JP7300240B2 - 神経細胞賦活化剤 - Google Patents

神経細胞賦活化剤 Download PDF

Info

Publication number
JP7300240B2
JP7300240B2 JP2022557466A JP2022557466A JP7300240B2 JP 7300240 B2 JP7300240 B2 JP 7300240B2 JP 2022557466 A JP2022557466 A JP 2022557466A JP 2022557466 A JP2022557466 A JP 2022557466A JP 7300240 B2 JP7300240 B2 JP 7300240B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
cells
differentiation
vegf
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2022557466A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2022080473A1 (ja
Inventor
幸子 三沢
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of JPWO2022080473A1 publication Critical patent/JPWO2022080473A1/ja
Priority to JP2023099848A priority Critical patent/JP2023116733A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7300240B2 publication Critical patent/JP7300240B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Description

本発明の第１の態様
本発明は、インドリノン化合物を有効成分とする、精神神経系疾患等の治療に用いられる神経細胞賦活化剤に関するものである。本発明はまた、インドリノン化合物を有効成分とする神経細胞栄養因子群（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ）、すなわち脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ：ＢＤＮＦ）、血管新生に関わる増殖因子として発見されたのでその名がついたが、現在は神経細胞栄養因子でもあると認定されている血管内皮増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）ファミリー、ＶＥＧＦの受容体ファミリー、ＶＥＧＦの共受容体の1つ以上を発現促進する神経細胞賦活化剤に関するものである。
本発明の第２の態様
本発明は、多能性幹細胞から神経細胞への分化誘導法であって、フィーダー細胞及び動物由来の血清やマトリジェルなどを含まない未同定成分の関与を排除した生物環境（ゼノフリー培養系）による分化誘導法に関する。本発明はまた、従来法に比較して工程が簡便であると共に、未分化な細胞の残存が少なく、メカニズム解析が容易な分化誘導法に関する。
本発明の第１の態様
近年、社会の高度化、複雑化に伴い、うつ病、ＰＴＳＤ、パニック障害等を有する患者の数が増大しており、問題視されている。このような背景から、重点的に対策に取り組むべきとされている四大疾病（がん、脳卒中、心筋梗塞、糖尿病）に、精神疾患が加えられ、五大疾病と呼ばれるようになってきた。脳・神経系の疾患による脳機能の低下は、患者自身の生活の質の重大な低下を招くだけでなく、看病又は介護に関わる家族などの周辺の人々の生活にも大きな影響を与える。したがって、これら疾患による脳機能の低下の改善や予防が重要な課題となっている。
これら脳・神経機能の低下に起因する精神神経系疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、加齢に伴う神経障害（認知症など）、うつ病、統合失調症、双極性障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、不安障害、パニック障害、自閉症スペクトラム障害、発達障害などを含む様々な脳・神経系の疾患において、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現低下が認められることが報告されている（非特許文献１～６、８～１５、１７、１８）。
そこで、脳・神経系疾患において、ＢＤＮＦとＶＥＧＦタンパク質の補充療法が試みられてきた。ＶＥＧＦタンパク質は脳血管関門を通過しないため脳室内投与が試みられてきた。また、ＢＤＮＦ発現を増加させる薬剤又は化合物なども検討されてきた（特許文献１、２）。
再生医療には、大きく分けて２通りの方法がある。一つはｉＰＳ細胞のような幹細胞を利用する方法である。もう一つは自己再生能力を引き出す方法であり、障害を受けて機能的に働かなくなった細胞の自己修復能力を引き出す方法に供する機能性物質として、ＢＤＮＦを含む細胞増殖因子の活性化を担う機能的物質の探索が提案されている（非特許文献１）。現在、セロトニン再取り込み阻害剤などの、モノアミン系物質を標的とした抗うつ剤の限界について議論されており、ＢＤＮＦ産生を促進する物質が新規抗うつ剤のシーズとして注目され、種々の漢方薬についてスクリーニングが行われている（非特許文献１）
一方、ＶＥＧＦシグナル伝達系タンパクの発現増加は、神経幹細胞の増殖と分化促進に有効だとされ、リコンビナントＶＥＧＦ－Ｃ、リコンビナントＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－ＣとＶＥＧＦ－Ｄの受容体であるＶＥＧＦ受容体２、３の活性化化合物を使用して、認知機能障害の治療が検討された（特許文献３～６）。また、ＶＥＧＦタンパク質投与やウィルスベクターを用いたＶＥＧＦ発現増加が、ＡＬＳ疾患モデル動物に有意な改善効果をもたらしたことから（非特許文献１６、１７、１８）、ＶＥＧＦタンパク質がＡＬＳ治療薬として検討された。しかし、ＶＥＧＦタンパクは、脳血流関門を通らないため直接的な脳室内投与が臨床試験で行われたが（特許文献７、非特許文献８、非特許文献１４）、臨床試験は２０１５年に中止された。
２０１９年に米国ＦＤＡで承認された即効性のある強力な抗うつ剤ケタミンは、その投与により、ストレスにより委縮した神経細胞の樹状突起がＶＥＧＦとＢＤＮＦを介して再伸展し、これが症状の改善につながることが明らかにされた（非特許文献７）。このように、抗うつ剤ケタミンの薬効発現には、ＶＥＧＦとＢＤＮＦが共同して機能することが必須である。
精神神経系疾患の治療において、ＶＥＧＦタンパク質剤を使用する検討は行われてきたが、ヒトでは成功していない。また、低分子化合物を使用してＶＥＧＦの発現を増大させ、脳神経疾患を治療しようとする検討は、これまで行われてこなかった。
本発明の第２の態様
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から神経細胞への分化法がこれまでに多数報告され（特許文献８および特許文献９、非特許文献１９～２４）、再生医療および神経変性疾患などへの創薬に対する利用が図られている（特許文献８および特許文献９）（非特許文献１９、２５および２６）。
しかし、これらの方法では、例えば分化誘導後に残存する未分化な細胞をセルソーティングで除く必要がある（非特許文献１９）。また、異種生物由来のフィーダー細胞を使用したり（特許文献８、非特許文献１９、２０および２４）、未同定成分の含まれるマウス肉腫細胞由来マトリジェルを使用しなければならない（特許文献８および９、非特許文献１９～２６）。更に異種生物由来の未同定成分を含む血清やマウスグリア細胞共培養を使用したり（非特許文献１９、２１および２５）、胚葉体細胞（細胞凝集体）形成を経るなど複雑な段階的分化による分化工程が必要である（特許文献８および９、非特許文献２２、２４～２６）。そして細胞毒性の高い試薬を使用しなければならない（特許文献９、非特許文献１９、２０および２４）等の課題を抱えている。
特開２００１－３２８９４７公報 ＷＯ２０１７／１０４７０６公報 ＥＰ２７１４０６３公報 ＵＳ２００７／００８２８４８公報 ＵＳ２００８／００５７０２８公報 ＷＯ２０１２／１６３５４２公報 特表２００８－５００３１２公報（Ｐ２００８－５００３１２Ａ） 特表２０１３－５０１５０２公報 ＷＯ２０１６／０６３９８５公報
福地守、薬学雑誌１３７（９）１１０３－１１１５（２０１７） 橋本謙治、日薬理誌１２７、２０１－２０４（２００６） Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．１２：３３５（２０２０） 総説、Ａｎｇｅｌｕｃｃｉら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．１０：３４５－３５２（２００５） Ｌａｉら、Ｗｏｒｌｄ Ｊ ｏｆ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．６：１０２－１１７（２０１６） Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．６：１０８（２０１７） Ｄｅｙａｍａら、Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．８６：１４３－１５２（２０１９） 総説、Ｋｅｉｆｅｒら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．１４１：２６１－２７１（２０１４） Ｌａｎｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １２：４３９－４５４ （２０１６） Ｈｏｈｍａｎら、ＪＡＭＡ ７２：５２０－５２９ （２０１５） Ｍａｒｔｉｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０：１０８９－１０９３（２００７） Ｎｉｅｔｏら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １２：６６２４０７ （２０２１） Ｓａｇｈａｚａｄｅｈら、Ｊ Ａｕｔｉｓｍ Ｄｅｖ Ｄｉｓｏｒｄ． ４７：１０１８－１０２９ （２０１７） Ｄａｍｍａら、Ｂｒａｉｎ Ｃｏｍｍｕｎ．２：ｆｃａａ１６０ （２０２０） Ｓａｍｐａｉｏら、Ｎｅｕｒａｌ Ｒｅｇｅｎ． Ｒｅｓ．１２：５４９－５５７（２０１７） Ｓｔｏｒｋｅｂａｕｍ Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８（１）： ８５－９２ （２００５） Ａｚｚｏｕｚ Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４２９； ４１３－７ （２００４） 吉村玲児、日本生物学精神医学会誌 ２２：８３－８７（２０１１） Ｉｍａｍｕｒａ Ｋ，ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ２４：２０１７． Ｇｏｔｏ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．４：１１５－１２５、２０１７ Ｚｈａｎｇ Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ．７８：７８５－９８、２０１３. Ｗａｎｇ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．９：１２２１－１２３３、２０１７. Ｆｅｒｎａｄｏｐｕｌｌｅ Ｍ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７９：２０１８． Ｆｕｊｉｍｏｒｉ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２４：１５７９－１５８９、２０１８． Ｋｏｎｄｏ Ｔ． ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２１：２３０４－２３１２、２０１７． Ｋｅｉｋｏ Ｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２０２１ Ｆｅｂ ９；１０．１００２／ａｎａ．２６０４７
本発明の第１の態様
本発明は、神経精神系疾患等の治療に用いられる神経細胞賦活化剤を提供することを目的とする。特に、ＢＤＮＦ、及び／又はＶＥＧＦシグナル伝達系に関するタンパク質の発現を促進させることを介して、神経細胞を賦活化する神経細胞賦活化剤を提供することを目的とする。
本発明の第２の態様
本発明は、未同定成分の関与を排除した生物環境（ゼノフリー培養系）で、胚葉体（細胞凝集体）の形成工程を経由することなく多能性幹細胞から神経細胞へ未分化細胞の残存を抑えて分化誘導する方法を提供することを目的とする。
本発明の第１の態様
ｉＰＳ細胞はその多能性幹細胞という性質から、再生医療の柱の一つとして、研究開発や臨床試験が進められてきた。ｉＰＳ細胞から作成した心筋細胞シート移植による虚血性心疾患の心筋再生、ｉＰＳ細胞から作成したドパミン神経前駆細胞移植によるパーキンソン病治療、ｉＰＳ細胞から作成した網膜色素上皮細胞移植による加齢黄斑変性症治療などの臨床試験が開始され、また、ｉＰＳ細胞から作成した血小板製剤の開発も進んでいる。
創薬分野においてもｉＰＳ細胞という手段を得たことは大きな技術革新となった。現在の創薬では、一つの医薬品が上市されるまでに、１，０００億円以上の研究・開発費と１０年以上の歳月が費やされている。創薬プロセスでは、（１）病態メカニズムの解明や創薬シーズの探索等の基礎的研究、（２）スクリーニング系の構築と化合物スクリーニング、（３）候補薬物の安全性試験、有効性試験、及び動態試験等を経たのち、臨床試験が実施されている。しかしながら、多くの薬物が、毒性の判明等により、臨床試験後あるいは市販後にドロップアウトしている。開発コストを抑えつつ、安全性及び有効性の高い新薬の開発に成功するためには、臨床試験までの創薬プロセスの各ステップの効率化と精度の向上が必須である。
そこで近年、ヒトｉＰＳ細胞から作製した肝細胞、心筋細胞、神経細胞等を用いた創薬プロセスの一新と加速化の期待が高まっている。治療薬の探査法として疾患特異的ｉＰＳ細胞を用いて、他疾患の既存薬の薬効評価（スクリーニング）が試みられるようになっている。このｉＰＳ創薬により、慢性骨髄性白血病抗がん剤のボスチニブがＡＬＳの、免疫抑制剤のラパマイシンが進行性骨化性線維異形成症やペンドレッド症候群の、麦角アルカロイド誘導体パーキンソン病薬のブロモクリプチンがアルツハイマー病の、パーキンソン病改善ドパミンＤ２受容体系作動薬のロピニオールがＡＬＳの、それぞれ治療薬となり得ることが確認された。そして、京都大学では、ＡＬＳ患者を対象としたボスチニブの臨床試験、進行性骨化性線維異形成症患者を対象としたラパマイシンの臨床試験、アルツハイマー病患者を対象としたブロモクリプチンの臨床試験が開始されており、慶応大学ではＡＬＳ患者を対象としたロピニオールの臨床試験、ペンドレッド症候群患者を対象としたラパマイシンの臨床試験が開始されている。ロピニオールは、ＡＬＳの進行を約７か月遅らせるという中間報告が発表された。２０２１年９月３０日にボスチニブが、第Ｉ相試験により一部の患者においてＡＬＳの進行をおさえた可能性が報告されたが、肝障害など大きな課題が残されている。
本発明者は、ｉＰＳ細胞のヒト疾患モデルとして有用性が公知であることから、簡便で、ｉＰＳ細胞培養から神経細胞分化終了まで、フィーダー細胞、マトリジェルや、血清などの成分の量及び質が同定又は一定化できない動物由来物を用いないゼノフリー培養系を開発した。そして、３株の健常者由来ｉＰＳ細胞を用いて、まず健常者由来ｉＰＳ細胞において神経細胞の分化に伴い発現が強化される遺伝子と発現が低下する遺伝子の詳細な解析を行った。また、３株の健常者由来ｉＰＳ細胞と４株の家族性又は孤発性ＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞を用いて、健常者由来ｉＰＳ細胞とＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞との遺伝子発現動態の違いについて詳細な解析を行った。さらに、健常な神経発達と生存に関わる機構を解明して、再生医療の柱の一つである自己再生能力を引き出し神経変性疾患を改善する疾患修飾薬、即ち症状進行を抑える又は疾患を改善する薬剤の開発を行った。
ＡＬＳにおける運動神経細胞死の回避に関わることが知られているＶＥＧＦ－Ａ及びそのファミリーとそれらの受容体の遺伝子発現動態を、ｉＰＳ細胞から運動神経細胞への分化過程及び分化完了後の長期神経細胞培養まで経時的に追跡した。その結果、ＶＥＧＦ－Ａの発現は神経細胞において特に増加することなくほぼ全過程を通じて一定していたが、ＶＥＧＦ－ＡシグナルのネガティブレギュレーターであるＶＥＧＦ受容体－１の発現が、最終分化した運動神経細胞でほとんど消滅することがわかった。ところが、ＶＥＧＦ－Ａシグナルによる神経細胞生存活性を担うと言われているＶＥＧＦ受容体－２も発現が減少する傾向にあることがわかった。このことから、ＶＥＧＦ受容体－２に結合してその活性を修飾する化合物を中心としてスクリーニングを重ねたところ、本発明のインドリノン化合物が、孤発性ＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞から分化した運動神経細胞死を防ぐ効果があることを発見した。
加えて、本発明のインドリノン化合物は、スクリーニング評価系に神経栄養因子の補充をしなくても、神経細胞の生存維持できることを見出し、本発明のインドリノン化合物に神経栄養因子（ＢＤＮＦ、ＶＥＧＦファミリー、ＶＥＧＦファミリー受容体）のオートクラインによる神経細胞賦活化作用があり、生存維持効果があることを確認した。
本発明者は、本発明のインドリノン化合物としてセマキサニブ（Ｓｅｍａｘａｎｉｂ）を使用して、この作用機序を鋭意検討したところ、ＢＤＮＦ及びＶＥＧＦシグナル伝達系を担う遺伝子群の同時発現促進により、神経細胞生存維持、神経可塑性などの神経系の健常な機能維持が向上するという全く新しい作用機序を発見した。本発明化合物では、ＢＤＮＦの発現促進と共に、神経細胞生存維持と樹状突起の伸長・分岐促進及びスパイン形成とシナプス新生などの神経可塑性を担い、神経幹細胞の増殖と分化促進に関与するＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質（ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ受容体－２、ＶＥＧＦ受容体－３、ＶＥＧＦ－ＡとＶＥＧＦ－ＣとＶＥＧＦ－Ｄの共受容体（ニューロピリン２））の発現が促進、増強されることを見出した。
本発明者は、本発明のインドリノン化合物の作用機序から、本発明化合物が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、レット症候群、加齢に伴う神経障害（認知症など）などの神経変性疾患や、うつ病、統合失調症、双極性障害、自閉症スペクトラム、発達障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、不安障害、パニック障害などの精神神経系疾患や、脳卒中後の症状回復、脊髄損傷後の機能回復に対して、神経細胞賦活化剤として機能し、これらの精神神経系疾患を予防又は治療できることを見出した。健康寿命の延伸にも貢献すると考えられる。
本発明の第２の態様
本発明者は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から神経細胞への分化誘導方法の改良について鋭意検討を重ねてきた。特に、培養に使用する試剤の最適化とそれに伴う分化誘導方法の最適化を検討した。その結果、これまで神経系細胞の分化誘導に添加することが必要と考えられてきたレチノイン酸（ＲＡ）の添加が必要でなくなる等、多くの知見を得ることができた。その知見の概要を図７に示す。本発明の分化誘導法は、大きく次の２つの段階に分けることができる。
ａ）分化の開始段階（工程２）：
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から神経細胞への分化を開始するためには、従来法では胚葉体（ｅｍｂｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）を形成させるが、神経細胞形成までに長期間を要し、工程も複雑である。本発明者はフィーダー細胞を用いないゼノフリー培養系ではそもそもこの胚葉体形成と制御が困難であることを見出した。
このため、神経細胞分化開始に決定的な役割を果たす転写因子、ニューロジェニン遺伝子ファミリー（１、２、及び３）の発現誘導を用いることを考えた。発現ベクターを用いて、ニューロジェニン遺伝子ファミリー（１、２、及び３）のすべての組み合わせと単独での遺伝子導入による一過性の発現誘導実験を行ったところ、ニューロジェニン２がｉＰＳ細胞から神経細胞への分化誘導に必要十分であることがわかった。
ニューロジェニン２を一過性に発現させるためには、ＲＮＡリポフェクション法でニューロジェニン２遺伝子をｉＰＳ細胞に導入する方法がある。また、ニューロジェニン２遺伝子をベクターに搭載してｉＰＳ細胞に導入し、例えばドキシサイクリンで一過性にニューロジェニン２の発現誘導を短期間行う方法がある。方法は細胞の使用目的に応じて適宜選択することができる。臨床応用のためにはＲＮＡリポフェクション法でニューロジェニン２遺伝子を導入する方法が望ましいが、ＲＮＡリポフェクション法は細胞への遺伝子導入効率が低く、かつ導入効率は培養条件など多くの要因によって左右され、安定した結果を得ることが難しい。薬剤のスクリーニングおよび薬剤の機序の解析には、安定してｉＰＳ細胞の分化誘導を開始することが求められ、そのためニューロジェニン２遺伝子をベクターに搭載してｉＰＳ細胞に導入し、ドキシサイクリンなどによる発現誘導を用いることが望ましい。
