JP7309196B2 - タンパク質蓄積の調節及びその使用 - Google Patents

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Description

本出願は、それらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年１１月７日に出願された「タンパク質蓄積の調節及びその使用」と題するオーストラリア仮特許出願第２０１６９０４５４１号、及び２０１７年３月２３日に出願された「タンパク質蓄積の調節及びその使用」と題するオーストラリア仮特許出願第２０１７９０１０２６号に対する優先権を主張する。
本発明は、一般的に、神経変性状態に関する。より詳細には、本発明は、サイクリンＦの異常に低いレベル又は活性を有する運動ニューロンにおけるサイクリンＦをコードする核酸配列の発現を介した、異常なタンパク質蓄積を抑制し、運動ニューロンの生存を促進し、運動ニューロン変性を抑制及び神経変性状態を治療するための組成物及び方法に関する。本発明はまた、運動ニューロンの生存を促進し、運動ニューロンの変性を阻害し及び／又は運動ニューロンにおける異常なタンパク質蓄積を阻害する薬剤を同定し、神経変性状態の治療、神経変性状態の診断、及び神経変性状態の進行の予測に有用な薬剤を同定し、及び神経変性状態の進行を低下させることにおける治療の有効性を監視する方法に関する。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、主に運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）としての臨床症状に基づいて集合的に呼ばれる一群の神経変性疾患の最も一般的な形態である。ＡＬＳは、脳及び脊髄における運動ニューロンの進行性死による麻痺及び筋肉の変性を特徴とする遅発型致死性疾患である。ＡＬＳ患者の約２０％は前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）とも診断され、ＡＬＳとＦＴＤの両方の分離、特にＣ９ＯＲＦ７２に変異を有する家族において見られる可能性がある（Neumann et al., 2007. Archives of Neurology 64:1388-1394; Bigio et al., 2013. Acta Neuropathologica 125:463-465）。ＡＬＳの生物学的基礎はあまり理解されていないままであるが、最近のいくつかの発見が病原性メカニズムへの洞察を提供している。家族性症例の生物学を理解することは、散発性ＡＬＳをよりよく理解するための固有の機会を提供する。
ＡＬＳ症例の約１０％は、家族歴が陽性（家族性ＡＬＳ）であり、散発性ＡＬＳ症例と臨床的に区別がつかないように見える。ＲＮＡ代謝に関与する多数の遺伝子における突然変異（例えばＴＤＰ４３（Neumann et al., 2006, Science 314:130-133）及びＦＵＳ（Mackenzie et al., 2010, Lancet Neurology 9:995-1007））、及びタンパク質分解（Ｆ．例えば、ＵＢＱＬＮ２（Williams et al., 2012, Neurobiology of Aging 33:2527 e2523-2510）及びＴＢＫ１（Cirulli et al., 2015, Science 347:1436-1441, Freischmidt et al., 2015, Nature Neuroscience 18:631-636)など）は、家族性ＡＬＳの病因に関与している。最近の研究において、新しいＡＬＳ遺伝子、ＣＣＮＦへの突然変異は、家族性及び散発性のＡＬＳ／ＦＴＤ患者において同定された（Williams et al., 2016, Nat Commun 7:11253）。ＣＣＮＦは、プロテアソームによる分解のために不要で損傷したタンパク質をユビキチン化する細胞のリサイクルシステムの不可欠な部分である、Ｓｋｐ１－Ｃｕｌ１－Ｆ－ボックス（ＳＣＦ）Ｅ３ユビキチン－タンパク質リガーゼ複合体の成分であるサイクリンＦをコードする（Bai et al., 1996, Cell 86:263-274）。Ｗｉｌｌｉａｍらによって確認されたＣＣＮＦ突然変異（２０１６、上記）は、インビトロ及びインビボでＡＬＳ発病の不完全なタンパク質分解及び特徴的な特徴をもたらすことが示された。
タンパク質分解は、２つの主要な細胞内タンパク質分解経路、すなわちユビキチン－プロテアソームシステム（ＵＰＳ）及びオートファジーによって行われる必須の細胞プロセスである。通常のオートファジーは、オートファジー液胞（オートファゴソーム）への隔離を介してタンパク質の蓄積を防ぐ動的な多段階プロセスである。オートファゴソームとリソソームのその後の融合はタンパク質分解をもたらす。この過程の中断は、タンパク質凝集物の蓄積及び神経変性をもたらす。
神経変性状態では、正常な自己貪食フラックスが変化し、その結果、自食作用液胞又は自食作用胞が蓄積する。ほとんどのＡＬＳ及びＦＴＤ症例の顕著な病理学的特徴は、神経細胞質封入体における異常にユビキチン化されたタンパク質、特にＴＤＰ－４３の存在である（Neumann et al., 2013. Nat. Rev. Neurosci. 14, 248-264）。ユビキチンは、翻訳後に基質タンパク質のリジン残基に結合して、ｉ）プロテアソームを介したそれらの分解、ｉｉ）それらの細胞内の位置及び活性の変化、及び／又はｉｉｉ）促進又はタンパク質の相互作用を防ぐ（Komander and Rape, 2012）。ユビキチン化は、３つの主な工程：Ｅ１による活性化、Ｅ２によるユビキチン抱合、及びＥ３による基質連結のそれぞれで行われる。この連続的なカスケードの結果は、タンパク質を異なる機能に向かわせる異なる結合を介して、ユビキチンをタンパク質上のリジン残基に結合させる。Ｗｉｌｌｉａｍ等の所見（２０１６、上記）は、ＣＣＮＦの突然変異型が、運動ニューロン死を引き起こす異常なタンパク質分解の根底にある可能性があるＴＤＰ－４３を含む、ユビキチン化タンパク質の異常なユビキチン化及び蓄積に寄与することを示している。
本発明は、部分的には、（１）ＴＤＰ－４３がＳＣＦサイクリンF複合体の相互作用パートナー及び基質であるという決定、（２）サイクリンＦの欠乏が運動ニューロンでのＴＤＰ－４３の蓄積をもたらすという決定、及び（３）神経変性状態を有する患者のサブセットが運動ニューロンにおいてサイクリンＦの異常に低いレベル又は活性を有するという決定から生じる。これらの所見に基づいて、本発明者らは、神経変性状態を有する患者のこのサブセットにおいて運動ニューロン中のサイクリンＦレベルを増加させることは、タンパク質の異常蓄積を減少させ、それによって後述するように運動ニューロン生存を増強するであろうと提案する。
したがって、一態様において、本発明は、対照と比較して、レベル又は活性が低下したサイクリンＦを用いて運動ニューロンの生存を促進する方法を提供する。これらの方法は、一般的に、運動ニューロンにおけるサイクリンＦをコードする核酸配列の発現を増加させるか又は刺激することによって、それによって運動ニューロンの生存を促進することを含むか、それからなるか、又は本質的にそれからなる。
本発明の別の態様は、対照と比較して、レベル又は活性が低下したサイクリンＦで運動ニューロンの変性を阻害する方法を提供する。これらの方法は、一般的に、運動ニューロンにおけるサイクリンＦをコードする核酸配列の発現を増加させるか又は刺激することによって、それによって運動ニューロンの変性を阻害することを含むか、それからなるか、又は本質的にそれからなる。
さらに別の態様では、本発明は、対照と比較して、サイクリンＦのレベル又は活性が低下した運動ニューロンにおける異常なタンパク質蓄積を阻害する方法を提供する。これらの方法は、一般的に、運動ニューロンにおけるサイクリンＦをコードする核酸配列の発現を増加又は刺激することを含み、それからなり、又はそれから本質的になり、それにより運動ニューロンにおける異常なタンパク質蓄積を阻害する。適切には、異常なタンパク質蓄積は、異常な蓄積タンパク質（例えば、ＴＤＰ－４３のようなタンパク質蓄積又は凝集を受けやすいタンパク質）を含む。
本発明のさらに別の態様は、対照と比較して、サイクリンＦのレベル又は活性が低下した運動ニューロンを有する対象における神経変性状態を治療する方法を提供する。これらの方法は、一般的に、運動ニューロンにおけるサイクリンＦをコードする核酸配列の発現を増加又は刺激し、それによって神経変性状態を治療することを含む、それからなる、又は本質的にそれからなる。適切には、本方法は、運動ニューロンにおけるサイクリンＦをコードする核酸配列の発現を増加させる又は発現を刺激する前に、対象が、対照と比較して、サイクリンＦのレベル又は活性が低下した運動ニューロンを有することを決定することをさらに含む。
特定の実施形態において、本方法は、運動ニューロン内で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたサイクリンＦをコードする核酸配列を含む構築物を運動ニューロンに導入することを含む。このタイプの例示的な例では、構築物はウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）の形態である。
本発明のさらなる態様は、対照と比較して、サイクリンＦのレベル又は活性が低下した運動ニューロンを有する対象における神経変性状態を治療する方法を提供する。これらの方法は、一般的に、運動ニューロンにおいて作動可能であるプロモーターに作動可能に連結されたサイクリンＦをコードする核酸配列を含む構築物を投与することを含むか、それからなるか、又は本質的にそれからなる。適切には、構築物はウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）の形態である。特定の実施形態において、本方法は、構築物の投与の前に、対象が、対照と比較して、サイクリンＦのレベル又は活性が低下した運動ニューロンを有することを決定することをさらに含む。
本発明のさらに別の態様は、運動ニューロンにおいて作動可能であるプロモーターに作動可能に連結されたサイクリンＦをコードする核酸配列を含む組換えウイルスベクターを提供する。適切には、組換えウイルスベクターはＡＡＶベクターである。
本発明はまた、別の態様において、神経変性状態を治療又は予防するための候補薬剤を同定する方法を提供する。これらの方法は、一般的に以下を含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になる：（ａ）細胞集団を対象物と接触させること、ここで、細胞は、対照に対して、サイクリンＦのレベル又は活性が減少し、及び／又は異常タンパク質蓄積を有する；及び（ｂ）対象物の存在下で（ｉ）サイクリンＦのレベル又は活性、及び／又は（ｉｉ）細胞内の異常なタンパク質蓄積を測定する；及び（ｃ）神経変性を治療又は予防するための候補薬剤を同定すること、ここで、試験物が、対象物の存在下で（ｉ）サイクリンＦのレベル又は活性を増加させるか、又は（ｉｉ）異常なタンパク質蓄積を減少させる場合、対象物は神経変性状態を治療又は予防するための候補薬剤である。適切には、細胞は、運動ニューロン又は運動ニューロン細胞の代用物となる細胞（例えば、皮膚線維芽細胞などの皮膚細胞、又は末梢血単核球などの血液細胞など、これらは運動ニューロンに類似した疾患関連分子特性を示す）から選択される。
別の態様では、本発明は、対象における神経変性状態の存在を診断するための方法を提供する。これらの方法は、一般的に、対照と比較して、サイクリンＦのレベルが低下した運動ニューロン又は運動ニューロンの代用物である細胞を対象において検出することを含む、それからなる、又は本質的にそれからなる。
本発明のなお別の態様は、対照における神経変性状態の存在を診断するための方法を提供する。これらの方法は、一般的に、以下を含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になる：（ａ）対象から細胞を含む試料を得ること；（ｂ）細胞中のサイクリンＦのレベル又は活性を検出するために試料中の細胞に対して少なくとも１つのアッセイを実施すること；及び（ｃ）細胞中のサイクリンＦのレベル又は活性が、対照試料中のサイクリンＦのレベル又は活性と比較して減少している場合、神経変性状態を有すると対象を診断すること。特定の実施形態において、細胞は、運動ニューロン又は運動ニューロンの代用物である細胞から選択される。
本発明のさらに別の態様は、運動ニューロンにおけるサイクリンＦのレベル又は活性を決定するための１つ以上の試薬と、任意選択でその決定を実行するための説明書とを含む、対象における神経変性状態の存在を診断するためのキットを提供する。
本発明の別の態様は、対象における神経変性状態の進行を予測するための方法を提供する。これらの方法は、一般的に以下を含む、それらからなる、又は本質的にそれらからなる：（ａ）対象から第１の試料を得ること、ここで、第１の試料は、運動ニューロン及び／又は運動ニューロンの代用物である細胞（例えば、皮膚線維芽細胞などの皮膚細胞、末梢血単核球などの血液細胞など）を含む；（ｂ）第１の試料が得られたときより遅い時間に対象から第２の試料を得ること、ここで、第２の試料は、運動ニューロン及び／又は運動ニューロンの代用物である細胞（例えば、皮膚線維芽細胞などの皮膚細胞、末梢血単核球などの血液細胞など）を含む；（ｃ）サイクリンＦのレベル又は活性を検出するために細胞試料に対して少なくとも１つのアッセイを実施すること；及び（ｄ）対象における神経変性状態の進行を予測すること、ここで、（ｉ）第２の試料中のサイクリンＦのレベル又は活性が第１の試料中のサイクリンＦのレベル又は活性と比較して減少している場合、神経変性状態は進行していると予測され、又は（ｉｉ）第２の試料中のサイクリンＦのレベル又は活性が、第１の試料中のサイクリンＦのレベル又は活性と比較して増加又は変化していない場合、神経変性状態は進行していないと予測される。
本発明のさらなる態様は、対象における神経変性状態の進行を減少させることにおける治療の有効性をモニターする方法を提供する。これらの方法は、一般的に、以下を含む、それらからなる、又は本質的にそれらからなる：（ａ）対象への治療の投与前後の神経変性状態を有する対象からの運動ニューロン及び／又は運動ニューロンの代用物である細胞（例えば、皮膚線維芽細胞などの皮膚細胞、末梢血単核球などの血液細胞など）を含む試料中のサイクリンＦのレベル又は活性を決定するための少なくとも１つのアッセイを実施すること；及び（ｂ）治療の投与前の対象からの試料中のサイクリンＦのレベル又は活性を、治療の投与後に対象からの試料中のサイクリンＦのレベル又は活性と比較すること；及び（ｃ）対象における神経変性状態の進行の減少における治療の有効性をモニターすること、ここで、治療の投与前の試料中のサイクリンＦのレベル又は活性と比較して、治療の投与後の試料中のサイクリンＦのレベル又は活性の増加は、治療が、対象における神経変性状態の進行の減少に有効であることを指示する。
上記及び本明細書の他所に記載される態様及び実施形態のいずれかにおいて、神経変性状態は、典型的には、運動ニューロン変性によって特徴付けられ、特定の実施形態において、神経変性状態はＡＬＳ及びＦＴＤから選択される。
図１は、生細胞中のプロテオームの標識を示す概略図及び写真図である。Ａ．ＢｉｏＩＤ－サイクリンＦを用いたビオチン化の概略図。Ｂ．サイクリンＦ－ＢｉｒＡ＊は、培地に５０μＭのビオチンを添加し、さらに２４時間インキュベートすると、タンパク質をビオチン化する。Ｃ．イムノブロッティングは、生きたＦｌｐ－Ｉｎ Ｔ－Ｒｅｘ ２９３細胞において、内因性ＴＤＰ－４３がサイクリンＦ－ＢｉｒＡ＊*によってビオチン化されていることを示している。 図２は、サイクリンＦが、ＨＥＫ細胞及びニューロン様細胞においてＴＤＰ－４３を免疫共沈降させることを示す写真図である。Ａ．ｍＣｈｅｒｒｙ－サイクリンＦはＮｅｕｒｏ２Ａ細胞で内因性ＴＤＰ－４３を免疫共沈降させる。 Ｂ．サイクリンＦ－フラッグは、ＨＥＫ２９３細胞において過剰発現されたＴＤＰ－４３－ＨＡを免疫共沈降させる。 Ｃ．ＴＤＰ－４３は、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞において、ｍＣｈｅｒｒｙ－サイクリンＦWT及びｍＣｈｅｒｒｙ－サイクリンＦS621Gと免疫沈降する。 図３は、ＴＤＰ－４３及びサイクリンＦがＨＥＫ２９３細胞の核内に共局在することを示すグラフ及び写真である。サイクリンＦを過剰発現している細胞は、ＴＤＰ－４３染色の減少を示す。 図３は、ＴＤＰ－４３及びサイクリンＦがＨＥＫ２９３細胞の核内に共局在することを示すグラフ及び写真である。サイクリンＦを過剰発現している細胞は、ＴＤＰ－４３染色の減少を示す。 サイクリンＦ発現のｓｉＲＮＡ媒介減少を有する細胞が、陰性対照と比較してより大きなＴＤＰ－４３発現を有することを示す写真及びグラフ図である。 図５は、実質的に少ないサイクリンＦが、健康な対照と比較して、散発性ＭＮＤ患者の運動ニューロンにおいて観察されることを示す写真図である。死後患者の脊髄組織は、サイクリンＦ（茶色）及び核（青色）について免疫標識される。 野生型ＣＣＮＦ導入遺伝子の発現が、ＡＬＳの発症に関連した突然変異型ＴＤＰ－４３対立遺伝子（ＴＤＰ－４３A315T）を発現するニューロンにおけるＴＤＰ－４３の病理学的レベルを低下させることを示す写真図である。Ｋｅら（2015. Acta Neuropathologica, 130(5): 661-678）に記載されているように、ＴＤＰ－４３A315T発現の誘導（ｄｏｘの除去）後、ＴＤＰ－４３A315TマウスのニューロンにおいてＴＤＰ－４３A315T（赤）のロバスト発現が観察される。しかしながら、ＡＡＶ９-ＣＣＮＦWTを注射したＴＤＰ－４３A315Tマウスでは、ロバストな野生型サイクリンＦ（緑色）の発現が神経細胞で観察され、ＴＤＰ－４３A315T（赤色）の証拠はウイルス形質導入神経細胞では見られず、これはＴＤＰ－４３のクリアランスを示唆している。
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発明の詳細な説明
１．定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。さらに、文脈によって別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料が記載されている。本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。
単数形の用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないと示さない限り、複数の指示対象を含む。さらに、核酸又はポリペプチドについて与えられたすべての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ、及びすべての分子量又は分子量の値は近似値であり、説明のために提供されていることを理解されたい。
本明細書で使用されるとき、「及び／又は」は、関連する列挙された項目のうちの１つ又は複数のありとあらゆる可能な組合せ、ならびに代替（又は）で解釈されるときの組合せの欠如を指す。
さらに、本明細書で使用される「約」及び「およそ」という用語は、量、用量、時間、温度、活性、レベル、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量などの測定可能な値を指すとき、重量、位置、長さなどは、特定の量、用量、時間、温度、活性、レベル、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、位置、長さなどの±１５％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、さらには±０．１％の変動を包含することを意味する。
本明細書で使用される「活性」という用語は、転写産物又は翻訳産物が生物学的効果を生じる能力の尺度又は生物学的に活性な分子のレベルの尺度として理解されるべきである。したがって、サイクリンＦに関して、「活性」という用語は、以下の活性のうちの任意の１つ又は複数を指す：（１）他のサブユニットと会合してＳｋｐ１－Ｃｕｌ１－Ｆ－ボックス（ＳＣＦ）Ｅ３ユビキチン－タンパク質リガーゼ複合体（ＳＣＦＣサイクリンF）を形成する；（２）細胞周期チェックポイント制御を促進するためにＢ－Ｍｙｂ活性を抑制する；及び（３）基質（例えば、ＣＤＣ６、ＲＲＭ２、ＣＰ１１０、及びＳＬＢＰ、ならびに本明細書に開示のＴＤＰ－４３）と相互作用して、基質のユビキチン化及び分解を促進する。
本明細書で使用される場合、「投与される」という用語は、所望の部位での化合物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法又は経路による、本明細書に記載の薬剤の対象への配置を指す。本明細書に記載の薬剤は、対象において有効な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。すなわち投与は、対象の所望の位置への送達をもたらし、そこでは組成物の少なくとも一部が送達される。例示的な投与様式としては、注射、注入、点滴注入、又は摂取が挙げられるが、これらに限定されない。「注射」は、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、心室内、カプセル内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管内、皮下、表皮下、関節内、亜嚢内、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、及び胸骨内注射と注入を含む。
用語「同時に投与」又は「同時に投与する」又は「同時投与」などは、２つ以上の活性物質を含有する単一組成物の投与、又は別々の組成物としての各活性物質の投与、及び／又は有効な結果がそのような全ての活性物質が単一の組成物として投与されたときに得られるものと同等であるように、同時に又は十分に短い期間内に同時に又は連続的に別々の経路による送達を指す。「同時に」とは、活性剤が実質的に同時に、望ましくは同じ製剤中で一緒に投与されることを意味する。「同時に」とは、活性剤が接近した時間で与されること、例えば、ある剤が別の前又は後に約１分以内から約１日以内に投与されることを意味する。任意の同時期の時間が有用である。しかしながら、同時に投与されない場合、薬剤は、約１分以内から約８時間以内、適切には約１から約４時間以内に投与されることがしばしばある。同時に投与する場合、薬剤は対象の同じ部位に適切に投与される。「同一部位」という用語は正確な位置を含むが、約０．５から約１５センチメートル以内、好ましくは約０．５から約５センチメートル以内であり得る。本明細書で使用される「別々に」という用語は、ある間隔で、例えば約１日から数週間又は数ヶ月の間隔で薬剤が投与されることを意味する。活性剤はどちらの順序で投与してもよい。本明細書で使用される「連続して」という用語は、薬剤が、例えば数分、数時間、数日又は数週間の間隔で順番に投与されることを意味する。適切な場合には、活性剤は規則的な繰り返し周期で投与され得る。
用語「薬剤」又は「調節剤」は、所望の薬理学的効果及び／又は生理学的効果を誘導する化合物を含む。この用語はまた、限定されないが、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝物、類似体などを含む、本明細書に具体的に記載される化合物の薬学的に許容されかつ薬理学的に活性な成分も包含する。上記の用語が使用される場合、これは活性剤それ自体ならびに製薬上許容される薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝産物、類似体などを含むことが理解されるべきである。用語「薬剤」は狭く解釈されるべきではないが、小分子、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質のようなタンパク質性分子、ならびにそれらを含む組成物、ならびにＲＮＡ、ＤＮＡ及びその模倣体のような遺伝的分子及び化学的類似体ならびに細胞薬剤に拡張する。「薬剤」という用語は、本明細書で言及されるポリペプチドを産生及び分泌することができる細胞、ならびにそのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。したがって、「薬剤」という用語は、ウイルス又は非ウイルスベクターなどのベクター、発現ベクター、及びある範囲の細胞内での発現及び細胞内での分泌のためのプラスミドを含む核酸構築物にまで及ぶ。本明細書中で使用される場合、用語「候補薬剤」及び「対象剤」は、運動ニューロンの生存を刺激及び／又は増大及び／又は促進し、及び／又は運動ニューロンの変性を抑制又は減少させ、及び／又は運動ニューロンにおける異常なタンパク質蓄積を抑制又は減少するそれらの能力に関してスクリーニングされる薬剤及び／又は組成物を指すために互換的に使用される。
