的に阻害することが可能である。 According to the present invention, it is possible to specifically inhibit the production of Aβ protein.
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. The embodiments are intended to facilitate understanding of the principles of the present invention, and the scope of the present invention is as follows. The scope of the present invention is not limited to the embodiments, and other embodiments in which the configurations of the following embodiments are appropriately replaced by those skilled in the art are also included in the scope of the present invention.
本実施形態にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、Ｓ４ペプチド(FGBTWDYWVYR、ＢはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)のＮ末側及び／又はＣ末側に、一つ又は複数のＲを付加したＳ４’ペプチド、又は、該Ｓ４’ペプチドのアミノ酸配列においてＶ又は該ＶのＣ末側のＹが欠失又は置換されているアミノ酸配列からなるＳ４’’ペプチドを含み、βセクレターゼ及び／又はγセクレターゼの活性を阻害する。 The Aβ protein-specific production inhibitor according to this embodiment has one or more or an S4'' peptide consisting of an amino acid sequence in which V or Y on the C-terminal side of V is deleted or substituted in the amino acid sequence of the S4' peptide, and β-secretase and/or inhibit the activity of γ-secretase.
Ｓ４’ペプチドは、特に限定されるものではないが、例えば下記である。
FGBTWDYWVYRR(配列番号３) →Ｓ４Ｒ
RFGBTWDYWVYR(配列番号４) →ＲＳ４
RFGBTWDYWVYRR(配列番号８)
RRFGBTWDYWVYRR(配列番号９)
RFGBTWDYWVYRRR(配列番号１０)
RRFGBTWDYWVYR(配列番号１１)
FGBTWDYWVYRRR(配列番号１) →Ｓ４ＲＲ
RRFGBTWDYWVYRRR(配列番号１２)
Ｓ４’’ペプチドは、特に限定されるものではないが、例えば下記である。
FGBTWDYWYRRR(配列番号６) →V9Δ
FGBTWDYWVRRR(配列番号７) →Y10Δ
好ましくは本実施形態にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列からなるペプチドを含み、具体的にはそのペプチドはFGBTWDYWVYRRRである。ここでBはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である。このペチドは改変型Ｃ９９結合ペプチド(Ｓ４ＲＲ)と称することが可能である。Examples of the S4' peptide include, but are not limited to, the following.
FGBTWDYWVYRR (sequence number 3) → S4R
RFGBTWDYWVYR (sequence number 4) →RS4
RFGBTWDYWVYRR (SEQ ID NO: 8)
RRFGBTWDYWVYRR (SEQ ID NO: 9)
RFGBTWDYWVYRRR (SEQ ID NO: 10)
RRFGBTWDYWVYR (SEQ ID NO: 11)
FGBTWDYWVYRRR (sequence number 1) → S4RR
RRFGBTWDYWVYRRR (SEQ ID NO: 12)
Examples of the S4″ peptide include, but are not limited to, the following.
FGBTWDYWYRRR (SEQ ID NO: 6) → V9Δ
FGBTWDYWVRRR (sequence number 7) → Y10Δ
Preferably, the Aβ protein-specific production inhibitor according to this embodiment contains a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, specifically the peptide is FGBTWDYWVYRRR. Here, B is an L-4,4'biphenylalanine residue. This peptide can be referred to as a modified C99 binding peptide (S4RR).
配列番号１にて示されるアミノ酸配列を有する本発明にかかるペプチドにおいて、２番目のグリシンのカルボキシル基と上記L-4,4’ビフェニルアラニンのアミド基がペプチド結合しており、４番目のスレオニンのアミド基と上記L-4,4’ビフェニルアラニンのアミド基がペプチド結合している。 In the peptide according to the present invention having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the carboxyl group of the second glycine and the amide group of the L-4,4'biphenylalanine are peptide-bonded, and the fourth threonine The amide group and the amide group of the above L-4,4'biphenylalanine are peptide-bonded.
本発明にかかるペプチドは、適宜修飾が施されていてもよい。具体的には、ビオチン修飾、蛍光色素修飾、糖鎖修飾、脂質修飾等が挙げられ、これらの何れかに限定されるものではない。このような修飾箇所は、特に限定されるものではなく、ペプチド内部、ペプチドのＣ末端、又はペプチドのＮ末端の何れであってもよい。これらの修飾方法は、公知の方法を採用すればよく、特に限定されるものではない。 Peptides according to the present invention may be appropriately modified. Specific examples include biotin modification, fluorescent dye modification, sugar chain modification, lipid modification, etc., but are not limited to any of these. Such modifications are not particularly limited, and may be inside the peptide, at the C-terminus of the peptide, or at the N-terminus of the peptide. These modification methods may employ known methods, and are not particularly limited.