なお、ニューロジェニン２は分化の開始スイッチであるため、ニューロジェニン２の発現誘導は分化開始の初期には一定期間は必要であるが、その後はニューロジェニン２の発現を中止することが好ましく、ドキシサイクリンによるニューロジェニン２の発現誘導にはドキシサイクリンの処理時間が１６から２０時間であることが好ましいことを見出した。ドキシサイクリン添加による発現誘導ができるニューロジェニン２遺伝子を導入したｉＰＳ細胞を、ドキシサイクリンを用いて１６から２０時間処理してニューロジェニン２を発現させると、図８ｂ）図９ｂ）に示されるように細胞から突起が伸長しはじめ、細胞も小さくなり、神経前駆細胞の形態を示すように変化する（図８ａ）、図９ａ）のドキシサイクリン処理を行わないコントロールの細胞と比較）。この状態を図７の分化の開始段階と定義した。
また、ｉＰＳ細胞の分化を開始するための環境としては、Ｒｏｃｋ阻害剤を含有するｉＰＳ維持培地が好ましいことが分かった。
ｂ）分化の発達段階（工程３）：
ドキシサイクリン処理によるニューロジェニン２の一過性発現により分化が開始されたｉＰＳ細胞の分化誘導をさらに進めるために、培養方法と培養試剤を検討したところ、図７に示すようにラミニンでコーティングした容器で一次培養、二次培養と、適宜５種の試剤（Ｒｏｃｋ阻害剤、ＴＧＦβファミリー阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト）を段階的に使用しながら分化を進行させ、三次培養でＲｏｃｋ阻害剤と神経栄養因子（ＢＤＮＦ，ＧＤＮＦ，ＩＧＦ－１）を加えて培養することによりゼノフリー培養系での神経細胞分化誘導が可能となった（図７ 分化の発達段階）。
健常者ではない患者由来のｉＰＳ細胞の場合（例えばＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞などの場合）、分化誘導の過程の途中で細胞が死滅し、神経細胞への分化完了に必要な長期培養が不可能なことが起きる。その場合には、インドリノン化合物を添加すると、長期培養が可能になり、患者由来の分化が完了した神経細胞が作製できることが明らかとなった。
このように、本発明者は、健常者と患者のｉＰＳ細胞から所望の神経細胞を作製することができることを見出した。
なお、本発明者が、上記分化の発達段階で分化誘導に必要な試剤を検討したところ、従来法の分化誘導方法で必要と考えられていたレチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ：ＲＡ）やＢＭＰシグナル阻害剤ＬＤＮ１９３１８９を添加しなくても神経細胞への分化が誘導できることを見出した。更に、本発明の分化誘導法では、従来法の神経系細胞の分化誘導剤であるＲＡやＬＤＮ１９３１８９を添加すると、一般的な知見とは逆に、細胞死が起こることを見出した。
本発明のｉＰＳ細胞から神経細胞への分化誘導方法を、従来法の分化培養方法と比較すると、以下の特徴があることが明らかとなった。
１）ニューロジェニン２を遺伝子導入することで、ｉＰＳ細胞に対して的確に分化誘導を開始できるようになった。
２）ゼノフリー培養系での神経細胞への分化誘導が可能になったことから、異種生物由来物質の混入を回避でき、ヒトへの再生医療への応用が可能になった。
３）胚葉体（細胞凝集体）を形成せずに神経細胞に分化誘導できることから、浮遊細胞用容器に移送して培養する工程が省略でき、安定した分化誘導のための培養が可能となった。
４）分化の発達促進剤の添加が最大６種で済み、最終分化の際の神経栄養因子の添加を併せて最大９種の試剤で培養が可能であるので、工程管理が容易になり、夾雑物の削減が図れるようになった。
５）一般に、異種生物由来物質を用いた場合、その構成成分の種類及び混入量は同定不可能であり、またロットにより大きく異なるため、アーチファクトと有意なデータとの判断が困難である。本発明の分化法を用いることにより、混入状態にばらつきのある夾雑物の影響を回避し、より高い再現性が担保できるようになった。即ち、さらなる神経細胞レベルでの機能・病態解明の手段を提供することができるようになった。
６）分化誘導にインドリノン化合物を添加することにより、ｉＰＳ細胞が神経疾患患者由来のｉＰＳ細胞などの場合のように細胞の活動度が低いものであっても、途中で死滅することなく最終分化した神経細胞を作製できるようになった。
７）インドリノン化合物が、ｉＰＳ細胞のアポトーシス阻害タンパク質サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の遺伝子発現を促進すること見出した。その結果、ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞では、サバイビン遺伝子の発現が顕著に低下しているが、そのようなｉＰＳ細胞の分化誘導において、インドリノン化合物を添加することにより、サバイビンの発現が改善され、分化誘導時においても、早期に細胞が死滅することなく、分化した神経細胞が作製できるようになった。
本発明者は、以上の知見に基づいて本発明を完成した。
即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
本発明の第１の態様
（１）一般式（１）
Figure 0007300240000001
 ［式中、Ｒ1、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、置換又は無置換の炭素数１～４の低級アルキル基、ホルミル基、アセチル基、カルボキシル基、置換又は無置換の炭素数１～４の低級アルコキシカルボニル基又は置換又は無置換の炭素数１～４の低級アルキルアミド基であり、置換基としては、ハロゲン原子、カルボキシル基、炭素数１～４の低級アルコキシカルボニル基、炭素数１～４のジ低級アルキルアミノ基である。
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、置換又は無置換の炭素数１～４の低級アルキル基、炭素数１～４の低級アルコキシ基、炭素数１～４の低級アルキルカルボニル基、炭素数１～４の低級アルコキシカルボニル基、カルボキシル基および水酸基からなる群より独立して選択され、置換基としては、ハロゲン原子、カルボキシル基、炭素数１～４の低級アルコキシカルボニル基である。］で表されるインドリノン化合物もしくはその薬学上許容される塩を有効成分として含有する、神経細胞賦活化剤。
（２）Ｒ1、Ｒ２およびＲ３が、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、エチル基、ハロゲン原子、ホルミル基、アセチル基、カルボキシル基、エチルオキシカルボニル基、メトキシカルボニルメチル基、エトキシカルボニルメチル基、２－カルボシキエチル基、２－メトキシカルボニルエチル基、２－エトキシカルボニルエチル基、２－ジエチルアミノエチルアミド基であり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基である、上記（１）に記載の神経細胞賦活化剤。
（３）Ｒ1、Ｒ２およびＲ３におけるハロゲン原子が、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７におけるハロゲン原子がフッ素原子、塩素原子である、上記（１）又は（２）に記載の神経細胞賦活化剤。
（４）Ｒ1およびＲ３がメチル基、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が水素原子である、上記（１）又は（２）に記載の神経細胞賦活化剤。
（５）神経細胞賦活化が、神経細胞の生存維持の活性化である、上記（１）～（４）のいずれかに記載の神経細胞賦活化剤。
（６）神経細胞が、中枢又は抹消神経系神経細胞である、上記（１）～（５）のいずれかに記載の神経細胞賦活化剤。
（７）神経細胞が、再生医療における移植神経幹細胞である、上記（１）～（６）のいずれかに記載の神経細胞賦活化剤。
（８）神経細胞賦活化が、ＢＤＮＦ及び／又はＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質の発現促進を介したものである、上記（１）～（６）のいずれかに記載の神経細胞賦活化剤。
（９）上記（１）～（８）のいずれかに記載の神経細胞賦活化剤を有効成分とする、精神神経系疾患治療剤。
（１０）精神神経系疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、加齢に伴う神経障害（認知症など）、うつ病、統合失調症、双極性障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、不安障害、パニック障害、自閉症スペクトラム障害、発達障害、レット症候群、ダウン症、脳虚血障害、又は脊髄損傷である、上記（９）に記載の精神神経系疾患治療剤。
（１１）一般式（１）
Figure 0007300240000002
 ［式中、Ｒ1、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、置換又は無置換の炭素数１～４の低級アルキル基、ホルミル基、アセチル基、カルボキシル基、置換又は無置換の炭素数１～４の低級アルコキシカルボニル基又は置換又は無置換の炭素数１～４の低級アルキルアミド基であり、置換基としては、ハロゲン原子、カルボキシル基、炭素数１～４の低級アルコキシカルボニル基、炭素数１～４のジ低級アルキルアミノ基である。
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、置換又は無置換の炭素数１～４の低級アルキル基、炭素数１～４の低級アルコキシ基、炭素数１～４の低級アルキルカルボニル基、炭素数１～４の低級アルコキシカルボニル基、カルボキシル基および水酸基からなる群より独立して選択され、置換基としては、ハロゲン原子、カルボキシル基、炭素数１～４の低級アルコキシカルボニル基である。］で表されるインドリノン化合物もしくはその薬学上許容される塩を有効成分として含有する、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及び/又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達系タンパク質の発現促進剤。
（１２）Ｒ1、Ｒ２およびＲ３が、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、エチル基、ハロゲン原子、ホルミル基、アセチル基、カルボキシル基、エチルオキシカルボニル基、メトキシカルボニルメチル基、エトキシカルボニルメチル基、２－カルボシキエチル基、２－メトキシカルボニルエチル基、２－エトキシカルボニルエチル基、２－ジエチルアミノエチルアミド基であり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基である、上記（１１）に記載の発現促進剤。
（１３）Ｒ1、Ｒ２およびＲ３におけるハロゲン原子が、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７におけるハロゲン原子がフッ素原子、塩素原子である、上記（１１）又は（１２）に記載の発現促進剤。
（１４）Ｒ1およびＲ３がメチル基、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が水素原子である、上記（１１）又は（１２）に記載の発現促進剤。
（１５）発現促進が、ＢＤＮＦ又はＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質の発現促進である、上記（１１）～（１４）のいずれかに記載の発現促進剤。
（１６）発現促進が、ＢＤＮＦとＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質の同時発現促進である、上記（１１）～（１４）のいずれかに記載の発現促進剤。
（１７）ＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質が、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ受容体－２、ＶＥＧＦ受容体－３、及びＶＥＧＦ－ＡとＶＥＧＦ－ＣとＶＥＧＦ－Ｄの共受容体ニューロピリン２の少なくとも一つ以上であることを特徴とする、上記（１１）～（１６）のいずれかに記載の発現促進剤。
（１８）ＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質が、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｃ、及びＶＥＧＦ－Ｄであることを特徴とする、上記（１１）～（１７）のいずれかに記載の発現促進剤。
（１９）ＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質が、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ受容体－２、ＶＥＧＦ受容体－３、及びＶＥＧＦ－ＡとＶＥＧＦ－ＣとＶＥＧＦ－Ｄの共受容体ニューロピリン２である、上記（１１）～（１７）のいずれかに記載の発現促進剤。
本発明の第２の態様
（２０）インドリノン化合物を有効成分とする、ｉＰＳ細胞のサバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）発現促進剤。
（２１）ｉＰＳ細胞がＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞である、上記（２０）に記載のサバイビン発現促進剤。
（２２）ｉＰＳ細胞が、分化誘導中のｉＰＳ細胞である、上記（２０）又は（２１）に記載のサバイビン発現促進剤。
（２３）インドリノン化合物が、上記（１）～（４）に記載の化合物である、上記（２０）～（２２）のいずれかに記載のサバイビン発現促進剤。
（２４）インドリノン化合物が、セマキサニブ（Ｓｅｍａｘａｎｉｂ）である、上記（２３）に記載のサバイビン発現促進剤。
（２５）ｉＰＳ細胞が、ニューロジェニン２の一過性の発現誘導ができるｉＰＳ細胞である、上記（２０）～（２４）のいずれかに記載のサバイビン発現促進剤。
（２６）インドリノン化合物を有効成分とする、ｉＰＳ細胞から分化誘導された神経細胞のサバイビン発現促進剤。
（２７）神経細胞が、運動神経細胞である、上記（２６）に記載のサバイビン発現促進剤。
（２８）神経細胞が、ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導された神経細胞である、上記（２６）又は（２７）に記載のサバイビン発現促進剤。
（２９）インドリノン化合物が、上記（１）～（４）に記載の化合物である、上記（２６）～（２８）のいずれかに記載のサバイビン発現促進剤。
（３０）インドリノン化合物がセマキサニブ（Ｓｅｍａｘａｎｉｂ）である、上記（２９）に記載のサバイビン発現促進剤。
（３１）ｉＰＳ細胞が、ニューロジェニン２の一過性の発現誘導ができるiＰＳ細胞である、上記（２６）～（３０）のいずれかに記載のサバイビン発現促進剤。
（２０）～（３１）において、インドリノン化合物は、１Ｍ～１ｐＭ、中でも１０ｍＭ～１０ｐＭ、中でも１００μＭ～１００ｐＭの濃度で、ｉＰＳ細胞又はｉＰＳ細胞から分化誘導された神経細胞と接触させればよい。
本発明において、ニューロジェニン２の一過性の発現誘導の「一過性」は、１６～２０時間とすることができる。
（３２）ゼノフリー培養系で、胚葉体（細胞凝集体）の形成工程を経由することなくｉＰＳ細胞から神経細胞への分化誘導方法であって、
１）ヒトニューロジェニン２遺伝子が導入されたｉＰＳ細胞をラミニンコーティングされた容器で培養する工程と、
２）分化の開始のために、ニューロジェニン２遺伝子の一過性の発現誘導を行う工程と、
３）分化が開始したｉＰＳ細胞をラミニンコーティングされた容器で培養し、分化の発達促進試剤として、低分子ＴＧＦβファミリー阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ＧＳＫ３阻害剤、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト及びＲｏｃｋ阻害剤、インドリノン化合物の６種の内、少なくとも１種以上を添加する工程と
を含む、ｉＰＳ細胞から神経細胞への分化誘導方法。
（３２）において、工程２）はｉＰＳ細胞を神経前駆細胞に分化誘導する工程であり、工程３）は、神経前駆細胞を神経細胞に分化誘導する工程である。
（３２）において、低分子ＴＧＦβファミリー阻害剤は、１ｍＭ～１ｎＭ、中でも１００μＭ～１０ｎＭの濃度で、ｉＰＳ細胞又は分化が開始したｉＰＳ細胞と接触させればよい。
（３２）において、アデニル酸シクラーゼ活性化剤は、１ｍＭ～１ｎＭ、中でも１００μＭ～１０ｎＭの濃度で、ｉＰＳ細胞又は分化が開始したｉＰＳ細胞と接触させればよい。
（３２）において、ＧＳＫ３阻害剤は、１ｍＭ～１ｎＭ、中でも１００μＭ～１０ｎＭの濃度で、ｉＰＳ細胞又は分化が開始したｉＰＳ細胞と接触させればよい。
（３２）において、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニストは、１ｍＭ～１ｎＭ、中でも１００μＭ～１０ｎＭの濃度で、ｉＰＳ細胞又は分化が開始したｉＰＳ細胞と接触させればよい。
（３２）において、Ｒｏｃｋ阻害剤は、１ｍＭ～１ｎＭ、中でも１００μＭ～１０ｎＭの濃度で、ｉＰＳ細胞又は分化が開始したｉＰＳ細胞と接触させればよい。
（３２）において、インドリノン化合物は、１Ｍ～１ｐＭ、中でも１０ｍＭ～１０ｐＭ、中でも１００μＭ～１００ｐＭの濃度で、ｉＰＳ細胞又は分化が開始したｉＰＳ細胞と接触させればよい。
（３３）ラミニンコーティングが、ヒト組み換え型ラミニンフラグメントでのコーティングである、上記（３２）に記載の分化誘導方法。
（３４）ヒトニューロジェニン２遺伝子の導入は、ＲＮＡリポフェクション法あるいはプラスミドベクター又はウイルスベクターにニューロジェニン２遺伝子を搭載し、ドキシサイクリン処理などにより一過性に発現誘導が可能になったベクターを用いて行う、上記（３２）又は（３３）に記載の分化誘導方法。
（３５）培養が、培養ディッシュ上の二次元培養である、上記（３２）～(３４)のいずれかに記載の分化誘導方法。
（３６）分化の開始、即ち工程２）を、Ｒｏｃｋ阻害剤が添加され、必要に応じてインドリノン化合物を添加したｉＰＳ細胞の維持培地で行う、上記（３２）～（３５）に記載の分化誘導方法。
（３６）において、Ｒｏｃｋ阻害剤の培地中の濃度は、１ｍＭ～１ｎＭ、中でも１００μＭ～１００ｎＭ、インドリノン化合物は、１Ｍ～１ｐＭ、中でも１０ｍＭ～１０ｐＭ、中でも１００μＭ～１００ｐＭとすることができる。
（３７）工程２）において、ベクターを用いてニューロジェニン２遺伝子が遺伝子導入されたｉＰＳ細胞を使用して一過性のニューロジェニン２の発現誘導を行う場合は、１６～２０時間の一過性の誘導である、必要に応じてインドリノン化合物を添加する、上記（３２）～（３６）のいずれかに記載の分化誘導方法。
（３８）工程３）において、分化の発達促進剤として、分化誘導の段階に対応して、
ａ）第一段階（一次培養）では、Ｒｏｃｋ阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ＧＳＫ３阻害剤、低分子ＴＧＦβファミリー阻害剤を添加し、必要に応じてインドリノン化合物を添加し、
ｂ）第二段階（二次培養）では、Ｒｏｃｋ阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニストを添加し、必要に応じてインドリノン化合物を添加し、
ｃ）第三段階（三次培養）では、Ｒｏｃｋ阻害剤を添加し、必要に応じて神経栄養因子及び/又はインドリノン化合物を添加する、上記（３２）～（３７）のいずれかに記載の神経細胞への分化誘導方法。
（３８）において、第一段階（一次培養）は細胞が神経前駆細胞からさらに分化を進める状態である段階をいい、第二段階（二次培養）は細胞が神経細胞への分化進行の状態である段階をいい、第三段階（三次培養）は細胞が神経細胞の分化完了に向かう状態である段階をいう。例えば、ｉＰＳ細胞へニューロジェニン２発現誘導剤添加培養開始（即ち、工程２）の開始）から、第一段階（一次培養）は０１～１４日目、第二段階（二次培養）は１４～６日目、第三段階（三次培養）は６～４０日目、特に６～２２日目とすることができる。
（３９）分化開始後のｉＰＳ細胞の培養では、レチノイン酸（ＲＡ）とＬＤＮ１９３１８９を使用しない、上記（３２）～（３８）のいずれかに記載の神経細胞への分化誘導方法。
（３９）において、分化開始は、工程２）の開始をいう。
（４０）細胞の活動度が弱く、分化の発達時に停滞又は死滅するｉＰＳ細胞においては、工程２）及び／または工程３）において、インドリノン化合物を分化誘導の培地に添加する、上記（３８）に記載の神経細胞への分化誘導方法。
（４１）ｉＰＳ細胞が神経疾患患者由来のｉＰＳ細胞である、上記（４０）に記載の神経細胞への分化誘導方法。
（４２）神経患者が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者である、上記（４１）に記載の神経細胞への分化誘導方法。
（４３）インドリノン化合物がセマキサニブ（Ｓｅｍａｘａｎｉｂ）である、上記（４１）～(４２)のいずれかに記載の神経細胞への分化誘導方法。
（４４）神経細胞が、運動神経細胞である、上記（３２）～(４３)のいずれかに記載の神経細胞への分化誘導方法。
（４５）上記（３２）～（４４）のいずれかに記載の分化誘導方法で作製される、ｉＰＳ細胞由来の神経細胞。
（４６）神経細胞が、運動神経細胞である、上記（４５）に記載のｉＰＳ細胞由来の神経細胞。
（４７）ゼノフリー培養系で長期間培養維持できる、上記（４５）又は（４６）に記載のｉＰＳ細胞由来の神経細胞。
（４８）長期間培養維持が、少なくとも４カ月間の培養維持である、上記（４６）のｉＰＳ細胞由来の神経細胞。
（４９）ｉＰＳ細胞が神経疾患患者由来のｉＰＳ細胞である、上記（４５）～（４８）のいずれかに記載のｉＰＳ細胞由来の神経細胞。
（５０）神経疾患患者が、ＡＬＳ患者である、上記（４９）に記載のｉＰＳ細胞由来の神経細胞。
