JP7312930B2

JP7312930B2 - 測定装置

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Publication number: JP7312930B2
Application number: JP2020525638A
Authority: JP
Inventors: 法親緒方
Original assignee: 株式会社日本バイオデータ
Priority date: 2018-06-15
Filing date: 2019-06-12
Publication date: 2023-07-24
Anticipated expiration: 2039-06-12
Also published as: JPWO2019240202A1; WO2019240202A1

Description

本発明は，測定装置に関する。より詳しく説明すると，本発明は，細胞の物性や挙動を測定できる電気化学的測定装置に関する。

特許５６１７５３２号公報には，誘電サイトメトリ装置及び誘電サイトメトリによる細胞分取方法が記載されている。

特許５６１７５３２号公報

従来の誘電サイトメトリでは，電極付近にある試料の物性を測定できないという問題や，電極と試料との距離により測定値が変動するという問題があった。

そこで，本明細書は，試料の物性をより精度よく測定でき，試料の挙動をも測定できる電気化学的測定装置を提供することを目的とする。

上記の課題は，電極を試料の断面積よりも小さくすることで，電極付近に存在する試料の物性をも測定できるという知見に基づく。また，隣接する電極の間の距離を小さくするとより精度よく試料の物性を測定でき，電圧を印可する電極の間を溶液は通るものの試料は通さない隔壁を設けることで，さらに精度よく試料の物性を測定できるという知見に基づく。

本明細書において最初に記載される発明は測定装置１に関する。この測定装置は，溶液３を収容する溶液槽５と，第１の電極７及び第２の電極９と，電圧印加手段１１と，電流測定手段１３と，を備える電気化学測定装置１である。

第１の電極７及び第２の電極９は，溶液槽５内に存在し，少なくとも表面の一部が溶液中に露出する。

電圧印加手段１１は，第１の電極７及び第２の電極９との間に電圧を印可するための要素である。

電流測定手段１３は，第１の電極７及び第２の電極９との間に流れる電流を測定するための要素である。

そして，この装置は，第１の電極７の溶液槽５に露出した部分１５の表面積Ｓが０．１μｍ^２以上１００μｍ^２以下である。

この測定装置は，例えば，溶液中に含まれる試料１７であって第１の電極付近に存在するもの１７ａの物性又は動きを測定するための装置である。試料１７の例は，生物細胞又はリポソームであり，表面積Ｓが生物細胞又はリポソームの面積より小さいことが好ましい。

この装置は，溶液中に含まれる試料１７が第２の電極に付着することを防止する付着防止手段１９を有することが好ましい。

第１の電極７及び第２の電極９はそれぞれ複数存在し，隣接する第１の電極７又は第２の電極９までの最小距離が３１ｍｍ以下であるものが好ましい。

第１の電極７及び第２の電極９は，基板２１上に設けられてもよい。また，第２の電極９は，基板２１の凹み部分２３に設けられ，付着防止手段１９は，凹み部を覆う網であるものが好ましい。

第１の電極７は，基板上２１に設けられ，
第２の電極９は，溶液槽５の側壁に設けられ，
付着防止手段１９は，第２の電極を覆う網であってもよい。

第２の電極９は，溶液に浮遊する電極収容体２３に設けられ，電極収容体２３の少なくとも一部が，付着防止手段１９を有し，第１の電極７は，基板上２１に設けられるものであってもよい。

この明細書に記載した発明は，，試料の物性をより精度よく測定でき，試料の挙動をも測定できる電気化学的測定装置を提供できる。

図１は，測定装置の構成例を示す概念図である。図２は，第１の電極及び第２の電極が基板上に設けられた測定装置の例を示す概念図である。図３は，アレイ状に形成された第１の電極及び第２の電極を示す概念図である。図４は，第１の電極が溶液槽の側壁に設けられ，第２の電極は溶液槽の底に設けられる測定装置を示す概念図である。図５は，第２の電極が溶液にうく電極収容体に収容された測定装置の例を示す概念図である。図６は，実施例において製造された電極の概念図である。図７は，誘電スペクトルを測定するための誘電測定装置を示す概念図である。図８は，電極と細胞の様子を示す図面に代わる写真である。図９は，測定されたCole-Coleプロット（図９（Ａ））及び周波数－位相プロット（図９（Ｂ））を示す図面に代わるグラフである。図１０は，電極間の距離の効果を示すためのCole-Coleプロット（図１０（Ａ））及び周波数－位相プロット（図１０（Ｂ））を示す図面に代わるグラフである。図１１は，非電解質の影響を検討するための周波数－位相プロットを示す図面に代わるグラフである。図１２は，移動する細胞を追跡した様子を示す概念図である。

