JP7304030B2 - Method for predicting efficacy and prognosis of cancer treatment, and method for selecting therapeutic means - Google Patents
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Description
本発明は腫瘍組織内の遺伝子発現量に基づく腫瘍内免疫状態の分析方法に関する。 The present invention relates to a method for analyzing intratumoral immune status based on gene expression levels in tumor tissue.
がんの治療手段として様々な手法が開発されており、従来の化学療法や放射線治療に加えて、分子標的薬や免疫機構に着目された手法も開発されている。例えば、特定のがん遺伝子の異常に対する分子標的薬がある。すべてのがん患者が投与対象になるのではなく、標的となる遺伝子変異の有無を事前に解析しておくことが推奨されており、このような目的に使用される試薬はコンパニオン診断薬と呼ばれている。このようなコンパニオン診断薬として、例えば、コバス（登録商標）ＥＧＦＲ変異検出キットｖ２．０（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）が市販されている。また、がん細胞表面に発現している抗原分子を標的とした抗体治療薬がある。トラスツズマブは抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体であり、モガリズムマブは抗ＣＣＲ４抗体である。いずれも、がん細胞表面に標的分子が発現していることを確認するために、それぞれに対して、ダコ ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ ＩＩ（登録商標）とポテリジオテスト（登録商標）がコンパニオン診断薬として利用されている。 Various methods have been developed as cancer treatment methods, and in addition to conventional chemotherapy and radiotherapy, methods focusing on molecular-targeted drugs and immune mechanisms have also been developed. For example, there are molecular targeted drugs for specific oncogene abnormalities. Not all cancer patients are subject to administration, but it is recommended that the presence or absence of target gene mutations be analyzed in advance, and reagents used for this purpose are called companion diagnostic agents. is As such a companion diagnostic agent, for example, Cobas (registered trademark) EGFR Mutation Detection Kit v2.0 (manufactured by Roche Diagnostics) is commercially available. There are also antibody therapeutic agents that target antigen molecules expressed on the surface of cancer cells. Trastuzumab is an anti-HER2 monoclonal antibody and mogalismumab is an anti-CCR4 antibody. In both cases, Dako HercepTest II (registered trademark) and Potelligiotest (registered trademark) are used as companion diagnostic agents for each to confirm that the target molecule is expressed on the surface of cancer cells. there is
近年、がん細胞を排除しようとする生体の免疫機構を回避する働きをがん細胞が巧みに利用していること、さらにがん細胞自身が腫瘍内に免疫を抑制する環境を形成していることが明らかになり、このような免疫回避機構や免疫抑制状態を解除することで、抗腫瘍効果を得るための「免疫チェックポイント阻害薬」が開発された。また、積極的にがん細胞を排除する能力を有する人工的に作成された細胞、例えば、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）、ＴＣＲ遺伝子改変Ｔ細胞（ＴＣＲ－Ｔ）が知られている。また、免疫細胞とがんとを架橋する抗体である二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ）や、腫瘍組織内で選択的に増殖・拡散して腫瘍組織を破壊するウイルス（腫瘍溶解性ウイルス）を利用する方法も知られている。このような治療手段においても、治療の奏功性を上げられる事前の評価手段の開発が求められている。 In recent years, it has been found that cancer cells skillfully use the ability to evade the body's immune system, which attempts to eliminate cancer cells, and that cancer cells themselves create an environment within the tumor that suppresses immunity. This has become clear, and "immune checkpoint inhibitors" have been developed to obtain antitumor effects by releasing such immune evasion mechanisms and immunosuppressive states. Also known are artificially produced cells that have the ability to actively eliminate cancer cells, such as chimeric antigen receptor T cells (CAR-T) and TCR gene-modified T cells (TCR-T). there is In addition, bispecific T cell-inducing antibodies (BiTE), which are antibodies that bridge immune cells and cancer, and viruses that selectively proliferate and spread within tumor tissue to destroy tumor tissue (oncolytic virus ) is also known. For such therapeutic means, there is also a demand for the development of prior evaluation means that can improve the effectiveness of treatment.
一方、免疫状態の表現にも様々な方法があり、レーダーチャート形式での表示法も開発されている。評価軸の設定にてその意味するところは異なり、がん免疫サイクルの状態を示すためのレーダーチャート（非特許文献１）、血中サイトカインの観点から作成されたレーダーチャート（非特許文献２）の報告などがある。 On the other hand, there are various methods for expressing immune status, and a display method in the form of a radar chart has also been developed. The setting of the evaluation axis has different meanings, a radar chart for indicating the state of the cancer immune cycle (Non-Patent Document 1), and a radar chart created from the viewpoint of blood cytokines (Non-Patent Document 2). There are reports.
本発明の課題は、がんの免疫療法の奏功性を上げるための新たな評価手段を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a new evaluation means for increasing the efficacy of cancer immunotherapy.
本発明者らは、上記事情のもと、免疫治療手段の奏功性に影響を及ぼす要因に腫瘍内免疫状態が関与していると推測し、鋭意研究した。その結果、がん免疫サイクルに関連する遺伝子群および腫瘍増殖に関連する遺伝子群の発現量が腫瘍内免疫状態に関連することを見出し、該遺伝子発現量をスコア化して該スコア値に基づき腫瘍組織サンプルの腫瘍内免疫状態を評価し、該評価によって各種の治療手段によるがん患者の治療効果および予後を予測することができることを見出した。 Under the circumstances described above, the present inventors presumed that the intratumoral immune state was involved in the factors affecting the efficacy of immunotherapeutic means, and conducted intensive research. As a result, it was found that the expression levels of a gene group related to the cancer immune cycle and a gene group related to tumor growth are related to the intratumoral immune state, and the gene expression levels were scored, and based on the score value, the tumor tissue We have evaluated the intratumoral immune status of samples and found that the evaluation can predict the therapeutic efficacy and prognosis of cancer patients with various therapeutic modalities.
したがって、本発明は、下記の態様を提供する。
（１）複数のがん患者由来の腫瘍組織サンプルの、がん免疫サイクルに関連する遺伝子群および腫瘍増殖に関連する遺伝子群の遺伝子発現量のスコア値による、腫瘍内免疫状態の評価に基づいて、一のがん患者の治療効果および予後を予測することを特徴とする、がん患者の治療効果および予後の予測方法、
（２）がん免疫サイクルに関連する遺伝子群として遺伝子セット：Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｐｒｉｍｉｎｇ＆ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｔ－ｃｅｌｌｓ、ＩＦＮ－γ ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｅｌｌｓ、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、およびＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ、腫瘍の増殖に関連する遺伝子群として遺伝子セット：Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、およびＧｌｙｃｏｌｙｓｉｓ、の少なくとも９個の遺伝子セットの遺伝子発現量のスコア値を用いることを特徴とする、上記（１）記載の方法、
（３）スコア値がｓｉｎｇｌｅ ｓａｍｐｌｅ Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓによる統計処理に基づき算出されることを特徴とする、上記（１）または（２）記載の方法、
（４）スコア値に基づき腫瘍組織サンプルの腫瘍内免疫状態を２以上のクラスターに分類することを特徴とする、上記（１）～（３）のいずれか１項記載の方法、
（５）腫瘍組織サンプルが胃がんサンプルであり、スコア値に基づき腫瘍組織サンプルの腫瘍内免疫状態をＣＯＬＤ、ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥ、ＨＯＴ－ＩＤ、およびＨＯＴ－ＭＣの４つのクラスターに分類することを特徴とする、上記（４）記載の方法、
（６）前記複数のがん患者由来の腫瘍組織サンプルのスコア値が既存のサンプル由来のスコア値を含んでいてもよい、上記（１）～（５）のいずれか１項記載の方法、
（７）前記複数のがん患者由来の腫瘍組織サンプルの前記遺伝子発現量のスコア値と腫瘍内免疫状態の評価に基づいて、腫瘍組織サンプルの腫瘍内免疫状態を評価するためのアルゴリズムを作成し、該アルゴリズムに基づいて一のがん患者由来の腫瘍組織サンプルの腫瘍内免疫状態を評価し、該腫瘍内免疫状態の評価に基づいて該一のがん患者の治療効果および予後を予測することを特徴とする、上記（１）～（６）のいずれか１項記載の方法、
（８）前記腫瘍内免疫状態の評価に基づいて該一のがん患者の治療手段を選択することをさらに含む、上記（１）～（７）のいずれか１項記載の方法、
（９）腫瘍内免疫状態をＣＯＬＤ、ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥ、ＨＯＴ－ＩＤ、ＨＯＴ－ＭＣの４群に分類することを特徴とする、胃がんサンプルの腫瘍内免疫状態の評価方法、（１０）上記（９）記載の方法による腫瘍内免疫状態の評価に基づいて治療手段を選択することを特徴とする、腫瘍治療手段の選択方法、
（１１）腫瘍内免疫状態の評価がＣＯＬＤの場合、人工的に抗原認識能を付与させた免疫系細胞または腫瘍選択的溶解能を有するウイルスの投与よる治療手段とすることを特徴とする、上記（１０）記載の方法、
（１２）腫瘍内免疫状態の評価がＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥの場合、手術による切除または免疫チェックポイント阻害剤とＴＧＦ－β阻害剤の併用投与による治療手段とすることを特徴とする、上記（１０）記載の方法、
（１３）腫瘍内免疫状態の評価がＨＯＴ－ＩＤの場合、手術による切除後、比較的予後が良好で、化学療法などの標準治療の効果が期待できることを特徴とする、上記（１０）記載の方法、
（１４）腫瘍内免疫状態の評価がＨＯＴ－ＭＣの場合、早期に免疫チェックポイント阻害剤の投与による治療手段とすることを特徴とする、上記（１０）記載の方法、
（１５）上記（９）記載の方法による腫瘍内免疫状態の評価に基づいて治療予後を予測することを特徴とする、治療予後の予測方法、
（１６）腫瘍内免疫状態の評価がＨＯＴ－ＩＤの場合、生存率が高いと予測することを特徴とする、上記（１５）記載の方法、
（１７）少なくとも、Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｐｒｉｍｉｎｇ＆ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｔ－ｃｅｌｌｓ、ＩＦＮ－γ ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｅｌｌｓ、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ、Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎの９つの遺伝子セットの発現量に基づき、腫瘍組織サンプルの腫瘍内免疫状態を可視化する方法、
（１８）可視化手段がレーダーチャート形式であることを特徴とする、上記（１７）記載の方法、
（１９）胃がんサンプルにおける遺伝子セットＴ－ｃｅｌｌｓのイムノグラムスコア値が３未満の場合、該胃がんサンプルの腫瘍内免疫状態をＣＯＬＤと判定することを特徴とする、胃がんの腫瘍内免疫状態の評価方法、
（２０）胃がんサンプルにおける遺伝子セットＴ－ｃｅｌｌｓのイムノグラムスコア値が３未満であり、かつ遺伝子セットＩＦＮ－γ ｒｅｓｐｏｎｓｅのイムノグラムスコア値が３．５未満の場合、該胃がんサンプルの腫瘍内免疫状態をＣＯＬＤと判定することを特徴とする、上記（１９）記載の方法、
（２１）さらに、胃がんサンプルにおける遺伝子セットＴ－ｃｅｌｌｓのイムノグラムスコア値が３以上であり、かつ遺伝子セットＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎのイムノグラムスコア値が２．５未満の場合、該胃がんサンプルの腫瘍内免疫状態をＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥと判定することを特徴とする、上記（１９）または（２０）記載の方法、
（２２）さらに、胃がんサンプルにおける遺伝子セットＴ－ｃｅｌｌｓのイムノグラムスコア値が３以上であり、かつ遺伝子セットＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎのイムノグラムスコア値が２．５以上であり、かつ、遺伝子セットＧｌｙｃｏｌｙｓｉｓのイムノグラムスコア値が２．５未満の場合、該胃がんサンプルの腫瘍内免疫状態をＨＯＴ－ＩＤと判定することを特徴とする、上記（２１）記載の方法、
（２３）さらに、胃がんサンプルにおける遺伝子セットＴ－ｃｅｌｌｓのイムノグラムスコア値が３以上であり、かつ遺伝子セットＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎのイムノグラムスコア値が２．５以上であり、かつ遺伝子セットＧｌｙｃｏｌｙｓｉｓのイムノグラムスコア値が２．５以上の場合、該胃がんサンプルの腫瘍内免疫状態をＨＯＴ－ＭＣと判定することを特徴とする、上記（２２）記載の方法、
（２４）さらに胃がんサンプルにおける遺伝子セットＩＦＮ－γのイムノグラムスコア値が３．５以上である、上記（２１）～（２３）のいずれか１項記載の方法、
（２５）上記（２３）または（２４）記載の方法によって得られた胃がんサンプルの腫瘍内免疫状態の評価結果に基づいて治療効果および予後を予測することを特徴とする、胃がん患者の治療効果および予後の予測方法。
Accordingly, the present invention provides the following aspects.