（５１）ヒトニューロジェニン２遺伝子が導入されたＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞が、ゼノフリー培養系で一過性のニューロジェニン２の発現誘導を受けて分化誘導を開始し、インドリノン化合物の存在下に培養して得られた神経細胞。
（５２）上記（４５）～(５１)のいずれかに記載のｉＰＳ細胞由来の神経細胞を用いる、精神神経系疾患治療剤のスクリーニング方法。
（５３）ｉＰＳ細胞由来の神経細胞がＡＬＳ患者のｉＰＳ細胞由来の神経細胞であり、神経疾患治療剤がＡＬＳ治療剤である、（５２）に記載の神経疾患治療剤のスクリーニング方法。
（５２）及び（５３）のスクリーニング方法は、例えば、上記（４５）～(５１)のいずれかに記載のｉＰＳ細胞由来の神経細胞と被験物質を接触させる工程と、精神神経系疾患のバイオマーカーを、被験物質を接触させる場合と接触させない場合とで比較するか、又は被験物質を接触させた後と接触させる前とで比較する工程と、被検物質の接触により精神神経系疾患で低減するバイオマーカーでは増加させる被験物質を選択し、精神神経系疾患で増加するバイオマーカーでは低減させる被験物質を選択する工程を含む方法とすることができる。
精神神経系疾患のバイオマーカーとしては、遺伝子発現の変化や、産生タンパク質の種類及び／又は量の変化であって、その疾患に特有の変化を用いることができる。
ＡＬＳやアルツハイマー病をはじめとする神経変性疾患の場合、例えばニューロフィラメント軽鎖などの神経細胞の分解産物の増加を疾患の状態の程度のバイオマーカーにすることもできる。
（５４）インドリノン化合物を有効成分とする、ＡＬＳ患者のｉＰＳ細胞から分化誘導により神経細胞分化へとコミットした細胞群の細胞賦活剤。即ち、インドリノン化合物を有効成分とする、ＡＬＳ患者のｉＰＳ細胞からの分化誘導により、神経細胞に分化することが方向付けられた細胞群の細胞賦活化剤。
（５５）分化誘導される神経細胞が少なくとも１ヶ月間培養維持できるように賦活される、上記（５４）に記載の細胞賦活化剤。
（５６）分化誘導される神経細胞が４ヶ月間培養維持できるように賦活される、上記（５４）に記載の細胞賦活化剤。
（５７）神経細胞が運動神経細胞である、上記（５４）～（５６）のいずれかに記載の神経細胞賦活化剤。
（５８）インドリノン化合物がセマキサニブ（Ｓｅｍａｘａｎｉｂ）である、上記（５４）～（５７）のいずれかに記載の細胞賦活化剤。
（５９）ｉＰＳ細胞が、ニューロジェニン２の一過性の発現誘導ができるiＰＳ細胞である、上記（５４）～（５８）のいずれかに記載の細胞賦活化剤。
本発明の第１の態様
本発明のインドリノン化合物は、優れた神経細胞賦活化作用を有することから、損傷又は機能障害を受けた中枢系・末梢系の神経細胞あるいは移植神経幹細胞の賦活化に有用である。その結果、本発明の神経細胞賦活化剤は、精神神経系疾患の予防及び／又は治療剤として有用である。更に、本発明の化合物は、低分子化合物であることから、ＢＤＮＦやＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質薬剤と比較して安価であり、安定性に優れる。またＶＥＧＦタンパク質薬剤は血液脳関門を通過しないため脳室内投与が必要で、臨床利用に問題が大きいが、本発明の化合物はこのような問題がなく、中枢系の神経細胞あるいは移植神経幹細胞に好適に使用できる。また、下位運動ニューロンなどの末梢神経細胞にも有効である。
本発明のインドリノン化合物は、ＢＤＮＦ及び／又はＶＥＧＦシグナル伝達系を担う遺伝子群を同時に発現促進し、神経幹細胞の増殖と分化を促進し、ストレスあるいは疾患により委縮した樹状突起の再伸長や分岐を促進し、スパインの形成を促して神経可塑性を向上させる。その結果、神経細胞の賦活化が生じることになる。更には、ＢＤＮＦとＶＥＧＦシグナル伝達系神経栄養因子神経細胞におけるオートクライン発現により、神経細胞維持、神経可塑性や神経幹細胞の増殖と分化促進などが向上し、海馬での記憶再構成が促される。これらの効果により、本発明のインドリノン化合物は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、加齢に伴う神経障害（認知症など）、うつ病、統合失調症、双極性障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、不安障害、パニック障害、自閉症スペクトラム障害、発達障害、レット症候群、ダウン症候群、脳虚血障害、及び脊髄損傷などの多様な精神神経系疾患の治療又は予防薬、再生医療における治療又は予防薬、神経細胞賦活化剤として有用である。また、加齢による脳萎縮を抑えることにより、健康寿命の延長に貢献すると考えられる。
本発明の神経賦活化剤が、神経系の正常な機能維持の基礎となり、神経系の正常な機能維持のためには生理的条件下で共役して作用することが必要となる複数の神経栄養因子を同時に賦活化することにより、実施例で効果が実証されたＡＬＳのみならず、上記例示した多様な精神変性疾患及び精神疾患に対する未来型治療薬となり得ることの科学的根拠について以下に説明する。
本発明の神経賦活剤がＡＬＳ患者由来神経細胞の細胞死を回避させ、ＡＬＳ患者由来神経細胞生存維持効果を示し、かつ神経細胞の培養維持に必須と考えられているＢＤＮＦの添加を停止してからも神経細胞が維持できたことから、種々の神経細胞の生存維持に必須である神経細胞栄養因子のオートクラインを促進する活性があることが推測できた。測定の結果、ＢＤＮＦに加えて、ＶＥＧＦファミリー、ＶＥＧＦ受容体ファミリー、ＶＥＧＦ共受容体ニューロピリン-２（Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－２）の発現の賦活化が証明できた。
ＶＥＧＦ及びその受容体のファミリーは、血管形成に関わる増殖因子として発見されたが、その後神経栄養因子として重要な活性を有し、神経細胞の生存維持、神経新生、神経軸索伸長に重要な役割を果たすことが明らかになり（Ｊｉｎ Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００２）９９（１８）；１１９４６－１１９５０ “Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＶＥＧＦ） ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ”）（Ｓｏｎｄｅｌ Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ （１９９９）１９（１４）； ５７６１－５７４０ “Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｈａｓ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ａｘｏｎａｌ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ， ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｎｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ”）（Ａｌｍｏｄｏｖａｒ ＣＲ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ （２００９） ８９（２）； ６０７－６４８ “Ｒｏｌｅ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ＶＥＧＦ ｉｎ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ”）、加えて正常な記憶、学習などの脳機能維持に欠かせない神経可塑性を支えていることが示されている（Ｌｉｃｈｔ Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． （２０１１） １０８：５０８１－５０８６ “Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｂｙ ＶＥＧＦ”）。そして、その神経細胞保護作用から、ＡＬＳ及びアルツハイマー病などの神経変性疾患の治療への応用が進められてきた（Ｌａｎｇｅ Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ （２０１６） １２； ４３９－４５４ “Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ： ａ ｎｅｕｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ”）。また、２０１９年に米国ＦＤＡで承認された即効性のある強力な抗うつ剤ケタミンの効果発現には、ＢＤＮＦとＶＥＧＦが共同して機能することが必須であるとイェール大学から報告されている（Ｎｅｗｓ ｒｅｌｅａｓｅｓ： ｗｗｗ．ｎｉｈ．ｇｏｖ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｊａｎｕａｒｙ ３１， ２０１９ ＢＤＮＦ－ＶＥＧＦ ｉｎｔｅｒｐｌａｙ ｋｅｙ ｔｏ ｒａｐｉｄ ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ ａｃｔｉｏｎｓ）（Ｄｅｙａｍａ Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ （２０１９） ８６； １４３－１５２ “Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｅｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｑｕｉｒｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ”）。運動神経でオートクラインが行われる（Ｈｏｈｍａｎ ＴＪ．， ｅｔ ａｌ．， ＪＡＭＡ （２０１５）７２（５）； ５２０－５２９ “Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｃｌｉｎｅ“ ）。神経変性疾患のみならず、精神疾患の病態とその改善にも関与することが明らかになっている。
ＡＬＳは、病勢の進展が比較的速い運動神経変性疾患であり、球麻痺、四肢の筋萎縮、及び呼吸筋麻痺のため、診断から３～５年で死亡することが多い。治療薬については、延命効果を有すリルゾールとさらにＱＯＬの向上を示すエダラボンが認可されているが、効果は残念ながら限定的である。遺伝子変異が明らかになっている家族性ＡＬＳは５～１０％であり、孤発性が９０～９５％を占める。２００１年にＯｓｔｈｕｙｓｅらにより神経変性疾患の病態とＶＥＧＦ発現低下が関連することが明らかになり（Ｏｏｓｔｈｕｙｓｅ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ （２００１） ２８； １３１－８ “Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｐｏｘｉａ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃａｕｓｅｓ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”）、ＶＥＧＦ の運動神経細胞保護作用が明らかになった。その後、国際的なメタ解析によりＡＬＳ患者と健常者の遺伝子を比較したところ、孤発例を含めたＡＬＳの多くの症例でＶＥＧＦ発現低下によりＡＬＳ発症リスクが高まることがわかった（Ｌａｍｂｒｅｃｈｔｓ Ｄ， Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ（２００３） ３４； ３８３－９４ “ＶＥＧＦ ｉｓ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｒ ｏｆ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｄｅａｔｈ”）。２００６年にはＢｒｏｃｋｉｎｇらによりＡＬＳ患者脊髄前角の運動神経におけるＶＥＧＦＲ－２ ｍＲＮＡが検出限界以下に減少している症例が示された（Ｂｒｏｃｋｉｎｇｔｏｎ Ａ．， ｅｔ ａｌ．， ＮｅｕｒｏＰａｔｈｏｌ Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ （２００６） ６５； ２６－３６ “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ”）。
これらの結果をもとに、ＶＥＧＦを ＡＬＳの治療に用いる手法が積極的に検討されてきた（Ｏｒｉｏｎ Ｐ Ｋｅｉｆｅｒ Ｊｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ． （２０１４）１４１（３）； ２６１－７１ “Ｇｅｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ＶＥＧＦ ｆｏｒ ＡＬＳ”）（Ｔｏｖｅｒ－ｙ－Ｒｏｍｏ Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ （２０１４）８； ６１ “Ｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ａｓ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＡＬＳ ｔｈｅｒａｐｙ”）。ＶＥＧＦタンパク質は血液脳関門を通過できないため、薬剤として用いる場合には脳室内投与を行うが、ＡＬＳモデル動物においてＶＥＧＦ投与が発症を遅延させ、かつ延命効果があることが示された（Ｓｔｏｒｋｅｂａｕｍ Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ （２００５） ８（１）； ８５－９２ “Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＶＥＧＦ ｉｎ ａ ｒｏｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＡＬＳ”）。ウイルスベクターを用いた動物実験でも有意の効果が得られているが（Ａｚｚｏｕｚ Ｍ，， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （２００４） ４２９； ４１３－７ “ＶＥＧＦ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｉｔｈ ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅｌｙ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄ ｌｅｎｔｉｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｌｏｎｇｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ＡＬＳ ｍｏｄｅｌ”）、これはヒト医療に応用するには障害が大きい。現在、ＡＬＳ患者を対象としたいくつかのＶＥＧＦ脳室内投与法を用いた治験が行われきている（Ｏｒｉｏｎ Ｐ． Ｋｅｉｆｅｒ Ｊｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ．（２０１４）１４１（３）： ２６１－２７１ “Ｇｅｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ＶＥＧＦ ｆｏｒ ＡＬＳ”）（特許文献 特表２００８－５００３１２（Ｐ２００８－５００３１２Ａ）（Ｄａｍｍａ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｃｏｍｍｕｎ． （２０２０）２（２）； ｆｃａａ１６０ “Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ， ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ”）。ただし、これはポンプを備えた装置を脳に恒常的に設置することになるため、患者の身体的負担、高度な技術を要し、特殊な施設ではないと行えない、費用も高額になるなど観点から、本発明の神経細胞賦活化剤のアドバンテージが大きいことは明らかである。
アルツハイマー病においても、国際的なアルツハイマー病の発症予測や治療薬の効果判定法の確立を目的とした臨床研究団体ＡＤＮＩ（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ｎｅｕｒｏｉｍａｇｉｎｇ ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ）からＶＥＧFがアルツハイマー病と加齢による認知症のバイオマーカーとなり、脳脊髄液においてＶＥＧＦの濃度が高いほど認知能力が高く及び海馬の容積も大きいことが示された（Ｈｏｈｍａｎ ＴＪ．， ｅｔ ａｌ．， ＪＡＭＡ （２０１５） ７２（５） ； ５２０－５２９ “Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｃｌｉｎｅ“ ）。
ハンチントン病においても、ＶＥＧＦが神経細胞保護作用を有することが報告されている（Ｅｌｌｉｓｏｎ ＳＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． （２０１３）２１：１８６２－７５ “Ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＶＥＧＦ１６５ ｉｎ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｔｒｉａｔｕｍ”）。
神経変性疾患（ＡＬＳ， アルツハイマー病、ハンチントン病など）に加え、末梢性神経障害やてんかんにおいても、ＶＥＧＦファミリー、ＶＥＧＦの受容体ファミリー、ＶＥＧＦの共受容体が神経細胞保護作用を持ち、治療薬としての有効性が示唆されている（Ｌａｎｇｅ Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ （２０１６）１２（８）： ４３９－５４ “Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ： Ａ ｎｅｗ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ”）。
うつ病治療においてもＶＥＧＦが根本的な役割を果たすという研究がイェール大学を中心に行われている。抗うつ薬作用の分子メカニズムは明らかでないが、ひとつの仮説により、海馬における増殖因子のシグナル伝達と成人の神経発生の促進が、このような効果に関連する可能性が示唆される。Ｗａｒｎｅｒ－ＳｃｈｍｉｄｔとＤｕｍａｎは、異なる種類の抗うつ薬が海馬における神経栄養性因子であり血管新生促進性因子でもあるＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）の発現に及ぼす効果について検討した。この因子は、同研究グループが、過去に電気けいれん（ＥＣＳ）療法により増強されることを示していたものである。ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの含有量は、海馬ホモジネートにおけるＶＥＧＦの含有量と同様に、フルオキセチン（セロトニン再取り込み阻害薬）またはデシプラミン（ノルエピネフリン再取り込み阻害薬）を１４日間投与したラットの海馬顆粒細胞層において増大した。ＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ－１（ＶＥＧＦ受容体－２の別名）の薬理学的阻害は、ＥＣＳまたはフルオキセチンやデシプラミンへの慢性曝露により生成される海馬顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）における細胞増殖の増加を阻害したが、ＶＥＧＦアイソフォームの脳室内投与はＳＧＺの細胞増殖を促進した。さらに、Ｆｌｋ－１（ＶＥＧＦ受容体－２の別名）の薬理学的阻害は、慢性および亜慢性の抗うつ薬治療モデルにおけるデシプラミンのラット行動応答に及ぼす影響を阻害したが、ＶＥＧＦは抗うつ薬様の効果を示した。以上より、著者らは、いくつかの種類の抗うつ薬の行動的影響とそれらがＳＧＺ細胞増殖に及ぼす影響の両方を仲介するうえで、ＶＥＧＦが重要な役割を担うとの結論に達している（Ｊ． Ｌ． Ｗａｒｎｅｒ－Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｒ． Ｓ． Ｄｕｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． （２００７）１０４； ４６４７－４６５２ “ＶＥＧＦ ｉｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔｓ”）。
２０１９年に米国ＦＤＡで承認された即効性のある強力な抗うつ剤ケタミンの効果発現には、ＶＥＧＦ がその機能を担い（Ｄｅｙａｍａ Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ． （２０１９）１７６（５）； ３８８－４００ “Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｎａｌ ＶＥＧＦ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ Ｃｏｒｔｅｘ ｉｎ ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｋｅｔａｍｉｎｅ“）、かつＢＤＮＦとＶＥＧＦが共同して機能することが必須であると報告されている（Ｎｅｗｓ ｒｅｌｅａｓｅｓ： ｗｗｗ．ｎｉｈ．ｇｏｖ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｊａｎｕａｒｙ ３１， ２０１９ “ＢＤＮＦ－ＶＥＧＦ ｉｎｔｅｒｐｌａｙ ｋｅｙ ｔｏ ｒａｐｉｄ ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ ａｃｔｉｏｎｓ”）（Ｄｅｙａｍａ Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ （２０１９） ８６； １４３－１５２ “Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｑｕｉｒｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ”）。