本発明にかかるペプチドはＣ９９のＮ末端領域に結合する。Ｃ９９とは、βＣＴＦとも称され、ＡＰＰ（例えばＮＣＢＩのAccession No Q95241.1等に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）が、βセクレターゼによって切断された産物であるために、Ｃ９９のＮ末端領域に結合するということは、ＡＰＰに結合するということ同意である。そして、Ｃ９９のＮ末端領域とは、ＡＰＰからすれば、βセクレターゼの切断認識部位付近に該当するものである。そのため本発明にかかるペプチドは、βセクレターゼの活性阻害剤として有用である。 The peptides of the invention bind to the N-terminal region of C99. C99 is also called βCTF, and is a product of APP (for example, a protein having the amino acid sequence described in NCBI Accession No Q95241.1, etc.), which is cleaved by β-secretase, so it binds to the N-terminal region of C99. To do is to agree to bind to APP. The N-terminal region of C99 corresponds to the vicinity of the β-secretase cleavage recognition site in terms of APP. Therefore, the peptide according to the present invention is useful as a β-secretase activity inhibitor.
また、Ｃ９９のＮ末端領域付近はγセクレターゼによっても認識及び切断され、切断後の断片がＡβタンパク質（例えばＮＣＢＩのAccession No 1Z0Q_A、1BA6_A）に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）として産生されるため、Ｃ９９のＮ末端領域に結合するということは、Ａβタンパク質に結合するということ同じ意味である。 In addition, the vicinity of the N-terminal region of C99 is also recognized and cleaved by γ-secretase, and the cleaved fragment is produced as Aβ protein (for example, a protein having the amino acid sequence described in Accession Nos. 1Z0Q_A and 1BA6_A of NCBI). Binding to the N-terminal region of C99 has the same meaning as binding to Aβ protein.
本発明にかかるペプチドは、種々の溶媒に可溶であり、その具体的な溶媒は特に限定されることはないが、例えば水、ＰＢＳ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ等の溶媒が挙げられる。また、これらの溶媒を二種以上組み合わせて用いてもよい。 Peptides according to the present invention are soluble in various solvents, and specific solvents are not particularly limited, but examples include solvents such as water, PBS, DMSO, and DMF. Moreover, you may use these solvent in combination of 2 or more types.
本発明にかかるペプチドは、Ｃ９９のＮ末端領域に結合する。上述のように当該領域は、γセクレターゼのＣ９９切断認識部位付近に該当する領域であることから、γセクレターゼの活性阻害剤として有用である。このように本発明にかかるペプチドは、βセクレターゼ及びγセクレターゼの双方の活性を阻害する。 The peptides of the invention bind to the N-terminal region of C99. As described above, the region corresponds to the vicinity of the C99 cleavage recognition site of γ-secretase, and is therefore useful as a γ-secretase activity inhibitor. Thus, the peptides according to the invention inhibit the activity of both β-secretase and γ-secretase.
本発明にかかるペプチドは、公知の方法によって作製することが出来る。具体的には、ペプチド合成機などを用いた化学的な製造方法を採用してもよいし、ペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を宿主細胞に導入して、生化学的な合成方法を採用してもよい。 Peptides according to the present invention can be produced by known methods. Specifically, a chemical production method using a peptide synthesizer or the like may be employed, or a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the peptide is introduced into a host cell and biochemically synthesized. method may be adopted.
本発明にかかるペプチドは上述のようにＣ９９のＮ末端領域に結合する。本発明にかかるペプチドは、このような現象に基づいて機能を発揮するために、ＡＰＰ以外の他の基質に対するβセクレターゼ活性もγセクレターゼ活性も阻害しない傾向となる。即ち、本発明のペプチドは、ＡＰＰ特異的なβセクレターゼ阻害活性及びγセクレターゼ阻害活性を有する。 The peptides of the invention bind to the N-terminal region of C99 as described above. Since the peptides of the present invention exert their functions based on such a phenomenon, they tend not to inhibit β-secretase activity or γ-secretase activity toward substrates other than APP. That is, the peptide of the present invention has APP-specific β-secretase inhibitory activity and γ-secretase inhibitory activity.