(1) Based on the evaluation of the intratumoral immune state by the score value of the gene expression level of the gene group related to the cancer immune cycle and the gene group related to tumor growth in tumor tissue samples derived from multiple cancer patients , a method for predicting the therapeutic effect and prognosis of a cancer patient, characterized by predicting the therapeutic effect and prognosis of a cancer patient;
(2) Gene set as gene group related to cancer immune cycle: Innate immunity, Priming & activation, T-cells, IFN-γ response, Inhibitory cells, Inhibitory molecules, and Recognition of tumor cells, as gene group related to tumor growth The method according to (1) above, characterized by using score values of gene expression levels of at least nine gene sets of gene sets: Proliferation and Glycolysis;
(3) The method according to (1) or (2) above, wherein the score value is calculated based on statistical processing by single sample Gene Set Enrichment Analysis,
(4) The method according to any one of (1) to (3) above, wherein the intratumor immune status of the tumor tissue sample is classified into two or more clusters based on the score value;
(5) the tumor tissue sample is a gastric cancer sample, and the intratumor immune status of the tumor tissue sample is classified into four clusters of COLD, INTERMEDIATE, HOT-ID, and HOT-MC based on the score value; the method described in (4) above;
(6) The method according to any one of (1) to (5) above, wherein the score values of the tumor tissue samples derived from the plurality of cancer patients may include score values derived from existing samples;
(7) creating an algorithm for evaluating the intratumoral immune state of the tumor tissue sample based on the score value of the gene expression level and the evaluation of the intratumoral immune state of the tumor tissue samples derived from the plurality of cancer patients; , evaluating the intratumoral immune status of a tumor tissue sample derived from one cancer patient based on the algorithm, and predicting the therapeutic effect and prognosis of the one cancer patient based on the evaluation of the intratumoral immune status The method according to any one of (1) to (6) above, characterized by
(8) The method according to any one of (1) to (7) above, further comprising selecting a therapeutic means for the one cancer patient based on the evaluation of the intratumoral immune status;
(9) A method for evaluating the intratumoral immune status of a gastric cancer sample, characterized by classifying the intratumoral immune status into four groups of COLD, INTERMEDIATE, HOT-ID, and HOT-MC, (10) described in (9) above. A method for selecting a therapeutic modality for tumors, characterized in that the therapeutic modality is selected based on an assessment of intratumoral immune status by the method of
(11) When the intratumor immune status is evaluated as COLD, the therapeutic means is administration of immune system cells artificially endowed with antigen recognition ability or a virus with tumor-selective lysis ability. (10) the method described,
(12) The method according to (10) above, wherein when the evaluation of intratumoral immune status is INTERMEDIATE, surgical resection or combined administration of an immune checkpoint inhibitor and a TGF-β inhibitor is used as a therapeutic means. ,
(13) According to (10) above, when the intratumoral immune status is evaluated by HOT-ID, the prognosis after surgical resection is relatively good, and the effects of standard treatments such as chemotherapy can be expected. Method,
(14) The method according to (10) above, wherein when the intratumoral immune status is evaluated for HOT-MC, early administration of an immune checkpoint inhibitor is used as a means of treatment;
(15) A method for predicting therapeutic prognosis, which comprises predicting therapeutic prognosis based on the evaluation of intratumoral immune status by the method described in (9) above;
(16) The method according to (15) above, wherein the survival rate is predicted to be high when the intratumoral immune status is evaluated as HOT-ID.
(17) Expression of at least 9 gene sets: Innate immunity, Priming & activation, T-cells, IFN-γ response, Inhibitory cells, Inhibitory molecules, Recognition of tumor cells, Glycolysis, and Proliferation Intratumoral immunization of tumor tissue samples based on quantity how to visualize the state,
(18) The method according to (17) above, wherein the visualization means is in the form of a radar chart;
(19) A method for evaluating the intratumoral immune status of gastric cancer, comprising determining the intratumoral immune status of the gastric cancer sample as COLD when the immunogram score value of the gene set T-cells in the gastric cancer sample is less than 3. ,
(20) When the immunogram score value of the gene set T-cells in the gastric cancer sample is less than 3 and the immunogram score value of the gene set IFN-γ response is less than 3.5, the intratumoral immune status of the gastric cancer sample The method according to (19) above, characterized in that the is determined to be COLD,
(21) Furthermore, when the immunogram score value of the gene set T-cells in the gastric cancer sample is 3 or more and the immunogram score value of the gene set Proliferation is less than 2.5, the intratumoral immune status of the gastric cancer sample The method according to (19) or (20) above, characterized by determining INTERMEDIATE,
(22) Furthermore, the immunogram score value of the gene set T-cells in the gastric cancer sample is 3 or more, and the immunogram score value of the gene set Proliferation is 2.5 or more, and the immunogram score of the gene set Glycolysis The method according to (21) above, wherein the intratumoral immune status of the gastric cancer sample is determined to be HOT-ID when the value is less than 2.5;
(23) Furthermore, the immunogram score value of the gene set T-cells in the gastric cancer sample is 3 or more, and the immunogram score value of the gene set Proliferation is 2.5 or more, and the immunogram score value of the gene set Glycolysis is 2.5 or more, the method according to (22) above, wherein the intratumoral immune status of the gastric cancer sample is determined as HOT-MC;
(24) The method according to any one of (21) to (23) above, wherein the gastric cancer sample further has an immunogram score value of 3.5 or higher for the gene set IFN-γ.
(25) The therapeutic effect and prognosis of gastric cancer patients are predicted based on the evaluation results of the intratumoral immune status of the gastric cancer sample obtained by the method described in (23) or (24) above. Prognostic prediction method.
本発明によれば、がん免疫サイクルに関連する遺伝子群および腫瘍増殖に関連する遺伝子群の遺伝子発現量のスコア値という新たな評価手段により腫瘍組織サンプルの腫瘍内免疫状態を評価し、該評価によってがん患者に治療手段がもたらすであろう治療効果および予後を予測することができる。さらに、該予測に基づき、一人ひとりの患者に対し、効果が期待できる治療法を選択し、適切な治療法を提案することが可能となる。かくして、免疫療法の奏功性を上げることができる。さらに、本発明によれば、複数の腫瘍組織サンプルを用いて、がん免疫サイクルに関連する遺伝子群および腫瘍増殖に関連する遺伝子群の遺伝子発現量のスコア値に基づき、該複数の腫瘍組織サンプルを２以上の腫瘍内免疫状態のクラスターに分類することができ、次いで、各クラスターの特徴に基づき、各サンプルが由来する患者の治療効果および予後の予測や該患者に適した治療手段を選択することができる。さらに、本発明によれば、このような複数の腫瘍組織サンプルを用いた腫瘍内免疫状態のクラスター分類およびその分類のためのスコア値を分析して、各クラスター分類のためのアルゴリズムを作成することができる。かくして、個別のがん患者の診断ツールを開発することができる。 According to the present invention, the intratumoral immune state of a tumor tissue sample is evaluated by a new evaluation means of the score value of the gene expression level of a gene group related to the cancer immune cycle and a gene group related to tumor growth, and the evaluation can predict the therapeutic effect and prognosis that therapeutic measures will bring to cancer patients. Furthermore, based on the prediction, it is possible to select a therapeutic method that can be expected to be effective for each individual patient, and to propose an appropriate therapeutic method. Thus, the efficacy of immunotherapy can be increased. Furthermore, according to the present invention, using a plurality of tumor tissue samples, based on the score values of the gene expression levels of the gene group related to the cancer immune cycle and the gene group related to tumor growth, the plurality of tumor tissue samples can be classified into two or more clusters of intratumoral immune status, and then, based on the characteristics of each cluster, predict the therapeutic effect and prognosis of the patient from which each sample is derived, and select the appropriate therapeutic means for the patient. be able to. Furthermore, according to the present invention, cluster classification of intratumoral immune status using such multiple tumor tissue samples and score values for the classification are analyzed to create an algorithm for each cluster classification. can be done. Thus, a diagnostic tool for individual cancer patients can be developed.