以下，図面を用いて本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。

本明細書において最初に記載される発明は測定装置１に関する。図１は，測定装置の構成例を示す概念図である。図１に示されるように，この測定装置は，溶液３を収容する溶液槽５と，第１の電極７及び第２の電極９と，電圧印加手段１１と，電流測定手段１３と，を備える電気化学測定装置１である。溶液の例は電解質溶液や，細胞やリポソームによっては，培地や培養液であってもよい。溶液槽５は溶液を収容できるものであればよく，用途に合わせてその大きさや素材を適宜選択できる。

第１の電極７及び第２の電極９は，溶液槽５内に存在し，少なくとも表面の一部が溶液中に露出する。電極の表面全体が露出して溶液と接触するものであってもよし，電極の一部が基板や溶液に埋没していてもよい。第１の電極７の溶液槽５に露出した部分１５の表面積Ｓが０．１μｍ^２以上１００μｍ^２以下である。Sの値は０．２の電極はμｍ^２以上８０μｍ^２以下でもよいし，０．５μｍ^２以上７０μｍ^２以下でもよいし，１μｍ^２以上５０μｍ^２以下でもよいし，０．５μｍ^２以上３０μｍ^２以下でもよいし，２μｍ^２以上１０μｍ^２以下でもよいし，１０μｍ^２以上５０μｍ^２以下でもよい。このように微小な電極に電圧を印加した場合，電極表面へ試料を輸送する拡散層の形が半球に近づき，試料が半球表面から電極に向けて収束するように拡散するので，試料の物性を精度よく測定できると考えられる。つまり，通常の電極を用いると隣接する電極に付着等した試料により測定値が変動するものの，電極を微小とすることでそのような問題を解消できると考えられる。半導体チップは微小化及び迅速化が達成できているので，このような微小電極を，半導体製造方法における技術を用いることで製造できる。

第２の電極９も第１の電極と同様のものであってもよい。また，第１の電極７及び第２の電極９は，複数存在してもよい。図２は，第１の電極及び第２の電極が基板上に設けられた測定装置の例を示す概念図である。図２に示される測定装置は，第１の電極７及び第２の電極９が，基板２１上に設けられている。そして，第２の電極９が，基板２１の凹み部分２３に設けられ，付着防止手段１９が，凹み部を覆う網である。網により，溶液は網を通過するものの，試料は網を通過しない。これにより，第２の電極に試料が付着する事態を防止できる。図２に示されるように第１の電極７及び第２の電極９は，基板に設けられたアレイ状のものであってもよい。また，第１の電極７及び第２の電極９は，それぞれの接続関係を調整できるように接続関係を制御できるものが好ましい。

図３は，アレイ状に形成された第１の電極及び第２の電極を示す概念図である。第１の電極７及び第２の電極９はそれぞれ複数存在し，隣接する第１の電極７又は第２の電極９までの最小距離ｄが３１ｍｍ以下であるものが好ましい。ｄの値があまりに小さいと隣接する電極において通電してしまうので，ｄの値は０．１μｍ以上であることが好ましく，１μｍ以上でもよいし，５μｍ以上でもよい。一方，ｄは，２５ｍｍ以下でもよいし，２０ｍｍ以下でもよいし，１５ｍｍ以下でもよいし，１０ｍｍ以下でもよいし，１ｍｍ以下でもよいし，５００μｍ以下でもよいし，１００μｍ以下でもよいし，５０μｍ以下でもよい。図３において，電極のうち溶液槽５に露出した部分１５が描画されている。また，図３のアレイ状の電極において，いずれが第１の電極７又は第２の電極９であってもよい。

電圧印加手段１１は，第１の電極７及び第２の電極９との間に電圧を印可するための要素である。電圧印加手段１１は，第１の電極７及び第２の電極９の間に電圧を印可する手段である。印加される電圧は交流であっても，直流であってもよいものの，通常は交流電圧である。電圧印加手段１１は，電極間に印加する交流電圧の周波数を制御できるものが好ましい。誘電サイトメトリ等において２つの電極の間に印加される電圧は公知であるから，公知の印過電圧を適宜調整したものを第１の電極７及び第２の電極９との間に印加すればよい。そして，複数の電極を有する電極アレイのうち，いずれの電極間に電圧を印可するかは，制御部により制御できるようにされていることが好ましい。