Ｃ９９特異的とは、Ｃ９９とその他の候補基質が同時に存在している場合に、Ｃ９９をより活性を阻害する基質として選択する傾向であることを示す。 C99-specific refers to the tendency to select C99 as the more inhibitory substrate when C99 and other candidate substrates are present simultaneously.
本発明にかかるペプチドに、本発明にかかるペプチド以外の他の成分が含有される場合、その具体的な他の成分は、βセクレターゼ及びγセクレターゼの双方の活性阻害効果を減少させない限り、特に限定されるわけではないが、例えば防腐剤、殺菌剤、安定剤等といった公知の剤が含まれていてもよい。 When the peptide according to the present invention contains components other than the peptide according to the present invention, the specific other components are not particularly limited as long as they do not reduce the activity inhibitory effects of both β-secretase and γ-secretase. Although not required, known agents such as preservatives, bactericides, stabilizers, and the like may be included.
上述した本発明にかかるペプチドは、アルツハイマー病の予防及び／又は治療における使用に好適である。また、上述した本発明にかかるペプチドは、アルツハイマー病の治療及び／又は予防するための、医薬の製造のための使用に好適である。 The peptides according to the invention described above are suitable for use in the prevention and/or treatment of Alzheimer's disease. Moreover, the peptide according to the present invention described above is suitable for use in the production of a medicament for treating and/or preventing Alzheimer's disease.
本発明にかかるアルツハイマー病治療及び／または予防剤は、上述の本発明のペプチドを含むものであるが、当該ペプチドは特にＡβタンパク質特異的産生抑制作用を発揮することから、本発明にかかるアルツハイマー病治療及び／又は予防剤は、副作用が低いといった顕著な効果を発揮する。 The therapeutic and/or prophylactic agent for Alzheimer's disease according to the present invention contains the above-described peptide of the present invention. /or the prophylactic agent exerts a remarkable effect such as low side effects.
本発明にかかるアルツハイマー病の治療及び／又は予防剤に、本発明にかかるペプチド以外の他の成分が含有される場合、その具体的な他の成分は、アルツハイマー病の治療及び／又は予防効果を減少させない限り、薬学的に許容可能な担体或いは添加物が含まれていてもよい。 When the therapeutic and/or preventive agent for Alzheimer's disease according to the present invention contains components other than the peptide according to the present invention, the specific other component has a therapeutic and/or preventive effect for Alzheimer's disease. Pharmaceutically acceptable carriers or additives may be included as long as they are not reduced.
薬学的に許容可能な担体又は添加物とは、任意の担体、希釈剤、賦形剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、媒体、乳化剤、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、香料、或いは甘味料を意味し、これらの中でも公知のものを適宜採用すればよい。 Pharmaceutically acceptable carriers or additives include any carriers, diluents, excipients, suspending agents, lubricants, adjuvants, vehicles, emulsifiers, absorbents, preservatives, surfactants, coloring agents, It means a flavoring agent or a sweetener, and among these, known ones may be used as appropriate.
本発明にかかるアルツハイマー病の治療及び／又は予防剤の剤型は、たとえば錠剤、散剤、シロップ剤、ハップ剤、注射剤、点滴剤等が挙げられ、特に限定はされないが、注射剤又は点滴剤とすることが好ましい。このような注射剤や点滴剤は、水性であっても、非水性であっても、懸濁性であっても良い。また、用時調製型の剤型であってもよい。 The dosage form of the therapeutic and/or prophylactic agent for Alzheimer's disease according to the present invention includes, for example, tablets, powders, syrups, poultices, injections, drips, etc., and is not particularly limited, but injections or drips. It is preferable to Such injections and infusions may be aqueous, non-aqueous, or suspension. Moreover, it may be a dosage form prepared just before use.