Ｉ．本発明の一般的記載
本明細書において、「がん」の種類は限定されず、いずれのがんであってもよい。例えば、限定するものではないが、頭頚部がん、胃がん、食道がん、大腸がん、肝がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、腎がん、脳腫瘍、子宮がん、卵巣がん、メラノーマ、白血病、肉腫等の種々のがんが挙げられる。また、原発性がん、転移性がん、および再発性がんも包含される。
I. General Description of the Invention As used herein , the type of “cancer” is not limited and may be any cancer. For example, but not limited to, head and neck cancer, stomach cancer, esophageal cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, kidney cancer, brain cancer, uterine cancer, ovarian cancer, Various cancers such as melanoma, leukemia, and sarcoma are included. Also included are primary, metastatic, and recurrent cancers.
本明細書において、「腫瘍組織サンプル」とは、がん患者から採取された病巣部位を含む組織であり、組織の種類はがんの種類に依存して適宜選択される。 As used herein, a "tumor tissue sample" is a tissue containing a focal site collected from a cancer patient, and the type of tissue is appropriately selected depending on the type of cancer.
免疫チェックポイント阻害剤の登場で、生体の持つ免疫反応が、がん細胞を認識し排除して腫瘍を長期にわたりコントロールすることが可能であり、免疫には、がんを治す力があることが証明された。がんに対する免疫反応は、非常にダイナミックで、生体の環境下において経時的な変化と解剖学的な影響を受けている。この複雑ながん免疫応答を一連のサイクルとして評価する「がん免疫サイクル（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｃｙｃｌｅ）」という概念が提唱されており、腫瘍特異的Ｔ細胞による抗腫瘍免疫応答は次の７つのステップで説明される。（１）腫瘍抗原の放出、（２）抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ， ＡＰＣ）による腫瘍抗原の取り込みとリンパ節への遊走、（３）Ｔ細胞への抗原提示と抗原特異的Ｔ細胞の活性化、（４）活性化Ｔ細胞の遊走、（５）腫瘍組織への浸潤、（６）腫瘍細胞の認識、（７）攻撃。Ｔ細胞に攻撃され細胞死を起こした腫瘍細胞は新たな腫瘍抗原を放出し、（１）に戻る。この一連のサイクルにおいて、いずれのステップが障害されても効果的ながん免疫応答の誘導が困難となり、がんは免疫監視機構から逃避する。がん細胞は抗腫瘍免疫反応から逃避するメカニズムを獲得し、増殖を続け、やがて腫瘍を形成する。また、腫瘍の増殖や代謝機能も腫瘍の免疫状態に影響を及ぼすことが知られている。かくして、腫瘍内免疫状態は、がん免疫応答因子と、がん細胞自体の因子（増殖等）とのバランスによって決定される。 With the advent of immune checkpoint inhibitors, it is possible for the body's immune response to recognize and eliminate cancer cells and control tumors over the long term. Proven. Immune responses to cancer are highly dynamic, subject to chronological changes and anatomical influences in the living environment. The concept of "Cancer Immunity Cycle" has been proposed to evaluate this complex cancer immune response as a series of cycles, and the anti-tumor immune response by tumor-specific T cells has the following seven steps: explained. (1) tumor antigen release, (2) tumor antigen uptake by antigen presenting cells (APC) and migration to lymph nodes, (3) antigen presentation to T cells and activity of antigen-specific T cells (4) migration of activated T cells; (5) invasion into tumor tissue; (6) recognition of tumor cells; (7) attack. Tumor cells attacked by T cells and undergoing cell death release new tumor antigens, returning to (1). In this series of cycles, even if any step is disturbed, it becomes difficult to induce an effective cancer immune response, and the cancer escapes from the immune surveillance mechanism. Cancer cells acquire mechanisms to escape from anti-tumor immune responses, continue to proliferate, and eventually form tumors. Tumor growth and metabolic functions are also known to affect the immune status of tumors. Thus, intratumoral immune status is determined by the balance between cancer immune response factors and factors of the cancer cells themselves (proliferation, etc.).
本発明では、がん免疫サイクルに関連する遺伝子群および腫瘍増殖に関連する遺伝子群の発現量が腫瘍内免疫状態に関連することを見出し、これらの遺伝子群の発現量を腫瘍内免疫状態の評価用指標として用いた。なお、腫瘍の増殖には代謝も関わるため、本明細書において、腫瘍増殖に関連する遺伝子群には腫瘍細胞の代謝機能に関連する遺伝子も包含される。また、腫瘍の増殖に関連する遺伝子群は、特に予後に関連すると思われる。 In the present invention, it was found that the expression levels of a gene group related to the cancer immune cycle and a gene group related to tumor growth are related to the intratumoral immune state, and the expression levels of these gene groups were used to evaluate the intratumoral immune state. used as an index for Since metabolism is also involved in tumor growth, the group of genes associated with tumor growth as used herein also includes genes associated with the metabolic function of tumor cells. Also, gene clusters associated with tumor growth appear to be particularly relevant to prognosis.
腫瘍内には、がん細胞、免疫細胞、間質細胞など多彩な細胞が存在し、腫瘍内免疫状態とは無関係な遺伝子も発現している可能性もあるため、先ずは免疫反応の特徴に関連する特定の遺伝子セットごとに解析するのが効率的である。 Tumors contain a wide variety of cells, including cancer cells, immune cells, and stromal cells, and there is a possibility that genes unrelated to the intratumoral immune state may also be expressed. It is efficient to analyze by specific set of related genes.
細胞の機能や特徴は、各種遺伝子の発現量に依存すると考えられる。細胞の機能や特徴は、単独の遺伝子の機能に依存するのではなく、複数の遺伝子（すなわち、遺伝子群）の協調により発揮されると考えられている。現在、細胞の各種機能または特徴に関連する複数の遺伝子からなる遺伝子セットが種々報告されている。本発明においては、このような遺伝子セットをがん免疫サイクルに関連する遺伝子群および腫瘍の増殖に関連する遺伝子群として使用することができる。 The functions and characteristics of cells are thought to depend on the expression levels of various genes. It is believed that the functions and characteristics of cells are not dependent on the function of a single gene, but are brought about by the cooperation of multiple genes (ie gene clusters). Currently, various gene sets consisting of multiple genes related to various functions or characteristics of cells have been reported. In the present invention, such a gene set can be used as a gene group related to cancer immune cycle and a gene group related to tumor growth.
がん免疫サイクルに関連する遺伝子セットの例としては、限定するものではないが、Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｐｒｉｍｉｎｇ ＆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｔ－ｃｅｌｌ Ｐｒｉｍｉｎｇ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｔ ｃｅｌｌｓ、Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、ＩＦＮγ ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ： Ｔｒｅｇｓ、Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ； Ｔｒｅｇ、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ： ＭＤＳＣ、Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ； ＭＤＳＣ、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｏｔｈｅｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ、Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ、Ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ、Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ Ｔｏｕｍｏｒｓ等が挙げられる。ここで、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ」は、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ： ＴｒｅｇｓおよびＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ： ＭＤＳＣを統合した遺伝子セットである。 Examples of gene sets associated with the cancer immune cycle include, but are not limited to, Innate immunity, Priming & activation, T-cell priming and activation, T cells, Antitumor T-cell immunity, IFNγ response, Inhibitory cells, Inhibitory cells: Tregs, Absence of inhibitory cells; Tregs, Inhibitory cells: MDSC, Absence of inhibitory cells; MDSC, Inhibitory molecules, Absence of check kpoint expression, Absence of Other inhibition Molecules, Recognition of tumor cells, Recognition of Cancer Cells by T cells , Tumor antigenicity, Trafficking and Infiltration of T Cells into Toumors, and the like. Here, "Inhibitory cells" is a gene set integrating Inhibitory cells: Tregs and Inhibitory cells: MDSCs.
腫瘍の増殖に関連する遺伝子セットの例としては、限定するものではないが、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ、Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ、Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ等が挙げられる。 Examples of gene sets associated with tumor growth include, but are not limited to, Proliferation, Apoptosis, Cell Cycle, Glycolysis, Fatty Acid Oxidation, and the like.
上記のがん免疫サイクルに関連する遺伝子セットおよび腫瘍の増殖に関連する遺伝子セットの例を表１に記載する。
なお、本発明において使用される遺伝子セットは本明細書に記載のものに限定されるものではなく、本明細書に記載の遺伝子セットと同等な遺伝子セットおよびその構成遺伝子を適宜使用すればよい。かかる同等の遺伝子セットおよびその構成遺伝子は、当業者に明らかである。例えば、MSigDB(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/collections.jsp#H)に登録されている１７８１０の遺伝子セットなどから適宜選択することができる。 Note that the gene sets used in the present invention are not limited to those described herein, and gene sets equivalent to the gene sets described herein and constituent genes thereof may be used as appropriate. Such equivalent gene sets and their constituent genes will be apparent to those skilled in the art. For example, it can be appropriately selected from 17810 gene sets registered in MSigDB (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/collections.jsp#H).