本明細書中で使用される場合、「サイクリンＦのレベル又は活性を増強する薬剤」とは、サイクリンＦのｍＲＮＡ又はタンパク質のレベル、サイクリンＦの活性、サイクリンＦのｍＲＮＡもしくはタンパク質の半減期、又は別の分子（例えば、ＴＤＰ－４３などのサイクリンＦの基質及び／又はＳＣＦＣサイクリンF複合体の他の成分）へのサイクリンＦの結合を増加させる薬剤をいう。例えば、薬剤は、サイクリンＦがＳＣＦＣサイクリンF複合体の他の成分と会合し、プロテアソームによるクリアランスのためにタンパク質をユビキチン化する能力を直接的又は間接的に増強し得る。ｍＲＮＡの発現レベルは、標準的なＲＮａｓｅ保護アッセイ又はインサイチュハイブリダイゼーションアッセイを用いて決定することができ、タンパク質のレベルは、標準的なウエスタン分析又は免疫組織化学分析を用いて決定することができる。タンパク質のユビキチン化レベルもまた標準的なアッセイを用いて測定することができる。いくつかの実施形態において、サイクリンＦのレベル又は活性を増強する薬剤は、サイクリンＦの活性を少なくとも２０、４０、６０、８０、又は９０％増加させる。いくつかの実施形態において、サイクリンＦのレベルは、サイクリンＦ増強剤の存在下で少なくとも２、３、５、１０、２０、又は５０倍高い。
用語「シス作用エレメント」、「シス作用配列」又は「シス調節領域」は、本明細書では互換的に使用され、作動可能に連結されたプロモーターの転写活性、及び／又は作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現を調節する任意のヌクレオチド配列を意味する。当業者は、シス配列が、コード配列及び非コード配列を含む任意のヌクレオチド配列の活性化、サイレンシング、増強、抑制又は他の方法でその配列の発現レベル及び／又は細胞型特異性及び／又は発生特異性を変化させることができることを気づく。
「コード配列」とは、遺伝子のポリペプチド産物又は遺伝子の最終ｍＲＮＡ産物（例えば、スプライシング後の遺伝子のｍＲＮＡ産物）のコードに寄与する任意の核酸配列を意味する。対照的に、「非コード配列」という用語は、遺伝子のポリペプチド産物又は遺伝子の最終ｍＲＮＡ産物のコードに寄与しない任意の核酸配列を指す。
本明細書中で使用される場合、「コンパニオン診断」とは、特定の治療による治療に感受性のある対象を同定するため、又は治療をモニターするため、及び／あるいは対象又は対象のサブグループもしくは他のグループに対して有効用量を同定するために使用される診断方法及び／又は試薬をいう。本明細書の目的のために、コンパニオン診断は、試料中の（例えば、本明細書に記載のような）サイクリンＦのレベル又は活性を決定するための試薬などの試薬を指す。コンパニオン診断は、試薬を指し、さらに試薬を用いて行われる試験を指す。
本明細書を通して、文脈上別段の要求がない限り、「含む」、「備える」、及び「含むこと」という用語は、記載されたステップもしくは要素又はステップもしくは要素のグループを含むことを意味するが、任意の他のステップもしくは要素又はステップもしくは要素のグループを排除しないことが理解される。したがって、用語「含むこと」などの使用は、列挙された要素が必要又は必須であることを示すが、他の要素は任意選択であり、存在してもよく、又は存在しなくてもよいことを意味する。「からなる」とは、「からなる」という語句の後に続くものすべてを含み、それに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であり、他の要素が存在しなくてもよいことを示す。「から本質的になる」とは、語句の後に列挙された任意の要素を含むことを意味し、列挙された要素についての開示において特定される活性又は作用を妨害又は寄与しない他の要素に限定される。したがって、「から本質的になる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であるが、他の要素は任意選択であり、列挙された要素の活性又は作用に影響を及ぼすかどうかによって存在してもしなくてもよいことを示す。
本明細書で使用される場合、「状態」という用語は、生きている動物又はその一部の正常状態の障害を構成する、身体機能の遂行を妨害又は修正する、正常からの解剖学的及び生理学的逸脱を含む。
用語「条件付き発現」、「条件付きで発現する」、「条件付きで発現すること」などは、刺激又は他のシグナル（例えば、化学物質、光、ホルモン、ストレス、又は病原体）の存在又は非存在によって目的の遺伝子の発現を活性化又は抑制する能力を指す。特定の実施形態において、目的の核酸配列の条件付き発現は、インデューサーの存在又はインヒビターの非存在に依存する。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において定義されており、それらは一般に以下のように細分類することができる。
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保存的アミノ酸置換はまた、側鎖に基づく分類を含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンである；脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンである；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンである；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンである；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンである；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。例えば、ロイシンのイソロイシン又はバリンへの置換、アスパラギン酸のグルタミン酸への置換、スレオニンのセリンへの置換、又はアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸への類似の置換は、得られた変異体ポリペプチドの性質に対する主な効果ではないと予想するのが合理的である。アミノ酸変化が機能的ポリペプチドをもたらすかどうかは、その活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。保存的置換は、例示的な置換及び好ましい置換の見出しの下に表２に示される。本発明の範囲内に含まれるアミノ酸置換は、一般に、（ａ）置換の領域におけるペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖のバルクを維持することに対するそれらの効果において有意に異ならない置換を選択することによって達成される。置換が導入された後、変異体は生物学的活性についてスクリーニングされる。
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運動ニューロン又は運動ニューロン代用細胞を接触させることに関連して本明細書で使用される「接触する」又は「接触する」という用語は、運動ニューロン又は代用細胞を指示化合物及び／又は薬剤を含む適切な培地に供することを含む。運動ニューロン又は代用細胞がインビボである場合、「接触すること」又は「接触」は、化合物及び／又は薬剤が、インビボで運動ニューロン又は代用細胞に接触するように、適切な投与経路を介して医薬組成物中の化合物及び／又は薬剤を対象に投与することを含む。特定の実施形態において、接触した運動ニューロン又は代用細胞は、細胞生存についてアッセイされる。細胞生存の測定は、細胞を化合物又は薬剤と接触させてから一定期間経過した後の生存細胞数に基づくことができる。例えば、生細胞数は、少なくとも約５分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間後、２日、３日又はそれ以上の後に計数することができ、未処理対照における生存細胞数と比較することができる。
「構築物」という用語は、異なる供給源由来の１つ又は複数の単離された核酸配列を含む組換え遺伝分子を指す。したがって、構築物は、異なる起源の２つ以上の核酸配列が単一の核酸分子に組み立てられたキメラ分子であり、（１）天然にはともに見出されない調節配列及びコード配列を含む核酸配列（すなわち、少なくとも１つのヌクレオチド配列は、その他のヌクレオチド配列の少なくとも１つに関して異種である）、又は（２）機能的ＲＮＡ分子又は天然に隣接していないタンパク質の一部をコードする配列、又は（３）天然に隣接しないプロモーターの部分を含有する任意の構築物を含む。代表的な構築物には、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製ポリヌクレオチド分子、ファージ、又は線状もしくは環状の一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ核酸分子などの任意の組換え核酸分子が含まれ、これらは、任意の供給源由来であり、ゲノム組み込み又は自律複製が可能であり、１つ以上の核酸分子が作動可能に連結されている核酸分子を含む。本発明の構築物は、一般に、例えば、標的核酸配列又はモジュレーター核酸配列などの、構築物にも含まれる目的の核酸配列の発現を指示するのに必要な要素を含む。そのような要素は、関心の核酸配列に（直接転写するように）作動可能に連結されているプロモーターなどの調節要素を含むことができ、しばしばポリアデニル化配列も含む。本発明の特定の実施形態において、構築物はベクター内に含まれていてもよい。構築物の構成要素に加えて、ベクターは、例えば、１つ以上の選択可能なマーカー、原核生物及び真核生物の起源などの１つ以上の複製起点、少なくとも１つのマルチクローニングサイト、及び／又は構築物の宿主細胞のゲノムへの安定した組込み促進する要素を含み得る。２つ以上の構築物は、単一のベクターなどの単一の核酸分子内に含まれ得るか、又は２つ以上の別々のベクターなどの２つ以上の別々の核酸分子内に含まれ得る。「発現構築物」は、一般に、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも調節配列を含む。このようにして、例えば、発現されるべきヌクレオチド配列と作動可能に連結したプロモーターが、宿主細胞を含む生物又はその一部における発現のための発現構築物において提供される。本発明の実施のために、構築物及び宿主細胞を調製及び使用するための従来の組成物及び方法は当業者に周知であり、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition Volumes 1, 2, and 3. J. F. Sambrook, D. W. Russell, and N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000を参照されたい。
本明細書で使用される「対照運動ニューロン」という用語は、神経変性状態を有さない１つ又は複数の対象（例えば、対照対象）由来の運動ニューロンを意味する。
「に対応する」又は「に対応すること」とは、参照アミノ酸配列に対して実質的な配列類似性又は同一性を示すアミノ酸配列を意味する。一般に、アミノ酸配列は、参照アミノ酸配列の少なくとも一部に対して、少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、９７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、さらには１００％までの配列類似性又は同一性を示す。
用語「減少する」、「低下する」又は「阻害する」及びそれらの文法上の等価物はすべて、本明細書では一般に、統計的に有意な量だけ減少することを意味するために使用される。しかしながら、誤解を避けるために、用語「減少する」、「低下する」又は「阻害する」及びそれらの文法上の等価物は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％の減少を意味し、減少は１００％未満である。一実施形態において、減少は、１００％の減少（例えば、参照試料と比較して存在しないレベル）、又は参照レベルと比較して１０～１００％の間の任意の減少を含む。
本明細書で使用されるとき、用語「検出可能な標識」は、分子の存在の検出、画像化、及び／又はモニタリングを可能にする分子又は分子中の要素又は官能基を指す。限定されないが、検出可能な標識は、エコー源性物質（液体又は気体のいずれか）、非金属同位体、光学レポーター、ホウ素中性子吸収剤、常磁性金属イオン、強磁性金属、γ線放射性同位体、陽電子放射性同位体、又はＸ線吸収剤であり得る。
「検出可能な応答」とは、一般に、観察によって又は機器によって検出可能であるシグナルの変化又は発生を指す。特定の例において、検出可能な応答は、蛍光又は蛍光の変化、例えば、蛍光強度の変化、蛍光励起又は発光波長分布、蛍光寿命、及び／又は蛍光偏光である。
本明細書で使用されるとき、用語「診断」、「診断すること」などは、対象が状態を発症する尤度、又は対象における状態の存在もしくは性質を決定することを包含するように本明細書で互換的に使用される。これらの用語はまた、疾患の重症度又は疾患のエピソードを決定すること、ならびに診断が治療の最初の選択、治療の変更（例えば、用量又は投薬計画の調整）などを含む治療を導く合理的治療の文脈においても包含する。「尤度」とは、特定の測定された又は誘導されたバイオマーカー値を有する対象が実際に所与の数学的モデルに基づく状態を有するか否かの尺度を意味する。例えば、増加した尤度は相対的又は絶対的であり得、そして定性的に又は定量的に表され得る。例えば、以前の集団研究に基づいて、対象の測定されたサイクリンＦレベル又は活性を決定し、対象を「増加された尤度」カテゴリに入れることによって、可能性の増加を単純に判定することができる。「尤度」という用語はまた、本明細書において「確率」という用語と互換的に使用される。「リスク」という用語は、将来のある時点で特定のイベントが発生する可能性又は可能性に関連する。「リスク層別化」とは、医師が患者を特定の疾患を発症する危険性が低い、中程度、高い、又は最も高いと分類できるようにするための既知の臨床的危険因子の配列を指す。
本明細書中で使用される場合、「投与量単位」とは、治療されるべき対象のための単位投与量として適した物理的に別々の単位をいう。各単位は、必要な薬学的担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された所定量の薬剤を含む。
本明細書中で使用される場合、用語「有効量」とは、運動ニューロン細胞の生存を促進するため、又はそのような細胞の死を予防又は遅らせるために有効である化合物及び／又は薬剤の量を意味する。治療上有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。一般に、治療有効量は、対象の病歴、年齢、状態、性別、ならびに対象における病状の重症度及び種類、ならびに神経変性状態における病理学的過程を阻害する他の薬剤の投与によって変わり得る。
本明細書中で使用される場合、用語「コードする」、「コードすること」などは、別の核酸又はポリペプチドを提供するための核酸の能力をいう。例えば、核酸配列は、ポリペプチドを産生するために転写及び／又は翻訳することができる場合、又はポリペプチドを産生するために転写及び／又は翻訳することができる形態に処理することができる場合、ポリペプチドを「コードする」と言われる。そのような核酸配列は、コード配列、又はコード配列と非コード配列の両方を含み得る。したがって、用語「コードする」、「コードすること」などは、ＤＮＡ分子の転写から生じるＲＮＡ産物、ＲＮＡ分子の翻訳から生じるタンパク質、ＲＮＡ産物及びＲＮＡ産物のその後の転写を形成するためのＤＮＡ分子の転写から生じるタンパク質、又はＲＮＡ産物を提供するためのＤＮＡ分子の転写から生じるタンパク質、プロセシングされたＲＮＡ産物（例えばｍＲＮＡ）を提供するためのＲＮＡ産物のプロセシング、及びプロセシングされたＲＮＡ産物のその後の翻訳が含まれる。
遺伝子配列に関する用語「発現」は、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）を産生するための遺伝子の転写、及び適切な場合には、その翻訳を指す。得られたｍＲＮＡ転写物のはタンパク質への翻訳を指す。したがって、文脈から明らかになるように、コード配列の発現はコード配列の転写及び翻訳から生じる。逆に、非コード配列の発現は、非コード配列の転写から生じる。
本明細書で使用されるとき、用語「遺伝子」は、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど、及びいくつかの実施形態において、ポリペプチドを産生するために使用され得る核酸分子を指す。遺伝子は機能的タンパク質を産生するために使用されてもされなくてもよい。遺伝子は、コード領域及び非コード領域（例えば、イントロン、プロモーター、エンハンサー、終結配列及び５’及び３’非翻訳領域を含む調節要素）の両方を含み得る。特定の実施形態において、「遺伝子」という用語は、その範囲内に、特定のポリペプチド、イントロン、ならびに発現調節に関与する隣接５’及び３’非コードヌクレオチド配列をコードするオープンリーディングフレームを含む。これに関して、遺伝子は、プロモーター、エンハンサー、所定の遺伝子と天然に関連している終結及び／もしくはポリアデニル化シグナル、又は異種制御配列などの制御配列をさらに含み得る。遺伝子配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ又はそれらの断片であり得る。この遺伝子は、染色体外維持のために又は宿主への導入のために適切なベクターに導入され得る。
用語「増加する」、「増強する」、又は「活性化する」及びそれらの文法上の等価物はすべて、本明細書では静的に有意な量の増加を一般的に意味するために使用される。誤解を避けるために、用語「増加する」、「増強する」、又は「活性化する」及びそれらの文法上の等価物は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約２０％の、少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は１００％までの増加、又は１０～１００％の任意の増加を意味し、又は参照レベルと比較して少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍の増加、又は２倍から１０倍又はそれ以上の間の任意の増加を意味する。
本明細書中で使用される場合、語句「運動ニューロン変性の阻害」は、運動ニューロン生存能力の喪失の減少、運動ニューロン機能の喪失の減少、及び／又は運動ニューロンの数の減少を指す。いくつかの実施形態において、運動ニューロンと本明細書に記載の薬剤との接触は、無処置の対照と比較して、運動ニューロンの変性において、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍又はそれ以上の減少をもたらす。運動ニューロンの変性は、例えば、一般的に、酸化ストレス又は小胞体ストレス又はアポトーシス又はニューロン死をアッセイすることによって評価することができる。
本明細書で使用される「レベル」という用語は、サイクリンＦの絶対量、サイクリンＦの相対量又は濃度、ならびにそれに相関する、又はそれから導き出すことができる任意の値又はパラメータを包含する。例えば、レベルは、重量、モル、存在量、μｇ／Ｌなどの濃度、又は相対量であり得、例えば、参照又は対照レベルの９／１０、４／５、７／１０、３／５、１／２、２／５、３／１０、１／５、１／１０、１／２０、１／５０、１０-1、１０-2、１０-3、１０-4、１０-5、１０-6、１０-7、１０-8、１０-9、１０-10、１０-11、１０-12、１０-13、１０-14又は約１０-15であり得る。任意選択的に、レベルという用語は、ハウスキーピング遺伝子の発現などの内部標準化対照に対して標準化されたサイクリンＦのレベルを含む。サイクリンＦのレベルに適用される「レベル」という用語は、その範囲内に、ＣＣＮＦ転写産物（例えば、ＣＣＮＦｍＲＮＡ）及び／又はＣＣＮＦ翻訳産物（例えば、サイクリンＦ）のレベルを含む。
本明細書で使用される「レベル」及び／又は「活性」という用語はさらに、遺伝子発現レベル又は遺伝子活性を指す。遺伝子発現は、遺伝子産物の産生をもたらす転写及び翻訳による遺伝子に含まれる情報の利用として定義することができる。測定された「発現レベル」は、産生された転写又は翻訳産物の量についての指標である。
本明細書で使用されるとき、用語「調節する」とは、目的とする分子、プロセス、経路、又は減少における定性的又は定量的な変化、変更、又は修飾を引き起こす又は促進することを意味する。限定ではないが、そのような変化は、結合特性の増加、減少、変化、又はプロセス、経路、もしくは現象の異なる成分もしくは分岐の相対強度もしくは活性の変化であり得る。
用語「調節因子」は、目的とするプロセス、経路、又は現象における定性的又は定量的な変化、変更、又は修飾を引き起こす又は促進する任意の分子又は化合物を指す。本明細書で使用されるとき、用語「調節因子」は、生物学的経路又は標的の阻害剤及び活性化剤の両方を含む。
本明細書中で使用される場合、語句「運動ニューロン変性」又は「運動ニューロンの変性」は、運動ニューロンの劣化の状態を意味し、ニューロンは、死滅するか又はより低いもしくはより機能的に活性の低い形態に変化する。
用語「神経変性状態」は、中枢又は末梢神経系の急性及び慢性の状態、障害又は疾患を包含する包括的な用語であり、一般に神経系の細胞又は組織の悪化によって引き起こされるか又はそれと関連している。神経変性状態は加齢に関連しているか、又は傷害もしくは外傷に起因するか、又は特定の疾患もしくは障害に関連している可能性がある。急性神経変性状態には、限定されないが、神経細胞死又は傷害に関連する症状が含まれ、脳血管の機能不全、限局性又はびまん性脳外傷、びまん性脳損傷、脊髄損傷又は末梢神経外傷が含まれ、物理的もしくは化学的な火傷、深い切り傷又は四肢の切断をもたらす。急性神経変性障害の例は、脳虚血又は塞栓性閉塞及び血栓性閉塞を含む梗塞、急性虚血後の再灌流、周産期低酸素性虚血性傷害、心停止、ならびにあらゆるタイプの頭蓋内出血（硬膜外、硬膜下、くも膜下及び脳内など）、頭蓋内及び椎骨内病変（挫傷、穿通、せん断、圧迫及び裂傷など）、ならびにむち打ち症候群及び振とう乳児症候群である。慢性試料神経変性状態には、限定されないが、アルツハイマー病、びまん性レビー小体病、進行性核上性麻痺（スチール－リチャードソン症候群）、多系統変性症（シャイドラガー症候群）、神経変性に関連する慢性てんかん症状、筋萎縮性を含む運動ニューロン疾患、側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、変性性運動失調症、皮質基底核変性、グアムのＡＬＳ－パーキンソン病ー認知症合併症、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、パーキンソン病、シヌクレイノパチー（多系統萎縮症など）、原発性進行性失語症、線条体黒質変性症、マカドージョセフ病／脊髄小脳変性症３型及びオリーブ橋小脳変性症、ギルズ・デ・ラ・トゥレット病、球麻痺及び偽球麻痺、脊髄性及び脊髄球性筋萎縮症（ケネディ病）、原発性側索硬化症、家族性痙性対麻痺、ヴェルドニク－ホフマン病、クーゲルベルク－ウェランダー病、テイ－サックス病、サンドホフ病、家族性痙攣病、Wohlfart-Kugelberg-Welander病、痙性対麻痺、進行性多巣性白質脳症、家族性自律神経失調症（Ｒｉｌｅｙ－Ｄａｙ症候群）、及び及びプリオン病（ただし、限定されないが、クロイツフェルト・ヤコブ、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ－Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ病、Ｋｕｒｕ及び致命的家族性不眠症）、脱髄疾患及び多発性硬化症を含む障害及び白質ジストロフィーなどの遺伝性疾患が含まれる。特定の実施形態において、神経変性状態は、ＡＬＳ及びＦＴＤから選択される。
「神経向性ウイルスベクター」という用語は、運動ニューロンを含む神経細胞に選択的に感染するウイルスベクターを指す。