本発明にかかるアルツハイマー病の治療及び／又は予防剤は、アルツハイマー病に罹患した患者に投与する工程を含む免疫疾患の治療方法における利用可能性を有している。また、アルツハイマー病の病態や症状を発症していないものの、アルツハイマー病の素因を持ち得る患者に投与する工程を含むアルツハイマー病の予防方法における利用可能性も有する。さらに、アルツハイマー病発症前段階の軽度認知障害（例えばＭＭＳＥ２６点以下等）を呈する者においても利用可能性を有する。軽度認知障害（MCI）は、認知症に至らない程度の認知機能障害が生じる症例であり、基本的な日常生活に支障がない状態ではあるが、重要な約束を忘れたり、初めての場所へ旅行することが困難となる等の症状が生じる疾患である。MCIの段階でもアルツハイマー型認知症と同様にアルツハイマー病の原因である脳内アミロイドベータの蓄積が認められる。そのため本発明にかかるペプチドは、MCIを治療及び／又は予防するための、医薬の製造のために使用できる。 The therapeutic and/or prophylactic agent for Alzheimer's disease according to the present invention has applicability in a method for treating immune diseases, which includes the step of administering to a patient suffering from Alzheimer's disease. It also has applicability in a method for preventing Alzheimer's disease, which includes the step of administering to a patient who may be predisposed to Alzheimer's disease, although he/she has not developed the pathology or symptoms of Alzheimer's disease. Furthermore, it is also applicable to those who exhibit mild cognitive impairment in the pre-onset stage of Alzheimer's disease (for example, MMSE 26 points or less). Mild cognitive impairment (MCI) is a case of cognitive impairment that does not lead to dementia. It is a disease that causes symptoms such as difficulty in Accumulation of intracerebral amyloid beta, which is the cause of Alzheimer's disease, is observed in the stage of MCI as well as in Alzheimer's disease. The peptide according to the invention can therefore be used for the manufacture of a medicament for treating and/or preventing MCI.
本発明のアルツハイマー病患者とは、特に限定はされないが、例えば、記憶障害、見当識障害、学習障害、注意障害、空間認知機能、問題解決能力の障害等といった、徐々に進行する認知障害等の症状を呈する患者であり、その所見として画像診断等で大脳皮質に老人斑（Ａβタンパク質の沈着像）が存在すると診断される患者；びまん性の脳萎縮が存在すると診断される患者；タウタンパク質、Ａβ等の髄液バイオマーカー、血液バイオマーカー等で診断された患者であればよい。 The Alzheimer's disease patient of the present invention is not particularly limited, but for example, gradually progressing cognitive impairment such as memory impairment, disorientation impairment, learning impairment, attention impairment, spatial cognitive function, impairment of problem-solving ability, etc. Patients who exhibit symptoms and are diagnosed as having senile plaques (Aβ protein deposits) in the cerebral cortex by diagnostic imaging, etc.; patients diagnosed as having diffuse brain atrophy; tau protein, Any patient diagnosed with a cerebrospinal fluid biomarker such as Aβ, a blood biomarker, or the like may be used.
本発明にかかるアルツハイマー病の治療及び／又は予防剤の投与量並びに投与方法は、対象とする患者の性別、人種、年齢、全身状態、疾患の重篤度等に応じて、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの範囲で適宜設定することができる。 The dosage and administration method of the therapeutic and/or preventive agent for Alzheimer's disease according to the present invention are 0.001 to It can be appropriately set within the range of 100 mg/kg/day.
本発明にかかるアルツハイマー病の治療及び／又は予防剤は、上記の量を一日に一度に投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。また、上記疾患に対する治療効果を有する範囲において、投与間隔は、毎日、隔日、毎週、隔週、２～３週毎、毎月、隔月または２～３ヶ月毎でもよい。投与方法は、例えば経口、筋肉内、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、皮内、腹腔内、鼻腔内、肺内、眼内、腟内、頸部内、直腸内、皮下等へ投与する方法が挙げられ、特に限定はされない。 The therapeutic and/or prophylactic agent for Alzheimer's disease according to the present invention may be administered in the above amount once a day, or may be administered in several divided doses. In addition, the administration interval may be daily, every other day, every week, every other week, every 2-3 weeks, every month, every other month, or every 2-3 months, as long as the drug has therapeutic effect on the above diseases. Examples of administration methods include oral, intramuscular, intravenous, intraarterial, intrathecal, intradermal, intraperitoneal, intranasal, intrapulmonary, intraocular, intravaginal, intracervical, intrarectal, subcutaneous, and the like. and is not particularly limited.
１．ペプチドの作製
配列番号１～７に記載されているアミノ酸配列からなるペプチドをペプチドスクリーニング技術にて製造した。
配列番号１ S4RR FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号２ S4 FGBTWDYWVYR、 BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号３ S4R FGBTWDYWVYRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号４ RS4 RFGBTWDYWVYR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号５ ＃4 MHLVICDCYCTTDICYCYSCTPN
配列番号６ V9Δ FGBTWDYWYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号７ Y10Δ FGBTWDYWVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
下記に示す実験において、上述の配列番号１～７に示すアミノ酸配列を有するペプチドは全てＤＭＳＯに溶かした状態で使用した。1. Preparation of Peptide Peptides consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 7 were prepared by peptide screening technology.