例えば、「Ｐｒｉｍｉｎｇ ＆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」と同等な遺伝子セットとして、「Ｔ－ｃｅｌｌ Ｐｒｉｍｉｎｇ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」（例えば、非特許文献１参照）が挙げられる。例えば、「Ｔ ｃｅｌｌｓ」と同等な遺伝子セットとして、「Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」（例えば、非特許文献１参照）が挙げられる。例えば、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ： Ｔｒｅｇｓ」と同等な遺伝子セットとして、「Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ； Ｔｒｅｇ」（例えば、非特許文献１参照が挙げられる。例えば、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ： ＭＤＳＣ」と同等な遺伝子セットとして、「Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ； ＭＤＳＣ」（例えば、非特許文献１参照）が挙げられる。例えば、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」と同等な遺伝子セットとして、「Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」および「Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｏｔｈｅｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」（例えば、非特許文献１参照）が挙げられる。例えば、「Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ」と同等な遺伝子セットとして、「Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ」（例えば、非特許文献１参照）が挙げられる。 For example, gene sets equivalent to "Priming & Activation" include "T-cell Priming and Activation" (see, for example, Non-Patent Document 1). For example, gene sets equivalent to "T cells" include "Antitumor T-cell Immunity" (see, for example, Non-Patent Document 1). For example, gene sets equivalent to "Inhibitory cells: Tregs" include "Absence of inhibitory cells; Treg" (e.g., Non-Patent Document 1). "Absence of inhibitory cells; MDSC" (see, for example, Non-Patent Document 1) For example, gene sets equivalent to "Inhibitory molecules" include "Absence of checkpoint expression" and "Absence of Other inhibitory Mol ecules” (for example , Non-Patent Document 1) For example, gene sets equivalent to "Recognition of Tumor Cells" include "Recognition of Cancer Cells by T cells" (see, for example, Non-Patent Document 1).
本発明においては、遺伝子セットを構成する全遺伝子を用いてもよいし、構成遺伝子の全てを用いなくてもよい。例えば、各遺伝子セットを構成する遺伝子のうち、その関連する細胞の機能または特徴と特に相関性の高いいくつかの遺伝子のみを選択することができる。例えば、限定するものではないが、遺伝子セットを構成する遺伝子のうち、１～１０個の遺伝子を用いてもよい。 In the present invention, all genes constituting a gene set may be used, or not all constituent genes may be used. For example, among the genes that make up each gene set, only some genes that are particularly highly correlated with the function or characteristic of the associated cell can be selected. For example, without limitation, 1 to 10 genes of the genes that make up the gene set may be used.
腫瘍内免疫状態の評価用の遺伝子群の発現量のスコア値は、各遺伝子群を構成する各遺伝子の発現量から求められる。各遺伝子の発現量としては、各遺伝子から転写されたｍＲＮＡ量を指標とすることができる。サンプル中のｍＲＮＡの存在量の解析手段は特に限定されるものではなく、次世代シーケンサー利用技術の他、所謂第３世代シーケンサー利用技術など、当該分野で既知の技術を用いることができる。例えば、ｍＲＮＡの発現量として次世代シーケンサー（ＮＧＳ）解析に基づくＦＰＫＭ（Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）値を用いてもよい。なお、多数の遺伝子を同時に解析するには次世代シーケンサーなどのハイスループット型の解析装置が必要とされる。しかしながら、遺伝子群のスコア値と特に相関性の高い発現量を示すいくつかの遺伝子が存在する場合、該遺伝子のみを解析対象とすることで、例えば、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲなどの更に簡便な解析手法を用いることも可能である。 The score value of the expression level of the gene cluster for evaluating the intratumoral immune state is obtained from the expression level of each gene constituting each gene cluster. As the expression level of each gene, the amount of mRNA transcribed from each gene can be used as an index. The means for analyzing the amount of mRNA present in a sample is not particularly limited, and techniques known in the art, such as next-generation sequencer-utilizing techniques and so-called third-generation sequencer-utilizing techniques, can be used. For example, a FPKM (Fragments Per Kilobase of exon per Million mapped fragments) value based on next-generation sequencer (NGS) analysis may be used as the mRNA expression level. In order to analyze many genes simultaneously, a high-throughput analysis device such as a next-generation sequencer is required. However, when there are some genes that show an expression level that is particularly highly correlated with the score value of the gene group, only those genes are analyzed, for example, more convenient analysis methods such as multiplex real-time PCR It is also possible to use
次いで、各遺伝子群の遺伝子発現量を統計処理手段によって評価用のスコア値に変換する。該統計処理手段として、当業者に既知の手段を用いればよく、例えば、限定するものではないが、Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ、ＰＡＧＥ（ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｓｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）等が挙げられる。例えば、Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）を用いれば、発現量の偏りが大きい遺伝子セットを抽出することができる。さらに、１サンプルで同様の解析を行う統計処理手段としてｓｉｎｇｌｅ ｓａｍｐｌｅ Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ｓｓＧＳＥＡ）が知られている。サンプル数の点で本発明ではｓｓＧＳＥＡが好適に使用できる。 Then, the gene expression level of each gene group is converted into a score value for evaluation by statistical processing means. As the statistical processing means, means known to those skilled in the art may be used, and examples thereof include, but are not limited to, Gene Set Analysis, Gene Set Enrichment Analysis, PAGE (parametric analysis of gene set enrichment), and the like. For example, Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) can be used to extract gene sets with highly biased expression levels. Furthermore, single sample Gene Set Enrichment Analysis (ssGSEA) is known as a statistical processing means for performing a similar analysis on one sample. In terms of the number of samples, ssGSEA can be preferably used in the present invention.
例えば、遺伝子発現量のスコア値として、遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡ発現量（例えば、ＦＰＫＭ値）をＧＳＥＡやｓｓＧＳＥＡによって統計処理して得られる解析値（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ：ＥＳ）を採用しても良い。かかるＥＳは、該遺伝子群の発現状態を表す。なお、本明細書では、ｓｓＧＳＥＡ処理で得られたＥＳを特にｓｓＧＳＥＡスコアという。 For example, as the score value of the gene expression level, an analysis value (enrichment score: ES) obtained by statistically processing the mRNA expression level (eg, FPKM value) of each gene in the gene group by GSEA or ssGSEA may be adopted. . Such ES represents the expression state of the gene cluster. In this specification, ES obtained by ssGSEA treatment is particularly referred to as ssGSEA score.
サンプル中のｍＲＮＡの存在量は遺伝子毎に差があり、コピー数としては１０００倍の差がある場合も考えられる。したがって、好ましくは、標準化したスコア値を用いる。例えば、ＥＳを標準化した値（Ｚスコア）は、下記の式から求められる。
Ｚ＝（ＥＳ－Ｍ）／ＳＤ
［式中、ＥＳは、解析対象となる一の腫瘍組織サンプルから得られた特定の遺伝子群でのＥＳであり、ＭおよびＳＤはそれぞれ、複数の腫瘍組織サンプルにおける該遺伝子群のＥＳの平均値および標準偏差である。］
The amount of mRNA present in a sample varies from gene to gene, and it is conceivable that there may be a 1000-fold difference in copy number. Therefore, preferably standardized score values are used. For example, the standardized value of ES (Z score) is obtained from the following formula.
Z=(ES−M)/SD
[Wherein, ES is the ES of a specific gene group obtained from one tumor tissue sample to be analyzed, and M and SD are the mean values of the ES of the gene group in a plurality of tumor tissue samples, respectively. and standard deviation. ]
ＭおよびＳＤは、例えば、遺伝子データベース（例えば、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ：ＴＣＧＡ）から、解析対象の腫瘍組織サンプルと同じがんの症例における各遺伝子ＦＰＫＭ値の相当数のデータを入手し、ｓｓＧＳＥＡを行い、各遺伝子群におけるＥＳの平均値および標準偏差を計算して求めてもよい。または、複数であって相当数の腫瘍組織サンプルを解析対象とする場合は、該複数のサンプルのＥＳからＭおよびＳＤを算出してもよい。なお、本明細書において、相当数とは、例えば１００以上であり、好ましくは１００～１０００個、例えば約１００～３００個である。 M and SD, for example, from a gene database (e.g., The Cancer Genome Atlas: TCGA), obtain a considerable number of data of each gene FPKM value in the same cancer case as the tumor tissue sample to be analyzed, and perform ssGSEA. , the mean and standard deviation of ES in each gene group may be calculated. Alternatively, when a considerable number of multiple tumor tissue samples are to be analyzed, M and SD may be calculated from the ES of the multiple samples. In this specification, the term "substantial number" means, for example, 100 or more, preferably 100 to 1,000, for example, about 100 to 300.
かくして得られたＺスコアは、適宜、所望のスケールに変換してもよい。例えば、判断スケールを１～５とする目的で、Ｚスコアを基に以下の計算式に基づくイムノグラムスコア（Ｉｍｍｕｎｏｇｒａｍ ｓｃｏｒｅ、ＩＧＳ）を算出してもよい。
ＩＧＳ＝３＋１．５×Ｚ
The Z-score thus obtained may be converted to any desired scale as appropriate. For example, for the purpose of setting the judgment scale to 1 to 5, an immunogram score (IGS) based on the following formula may be calculated based on the Z score.
IGS = 3 + 1.5 x Z
かくして得られる遺伝子群の発現状態を表すスコア値に基づいて、腫瘍組織サンプルにおける腫瘍内免疫状態を評価する。本明細書において腫瘍内免疫状態とは、腫瘍における免疫系の状態を指す。 The intratumor immune status in the tumor tissue sample is evaluated based on the score value representing the expression status of the gene group thus obtained. As used herein, intratumoral immune status refers to the status of the immune system in a tumor.
腫瘍内免疫状態を表す手法として、がんの種類と治療法の組み合わせやその特徴に関連した様々な分類がありうる。例えば、限定するものではないが、ＨｏｔおよびＣｏｌｄなどの概念が知られている。Ｈｏｔは、免疫系ががんを見つけて戦いを仕掛けている「Ｈｏｔな」状態であり、一般に、がん免疫療法が効きやすい状態である。一方、Ｃｏｌｄは、免疫系ががんを見つけても戦いを仕掛けられないか、または免疫系ががんをそもそも見つけられておらず、免疫学的に不活性で「Ｃｏｌｄな」状態であり、一般に、がん免疫療法が効きにくい状態である。さらに、がんの種類によっては、ＨｏｔとＣｏｌｄに加えて、ＨｏｔとＣｏｌｄの中間の状態Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅや、Ｈｏｔ、Ｃｏｌｄおよび／またはＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅをそれぞれ２以上のクラスターに細分化した分類ができる。例えば、本発明では、胃がんの場合、Ｈｏｔ、ＣｏｌｄおよびＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅの３つのクラスターに分類でき、Ｈｏｔをさらに、予後に関連してＨｏｔ－ＩＤとＨｏｔ－ＭＣに分類できることが分かった。 Various classifications related to combinations of cancer types and treatment methods and their characteristics are possible as a way of expressing intratumoral immune status. For example, concepts such as, but not limited to, Hot and Cold are known. Hot is a "hot" state in which the immune system finds and fights against cancer, and is generally a state in which cancer immunotherapy is likely to work. On the other hand, Cold is an immunologically inactive and "cold" state where the immune system finds cancer but is unable to mount a fight, or the immune system has not found the cancer in the first place. In general, cancer immunotherapy is ineffective. Furthermore, depending on the type of cancer, in addition to Hot and Cold, it is possible to classify Intermediate, which is an intermediate state between Hot and Cold, and Hot, Cold, and/or Intermediate into two or more clusters. For example, in the present invention, it was found that gastric cancer can be classified into three clusters, Hot, Cold and Intermediate, and Hot can be further classified into Hot-ID and Hot-MC in relation to prognosis.