「得られた」とは、所有することを意味する。そのようにして得られた試料は、例えば、特定の供給源から単離又は誘導された核酸抽出物又はポリペプチド抽出物を含む。例えば、抽出物は、対象の体液又は組織から直接単離されてもよい。
本明細書で使用される「作動可能に接続された」又は「作動可能に連結された」という用語は、そのように記載された成分がそれらの意図する様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。例えば、目的のヌクレオチド配列（例えば、コード配列及び／又は非コード配列）に「作動可能に連結された」調節配列（例えば、プロモーター）は、調節配列と適合する条件下で、その配列の発現を可能にするために、目的とするヌクレオチド配列に対する調節配列の配置及び／又は配向を指す。調節配列は、それらがその発現を指示するように機能する限り、目的のヌクレオチド配列と連続している必要はない。従って、例えば、介在する非コード配列（例えば、未翻訳の、しかし転写された配列）がプロモーターとコード配列との間に存在し得、そしてプロモーター配列はなおコード配列に「機能的に連結している」と考えられ得る。
用語「過剰発現する」、「過剰発現」、又は「過剰発現した」は、互換的に、正常細胞（例えば、正常な運動ニューロン）と比較して検出可能に高いレベルで転写又は翻訳される遺伝子（例えば、ＴＤＰ－４３遺伝子）を指す。したがって、過剰発現は、タンパク質及びＲＮＡの過剰発現（転写の増加、転写後プロセシング、翻訳、翻訳後プロセシング、安定性の変化、及びタンパク質分解の変化による）、ならびにタンパク質トラフィックパターンの変化による局所的過剰発現（核局在化の増加）、及び例えば基質の酵素加水分解の増加におけるような機能活性の増強を指す。過剰発現はまた、正常細胞又は比較細胞（例えば、正常運動ニューロン）と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上であり得る。
本明細書において互換的に用いられる「患者」、「対象」、「宿主」又は「個体」という用語は、治療又は予防が望まれる任意の対象、具体的には脊椎動物の対象、さらにより具体的には哺乳動物の対象を指す。本発明の範囲内にある適切な脊椎動物としては、限定されないが、脊椎動物亜門の任意のメンバーが含まれ、例えば、霊長類（例えば、ヒト、サル及び類人猿、ならびにマカカ属（例えば、マカカ・ファシキュラリス（Macaca fascicularis）及び／又はアカゲザル（アカゲザル（Macaca mulatta））などのカニクイザル）などのサル種を含む）及びヒヒ（チャクマヒヒ（Papio ursinus））、ならびにマーモセット（マーモセット（Callithrix）属の種）、リスザル（リスザル（Saimiri）属の種）及びタマリン（タマリン（Saguinus）属の種）、ならびに類人猿の種、例えば、チンパンジー（チンパンジー（Pan troglodytes））、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット）、ウサギ目（例えば、ウサギ、野ウサギ）、ウシ（bovine）（例えば、ウシ（cattle））、ヒツジ（ovine）（例えば、ヒツジ（sheep））、ヤギ（caprine）（例えば、ヤギ（sheep））、ブタ（procine）（例えば、ブタ（pig））、ウマ（equine）（例えば、ウマ（horse））、イヌ（canine）（例えば、イヌ（dog））、ネコ（feline）（例えば、ネコ（cat））、鳥類（avian）（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、コンパニオンバード（companion bird）、例えば、カナリア、セキセイインコなど）、海洋哺乳動物（例えば、イルカ、クジラ）、爬虫類（ヘビ、カエル、トカゲなど）、魚が挙げられる。好ましい対象は、サイクリンＦのレベル又は活性を増大させること、及び／又は神経変性状態を治療することを必要とするヒトである。しかしながら、前述の用語は症状が存在することを意味しないことが理解される。
本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に釣り合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題もしくは合併症を伴わないで、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適している化合物、薬剤、材料、組成物、及び／又は剤形を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「医薬として許容される担体」は、医薬として許容される材料、組成物又はビヒクルを意味し、例えば、液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウム若しくは亜鉛、又はステアリン酸）、又は溶媒封入材料が挙げられ、これらは、主題の薬剤を１つの臓器又は体の一部から別の臓器又は生体の一部に運搬又は輸送することに関与する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者に有害ではないという意味で「許容され」なければならない。
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書ではヌクレオシドのポリマーを示すために「核酸」と互換的に使用される。典型的には、本発明のポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって結合された、ＤＮＡ又はＲＮＡ中に天然に見出されるヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）から構成される。しかしながら、この用語は、天然に存在する核酸に見出されるかどうかにかかわらず、化学的又は生物学的に修飾された塩基、修飾された骨格などを含むヌクレオシド又はヌクレオシド類似体を含む分子を包含し、そのような分子はある種の用途には好ましい場合がある。本出願がポリヌクレオチドに言及する場合、ＤＮＡ、ＲＮＡの両方、それぞれの場合に一本鎖及び二本鎖の形態の両方（及び各一本鎖分子の相補体）が提供されることが理解される。本明細書で使用される「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド材料自体及び／又は特定の核酸を生化学的に特徴付ける配列情報（例えば、塩基の略語として使用される一連の文字）を指すことができる。本明細書に提示されるポリヌクレオチド配列は、他に示されない限り、５’から３’方向に提示される。
本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーを指す。用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は本明細書では互換的に使用される。ペプチドは、比較的短いポリペプチドであり、典型的には長さが約２～６０アミノ酸の間である。本明細書中で使用されるポリペプチドは、典型的には、タンパク質中に最も一般的に見いだされる２０個のＬ－アミノ酸などのアミノ酸を含有する。しかしながら、当該技術分野において公知の他のアミノ酸及び／又はアミノ酸類似体を使用することができる。ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸は、例えば、炭水化物基、リン酸基、脂肪酸基、結合のためのリンカー、官能化などのような化学的実体の付加によって改変され得る。それと共有結合的又は非共有結合的に結合した非ポリペプチド部分を有するポリペプチドは、依然として「ポリペプチド」と見なされる。例示的な修飾としては、グリコシル化及びパルミトイル化が挙げられる。ポリペプチドは、天然の供給源から精製され、組換えＤＮＡ技術を用いて製造され、従来の固相ペプチド合成などの化学的手段により合成することができる。本明細書で用いられる用語「ポリペプチド配列」又は「アミノ酸配列」は、ポリペプチド材料自体を指すことができ、及び／又はポリペプチドを生化学的に特徴付ける配列情報（例えば、アミノ酸名の省略形として使用される一連の文字又は３文字のコード）を指すことができる。本明細書に提示されるポリペプチド配列は、他に示されない限り、Ｎ末端からＣ末端方向に提示される。
「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼ及び適切な転写に必要な他の因子に対する認識を提供することによって転写可能な配列の発現を制御する、通常、転写可能な配列の上流（５’）のヌクレオチド配列を指す。「プロモーター」は、ＴＡＴＡボックス、及び転写開始部位を特定するのに役立つ他の配列からなる短い核酸配列である最小プロモーターであり、それに制御要素（例えば、シス作用要素）が発現の制御のために付加される。「プロモーター」はまた、最小のプロモーターと、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御することができる制御要素（例えば、シス作用要素）とを含むヌクレオチド配列を指す。この種のプロモーター配列は近位及びより遠位の上流要素からなり、後者の要素はしばしばエンハンサーと呼ばれる。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができる核酸配列であり、プロモーターの生来の要素又はプロモーターのレベル又は組織特異性を増強するために挿入された異種要素であり得る。それは両方の方向（通常又は反転）で操作することができ、プロモーターから上流又は下流のいずれかに動かされた場合でも機能することができる。エンハンサー及び他の上流プロモーター要素の両方が、それらの効果を媒介する配列特異的核酸結合タンパク質に結合する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、又は天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、あるいは合成核酸セグメントから構成されてもよい。プロモーターはまた、生理学的条件又は発生条件に応答して転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合に関与する核酸配列を含み得る。不活性であるか、又は上流活性化の非存在下でプロモーター活性を大幅に低下させるプロモーター要素、特にＴＡＴＡ要素は、「最小又はコアプロモーター」と呼ばれる。適切な転写因子の存在下では、最小プロモーターは、転写を可能にするように機能する。したがって、「最小又はコアプロモーター」は、転写開始に必要なすべての基本要素、例えばＴＡＴＡボックス及び／又は開始剤のみからなる。
本明細書で使用されるとき、語句「運動ニューロンの生存を促進する」は、対照と比較して運動ニューロン細胞の生存の増加を指す。いくつかの実施形態において、運動ニューロンと本明細書に記載の薬剤との接触は、無処置対照と比較して、運動ニューロンの生存において少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍又はそれ以上の増加をもたらす。運動ニューロンの生存は、例えば、以下によって評価することができる：（ｉ）培養中の運動ニューロンの生存期間の延長；（ｉｉ）培養中又はインビボでのニューロン関連分子、例えばコリンアセチルトランスフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ及びサイクリンＦの産生の増加；（ｉｉｉ）培養中又はインビボでのＴＤＰ－４３を含むタンパク質の異常蓄積の減少；又は（ｉｖ）インビボでの運動ニューロン機能障害の症状の減少。そのような効果は、当該技術分野において公知の任意の方法によって測定することができる。非限定的な一例では、運動ニューロンの生存の増加は、Ａｒａｋａｗａら（1990, J. Neurosci. 10:3507-3515）によって記載された方法によって測定することができる；ニューロン関連分子の産生増加は、測定される分子に応じて、バイオアッセイ、酵素アッセイ、抗体結合、ノーザンブロットアッセイなどによって測定することができる；タンパク質の異常蓄積の減少は、例えば、Ｓｈｅｎら（2011, Cell Biochem Biophys 60:173-185）によって記載されているように、アグレソーム及び封入体中の凝集タンパク質の検出を介してアッセイされ得て、運動ニューロン機能障害は運動ニューロン障害の身体的徴候を評価することによって測定することができる。一実施形態において、運動ニューロン生存の増加は、サイクリンＦレベルの増加を測定することによって評価することができる。細胞生存はまた、生存色素の類似体であるフルオレセインジアセテートであるカルセインＡＭの取り込みによっても測定することができる。カルセインは生存細胞によって取り込まれ、生存細胞の無傷の膜によって保持されている蛍光塩に細胞内で切断される。生存可能なニューロンの顕微鏡によるカウントは、蛍光生存率アッセイで得られた相対蛍光値と直接相関する。したがって、この方法は、所与の培養物の全細胞集団における細胞生存の信頼性のある定量的測定を提供する（Bozyczko-Coyne et al., J. Neur. Meth. 50:205-216, 1993）。細胞の生存を評価する他の方法は、米国特許第５，９７２，６３９号；第６，０７７，６８４号及び第６，４１７，１６０号に記載されている。これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。インビボ運動ニューロンの生存は、対象における運動ニューロン、神経運動又は神経筋機能の増加によって評価することができる。非限定的な一例では、対象における運動ニューロンの生存は、対象における運動ニューロンの機能不全又は死亡に関連する状態の逆転、軽減、改善、抑制、進行の減速又は停止、重症度又は重症度によって評価することができる。例えば、ＡＬＳ又はＦＴＤが挙げられる。
用語「制御されたプロモーター」は、構成的にではなく、時間的及び／又は空間的に調節された様式で遺伝子発現を指向するプロモーターをいい、織特異的プロモーター及び誘導性プロモーターの両方を含む。それは天然及び合成配列ならびに合成及び天然配列の組み合わせであり得る配列を含む。異なるプロモーターは、異なる組織又は細胞型において、あるいは異なる発達段階において、又は異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得る。宿主細胞に有用な様々な種類の新しいプロモーターが絶えず発見されている。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全には規定されていないため、異なる長さの核酸断片は同一のプロモーター活性を有し得る。例示的な制御プロモーターとしては、限定されないが、セーフナー誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導システムに由来するプロモーター、サリチル酸誘導性システムに由来するプロモーター、アルコール誘導性システムに由来するプロモーター、グルココルチコイド誘導性システムに由来するプロモーター、病原体誘導性システムに由来するプロモーター、炭水化物誘導性システムに由来するプロモーター、ホルモン誘導性システムに由来するプロモーター、抗生物質誘導性システムに由来するプロモーター、金属誘導性システムに由来するプロモーター、熱ショック誘導性システムに由来するプロモーター、及びエクジソーム誘導性システムに由来するプロモーターが挙げられる。
「制御配列」、「制御要素」などは、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内部又は下流（３’非コーディング配列）に位置するヌクレオチド配列を意味し、それらは、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、又は関連するコード配列の翻訳に直接的又は間接的に影響を及ぼす。制御要素には、エンハンサー、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、Ｒｅｐ認識要素、遺伝子間領域及びポリアデニル化シグナル配列が含まれる。それらは、天然及び合成の配列、ならびに合成及び天然の配列の組み合わせであり得る配列を含む。
本明細書で使用される「組換えポリヌクレオチド」という用語は、核酸の操作によってインビトロで自然には通常見られない形態に形成されるポリヌクレオチドを指す。例えば、組換えポリヌクレオチドは発現ベクターの形態であり得る。一般に、そのような発現ベクターは、ヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写及び翻訳調節核酸を含む。
「組換えポリペプチド」とは、組換え技術を使用して、すなわち組換えポリヌクレオチドの発現を介して作製されたポリペプチドを意味する。
運動ニューロン中のサイクリンＦのレベルに関して本明細書で使用される「減少したレベル」という用語は、神経変性状態を有さない健康な対象の年齢が一致したランダムな集団（例えば、年齢が一致する、１０、２０、３０、４０、５０、１００、又は５００人の健康な対象のランダムな集団）の中央値を下回るサイクリンＦの任意のレベルを指す。特定の実施形態において、減少したレベルのサイクリンＦは、以下のうちの一方又は両方に関連するサイクリンＦレベルに対応する：（１）細胞区画（例えば、細胞質及び／又は核）へのＴＤＰ－４３の異常局在；（２）異常なＴＤＰ－４３構造（例えば、ＴＤＰ－４３を含む凝集体又は包含物）の形成。特定の実施形態において、運動ニューロンにおけるサイクリンＦの減少したレベル又は活性は、対照運動ニューロンにおけるサイクリンＦのレベル又は活性の約９／１０、４／５、７／１０、３／５、１／２、２／５、３／１０、１／５、１／１０、１／２０、１／５０、１０-1、１０-2、１０-3、１０-4、１０-5、１０-6、１０-7、１０-8、１０-9、１０-10、１０-11、１０-12、１０-13、１０-14又は約１０-15未満である。
本明細書中で使用される場合、「ＲＮＡ干渉分子」とは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的遺伝子又はゲノム配列の発現を妨害又は阻害する化合物をいう。そのようなＲＮＡ干渉剤としては、限定されないが、標的遺伝子又はゲノム配列に相同なＲＮＡ分子を含む核酸分子、又はその断片、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン又は低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的遺伝子の発現を妨害又は阻害する小分子が挙げられる。
本明細書で使用される「試料」という用語は、対象から抽出、未処理、処理、希釈又は濃縮することができるあらゆる生物学的標本を含む。試料は、限定されないが、体液、例えば、全血、血清、赤血球、白血球、血漿、唾液、尿、便（すなわち、糞便）、涙、汗、皮脂、乳頭吸引液、乳管洗浄液、腫瘍滲出液、滑液、腹水（ascitic fluid）、腹水（peritoneal fluid）、羊水、脳脊髄液、リンパ液、細針吸引液、羊水、その他の体液、細胞溶解物、細胞分泌物、炎症液、精液及び膣分泌物が挙げられる。試料は、組織試料及び生検材料、組織ホモジネートなどを含み得る。特定の実施形態において、試料は組織を含み、このタイプの代表的な例では、試料は切除、生検、又はコア針生検からのものである。さらに、細針吸引試料を使用することができる。試料は、パラフィン包埋組織及び凍結組織を含み得る。特定の実施形態において、試料は運動ニューロンを含む神経組織を含む。他の実施形態において、試料は、運動ニューロンの代わりとなる細胞を含み、その非限定的な例には、例えばＹａｎｇら（2015, Neurotox Res 28:138-146）によって開示される線維芽細胞、及び、例えば、www.sciencedaily.com/releases/2014/ 04/ 140408121918.htmに開示される血液細胞が含まれる。用語「試料」はまた、未処理の試料又は前処理された（又は前処理された）試料を含む。いくつかの実施形態において、試料は未処理の生物学的試料である。試料は、対象から細胞の試料を採取することによって得ることができるが、以前に単離された細胞（例えば、以前の時点で単離され、同じ又は別の人によって単離された）を用いることによっても達成できる。
本明細書中で使用される場合、用語「配列同一性」とは、比較ウィンドウにわたって、ヌクレオチドごと又はアミノ酸ごとに配列が同一である程度をいう。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較すること、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）又は同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ及びＭｅｔ）が両方の配列に存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を算出すること、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわちウィンドウサイズ）で除すること、及び結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを算出することによって計算される。本発明は、完全長のサイクリンＦポリペプチド、ならびにそれらの生物学的に活性な断片の本発明の方法及びシステムにおける使用を企図する。典型的には、全長のサイクリンＦポリペプチドの生物学的に活性な断片は、相互作用、例えば分子内又は分子間相互作用に関与し得る。
「類似性」とは、同一であるか、又は上記の表１及び２に定義されているような保存的置換を構成するアミノ酸のパーセンテージ数を指す。類似性は、ＧＡＰなどの配列比較プログラムを用いて決定することができる（Deveraux et al. 1984, Nucleic Acids Research 12: 387-395）。このようにして、本明細書に引用されたものと類似又は実質的に異なる長さの配列は、アライメントへのギャップの挿入によって比較され得、そのようなギャップは、例えばＧＡＰにより使用される比較アルゴリズムにより決定される。
２つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語は、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」及び「実質的な同一性」を含む。「参照配列」は、長さが、ヌクレオチド及びアミノ酸残基を含めて、少なくとも１２であるが、１５～１８個、しばしば少なくとも２５個のモノマー単位である。２つのポリヌクレオチドはそれぞれ、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、及び（２）２つのポリヌクレオチド間で異なる配列を含み得るため、２つの（又はそれを超える）ポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、「比較ウィンドウ」にわたって２つのポリヌクレオチドの配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定及び比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」とは、少なくとも６つの連続した位置、通常は約５０～約１００、より一般的には約１００～約１５０の概念的なセグメントを指し、その中の配列は、２つの配列が最適に整列された後に、同数の連続する位置と比較される。比較ウィンドウは、２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して約２０％以下の付加又は欠失（すなわちギャップ）を含み得る。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適整列は、コンピュータ化されたアルゴリズムの実装（GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA）によって、又は選択された様々な方法のいずれかによって生成された検査及び最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたって最も高い割合の相同性をもたらす）によって行われ得る。例えば、Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389に開示されているプログラムのＢＬＡＳＴファミリーによっても参照される。配列分析の詳細な考察は、Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15に見出すことができる。