SEQ ID NO: 1 S4RR FGBTWDYWVYRRR, B is L-4,4′ biphenylalanine residue SEQ ID NO: 2 S4 FGBTWDYWVYR, B is L-4,4′ biphenylalanine residue SEQ ID NO: 3 S4R FGBTWDYWVYRR, B is L- SEQ ID NO: 4 RS4 RFGBTWDYWVYR, which is a 4,4'biphenylalanine residue, B is an L-4,4'biphenylalanine residue, SEQ ID NO: 5 #4 MHLVICDCYCTTDICYCYSCTPN
SEQ ID NO: 6 V9Δ FGBTWDYWYRRR, B is L-4,4′ biphenylalanine residue SEQ ID NO: 7 Y10Δ FGBTWDYWVRRR, B is L-4,4′ biphenylalanine residue All peptides having amino acid sequences shown in 1-7 were used dissolved in DMSO.
２．可溶化γセクレターゼ活性評価
・γセクレターゼ画分の調製
HEK293の破砕液から100,000 x G １時間の超遠心の沈殿を膜画分とし、これを250 mMショ糖と1% CHAPSO（界面活性剤）を含むPIPES緩衝液で可溶化後、100,000 x G １時間の超遠心で得た上清をγセクレターゼ画分とした（Nakuda et al., J. Biol. Chem. 2006）。2. Evaluation of solubilized γ-secretase activity/Preparation of γ-secretase fraction
The membrane fraction was obtained by ultracentrifugation at 100,000 x G for 1 hour from the homogenate of HEK293, solubilized with PIPES buffer containing 250 mM sucrose and 1% CHAPSO (surfactant), and subjected to 100,000 x G 1. The supernatant obtained by ultracentrifugation for 2 hours was used as the γ-secretase fraction (Nakuda et al., J. Biol. Chem. 2006).
・γセクレターゼ基質の調製
sf9細胞にγセクレターゼ基質（C99やNotch）のバキュロウイルスを感染させ、３６時間後に細胞を遠心で回収した。細胞の沈殿をPEPES緩衝液で懸濁し（0.5 ml程度）、等量の2% NP-40を含むPEPES緩衝液で可溶化し、100,000 x G １時間の超遠心で上清を得た。この上清に対して、抗FLAG抗体アガロースビーズを添加し、一晩撹拌し基質タンパク質を回収する。ビーズから基質タンパク質を0.2 Mグリシン（pH 2.0）で溶出し、Tris緩衝液で中和後に、タンパク質定量を行い、精製標品とした。・Preparation of γ-secretase substrate
sf9 cells were infected with baculovirus of γ-secretase substrate (C99 or Notch), and cells were collected by centrifugation after 36 hours. The cell precipitate was suspended in PEPES buffer (approximately 0.5 ml), solubilized in PEPES buffer containing an equal volume of 2% NP-40, and ultracentrifuged at 100,000 x G for 1 hour to obtain a supernatant. Anti-FLAG antibody agarose beads are added to this supernatant, and the mixture is stirred overnight to recover the substrate protein. Substrate proteins were eluted from the beads with 0.2 M glycine (pH 2.0), neutralized with Tris buffer, and then protein quantified to obtain purified samples.
・ペプチド
各種ペプチド#4、S4、S4R、S4RR及びRS4(配列番号１～５)は、Fmoc固相合成法を利用したintavis社ResPeP SLDペプチド合成機で、またはSynPeptide社に合成委託した。いずれの場合もN末にアセチル基、C末にアミド基の修飾をした。各ペプチドはDMSOに溶解し、20 mM溶液を調製した。• Peptides Various peptides #4, S4, S4R, S4RR and RS4 (SEQ ID NOS: 1 to 5) were synthesized with an intavis ResPeP SLD peptide synthesizer using the Fmoc solid-phase synthesis method or consigned to SynPeptide. In both cases, the N-terminus was modified with an acetyl group and the C-terminus with an amide group. Each peptide was dissolved in DMSO to prepare a 20 mM solution.