腫瘍内免疫状態は、各遺伝子群の発現状態を示すスコア値によって表される発現パターンに基づいて評価する。例えば、相当数のサンプルにおける遺伝子群の発現量の平均と標準偏差を基準として、解析対象のサンプルにおける遺伝子群の発現量を比較することにより、腫瘍内免疫状態を評価することができる。相当数のサンプルにおける遺伝子群の発現量は、例えば、実際に相当数のサンプルを測定して得られるか、または大規模データベース等から得られる既存のデータを利用してもよい。 The intratumoral immune status is evaluated based on the expression pattern represented by the score value indicating the expression status of each gene group. For example, the intratumoral immune status can be evaluated by comparing the expression levels of the gene cluster in the sample to be analyzed with reference to the average and standard deviation of the expression levels of the gene cluster in a considerable number of samples. The expression levels of gene clusters in a considerable number of samples may be obtained, for example, by actually measuring a considerable number of samples, or existing data obtained from a large-scale database or the like may be used.
さらに、評価用指標である各遺伝子群の発現量のスコア値をグラフ等を用いて可視化すると、腫瘍内免疫状態の評価が容易である。可視化の手段としては、例えば、限定するものではないが、レーダーチャート形式、ヒートマップ形式等が挙げられる。 Furthermore, visualization of the score value of the expression level of each gene group, which is an index for evaluation, using a graph or the like facilitates evaluation of the intratumoral immune state. Examples of visualization means include, but are not limited to, a radar chart format, a heat map format, and the like.
ＩＩ．複数の腫瘍組織サンプルのクラスター分類による腫瘍内免疫状態の評価
本発明の一の態様では、腫瘍内免疫状態の評価用指標として、がん免疫サイクルに関連する遺伝子群および腫瘍増殖に関連する遺伝子群の遺伝子発現量のスコア値を用いる、複数の腫瘍組織サンプルの腫瘍内免疫状態の評価方法が提供される。該態様では、複数の患者から得られた腫瘍組織サンプルを用いる。サンプル数は、限定されないが、好ましくは１００個以上、例えば約１００～５００個が挙げられる。上記複数の腫瘍組織サンプルのスコア値は、実際に複数のサンプルを測定して得てもよく、または大規模データベース等から得られる既存のデータを利用してもよい。
II. Evaluation of intratumoral immune status by cluster classification of multiple tumor tissue samples In one aspect of the present invention, a group of genes related to the cancer immune cycle and a group of genes related to tumor growth are used as an index for evaluating the intratumoral immune status. A method for evaluating the intratumoral immune status of a plurality of tumor tissue samples using the gene expression level score value of is provided. In this embodiment, tumor tissue samples obtained from multiple patients are used. The number of samples is not limited, but preferably 100 or more, for example about 100 to 500. The score values of the plurality of tumor tissue samples may be obtained by actually measuring a plurality of samples, or may be obtained using existing data obtained from a large-scale database or the like.
本発明の該態様の評価方法は、治療効果や予後を予測したい患者由来のサンプルを評価するためのアルゴリズムを構築するために用いてもよい。例えば、該態様の評価方法により、複数の腫瘍組織サンプルから得られた各遺伝子群の遺伝子発現量のスコア値を用いて該サンプルを２以上の腫瘍内免疫状態のクラスターに分類し、該分類結果に基づき下記ＩＩＩに記載するように、治療効果や予後を予測したい患者由来のサンプルを評価するためのアルゴリズムを構築する。 The evaluation method of this aspect of the present invention may be used to construct an algorithm for evaluating patient-derived samples whose therapeutic effect or prognosis is to be predicted. For example, according to the evaluation method of this aspect, the samples are classified into two or more clusters of intratumor immune status using the score values of the gene expression levels of each gene group obtained from a plurality of tumor tissue samples, and the classification result is Build an algorithm for evaluating samples from patients whose treatment efficacy or prognosis is desired to be predicted, as described in III below.
アルゴリズムを構築しない場合は、該態様の評価方法により得られた複数の腫瘍組織サンプルの腫瘍内免疫状態のクラスター分類結果とスコア値の発現パターンを、治療効果や予後を予測したい患者由来のサンプルから得られたスコア値の発現パターンと比較し、該治療効果や予後を予測したい患者由来のサンプルが属するクラスターを判定することもできる。あるいは、治療効果や予後を予測したい患者由来のサンプルの遺伝子群の遺伝子発現量のスコア値と相当数の既存のサンプルデータ由来の遺伝子群の遺伝子発現量のスコア値を用いて、治療効果や予後を予測したい患者由来のサンプルと既存サンプルの腫瘍内免疫状態を一緒に評価してクラスター分類し、該治療効果や予後を予測したい患者由来のサンプルが属する腫瘍内免疫状態のクラスターを判定することもできる。 When the algorithm is not constructed, the cluster classification results of the intratumor immune status of multiple tumor tissue samples obtained by the evaluation method of this embodiment and the expression pattern of the score values are obtained from samples derived from patients whose therapeutic effects and prognosis are to be predicted. It is also possible to determine the cluster to which the patient-derived sample whose therapeutic effect or prognosis is to be predicted belongs by comparing with the expression pattern of the obtained score value. Alternatively, using the score values of the gene expression levels of the gene clusters of samples derived from patients whose therapeutic effects and prognosis are to be predicted and the score values of the gene expression levels of gene clusters derived from a considerable number of existing sample data, the therapeutic efficacy and prognosis can be predicted. It is also possible to evaluate together the intratumoral immune status of the patient-derived sample and the existing sample for which the therapeutic effect or prognosis is to be predicted, and classify the intratumoral immune status into clusters, and determine the cluster of the intratumoral immune status to which the patient-derived sample for which the therapeutic effect or prognosis is to be predicted belongs. can.
好ましくは、腫瘍内免疫状態の評価用指標として、がん免疫サイクルに関連する遺伝子群から選択される１以上の遺伝子セット、および腫瘍の増殖に関連する遺伝子群から選択される１以上の遺伝子セットを用いる。腫瘍内免疫状態の評価用指標として用いる遺伝子セット数はいくつでもよく、限定されない。利便性の観点から、例えば、がん免疫サイクルに関連する遺伝子セットおよび腫瘍の増殖に関連する遺伝子セットを合わせて６～１２セット程度用いてもよく、好ましくは８～１０セット程度が用いられる。なお、腫瘍内免疫状態の概要を把握するには、少なくとも、がん免疫サイクルに関連する遺伝子群から選択される７つの遺伝子セット：Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｐｒｉｍｉｎｇ ＆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｔ ｃｅｌｌｓ、ＩＦＮγ ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ、および腫瘍の増殖に関連する遺伝子群から選択される２つの遺伝子セット：Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓを用いるのがさらに好適である。 Preferably, one or more gene sets selected from a group of genes associated with the cancer immune cycle and one or more gene sets selected from a group of genes associated with tumor proliferation as an index for evaluating intratumoral immune status. Use Any number of gene sets may be used as an index for evaluating intratumoral immune status, and there is no limitation. From the viewpoint of convenience, for example, about 6 to 12 sets of gene sets associated with the cancer immune cycle and gene sets associated with tumor proliferation may be used, preferably about 8 to 10 sets. In addition, in order to grasp the outline of the intratumor immune state, at least seven gene sets selected from the gene group related to the cancer immune cycle: Innate immunity, Priming & activation, T cells, IFNγ response, Inhibitory cells, It is further preferred to use two gene sets selected from the group of genes associated with Inhibitory molecules, Recognition of tumor cells and tumor growth: Proliferation, Glycolysis.
本発明では、さらに、評価の精度を上げるために、がん免疫サイクルに関連する遺伝子群、腫瘍増殖に関連する遺伝子群に加えて、代謝に関連する遺伝子群等の他の遺伝子群を用いてもよい。他の遺伝子群としては、MSigDB(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/collections.jsp#H)に登録されている１７８１０の遺伝子セットなどから適切なものを抽出して活用可能である。 In the present invention, in addition to the cancer immune cycle-related gene group and the tumor growth-related gene group, another gene group such as a metabolism-related gene group is used to improve the accuracy of the evaluation. good too. As other gene groups, it is possible to extract appropriate ones from 17810 gene sets registered in MSigDB (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/collections.jsp#H) and use them. be.
本発明の該態様における腫瘍内免疫状態の評価方法では、複数の腫瘍組織サンプルの腫瘍内免疫状態を、上記の各遺伝子群（または遺伝子セット）の遺伝子発現量のスコア値の発現パターンに基づき、２以上のクラスターに分類する。腫瘍内免疫状態の分類には、がんの種類と治療法の組み合わせやその特徴に関連した様々な分類がありうる。どのように分類するかは、当業者が適宜決定することができる。一例として、スコア値を１～５のスケールに設定した場合、３より高いスコア値のサンプルをＨｏｔ、３以下のスコア値のサンプルをＣｏｌｄに大別してもよい。がんの種類によっては、ＨｏｔとＣｏｌｄに加えて、ＨｏｔとＣｏｌｄの中間の状態としてＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅや、Ｈｏｔ、Ｃｏｌｄおよび／またはＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅをそれぞれ２以上に細分化した腫瘍内免疫状態の分類ができる場合もある。 In the method for evaluating intratumoral immune status in this aspect of the present invention, the intratumoral immune status of a plurality of tumor tissue samples is evaluated based on the expression pattern of the score value of the gene expression level of each gene group (or gene set) described above, Classify into two or more clusters. Classification of intratumoral immune status can include various classifications related to combinations of cancer types and treatment modalities and their characteristics. A person skilled in the art can appropriately determine how to classify. As an example, when score values are set on a scale of 1 to 5, samples with score values higher than 3 may be classified as Hot, and samples with score values of 3 or less may be classified as Cold. Depending on the type of cancer, in addition to Hot and Cold, it may be possible to classify Intermediate as an intermediate state between Hot and Cold, and intratumoral immune states subdivided into two or more each of Hot, Cold and/or Intermediate. be.