本明細書で使用されるとき、用語「小分子」は、「天然産物様」である化合物を指すことができるが、用語「小分子」は「天然産物様」化合物に限定されない。むしろ、小分子は、典型的には、それがいくつかの炭素－炭素結合を含み、５０００ダルトン（５ｋＤａ）未満、好ましくは３ｋＤａ未満、さらにより好ましくは２ｋＤａ未満、そして最も好ましくは１ｋＤａ未満の分子量を有することを特徴とする。場合によっては、小分子は７００Ｄａ以下の分子量を有することが好ましい。
「統計的に有意な」又は「有意に」という用語は、統計学的有意性を指し、一般に、通常の、又はそれより低い、マーカーの濃度を下回る２標準偏差（２ＳＤ）を意味する。この用語は、違いがあるという統計的証拠を意味する。帰無仮説が実際に真である場合に、帰無仮説を棄却する決定を下す確率として定義される。多くの場合、決定はｐ値を使用して行われる。
本明細書で使用されるとき、用語「治療」、「治療すること」などは、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。その効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防することに関して予防的であり得、及び／又は状態の部分的又は完全な治癒及び／又はその状態に起因する有害作用に関して治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける状態の任意の治療を含み、（ａ）状態に罹りやすいが、まだそうであると診断されていない対象において状態が発生するのを予防する、（ｂ）状態を抑制すること、すなわちその発症を阻止すること、及び（ｃ）状態を緩和すること、すなわち、状態の後退を引き起こすことを含む。したがって、「神経変性状態の治療」は、その範囲内に、そのような状態（例えば、運動ニューロンの死）の開始を遅らせるか又は防止すること、そのような状態の進行又は重症度の悪化又は劣化を逆転、軽減、改善、抑制、減速又は停止させることを含む。一実施形態において、神経変性状態の症状は、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％軽減される。一実施形態において、神経変性状態の症状は５０％を超えて軽減される。一実施形態において、神経変性状態の症状は、８０％、９０％、又はそれ以上軽減される。治療には神経筋機能の改善も含まれる。いくつかの実施形態において、神経筋機能は少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上改善する。
本明細書で使用される「導入遺伝子」という用語は、植物、動物、又は他の生物の形質転換に使用される任意のヌクレオチド配列を指す。したがって、導入遺伝子は、コード配列、非コード配列、ｃＤＮＡ、遺伝子又はその断片もしくは部分、ゲノム配列、調節エレメントなどであり得る。トランスジェニック植物、トランスジェニック微生物、又はトランスジェニック動物などの「トランスジェニック」生物は、導入遺伝子が送達又は導入された生物であり、導入遺伝子をトランスジェニック生物中で発現させて産物を産生することができる。その存在は、生物に効果及び／又は表現型を付与することができる。
「ベクター」とは、ポリヌクレオチド分子、適切には、例えばプラスミド、バクテリオファージ、酵母又はウイルスに由来する、その中にポリヌクレオチドを挿入又はクローニングすることができるＤＮＡ分子を意味する。ベクターは、１つ以上のユニークな制限部位を含み得、標的細胞もしくは組織又は前駆細胞もしくはその組織を含む規定の宿主細胞において自律複製することができ、又はクローニングされた配列を再生できるように規定の宿主のゲノムと統合可能であり得る。したがって、ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在するベクターであり得て、その複製は、染色体複製とは無関係であり、例えば、線状又は閉環状プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、又は人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含み得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されるとゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体と一緒に複製されるものであり得る。ベクター系は、単一のベクターもしくはプラスミド、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを一緒に含む２つ以上のベクターもしくはプラスミド、又はトランスポゾンを含み得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に依存する。この場合、ベクターは、好ましくはウイルス又はウイルス由来のベクターであり、これは動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞において作動可能に機能的である。本発明の実施に有用である非限定的ウイルスベクターには、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルスベクター及びレンチウイルスベクターが含まれる。ベクターはまた、適切な形質転換体の選択のために使用され得る抗生物質耐性遺伝子のような選択マーカーを含み得る。そのような耐性遺伝子の例は当業者に知られており、そして抗生物質カナマイシン及びＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標））に対する耐性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子、及び抗生物質ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するｈｐｈ遺伝子を含む。
「野生型」、「天然の」及び「天然に存在する」という用語は、天然に存在する供給源から単離された場合にその遺伝子又は遺伝子産物の特徴を有する遺伝子又は遺伝子産物を指すために本明細書において互換的に用いられる。野生型、天然の又は天然に存在する遺伝子又は遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）は、集団において最も頻繁に観察され、したがって「正常」又は「野生型」形態の遺伝子又は遺伝子産物に任意に設計されているものである。
本明細書で使用されるとき、遺伝子の名前の下線又は斜体は、そのタンパク質産物とは対照的に、その遺伝子を示すものとし、それは、下線又は斜体がない場合には遺伝子の名前によって示される。例えば、「サイクリンＦ（イタリック体）」はサイクリンＦ遺伝子を意味し、一方「サイクリンＦ」はタンパク質産物又は転写及び翻訳から生成される産物、及び／又は「サイクリンＦ（イタリック体）」遺伝子の選択的スプライシングを示すものとする。
本明細書に記載の各実施形態は、特に明記しない限り、各実施形態すべてに必要な変更を加えて適用されるべきである。
２．省略
以下の省略は、本出願を通じて使用される。
ＭＮＤ＝運動ニューロン疾患
ＡＬＳ＝筋萎縮性側索硬化症
ＦＴＤ＝前頭側頭型認知症
ｈｒ＝時間
ｍｉｎ＝分
ｓ＝秒
３．運動ニューロンの生存促進又は変性抑制のための薬剤及び方法
本開示は、とりわけ、ＭＮＤ患者のサブセットが、サイクリンＦの異常に低いレベル又は活性，及び異常なタンパク質蓄積を有する運動ニューロンを有すること、及びサイクリンＦ補給が運動ニューロンにおける異常なタンパク質蓄積を抑制し、運動ニューロンの変性を抑制し、運動ニューロンの生存を促進し得ることを実証する。
これらの知見に基づいて、本発明は、運動ニューロンの生存を促進し、運動ニューロンの変性を阻害し、運動ニューロンにおける異常なタンパク質蓄積を阻害し、神経変性状態（例えば、ＡＬＳ又はＦＴＤ）を治療又は予防し、運動ニューロンの生存を促進し、運動ニューロンの変性を阻害し、及び／又は運動ニューロンにおける異常なタンパク質蓄積を阻害する薬剤を同定し、神経変性状態を治療し、試料神経変性状態を診断し、試料神経変性状態の進行を予測するのに有用な薬剤を同定し、及び神経変性状態の進行の減少において治療の有効性をモニタリングする方法を提供する。
したがって、本発明は、運動ニューロン、又は運動ニューロンを含む細胞の集団を、運動ニューロンにおけるサイクリンＦのレベル又は活性を増強させる薬剤と接触させることを含む、運動ニューロンの生存を促進し、運動ニューロンの変性を阻害し、及び／又は運動ニューロンにおける異常なタンパク質蓄積を阻害する方法を包含する。
３．１ サイクリンＦ増強剤
本発明は、運動ニューロンにおけるサイクリンＦのレベル又は活性を増強又は増加させ、それによって運動ニューロンの生存を促進し、運動ニューロンの変性を抑制し、運動ニューロンにおける異常なタンパク質蓄積を抑制する任意の薬剤を企図する。いくつかの実施形態において、サイクリンＦのレベル又は活性を増強する薬剤は、対照と比較して、サイクリンＦのレベル又は活性を少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％、又は少なくとも１、２、３、５、１０、２０、５０、又は１００倍増加させる。
特定の実施形態において、薬剤は、プロモーターに作動可能に連結されたサイクリンＦのコード配列を含む核酸構築物である。サイクリンＦについての任意のコード配列が使用され得、その例示的な例が配列番号１、２、４及び５に示される野生型ＣＣＮＦコード配列又はそれに対応する配列（例えば、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、２、４又は５に記載の配列のいずれか１つにハイブリダイズする配列）に適切に対応する。特定の実施形態において、コード配列は、配列番号３又は６に記載のアミノ酸配列、又はそれに対応する配列をコードする。
適切には、核酸構築物はベクターの形態であり、これはウイルスベクターであり得る。本発明の実施に適したウイルスベクターとしては、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルスベクター（米国特許第５，６７２，３４４号）及びレンチウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ウイルスベクターは神経向性ウイルスベクターである。
本発明の実施において、任意の血清型のＡＡＶが使用され得る。本発明の特定の実施形態において使用されるウイルスベクターの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、及びＡＡＶ８からなる群から選択される（例えば、Gao et al., 2002, PNAS 99:11854-11859; and Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003を参照されたい）。本明細書に列挙したもの以外の他の血清型を使用することができる。さらに、偽型ＡＡＶベクターもまた、本明細書に記載される方法において利用することができる。偽型ＡＡＶベクターは、第２のＡＡＶ血清型のキャプシド中に１つのＡＡＶ血清型のゲノムを含むものである。例えば、ＡＡＶ２キャプシド及びＡＡＶ１ゲノムを含むＡＡＶベクター、又はＡＡＶ５キャプシド及びＡＡＶ２ゲノムを含むＡＡＶベクター（Auricchio et al., 2001. Hum. Mol. Genet. 10(26):3075-81）が挙げられる。ＡＡＶベクターは、哺乳動物に対して非病原性である一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡパルボウイルスに由来する（Muzyscka, 1992. Curr. Top. Microb. Immunol. 158:97-129に概説されている。手短に言えば、組換えＡＡＶベースのベクターは、ウイルスゲノムの９６％を占めるｒｅｐ及びｃａｐウイルス遺伝子が除去され、ウイルスＤＮＡ複製、包装及び統合を開始するために使用される２つの隣接する１４５塩基対（ｂｐ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）を残す。ヘルパーウイルスの非存在下では、野生型ＡＡＶは、染色体１９ｑ１３．３で優先的な部位特異性でヒト宿主細胞ゲノムに組み込まれるか、又はエピソーム的に維持され得る。単一のＡＡＶ粒子は５ｋｂまでのｓｓＤＮＡを収容することができ、それ故、導入遺伝子及び調節エレメントのために約４．５ｋｂを残し、これは典型的には十分である。しかしながら、例えば、米国特許第５６，５４４，７８５号に記載されているようなトランススプライシングシステムは、この制限をほぼ倍増させる可能性がある。
例示的な実施形態において、ＡＡＶはＡＡＶ４である。多くの血清型のアデノ随伴ウイルス、特にＡＡＶ２は広く研究され、遺伝子治療ベクターとして特徴付けられている。別の例示的な実施形態において、ＡＡＶは、例えば、及びKlaw et al. (2013, Mol Ther Nucleic Acids. 2(7): e108)によって開示されているように、ＡＡＶ５である。当業者は、機能的ＡＡＶに基づく遺伝子治療ベクターの調製に精通している。ＡＡＶ産生、精製及びヒト対象への投与のための調製の様々な方法についての多数の参考文献が広範な刊行物に見出すことができる（例えば、Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003を参照されたい）。さらに、ＣＮＳの細胞を標的としたＡＡＶに基づく遺伝子治療は、米国特許第６，１８０，６１３号及び第６，５０３，８８８号を参照されたい。さらなる例示的なＡＡＶベクターは、ヒトタンパク質をコードする組換えＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８及びＡＡＶ２／９血清型ベクターである。具体的な実施形態において、ＡＡＶは、例えばＡｙｅｒｓら（2015, Mol Ther. 23(1): 53-62）に記載されるように、ｒＡＡＶ２／１、ｒＡＡＶ２／８及びＡＡＶ２／９から選択される神経向性ＡＡＶベクターである。
３．２ スクリーニングアッセイ
本発明はまた、適切なスクリーニングアッセイを用いて同定されるサイクリンＦ増強剤を企図する。同定された薬剤は、本明細書に記載されている特徴又は効果のいずれかを有することが提案されている。例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって同定された薬剤は、運動ニューロン生存の促進、運動ニューロン変性の阻害、運動ニューロンにおける異常タンパク質蓄積の阻害、及び／又は神経変性状態（例えばＡＬＳ又はＦＴＤ）の治療もしくは予防における使用に適切であり得る。例えば、運動ニューロンの生存を増加させ、運動ニューロンの変性を阻害し、又は運動ニューロンにおける異常なタンパク質蓄積を阻害するための候補薬剤は、運動ニューロン又は運動ニューロンの代用物である細胞（本明細書では「代用細胞」とも呼ばれる）に対する対象剤の効果を決定することによって同定できる。ここで、サイクリンＦのレベル又は活性が低下していて、及び／又は神経変性状態の発症に関連する別の遺伝子（例えば、ＴＤＰ－４３又は凝集を受けやすい別のタンパク質、例えば、ＳＯＤ１）は発現されるか又は過剰発現され、対象剤の存在下で対照と比較してより多くの運動ニューロン又は代用細胞は、対象剤が運動ニューロン生存を促進し、運動ニューロン変性を阻害し、運動ニューロンにおける異常タンパク質蓄積を阻害できることを示す。
したがって、特定の実施形態において、本発明のスクリーニングアッセイは、（ａ）細胞集団を試験薬剤と接触させること、ここで細胞はサイクリンＦのレベル又は活性の低下及び／又はタンパク質の異常なタンパク質蓄積を有する；（ｂ）対象の存在下で（ｉ）サイクリンＦのレベル又は活性及び／又は（ｉｉ）細胞内の異常なタンパク質蓄積を測定すること；及び（ｃ）治療のための候補薬を同定することを含む。ここで、対象物が、対象剤の存在下で、（ｉ）サイクリンＦのレベル又は活性を増加させるか、又は（ｉｉ）異常なタンパク質蓄積を減少させる場合、神経変性症状を治療又は予防するための候補薬剤である。
いくつかの実施形態において、細胞は運動ニューロンである。運動ニューロンは、当業者に利用可能な任意の供給源から得ることができる。さらに、運動ニューロンは任意の起源のものであり得る。したがって、いくつかの実施形態において、運動ニューロンは哺乳動物の運動ニューロンである。特定の実施形態において、運動ニューロンはヒト運動ニューロン又はマウス運動ニューロンである。この種の例示的な例では、運動ニューロンはマウスＥＳ細胞由来の運動ニューロンである。他の例示的な例では、運動ニューロンは、ＨＢ９運動ニューロン、Ｇ９３Ａ運動ニューロン、ＨＵＥＳ３由来運動ニューロン、及びそれらの組み合わせなどであるがこれらに限定されない運動ニューロン細胞株から選択される。
適切には、運動ニューロンは対象、例えば患者からのものである。いくつかの実施形態において、対象、例えば患者は神経変性状態に罹患している。いくつかの実施形態において、神経変性状態はＡＬＳ又はＦＴＤである。特定の実施形態において、運動ニューロンは、キャリア、例えば、無症状キャリアからのものである。
運動ニューロンは、対照と比較して、サイクリンＦの相対レベル及び／又は異常タンパク質蓄積のレベル又は活性が本質的に低いか、又は少なくとも１つの導入遺伝子の導入による対照と比較して、サイクリンＦの相対レベル及び／又は異常タンパク質蓄積の異常レベルを低下させる。導入遺伝子は、神経変性状態の発症に関連する遺伝子を調節する。特定の実施形態において、導入遺伝子は、サイクリンＦ転写物の転写又は翻訳を阻害するように機能するサイクリンＦアンタゴニスト核酸分子を含む。この種の代表的な転写物は、配列番号１、２、４、及び５に示される配列のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列を含む。例示的なアンタゴニスト核酸分子には、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム及びトリプレックス形成分子、ＲＮＡｉ及び外部ガイドシーケンスが含まれる。あるいは又はさらに、凝集しやすいタンパク質（例えば、ＴＤＰ－４３）が発現される導入遺伝子を運動ニューロンに導入することができる。このタイプの非限定的な例において、凝集感受性タンパク質（例えば、ＴＤＰ－４３）の発現は調節可能なプロモーターの使用を通じて条件付きである。
いくつかの実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、運動ニューロンではないが、他には運動ニューロンの代用である細胞を使用し、ここで細胞は、対照と比較して、サイクリンＦの相対レベル及び／又は異常タンパク質蓄積のレベル又は活性が本質的に低いか、又は運動ニューロンに関連して上述したような少なくとも１つの導入遺伝子の導入による対照と比較して、サイクリンＦの相対レベル及び／又は異常タンパク質蓄積の異常レベルを低下させる。この種の例示的な例では、本発明のスクリーニング方法は少なくとも１つの導入遺伝子を含む線維芽細胞を使用する。他の実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、少なくとも１つの導入遺伝子を含む細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）を使用する。
アッセイの非限定的な例では、試験薬剤を細胞と接触させるか又はインキュベートし、十分な期間の後、候補薬剤の影響を細胞の生存、変性又は細胞、おける／又は運動ニューロンにおけるタンパク質蓄積（例えば、ＴＤＰ－４３蓄積）に対して決定する。特定の実施形態において、生存した細胞をカウントし、それらの数を対照と比較する。対照は、試験薬剤と接触していない試料であり得る。対照は、運動ニューロン生存の既知のプロモーターで処理された試料であり得る。これは陽性対照として役立ち得る。対照は、運動ニューロン生存の既知の阻害剤で処理された試料であり得る。
運動ニューロン生存のいくつかの例示的なプロモーターとしては、ケンパウロン、アルスターパウロン、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）、及びそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。運動ニューロン生存のさらなるプロモーターには、例えば、２００９年１０月２１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１４６８に記載されているものが含まれる。
試験薬剤は、多種多様な異なる化合物を含むことができ、例えば、化学化合物及び化学化合物の混合物、例えば、有機小分子又は無機小分子；糖；オリゴ糖；多糖；生物学的巨大分子、例えば、ペプチド、タンパク質、ならびにペプチド類似体及び誘導体；ペプチド模倣薬；核酸；核酸類似体及び誘導体；生物学的材料から作られた抽出物、例えば、細菌、植物、真菌、又は動物細胞から作られた抽出物；天然に存在する又は合成組成物；ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、試験薬物は小分子である。
可能性のある試験薬剤の数は数百万に達する。小分子、ポリマー及びゲノムベースのライブラリーを開発するための方法は、例えば、Ding et al. (2002, J Am. Chem. Soc. 124: 1594-1596) and Lynn et al. (2001, J. Am. Chem. Soc. 123: 8155-8156)に記載されている。市販の化合物ライブラリーは、例えば、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣｈｅｍＤｉｖ、ＡｒＱｕｌｅ、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ、ｇｒａｆｆｉｎｉｔｙ、Ｐａｎｖｅｒａ、Ｖｉｔａｓ－Ｍ Ｌａｂ、Ｂｉｏｍｏｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ及びＯｘｆｏｒｄから入手することができる。これらのライブラリーは、本明細書に記載のスクリーニング装置及び方法を用いてスクリーニングすることができる。ＮＩＨロードマップ、分子ライブラリースクリーニングセンターネットワーク（ＭＬＳＣＮ）からのものなどの化合物ライブラリーも使用することができる。化学物質ライブラリー又は化合物ライブラリーは、通常、最終的にハイスループットスクリーニング又は工業製造で使用される貯蔵化学物質の集まりである。化学物質ライブラリーは、一連の貯蔵化学物質からなる簡単な用語で構成することができる。各化学物質は、化合物の化学構造、純度、量、及び物理化学的特性などの情報と、何らかの種類のデータベースに格納された関連情報を有する。
実施されている特定の実施形態に応じて、試験薬剤は、溶液中で遊離状態で提供され得るか、又は担体もしくは固体支持体、例えばビーズに付着され得る。試験薬剤の固定化のために多数の適切な固体支持体を使用することができる。適切な固体支持体の例には、アガロース、セルロース、デキストラン（すなわち、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅとして市販されている）、カルボキシメチルセルロース、ポリスチレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ろ紙、ニトロセルロース、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、ポリアミンメチルビニルエーテルマレイン酸コポリマー、ガラスビーズ、アミノ酸コポリマー、エチレン－マレイン酸コポリマー、ナイロン、シルクなどが含まれる。さらに、本明細書に記載の方法では、試験薬剤は個々に又はグループでスクリーニングすることができる。グループスクリーニングは、有効な対象のヒット率が低いと予想される場合に特に有用であり、その結果、所与のグループについて複数の陽性結果が予想されることはない。