加えて、イェール大学のグループは、ＶＥＧＦ－ＣとＶＥＧＦ－Ｄ、およびそれらの受容体であるＶＥＧＦ受容体－２及びＶＥＧＦ受容体－３（なお、ＶＥＧＦ受容体－２は、ＶＥＧＦ－Ａ、Ｃ、Ｄの受容体であり、ＶＥＧＦ受容体－３は、ＶＥＧＦ－Ｃ、Ｄの受容体である。）が、海馬における神経前駆細胞の増殖と分化を促進し、成人海馬における神経新生に必須であることを示している （Ｈａｎ Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ （２０１５） １０； １１５８－１１７２ “Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｈｕｍａｎｓ”）。特許文献２、特許文献３は、ＶＥＧＦ－ＣとＶＥＧＦ－Ｄタンパク質、およびそれらの受容体であるＶＥＧＦ受容体－２／３の活性化剤が、加齢及び神経変性疾患の治療薬として有用であることを記載している。
従って、本発明の神経賦活剤が多くの精神神経系疾患の未来型治療薬として大きな可能性を持つことが明らかである。
次に、ＢＤＮＦは、神経細胞の新生、神経前駆細胞の分化と成長、及び神経突起の伸長促進を司る神経栄養因子であり、脳神経の生存や神経突起の維持と疾患により委縮した神経突起の再伸長（Ｄｅｙａｍａ Ｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ （２０１９） ８６；１４３－１５２ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｅｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｑｕｉｒｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）に欠かすことができず、中枢神経系に見られる神経細胞による複雑なネットワーク構築を支える。成熟した神経細胞では、シナプスの形成と消滅、及び学習と記憶に関する神経の可塑性を司り、正常な脳機能の維持を行う（Ｍａｔｔｓｏｎ ａｎｄ Ｗａｎ， Ｎｅｕｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄ （２００８） １０； １５７－１５８）（Ｍｉｒａｎｄａ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（ ２０１９） １３； ３６３ “Ｂｒａｉｎ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ： Ａ Ｋｅｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｆｏｒ Ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｅａｌｔｈｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｒａｉｎ”）。これまでにＢＤＮＦが多くの神経変性疾患及び精神疾患のバイオマーカーであり、精神神経系疾患や脊髄損傷に対する治療効果があることが証明されている。２０１９年には東京医科歯科大学のグループにより、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡを脊椎損傷モデルマウスの損傷部位に投与して損傷部位でのＢＤＮＦ発現を増強することにより、早期運動機能回復が得られることが明らかにされた（Ｃｒｏｗｌｅｙ ＳＴ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ （２０１９） １７： ４６５－４７６“Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ Ｍｉｃｅ ｂｙ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｂｒａｉｎ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ ｍＲＮＡ”）。
ＢＤＮＦは、アルツハイマー型認知症と加齢に伴う認知障害のバイオマーカーであり（ Ｂｅｅｒｉ ＭＳ． ａｎｄ Ｓｏｎｎｅｎ Ｊ．， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ． （２０１６）８６（８）；７０２－３ “Ｂｒａｉｎ ＢＤＮＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓ ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｒｅｓｅｒｖｅ ａｇａｉｎｓｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ”） 、記憶を健康に保つための鍵となる分子で（Ｍａｇｄａｌｅｎａ Ｍｉｒａｎｄａ、ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ （２０１９） １３； ３６３ “Ｂｒａｉｎ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ： Ａ Ｋｅｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｆｏｒ Ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｅａｌｔｈｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｒａｉｎ”） （Ｔａｐｉａ－Ａｒａｎｃｉｂｉａ ｅｔ ａｌ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｒｅｖ（２００８）５９：２０１－２２０ Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｂｒａｉｎ ＢＤＮＦ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｇｉｎｇ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ“）、アルツハイマー病とパーキンソン病の有効な治療薬と考えられている（Ｓａｍｐａｉｏ， Ｔ．ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒａｌ Ｒｅｇｅｎ． Ｒｅｓ． （２０１７）１２； ５４９－５５７ “Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ”）。
ハンチントン病においても、ＢＤＮＦはバイオマーカーである（ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ （２０２０） １２： ａｒｔｉｃｌｅ ３３５ “Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｍｅａｓｕｒｅｓ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｒａｉｎ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ （ＢＤＮＦ） ａｓ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｉｎ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ”）。
うつ病の生涯有病率は約１０～２０％と非常に高く、自殺者のうちの６０～７０％がうつ病であると言われ、うつ病の病態解析と治療法の開発が喫緊の社会的課題である（橋本謙二 脳と精神の医学（２００９）２０（１）；５５－６０ ”脳由来神経栄養因子とうつ病“）。うつ病と不安障害においてＢＤＮＦ低下が関与し（Ｍａｒｔｉｎｏｗｉｃｈ Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｒｏｓｃｉ．（２００７）１０； １０８９－１０９３ “Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ＢＤＮＦ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｎｘｉｅｔｙ”）、抗うつ剤や電気刺激によるうつ病治療において、奏功があった症例ではＢＤＮＦが増加し、またＢＤＮＦ投与によってもうつ病改善がみられるという報告が数多くある（Ｓｅｎ Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．（ ２００８）６４（６）；５２７－３２ ”Ｓｅｒｕｍ ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ， ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ， ａｎｄ ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ： ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｅｓ ａｎｄ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ“）（Ｓｈｉｒａｙａｍａ Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２００２）２２（８）；３２５１－６１ “Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ”）。現在、セロトニン再取り込み阻害剤などの、モノアミン系化合物を標的とした抗うつ剤の限界について論議されており、ＢＤＮＦ産生を促進する物質が新規抗うつ剤のシーズとして注目され、各種の漢方薬についてスクリーニングが行われている(福地守、薬学雑誌（２０１７）１３７（９）；１１０３－１１１５）。
ＢＤＮＦ低下は、双極性障害のバイオマーカーであり（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （２０１５） １３；２８９ “Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ （ＢＤＮＦ） ａｓ ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｂｉｐｏｌａｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒ： ａ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ５２ ｓｔｕｄｉｅｓ”） 、統合失調症などの妄想幻覚を伴う重篤な精神病のバイオマーカーであり（Ｎｉｅｔｏ ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ（２０２１）１２；６６２４０７ “ＢＤＮＦ ａｓ ａ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｏｆ Ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ／Ｐｓｙｃｈｏｓｉｓ： Ａｎ Ｕｐｄａｔｅｄ Ｒｅｖｉｅｗ”）、自閉症スペクトラム障害のバイオマーカーである（Ｓａｇｈａｚａｄｅｈ Ａ． ａｎｄ Ｒｅｚａｅｉ Ｎ．， Ｊ Ａｕｔｉｓｍ Ｄｅｖ Ｄｉｓｏｒｄ． （２０１７） ４７（４）：１０１８－１０２９ “Ｂｒａｉｎ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ Ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ Ａｕｔｉｓｍ： Ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ Ｍｅｔａ－Ａｎａｌｙｓｉｓ”）。
ＢＤＮＦを単独で用いた治験において十分な効果が示されてこなかった理由として、ＢＤＮＦ以外の細胞栄養因子の共同作用が必要なことが指摘されてきたが（Ｓｈａｎｍｕｋｈａ Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ Ｄｉｓ （２０１７） １７： ４４－５８）、実際に２０１９年に米国ＦＤＡで認可された即効性のある強力な抗うつ剤ケタミンの効果発現には、ＢＤＮＦとＶＥＧＦが共同して機能することが必須であるとイェール大学から報告されている（Ｎｅｗｓ ｒｅｌｅａｓｅｓ： ｗｗｗ．ｎｉｈ．ｇｏｖ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｊａｎｕａｒｙ ３１， ２０１９ “ＢＤＮＦ－ＶＥＧＦ ｉｎｔｅｒｐｌａｙ ｋｅｙ ｔｏ ｒａｐｉｄ ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ ａｃｔｉｏｎｓ”）、（Ｄｅｙａｍａ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ （２０１９）８６；１４３－１５２ “Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｅｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｑｕｉｒｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ”）。
以上をまとめると、精神神経系疾患治療薬が生理的に機能するためには、複数の神経栄養因子が共同して働く必要があるが、従来の薬剤の開発は単一の標的物質をねらって行われており、このことが、従来法で開発された薬品が論理上期待される効果を発揮できなかった理由の一つであることは明らかである。また、タンパク質製剤と比較しても、本発明の神経細胞賦活化剤は、低分子化合物であるため、安価で、保存が容易であり、かつ血液脳関門も通過すると考えられるメリットがある。本発明の神経賦活化剤は、正常な神経系の機能が行われるために生理学的に必要とされる複数の神経栄養因子を賦活化するという機能性により、これまで創薬では考えられてこなかった生理的機能性を有す未来型の薬剤を提供し、ＡＬＳに限られず、アルツハイマー病やパーキンソン病、認知症、うつ病の治療－これらは、多くの社会的にインパクトの大きい－に寄与する可能性がある。従って、社会的および経済的に莫大な貢献をもたらすものである。
本発明の第２の態様
本発明の分化誘導方法では、ゼノフリー培養系で胚葉体（細胞凝集体）の形成を経ることなく、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から神経細胞に高効率に分化誘導することができるようになった。そのため、異種生物由来物質の混入を回避でき、ヒトへの再生医療への応用が可能になった。また、胚葉体（細胞凝集体）を形成せずに神経細胞に分化誘導できることから、浮遊細胞用容器に移送して培養する工程が省略でき、安定した分化誘導のための培養が可能となった。更には、分化の発達促進剤の添加が最大６種で済み、最終分化における神経栄養因子又はインドリノン化合物の添加を併せて最大９種の試剤で培養が可能であるため、工程管理が容易になり、夾雑物の削減が図れるようになった。特に、神経疾患患者由来のｉＰＳ細胞などの場合に、細胞の活動度が低いものであっても、インドリノン化合物を添加することにより、サバイビン遺伝子の発現促進が可能になり、途中で細胞が死滅することなく最終分化した神経細胞が作製できるようになった。
また、従来の神経系細胞の分化培養に使用される分化誘導剤であるレチノイン酸（ＲＡ）やＬＤＮ１９３１８９を使用することなく、ヒト疾患患者由来ｉＰＳ細胞から神経細胞に分化誘導でき、得られた神経細胞を長期間維持できるようになった。
特に、ゼノフリー培養系で得られたＡＬＳ患者由来の運動神経細胞の培養物は、これまでになかったものであり、同定できない多数の組成物の混雑、及びそれぞれの組成物の混雑量を制御できないという大きな問題を抱える生物由来の培養補助物（血清、フィーダー細胞、マトリジェル）由来の夾雑物を含まず、由来が明確で添加量も一貫して制御で可能な材料のみの使用に単純化されているので、創薬スクリーニングへの有用な手段を提供することができる。加えて、混入状態にばらつきのある夾雑物の影響を回避できることから、より高い再現性が担保できる。即ち、さらなる神経細胞レベルでの機能・病態解明の手段を提供することができる。また、ＲＮＡリポフェクション法で分化開始されたｉＰＳ細胞からの神経細胞では臨床応用が可能なものとなっている。即ち、本発明の運動神経細胞を用いて、再生医療や細胞療法が行えるようになったと考えられる。
更に、本発明の分化培養方法では、健常者あるいは疾患患者由来ｉＰＳ細胞から成熟神経細胞を容易に分化誘導できるため、この成熟神経細胞を使用して神経疾患治療剤のスクリーニングが容易であり、創薬に有用な手段を提供することができる。
Ａ．ｉＰＳ細胞株のフィーダーフリーかつゼノフリー培養系への順化が確立したことを示す顕微鏡画像である。Ｂ．ｉＰＳ研究所が提供している、フィーダー細胞を用いて培養したｉＰＳ細胞塊の顕微鏡画像である（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｉｊｉ．ｃｏｍ／ｊｃ／ｄ４？ｐ＝ｙｎｓ００２－０５７２８４９１＆ｄ＝ｄ４＿ｎｅｗｓ）。 ｉＰＳ細胞から運動神経細胞への分化手法を確立したことを示す図である。Ａ．健常者由来ｉＰＳ細胞の位相差顕微鏡画像を示した図である。Ｂ．健常者由来ｉＰＳ細胞から分化させた運動神経細胞（分化誘導３３日目）の位相差顕微鏡画像を示した図である。Ｃ．ｉＰＳ細胞から運動神経細胞に分化するときのマーカー遺伝子の発現動態を示した模式図である。ｉＰＳ細胞の分化に伴い、まず神経前駆細胞マーカー（ＰＡＸ６）が発現するが、その後分化の進行とともに発現が減少する。次に運動神経細胞マーカー（ＨＢ９）が発現し、その発現は運動神経細胞への分化に伴い増加する。そして、最終的に成熟運動神経マーカーが発現する。成熟運動神経細胞マーカーには、神経伝達物質受容体ＧｌｕＡ１を用いた。 ｉＰＳ細胞から運動神経細胞への分化に伴う図２Ｃで述べた分化マーカーｍＲＮＡ の発現変化を示す図である。神経前駆細胞マーカー（ＰＡＸ６）の発現は、分化誘導１５日目にはコントロールと比較して約３２００倍に増加し、その後分化に伴い分化３３日目には約１５００倍に低下した（上図）。運動神経マーカー（ＨＢ９）の発現は、分化に伴い分化誘導１５日目にはコントロールと比較して約２２００倍に増加し、３３日目には約６６００倍に達した（中図）。成熟神経細胞マーカー（神経伝達物質受容体ＧｌｕＡ１）の発現は、分化誘導１５日目まではほとんど変化せず、３３日目には約６００倍に増加した（下図）。以上のことから、ｉＰＳ細胞から運動神経細胞への分化が進行したと判断し、この遺伝子発現の動態をその後のｉＰＳ細胞の運動神経細胞への分化を確認するための指標とした。 インドリノン化合物（セマキサニブ）添加による孤発性ＡＬＳ患者由来神経細胞生存維持への効果を示す顕微鏡画像である。Ａ．健常者由来ｉＰＳ細胞を運動神経細胞に分化させた時、セマキサニブ（Ｓｅｍａｘａｎｉｂ）の添加によって、形態上ネガティブな影響を受けないことを示した顕微鏡画像である。Ｂ．孤発性ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞を運動神経細胞に分化させた時、セマキサニブの添加によって、運動神経細胞が細胞死から免れたことを示した顕微鏡画像である。分化初期（分化誘導１日目）にはセマキサニブの添加による差がみられない（左列）。しかし分化誘導１５日目になるとコントロールでは細胞が死滅したが、セマキサニブ添加群では神経突起を伸ばした細胞が認められ（中列）、分化誘導２７日目では健常者由来の運動神経細胞と同等の位相差顕微鏡画像が認められた（右図）。 セマキサニブ添加によるＢＤＮＦ発現促進効果を示した図である。セマキサニブの添加によって、健常者由来神経細胞におけるＢＤＮＦ発現はコントロールと比較して約４．６倍に増加し、孤発性ＡＬＳ患者由来神経細胞ではｉＰＳ細胞と比較して約３．４倍に増加した。セマキサニブの添加によって、ＢＤＮＦの神経細胞自身によるオートクラインが行われていることを示している。左図：健常者由来、右図：孤発性ＡＬＳ患者由来。 セマキサニブの添加による神経細胞生存維持、神経可塑性（樹状突起の伸長と分岐の促進）、神経幹細胞の増殖と分化促進に係る遺伝子の発現への効果を健常者由来細胞を用いて検討した。神経可塑性（樹状突起の伸長と分岐の促進）及び生存維持に係るＶＥＧＦ－Ａは、コントロールの約３倍に発現が増加した（上左図）。神経幹細胞の増殖と分化促進に係るＶＥＧＦ－Ｃは、コントロールの約９．３倍に発現が増加した（上中図）。神経幹細胞の増殖と分化促進に係るＶＥＧＦ－Ｄは、コントロールの約１８倍に発現が増加した（上右図）。ＶＥＧＦ－ＡとＶＥＧＦ－ＣとＶＥＧＦ－Ｄの受容体であるＶＥＧＦ受容体－２は、神経細胞への分化に伴い発現がｉＰＳ細胞の５０％に減少したが、セマキサニブの添加によってコントロールの約２．４倍に発現が増加した（下左図）。神経幹細胞の増殖と分化促進に係るＶＥＧＦ－ＣとＶＥＧＦ－Ｄの受容体であるＶＥＧＦ受容体－３は、コントロールの約４倍に発現が増加した（下中図）。神経幹細胞の増殖と分化促進に係るＶＥＧＦ受容体－２とＶＥＧＦ受容体－３の共受容体であるニューロピリン２は、コントロールの約４倍に発現が増加した（下右図）。セマキサニブは上記のようにＶＥＧＦシグナル伝達系に関わる遺伝子群の発現を増大させることが示された。 セマキサニブの添加による神経細胞生存維持、神経可塑性（樹状突起の伸長と分岐の促進）、神経幹細胞の増殖と分化促進に係る遺伝子の発現への効果を孤発性ＡＬＳ患者由来細胞を用いて検討した。