本発明の該態様における腫瘍内免疫状態の評価方法では、特に、胃がんサンプルの腫瘍内免疫状態を、ＣｏｌｄとＨｏｔ、更にその中間のＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅへのクラスターに大別することができ、Ｈｏｔのクラスターに属するサンプルについては更にＨｏｔ－ＭＣとＨｏｔ－ＩＤのクラスターに分類できる。 In the method for evaluating intratumoral immune status in this aspect of the present invention, the intratumoral immune status of gastric cancer samples in particular can be broadly divided into cold and hot clusters, as well as intermediate intermediate clusters. The belonging samples can be further classified into Hot-MC and Hot-ID clusters.
したがって、本発明のさらなる態様では、腫瘍内免疫状態をＣｏｌｄ、ＨｏｔおよびＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅの３つのクラスター、またはＣｏｌｄ、Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ、Ｈｏｔ－ＭＣおよびＨｏｔ－ＩＤの４つのクラスターに分類することを特徴とする、胃がんサンプルの腫瘍内免疫状態の評価方法が提供される。 Therefore, in a further aspect of the present invention, gastric cancer characterized by classifying intratumoral immune status into 3 clusters Cold, Hot and Intermediate, or into 4 clusters Cold, Intermediate, Hot-MC and Hot-ID. A method for assessing the intratumoral immune status of a sample is provided.
腫瘍内免疫状態と治療法の奏功性との相関性の観点では、Ｈｏｔのクラスターに属するサンプルの患者は免疫療法の奏功性が認められる可能性が高い。特に、免疫チェックポイント阻害剤による奏功性が認められた患者由来のサンプルはＨｏｔに分類される割合が高かった。 From the viewpoint of the correlation between the intratumoral immune status and the efficacy of the therapeutic method, it is highly likely that the patients whose samples belong to Hot's cluster will be found to be responsive to the immunotherapy. In particular, a high percentage of samples derived from patients who were found to be responsive to immune checkpoint inhibitors were classified as Hot.
一方、Ｃｏｌｄのクラスターに属するサンプルについては、免疫応答が認められず、抗原提示能が弱まっているサンプルでもあることがその他の遺伝子発現状態からも示唆された。したがって、Ｃｏｌｄのクラスターに属するサンプルの患者は、免疫チェックポイント阻害剤単独による奏功が期待できない。Ｃｏｌｄのクラスターに属するサンプルの患者については、治療手段としては、人工的に抗原認識能を付与させた免疫細胞や、腫瘍抗原を特に認識せず腫瘍を選択的に溶解させる能力を有する腫瘍溶解性ウイルスなどが有用であると考えられる。該人工的に抗原認識能を付与させた免疫細胞としては、例えば、ＣＡＲ－Ｔ、ＴＣＲ－Ｔなどが挙げられる。該腫瘍溶解性ウイルスとしては、例えば、Ｃ－ＲＥＶなどが挙げられる。また、例えば、ネオアンチゲンワクチン等と免疫チェックポイント阻害剤との併用による治療も考えられる。 On the other hand, other gene expression states also suggested that the samples belonging to the Cold cluster showed no immune response, and that the samples had a weakened antigen-presenting ability. Therefore, patients in samples belonging to the Cold cluster cannot be expected to respond to immune checkpoint inhibitors alone. For patients whose samples belong to the Cold cluster, therapeutic measures include immune cells that have been artificially given the ability to recognize antigens, and oncolytic cells that do not particularly recognize tumor antigens and have the ability to selectively lyse tumors. Viruses and the like are considered useful. Examples of the immune cells artificially endowed with antigen recognition ability include CAR-T and TCR-T. Examples of the oncolytic virus include C-REV. In addition, for example, treatment using a neoantigen vaccine or the like in combination with an immune checkpoint inhibitor is also conceivable.
胃がんにおいては、Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅのクラスターに属するサンプルは、上皮間葉転換をきたしたＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ型が多く集まっており、またＣＡＦ（間質線維芽細胞）の発現が高かった。したがって、Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅのクラスターに属するサンプルの患者は、転移をきたす可能性が高く、化学療法や免疫チェックポイント阻害剤による奏功が期待できない。Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅのクラスターに属するサンプルの患者の治療手段としては、例えば、手術による病巣の切除が挙げられる。また、ＣＡＦが産生するＴＧＦ－βが腫瘍内へのＴ細胞浸潤を妨げるバリアを形成することが知られているので、免疫チェックポイント阻害剤とＴＧＦ－β阻害剤との併用による治療が考えられる。 In gastric cancer, samples belonging to the Intermediate cluster had many Mesenchymal types with epithelial-mesenchymal transition, and CAF (interstitial fibroblast) expression was high. Therefore, patients in samples belonging to the Intermediate cluster have a high possibility of developing metastasis and cannot be expected to respond to chemotherapy or immune checkpoint inhibitors. Treatment measures for a sample of patients belonging to the Intermediate cluster include, for example, excision of the lesion by surgery. In addition, it is known that TGF-β produced by CAF forms a barrier that prevents T cell infiltration into tumors, so treatment with a combination of an immune checkpoint inhibitor and a TGF-β inhibitor is considered. .
胃がんの場合、Ｈｏｔ－ＭＣのクラスターに属するサンプルは、予後が不良の患者由来の割合が高く、これらの患者は直ちに何らかの処置手段が必要と判断される。したがって、Ｈｏｔ－ＭＣのクラスターに分類された腫瘍組織を有する患者は、手術予後が不良で、再発しやすい傾向にある。治療手段としては、例えば、周術期の免疫チェックポイント阻害剤治療も含め、免疫チェックポイント阻害剤の早期投与による治療が挙げられる。 In the case of gastric cancer, a high percentage of samples belonging to the Hot-MC cluster are derived from patients with a poor prognosis, and these patients are judged to require some form of treatment immediately. Therefore, patients with tumor tissue classified into the Hot-MC cluster have a poor surgical prognosis and are prone to recurrence. Treatment modalities include, for example, treatment with early administration of immune checkpoint inhibitors, including perioperative immune checkpoint inhibitor therapy.
胃がんの場合、Ｈｏｔ－ＩＤのクラスターに属するサンプルは、比較的予後の良好な患者由来であった。これらの患者は、手術予後が良好なだけではなく、免疫チェックポイント阻害薬の奏効が期待される。また、これらの患者は、生存率が高いと予測される。したがって、Ｈｏｔ－ＩＤのクラスターに分類された腫瘍組織を有する患者の治療手段としては、例えば、手術による病巣の切除や、早期の免疫チェックポイント阻害剤の投与による治療が挙げられる。 For gastric cancer, samples belonging to the Hot-ID cluster were from patients with a relatively good prognosis. These patients not only have a good surgical prognosis, but are also expected to respond to immune checkpoint inhibitors. These patients are also expected to have a high survival rate. Therefore, therapeutic measures for patients with tumor tissues classified into the Hot-ID cluster include surgical excision of lesions and early administration of immune checkpoint inhibitors.
このように、腫瘍組織サンプルの腫瘍内免疫状態は、該サンプルが由来する患者の治療効果および予後に関連する。したがって、サンプルが属するクラスターを基に各種治療手段が患者の治療効果および予後を予測することができる。したがって、本発明のさらに別の態様は、上記の腫瘍内免疫状態の評価方法によって、治療効果や予後を予測したい一の患者由来のサンプルの腫瘍内免疫状態を評価し、該サンプルが属するクラスターを基に各種治療手段による該患者の治療効果および予後を予測する方法を提供する。さらに、上記評価方法によって判定された該患者由来のサンプルが属するクラスターを基に、該患者において奏功性が期待できる治療手段を適宜選択することが可能となる。また、治療後の該患者由来のサンプルのクラスターの変遷により該治療の効果も判断可能となる。かくして、本発明の方法によれば、一人ひとりの患者の治療効果および予後を予測することができ、さらに、奏功性のある治療手段を選択することもできる。 Thus, the intratumoral immune status of a tumor tissue sample is related to therapeutic efficacy and prognosis of the patient from which the sample was derived. Therefore, based on the cluster to which the sample belongs, various therapeutic measures can predict the therapeutic effect and prognosis of the patient. Therefore, in still another aspect of the present invention, the intratumoral immune status of a sample derived from a patient whose therapeutic effect or prognosis is to be predicted is evaluated by the above method for evaluating intratumoral immune status, and the cluster to which the sample belongs is determined. Based on this, a method for predicting the therapeutic effect and prognosis of the patient by various therapeutic means is provided. Furthermore, based on the cluster to which the patient-derived sample determined by the above evaluation method belongs, it becomes possible to appropriately select a therapeutic means that can be expected to be effective in the patient. In addition, the change in the cluster of samples from the patient after treatment also allows determination of the effect of the treatment. Thus, according to the method of the present invention, it is possible to predict the therapeutic effect and prognosis of each individual patient, and also to select effective therapeutic measures.
したがって、本発明のさらに別の態様は、上記した腫瘍組織サンプルの腫瘍内免疫状態の評価方法による評価に基づいて、各種治療手段によるがん患者の治療効果および予後を予測する方法を提供する。 Therefore, still another aspect of the present invention provides a method for predicting the therapeutic effect and prognosis of cancer patients with various therapeutic measures, based on the evaluation by the method for evaluating the intratumoral immune status of tumor tissue samples.