・各種ペプチドのγセクレターゼ反応系での評価（Biochemical assay）
γセクレターゼ画分を、250 mMショ糖と各種プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むPIPES緩衝液で４倍に希釈しγセクレターゼ溶液とした。γセクレターゼ溶液に、１／１０量の1%ホスファチジルコリンと各種基質ならびに所定の濃度の各種ペプチドを添加し、37℃で４時間反応させた。ウエスタンブロット法により反応液中の産生A?量やNotch切断量を検討した。結果を図２に示す。図２に示されるように、S4は1μM～10μMにおいてAβ量を十分に減少させていないが、S4R、RS4及びS4RRのいずれも1μM～10μMにおいてAβ量を十分に減少させた。またS4R、RS4及びS4RRのいずれも1μM～10μMにおいてNotch切断を抑制していた。・Evaluation of various peptides in the γ-secretase reaction system (Biochemical assay)
The γ-secretase fraction was diluted 4-fold with PIPES buffer containing 250 mM sucrose and various protease inhibitor cocktails to prepare a γ-secretase solution. 1/10 amount of 1% phosphatidylcholine, various substrates, and various peptides at predetermined concentrations were added to the γ-secretase solution, and reacted at 37° C. for 4 hours. The amount of A? produced in the reaction solution and the amount of Notch cleavage were examined by Western blotting. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 2, S4 did not sufficiently reduce the amount of Aβ at 1 μM to 10 μM, but all of S4R, RS4 and S4RR sufficiently reduced the amount of Aβ at 1 μM to 10 μM. All of S4R, RS4 and S4RR suppressed Notch cleavage at 1 μM to 10 μM.
３．培養細胞での解析
ＡＰＰタンパク質を安定に発現し、且つ、一過的にＮｏｔｃｈを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞（７ＷＤ１０細胞）に対して、各種ペプチド#4、S4、S4R、S4RR及びRS4(配列番号１～５)を作用させて、Ａβタンパク質の産生と、Ｎｏｔｃｈタンパク質の切断を確認する実験を行った。3. Analysis in cultured cells Various peptides #4, S4, S4R, S4RR and RS4 (SEQ ID NO: 1 to 5) were acted on to confirm the production of Aβ protein and the cleavage of Notch protein.
上記細胞の培養液に、上記５種類のペプチドをそれぞれ最終濃度が１０、２０、並びに４０μＭとなるように添加した。その後、細胞培養液（Ｍｅｄｉｕｍ）或いは細胞破砕液（Ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）中に含まれるｓＡＰＰβ、ＮＩＣＤ、Ｃ９９（βＣＴＦ）、及びＡβタンパク質（細胞溶解液中に存在するものをintracellular Aβとし、細胞培養液中に存在するものをextracellular Aβとする）それぞれ認識する抗体を用いたウエスタンブロッティング法にて確認した。 The five types of peptides described above were added to the cell culture medium at final concentrations of 10, 20, and 40 μM, respectively. After that, sAPPβ, NICD, C99 (βCTF), and Aβ proteins contained in the cell culture medium (Medium) or cell lysate (intracellular Aβ is defined as those present in the cell lysate, and extracellular Aβ) was confirmed by Western blotting using an antibody that recognizes each.
図３では、全てのペプチドを添加した場合に、その添加した濃度にかかわらず細胞溶解液中にＮＩＣＤの存在量を減少させないことが明らかに示されている。そのため配列番号１にかかるペプチドが他のペプチドと同様に基質特異性があることが示されている。 Figure 3 clearly shows that the addition of all peptides did not reduce the abundance of NICD in the cell lysate regardless of the concentration added. Therefore, it has been shown that the peptide of SEQ ID NO: 1 has substrate specificity like other peptides.
また、図３では、配列番号１にかかるペプチドが他のペプチドと比較して優れたＣ９９の減少効果を示しており、また配列番号１にかかるペプチドが他のペプチドと比較して、優れたβセクレターゼの活性阻害効果を有することを示している。 Further, in FIG. 3, the peptide of SEQ ID NO: 1 shows a superior C99 reduction effect compared to other peptides, and the peptide of SEQ ID NO: 1 has a superior β It has been shown to have a secretase activity inhibitory effect.
また、配列番号１にかかるペプチドが他のペプチドと比較して優れたＡβタンパク質の減少効果を示しており、また配列番号１にかかるペプチドが他のペプチドと比較して、優れたγセクレターゼの活性阻害効果を有することを示している。 In addition, the peptide of SEQ ID NO: 1 exhibits a superior Aβ protein-reducing effect compared to other peptides, and the peptide of SEQ ID NO: 1 exhibits superior γ-secretase activity compared to other peptides. It has been shown to have an inhibitory effect.