セマキサニブを添加しない場合、１５日目に細胞が死滅したため、ｉＰＳ細胞との比較を行った。神経可塑性（樹状突起の伸長と分岐の促進）及び生存維持に係るＶＥＧＦ－Ａは、ｉＰＳ細胞の約２倍に発現が増加した（上左図）。神経幹細胞の増殖と分化促進に係るＶＥＧＦ－Ｃは、ｉＰＳ細胞の約５．５倍に発現が増加した（上中図）。神経幹細胞の増殖と分化促進に係るＶＥＧＦ－Ｄは、ｉＰＳ細胞の約４倍に発現が増加した（上右図）。ＶＥＧＦ－ＡとＶＥＧＦ－ＣとＶＥＧＦ－Ｄの受容体であるＶＥＧＦ受容体－２は、神経細胞への分化に伴い発現がｉＰＳ細胞の約３０％に減少した（下左図）。神経幹細胞の増殖と分化促進に係るＶＥＧＦ－ＣとＶＥＧＦ－Ｄの受容体であるＶＥＧＦ受容体－３は、ｉＰＳ細胞の約７３％に発現が減少した（下中図）。神経幹細胞の増殖と分化促進に係るＶＥＧＦ受容体－２とＶＥＧＦ受容体－３の共受容体であるニューロピリン２は、ｉＰＳ細胞の約５倍に発現が増加した（下右図）。セマキサニブは上記のようにＶＥＧＦ受容体－2及びＶＥＧＦ受容体－３を除き、ＶＥＧＦシグナル伝達系に関わる遺伝子群の発現を増大させることが示された。 本発明の神経細胞分化誘導方法の概要を表した図である。 ドキシサイクリンで一過性に発現誘導できるヒトニューロジェニン２遺伝子が遺伝子導入された健常者由来ｉＰＳ細胞をドキシサイクリン（ＤＯＸ）存在下で１６時間培養したもの（右図）とＤＯＸ非存在下で１６時間培養したもの（左図）を示す位相差顕微鏡写真の画像である。右図の場合、ほとんどのｉＰＳ細胞が突起を伸ばし始め、神経前駆細胞様に形態変化をしていることが示された。一方、ＤＯＸ非存在下の場合には、神経前駆細胞様の細胞は見出せなかった。ＤＯＸの存在により、ヒトニューロジェニン２の発現が誘導されたｉＰＳ細胞において分化が開始され、神経前駆細胞様の細胞に変化したことが示されている。 図８の神経幹細胞様の細胞を更に培養を継続した時の細胞の変化を表した図である。ＤＯＸ存在下でｉＰＳ細胞を合計２４時間培養した場合でも、右図に示されるように神経前駆細胞様の形態が維持されていた。 健常者由来ｉＰＳ細胞を分化誘導開始後、１日目、３日目、３２日目の神経前駆細胞様の細胞の神経細胞への形態変化の推移を位相差顕微鏡写真で表した図である。分化誘導１日目から神経突起の伸長が観察される（上右図ｂ）。分化誘導３日目にはすべての細胞からさらに神経突起の伸長が進行する（下左図ｃ）。分化誘導３２日目には神経突起の発達した神経細胞が観察された（下右図ｄ）。 健常者由来ｉＰＳ細胞から運動神経細胞への分化に伴う分化マーカーｍＲＮＡの発現の変化を示した図である。神経前駆細胞マーカーとして、ＰＡＸ６のｍＲＮＡの発現は分化誘導４日目には増加が観察され、分化誘導１５日目に最大値に達し（ｉＰＳ細胞での発現を１とすると約３２００倍）、その後徐々に減少に転じる（上図ａ）。運動神経細胞マーカーのＨＢ９の発現は分化誘導１５日目に急激に増加し（ｉＰＳ細胞での発現を１とすると約２２００倍）、神経細胞への成熟に従って増加していく（中図ｂ）。神経伝達物質グルタミン酸レセプターのサブユニットの一つＧｌｕＡ１の発現は、分化誘導１８日目に急激に増加し（ｉＰＳ細胞での発現を１とすると約６６０倍）、その後も高い発現を維持する（下図ｃ）。これらのことから、当該方法によるｉＰＳ細胞から神経幹細胞を経て成熟運動神経細胞へ分化が進行し、分化誘導３３日目までには成熟運動神経細胞が成立する。 孤発性ＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞の分化誘導開始後、インドリノン化合物の添加あるなしでの１６時間後、１５日目、２６日目の神経幹細胞様の細胞の神経細胞への形態変化の推移を位相差顕微鏡写真で表した図である。ｂ）分化誘導１６時間後には、正常人由来ｉＰＳ細胞と同様に（図８～１０）、神経突起の伸長がインドリノン化合物添加なし（左図）とインドリノン化合物添加あり（右図）においてともに観察される。ｃ）分化誘導１５日目になるとインドリノン化合物添加なし（左図）の細胞は死滅したが、インドリノン化合物添加あり（右図）ではさらに神経突起の伸長が進行する。分化誘導２６日目にはインドリノン化合物添加ありの場合に神経突起の発達した神経細胞が観察された。一方、健常者由来ｉＰＳ細胞から分化した神経細胞では、長期保持（４か月まで確認）できている。 健常者由来及びＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞および分化後のそれぞれの神経細胞におけるアポトーシス阻害タンパク質サバイビンのｍＲＮＡ発現量の相対比を示したものである。健常者由来及びＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞のサバイビンの発現を比較すると、ＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞では健常者由来ｉＰＳ細胞の約１８％にサバイビン発現量が低下していた。健常者由来ｉＰＳ細胞から分化した神経細胞では、インドリノン化合物を添加した場合、添加しない神経細胞と比較してサバイビンｍＲＮＡ発現量が３倍に増加していた。ＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞は神経細胞に分化させると死滅するが、インドリン化合物を添加して分化させたＡＬＳ患者由来神経細胞ではサバイビンの発現量がＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞と比較して約３倍増加しており、健常者由来神経細胞（インドリノン添加なし）の８０％まで達した。
本発明の第１の態様
本発明の「インドリノン化合物」とは、一般式（１）
Figure 0007300240000003
［式中、Ｒ1、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、置換又は無置換の炭素数１～４の低級アルキル基、ホルミル基、アセチル基、カルボキシル基、置換又は無置換の炭素数１～４の低級アルコキシカルボニル基又は置換又は無置換の炭素数１～４の低級アルキルアミド基であり、置換基としては、ハロゲン原子、カルボキシル基、炭素数１～４の低級アルコキシカルボニル基、炭素数１～４のジ低級アルキルアミノ基である。
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、置換又は無置換の炭素数１～４の低級アルキル基、炭素数１～４の低級アルコキシ基、炭素数１～４の低級アルキルカルボニル基、炭素数１～４の低級アルコキシカルボニル基、カルボキシル基および水酸基からなる群より独立して選択され、置換基としては、ハロゲン原子、カルボキシル基、炭素数１～４の低級アルコキシカルボニル基である。］で表されるインドリノン化合物もしくはその薬学上許容される塩のことを言う。炭素数１～４の低級アルキル基とは、メチル基、エチル基，ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基のことを挙げることができる。好ましくは、メチル基、エチル基を上げることができる。ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子のことを挙げることができる。好ましくは、フッ素原子、塩素原子のことを挙げることができる。インドリノン化合物としては、ＵＳ５７９２７８３（又は日本特許第３２３１０４４号）に記載の化合物を用いることができ、好ましいものとしては、上記のＲ1、Ｒ２およびＲ３が、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、エチル基、ハロゲン原子、ホルミル基、アセチル基、カルボキシル基、エチルオキシカルボニル基、メトキシカルボニルメチル基、エトキシカルボニルメチル基、２－カルボシキエチル基、２－メトキシカルボニルエチル基、２－エトキシカルボニルエチル基、２－ジエチルアミノエチルアミド基であり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基であるインドリノン化合物を挙げることができる。より好ましいものとして、３－［（２，４－ジメチルピロール－５－イル）メチレン］－２－インドリノン（Ｓｅｍａｘａｎｉｂ）、３－［（４－（２－カルボキシエチル）－３－メチルピロール－５－イル）メチレン］－２－インドリノン、３－［（３－エトキシカルボニル－２，４－ジメチルピロール－５－イル）メチレン］－２－インドリノン、５－クロロ－３－［（２，４－ジメチルピロール－５－イル）メチレン］－２－インドリノン（Ｃｈｌｏｒｏ－Ｓｅｍａｘａｎｉｂ）、５－フルオロ－３－［（３－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－２，４－ジメチルピロール－５－イル）メチレン］－２－インドリノン（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）を挙げることができる。更に好ましいものとして、下記化学式
Figure 0007300240000004
 を有する３－［（２，４－ジメチルピロール－５－イル）メチレン］－２－インドリノン（セマキサニブ、Ｓｅｍａｘａｎｉｂ）を挙げることができる。
本発明のインドリノン化合物は、ＵＳ５７９２７８３に記載の方法に準じて合成することができる。
インドリノン化合物の薬学上許容される塩とは、酸付加塩を挙げることができる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩等の無機酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩を挙げることができる。
本発明の「脳由来神経栄養因子」とは、ＢＤＮＦ（Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）のことを言う。ＢＤＮＦは、脳内に広く分布しており、神経細胞の分化の引き金となり、さらに成熟を促進している。また、神経伝達物質合成酵素の発現を上昇させ、シナプス分子の増加や機能強化を通じて、シナプス伝達効率を上げている。
本発明の「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）」とは、一般にＶＥＧＦ－Ａのことを言い、その他のＶＥＧＦファミリーに属するものとして、ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＰＬＧＦ）、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄがあり、血管新生やリンパ管新生に対し重要な役割を果たす。血管新生に係る増殖因子として発見されたためその名がついたが、その後神経細胞栄養因子として重要な活性を有し、神経細胞の生存維持、神経新生、神経軸索伸長、正常な記憶及び学習などの脳機能維持に欠かせない神経可塑性を支えていることが認定されている。これらＶＥＧＦファミリーのタンパク質は、受容体型チロシンキナーゼであるＶＥＧＦ ｒｅｓｅｐｔｏｒ （ＶＥＧＦＲ）の自己リン酸化を誘導する。このＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ受容体システムを介した細胞内シグナル伝達により生物学的機能が惹起されることになる。
本発明の「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達系タンパク質」は、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ受容体－２（ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄの受容体）、ＶＥＧＦ受容体－３（ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄの受容体）、及びニューロピリン２（ＶＥＧＦ－ＡとＶＥＧＦ－ＣとＶＥＧＦ－Ｄの共レセプター）を含む。ＶＥＧＦ－Ａは血管新生および血管透過性を調節し、ＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄは、主にリンパ管新生を調節する。ＶＥＧＦ－Ａは、神経細胞の生存維持に重要な役割を果たす。さらにＶＥＧＦ－Ａは神経可塑性、例としてうつ病やＰＴＳＤなどにより減少したスパインの形成とシナプス形成、樹状突起の再伸長と分岐に重要な役割を果たす。ＶＥＧＦ－Ｃ及びＶＥＧＦ－Ｄは神経幹細胞の増殖と分化促進に重要な役割を果たす。また、ＶＥＧＦはニューロピリンとＶＥＧＦ受容体の両方からなる受容体複合体に結合する。この受容体複合体はＶＥＧＦシグナル伝達活性を有することが知られている。
そこで、リコンビナントＶＥＧＦ－ＣとＶＥＧＦ－Ｄのタンパク製剤を使用して、ダウン症候群、アルツハイマー病等の多様な神経変性性疾患の治療薬として使用することが検討されている（特許文献４と５）。しかし、これらはタンパク質製剤であるため、脳内標的組織への送達制御が困難であった。
本発明のインドリノン化合物は、上記ＢＤＮＦ及び／又はＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質群を発現増強又は発現促進させる特徴を有している。また、インドリノン化合物によっては、例えばセマキサニブに示されるように、上記ＢＤＮＦとＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質群を同時発現増強させる特徴を有している。ＢＤＮＦとＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質群は、生理的に治療効果を示すために共役して働く必要性があることが認められている（非特許文献７）。これらの結果、神経可塑性（樹状突起の再伸長と分岐、スパインの形成とシナプス形成）を助長すると共に、神経幹細胞の増殖及び分化を促進することが新たに見出された。従って、本発明のインドリノン化合物を使用することにより、神経細胞生存維持に加えて神経可塑性が促進され、神経幹細胞の増殖及び分化が促進されて、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、加齢に伴う神経障害（認知症など）、うつ病、統合失調症、双極性障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、不安障害、パニック障害、自閉症スペクトラム障害、発達障害、レット症候群、ダウン症候群等の精神神経系疾患を改善できると考えられる。また、神経幹細胞の増殖・分化を促進することから、失った神経細胞が補われることになるので、脳虚血後の症状回復や、脊髄損傷後の機能回復、健康寿命の延伸、再生医療における移植神経幹細胞の維持定着にも有用であると考えられる。
強力で即効性のある抗うつ剤として、解離性麻酔薬ケタミンが２０１９年に米国ＦＤＡによって認可された。ケタミンが、抗うつ作用を発揮するには、ＢＤＮＦの投与や発現増幅だけでは不十分であり、ＶＥＧＦによる共役が必要であるとされている（非特許文献７）。即ち、抗うつ作用を確実なものとするためには、ＢＤＮＦとＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質の両者を同時に発現促進することが、抗うつ剤としての生理的機能の発現に必須であると考えられる。このように、ＢＤＮＦとＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質を同時に発現促進させ、生理学的に共役することによって、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、加齢に伴う神経障害（認知症など）、うつ病、統合失調症、双極性障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、不安障害、パニック障害、自閉症スペクトラム障害、発達障害、レット症候群、ダウン症候群を含む多様な精神神経系疾患や、脳虚血、神経損傷等の治療、症状改善に、より有効になると考えられる。
しかも、本発明化合物は低分子化合物であるため、脳内への移行が容易であり、しかも安定で保存が容易である。また、本発明化合物が安定で保存が容易であることから、タンパク製剤では実現できなかった点鼻薬やパッチ剤などの簡易な医薬品の開発が可能となっている。
本発明の「神経細胞賦活化剤」とは、損傷を受けた神経細胞、機能障害を起こした神経細胞あるいは移植された神経幹細胞において、神経可塑性（樹状突起の再伸長と分岐、スパインの形成とシナプス形成）を助長し、アポトーシス（損傷を受けた神経細胞の細胞死）を回避して神経細胞生存維持を助け、又は神経幹細胞の増殖・分化を促進させることにより、神経細胞の維持を図ることを言う。
損傷を受けた神経細胞としては、例えば脳虚血障害、脊髄損傷に係る神経細胞における損傷を受けた細胞を挙げることができる。また、損傷を受けた神経細胞としては、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの損傷を受けた神経細胞が脱落する疾患における脱落する神経細胞も挙げることができる。機能障害を起こした神経細胞としては、例えばうつ病、統合失調症、双極性障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、パニック・不安障害、レット症候群、ダウン症候群、自閉症スペクトラム、発達障害、認知症を含む加齢に伴う神経障害などの原因となる神経細胞などを挙げることができる。移植された神経幹細胞としては、例えば脊髄損傷、アルツハイマー病またはパーキンソン病の治療に用いられた移植神経幹細胞、あるいは黄斑変性症の治療に使用されるｉＰＳ細胞に由来する神経細胞などを挙げることができる。
本発明の「精神神経系疾患」とは、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、加齢に伴う神経障害（認知症など）、うつ病、統合失調症、双極性障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、不安障害、パニック障害、自閉症スペクトラム障害、発達障害、レット症候群、ダウン症候群などを挙げることができる。
本発明の「発現促進剤」とは、ＢＤＮＦ及び／又はＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質を発現促進又は発現増強させることを言う。ＢＤＮＦとＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質の同時発現の場合には、神経可塑性と神経幹細胞の増殖及び分化をより効果的に促進することができる。本発明の発現促進剤は、優れたＢＤＮＦ発現促進効果を有し、ＢＤＮＦの発現増加によって、委縮した樹状突起の再伸長や分岐が起こり、スパインの形成が促され神経可塑性が向上する。さらには海馬での記憶再構成が促される。また、本発明の発現促進剤は、優れたＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体とその共受容体の発現促進を有し、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体とその共受容体の発現増加によって、ＡＬＳにおける運動神経細胞死が抑制され、加えて神経幹細胞の増殖とその分化が促進される。
本発明の発現促進剤では、ＢＤＮＦとＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質が同時発現促進する場合には、これらの相乗効果が期待でき、これまでのそれぞれの単独物質を用いて試みられてきた治療効果の枠を超えて、神経細胞維持、神経可塑性の向上、神経幹細胞の増殖と分化促進における生物学的動態に近づけるものとして、精神神経系疾患の治療と予防及び脳卒中後の症状回復や脊髄損傷後の機能回復に対する効果を統合的にとらえることができるようになる。ＢＤＮＦとＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質の同時発現促進の相乗効果により、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、加齢に伴う神経障害（認知症など）、うつ病、統合失調症、双極性障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、不安障害、パニック障害、自閉症スペクトラム障害、発達障害、レット症候群、ダウン症候群、脳卒中後の症状回復、脊髄損傷後の機能回復などの精神神経系疾患をより有効に治療することが可能となっている。加えてうつ病改善にはＢＤＮＦとＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質の共役が必須である。また神経幹細胞移植による再生医療の優れた補助薬としてパーキンソン病やアルツハイマー病、および脊髄損傷治療への臨床応用が可能となり、さらに再生医療推進が可能となっている。
本発明の「治療剤」とは、本発明化合物を有効成分として含有し、精神神経系疾患の予防又は治療に使用される医薬組成物のことを言う。これらの医薬組成物は、一般的な医薬製剤として調整され、経口または非経口的に投与される。経口的に投与する場合、通常当分野で用いられる投与形態で投与することができる。非経口的に投与する場合には、局所投与剤（経皮剤など）、注射剤、経鼻剤などの投与形態で投与することができる。経口剤としては、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などが挙げられる。注射液としては、例えば、無菌の溶液または懸濁液などが挙げられる。局所投与剤としては、例えば、通常のパッチ剤、点鼻薬などが挙げられる。これら製剤は通常用いられる医薬用担体を用いて調製される。