限定されることなく、細胞は、最適なシグナル対ノイズ比を提供する任意の密度でプレーティングすることができる。例えば、細胞を３８４ウェルプレートに１，０００～２０，０００細胞／ウェルの密度で蒔くことができる。いくつかの実施形態において、細胞は、３８４ウェルプレートに１，０００；２，０００；４，０００；８，０００；１２，０００；１６，０００；又は２０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングされる。一実施形態において、細胞を３８４ウェルプレートに８，０００細胞／ウェルの密度で播種する。上記に基づいて、当業者は他の細胞培養容器用のプレーティング密度を調整することができる。例えば、３８４ウェルプレート内のウェルの寸法及び使用される容器を計算し、３８４ウェルプレートからのウェルと使用される受けるとの間の容積比又は表面積比に基づいて播種される細胞の数をスケーリングすることができる。
特定の実施形態において、凝集しやすいタンパク質（例えば、ＴＤＰ－４３）の蓄積が測定される。このタイプの非限定的な例では、凝集感受性タンパク質は検出可能な標識を含む。検出可能な標識は、例えば以下に記載されるように、当該技術分野で公知の任意の適切な標識であり得る。特定の実施形態において、検出可能な標識は、ハイスループットスクリーニングを可能にするためにハイコンテント顕微鏡システムを使用して検出され得る蛍光レポーター（例えば、ＹＦＰタグ）のような光学レポーターである。他の実施形態において、検出可能な標識は、リン光部分、エピトープ、放射性標識、又は当該技術分野において公知の他の任意の検出可能部分であり、当該技術分野において公知の方法のいずれかを用いて検出され得る。特定の実施形態において、検出可能な標識は、例えば以下に記載されるように、細胞生存率の測定を可能にする。タンパク質蓄積が評価されるスクリーニングアッセイの実施形態において、対照と比較したタンパク質蓄積の減少は、試験薬剤がタンパク質蓄積を阻害することを示す。これらの例では、スクリーニングアッセイは、タンパク質蓄積が対象剤によって阻害された同じ細胞又は同じ種類の細胞におけるサイクリンＦのレベル又は活性の増加を検出することを適切にさらに含む。このタイプの代表的な例では、細胞中のサイクリンＦのレベルは適切なイムノアッセイ（例えば、ウエスタンブロット又は免疫組織化学）を用いて決定される。
いくつかの実施形態において、運動ニューロン又は代用細胞の生存が評価され、この種類の非限定的な例では、評価は、運動ニューロン又は代用細胞マーカー及び細胞複製マーカーを検出することを含む。選択された対象剤は、運動ニューロン又は代用細胞マーカーと細胞複製マーカーが同じ細胞内に共局在する薬剤にさらに限定することができる。
培養中の運動ニューロン又は代用細胞を同定及び計数するための任意の利用可能な方法を使用することができる。例えば、運動ニューロン又は代用細胞は、検出可能な標識を含み得るか、又は同定もしくは計数のために検出可能な応答を提供し得る。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は光学レポーターである。適切な光学レポーターとしては、蛍光レポーター及び化学発光基が挙げられるが、これらに限定されない。多種多様な蛍光レポーター色素が当該技術分野で公知である。典型的には、フルオロフォアは、芳香族又はヘテロ芳香族化合物であり、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドール、ベンズインドール、オキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、シアニン、カルボシアニン、サリチレート、アントラニル酸塩、クマリン、フルオレセイン、ローダミン又は他の同様の化合物であり得る。適切な蛍光レポーターとしては、フルオレセイン又はローダミン色素などのキサンテン色素が含まれ、例えば、限定されないが、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’－ジメトキシ－４’５’－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）が挙げられる。適切な蛍光レポーターはまた、アルファ又はベータ位置にアミノ基を有するナフチルアミン色素を含む。例えば、ナフチルアミノ化合物としては、１－ジメチルアミノ－ナフチル－５－スルホネート、１－アニリノ－８－ナフタレンスルホネート、２－ｐ－トルイジニル－６－ナフタレンスルホネート、及び５－（２’－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）が挙げられる。他の蛍光レポーター色素には、３－フェニル－７－イソシアナトクマリンなどのクマリン；９－イソチオシアナトアクリジン及びアクリジンオレンジなどのアクリジン類；Ｎ－（ｐ（２－ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド；シアニン類、例えば、Ｃｙ２、インドジカルボシアニン３（Ｃｙ３）、インドジカルボシアニン５（Ｃｙ５）、インドジカルボシアニン５．５（Ｃｙ５．５）、３４－カルボキシ－ペンチル）－３’－エチル－５，５’－ジメチルオキサカルボシアニン（ＣｙＡ）；１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ－キサンテノ［２，３，４－ｉｊ：５，６，７－ｉ’ｊ’］ジキノリジン－１８－イウム、９－［２（又は４）－［［［６－２，５－ジオキソ－１－ピロリジニル）オキシ］－６－オキソヘキシル］アミノ］スルホニル］－４（又は２）－スルホフェニル］－２，３，６，７，１２，１３，１６，１７オクタヒドロ－内部塩（ＴＲ又はＴｅｘａｓ Ｒｅｄ）；ＢＯＤＩＰＹ．ＴＭ．色素；ベンゾオキサジアゾール；スチルベンピレン；ピレンなどが含まれる。これらの蛍光化合物の多くの適切な形態が利用可能であり、使用され得る。
いくつかの実施形態において、運動ニューロン又は代用細胞は蛍光タンパク質を発現する。検出可能な標識としての使用に適した蛍光タンパク質の例としては、限定されないが、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＤｓＲｅｄ）、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及びそれらの変異体が挙げられる（例えば、米国特許第６，４０３，３７４号、第６，８００，７３３号、及び第７，１５７，５６６号を参照されたい）。ＧＦＰ変異体の具体例としては、限定されないが、増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、不安定化ＥＧＦＰ、Ｄｏａｎら（2005, Mol. Microbiol. 55:1767-1781）において記載されているＧＦＰ変異体、Ｃｒａｍｅｒｉら（1996, Nat. Biotechnol. 14:315319）において記載されているＧＦＰ変異体、Ｒｉｚｚｏら（2004, Nat. Biotechnol. 22:445）及びＴｓｉｅｎ（1998, Annu. Rev. Biochem. 67:509）において記載されているセルリアン蛍光タンパク質、及びＮａｇａｌら（2002, Nat. Biotechnol. 20:87-90）において記載されている黄色蛍光タンパク質が挙げられる。ＤｓＲｅｄ変異体は、例えば、Ｓｈａｎｅｒら（2004, Nat. Biotechnol. 22:1567-1572）に記載され、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｅ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍｏｌａｎｇｅ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＨｏｎｅｙｗ、及びｍＴａｎｇｅｒｉｎｅを含む。追加のＤｓＲｅｄ変異体は、例えば、Ｗａｎｇら（2004, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:16745-16749）に記載され、ｍＲａｓｐｂｅｒｙ及びｍＰｌｕｍを含む。ＤｓＲｅｄ変異体のさらなる例は、Ｆｉｓｃｈｅｒら（2004, FEBS Lett. 577:227-232）に記載されるｍＲＦＰｍａｒｓ、Ｆｉｓｃｈｅｒら（2006, FEBS Lett. 580:2495-2502）に記載されるｍＲＦＰｒｕｂｙを含む。
蛍光タンパク質の非限定的なリストには、ＡｃｅＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＡＱ１４３、ＡｓＲｅｄ２、Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎ（ｍＡＧ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｃＯＦＰ、ＣｏｐＧＦＰ、Ｃｙａｎ、ＣｙＰｅｔ、Ｄｒｏｎｐａ、ＤｓＲｅｄ／ＤｓＲｅｄ２／ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ｅｑＦＰ６１１、ＥＹＦＰ、ＧＦＰｓ、ＨｃＲｅｄｌ、ＨｃＲｅｄ－ｔａｎｄｅｍ、Ｊ－Ｒｅｄ、Ｋａｅｄｅ、ＫＦＰ、ＫｉｋＧＲ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ｍＥｏｓＥＰ、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ＭｉＣｙ、ｍＫＯ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＹＦＰ、ｍＹＦＰ、ｍＹＦＰ、ＰＡ－ＧＦＰ、ＰＡ－ｍＲＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰＳ－ＣＦＰ－２、Ｒｅｎｉｌｌａ、ｔｄＦｏｓＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＵＶ－Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ、ならびにそれらの誘導体及び類似体が含まれる。一実施形態において、蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。
例えば、フルオロフォア又は蛍光タンパク質からの蛍光の検出のための当該技術分野で公知の特定のデバイス又は方法は、限定されないが、インビボ近赤外蛍光（Frangioni, 2003. Curr. Opin. Chem. Biol. 7:626-634）、Ｍａｅｓｔｒｏ（商標）インビボ蛍光イメージングシステム（Cambridge Research & Instrumentation, Inc.; Woburn, Mass）、フライングスポットスキャナーを用いるインビボ蛍光画像（2001, IEEE Transactions on Biomedical Engineering 48:1034-1041）などが挙げられる。光学応答を検出するための他の方法又は装置としては、限定されないが、目視検査、ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真用フィルム、レーザー走査装置、蛍光光度計、フォトダイオード、量子計数器、落射蛍光顕微鏡、走査顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダー、又は光電子増倍管を用いた信号増幅が含まれる。
蛍光タンパク質は、運動ニューロン又は代用細胞中のトランスジェニックレポーター遺伝子から発現させることができる。トランスジェニックレポーター遺伝子からの蛍光タンパク質の発現は、運動ニューロン特異的遺伝子の発現に作動可能に連結され得るか、又は運動ニューロン特異的プロモーターの制御下にあり得る。したがって、いくつかの実施形態において、蛍光タンパク質をコードする配列は、運動ニューロンに特異的な遺伝子のためのプロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態において、蛍光タンパク質をコードする配列は、ＨＢ９遺伝子プロモーターに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態において、運動ニューロン又は代用細胞は、画像ベースの方法によって計数される。検出可能な標識の存在は、画像ベースの方法を自動化により適したものにする。運動ニューロン又は代用細胞が蛍光タンパク質を発現する場合、生存運動ニューロンは、計数が行われたときに蛍光タンパク質を発現しているものであり得る。いくつかの実施形態において、試験薬剤とのインキュベーション後に生存する運動ニューロンの数は、対照の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１．１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍又はそれ以上である。
いくつかの実施形態において、試料中の運動ニューロン又は代用細胞の数は、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴＩを使用した自動画像取得及び分析によって評価される。獲得閾値／パラメータは、多数の運動ニューロンのコンピュータベースの呼び出しがヒトベースの呼び出しと一致するように設定される。そのような自動画像取得及び分析は、化合物のハイスループットスクリーニングを可能にする。
運動ニューロンの数は、以下によって評価することができる：（ｉ）未処理の対照と比較して、培養物中の細胞の総数の増加；（ｉｉ）未処理対照と比較して、試験培養物中に検出可能な標識を発現する細胞の総数の増加；（ｉｉｉ）未処理対照と比較して、培養物中の全細胞数に対する検出可能な標識を発現する細胞の割合の増加；又は（ｉｖ）それらの組み合わせ。
アッセイは、細胞培養のために当業者に利用可能な任意の適切な容器又は装置で行われ得る。例えば、アッセイは、２４、９６、又は３８４ウェルプレート中で行われ得る。一実施形態において、アッセイは３８４ウェルプレート中で行われる。
運動ニューロン又は代用細胞の生存が評価されるスクリーニングアッセイの実施形態において、対照と比較した生存の増加は、試験薬剤が運動ニューロン又は代用細胞の生存を促進するか、あるいは運動ニューロン又は代用細胞の変性もしくは死を阻害又は低減することを示す。これらの場合、スクリーニングアッセイは、適切には、細胞生存が増加したか、又は細胞変性もしくは死が試験薬剤によって阻害された、同じ細胞又は同じ型の細胞におけるサイクリンＦのレベル又は活性の増加を検出することをさらに含む。このタイプの代表的な例では、細胞中のサイクリンＦのレベルは、適切なイムノアッセイ（例えば、ウエスタンブロット又は免疫組織化学）を用いて決定される。
いくつかの実施形態において、スクリーニング方法はハイスループットスクリーニングである。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）は、ロボット工学、データ処理及び制御ソフトウェア、液体処理装置、及び高感度検出器を使用する科学実験のための方法である。ハイスループットスクリーニング又はＨＴＳにより、研究者は、数百万もの生化学的、遺伝的又は薬理学的試験を迅速に実施することができる。ハイスループットスクリーニングは、当業者にはよく知られ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，９７６，８１３号；第６，４７２，１４４号；第６，６９２，８５６号；第６，８２４，９８２号；及び第７．０９１，０４８号に記載されるものが含まれる。
ＨＴＳは、候補化合物のライブラリーに対してアッセイのスクリーニングを実行するために自動化を使用する。アッセイは比活性の試験であり、通常は生化学的又は生物学的メカニズムの阻害又は刺激である。典型的なＨＴＳスクリーニングライブラリー又は「デックス」は、１００，０００から２，０００，０００超の化合物を含み得る。
ＨＴＳの重要な実験器具又は試験容器は、マイクロタイタープレートである：通常は使い捨てであり、ウェルと呼ばれる小さい、開いたディボットの格子を特徴とするプラスチック製の小さい容器である。ＨＴＳ用の最新のマイクロプレートは、一般に３８４、１５３６、又は３４５６ウェルを有する。これらはすべて９６の倍数であり、８×１２９ｍｍ間隔のウェルを持つ元の９６ウェルマイクロプレートを反映している。
アッセイを準備するために、研究者は、運動ニューロン又は代用細胞集団などの、実験を実施したい適切な試薬でプレートの各ウェルを満たす。試薬がウェル内の化合物と吸収、結合、又は他の方法で反応する（又は反応しない）のを可能にするためにいくらかのインキュベーション時間が経過した後、手動又は機械によって、プレートの全ウェルにわたって測定が行われる。研究者が顕微鏡を使って（例えば）コンピュータでは簡単には判断できないような変化を探す場合、手動測定がしばしば必要になる。それ以外の場合は、比色測定、放射能計数など、特殊な自動分析装置がウェルに対して多数の実験を実行できる。この場合、機械は、各実験の結果を数値のグリッドとして出力し、各数は単一のウェルから得られた値にマッピングする。大容量の分析装置は、このような数分のスペースで数十のプレートを測定することができ、非常に迅速に数千の実験データポイントを生成する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって選択される化合物又は薬剤を提供する。本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって選択される化合物の類似体、誘導体、異性体、及び薬学的に許容される塩も本明細書に包含されることを理解されたい。
４．運動ニューロン又は代用細胞の接触
例えば本明細書に記載される、運動ニューロンもしくは運動ニューロンの代わりに適切である非運動ニューロン細胞（本明細書では「代用細胞」とも呼ばれる）などの細胞、又は運動ニューロンもしくは代用細胞を含む細胞の集団は、細胞培養物中で、例えばインビトロ又はエクスビボで本明細書に記載の薬剤と接触させることができ、又は例えばインビボで対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のものを含む神経変性状態を治療、予防及び／又は診断するために、本明細書に記載の薬剤を対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化合物及び／又は薬剤は、ＡＬＳを治療、予防及び／又は診断するために対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化合物及び／又は薬剤は、ＦＴＤを治療、予防及び／又は診断するために対象に投与することができる。
インビトロ法の場合、運動ニューロンは異なる供給源から得ることができる。例えば、運動ニューロンは、対象から得られ得るか、又は対象由来の非運動ニューロン細胞に由来し得る。いくつかの実施形態において、運動ニューロンは全細胞である。いくつかの実施形態において、対象は神経変性状態に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は神経変性状態を発症する危険性がある。いくつかの実施形態において、対象は神経変性状態を有することが疑われる。いくつかの実施形態において、対象は、神経細胞死を特徴とする状態を発症する危険性がある。いくつかの実施形態において、対象は、神経細胞死を特徴とする状態に罹患していると疑われる。いくつかの実施形態において、対象は神経細胞死に罹患している。いくつかの実施形態において、対象はＳＭＡに罹患している。いくつかの態様において、対象はＡＬＳに罹患している。いくつかの実施形態において、対象は担体、例えば無症状の担体である。いくつかの実施形態において、運動ニューロン細胞は対象の胚性幹細胞（ＥＳＣ）に由来する。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象はマウスである。いくつかの実施形態において、マウスはトランスジェニックマウスである。胚性幹細胞から運動ニューロンの分化を誘導する方法は、例えば、２００７年４月１５日にオンラインで公開されたDi Giorgio et al., Nature Neuroscience (2007); doi:10.1038/nn1885及びWichterle et al., Cell (2002) 110:385-397に記載されているように当該技術分野で公知である。いくつかの例において、誘導多能性幹細胞は、対象から生成され得、次いで運動ニューロンに分化し得る。対象から運動ニューロンを導き出す１つの例示的な方法は、Dimos, J.T., et al. Science (2008) 321, 1218-122 (Epub Jul. 31, 2008)に記載されている。
インビボ方法では、本明細書に記載の治療上有効量の薬剤を対象に投与することができる。対象に薬剤を投与する方法は当該技術分野において公知であり、当業者には容易に利用可能である。
当業者はまた、本明細書中に記載される薬剤が、運動ニューロン変性を阻害するか又は運動ニューロン生存を促進するために使用され得、それは運動ニューロン変性によって特徴付けられる多数の状態の治療、予防又は改善をもたらし得る。運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）は、運動ニューロン、話すこと、歩くこと、呼吸すること、嚥下すること及び身体の全身運動を含む自発的な筋肉活動を制御する神経細胞に選択的に影響を及ぼす一群の神経変性状態である。骨格筋は、脊髄の腹側角に位置する一群のニューロン（下側運動ニューロン）によって神経支配され、これが腹側根を筋細胞に突き出している。これらの神経細胞はそれ自体、脳の運動皮質から突出する皮質脊髄路又は上部運動ニューロンによって神経支配されている。肉眼的病理学では、脊髄の腹側角の変性、ならびに腹側根の萎縮がある。脳では、萎縮が前頭葉と側頭葉に存在することがある。顕微鏡検査では、ニューロンはスポンジ症、活性化星状細胞及びミクログリアの存在、ならびに特徴的な「かす状」の封入体、ブニナ体、及び液胞形成を含む多数の封入体を示すことがある。運動ニューロン疾患は多様であり、その効果において破壊的である。それらは一般的にその起源と因果関係に明確な違いがあるが、患者にとっての結果にも同様の結果：重度の筋力低下をもたらす。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、偽性球麻痺、進行性眼球麻痺、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）及びポリオ後症候群はすべてＭＮＤの例である。運動ニューロン変性の主な部位は神経変性状態を分類する。
上部及び下部運動ニューロンの両方に影響を及ぼすＡＬＳは、ＭＮＤの最も一般的な形態である。進行性の眼球麻痺は脳幹の下部運動ニューロンに影響を及ぼし、発話の鈍化や咀嚼や飲み込みの困難を引き起こす。これらの症状のある人は、ほとんど常に腕と脚に異常な徴候を示す。原発性側索硬化症は上部運動ニューロンの疾患であるが、進行性筋萎縮症は脊髄の下部運動ニューロンにのみ作用する。ＭＮＤを診断するための手段は当業者に周知である。症状の非限定的な例を以下に記載する。
４．１ 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）
Ｌｏｕ Ｇｅｈｒｉｇ病又は古典的運動ニューロン疾患とも呼ばれる筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、進行性の、最終的には致命的な障害であり、最終的にすべての随意筋へのシグナルを破壊する。米国では、医師は運動ニューロン疾患とＡＬＳという用語を同じ意味で使用している。上部運動ニューロンと下部運動ニューロンの両方が影響を受ける。古典的なＡＬＳを患っている人々の約７５％は、球根筋（発話、嚥下、及び咀嚼を制御する筋肉）の衰弱及び消耗も発症する。症状は、通常、腕、手、足、又は嚥下筋に最初に見られる。筋力低下と萎縮は、体の両側で過度に発生する。影響を受けた個人は力と腕、脚、そして体を動かす能力を失う。他の症状には、痙縮、誇張された反射、筋肉のけいれん、束縛、飲み込みや言葉の形成に関する問題の増加などがある。発話が曖昧になったり鼻腔内になることがある。横隔膜と胸壁の筋肉が適切に機能しなくなると、ヒトは機械的な支援なしで呼吸する能力を失う。この病気は通常、人の心や性格を損なうことはないが、最近のいくつかの研究では、ＡＬＳ患者の中には意思決定や記憶の問題などの認知機能に変化をもたらす可能性があるものがある。ＡＬＳは最も一般的には４０～６０歳の間の人々を襲うが、若年及び高齢の人々もまたこの疾患を発症し得る。男性は女性よりも頻繁に影響を受ける。ＡＬＳのほとんどの症例は散発的に起こり、それらの個人の家族は病気を発症するリスクが高いとは考えられていない。しかしながら、成人には家族型ＡＬＳがあり、これはしばしばＲＮＡ代謝に関与する遺伝子（例えばＴＤＰ４３及びＦＵＳ）及びタンパク質分解（例えばＵＢＱＬＮ２、ＴＢＫ１及びＣＣＮＦ）の突然変異から生じる。さらに、まれな若年発症型ＡＬＳは遺伝的である。ＡＬＳ患者の大部分は、呼吸不全で死亡し、通常症状の発症から３～５年以内に死亡する。しかしながら、罹患者の約１０％が１０年以上生存している。