配列番号３にかかるペプチドS4R及び配列番号４にかかるペプチドRS4は、ともに細胞内に産生されるAβを十分には減少させてはいない。しかし、配列番号３にかかるペプチドS4R及び配列番号４にかかるペプチドRS4は、ともにS4と比較して、細胞外に分泌されるAβを十分に減少させている。APPはN末端側が細胞外に配向し、細胞膜を1回貫通する膜タンパク質で、まずβセクレターゼで細胞外ドメインが切断されてC99となり、さらにC99がγセクレターゼによって切断され、約40個のアミノ酸でできたAβとなるが、このとき細胞内で産生されるAβ42は少量作られ、細胞外に分泌されるAβ40は多く産生される。S4R及びRS4は、ともに、多く産生される細胞外に分泌されるAβを十分に減少させる点において、S4と比較して優れた効果を有する。 Both the peptide S4R of SEQ ID NO:3 and the peptide RS4 of SEQ ID NO:4 do not sufficiently reduce Aβ produced in cells. However, both the peptide S4R of SEQ ID NO: 3 and the peptide RS4 of SEQ ID NO: 4 sufficiently reduce extracellular secreted Aβ compared to S4. APP is a transmembrane protein with the N-terminal side oriented to the extracellular side. APP is a membrane protein that spans the cell membrane once. First, the extracellular domain is cleaved by β-secretase to form C99, and C99 is further cleaved by γ-secretase to form approximately 40 amino acids. Aβ is produced, but at this time a small amount of Aβ42 is produced intracellularly, and a large amount of Aβ40 is produced extracellularly. Both S4R and RS4 are more effective than S4 in that they sufficiently reduce the amount of extracellularly secreted Aβ that is abundantly produced.
図４は、S4R及びS4RRにおいて、細胞外に分泌されるAβの減少量をグラフ化したものである。S4R及びS4RRはともに濃度依存的に細胞外に分泌されるAβ量を減少させていることが明白である。なお図４には記載していないが図３に示されているようにRS4も濃度依存的に細胞外に分泌されるAβ量を減少させる。 FIG. 4 is a graph showing the decrease in extracellular secreted Aβ in S4R and S4RR. It is clear that both S4R and S4RR decrease the amount of Aβ secreted extracellularly in a concentration-dependent manner. Although not shown in FIG. 4, as shown in FIG. 3, RS4 also decreases the amount of Aβ secreted extracellularly in a concentration-dependent manner.
４．短鎖化ペプチドの検討
下記に記載されているアミノ酸配列からなるペプチドをFmoc固相合成法を利用したintavis社ResPeP SLDペプチド合成機で製造した。N末にアセチル基、C末にアミド基の修飾をした。各ペプチドはDMSOに溶解し、20 mM溶液を調製した。
配列番号１３ T4Δ FGBTWDYWYVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号１４ W5Δ FGBTWDYWYVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号１５ D6Δ FGBTWDYWYVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号１６ Y7Δ FGBTWDYWYVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号１７ W8Δ FGBTWDYWYVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号６ V9Δ FGBTWDYWYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号７ Y10Δ FGBTWDYWVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
24-wellプレートに、2.5 × 104細胞/ wellの密度でAPPとΔE Notchを共発現するCHO細胞を播種し、翌日に所定の濃度の各種ペプチドを含む培地と交換した。ペプチドの最終濃度は10μMであった。24時間培養後、ウエスタンブロット法により、分泌A?量やNotch切断量などを検討した。図５は、T4Δ、W5Δ、D6Δ及びY7Δにおいて、細胞内に産生されるAβ量及び細胞外に分泌されるAβ量を検討したものである。図６は、W8Δ、V9Δ及びY10Δにおいて、細胞内に産生されるAβ量及び細胞外に分泌されるAβ量を検討したものである。図５及び図６に示されるように４位、５位、６位、７位又は８位の欠失は、細胞内に産生されるAβ量の抑制活性を喪失させるとともに、細胞外に分泌されるAβ量の抑制活性を喪失させる。しかしながら図５及び図６に示されるように９位又は１０位の欠失は、細胞内に産生されるAβ量の抑制活性が維持されており、細胞外に分泌されるAβ量の抑制活性も維持していることが判明した。4. Examination of Shortened Peptides Peptides having the amino acid sequences shown below were produced using an intavis ResPeP SLD peptide synthesizer using the Fmoc solid-phase synthesis method. The N-terminus was modified with an acetyl group and the C-terminus with an amide group. Each peptide was dissolved in DMSO to prepare a 20 mM solution.