電流測定手段１３は，第１の電極７及び第２の電極９との間に流れる電流を測定するための要素である。電流測定手段１３は，公知である。電流測定手段１３は，２つの電極間の電流を測定することで，各種物性を測定できるものであってもよい。

この測定装置は，例えば，溶液中に含まれる試料１７であって第１の電極付近に存在するもの１７ａの物性又は動きを測定するための装置である。試料１７の例は，生物細胞又はリポソームであり，表面積Ｓが生物細胞又はリポソームの面積より小さいことが好ましい。第１の電極付近の例は，第１の電極と隣接する電極において，第１の電極への距離が近い領域である。

この装置は，溶液中に含まれる試料１７が第２の電極に付着することを防止する付着防止手段１９を有することが好ましい。付着防止手段１９は，第１の電極に試料が付着することをも防止してもよい。付着防止手段１９の例は，後述する網や半透膜である。付着防止手段１９が網の場合，網の目の大きさが試料（の断面積）よりも小さいものが好ましい。そのような網を用いることで溶液の移動を確保しつつ，試料が電極に付着する事態を効果的に防止できる。

図４は，第１の電極が溶液槽の側壁に設けられ，第２の電極は溶液槽の底に設けられる測定装置を示す概念図である。図４の例では，第１の電極７が，基板上２１に設けられ，第２の電極９が，溶液槽５の側壁に設けられ，付着防止手段１９が，第２の電極を覆う網である。このような位置関係にある場合，特に試料が細胞であると，試料が第２の電極に付着する事態を効果的に防止できたため，好ましい。この場合の，溶液槽５は，底面と底面から伸びる側壁とを有するものである。底面の形状の例は，円形，楕円形，及び多角形である。第２の電極は，底面から所定の高さにあることが好ましい。高さの例は，１μｍ以上１ｍｍ以下であり，１０μｍ以上１００μｍ以下でもよい。

基板は，絶縁体により構成されていてもよい。基板が透明又は半透明な絶縁体により構成されていることが好ましい。そのような絶縁体の例は，透明セラミックスである。透明セラミックスは，例えばＡｌ２Ｏ３，Ｙ２Ｏ３及びＹＡＧのいずれか又は複数を用いることで達成できる。基板が透明であれば，特に試料が細胞やリポソームの場合に，それらの挙動を観測しやすい。

図５は，第２の電極が溶液に浮く電極収容体に収容された測定装置の例を示す概念図である。電極収容体の例は，浮きである。第２の電極９は，溶液に浮遊する電極収容体２３に設けられ，電極収容体２３の少なくとも一部が，付着防止手段１９（例えば網）を有し，第１の電極７は，基板上２１に設けられるものであってもよい。

次に，電気化学測定装置の原理を簡単に説明する。
電極板間に交流電圧を印加して，流れる電流を測定することで，電極間の複素抵抗（複素インピーダンス）が得られる。印加される交流電圧の周波数を変化させると，測定される複素抵抗も変化する。このような測定は，市販されている精密インピーダンスアナライザ（電流測定装置）を用いて行うことができる。

周波数に依存した複素抵抗は，測定容器の形状に依存した因子，複素抵抗測定器と測定容器の間の電気配線の伝送特性に依存した因子などを補正することにより，細胞懸濁液の複素誘電率に変換できる。複素誘電率の周波数依存性を，複素誘電率分散（誘電スペクトル）という。

細胞懸濁液の複素誘電率分散は，単一の緩和関数（例えば，Cole-Cole関数），あるいは複数の緩和関数の重ね合わせにより表現できる。実験的に得られた複素誘電率分散に対して，緩和関数が含む未定係数を変数とした非線形適合を行うことにより，その変数を最適化できる。例えばCole-Cole関数の場合，分散曲線を特徴づける変数として，緩和強度及び緩和周波数がある。これらの誘電変数は，細胞の構造や物性と密接に関連している。誘電変数から細胞を構成する相（細胞膜，細胞質など）の電気的物性値を推定する方法は，例えば特開２００９－４２１４１号公報に記載されている。

測定装置を製造するにあたり，基板（チップ）上に電極を開発した。図６は，実施例において製造された電極の概念図である。電極表面は，窒化チタン（TiN）で形成され，溶液や動物細胞などの試料と接することとなる部分である。非ドープケイ酸塩ガラス（NSG，SiO2），アルミニウム（Al），酸化ケイ素（SiO2），ケイ素（Si）が用いられた。