ＩＩＩ．個別のサンプルのアルゴリズムによる腫瘍内免疫状態の評価
上記ＩＩに記載の腫瘍内免疫状態の評価方法による、複数の腫瘍組織サンプルを用いて解析した各種がんの腫瘍内免疫状態のクラスター分類結果および各遺伝子群（または遺伝子セット）のスコア値に基づいて、各クラスターに分類するためのアルゴリズムが得られる。該アルゴリズムにしたがえば、一の患者由来の腫瘍組織サンプルの腫瘍内免疫状態を個別に評価することができる。さらに、上記ＩＩに記載したのと同様に、かかる腫瘍内免疫状態に基づいて、該一の患者の治療効果および予後を個別に予測することができ、また、奏功性が期待できる治療手段を個別に選択することができる。
III. Evaluation of intratumoral immune status by algorithm for individual samples Cluster classification results of intratumoral immune status of various cancers analyzed using a plurality of tumor tissue samples by the method for evaluating intratumoral immune status described in II above, and each Based on the score value of the gene group (or gene set), an algorithm is derived to classify each cluster. According to the algorithm, the intratumoral immune status of tumor tissue samples from a single patient can be individually assessed. Furthermore, in the same manner as described in II above, based on such intratumoral immune status, the therapeutic effect and prognosis of the one patient can be individually predicted, and therapeutic measures that can be expected to be effective can be individually selected. can be selected to
したがって、本発明のさらなる態様は、がん免疫サイクルに関連する遺伝子群および腫瘍増殖に関連する遺伝子群の遺伝子発現量のスコア値による腫瘍内免疫状態の評価のためのアルゴリズムに基づいて、個別のがん患者由来の腫瘍組織サンプルの腫瘍内免疫状態を評価する方法を提供する。各種がん患者の腫瘍内免疫状態の評価のためのアルゴリズムは、上記ＩＩに記載したように各種がんについて複数の腫瘍組織サンプルを用いてクラスター分類を行い、該クラスター分類結果および各遺伝子群（または遺伝子セット）の遺伝子発現量のスコア値に基づいて得ることができる。したがって、該アルゴリズムにおいて腫瘍内免疫状態の評価用指標として用いられる遺伝子セットの数は、分類される腫瘍内免疫状態のクラスターの数に依存し、特に限定されないが、利便性の観点から、がん免疫サイクルに関連する遺伝子セットおよび腫瘍の増殖に関連する遺伝子セットから選択される１～５セット程度が好ましい。分類される腫瘍内免疫状態のクラスターの数は、がんの種類に依存し、好ましくは、少なくともＣｏｌｄおよびＨｏｔの２つのクラスターを含む。本発明の該態様において、サンプルにおける遺伝子群の遺伝子発現量の測定は、次世代シーケンサーなどのハイスループット型の解析装置によって行ってもよいが、評価用指標の数が少ないため、例えば、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲなどの更に簡便な方法でも可能である。 Therefore, a further aspect of the present invention is based on an algorithm for evaluating intratumoral immune status by score values of gene expression levels of a gene group associated with the cancer immune cycle and a gene group associated with tumor growth. A method for assessing the intratumoral immune status of a tumor tissue sample from a cancer patient is provided. Algorithms for evaluating the intratumoral immune status of various cancer patients perform cluster classification using a plurality of tumor tissue samples for various cancers as described in II above, and the cluster classification results and each gene group ( or gene set). Therefore, the number of gene sets used as an index for evaluating intratumoral immune status in the algorithm depends on the number of clusters of intratumoral immune status to be classified, and is not particularly limited. About 1 to 5 sets selected from a gene set associated with the immune cycle and a gene set associated with tumor growth are preferred. The number of clusters of intratumor immune status classified depends on the cancer type and preferably includes at least two clusters, Cold and Hot. In this aspect of the present invention, the gene expression level of a gene group in a sample may be measured by a high-throughput analysis device such as a next-generation sequencer. A simpler method such as real-time PCR is also possible.
例えば、胃がんの場合、胃がんサンプルの遺伝子セットＴ－ｃｅｌｌｓのＩＧＳが３未満の場合は、該サンプルの腫瘍免疫状態はＣｏｌｄと判断できる。更に遺伝子セットＩＦＮ－γのＩＧＳが３．５未満だとＣｏｌｄの判断精度が向上する。また、胃がんサンプルの遺伝子セットＴ－ｃｅｌｌｓのＩＧＳが３以上であって、遺伝子セットＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎのＩＧＳが２．５未満の場合、該サンプルの腫瘍内免疫状態はＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅと判断できる。また、胃がんサンプルの遺伝子セットＴ－ｃｅｌｌのＩＧＳが３以上、遺伝子セットＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎのＩＧＳが２．５以上であって、遺伝子セットＧｌｙｃｏｌｙｓｉｓのＩＧＳが２．５未満の場合、該サンプルの腫瘍内免疫状態はＨｏｔ－ＩＤと判断できる。更に、上記いずれの条件にも当てはまらないサンプルの腫瘍内免疫状態は、Ｈｏｔ－ＭＣと判断できる。なお、ここではＩＧＳ値で示しているが、かかるＩＧＳ値と同等の値になる（すなわち、ＩＧＳ値に換算すれば上記の数値になる）いずれのスコア値を用いてもよい。かくして、少なくともＴ－ｃｅｌｌｓ、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、およびＧｌｙｃｏｌｙｓｉｓの３つの特定の遺伝子セット、または少なくともＴ－ｃｅｌｌｓ、ＩＦＮ－γ、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、およびＧｌｙｃｏｌｙｓｉｓの４つの特定の遺伝子セットの発現量のスコア値を用いることにより、胃がんサンプルの腫瘍内免疫状態を評価することができる。さらに、上記ＩＩに記載したとおり、このような腫瘍内免疫状態に基づき、各種治療手段による胃がん患者の治療効果および予後を予測することができ、また、奏功性が期待できる治療手段を適宜選択することができる。 For example, in the case of gastric cancer, if the IGS of the gene set T-cells of a gastric cancer sample is less than 3, the tumor immune status of the sample can be determined as Cold. Furthermore, when the IGS of the gene set IFN-γ is less than 3.5, the cold judgment accuracy is improved. In addition, when the IGS of the gene set T-cells of the gastric cancer sample is 3 or more and the IGS of the gene set Proliferation is less than 2.5, the intratumoral immune status of the sample can be determined to be Intermediate. In addition, when the IGS of the gene set T-cell of the gastric cancer sample is 3 or more, the IGS of the gene set Proliferation is 2.5 or more, and the IGS of the gene set Glycolysis is less than 2.5, the intratumoral immune status of the sample can be determined as Hot-ID. Furthermore, the intratumoral immune status of samples that do not meet any of the above conditions can be determined as Hot-MC. Although the IGS value is used here, any score value equivalent to the IGS value (that is, the above numerical value when converted to the IGS value) may be used. Thus, by using the expression level score values of at least three specific gene sets of T-cells, Proliferation, and Glycolysis, or of at least four specific gene sets of T-cells, IFN-γ, Proliferation, and Glycolysis , the intratumoral immune status of gastric cancer samples can be assessed. Furthermore, as described in II above, based on such intratumoral immune status, the therapeutic effect and prognosis of gastric cancer patients with various treatment methods can be predicted, and treatment methods that can be expected to be effective can be appropriately selected. be able to.
以下、実施例にて本願発明を説明するが、本願発明は実施例により特に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not particularly limited by the examples.
実施例１：９つの遺伝子セットによる胃がん患者の腫瘍内免疫状態の評価
予後に関する情報が得られている胃がんサンプル３１検体を解析対象とし、９つの遺伝子セット：Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｐｒｉｍｉｎｇ＆ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｔ－ｃｅｌｌｓ、ＩＦＮ－γ ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、およびＧｌｙｃｏｌｙｓｉｓによる解析を行った。該解析には、表１に示される各遺伝子セットの全ての遺伝子の発現を用いた。なお、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ」として、表１に示される「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ： Ｔｒｅｇｓ」および「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ： ＭＤＳＣ」の遺伝子を用いた。
Example 1: Evaluation of Intratumoral Immune Status of Gastric Cancer Patients Using Nine Gene Sets 31 gastric cancer samples for which prognostic information has been obtained were analyzed, and nine gene sets were analyzed: Innate immunity, Priming & activation, T-cells, and IFN. -Analysis was performed by γ response, Inhibitory cells, Inhibitory molecules, Recognition of tumor cells, Proliferation, and Glycolysis. Expression of all genes in each gene set shown in Table 1 was used for the analysis. As the "Inhibitory cells", the genes of "Inhibitory cells: Tregs" and "Inhibitory cells: MDSC" shown in Table 1 were used.
１．解析用サンプルの調製
細胞内ＲＮＡを安定に保存するため、胃切除直後に得られた全ての腫瘍および隣接する正常肺組織サンプルは、ＲＮＡｌａｔｅｒ ＲＮＡ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）による処理を行った。このうち、予後状態の判明している胃がん患者３１名からの腫瘍組織サンプルを遺伝子発現解析に用いた。ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）またはＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ／ｍｉＲＮＡユニバーサルキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を製造元のプロトコルに従って使用して、ＤＮＡおよびＲＮＡサンプルを調製した。
1. Preparation of Samples for Analysis To stably preserve intracellular RNA, all tumor and adjacent normal lung tissue samples obtained immediately after gastrectomy were treated with RNAlater RNA Stabilization Reagent (Qiagen). Among them, tumor tissue samples from 31 gastric cancer patients with known prognosis were used for gene expression analysis. DNA and RNA samples were prepared using the AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen) or the AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal Kit (Qiagen) according to the manufacturer's protocol.
２．遺伝子発現解析
遺伝子発現解析にはＨｉｓｅｑ１５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いた。該装置で解析するためのＰｏｌｙ－Ａ＋ ＲＮＡシーケンシングライブラリーは、胃がんサンプルより得られたＲＮＡをＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｓｔｒａｎｄ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて処理を行い得た。腫瘍組織由来サンプルは１００ｂｐエンドペア読み取りモードにて配列データを得た。次にＲＮＡ配列決定リードをＴｏｐｈａｔ（バージョン１．３．２）を使用して整列させた。上記９評価軸の各遺伝子の発現値を、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（バージョン２．０．２）を使用してマッピングされた百万フラグメント当たりの転写物のキロベース当たりのフラグメント（ＦＰＫＭ）として計算した。次にＧｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ，ｖ９）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２００５；１０２（４３）：１５５４５－１５５５５０）を用いてｓｉｎｇｌｅ ｓａｍｐｌｅ Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ｓｓＧＳＥＡ）を行い、ｓｓＧＳＥＡスコアを求めた。
2. Gene expression analysis Hiseq1500 (manufactured by Illumina) was used for gene expression analysis. A Poly-A+ RNA sequencing library for analysis with this device was obtained by processing RNA obtained from gastric cancer samples using the SureSelect Strand-Specific RNA library preparation kit for Illumina (manufactured by Agilent Technologies). Tumor tissue-derived samples were sequenced in 100 bp end-pair reading mode. RNA sequencing reads were then aligned using Tophat (version 1.3.2). Expression values for each gene in the 9 evaluation axes were calculated as fragments per kilobase of transcript per million fragments (FPKM) mapped using Cufflinks (version 2.0.2). Next, a single sample Gene Set Enrichment Analysis (ssGSEA) was performed using Gene Set Enrichment Analysis (GSEA, v9) (Proc. Natl. Acad. Sci., 2005; 102(43): 15545-155550), and ssG SEA score asked.