上記医薬用担体としては、医薬分野において常用され、かつ本発明の化合物と反応しない物質が用いられる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤の製造に用いられる医薬用担体の具体例としては、乳糖、トウモロコシデンプン、白糖、マンニトール、硫酸カルシウム、結晶セルロースのような賦形剤、カルメロースナトリウム、変性デンプン、カルメロースカルシウムのような崩壊剤、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンのような結合剤、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油のような滑沢剤が挙げられる。錠剤は、通常のコーティング剤を用い、周知の方法でコーティングしてもよい。
シロップ剤製造に用いられる担体の具体例としては、白糖、ブドウ糖、果糖のような甘味剤、アラビアゴム、トラガント、カルメロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、結晶セルロース、ビーガムのような懸濁化剤、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０のような分散剤が挙げられる。
注射剤は、通常、上記の有効成分を注射用蒸留水に溶解して調製するが、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤等を添加することができる。更に、該化合物を注射用蒸留水又は植物油に懸濁した懸濁性注射剤の形であってもよく、必要に応じて基剤、懸濁化剤、粘調剤等を添加することができる。
本発明の第２の態様
本発明の第２の態様において、「インドリノン化合物」とは、インドリノン骨格を有する低分子化合物のことであり、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）遺伝子の発現促進作用と共にＢＤＮＦなどの神経栄養因子の発現促進の作用のあるものをいう。例えば、セマキサニブ（Ｓｅｍａｘａｎｉｂ）を挙げることができる。
本発明の「ｉＰＳ細胞」とは、ヒト体細胞に山中因子等を組み込んで作製された人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）のことである。ヒト体細胞としては、健常者や神経疾患患者などの体細胞を用いることができる。精神神経系疾患患者としては、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、加齢に伴う神経障害（認知症など）、うつ病、統合失調症、双極性障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、不安障害、パニック障害、自閉症スペクトラム障害、発達障害、レット症候群、ダウン症候群、脳虚血障害、又は脊髄損傷の患者を挙げることができる。
本発明の「サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）」とは、カスパーゼの活性化を阻害しアポトーシスを抑制するタンパク質である。サバイビンはしばしば癌細胞で高発現しているのに対し、多くの完全に分化した皮膚組織などの短期でターンオーバーする細胞ではほぼ発現がみられない。そのため、サバイビンはがん治療の格好のターゲットとみられてきたが、血液幹細胞、Ｔリンパ細胞、赤芽球などの正常な増殖及び分化に必須であることも明らかになり、サバイビンをターゲットにしたがん治療に危惧が持たれている（Ｂｉｒｄ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｅｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ(２００４)４：１６６．）（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ（２００７）２０４：１６０３－１１）。また、成熟した神経細胞が長期維持される大脳皮質などではサバイビンの発現が保持され、神経細胞の長期維持に大きな役割を果たすと考えられている。神経前駆細胞の分化誘導開始に伴いサバイビンのｍＲＮＡ発現が増加することが知られており、成人海馬における神経前駆細胞の増殖と分化にサバイビンが必須であり、特に外傷性脳損傷後の成人の海馬における神経新生と外傷性脳損傷後の回復に大きな役割を果たすことが示されている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ(２０１５)３００：２１９－２２８）。また、高齢化により海馬における神経幹細胞の活性が下がりこれが加齢による認知力の低下と関連すると言われており、高齢で活動性が低下した13週令のマウスの海馬神経幹細胞に、レトロウイルスを用いてサバイビンを発現させることにより若い3週令の状態に戻すことができたという報告があり（Ｍｉｒａｎｄａ ＣＪ，ｅｔ ａｌ．，Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ （２０１２） １１；５４２－５５２ “Ａｇｉｎｇ ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｗｎｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ”）、サバイビン発現増強による健康寿命の延伸への貢献も期待されている。
本発明の「発現促進剤」とは、サイバビン遺伝子の発現促進を行い、発現したサバイビンタンパク質によるアポトーシス抑制と細胞賦活化を可能にするものをいう。
本発明の「ゼノフリー」とは、「ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｆｒｅｅ」という意味であり、短縮された形で，「ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ」という単語として使用される。即ち、ゼノフリーという言葉は，「異種由来成分を含まない」，「動物性由来物を含まない」，または「非ヒト由来成分を含まない」という意味である。
本発明の「ゼノフリー培養系」とは、細胞の培養環境がゼノフリーということであり、例えば，培養培地中に動物由来成分（ウシ由来血清、フィーダー細胞、マウス肉腫由来マトリジェルなど）が使用されていない場合に、ゼノフリー培養系であるといわれる。
本発明の「胚葉体（細胞凝集体）」とは、ＥＢ（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）とも言われ、ｉＰＳ細胞を浮遊培養するとボール状の細胞塊が形成され、この細胞塊を胚葉体という。胚葉体の状態で２週間程度培養すると、様々な細胞種への分化が観察され、単一の細胞分離が困難になる。
本発明の「ヒトニューロジェニン２遺伝子」とは、神経幹細胞からニューロンへの分化を促進する因子の一つであり、ｂＬＨＬ型転写因子である。
本発明の「ヒトニューロジェニン２遺伝子が遺伝子導入されたｉＰＳ細胞」とは、ヒトニューロジェニン２遺伝子がＲＮＡリポフェクション法で導入されたｉＰＳ細胞、又はプラスミドベクター又はウイルスベクターにニューロジェニン２遺伝子を搭載し、一過性に発現誘導が可能になったベクターで遺伝子導入されたｉＰＳ細胞のことをいう。ＲＮＡリポフェクション法とは、負の電荷を持つＤＮＡの周りに正の電荷を持つ陽イオン性リポソームが結合し複合体を形成して、エンドサイトーシス現象により細胞表面から細胞内にＤＮＡを取り込ます方法をいう（Ｃｈｅｓｎｏｙ Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．（２０００） ２９：２７－４７）。一方、プラスミドベクター又はウイルスベクターにニューロジェニン２遺伝子を搭載し、一過性に発現誘導が可能になったベクターは、Ｋｉｍらの手法（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１６）１３５７：１１１－１３１）に従い作成できる。 例えば、Ｋｉｍらの手法に従い、ドキシサイクリンによってニューロジェニン２が一過性に発現されるベクターを作製し、ｉＰＳ細胞に遺伝子導入することができる。
本発明の「ラミニンコーティング」とは、ヒト組み換え型ラミニンフラグメントで培養容器（培養ディシュなど）をコーティングすることをいう。好ましくはｉＭａｔｒｉｘ－５１１（ニッピ）でコーティングすることを挙げることができる。ｉＰＳ細胞やｉＰＳ細胞から神経細胞への分化、および分化した神経細胞の培養維持に関しては、ラミニンコーティングした培養ディッシュ上の二次元培養で行うことが望ましい。
なお、ｉＰＳ細胞から神経細胞への分化、神経細胞の維持には、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ＭｅｄｉｕｍまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ＭｅｄｉｕｍとＤＭＥＭ／Ｆ１２の１：１混合培地を用いることができる。
本発明の「一過性の発現誘導」とは、ヒトニューロジェニン２遺伝子をｉＰＳ細胞に導入し、一時的に転写因子ニューロジェニン２タンパク質を発現させることをいう。発現誘導は、ＲＮＡリポフェクション法ではリポフェクションによって行われるが、ベクターを使用する場合には、例えばドキシサイクリンによってニューロジェニン２が一過性に発現されるベクターが使用されるため、ドキシサイクリンの存在下においてのみ、一過性にニューロジェニン２を発現させることができる。
本発明の「低分子ＴＧＦβファミリー阻害剤」とは、ＴＧＦ-βと類似した構造を持ち， 類似した経路でシグナルを伝えるＴＧＦβファミリーの情報伝達を阻害する低分子化合物のことをいう。ＴＧＦβファミリーは、細胞増殖、分化、発生、アポトーシスの制御等の多種多様な細胞機能に関与しており、この作用を抑制、阻害することによって、例えば血球細胞やリンパ球に対しても増殖や機能を促進することができる。ＴＧＦβファミリーの低分子阻害剤としては、例えば、ＳＢ４３１５４２、ＬＹ３６４９４７（４－［３－（２－ピリジニル)－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－キノリン）、ＬＤＮ－１９３１８９、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ （ＬＹ２１５７２９９）、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ７８８３８８などを挙げることができる。
本発明の「アデニル酸シクラーゼ活性化剤」とは、アデニル酸シクラーゼを活性化する化合物のことであり、アデニル酸シクラーゼは、多くの神経伝達物質やホルモンの第二メッセンジャーであるｃＡＭＰをＡＴＰから変換して合成する酵素である。アデニル酸シクラーゼの活性化剤としては、例えばＦ０８５５（ホルスコリン）、ＤＧ０２８７７（塩酸コルホルシン・ダロパート）などを挙げることができる。
本発明の「ＧＳＫ３阻害剤」とは、細胞分裂，細胞増殖，細胞運動性および細胞生存にも関わるグリコーゲン合成酵素３（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）の阻害剤をいう。例えば、ＣＨＩＲ－９９０２１（６－［［２－［［４－（２，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（４－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌｅ－２－ｙｌ）－２－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｎｉｃｏｔｉｎｏｎｉｔｒｉｌｅ）、Ａ１０７０７２２（１－（７－Ｍｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎ－４－ｙｌ）－３－［６－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ］ｕｒｅａ）、ＢＩＯ（（２‘Ｚ，３’Ｅ）－６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３‘－ｏｘｉｍｅ）、ＳＢ２１６７６３（３－（２，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－４－（１－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｅ－２，５－ｄｉｏｎｅ）、ＳＢ４１５２８６（３－［（３－Ｃｈｌｏｒｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］－４－（２－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－１ｈ－ｐｙｒｒｏｌｅ－２，５－ｄｉｏｎｅ)、ＴＣ－Ｇ２４（Ｎ－（３－Ｃｈｌｏｒｏ－４－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－５－（４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－１，３，４－ｏｘａｄｉａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ）、ＴＣＳ２００２ （２－Ｍｅｔｈｙｌ－５－［３－［４－（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－５－ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｙｌ］－１，３，４－ｏｘａｄｉａｚｏｌｅ)などを挙げることができる。
本発明の「Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト」とは、神経細胞の増殖と生存を増大させる7回膜貫通型の膜タンパク質Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄのアゴニスト（促進剤）のことである。例えば、パルモルファミン（２－（１－Ｎａｐｈｔｈｏｘｙ）－６－（４－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏａｎｉｌｉｎｏ）－９－ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｐｕｒｉｎｅ）、ＳＡＧ（３－Ｃｈｌｏｒｏ－Ｎ－［ｔｒａｎｓ－４－（ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ］－Ｎ－［３－（４－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）ｂｅｎｚｙｌ］－１－ｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ－２－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）などを挙げることができる。
本発明の「Ｒｏｃｋ阻害剤」とは、細胞の増殖や遺伝子発現といった細胞機能の基本に関与するリン酸化酵素であるＲＯＣＫ（ｐ１６０－Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｋｉｎａｓｅ）の阻害剤をいう。ＲＯＣＫ阻害剤は非常に強力な細胞死抑制作用を示す物質であり、例えばＹ－２７６３２、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、ＲＫＩ－１４４７、ＧＳＫ－４２９２８６Ａ、Ｆａｓｕｄｉｌ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅなどを挙げることができる。
本発明の「神経栄養因子」とは、細胞成長・増殖因子やサイトカインのうち、神経に対する作用を持つものであり、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ／ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ／ＢＤＮＦ）、ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３ （ＮＴ－３）、ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－４／５（ＮＴ－４／５）、グリア細胞由来神経栄養因子（Ｇｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ：ＧＤＮＦ）、ＩＧＦ-1（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－１）、血管内皮増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ：ＶＥＧＦ）を挙げることができる。
本発明の「細胞の活動度が弱い」とは、分化の発達時に停滞又は死滅するような、細胞として不活発であることをいう。例えば遺伝子の変異やエピジェネティックな異常に由来して器質的に問題のある疾患患者由来のｉＰＳ細胞を分化誘導させる場合、ｉＰＳ細胞に負荷が掛かっていることから、細胞の活動度が弱っており、分化の途中で細胞分化が停滞したり、細胞が死滅したりすることになる。
本発明の「精神神経系疾患患者」とは、脳・脊髄・末梢神経など神経自体の病変または筋肉自体の病変によって運動障害や認知障害をきたす疾患のことをいう。 例えばパーキンソン病、脊髄小脳変性症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、ウイルスや菌による神経炎や脊髄炎、重症筋無力症、筋ジストロフィー、多発性筋炎などが挙げられる。更には認知症、急性の脳卒中から徐々に進行する血管性認知症まで広汎な病態を有する脳血管障害、ハンチントン病、加齢なども挙げられる。また、神経突起の退縮やスパイン密度減少、海馬における神経新生の減弱を伴ううつ病、統合失調症、双極性障害、パニック障害、ＰＴＳＤ、パニック障害、不安障害などが挙げられる。また、脳発達時のシナプス刈り込み異常による自閉症スペクトラム、注意欠陥多動性障害などの発達障害が挙げられる。
本発明の「神経疾患治療剤のスクリーニング方法」とは，神経疾患患者由来のｉＰＳ細胞から神経細胞、特に運動神経細胞に分化誘導し、患者の神経細胞（特に運動神経細胞）を反映した疾患特異的な神経細胞を作製し、その細胞を用いて、その疾患に最適な治療薬のスクリーニングを行う方法のことである。本発明で分化誘導された疾患特異的な神経細胞を用いて、神経疾患治療に有効な化合物（たとえば医薬化合物、溶媒、小分子、ペプチド、またはポリヌクレオチド）のスクリーニングが行える。例えば、薬剤単独でまたは他の化合物と組み合わせてスクリーニングを行い、分化誘導された疾患特異的な神経細胞の形態または機能的な変化を解析することにより、スクリーニング化合物の評価ができる。形態的な変化の評価の例としては、樹状突起の伸展や樹状突起分岐数の増加、樹状突起上のスパインの増加、軸索の伸長などにより評価することができる。機能的な変化の評価の例としては、遺伝子発現の変化、あるいは、産生タンパク質の種類または発現量の変化により評価することができる。
更に、本発明の分化誘導された疾患特異的な神経細胞は、神経疾患特異的神経細胞特異的動態の解析に用いることができる。
本発明の「細胞賦活化剤」とは、生理的環境下では共同して働くことが求められる複数の因子の活性を同時に促進することができ、これまでの単一分子をターゲットとした創薬とは大きく異なり、生理的機能性を有するまったく新しいタイプの治療薬の基盤になるものである。これまで有効な治療法の確立されていない多くの精神神経疾患（筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、加齢に伴う神経障害（認知症など）、うつ病、統合失調症、双極性障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、不安障害、パニック障害、自閉症スペクトラム障害、発達障害、レット症候群、ダウン症候群、脊髄損傷など）に適用できる、未来型の精神神経系疾患治療薬の開発に重要な役割を果たしていくものである。さらに、低分子化合物であり、安価で保存が容易であり、かつ血液脳関門も通過する可能性が高く、これまで使用が模索されてきた神経栄養因子の補充療法とも一線を画するものである。
本発明の「培養維持できる」とは、未同定の夾雑物を含まないゼノフリーの培養条件下で、少ない工程及び試剤を用いて、安定して最終分化した神経細胞を最低４か月培養維持できることをいう。神経疾患患者由来のｉＰＳ細胞などの場合に、細胞の活動度が低いものであっても、例えば、インドリノン化合物を添加することにより、途中で死滅することなく最終分化した神経細胞を作製し、培養維持できるようにしたものをいう。
以下、実施例および試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれによって何ら限定されるものではない。
本発明の第１の態様
（実施例１－１）フィーダーフリーによるｉＰＳ細胞の培養系の確立
（１）材料・試薬
１）健常者由来ｉＰＳ細胞（ＨＳＰ０００３、０００９、００２９）及びＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞（ＨＳＰ０２９０（家族性）、０２９２（家族性）、０１３４（孤発性）、0１４０（家族性））（国立開発法人理化学研究所バイオリソースセンター（以下ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）;
３）ｉＰＳ細胞培養培地ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ 味の素（タカラバイオ）；
４）ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ニッピ（ タカラバイオ）；
５）Ｙ－２７６３２ １０ｍＭ溶液（富士フイルム和光純薬）；
６）ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャー）;
７）ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（タカラバイオ）;
８）Ｄ－ＰＢＳ（－）（ナカライテスク)；
１０）バイセル凍結処理容器（フナコシ）.