４．２ 前頭側頭型認知症
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は前頭側頭葉及び／又は側頭葉を主に含む進行性のニューロンの喪失、及び紡錘体ニューロンの７０％を超える典型的な喪失を特徴とする前頭側頭葉変性の臨床症状であるが、他のニューロン型は無傷のままである。ＦＴＤでは、前頭葉及び側頭葉の一部が萎縮又は縮小する。脳の前頭葉及び側頭葉は、一般に人格、行動及び言語に関連している。一般的な徴候や症状は、影響を受ける脳の部分によって異なる。ＦＴＤのヒトの中には、性格が劇的に変化して社会的に不適切、衝動的又は感情的に無関心になる人もいれば、言語を使用する能力を失う人もいる。徴候や症状には、社会的及び個人的行動の著しい変化、無関心、感情の鈍化、表現言語と受容言語の両方の欠如が含まれる。現在、ＦＴＤの治療法はないが、症状を軽減するのに役立つ治療法がある。
４．３ 脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、全てが遺伝的原因及び脊髄及び脳幹の運動ニューロンの喪失による衰弱の発現を共通に有する、いくつかの異なる障害を指す。骨格筋の脱力及び消耗は、脊髄の前角細胞の進行性の変性によって引き起こされる。この弱さは腕よりも脚のほうがより深刻である。ＳＭＡは、発症年齢、遺伝のパターン、症状の重症度や進行度など、さまざまな形態をとる。一般的なＳＭＡのいくつかを以下に説明する。
ＳＭＮ遺伝子産物の欠陥は、ＳＭＡ及びＳＭＮタンパク質レベルの主な原因として考えられ、ＳＭＡに罹患している対象の生存と相関する。ＳＭＡの最も一般的な形はＳＭＮ遺伝子の突然変異によって引き起こされる。ＳＭＮ（生存運動ニューロン）遺伝子を含む５番染色体の領域は、大きな重複がある。いくつかの遺伝子を含む大きな配列は、隣接するセグメントに２回出現する。したがって、遺伝子の２つのコピー、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２がある。ＳＭＮ２遺伝子は、タンパク質を製造することにおいてそれをそれほど効率的ではないようにする追加の突然変異を有するが、ただし、それは低レベルではそうである限りにおいてである。ＳＭＡは、両方の染色体からのＳＭＮ１遺伝子の喪失によって引き起こされる。ＳＭＡ１からＳＭＡ３までの範囲のＳＭＡの重症度は、残りのＳＭＮ２遺伝子がＳＭＮ１の喪失をどれだけうまく補うことができるかに部分的に関連する。
ウェルドニッヒ－ホフマン病とも呼ばれるＳＭＡ Ｉ型は、子供が生後６ヶ月になるまでに明らかになる。症状には、低緊張（筋緊張の低下）、四肢の動きの衰弱、腱反射の欠如、痙攣、嚥下困難、摂食困難、呼吸障害などがある。一部の子供はまた、側弯症（脊椎の湾曲）又は他の骨格異常を発症する。罹患した子供は決して座ったり立ったりしないで、大多数は通常２歳までに呼吸不全で死亡する。
ＳＭＡ ＩＩ型の症状は通常、子供が生後６ヶ月になった後に始まる。特徴としては、立ったり歩いたりすることができないこと、呼吸器系の問題、緊張低下、腱反射の減少又は消失、及び束縛が挙げられる。これらの子供たちは座ることを学ぶかもしれないが、立っていません。平均余命はさまざまで、一部の個人は青年期以降に生活している。
ＳＭＡ ＩＩＩ型（Ｋｕｇｅｌｂｅｒｇ－Ｗｅｌａｎｄｅｒ病）の症状は２～１７歳の間に現れ、異常な歩行、ランニング、階段を上る、又は椅子から立ち上がるのが困難；指の細かい震えを含む。下肢が最もよく影響を受ける。合併症としては、脊柱側弯症及び関節拘縮－関節の自由な動きを妨げる異常な筋緊張及び衰弱によって引き起こされる関節周囲の筋肉又は腱の慢性的な短縮が挙げられる。
他の形態のＳＭＡとしては、例えば、遺伝性Ｂｕｌｂｏ－Ｓｐｉｎａｌ ＳＭＡケネディ病（Ｘ連鎖、アンドロゲン受容体）、呼吸困難を伴うＳＭＡ（ＳＭＡＲＤ １）（第１１染色体、ＩＧＨＭＢＰ２遺伝子）、上肢優位を伴う遠位ＳＭＡ（第７染色体、グリシルｔＲＮＡシンターゼ）、及びＸ連鎖乳児ＳＭＡ（遺伝子ＵＢＥ１）が挙げられる。
ＳＭＡの現在の治療は、慢性運動単位喪失の二次的効果の予防及び管理からなる。ＳＭＡの治療のために臨床試験中のいくつかの薬剤には、酪酸塩、バルプロ酸、ヒドロキシ尿素及びリルゾールが含まれる。
Ｆａｚｉｏ－Ｌｏｎｄｅ病の症状は１～１２歳の間に現れ、顔面の脱力、嚥下障害（嚥下困難）、喘鳴（しばしば喉頭の急性閉塞に関連する高音の呼吸音）、話すことの困難さ（構音障害）、及び目の筋肉の麻痺ＳＭＡタイプＩＩＩのほとんどの個人は、呼吸合併症で死亡する。
進行性脊髄球性筋萎縮症としても知られるケネディ病は、Ｘ連鎖劣性疾患である。ケネディ病患者の娘は保因者であり、息子がこの疾患に罹患する可能性は５０％である。発症は１５～６０歳の間に起こる。症状には、顔面及び舌の筋肉の衰弱、手の振戦、筋肉のけいれん、嚥下障害、構音障害、ならびに男性の乳房及び乳腺の過度の発達が含まれる。弱さは通常、四肢に広がる前に骨盤で始まる。何人かの個体は、インスリン非依存性真性糖尿病を発症する。
障害の経過は様々であるが、一般的にはゆっくり進行的である。個人は、病気の晩期まで外来性のままでいる傾向がある。ケネディ病患者の平均余命は通常正常である。
関節症を伴う先天性ＳＭＡ（四肢の異常姿勢が固定された関節の持続性拘縮）はまれな疾患である。症状としては、重度の拘縮、脊柱側弯症、胸部変形、呼吸器系の問題、異常に小さい顎、上瞼の垂れ下がりなどがある。
進行性眼球萎縮症とも呼ばれる進行性眼球麻痺は、嚥下、話す、咀嚼、及び他の機能に必要な下部運動ニューロンを制御する領域である、球状の脳幹を含む。症状としては、嚥下筋衰弱（嚥下に伴う）、弱い顎と顔面の筋肉、進行性の失語、舌筋萎縮などがある。下部運動ニューロンと上部運動ニューロンの両方の徴候を伴う四肢の脱力は、ほとんどいつも明白であるが、あまり目立たない。影響を受けた人は、笑いや泣き声（感情的な怠惰と呼ばれる）の噴出を起こす。個人は最終的には食事や会話ができなくなり、窒息や誤嚥性肺炎の危険性が高まる。これは、声帯を通って下部気道や肺に液体や食物が通過することによって引き起こされる。脳卒中及び重症筋無力症はそれぞれ、進行性眼球麻痺の症状と類似した特定の症状を有し、この障害を診断する前に除外しなければならない。ＡＬＳ症例の約２５パーセントで、初期症状は眼球の病変から始まる。古典的なＡＬＳを患っている個人の約７５％が、結局は球根の関与を示している。多くの臨床医は、腕や脚に異常があるという証拠なしに、それだけで進行性の眼球麻痺が起こることは極めて稀であると考えている。
進行性球麻痺の多くの症状を共有する偽球麻痺は、上部運動ニューロン変性及び話す能力、噛む能力、及び飲み込む能力の進行性の喪失を特徴とする。顔面筋肉の漸進的な脱力は無表情の顔をもたらす。個人は、しゃがれた声と増加した咽頭反射を生じさせる場合がある。舌が動かなくなり、口から突き出ることができなくなる可能性がある。個人はまた感情的な不安定さを経験する場合がある。
原発性側索硬化症（ＰＬＳ）は上部運動ニューロンのみに影響を及ぼし、男性では女性よりもほぼ２倍一般的である。発症は一般に５０歳以降に起こる。ＰＬＳの原因はわかっていない。随意運動を制御する大脳皮質の特定の神経細胞（脳を覆っている細胞の薄い層）が徐々に変性し、その制御下にある筋肉が弱くなる。科学者が遺伝することはめったにないと考えるこの症候群は、何年も何十年にもわたって徐々に進行し、罹患した筋肉のこわばりと不器用さをもたらす。障害は、通常、最初に脚、次に体幹、腕と手、そして最後に眼球の筋肉が順に発症する。症状には、バランスの悪さ、脚の衰弱とこわばり、ぎこちなさ、動きの遅さとこわばりを生む脚の痙縮、足の引きずり（歩行不能）、及び構音障害（関節の動作不良）を引き起こす顔面障害（明瞭度の低い会話）が含まれる。ＡＬＳとＰＬＳ（ＡＬＳの変形と考えられる）との間の主な違いは、関与する運動ニューロン及び疾患進行速度である。ＰＬＳは、痙性対麻痺、足の痙縮を引き起こし、通常青年期に始まる上部運動ニューロンの遺伝性疾患と間違われる可能性がある。ほとんどの神経科医は、ＰＬＳの診断を下す前に少なくとも３年間、罹患した個人の臨床経過を辿る。この障害は致命的ではないが、生活の質に影響を与える可能性がある。ＰＬＳはしばしばＡＬＳに発症する。
進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）は、下部運動ニューロンのみ遅いが進行性の変性によって特徴付けられる。それは主に男性に発症し、他のＭＮＤよりも早く発症する。弱さは通常、最初に手の中に見られ、次に下半身に広がり、そこで深刻になることがある。その他の症状としては、筋肉の消耗、不器用な手の動き、線維束性攣縮、筋肉のけいれんなどがある。体幹の筋肉と呼吸が影響を受ける可能性がある。風邪にさらされると症状が悪化することがある。この病気は多くの場合ＡＬＳに進行する。
ポリオ後症候群（ＰＰＳ）は、ポリオからの回復から数十年後にポリオ生存者を襲う可能性がある状態である。ＰＰＳは、傷害、病気（変性性関節疾患など）、体重の増加、又は加齢の過程で、最初のポリオ発作後も機能し続けていた脊髄運動ニューロンが損傷又は死亡すると発生すると考えられている。多くの科学者は、ＰＰＳが以前にポリオに罹患した筋肉の潜在的な弱さであり、新しいＭＮＤではないと考えている。症状には、疲労、ゆっくりと進行する筋力低下、筋萎縮、束縛、耐寒性、及び筋肉痛と関節痛が含まれる。これらの症状は、初期疾患の影響を受けている筋肉群の間で最も頻繁に発生する。他の症状には、側弯症などの骨格奇形及び呼吸困難、嚥下又は睡眠が含まれる。症状は高齢者や初期の病気の影響を最も強く受けているヒトの間でより頻繁に見られる。軽度の症状しか経験しない人もいれば、ＳＭＡを発症する人もいるが、まれにＡＬＳの形とは思われるがそうではないこともある。ＰＰＳは通常命にかかわるものではない。医師は、麻痺性ポリオの生存者の約２５～５０パーセントのＰＰＳの発生率を推定している。
いくつかの実施形態において、神経変性状態はＡＬＳ又はＦＴＤであり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、神経変性状態と診断された対象を選択することをさらに含む。神経変性状態に罹患している対象は、提示された症状に基づいて選択することができる。例えば、ＡＬＳに罹患している対象は、線維束性攣縮、けいれん、堅くて凝った筋肉（痙縮）、腕、肩又は舌のひきつれ、手、腕又は脚に影響を及ぼす筋肉の脱力、鈍くて鼻による発話、又は咀嚼又は飲み込むことの困難性の症状を示し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、神経変性状態を発症する危険性のある対象を選択することをさらに含む。神経変性状態を発症する危険性がある対象は、遺伝子診断試験（例えば、神経変性状態に関連する遺伝子における突然変異について（例えば、サイクリンＦレベル又は活性をアッセイする）について）又は提示される症状に基づいて選択され得る。例えば、ＡＬＳに罹患している対象は、線維束性攣縮、けいれん、堅くて凝った筋肉（痙縮）、腕、肩又は舌のひきつけ、手、腕又は脚に影響を及ぼす筋肉の脱力、鈍くて鼻による発話、又は咀嚼もしくは飲み込みの困難性の症状を示し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、神経変性状態を有することが疑われる対象を選択することをさらに含む。神経変性状態を有することが疑われる対象は、診断試験（例えば、サイクリンＦのレベル又は活性をアッセイする）に基づいて、又は提示された症状又はそれらの組み合わせに基づいて選択することができる。例えば、ＡＬＳに罹患している対象は、線維束性攣縮、けいれん、堅くて凝った筋肉（痙縮）、腕、肩又は舌のひきつけ、手、腕又は脚に影響を及ぼす筋肉の脱力、鈍くて鼻による発話、又は咀嚼もしくは飲み込みの困難性の症状を示し得る。
５．診断テスト、疾病進行のモニタリング、治療効果
本開示のある態様は、神経変性状態及び／又は運動ニューロン変性を特徴とする状態を診断するための診断試験及び方法に関する。本開示の他の態様は、対象における神経変性状態の進行をモニターするための方法、及び対象における神経変性状態の進行を減少させることにおける治療の有効性をモニターする方法に関する。
一態様において、対象における神経変性状態を診断するための方法は、対象において、対照と比較してサイクリンＦのレベルが減少した運動ニューロン又は運動ニューロンの代用である細胞（例えば、皮膚線維芽細胞などの皮膚細胞、又は末梢血単核球などの血液細胞など）を検出することを含む。
このタイプの代表的な例では、診断方法は以下を含む：（ａ）対象から細胞を含む試料を入手すること；（ｂ）細胞中のサイクリンＦのレベル又は活性を検出するために試料中の細胞に対して少なくとも１つのアッセイを実施すること；（ｃ）細胞中のサイクリンＦのレベル又は活性が、対照試料中のサイクリンＦのレベル又は活性と比較して減少している場合、神経変性状態を有すると対象を診断すること。特定の実施形態において、細胞は、運動ニューロン又は運動ニューロンの代わりとなる細胞（例えば、皮膚線維芽細胞などの皮膚細胞、末梢血単核球などの血液細胞など）から選択される。
一態様において、対象における神経変性状態の進行を予測する方法は、以下を含む：（ａ）対象から第１の試料を得ること、ここで、第１の試料は運動ニューロン及び／又は運動の代用物である細胞を含むニューロン（例えば、皮膚線維芽細胞などの皮膚細胞、末梢血単核球などの血液細胞など）である；（ｂ）第１の試料が得られたときより遅い時間に対象から第２の試料を得ること、ここで、第２の試料は運動ニューロン及び／又は運動ニューロンの代用である細胞（例えば、皮膚線維芽細胞などの皮膚細胞、末梢血単核球などの血液細胞など）である；（ｃ）サイクリンＦのレベル又は活性を検出するために細胞試料に対して少なくとも１つのアッセイを実施すること、ここで、（ｉ）第２の試料中のサイクリンＦのレベル又は活性が第１の試料中のサイクリンＦのレベル又は活性と比較して減少している場合、神経変性状態は進行すると予測される；又は（ｉｉ）第２の試料中のサイクリンＦのレベル又は活性が第１の試料中のサイクリンＦのレベル又は活性と比較して増加又は変化していない場合、神経変性状態は進行しないと予測される。
一態様において、対象における神経変性状態の進行を軽減することにおける治療の有効性を監視する方法は、以下を含む：（ａ）対象への治療の投与前と投与後に、神経変性状態を有する対象からの運動ニューロン及び／又は運動ニューロンの代用物（例えば、皮膚線維芽細胞などの皮膚細胞、末梢血単核球などの血液細胞など）を含む試料中のサイクリンＦのレベル又は活性を決定するための少なくとも１つのアッセイを行うこと；及び（ｂ）治療の投与前の対象からの試料中のサイクリンＦのレベル又は活性を、治療の投与後の対象からの試料中のサイクリンＦのレベル又は活性と比較すること；及び（ｃ）対象における神経変性状態の進行を減少させることにおける治療の有効性を監視すること。いくつかの実施形態において、治療の投与前の試料中のサイクリンＦのレベル又は活性と比較した、治療の投与後の試料中のサイクリンＦのレベル又は活性の増加は、治療が、対象における神経変性状態の進行を減少させることにおいて有効であることの指標である。いくつかの実施形態において、治療の投与前の試料中のサイクリンＦのレベル又は活性と比較した、治療の投与後の対象からの試料中のサイクリンＦのレベル又は活性の減少は、治療が、対象における神経変性状態の進行を軽減するのに効果的ではないことの指標である。いくつかの実施形態において、治療の投与前の試料中のサイクリンＦのレベル又は活性と比較して、治療の投与後の対象からの試料中のサイクリンＦのレベル又は活性の変化がないことは、治療が。対象における神経変性状態の進行を減少させるのに有効ではないことの指標である。
任意の適切な対照を使用することができる。いくつかの実施形態において、対照は神経変性状態を有さない対象である。いくつかの実施形態において、対照は、神経変性状態を有さない対象を示す参照標準又はレベルである。いくつかの態様において、対照は、神経変性状態の進行が停止又は逆転している対象を示す参照標準又はレベルである。
本開示は、細胞中のサイクリンＦのレベル又は活性を検出することができる任意のアッセイを使用することを企図している。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアッセイは、ＴＤＰ－４３へのサイクリンＦの結合を検出するための基質結合アッセイを含む。当業者は、細胞中のサイクリンＦのレベル又は活性を検出するのに適した基質結合アッセイをどのように実施するかを理解する。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアッセイは、運動ニューロン又は代用細胞におけるサイクリンＦ ｍＲＮＡ又はサイクリンＦタンパク質のレベルを測定するアッセイを含む。細胞内のｍＲＮＡ又はタンパク質を測定することができる任意のアッセイ（例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、マイクロアレイ、ｑＲＴ－ＰＣＲなど）、配列決定アッセイ（例えば、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、遺伝子発現のキャップ分析（ＣＡＧＥ）、超並列シグネチャーシークエンシング（ＭＰＳＳ）、ＧＲＯ－ｓｅｑ、及びＲＮＡ－ｓｅｑ）及び免疫学に基づくアッセイ（例えば、ウエスタンブロッティング、免疫組織化学、フローサイトメトリーなど）を使用することができる。神経変性状態又は参照標準もしくはレベルを有さない対象から得られた対照運動ニューロン又は代用細胞と比較して、運動ニューロン又は代用細胞中のサイクリンＦ ｍＲＮＡ及び／又はサイクリンＦタンパク質のレベルの上昇は、対象が、神経変性状態及び／又は運動ニューロン変性を特徴とする状態を発症しているか又は発症する危険があることを指名していることを当業者は認識する必要がある。
いくつかの実施形態において、本方法は、神経変性状態を有することが疑われる対象を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態において、診断方法は、運動ニューロン変性を特徴とする状態を有することが疑われる対象を選択することをさらに含む。
当業者は、対象における神経変性状態の進行を減少させることにおける任意の治療法の有効性が本明細書に記載される方法に従ってモニターされ得ることを理解する。
６．治療方法
本発明のある態様は、神経変性状態、及び運動ニューロン変性によって特徴付けられる状態を治療するための方法に関する。
一態様では、それを必要とする対象における神経変性状態を治療又は予防する方法は、サイクリンＦのレベル又は活性を増強又は増大させる薬剤の有効量を対象に投与することを含む。
一態様では、それを必要とする対象における運動ニューロン変性を特徴とする状態を治療又は予防する方法は、サイクリンＦのレベル又は活性を増強又は増大させる薬剤の有効量を対象に投与することを含む。
適切には、薬剤は、対象におけるサイクリンＦのレベル又は活性を増強又は増大させ、運動ニューロンの生存を促進し、かつ／又は運動ニューロンの変性を阻害する。いくつかの実施形態において、薬剤は、サイクリンＦのレベル又は活性を増強又は増大させ、対象における神経変性状態に関連する少なくとも１つの症状を改善する。いくつかの実施形態において、薬剤はサイクリンＦのレベル又は活性を増強又は増大させ、対象の神経変性状態を治療する。いくつかの実施形態において、薬剤はサイクリンＦのレベル又は活性を増強又は増大させ、対象が神経変性状態を発症するのを防止する。いくつかの実施形態において、薬剤は、サイクリンＦのレベル又は活性を増強又は増大させ、対象の神経変性状態が進行するのを妨げる。
いくつかの実施形態において、薬剤は、複合体の基質（例えば、ＴＤＰ－４３）を含むＳＣＦＣサイクリンF複合体のレベルを上昇させ、対象における運動ニューロンの生存を促進し、及び／又は運動ニューロン変性を阻害する。いくつかの実施形態において、薬剤は、複合体の基質（例えば、ＴＤＰ－４３）を含むＳＣＦＣサイクリンF複合体のレベルを上昇させ、対象における神経変性状態に関連する少なくとも１つの症状を改善する。いくつかの実施形態において、薬剤は、複合体の基質（例えば、ＴＤＰ－４３）を含むＳＣＦＣサイクリンF複合体のレベルを上昇させ、対象の神経変性状態を治療する。いくつかの実施形態において、薬剤は、複合体の基質（例えば、ＴＤＰ－４３）を含むＳＣＦＣサイクリンF複合体のレベルを上昇させ、対象が神経変性状態を発症するのを防止する。いくつかの実施形態において、薬剤は、複合体の基質（例えば、ＴＤＰ－４３）を含むＳＣＦＣサイクリンF複合体のレベルを上昇させ、対象の神経変性状態が進行するのを妨げる。
いくつかの実施形態において、薬剤は、タンパク質凝集を受けやすいタンパク質（例えば、ＴＤＰ－４３）の量を減少させ、対象において運動ニューロンの生存を促進し、及び／又は運動ニューロンの変性を阻害する。いくつかの実施形態において、薬剤は、タンパク質凝集を受けやすいタンパク質（例えば、ＴＤＰ－４３）の量を減少させ、対象における神経変性状態に関連する少なくとも１つの症状を改善する。いくつかの実施形態において、薬剤は、タンパク質凝集を受けやすいタンパク質（例えば、ＴＤＰ－４３）の量を減少させ、対象の神経変性状態を治療する。いくつかの実施形態において、薬剤は、タンパク質凝集を受けやすいタンパク質（例えば、ＴＤＰ－４３）の量を減少させ、対象が神経変性状態を発症するのを防ぐ。いくつかの実施形態において、薬剤は、タンパク質凝集を受けやすいタンパク質（例えば、ＴＤＰ－４３）の量を減少させ、対象の神経変性状態が進行するのを妨げる。
サイクリンＦのレベル又は活性を有する任意の薬剤を本明細書に記載の実施形態において使用することができる。
いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
いくつかの実施形態において、対象は、神経変性状態、又は運動ニューロン変性を特徴とする状態の治療のために選択される。いくつかの実施形態において、対象は、神経変性状態、又は運動ニューロン変性を特徴とする状態を発症する危険性がある。いくつかの実施形態において、対象は、神経変性状態、又は運動ニューロン変性を特徴とする状態を有することが疑われる。いくつかの実施形態において、対象は神経変性状態に罹患している。神経変性状態は、本明細書に記載の任意の神経変性状態であり得る。いくつかの実施形態において、神経変性状態は運動ニューロン変性によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、神経変性状態は運動ニューロン疾患である。いくつかの実施形態において、神経変性状態は、運動ニューロンにおけるサイクリンＦの減少した、又は異常に低いレベル又は活性によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、神経変性状態はＡＬＳである。いくつかの実施形態において、神経変性状態はＦＴＤである。