次に、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ （ＴＣＧＡ）に登録された胃がん３７５例の各遺伝子の発現量（ＦＰＫＭ値）データをダウンロードし、上記と同様にしてｓｓＧＳＥＡスコアを求めた。遺伝子セット毎に、ＴＣＧＡに登録された胃がん患者のｓｓＧＳＥＡスコアの平均値と標準偏差を計算した。つづいて、上記の胃がん患者３１名の腫瘍組織サンプルから得られた、遺伝子セット毎のｓｓＧＳＥＡスコアを、ＴＣＧＡデータから作成した平均値と標準偏差を基準として標準化し、
式：Ｚ＝（ＥＳ－Ｍ）／ＳＤ
にしたがってＺスコアを計算した。本実施例の胃がんサンプルのｓｓＧＳＥＡスコアを上記式中のＥＳに挿入し、ＴＣＧＡに登録された胃がん患者のｓｓＧＳＥＡスコアの平均値と標準偏差をそれぞれ、上記式中のＭおよびＳＤに挿入した。さらに、Ｚスコアを、
式：ＩＧＳ＝３＋１．５×Ｚ
にしたがって１～５点からなるイムノグラムスコア（ＩＧＳ）に変換した。
Next, the expression level (FPKM value) data of each gene in 375 cases of gastric cancer registered with The Cancer Genome Atlas (TCGA) was downloaded, and the ssGSEA score was determined in the same manner as above. Mean values and standard deviations of ssGSEA scores of gastric cancer patients registered with TCGA were calculated for each gene set. Subsequently, the ssGSEA score for each gene set obtained from the tumor tissue samples of the 31 gastric cancer patients was standardized based on the average value and standard deviation created from the TCGA data,
Formula: Z = (ES-M) / SD
Z-scores were calculated according to The ssGSEA scores of the gastric cancer samples of this example were inserted into ES in the above formula, and the average value and standard deviation of the ssGSEA scores of gastric cancer patients registered with TCGA were inserted into M and SD in the above formula, respectively. Furthermore, the Z-score is
Formula: IGS = 3 + 1.5 x Z
It was converted to an immunogram score (IGS) consisting of 1 to 5 points according to.
３．腫瘍内免疫状態の評価
上記２で得られたイムノグラムスコア値を用いた３１サンプルのレーダーチャート形式での解析結果を図１に示す。さらに、イムノグラムスコア値に基づく腫瘍内免疫状態の評価結果を図２に示す。図中、ＢＫＴ００１等の記号は本実施例で用いたサンプル番号を示す。また、ＩＧＳ１は遺伝子セット「Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、ＩＧＳ２は遺伝子セット「Ｐｒｉｍｉｎｇ＆ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」、ＩＧＳ３は遺伝子セット「Ｔ－ｃｅｌｌｓ」、ＩＧＳ４は遺伝子セット「ＩＦＮ－γ ｒｅｓｐｏｎｓｅ」、ＩＧＳ５は遺伝子セット「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｅｌｌｓ」、ＩＧＳ６は遺伝子セット「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、ＩＧＳ７は遺伝子セット「Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ」、ＩＧＳ８は遺伝子セット「Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ」、ＩＧＳ９は遺伝子セット「Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ」のＩＧＳを示す。
3. Evaluation of Intratumoral Immune State FIG. 1 shows the analysis results of 31 samples in radar chart form using the immunogram score values obtained in 2 above. Furthermore, FIG. 2 shows the evaluation results of the intratumoral immune status based on the immunogram score values. In the figure, symbols such as BKT001 indicate sample numbers used in this example. In addition, IGS1 is a gene set "Innate immunity", IGS2 is a gene set "Priming &activation", IGS3 is a gene set "T-cells", IGS4 is a gene set "IFN-γ response", IGS5 is a gene set "Inhibitory Cells", IGS6 denotes the gene set “Inhibitory molecules”, IGS7 the gene set “Recognition of tumor cells”, IGS8 the gene set “Glycolysis”, and IGS9 the gene set “Proliferation”.
図１および図２から明らかなように、サンプル毎に各遺伝子セットの発現量に傾向があり、腫瘍内免疫状態と遺伝子セットの発現量との間に相関関係があることが分かった。また、図２から明らかなように、上記遺伝子セットの発現量に基づき、胃がんサンプルの腫瘍免疫状態は、ＣＯＬＤ、ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥ、およびＨＯＴ－ＩＤ、ＨＯＴ－ＭＣの４つのクラスターに分類された。 As is clear from FIGS. 1 and 2, there is a tendency in the expression level of each gene set for each sample, and it was found that there is a correlation between the intratumor immune state and the expression level of the gene set. In addition, as is clear from FIG. 2, based on the expression level of the gene set, the tumor immune status of gastric cancer samples was classified into four clusters: COLD, INTERMEDIATE, HOT-ID, and HOT-MC.
実施例２：個別の胃がんサンプルの腫瘍内免疫状態の評価
実施例１で得られた３１名の胃がん患者のクラスター解析の結果から、下記のアルゴリズムにより胃がんサンプルの腫瘍内免疫状態を分類できることが分かった。すなわち、
「Ｔ Ｃｅｌｌｓ」のイムノグラムスコア値が３未満の場合、Ｃｏｌｄと分類した。
「Ｔ Ｃｅｌｌｓ」のイムノグラムスコア値が３以上、かつ、「Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ」のイムノグラムスコア値が２．５未満の場合、Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅと分類した。
「Ｔ Ｃｅｌｌｓ」のイムノグラムスコア値が３以上、かつ、「Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ」のイムノグラムスコア値が２．５以上、かつ、「Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ」のイムノグラムスコア値が２．５未満の場合、Ｈｏｔ－ＩＤと分類した。
上記のいずれにも該当しない場合、Ｈｏｔ－ＭＣと分類した。
Example 2: Evaluation of the intratumoral immune status of individual gastric cancer samples From the results of the cluster analysis of the 31 gastric cancer patients obtained in Example 1, it was found that the intratumoral immune status of gastric cancer samples could be classified by the following algorithm. rice field. i.e.
If the "T Cells" immunogram score value was less than 3, it was classified as Cold.
When the immunogram score value of "T Cells" was 3 or more and the immunogram score value of "Proliferation" was less than 2.5, it was classified as Intermediate.
If the immunogram score value of "T Cells" is 3 or more, and the immunogram score value of "Proliferation" is 2.5 or more, and the immunogram score value of "Glycolysis" is less than 2.5, Hot-ID classified as
If none of the above applies, it was classified as Hot-MC.
さらに、ＴＣＧＡ登録データのうち、予後データが付与されていた２４０個の胃がんサンプルの各遺伝子の発現量（ＦＰＫＭ値）データを用いて、実施例１に記載されるように９個の遺伝子セットのイムノグラムスコア値を求め、解析した結果、上記の３１サンプルと同様のアルゴリズムが得られた。 Furthermore, of the TCGA registration data, using the expression level (FPKM value) data of each gene of 240 gastric cancer samples to which prognostic data was assigned, 9 gene sets as described in Example 1 As a result of determining and analyzing the immunogram score value, the same algorithm as for the above 31 samples was obtained.
３１サンプルから得られたアルゴリズムおよびＴＣＧＡ登録データ由来の２４０サンプルから得られたアルゴリズムの結果を図３に示す。この結果により、個別の胃がん患者は、上記アルゴリズムに基づき、１～３つの評価用指標のスコア値を用いて腫瘍内免疫状態を評価できることが分かった。さらに、かかる腫瘍内免疫状態の評価に基づき、該患者の治療効果や予後を予測し、該患者に適した治療手段を選択することができる。 The results of the algorithm from 31 samples and from 240 samples from the TCGA registry data are shown in FIG. Based on these results, it was found that individual gastric cancer patients can be evaluated for intratumoral immune status using score values of 1 to 3 evaluation indices based on the algorithm described above. Furthermore, based on the evaluation of such intratumoral immune status, therapeutic effects and prognosis of the patient can be predicted, and appropriate therapeutic means for the patient can be selected.
Claims (20)
ここで、がん免疫サイクルに関連する遺伝子群として遺伝子セット：Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｐｒｉｍｉｎｇ＆ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｔ－ｃｅｌｌｓ、ＩＦＮ－γ ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｅｌｌｓ、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、およびＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ、腫瘍の増殖に関連する遺伝子群として遺伝子セット：Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、およびＧｌｙｃｏｌｙｓｉｓ、の少なくとも９個の遺伝子セットの遺伝子発現量のスコア値を用いることを特徴とし、前記Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｅｌｌｓは、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｅｌｌｓ ＴｒｅｇｓおよびＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｅｌｌｓ ＭＤＳＣの遺伝子セットからなる、方法。 Based on the evaluation of the intratumor immune status by the score value of the gene expression level of the gene group related to the cancer immune cycle and the gene group related to tumor growth in tumor tissue samples derived from multiple cancer patients, one cancer A method for predicting the therapeutic effect and prognosis of a cancer patient, characterized by predicting the therapeutic effect and prognosis of the patient,
Here, gene sets related to the cancer immune cycle include: Innate immunity, Priming & activation, T-cells, IFN-γ response, Inhibitory cells, Inhibitory molecules, and Recognition of tumor cells, Genes related to tumor growth A method characterized by using score values of gene expression levels of at least nine gene sets of gene sets: Proliferation, and Glycolysis, wherein the Inhibitory Cells consist of gene sets of Inhibitory Cells Tregs and Inhibitory Cells MDSC.
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