予備チップ
20μm間隔の10μm四方の36個の電極パッドを6行6列のグリッド電極アレイとし，28900μm²の領域を覆った。

細動の挙動追跡用チップ
3.4μmの間隔をおいて6.6μm角の36個の電極パッドを6行6列のグリッド電極アレイとし，3200μm²の領域を覆った。

誘電測定装置
図７に誘電スペクトルを測定するための誘電測定装置を示す。この例では，アジレント４２９４Ａプレシジョンインピーダンスアナライザーを用いて，誘電スペクトルを測定した。Ｚ値と位相を測定した。

溶液としてグルコース溶液及びＰＢＳを用いた。試料の例として，ここでは，２５μｍのポリスチレン製のビーズを用いた。

MGM-450昆虫培地に10μm四方の電極２個を20μm間隔で接触させ，培地に昆虫細胞塊を加えた。光学顕微鏡を用いて電極を観察し，電極上部に細胞塊が乗っていない２つの電極間でLCRメーターを用いて100mVで100Hzから1000000Hzまでのインピーダンス測定を行ってZ値とθ値を得た。同様に，MGM-450昆虫培地に10μm四方の電極２個を20μm間隔で接触させ，培地に昆虫細胞塊を加えた。光学顕微鏡を用いて電極を観察し，電極上部に細胞塊が乗っている２つの電極間でLCRメーターを用いて100mVで100Hzから1000000Hzまでのインピーダンス測定を行ってZ値とθ値を得た。図８は，電極と細胞の様子を示す図面に代わる写真である。図９は，測定されたCole-Coleプロット（図９（Ａ））及び周波数－位相プロット（図９（Ｂ））である。測定結果をθ-Hz平面上に図示したときに観察される10000Hz付近のピークは電極上部に細胞塊が乗っている２つの電極間の測定において低周波側にシフトした。

電極間の距離についての検討
電極として，10μm四方の電極と6.6μm四方の電極とマニュアルプローバーのプローブ針を用いた。10μm四方の電極と6.6μm四方の電極は，いずれも独立の導線で繋がっており，導線の反対側の端はマニュアルプローバーのプローブ針を用いてプロービングすることで導通が得られるようにした。

リン酸緩衝生理食塩水に6.6μm四方の電極２個を接触させ，LCRメーターを用いて100mVで100Hzから100000000Hzまでのインピーダンス測定を行ってZ値とθ値を得た。θ値は100Hzで-80°，10000Hzで-60°，10000000Hzで-80°となり，100000000で-75°となり，従来技術で測定されてきた高周波領域に現れる電極表面から離れた領域にある電極間中間物質の電気化学的特性と，従来技術では測定されなかった10000Hz付近に現れる電極表面領域にある電極間中間物質の電気化学的特性が確認された。電極の間隔が3μmから60μmの範囲では測定結果が変化しなかった。

リン酸緩衝生理食塩水に6.6μm四方の電極１個とマニュアルプローバーのプローブ針を接触させ，LCRメーターを用いて100mVで100Hzから100000000Hzまでのインピーダンス測定を行ってZ値とθ値を得た。図１０は，電極間の距離の効果を示すためのCole-Coleプロット（図１０（Ａ））及び周波数－位相プロット（図１０（Ｂ））を示す図面に代わるグラフである。電極の間隔を2.5mmから8mmの範囲で変化させると，θ値は100Hzで-80°，10000Hzで-60°となるまでは前述の実施例と同様であったが，10000000Hz付近でθの値が電極間距離依存的に-80°から-70°まで増大し，100000000Hz付近でθの値が電極間距離依存的に-75°から-45°まで増大した。電極表面領域にある電極間中間物質の電気化学的特性は10000Hz付近に現れ，電極間の距離を変化させることによって変化しなかった。一方で電極表面から離れた領域にある電極間中間物質の電気化学的特性は高周波領域に現れ，電極間の距離を変化させることによって変化した。

非電解質の効果
電極表面領域にある電極間中間物質（試料）の電気化学的特性に由来するθの増大と電極表面から離れた領域にある電極間中間物質の電気化学的特性に由来するθの増大とは，θ-Hz平面上に２つのピークを生じるが，この２つのピークの間に生じる谷底のHzの値が，電極表面領域にある電極間中間物質の電気化学的特性の現れる10000Hz付近に近づくと，電極表面領域にある電極間中間物質の電気化学的特性と電極表面から離れた領域にある電極間中間物質の電気化学的特性をθ-Hz平面上の２つのピークとして分離することが困難になると予測される。これまでの測定結果を外挿すると，前述の谷底のHzの値は10^(7.1+0.1(電極間距離(mm)))であり，電極間距離が31mm以上になると電極表面領域にある電極間中間物質の電気化学的特性と電極表面から離れた領域にある電極間中間物質の電気化学的特性をθ-Hz平面上の２つのピークとして分離することが困難になる。