SEQ ID NO: 13 T4Δ FGBTWDYWYVRRR, B is L-4,4′ biphenylalanine residue SEQ ID NO: 14 W5Δ FGBTWDYWYVRRR, B is L-4,4′ biphenylalanine residue SEQ ID NO: 15 D6Δ FGBTWDYWYVRRR, B is L- SEQ ID NO: 16 Y7Δ FGBTWDYWYVRRR, which is a 4,4′ biphenylalanine residue, B is an L-4,4′ biphenylalanine residue, SEQ ID NO: 17 W8Δ FGBTWDYWYVRRR, B is an L-4,4′ biphenylalanine residue SEQ ID NO: 6 V9Δ FGBTWDYWYRRR, B is L-4,4′ biphenylalanine residue SEQ ID NO: 7 Y10Δ FGBTWDYWVRRR, B is L-4,4′ biphenylalanine residue
CHO cells co-expressing APP and ΔE Notch were seeded in a 24-well plate at a density of 2.5 × 10 4 cells/well, and the next day, the medium was replaced with a medium containing various peptides at predetermined concentrations. The final concentration of peptide was 10 μM. After culturing for 24 hours, the amount of secreted A? and the amount of Notch cleavage were examined by Western blotting. FIG. 5 shows the amount of Aβ produced intracellularly and the amount of Aβ secreted extracellularly in T4Δ, W5Δ, D6Δ and Y7Δ. FIG. 6 shows the amount of Aβ produced intracellularly and the amount of Aβ secreted extracellularly in W8Δ, V9Δ and Y10Δ. As shown in FIGS. 5 and 6, the deletion at positions 4, 5, 6, 7 or 8 loses the inhibitory activity on the amount of Aβ produced intracellularly, and the secreted extracellular Aβ inhibitory activity is lost. However, as shown in FIGS. 5 and 6, the deletion at position 9 or 10 maintains the inhibitory activity on the amount of Aβ produced in the cells, and the inhibitory activity on the amount of Aβ secreted extracellularly is also maintained. found to be maintained.
５．動物への投与
１０匹のＡＰＰノックインマウス(ノックイン技法により作製されたマウス)の腹腔内に、ＤＭＳＯに溶解した配列番号１にかかるペプチドを２００，４００，１０００nmol/マウス投与した。投与は５日連続して行い、５日の後にマウスを安楽死させ、大脳を摘出した。5. Administration to animals 10 APP knock-in mice (mice produced by the knock-in technique) were intraperitoneally administered with 200, 400, 1000 nmol/mouse of the peptide of SEQ ID NO: 1 dissolved in DMSO. Administration was continued for 5 consecutive days, after 5 days the mice were euthanized and the cerebrum was removed.
摘出した大脳を公知の方法で溶解し、抗４Ｇ８抗体で免疫沈降を行った後に、抗マウスＡβ抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。陰性対照として、ＤＭＳＯのみを投与した群（１０匹）も同様に実験を行った。 The isolated cerebrum was lysed by a known method, immunoprecipitated with an anti-4G8 antibody, and then subjected to Western blotting using an anti-mouse Aβ antibody. As a negative control, a group (10 rats) to which only DMSO was administered was also tested in the same manner.
また、ウエスタンブロッティングでは、２、１０、５０、及び２００ｐｇのゲッ歯類由来のＡβを標準物質として実験を行った。 In Western blotting, 2, 10, 50, and 200 pg of rodent-derived Aβ were used as standard substances.
図７に示されるように配列番号１にかかるペプチドを腹腔内投与したマウスでは、大脳中のＡβを示すバンドが減少する事が明らかとなった。 As shown in FIG. 7, it was revealed that in mice to which the peptide of SEQ ID NO: 1 was intraperitoneally administered, the band indicating Aβ in the cerebrum decreased.
アルツハイマー病の予防及び／又は治療に利用できる。 It can be used for prevention and/or treatment of Alzheimer's disease.
配列番号１～５：合成ペプチド SEQ ID NOs: 1-5: synthetic peptides
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