（２）方法
Ｄ－ＰＢＳ（－）を１ｍＬいれた６０ｍｍ培養ディッシュにｉＭａｔｒｉｘ－５１１を２０μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で６０分以上反応させてラミニンコーティングを行った。次に溶液を除去し、ＳｔｅｍＦｉｔ培地に入れ替え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れてなじませる。必要量（４ｍＬ／培養ディッシュ）のＳｔｅｍＦｉｔ培地に終濃度１０μＭ になるようにＹ－２７６３２を加えて準備をする（以下ＳｔｅｍＦｉｔ＋Ｙ培地）。ラミニンコーティングを行った培養ディッシュからＳｔｅｍＦｉｔ培地を除去し、ＳｔｅｍＦｉｔ＋Ｙ培地に分与を受けたｉＰＳ細胞を懸濁してラミニンコーティングを行った培養ディッシュに播種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で培養を行う。翌日、Ｙ－２７６３２を加えていないＳｔｅｍＦｉｔ培地に交換する。隔日または毎日培地交換を行った。細胞が培養面積の６０～７０％ほど増殖すると継代を行った。継代は次のように行った。まず培養ディッシュからＳｔｅｍＦｉｔ培地を除去した後、４ｍＬのＤ－ＰＢＳ（－）で１回洗浄し、１ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを加えて３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で９分間反応させ、その後、４ｍｌのＳｔｅｍＦｉｔ培地を加えてピペッティングしてよく細胞を分散させて遠心管に移し、ｉＰＳ細胞を遠心分離により集めた。集めたｉＰＳ細胞は１ｍｌのＳｔｅｍＦｉｔ＋Ｙ培地に分散させて計数し、培養ディッシュ一枚あたり約４ｘ１０４個のｉＰＳ細胞を４ｍｌのＳｔｅｍＦｉｔ＋Ｙ培地に分散させ、ラミニンコーティングした培養ディッシュに播種した。数回の継代でフィーダーフリー培養系に順化できた。
細胞凍結を行う場合は、集めた細胞を約１ｘ１０６/mlになるようＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲで懸濁し、クライオチューブに分注し、バイセルに入れて－８０℃で３時間以上凍結後、数日以内に液体窒素に移して保存した。
（３）結果
健常者ｉＰＳ細胞の培養物の顕微鏡画像を図１のＡに示す。フィーダーフリーで培養したこのｉＰＳ細胞がｉＰＳ細胞の特徴を維持しながら増殖したことは、図１のＢの、フィーダー細胞を用いて培養したｉＰＳ細胞塊の顕微鏡写真（ｉＰＳ研究所の提供するウェブサイトｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｉｊｉ．ｃｏｍ／ｊｃ／ｄ４？ｐ＝ｙｎｓ００２－０５７２８４９１＆ｄ＝ｄ４＿ｎｅｗｓより）を参照することで理解できる。すべてのｉＰＳ細胞株でフィーダーフリー培養系への移行ができた。
（実施例１－２）ｉＰＳ細胞から運動神経への分化
（１）材料・試薬
１）健常人由来ｉＰＳ細胞（ＨＳＰ０００３、０００９、００２９）及びＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞（ＨＳＰ０２９０（家族性）、０２９２（家族性）、０１３４（孤発性）、０１４０（家族性））（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）;
２）ヒトｉＰＳ細胞用トランスポゾンベクターｐｉｇｇｙＢａｃ，Ａｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅ ＰＢ－ＴＡＧ－ＥＲＮ（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）（Ｋｉｍら、２０１６、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１３５７： １１１－１３１）；
３）ｐＣＡＧ－ＰＢａｓｅ（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）;
４）Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ＩＩ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)；
５）Ｇａｔａｗａｙ ｐＥＮＴＲ１Ａ (サーモフィッシャー);
６）ヒトニューロジェニン－２（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ－２）遺伝子（かずさゲノムテクノロジーズ）；
７）ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１（タカラバイオ）;
８）５０ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８（ナカライテスク）；
９）ドキシサイクリン １ｍｇ／ｍＬ（ＬＡＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）;
１０）ＤＭＥＭ／ＨＡＭ‘ｓ Ｆ１２培地（富士フイルム和光純薬）；
１１）Ｇｉｂｃｏ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャー）；
１２）Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ｘ１００）（富士フイルム和光純薬）；
１３）Ｎ２サプリメント（ｘ１００）（富士フイルム和光純薬）；
１４）Ｂ２７サプリメント（ｘ５０）（サーモフィッシャー）；
１５）Ｌ－アスコルビン酸 １０ｍｇ／ｍＬ（ｘ１０００）（シグマ・アルドリッチ）；
１６）ＳＢ４３１５４２（富士フイルム和光純薬 ０３３－２４３１）５ｍＭ／ＤＭＳＯ；
１７）ＣＨＩＡ９９０２１（富士フイルム和光純薬）１０ｍＭ／ＤＭＳＯ；
１８）ホルスコリン（富士フイルム和光純薬）１０ｍＭ／ＤＭＳＯ；
１９）パルモルファミン（富士フイルム和光純薬）１０ｍＭ／ＤＭＳＯ；
２０）リコンビナントＢＤＮＦ １０μｇ／ｍＬ Ｄ－ＰＢＳ（－）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、コスモバイオ）；
２１）リコンビナントＧＤＮＦ １０μｇ／ｍＬ Ｄ－ＰＢＳ（－）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、コスモバイオ）；
２２）リコンビナントＩＧＦ－１ １０μｇ／ｍＬ Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬）；
２３）神経細胞分化培地（以下ＮＤＭ）は、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ‘ｓ Ｆ１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍを1：1で混合したものにＮ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、Ｌ-グルタミン、１０μｇ／ｍＬ Ｌ-アスコルビン酸 を含有するもの;
２４）アイソジェン（ニッポンジーン）；
２７）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ）；
２８）ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ｔａｑ ＩＩ（タカラバイオ）;
２９）ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（Ｃｅｐｈｅｉｄ ＳＣ２５００Ｎ５－１）;
３０）リアルタイム用ＰＣＲプライマー（β-アクチン、ＰＡＸ６、ＨＢ９、グルタミン酸レセプター１）（表１）
（２）方法
Ａ．ドキシサイクリンによりニューロジェニン２発現を一過性に誘導できるｉＰＳ細胞株の樹立
かずさゲノムテクノロジーズから入手したヒトニューロジェニン２遺伝子には停止コドンが欠損していたため、定法に従い塩基挿入により停止コドンを付加し、ｐＥＮＴＲ１Ａにクローニングした。Ｋｉｍら（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．（２０１６）１３５７：１１１－１３１）の方法に従い、ドキシサイクリンによってニューロジェニン２発現が一過性に誘導されるｉＰＳ細胞株を作成した。ただし、遺伝子導入にはエレクトロポレーション法ではなく、ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１を用いてリバーストランスフェクション法により行った。
ベクターが組み込まれたｉＰＳ細胞は、Ｇ４１８（５０μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬまで漸次増加）によって選択し、限界希釈法によりそれぞれのｉＰＳ細胞株について５個以上のドキシサイクリンによりニューロジェニン２発現を一過性に誘導ができる細胞株を樹立した。（以下ドキシサイクリンによってニューロジェニン２が一過性に発現されるｉＰＳ細胞を総称してｉＰＳ-ＰＢＮ２とよぶ）。
ニューロジェニンは、万能幹細胞が神経細胞へと分化するときのスイッチであるトランスクリプションファクターである。ニューロジェニン１～３の３種類があるが、ニューロジェニンの組み合わせのすべてとそれぞれ単独での一過性発現によるｉＰＳ細胞から神経細胞への分化実験を行ったところ、ニューロジェニン２が添加された場合だけ神経細胞への分化ができ、しかもニューロジェニン２単独で神経細胞への分化を行えたため、ニューロジェニン2単独で用いることにした。
古典的な手法として幹細胞を細胞槐（胚葉体細胞（細胞凝集体）形成））を経て神経細胞に分化させる方法があるが、フィーダー細胞を用いない培養では胚葉体細胞（細胞凝集体）形成が困難であること、この方法では複雑な過程と多くの薬剤－細胞毒性を示すものが多い－の添加が必要で、分化にかかる時間も1か月以上の長期間を要するため、そのため簡便な方法を開発した。
Ｂ．ｉＰＳ細胞から運動神経への分化
ラミニンコーティングした６０ｍｍ培養ディッシュ１枚につき５ｘ１０４個のｉＰＳ－ＰＢＮ２細胞を４ｍＬの（ＳｔｅｍＦｉｔ＋Ｙ）＋１μｇ／ｍＬドキシサイクリン培地に懸濁し、播種した。１６時間後にＮＤＭ＋１０μＭ Ｙ－２７６３２＋３μＭ ＳＢ４３１５４２＋ ３μＭ ＣＨＩＡ９９０２１＋３μＭホルスコリン培地に交換した（Ｄ１）。４日目までに神経前駆細胞が盛んに増殖し培養面積の７０％ほどに達した。細胞を（実施例１－１）に示した方法で集めた。すなわちまず培養ディッシュからＮＤＭ＋１０μＭ Ｙ－２７６３２＋３μＭ ＳＢ４３１５４２＋ ３μＭ ＣＨＩＡ９９０２１＋３μＭホルスコリン培地を除去した後、４ｍＬのＤ－ＰＢＳ（－）で１回洗浄し、１ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを加えて３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で９分間反応させた後、４ｍｌのＮＤＭ培地を加えてピペッティングしてよく細胞を分散させて遠心管に移し、遠心分離により集めた細胞を１ｍｌのＮＤＭ培地に分散させて細胞数を計数し、培養ディッシュ1枚当たり２ｘ１０５個の細胞を４ｍＬのＮＤＭ＋１０μＭ Ｙ－２７６３２＋３μＭホルスコリン＋３μＭパルモルファミン培地に懸濁して、ラミニンコートした６０ｍｍ培養ディッシュに播種した（Ｄ４）。６日目に培地をＮＤＭ＋Ｙ－２７６３２＋神経栄養因子（１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＢＤＮＦ＋１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＧＤＮＦ＋１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＩＧＦ－１）培地に交換した（Ｄ６）。３日目ごとに培地を新しいＮＤＭ＋Ｙ－２７６３２＋神経栄養因子培地と交換した。経時的にアイソジェンを用いた定法でＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを用いて逆転写反応を行った。逆転写反応で得られたｃＤＮＡ産物及びＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ｔａｑ ＩＩ試薬を用いて、β-アクチン、ＰＡＸ６、ＨＢ９、ＧｌｕＡ１の経時的なｍＲＮＡ発現変化を、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒを用いて測定した。
ＨＢ９は最も信頼できる運動神経マーカーとして広く用いられている。成熟神経細胞は機能的に神経伝達物質による信号の伝達を行うことが必須であるため、成熟神経細胞マーカーの一つとして神経伝達物質レセプターのＧｌｕＡ１を用いた。ＰＡＸ６はプライマーデザインを円滑に行えたため使用した。
（３）結果
図２Ａ、Ｂに、健常者由来ｉＰＳ細胞株ＨＳＰ０００３－ＰＢＮ２＃２のニューロジェニン２誘導による運動神経細胞への分化に伴う形態変化を示した。分化誘導３３日目には細胞体から軸索及び樹状突起が伸長し、神経細胞としての特徴が形態的に確認された（図２Ｂ）。他のｉＰＳ－ＰＢＮ２株（ｉＰＳ０００９－ＰＢＮ２＃２、ｉＰＳ００２９－ＰＢＮ２＃２）でも運動神経細胞への分化誘導が見られた。
図２Ｃは、ｉＰＳ細胞の運動神経への分化に伴う神経前駆細胞マーカー（ＰＡＸ６）、運動神経マーカー（ＨＢ９）、及び成熟神経細胞マーカー（神経伝達物質グルタミン酸レセプター1（ＧｌｕＡ１））の発現様式に関する模式図であり、それぞれのマーカー遺伝子の発現変化がｉＰＳ細胞の運動神経への分化に従うことを表した。
図３に 健常者由来のＨＳＰ０００３－ＰＢＮ２＃２の運動神経細胞への分化に伴うマーカー遺伝子ｍＲＮＡの発現変化の実例を示す。神経前駆細胞マーカー（ＰＡＸ６）発現が分化誘導後に一過性に著しい増加を示し、その後運動神経細胞の成熟に伴い減少を示した。ＰＡＸ６の発現に続いて運動神経細胞マーカー（ＨＢ９）のｍＲＮＡ発現が増加していった。神経細胞の成熟に伴いＨＢ９の発現に続いて成熟神経細胞マーカー（神経伝達物質受容体ＧｌｕＡ１）のｍＲＮＡが著しく増加した。
この図２と図３の結果を、その後のｉＰＳ細胞から運動神経細胞への分化実験の指標とした。
（実施例１－３）ｉＰＳ細胞から運動神経細胞への分化時のセマキサニブの添加効果
（１）材料・試薬
１）ドキシサイクリンによりニューロジェニン２発現を一過性に誘導できる健常者由来ｉＰＳ細胞株ＨＳＰ０００３－ＰＢＮ２＃２及び孤発性ＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞株ＨＳＰ０１３４－ＰＢＮ２＃１；
３）ｉＰＳ細胞培養培地ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ 味の素（タカラバイオ）；
４）ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ニッピ（ タカラバイオ）；
５）Ｙ－２７６３２ １０ｍＭ溶液（富士フイルム和光純薬）；
６）ドキシサイクリン １ｍｇ／ｍＬ（ＬＡＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）;
７）１０ｍＭ ＳＵ５４１６（セマキサニブ；Ｓｅｍａｘａｎｉｂ） (Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｓ２８４５)；
８）ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャー）;
９）ＤＭＥＭ／ＨＡＭ‘ｓ Ｆ１２培地（富士フイルム和光純薬）；
１０）Ｇｉｂｃｏ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャー）；
１１）Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ｘ１００）（富士フイルム和光純薬）；
１２）Ｎ２サプリメント（ｘ１００）（富士フイルム和光純薬）；
１３）Ｂ２７サプリメント（ｘ５０）（サーモフィッシャー）；
１４）Ｌ－アスコルビン酸 １０ｍｇ／ｍＬ（ｘ１０００）（シグマ・アルドリッチ）；
１５）神経細胞分化培地（以下ＮＤＭ）は、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ‘ｓ Ｆ１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍを1：1で混合したものにＮ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、Ｌ－グルタミン、１０μｇ／ｍＬ Ｌ-アスコルビン酸 を含有するもの；
１６）ＳＢ４３１５４２（富士フイルム和光純薬）５ｍＭ／ＤＭＳＯ；
１７）ＣＨＩＡ９９０２１（富士フイルム和光純薬）１０ｍＭ／ＤＭＳＯ；
１８）ホルスコリン（富士フイルム和光純薬）１０ｍＭ／ＤＭＳＯ（ｘ３０００）；
１９）パルモルファミン（富士フイルム和光純薬）１０ｍＭ／ＤＭＳＯ；
２０）リコンビナントＢＤＮＦ １０μｇ／ｍＬ Ｄ－ＰＢＳ（－）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、コスモバイオ）；
２１）リコンビナントＧＤＮＦ １０μｇ／ｍＬ Ｄ－ＰＢＳ（－）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、コスモバイオ）；
２２）リコンビナントＩＧＦ－１ １０μｇ／ｍＬ Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬）；