いくつかの実施形態において、別の治療薬もまた対象に投与される。そのような別の治療薬又は「補助」薬は、典型的にはサイクリンＦ増強薬と同時に投与される。例えば、治療薬は、同じ製剤中で、又は別々の製剤中で投与することができる。例えば、酪酸塩、バルプロ酸、ヒドロキシ尿素又はリルゾール。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている薬剤は、ＡＬＳの１つ以上の症状の治療における使用に適した別の治療薬を組み合わせて使用され、例えば、限定されないが、以下のうちの１つ以上が挙げられる：（ｉ）水素化ピリド［４，３－ｂ］インドール又はその医薬として許容される塩、及び（ｉｉ）筋肉細胞へのエネルギーの供給を促進又は増加させる薬剤、ＣＯＸ－２阻害剤、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ－１（ＰＡＲＰ－Ｉ）阻害剤、３０Ｓリボソームタンパク質阻害剤、ＮＭＤＡ拮抗薬、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬、ナトリウムチャネル遮断薬、グルタミン酸放出阻害剤、Ｋ（Ｖ）４．３チャネル遮断薬、抗炎症薬、５－ＨＴ １Ａ受容体作動薬、神経栄養因子増強剤、運動ニューロン表現型生存及び／又は神経突起形成を促進する薬剤、血液脳関門を破壊から防ぐ薬剤、１つ以上の炎症性サイトカインの産生又は活性の阻害剤、免疫調節剤、神経保護剤、星状細胞の機能の調節剤、抗酸化剤（例えば、小分子触媒酸化防止剤）、フリーラジカル捕捉剤、１種以上の活性酸素種の量を減少させる薬剤、非タンパク質チオール含有量の減少を阻害する薬剤、正常な細胞タンパク質修復経路の刺激剤（例えば、分子シャペロンを活性化する薬剤）、神経栄養剤、神経細胞死の阻害剤、神経突起成長の刺激剤、神経細胞の死を防止し及び／又は損傷した脳組織の再生を促進する薬剤、サイトカイン調節剤、ミクログリア細胞の活性化レベルを低下させる薬剤、カンナビノイドＣＢ１受容体リガンド、非ステロイド性抗炎症薬、カンナビノイドＣＢ２受容体リガンド、クレアチン、クレアチン誘導体、塩酸プラミペキソールなどのドーパミン受容体アゴニストの立体異性体、繊毛神経栄養因子、繊毛神経栄養因子をコードする薬剤、グリア由来神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子をコードする薬剤、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン３をコードする薬剤、又はそれらの任意の組み合わせ。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の薬剤は、ＡＬＳ又はＦＴＤの１つ以上の症状の治療に使用するのに適した別の治療薬と組み合わせて使用される。例えば、限定されないが、以下の１つ以上を含む：抗生物質（例えば、アミノグリコシド、セファロスポリン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン、マクロライド、アゾリド、メトロニダゾール、ペニシリン、テトラサイクリン、トリメトプリムスルファメトキサゾール、バンコマイシン）、ステロイド（例えば、アンドラン（例、テストステロン）、コレスタン（例、コレステロール）、コール酸（例、コール酸）、コルチコステロイド（例、デキサメタゾン）、エストラエン（例、エストラジオール）、プレグナン（例、プロゲステロン）、麻薬性及び非麻薬性鎮痛薬（例、モルヒネ、コデイン、ヘロイン、ヒドロモルホン、レボルファノール、メペリジン、メタドン、オキシドン、プロポキシフェン、フェンタニル、メタドン、ナロキソン、ブプレノルフィン、ブトルファノール、ナルブフィン、ペンタゾシン）、抗炎症剤（例えば、アルクロフェナック、アルクロメタゾンジプロピオネート、アルゲストンアセトニド、アルファアミラーゼ、アムシナファル、アムシナフィド、アンフェナクナトリウム、塩酸アミプリロース、アナキンラ、アニロラック、アニトラザフェン、アパゾン、バルサラジド二ナトリウム、ベンダザック、ベノキサプロフェン、塩酸ベンジダミン、ブロメライン、ブロペラモル、ブデソニド、カルプロフェン、シクロプロフェン、シンタゾン、クリッププロフェン、クロベタゾールプロピオネート、クロベタゾンプロピオネート、クロメタゾンアセテート、コルメタゾンアセテート、コルトドキソン、デカノエート、デフラザコート、デラトリコート、デポテストステロン、デソニド、デソキシメタゾン、デキサメタゾン、ジプロピオネート、ジクロフェナックカリウム、ジクロフェナックナトリム、ジクロフェナックジアセテート、ジフルミドンナトリウム、ジフルニサル、ジフルプレドナート、ジフトタロン、ジメチルスルホキシド、ドロシノニド、エンドリソン、エンリモマブ、エノリカムナトリウム、エピリゾール、エトドラク、エトフェナメート、フェルビナク、フェナモル、フェンブフェン、フェンクロフェナク、フェンクロラック、フェンドサル、フェンピパロン、フェンチアザク、フェンフェフェンフェンダート、フラザロン、フルアザコート、フルフェナミック酸、フルミゾール、フルニソリドアセテート、フルニキシン、フルニキシンメグルミン、フルオコルチンブチル、フルオロメトロンアセテート、フルカゾン、フルルビプロフェン、フルトフェン、フルチカゾンプロピオネート、フラプロフェン、フロブフェン、ハルシノニド、ハロベタゾールプロピオネート、ハロプレドンアセテート、イブフェナック、イブプロフェン、イブプロフェンアルミニウム、イブプロフェンピコノール、イロニダップ、インドメタシン、インドメタシンナトリウム、インドプロフェン、インドキソール、イントラゾール、酢酸イソフルペレドン、イソキセパック、イソキシカム、ケトプロフェン、塩酸ロフェミゾール、ロモキシカム、ロテプレドノールエタボネート、メクロフェナム酸ナトリウム、メクロフェナム酸、メクロリゾンジブチレート、メフェナム酸、メサラミン、メクセラゾン、メステロロン、メタンドロステノロン、メテノロン、酢酸メテノロン、メチルプレドニゾロンスレプタン酸、モルニフルマート、ナブメトン、ナンドロロン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ナプロキソール、ニマゾン、オルサラジンナトリウム、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサンドロラン、オキサプロジン、オキシフェンブタゾン、オキシメトロン、塩酸パラニリン、ペントサンポリ硫酸ナトリウム、フェンブタゾンナトリウムグリセレート、ピルフェニドン、ピロキシカム、桂皮酸ピロキシカム、ピロキシカムオラミン、ピルプロフェン、プレドナゼート、プリフェロン、プロドリア酸、プロキアゾン、プロキサゾール、プロキサゾール、クエン酸プロキサゾール、リメキソロン、ロマザリット、サルコレックス、サルナセジン、サルサレート、塩化サンギナリウム、セクラゾン、セルメタシン、スタノゾルオール、スドキシカム、スリンダク、スプロフェン、タルメタシン、タルニフルマート、タロサレート、テブフェロン、テニダップ、テニダップナトリウム、テノキシカム、テシカム、テシミド、テストステロン、テストステロン配合物、テトリダミン、チキソコルトールピバレート、トルメチン、トルメチンナトリウム、トリクロニド、トリフルミデート、ジドメタシン、ゾメピラクナトリウム）、又は抗ヒスタミン薬（例、エタノールアミン（例、ジフェンヒドリンカルビノキサミン）、エチレンジアミン（例、トリペレナミンピリラミン））、アルキルアミン（例、クロルフェニラミン、デクスクロルフェニラミン、ブロムフェニラミン、トリプロリジン）、他の抗ヒスタミン、例、アステミゾール、ロラタジン、フェキソフェナジン、ブロフェニラミン、クレマスチン、アセトアミノフェン、プソイドエフェドリン、トリプロリジン）が挙げられる。
一態様において、本発明は、本明細書に記載された方法によって同定された薬剤と、神経変性状態、例えば、ＡＬＳ又はＦＴＤを治療するための、明細書に記載の方法を用いる説明書とを含むキットを特徴とする。
７．製剤及び投与
対象への投与のために、本明細書に記載の薬剤は、経口的に、非経口的に、例えば皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、鼻腔内点滴注入によって、又は鼻、喉及び気管支の粘膜などの粘膜への適用によって投与することができる。脊髄神経膠細胞などの神経系を標的とするための１つの方法は、髄腔内送達によるものである。標的薬剤は周囲のＣＳＦ及び／又は組織に放出され、放出された化合物は急性髄腔内注射直後に脊髄実質に浸透することができる。ＣＮＳ送達を含む薬剤送達戦略に関する包括的な概説については、全内容が参照により本明細書に組み込まれるHo et al., Curr. Opin. Mol. Ther. (1999), 1:336-3443; Groothuis et al., J. Neuro Virol. (1997), 3:387-400; Jan, Drug Delivery Systmes: Technologies and Commercial Opportunities, Decision Resources, 1998を参照されたい。
それらは、単独で又は適切な医薬担体と一緒に投与することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤又は乳剤のような固体又は液体形態であり得る。
薬剤は、有効量の薬剤を含み、１つ以上の医薬として許容される担体（添加剤）及び／又は希釈剤と一緒に製剤化された医薬として許容される組成物に製剤化することができる。薬剤は、以下のものに適合したものを含む、固体又は液体形態での投与用に特別に製剤化することができる：（１）経口投与、例えば、舌への適用のための飲薬（水性又は非水性の溶液又は懸濁液）、ロゼンジ、糖衣錠、カプセル、丸薬、錠剤（例えば、口腔、舌下、及び全身吸収を目的とするもの）、ボーラス、粉末、顆粒、ペースト；（２）非経口投与、例えば、無菌液剤もしくは懸濁剤としての皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射もしくは硬膜外注射、又は徐放性製剤；（３）局所適用、例えば、クリーム、軟膏、又は徐放性パッチもしくは皮膚に塗布されるスプレー；（４）膣内又は直腸内、例えば、ペッサリー、クリーム又はフォーム；（５）舌下；（６）眼球内；（７）経皮的；（８）経粘膜的；又は鼻内。さらに、化合物及び／又は薬剤を患者に埋め込むか、又は薬剤送達システムを用いて注射することができる。例えば、Ｕｒｑｕｈａｒｔら（1984. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236); Lewis, ed. “Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals” (Plenum Press, New York, 1981）；米国特許第３，７７３，９１９号；及び米国特許第３５３，２７０，９６０号を参照されたい。
薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例には、以下が含まれる：（１）糖、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース；（２）デンプン、例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ；（３）セルロース及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース及び酢酸セルロース；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク；（８）賦形剤、例えば、カカオバター及び座剤用ワックス；（９）油、例えば、ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネート及び／又はポリ無水物；（２２）増量剤、例えば、ポリペプチド及びアミノ酸；（２３）血清成分、例えば、血清アルブミン、ＨＤＬ及びＬＤＬ；（２２）Ｃ２～Ｃ１２アルコール、例えば、エタノール；（２３）医薬製剤に用いられる他の非毒性適合物質。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、防腐剤及び酸化防止剤も製剤中に存在させることができる。「賦形剤」、「担体」、「医薬として許容される担体」などの用語は、本明細書では互換的に使用される。
薬学的に許容される抗酸化剤としては、限定されないが、以下が挙げられる：（１）水溶性抗酸化剤、建夫ば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性酸化防止剤、例えば、アスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α－トコフェロールなど；（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など。
ＰＥＧは、その範囲内に、約２０～約２００００００の連結モノマー、典型的には約５０～１０００の連結モノマー、通常は約１００～３００の連結モノマーを含有する任意のエチレングリコールポリマーを含む。ポリエチレングリコールには、様々な数の連結モノマーを含むＰＥＧ、例えば、ＰＥＧ２０、ＰＥＧ３０、ＰＥＧ４０、ＰＥＧ６０、ＰＥＧ８０、ＰＥＧ１００、ＰＥＧ１１５、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ５００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ４６００、ＰＥＧ５０００、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１１０００、ＰＥＧ１２０００、ＰＥＧ２００００００、及びそれらの任意の混合物が含まれる。
薬剤は、ゼラチンカプセル、錠剤形態、糖衣錠、シロップ、懸濁液、局所用クリーム、座薬、注射用溶液、又は使用直前にシロップ、懸濁液、局所用クリーム、座薬又は注射用溶液を調製するためのキットで処方することができる。また、化合物及び／又は薬剤を組成物に含めることができ、それは血流中へのその緩慢な放出を容易にする、例えば、シリコンディスク、ポリマービーズである。
製剤は、便利には単位剤形で提供することができ、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製することができる。技術、賦形剤及び製剤は、一般に、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 1985, 17th edition, Nema et al., PDA J. Pharm. Sci. Tech. 1997 51:166-171に見出される。本発明の製剤を製造する方法は、活性剤を１種以上の賦形剤又は担体と会合させるか又は接触させるステップを含む。一般に、製剤は、１つ以上の薬剤を液体賦形剤又は微粉化した固体賦形剤又はその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで適切な場合には生成物を成形することによって調製される。
調製手順は、医薬調製物の滅菌を含み得る。薬剤は、潤滑剤、保存料、安定化剤、浸透圧に影響を与えるための塩などのような補助剤と混合することができ、それらは薬剤と有害に反応しない。
注射剤形の例には、液剤、懸濁剤及び乳剤が含まれる。注射可能な形態は注射可能な溶液、懸濁液又は乳濁液の即時調製のための滅菌粉末も含む。本発明の薬剤は、通常の食塩水、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ．ＴＭ．ＥＬ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンガー溶液、デキストロース溶液、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、植物油、及び適切なそれらの混合物、ならびに当該技術分野において公知である他の水性担体などの薬学的担体とともに注射することができる。適切な非水性担体はまた使用することができ、例としては、不揮発性油及びオレイン酸エチルが挙げられる。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性でなければならない。それは製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒径の維持により、界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、及び塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。適切な担体は、食塩水中の５％デキストロースである。しばしば、等張性及び化学的安定性を高めるために、緩衝剤及び防腐剤又は他の物質のような添加剤を担体に含めることが望ましい。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の薬剤は、リポソーム内に封入されて投与することができる。そのようなリポソームの製造及びそのようなリポソームへの分子の挿入は、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、当該技術分野において周知である。リポソーム懸濁液（特定の細胞、例えば下垂体細胞を標的とするリポソームを含む）も薬学的に許容される担体として使用することができる。
一実施形態において、薬剤は、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤など、化合物及び／又は薬剤を体からの急速な排泄から保護する担体とともに調製される。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は当業者に明らかであろう。これらの材料はまた、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に入手することもできる。
経口摂取の場合、経口投与用の固形製剤に有用な賦形剤は、当該技術分野で一般に使用されているものであり、有用な例は、賦形剤、例えば、ラクトース、スクロース、塩化ナトリウム、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴムなど、結合剤、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、エチルセルロース、アラビアゴム、シェラック、スクロース、水、エタノール、プロパノール、カルボキシメチルセルロース、リン酸カリウムなど、滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクなど、ならびに通常の既知の着色剤などの添加剤、アルギン酸及びＰＲＩＭＯＧＥＬ（商標）などの崩壊剤などである。
薬剤は、例えば、不活性希釈剤又は同化可能な食用担体とともに経口投与することができ、あるいは硬又は軟殻カプセルに封入することができ、あるいは錠剤に圧縮することができ、あるいはそれらを食事の食べ物とともに直接組み入れることができる。経口治療投与のためには、これらの化合物及び／又は薬剤を賦形剤とともに組み込まれ、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤などの形で使用することができる。そのような組成物及び調製物は少なくとも０．１％の化合物及び／又は薬剤を含むべきである。これらの組成物中の薬剤のパーセンテージは、もちろん変化してもよく、都合よくは単位の重量の約２％から約６０％の間であってもよい。そのような治療上有用な組成物中の化合物及び／又は薬剤の量は、適切な投与量が得られるようなものである。本発明による好ましい組成物は、経口投与単位が約１００～２０００ｍｇの化合物及び／又は薬剤を含むように調製される。
坐剤の製剤化に有用な基剤の例は、カカオバター、ポリエチレングリコール、ラノリン、脂肪酸トリグリセリド、ウィテプゾール（商標、Ｄｙｎａｍｉｔｅ Ｎｏｂｅｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）などの油性基剤である。液体製剤は、添加剤を使用して従来の方法で調製することができる、水性又は油性懸濁液、溶液、シロップ、エリキシルなどの形態であり得る。
組成物は、投薬後の最長期間にわたって循環レベルを最大にするために、ボーラス投与として投与することができる。ボーラス投与後に持続注入を使用することもできる。
薬剤は、エアロゾルの形態で気道に直接投与することもできる。吸入による投与のために、溶液又は懸濁液中の薬剤は、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガス、又はプロパン、ブタンもしくはイソブテンのような炭化水素噴射剤を含む加圧容器又はディスペンサーからのエアロゾルスプレーの形態で送達できる。薬剤はまた、アトマイザー又はネブライザーなどの非加圧形態で投与することもできる。
薬剤は非経口投与することもできる。これらの薬剤の溶液又は懸濁液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中で調製することができる。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの油中混合物中で調製することができる。例示的な油は、石油、動物、植物、又は合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、又は鉱物油である。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連する糖溶液、ならびにプロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのグリコールは、特に注射用溶液にとって好ましい液体担体である。通常の保存及び使用条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐための保存料を含有する。
投与の容易さ及び投薬量の均一性のために、経口又は非経口組成物を投薬単位形態で処方することが有利であり得る。
投与はまた、経粘膜的手段又は経皮的手段によるものであり得る。経粘膜又は経皮投与のためには、浸透させるべき障壁に適した浸透剤を製剤に使用する。そのような浸透剤は、当技術分野において一般的に知られており、例えば、経粘膜投与用には、洗剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレー又は坐剤の使用によって達成することができる。経皮投与のためには、当該分野で一般的に知られているように、薬剤を軟膏、膏薬、ゲル、又はクリームに処方する。
薬剤は、他の薬学的に活性な薬剤と組み合わせて対象に投与することができる。例示的な薬学的に活性な化合物及び／又は薬剤には、限定されないが、全ての完全な内容が参照により本明細書に組み込まれる、Harrison's Principles of Internal Medicine, 13.sup.th Edition, Eds. T. R. Harrison et al. McGraw-Hill N.Y., NY; Physician's Desk Reference, 50.sup.th Edition, 1997, Oradell New Jersey, Medical Economics Co.; Pharmacological Basis of Therapeutics, 8.sup.th Edition, Goodman and Gilman, 1990; United States Pharmacopeia, The National Formulary, USP XII NF XVII, 1990に記載されているものが挙げられる。いくつかの実施形態において、薬学的活性剤は、酪酸塩、バルプロ酸、ヒドロキシ尿素及びリルゾールからなる群から選択される。
薬剤及び他の薬学的に活性な薬剤は、同じ薬学的組成物中又は異なる薬学的組成物中で（同時に又は異なる時点で）対象に投与され得る。例えば、オーロラキナーゼ阻害剤及び神経変性状態を治療するためのさらなる薬剤は、同じ医薬組成物中又は異なる医薬組成物中で（同時に又は異なる時点で）対象に投与することができる。
単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる薬剤の量は一般に治療効果を生じる薬剤の量である。一般に、１００％のうち、この量は、化合物の約０．１％～９９％、好ましくは約５％～約７０％、最も好ましくは１０％～約３０％の範囲である。
錠剤、カプセル剤などはまた、トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、又はゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤；スクロース、ラクトース、サッカリンなどの甘味剤を含有し得る。投与単位形態がカプセル剤である場合、それは、上記の種類の材料に加えて、脂肪油などの液体担体を含み得る。
コーティングとして、又は投与単位の物理的形態を改変するために、他の様々な材料が存在してもよい。例えば、錠剤はシェラック、砂糖、又はその両方でコーティングされてもよい。シロップ剤は、有効成分に加えて、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素、ならびにＣｈｅｒｒｙ－又はオレンジフレーバーなどの香味料を含有してもよい。
医薬組成物は、投与説明書と共に容器、パック、又はディスペンサーに入れることができる。