リン酸緩衝生理食塩水に6.6μm四方の電極１個とマニュアルプローバーのプローブ針を接触させ，LCRメーターを用いて100mVで100Hzから1000000Hzまでのインピーダンス測定を行ってZ値とθ値を得た。図１１は，非電解質の影響を検討するための周波数－位相プロットを示す図面に代わるグラフである。測定結果をθ-Hz平面上に図示したときに観察される10000Hz付近のピークは，リン酸緩衝生理食塩水にスチレンビーズ，砂糖，真核細胞を加えることによって低周波側にシフトした。

電極２個をミセルや粒子などの不均質構造の分散した溶液に接触させるLCRメーターを用いたインピーダンス測定において，電極表面領域にある電極間中間物質の電気化学的特性と電極表面から離れた領域にある電極間中間物質の電気化学的特性を分離してそれぞれ測定する限定された条件では，片方の電極をミセルや粒子，細胞などの不均質構造が接触しないように網などで覆うことで，溶液に接触した２個の電極のうちどちらに不均質構造が接触したのか知ることができた。

試料の挙動分析
細胞なしで72時間培養培地を連続的に測定することにより，チップの耐久性を検証した。その結果，インピーダンスは変化しなかった。次に，隣り合っている60個の電極対を1時間15分間隔で繰り返し測定した。その結果，移動する細胞を追跡することができた。その様子を図１２に示す。図１２は，移動する細胞を追跡した様子を示す概念図である。細胞の位置は点線で囲ってある。つまり，細胞が移動すると電極において測定される電流値（したがってインピーダンス）が変化するので，細胞が移動したことを測定できる。

本発明は分析機器の分野で利用されうる。

１電気化学測定装置
３溶液
５溶液槽
７第１の電極
９第２の電極
１１電圧印加手段
１３電流測定手段
１５第１の電極の溶液槽に露出した部分

Claims

溶液（３）を収容する溶液槽（５）と，
前記溶液層（５）内に存在し，少なくとも表面の一部が前記溶液中に露出する第１の電極（７）及び第２の電極（９）と，
第１の電極（７）及び第２の電極（９）との間に電圧を印可する電圧印加手段（１１）と，
第１の電極（７）及び第２の電極（９）との間に流れる電流を測定する電流測定手段（１３）と，を備える電気化学測定装置（１）であって，
第１の電極（７）の前記溶液槽（５）に露出した部分（１５）の表面積Ｓが０．１μｍ^２以上１００μｍ^２以下である，
電気化学測定装置であって，
前記溶液中に含まれる試料（１７）が第２の電極に付着することを防止する付着防止手段（１９）を有し，
第２の電極（９）は，前記溶液に浮遊する電極収容体（２３）に設けられ，前記電極収容体（２３）の少なくとも一部が，前記付着防止手段（１９）を有し，
第１の電極（７）は，基板上（２１）に設けられる，電気化学測定装置。
請求項１に記載の電気化学測定装置であって，
前記電気化学測定装置は，前記溶液中に含まれる試料（１７）であって第１の電極付近に存在するもの（１７ａ）の物性又は動きを測定するための装置である，電気化学測定装置。
請求項１に記載の電気化学測定装置であって，
前記試料（１７）が生物細胞又はリポソームであり，前記表面積Ｓが前記生物細胞又はリポソームの面積より小さい，電気化学測定装置。
請求項１に記載の電気化学測定装置であって，第１の電極（７）及び第２の電極（９）はそれぞれ複数存在し，隣接する第１の電極（７）又は第２の電極（９）までの最小距離が３１ｍｍ以下である，電気化学測定装置。
請求項１に記載の電気化学測定装置であって，
第１の電極（７）及び第２の電極（９）は，基板（２１）上に設けられ，
第２の電極（９）は，前記基板（２１）の凹み部分（２３）に設けられ，前記付着防止手段（１９）は，前記凹み部を覆う網である，電気化学測定装置。
請求項１に記載の電気化学測定装置であって，
第１の電極（７）は，基板上（２１）に設けられ，
第２の電極（９）は，前記溶液槽（５）の側壁に設けられ，
前記付着防止手段（１９）は，第２の電極を覆う網である，
電気化学測定装置。