ＡＬＳ又はＦＴＤを治療するための有効量の化合物及び／又は薬剤を送達する有効性及び投与量に関する指針は、ＡＬＳ又はＦＴＤの動物モデルから得ることができる。例えば、Ｈｓｉｅｈ－Ｌｉら（2000. Nature Genetics 24:66-70）及びそこに引用されている参考文献に記載されているものを参照されたい。
毒性及び治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致命的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に有効な用量）を決定するために、細胞培養物又は実験動物における標準的な製薬手順によって決定できる。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、それは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。
細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに使用するための投与量の範囲を処方するのに使用することができる。そのような化合物及び／又は薬剤の投与量は、ほとんど又は全く毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、採用される剤形及び利用される投与経路に応じてこの範囲内で変わり得る。
有効量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養において決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大半減抑制を達成する治療薬の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて用量を処方することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定の投与量の効果は適切なバイオアッセイによってモニターすることができる。適切なバイオアッセイの例には、ＤＮＡ複製アッセイ、転写に基づくアッセイ、ＧＤＦ－８結合アッセイ、及び免疫学的アッセイが含まれる。
投与量は医師によって決定され、必要に応じて治療の観察された効果に適するように調整されてもよい。一般に、組成物は、化合物及び／又は薬剤が、１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇの用量で与えられるように投与される。抗体化合物及び／又は薬剤については、１つの好ましい投与量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重（一般的には１０ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ）である。抗体が脳内で作用するのであれば、通常５０ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの投与量が適切である。
治療の期間及び頻度に関して、治療が治療上の利益を提供している時期を決定し、投与量を増減するか、投与頻度を増減するか、治療を中止するか、治療を再開するか、又は治療計画にその他の変更を加えるかを決定するために、熟練した臨床医は対象をモニターすることが典型的である。投与スケジュールは、ポリペプチドに対する対象の感受性などのいくつかの臨床的要因に応じて、週に１回から毎日に変えることができる。所望の投与量を一度に投与するか、又は例えば２～４回に分けた投与量などの小投与量に分割して、たとえば１日を通して他の適切な間隔で、又は他の適切なスケジュールで投与することができる。そのような分割用量は単位剤形として投与することができる。投与スケジュールの例は、週１回、週２回、週３回、毎日、毎日２回、毎日３回、又は毎日４回以上の投与である。
８．キット
本明細書に記載の薬剤はキットで提供することができる。キットは、（ａ）薬剤、例えば薬剤を含む組成物、及び（ｂ）情報資料を含む。情報資料は、本明細書に記載の方法及び／又は本明細書に記載の方法のための薬剤の使用に関連する説明的、説明的、マーケティング的又は他の資料であり得る。例えば、情報資料は、運動ニューロンの生存を促進し、神経変性状態（例えば、ＡＬＳ又はＦＴＤ）、又は神経変性状態の少なくとも１つの症状、又は運動ニューロンの機能不全もしくは減少に関連する状態を治療又は予防するための薬剤の投与方法を記載する。
一実施形態において、情報資料は、適切な方法で、例えば、適切な用量、剤形、又は投与様式（例えば、本明細書に記載の用量、剤形、又は投与様式）で薬剤を投与するための説明書を含むことができる。別の実施形態において、情報資料は適切な対象、例えばヒト、例えば成人を識別するための説明書を含むことができる。キットの情報資料はその形態に限定されない。多くの場合、情報資料、例えば、説明書は、印刷物、例えば、印刷されたテキスト、図面、及び／又は写真、例えば、ラベル又は印刷されたシートにおいて提供される。しかしながら、情報資料はまた、点字、コンピュータ可読資料、ビデオ記録、又は音声記録などの他のフォーマットで提供することもできる。別の実施形態において、キットの情報資料は、リンク又は連絡先情報、例えば、物理アドレス、電子メールアドレス、ハイパーリンク、ウェブサイト、又は電話番号であり、キットのユーザーはモジュレータ及び／又はモジュレータに関する実質的な情報及び／又は本明細書に記載の方法におけるその使用を入手できる。当然に、情報資料はフォーマットの任意の組み合わせで提供することもできる。
薬剤に加えて、キットの組成は、他の成分、例えば、溶媒又は緩衝液、安定化剤又は保存剤、及び／又は本明細書に記載の状態又は障害（例えば膵島質量の増加）を治療するための第２の薬剤を含み得る。あるいは、他の成分をキットに含めることができるが、薬剤とは異なる組成物又は容器に入れることができる。そのような実施形態において、キットは、薬剤と他の成分とを混合するための、又は薬剤を他の成分と一緒に使用するための説明書を含むことができる。
薬剤は、任意の形態、例えば液体、乾燥形態又は凍結乾燥形態で提供することができる。薬剤は、実質的に純粋及び／又は無菌であることが好ましい。薬剤が溶液で提供されるとき、その溶液は水溶液であるのが好ましく、滅菌水溶液が好ましい。化合物及び／又は薬剤が乾燥形態として提供される場合、再構成は一般に適切な溶媒の添加による。溶媒、例えば滅菌水又は緩衝液は、キットに任意に提供され得る。
キットは、化合物及び／又は薬剤を含有する組成物のための１つ以上の容器を含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、（例えば、組成物中の）薬剤のための別々の容器、仕切り又はコンパートメント、及び情報資料を含む。例えば、（例えば、組成物中の）薬剤は、ボトル、バイアル、又はシリンジに入れることができ、情報資料は、プラスチック製のスリーブ又はパケットに入れることができる。他の実施形態において、キットの別々の要素は単一の分割されていない容器内に収容される。例えば、（例えば、組成物中の）薬剤は、ラベルの形態で情報資料を付着させたボトル、バイアル又はシリンジに入れられる。いくつかの実施形態において、キットは、それぞれが１つ又は複数の単位剤形（たとえば本明細書に記載の剤形）の（たとえば組成物中に）入っている複数（たとえばパック）の個々の容器を含む。例えば、キットは、各々が単一単位用量の薬剤を含有する複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケット、又はブリスターパックを含む。キットの容器は気密性及び／又は防水性であり得る。
化合物及び／又は薬剤（例えば組成物中）は、対象、例えば成人対象、例えば運動ニューロンを必要とする対象に投与することができる。この方法は、例えば運動ニューロンの生存を評価するために対象を評価すること、及びそれによって運動ニューロンが減少している又は運動ニューロンの死もしくは機能不全の傾向にあると対象を同定することを含み得る。
本発明を容易に理解しそして実用的効果を発揮させることができるように、特定の好ましい実施態様を以下の非限定的実施例によって説明する。
実験
ＢｉｏＩｄとＩｐは、サイクリンＦの相互作用パートナーとして内因性ＴＤＰ－４３を同定する
生きているＨＥＫ２９３細胞において、内因性タンパク質をＢｉｏＩＤ－サイクリンＦによって標識した（図１）。ビオチン化タンパク質をストレプトアビジンビーズを用いて精製し、トリプシン消化し、質量分析法を用いて同定した。ラベルフリーアプローチを用いて、ＢｉｏＩＤ／ＭＳとＩＰ／ＭＳの間で共通しているタンパク質を同定した。ＩｇＧ対照に結合したタンパク質をタンパク質混入物とみなした。このアプローチを用いて、ユビキチンリガーゼ活性に必要とされるサイクリンＦの安定な相互薬剤（Ｓｋｐ１及びＣｕｌ１）を同定することが可能であった。さらに、４３ｋＤａのＴＡＲＤＮＡ結合タンパク質（ＴＤＰ４３）に属するペプチドが注目され、この結果はイムノブロッティングを用いて確認された（図１）。
サイクリンＦとＴＤＰ－４３との間の相互作用は、ＨＥＫ２９３細胞及びＮｅｕｒｏ２ａ細胞における古典的免疫沈降法を用いてさらに検証された。サイクリンＦ－フラッグ及びＴＤＰ４３－ＨＡをＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトした。抗フラッグＭ２抗体を用いたサイクリンＦの免疫沈降は、サイクリンＦ－フラッグと同時免疫沈降したＴＤＰ－４３を明らかにした（図２）。さらに、サイクリンＦーｍＣｈｅｒｒｙは、ニューロン様Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞において内因性ＴＤＰ－４３と免疫共沈降することができ、ＴＤＰ－４３はサイクリンＦーｍＣｈｅｒｒｙを免疫共沈降させることができた（図２）。
サイクリンＦはＴＤＰ４３の細胞内レベルを調節する
ＴＤＰ－４３は、Ｔ－ＲＥｘ Ｆｌｐ－Ｉｎ ＨＥＫ２９３細胞において安定的に過剰発現され、かなりのレベルの細胞内ＴＤＰ４３をもたらした。ｍＣｈｅｒｒｙ－サイクリンＦをこれらの細胞に一過性にトランスフェクトした場合（一部の細胞のみがｍＣｈｅｒｒｙ－サイクリンＦを発現するように）、より低いＴＤＰ－４３強度がｍＣｈｅｒｒｙ－サイクリンＦを同時発現する細胞に存在することがわかった（図３）。逆に、安定的にトランスフェクトされたＴＤＰ４３ Ｔ－ＲＥｘ Ｆｌｐ－Ｉｎ ＨＥＫ２９３細胞において内因性サイクリンＦがサイレンシングされた（ｓｉＲＮＡを用いて）場合、ＴＤＰ－４３のレベルはｓｉＲＮＡ非影響細胞と比較して増加した（ネガティブコントロール）（図４）。散発性ＡＬＳ患者組織では、健常対照組織と比較して、運動ニューロンにおいて低レベルのサイクリンＦ発現が観察された（図５）。
材料及び方法
ＢｉｏＩＤ
簡単に説明すると、ＦＬＡＧ－ＢｉｒＡ＊－サイクリンＦをコードする遺伝子をｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ発現ベクターにクローニングした。ＦＬＡＧ－ＢｉｒＡ＊－サイクリンＦを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、Ｆｌｐ－ＩｎＴ－Ｒｅｘシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて作製した。安定にトランスフェクトした細胞を、１０％ＦＢＳ、抗生物質（１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍＬペニシリン）及び２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢゴールド（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を含むＤＭＥＭ中で選択し、５％ＣＯ2及び湿度９５％。の３７℃インキュベーター中に保持した。内因性タンパク質の遺伝子発現及びビオチン化のために、１μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）及び５０μｇ／ｍＬのビオチン（Ｓｉｇｍａ）を細胞培養培地に同時に添加した。２４時間後、細胞を氷冷ＰＢＳ中に回収し、３０００×ｇで３分間ペレット化した。ペレットをＰＢＳで２回洗浄し、－８０℃で急速冷凍した。細胞ペレットを修飾ＲＩＰＡ溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．１％ＳＤＳ、ターボヌクレアーゼ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ））中で４℃で１時間溶解した。その後、プローブを超音波処理し（１０秒、設定３、ＢｒａｎｓｏｎＳｏｎｉｆｉｅｒ４５０）、タンパク質凝集体を破壊する。溶解物を３５，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清をストレプトアビジン結合磁気ビーズ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共に４℃で３時間インキュベートした。磁石を使用して磁気ビーズを再捕捉し、次いで５０ｍＭの炭酸アンモニウムアンモニウム（ｐＨ８．３）中で６回洗浄した。ビーズによって捕捉されたタンパク質を１０ｍＭジチオトレイトール中で５０℃で３０分間還元した。アルキル化のために、２５ｍＭのヨードアセトアミドを室温で細胞溶解物に添加した。試料を３０分間暗所に保管した。アルキル化した後、試料を３７℃で一晩トリプシン消化（シークエンシンググレードの修飾トリプシン、Ｐｒｏｍｅｇａ）に供した。トリプシンペプチドを含有する上清を集め、乾燥した。凍結乾燥ペプチドを０．１％ギ酸に再懸濁し、ＭＳを用いて分析した。
ＦＬＡＧ及びｍＣｈｅｒｒｙアフィニティー精製
ＨＥＫ２９３又はＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞のいずれかに、リポフェクタミン２０００を用いてｍＣｈｅｒｒｙ－サイクリンＦ、Ｆｌａｇ－サイクリンＦ又はＴＤＰ－４３－ＨＡをコードする構築物をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を２４時間後に回収し、細胞ペレットをＮＰ４０溶解緩衝液（１％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル及びｐｈｏｓＳＴＯＰ（Ｒｏｃｈｅ））に再懸濁した。細胞再懸濁物をプローブ音波処理（１０秒間、設定３、Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０）してタンパク質凝集体を破壊した。得られた溶解物を１４，０００×ｇで３０分間遠心分離して細胞片を除去した。各上清の５００μｇアリコートを２μｇの抗ＦＬＡＧ Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）、１μｇの抗ｍＣｈｅｒｒｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）又は１μｇの抗ＴＤＰ４３（Ａｂｎｏｖａ）のいずれかと共に４℃で１時間インキュベートした。抗体－タンパク質複合体を捕捉するために、上清をプロテインＡ／Ｇ磁気ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）と共に４℃で２時間インキュベートした。磁石を使用してビーズを集め、そしてＮＰ４０溶解緩衝液中で３回洗浄した。ウエスタンブロット分析のために、ビーズを３０ｍＭＤＴＴを含有する１×ＬＤＳ緩衝液に再懸濁し、そして９５℃で５分間煮沸した。
ＳＤＳ ＰＡＧＥ及びイムノブロッティング
等量のタンパク質を４～１２％ビスートリスＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で分離した。トランスブロットターボセミドライトランスファーセルを用いてタンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写した。一次抗体と共に４℃で一晩又は室温で１時間インキュベートする前に、膜をＰＢＳＴ中５％粉乳中で３０分間ブロックした。この研究に用いた一次抗体は、ウサギポリクローナル抗サイクリンＦ（１：３００；カタログ番号ｓｃ－９５２、サンタクルーズバイオテクノロジー）、マウスモノクローナル抗ｍＣｈｅｒｒｙ（１：３００；カタログ番号６３２５４３、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、マウスモノクローナル抗ＴＤＰ－４３（１：１０００；カタログ番号Ｈ０００２３４３５－Ｍ０１、Ａｂｎｏｖａ）、マウスモノクローナルβ－チューブリン（１：１０００；カタログ番号Ｔ５１６８、Ｓｉｇｍａ）であった。インキュベーション後、膜をＰＢＳ－Ｔ中で１０分間３回洗浄した後、蛍光標識したＩＲＤｙｅ８００ＣＷを用いた。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１５，０００；カタログ番号９２６－３２２１１、ＬＩ－ＣＯＲ）二次抗体をＲＴで３０分間適用した。タンパク質をＬｉ－ＣｏｒＯｄｙｓｓｅｙイメージングシステムを用いて適切な波長で画像化した。
免疫蛍光
ＨＡタグ付きＴＤＰ－４３を安定的に発現するＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ－Ｉｎ Ｔ－Ｒｅｘ細胞をカバーガラス上で増殖させ、次いでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｍＣｈｅｒｒｙ－サイクリンＦをコードする構築物でトランスフェクトした。２４時間後、細胞を４％ホルムアルデヒド中で１５分間固定し、そしてＰＢＳ中で洗浄した。細胞を０．２％トリトンＸ－１００を含有するＰＢＳを用いて１０分間透過処理し、次いで０．２Ｍグリシンを含む１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴを用いて３０分間ブロックした。透過処理した細胞を１：１０００の抗ＴＤＰ－４３（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ）と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、試料を種特異的なＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、次いでＨｏｅｃｈｓｔと共にインキュベートした。ｍＣｈｅｒｒｙ－サイクリンＦ及びＴＤＰ－４３をＺｅｉｓｓ顕微鏡を用いて画像化した。
同定された全ての特許及び他の刊行物は、例えば、本発明に関連して使用され得るそのような刊行物に記載された方法論を記載及び開示する目的で、参照により本明細書に明確に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供されている。この点に関しては、先行発明のために、又は他の何らかの理由で、本発明者らがそのような開示に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。これらの文書の日付に関する記述又は内容に関する表現はすべて、出願人が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付又は内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。
実施例１
野生型ｃｃｎｆ導入遺伝子の発現はＡＬＳに関連する突然変異ＴＤＰ－４３対立遺伝子を発現するニューロンにおけるＴＤＰ－４３の病理学的レベルを低下させる
ＴＤＰ－４３A315Tマウスは、ニューロン誘導性プロモーター系の制御下で病原性Ａ３１５Ｔ ＡＬＳ突然変異を有するヒトＴＤＰ－４３を発現する（Ｋｅら、２０１５、上記）。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の非存在下では、ＴＤＰ－４３A315Tマウスは、運動皮質及び脊髄を含むＣＮＳのニューロンにおいて導入遺伝子を発現する。ＴＤＰ－４３A315Tマウスは、早期発症型及び進行性の運動障害及び筋萎縮を発症する。生化学的には、不溶性の細胞質ＴＤＰ－４３の蓄積が、著しい神経細胞の喪失と共にＴＤＰ－４３A315Tマウスにおいて見られた。
野生型ＣＣＮＦ発現が不溶性細胞質ＴＤＰ－４３の蓄積を救済できるかどうかを調べるために、ＡＡＶ９－ＣＣＮＦ（１×１０12ウイルス粒子）を新生ＴＤＰ－４３A315Tトランスジェニックマウスに注射し、４週齢でＤｏｘをマウスの食餌から除去して、ＴＤＰ－４３A315T発現を誘導した。通常の飼育条件で４週間後、マウスを４％パラホルムアルデヒドで心臓灌流し、固定した脳切片を免疫組織化学的に評価した。ＴＤＰ－４３A315Tを検出するためにヒト特異的ＴＤＰ－４３抗体を用いて免疫標識を行い、サイクリンＦをＧＦＰレポーターに融合させる。予想通り、ＡＡＶ９エンプティ構築物を注射したマウスでは、ニューロンにおいてＴＤＰ－４３A315T（赤）の強い核発現が観察された（図６参照）。しかしながら、ＡＡＶ９－ＣＣＮＦWTを注射したマウスでは、サイクリンＦWT（緑色）を発現するニューロンにおいてＴＤＰ－４３A315T（赤色）の発現はほとんど見られなかった。
これらのデータは、ＡＡＶ９のような送達ベクターを用いてＣＣＮＦWTを治療的に送達することが可能であり、それがニューロン中のＴＤＰ－４３の病理学的レベルを実質的に低下させることを実証する。
本明細書中のいずれかの参考文献の引用は、そのような参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。
本明細書を通して、その目的は、本発明をいずれか１つの実施形態又は特定の特徴の集まりに限定することなく、本発明の好ましい実施形態を説明することであった。したがって、当業者は、本開示に照らして、例示された特定の実施形態において、本発明の範囲から逸脱することなく様々な修正及び変更を加えることができることを理解するであろう。 そのような修正及び変更はすべて、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

Claims (9)

  1. 対照と比較してサイクリンＦのレベル及び活性が低下した運動ニューロンを有する対象における神経変性状態を治療するための組成物の製造における、サイクリンＦをコードする核酸配列の発現を増加又は刺激する薬剤の使用であって、ここで、神経変性状態が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）から選択され、前記薬剤が、運動ニューロンにおいて作動可能であるプロモーターに作動可能に連結されたサイクリンＦをコードする核酸配列を含む構築物を含む、使用。
  2. 前記構築物がウイルスベクターの形態である、請求項１に記載の使用。
  3. 前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２に記載の使用。
  4. 前記治療が、対照と比較してサイクリンＦのレベル及び活性が低下した運動ニューロンの変性を阻害することを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の使用。
  5. 前記治療が、対照と比較してサイクリンＦのレベル及び活性が低下した運動ニューロンにおける、不溶性ＴＤＰ－４３の細胞質蓄積を阻害することを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の使用。
  6. 前記治療が、対照と比較してサイクリンＦのレベル及び活性が低下した運動ニューロンの生存を促進することを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の使用。
  7. 対照と比較してサイクリンＦのレベル及び活性が低下した運動ニューロンにおける不溶性ＴＤＰ－４３の細胞質蓄積を阻害するための組成物の製造における、サイクリンＦをコードする核酸配列の発現を増加又は刺激する薬剤の使用であって、前記薬剤が、運動ニューロンにおいて作動可能であるプロモーターに作動可能に連結されたサイクリンＦをコードする核酸配列を含む構築物を含む、使用。
  8. 前記構築物がウイルスベクターの形態である、請求項７に記載の使用。
  9. 前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項８に記載の使用。
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