２３）アイソジェン（ニッポンジーン）；
２４）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ）；
２５）ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ｔａｑ ＩＩ（タカラバイオ）;
２６）ＳｍａｒｔCycler（Ｃｅｐｈｅｉｄ ＳＣ２５００Ｎ５－１）;
２７）リアルタイムＰＣＲ用プライマー（β－アクチン、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、以下の表１から選択した。
Figure 0007300240000005
（２）方法
ドキシサイクリンによりニューロジェニン２発現を一過性に誘導できる健常者由来ｉＰＳ細胞株ＨＳＰ０００３－ＰＢＮ２＃２及び孤発性ＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞株ＨＳＰ０１３４－ＰＢＮ２＃１をラミニンコーティングした６０ｍｍ培養ディッシュ1枚につき５ｘ１０４個を４ｍＬの（ＳｔｅｍＦｉｔ＋Ｙ）＋１μｇ／ｍＬドキシサイクリン培地に懸濁し、播種した。インドリノン化合物（セマキサニブ）は終濃度が２．５μＭとなるように培養液中に添加した。実験対照群（コントロール）としては溶媒であるＤＭＳＯを添加した。１６時間後にＮＤＭ＋１０μＭ Ｙ－２７６３２＋３μＭ ＳＢ４３１５４２＋３μＭ ＣＨＩＡ９９０２１＋３μＭホルスコリン培地に交換した（Ｄ１）。セマキサニブは終濃度が２．５μＭとなるように培養液中に添加した。４日目までに分化した神経前駆細胞が盛んに増殖し、コロニーを形成する。その後の神経細胞の観察に適するように細胞同士の間隔をあけるため、細胞を（実施例１－１）に示した方法で集め、すなわちまず培養ディッシュからＮＤＭ＋１０μＭ Ｙ－２７６３２＋３μＭ ＳＢ４３１５４２＋３μＭ ＣＨＩＡ９９０２１＋３μＭホルスコリン培地を除去した後、４ｍＬのＤ－ＰＢＳ（－）で１回洗浄し、１ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを加えて３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で９分間反応させた後、４ｍｌのＳｔｅｍＦｉｔ培地を加えてピペッティングしてよく細胞を分散させて遠心管に移し、遠心分離により細胞を集めた。その後はセマキサニブ添加以外は（実施例１－２）に従った。すなわち、集めた細胞を１ｍｌのＮＤＭ培地に分散させて細胞数を計数し、培養ディッシュ1枚当たり２ｘ１０５個の細胞を４ｍＬのＮＤＭ＋１０μＭ Ｙ－２７６３２＋３μＭホルスコリン＋３μＭパルモルファミン培地に懸濁して、ラミニンコートした６０ｍｍ培養ディッシュに播種した（Ｄ４）。６日目に培地をＮＤＭ＋Ｙ－２７６３２＋神経栄養因子（１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＢＤＮＦ＋１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＧＤＮＦ＋１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＩＧＦ－１）培地に交換した（Ｄ６）。３日目ごとに培地を新しいＮＤＭ＋神経栄養因子＋２．５μＭセマキサニブ培地またはＮＤＭ＋神経栄養因子＋ＤＭＳＯ培地と交換した。分化誘導９日目に３日目ごとに培地を新しいＮＤＭ＋Ｙ－２７６３２＋神経栄養因子＋２．５μＭセマキサニブ培地と交換する群と培地の更新を行わない群に分けた。経時的にアイソジェンを用いた定法でＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを用いて逆転写反応を行った。逆転写反応で得られたｃＤＮＡ産物及びＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ｔａｑ ＩＩ試薬を用いて、β－アクチンと脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のＶＥＧＦ－Ａ，Ｃ，Ｄ及び ＶＥＧＦ受容体－１，２，３及びニューロピリン２の経時的なｍＲＮＡ発現変化をＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒを用いて測定した。
（３）結果
図４Ａに示すように、健常者由来ｉＰＳ細胞株ＨＳＰ０００３－ＰＢＮ２＃２ではセマキサニブ添加の有る無しにかかわらず運動神経細胞へ分化した。分化誘導１日目（図４Ａ左列）と分化誘導３３日目（図４Ａ右列）の運動神経細胞の顕微鏡画像を示す。一方、図４Ｂ（左列）に分化誘導１日目の顕微鏡画像を示したが、孤発性ＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞株ＨＳＰ０１３４－ＰＢＮ２＃１では、４日目まではコントロール群もセマキサニブ添加群も同様に神経前駆細胞に分化し増殖をしたが、分化誘導８日目からコントロール群の細胞は神経突起の伸長を停止し、分化誘導１５日目で完全に死滅した（図４Ｂ中列上図、赤太枠１５日目顕微鏡画像）。セマキサニブ添加群では生存が維持された（図４Ｂ中列下図）。コントロール群とセマキサニブ添加群はそれぞれ５枚の独立した培養ディッシュで観察し、５枚すべてで同様の結果が観察された。図４Ｂ右下図に分化誘導２７日目のセマキサニブ添加運動神経細胞の顕微鏡画像を示す。この結果から、セマキサニブはＡＬＳ患者由来運動神経細胞の生存維持効果を有すると考えられた。
さらに、このＡＬＳ患者由来神経細胞培養では、神経細胞の培養には必須と考えられている神経栄養因子の更新を分化誘導９日目で停止した３枚の培養ディッシュの神経細胞も順調に生存し、顕微鏡下では３日目ごとに神経栄養因子を新たに添加した２枚の培養ディッシュの神経細胞よりも状態が良いと判断された。
このため、神経栄養因子のオートクラインが考えられた。リアルタイムＰＣＲを用いて、神経栄養因子として添加している３つのうちの１つである脳由来神経栄養因子ＢＤＮＦのｍＲＮＡ発現変化を調べた結果、図５に示すように、健常者由来ｉＰＳ細胞株ＨＳＰ０００３ＰＢＮ２＃２ではセマキサニブ添加群ではコントロール群と比較して約５倍、ｉＰＳ細胞と比較して約１４倍のＢＤＮＦ発現増加が検出された。孤発性ＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞株ＨＳＰ０１３４ＰＢＮ２＃１ではコントロール群は１５日目で死滅したためｉＰＳ細胞としか比較できなかったが、ｉＰＳ細胞と比較して約３．５倍のＢＤＮＦ発現増加が検出された。
この結果から、健常者由来ｉＰＳ細胞とＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞からそれぞれ分化した運動神経細胞において、セマキサニブはＢＤＮＦの発現促進効果を有することが示された。また、図４の顕微鏡画像から、ほぼ１００％神経突起が伸びた運動神経細胞と認められることから、この運動神経細胞自身のオートクラインであることが分かる。健常者では神経細胞が自身に必要なＢＤＮＦをオートクラインで発現するように転換していったが、ＡＬＳ患者ではこの転換を行うことができず、ＢＤＮＦの発現が低下して死滅したと推測される。このように、セマキサニブは、運動神経細胞に働きかけ、ＢＤＮＦのオートクラインによる発現を促進することが明らかとなった。セマキサニブは、運動神経細胞自身によるＢＤＮＦオートクライン発現を促進することにより効率良く運動神経細胞を賦活化することができると考えられる。
また、近年うつ病及び認知機能の改善、認知症予防に運動が推奨されているが、これは運動によりＢＤＮＦおよびＶＥＧＦの産生が増加することによる神経可塑性向上と海馬における神経新生の促進による効果であるとされている（熊谷秋三ら、Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｅｘｅｒｃｉｓｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ （２００６） ９： １－４５ “認知機能及び脳由来神経栄養因子に関する運動疫学“）（Ｃｏｔｍａｎ ＣＷ ａｎｄ Ｂｅｒｃｈｔｏｌｄ ＮＣ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ （２００２） ２５（６）； ２９５－３０１ “Ｅｘｅｒｃｉｓｅ： ａ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｂｒａｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ”）（Ｆａｂｅｌ Ｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２００３） １８： ２８０３－２８１２ “ＶＥＧＦ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｅｘｃｉｓｅｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｄｕｌｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ”）．（Ｄｕｍａｎ ＲＳ， Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ （２００５）２６： ８８－９３ “Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｏｄ ： Ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｘｅｒｃｉｓｅ， ｄｉｅｔ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ”）。
（実施例１－４）ｉＰＳ細胞から分化した運動神経細胞における生存維持と神経可塑性と神経細胞の増殖と分化促進に係るタンパク質遺伝子の発現に関する評価
（１）材料・試薬
１）ドキシサイクリンによりニューロジェニン２発現を一過性に誘導できる正常人由来ｉＰＳ細胞株ＨＳＰ０００３－ＰＢＮ２＃２及び孤発性ＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞株ＨＳＰ０１３４－ＰＢＮ２＃１；
３）ｉＰＳ細胞培養培地ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ 味の素（タカラバイオ）；
４）ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ニッピ（ タカラバイオ）；
５）Ｙ－２７６３２ １０ｍＭ溶液（富士フイルム和光純薬）；
６）ドキシサイクリン １ｍｇ／ｍＬ（ＬＡＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）;
７）１０ｍＭ ＳＵ５４１６（セマキサニブ；Ｓｅｍａｘａｎｉｂ） (Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｓ２８４５)；
８）ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャー）;
９）ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地（富士フイルム和光純薬）；
１０）Ｇｉｂｃｏ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャー）；
１１）Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ｘ１００）（富士フイルム和光純薬）；
１２）Ｎ２サプリメント（ｘ１００）（富士フイルム和光純薬）；
１３）Ｂ２７サプリメント（ｘ５０）（サーモフィッシャー）；
１４）Ｌ－アスコルビン酸 １０ｍｇ／ｍＬ（ｘ１０００）（シグマ・アルドリッチ）；
１５）神経細胞分化培地（以下ＮＤＭ）は、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍを１：１で混合したものにＮ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、Ｌ－グルタミン、１０μｇ／ｍＬ Ｌ－アスコルビン酸を含有するもの；
１６）ＳＢ４３１５４２（富士フイルム和光純薬）５ｍＭ／ＤＭＳＯ；
１７）ＣＨＩＡ９９０２１（富士フイルム和光純薬）１０ｍＭ／ＤＭＳＯ；
１８）ホルスコリン（富士フイルム和光純薬）１０ｍＭ／ＤＭＳＯ（ｘ３０００）；
１９）パルモルファミン（富士フイルム和光純薬）１０ｍＭ／ＤＭＳＯ；
２０）リコンビナントＢＤＮＦ １０μｇ／ｍＬ Ｄ－ＰＢＳ（－）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、コスモバイオ）；
２１）リコンビナントＧＤＮＦ １０μｇ／ｍＬ Ｄ－ＰＢＳ（－）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、コスモバイオ）；
２２）リコンビナントＩＧＦ－１ １０μｇ／ｍＬ Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬）；
２３）アイソジェン（ニッポンジーン）；
２４）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ）；
２５）ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ｔａｑ ＩＩ（タカラバイオ）;
２６）ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（Ｃｅｐｈｅｉｄ ＳＣ２５００Ｎ５－１）;
２７）リアルタイムＰＣＲ用プライマー（β－アクチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ受容体－１、ＶＥＧＦ受容体－２、ＶＥＧＦ受容体－３、ニューロピリン２）は、表1から選択した。
（２）方法
ドキシサイクリンによりニューロジェニン２発現を一過性に誘導できる健常者由来ｉＰＳ細胞株ＨＳＰ０００３－ＰＢＮ２＃２及び孤発性ＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞株ＨＳＰ０１３４－ＰＢＮ２＃１をラミニンコーティングした６０ｍｍ培養ディッシュ1枚につき５ｘ１０４個を、４ｍＬの（ＳｔｅｍＦｉｔ＋Ｙ）＋１μｇ／ｍＬドキシサイクリンに懸濁し、播種した。インドリノン化合物（セマキサニブ）は終濃度が２．５μＭとなるように培養液中に添加した。実験対照群（コントロール）としては溶媒であるＤＭＳＯを添加した。１６時間後にＮＤＭ＋１０μＭ Ｙ－２７６３２＋３μＭ ＳＢ４３１５４２＋３μＭ ＣＨＩＡ９９０２１＋３μＭホルスコリンに培地を交換した（Ｄ１）。セマキサニブ終濃度が２．５μＭとなるように培養液中に添加した。実験対照群（コントロール）では溶媒であるＤＭＳＯを添加した。４日目までに分化した神経前駆細胞が盛んに増殖し、コロニーを形成した。その後の神経細胞の観察に適するように細胞同士の間隔をあけるため、細胞を（実施例１－１）に示した方法で集めた。すなわちまず培養ディッシュからＮＤＭ＋１０μＭ Ｙ－２７６３２＋３μＭ ＳＢ４３１５４２＋３μＭ ＣＨＩＡ９９０２１＋３μＭホルスコリン培地を除去した後、４ｍＬのＤ－ＰＢＳ（－）で１回洗浄し、１ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを加えて３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で９分間反応させた後、４ｍｌのＮＤＭ培地を加えてピペッティングしてよく分散させ、遠心管に移し、遠心分離により細胞を集めた。その後はセマキサニブ添加以外は（実施例１－２）に従った。すなわち、集めた細胞を１ｍｌのＮＤＭ培地に分散させて細胞数を計数し、培養ディッシュ1枚当たり２ｘ１０５個の細胞を４ｍＬのＮＤＭ＋１０μＭ Ｙ－２７６３２＋３μＭホルスコリン＋３μＭパルモルファミン＋２．５μＭセマキサニブ培地または４ｍＬのＮＤＭ＋１０μＭ Ｙ－２７６３２＋３μＭホルスコリン＋３μＭパルモルファミン＋ＤＭＳＯ培地に懸濁し、ラミニンコートした６０ｍｍ培養ディッシュに播種した（Ｄ４）。６日目に培地をＮＤＭ＋Ｙ－２７６３２＋神経栄養因子（１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＢＤＮＦ＋１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＧＤＮＦ＋１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＩＧＦ－１）＋２．５μＭセマキサニブ培地またはＮＤＭ＋Ｙ－２７６３２＋神経栄養因子（１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＢＤＮＦ＋１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＧＤＮＦ＋１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＩＧＦ－１）＋ＤＭＳＯ培地に交換した（Ｄ６）。３日目ごとに培地を新しいＮＤＭ＋神経栄養因子＋２．５μＭセマキサニブ培地またはＮＤＭ＋Ｙ－２７６３２＋神経栄養因子（１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＢＤＮＦ＋１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＧＤＮＦ＋１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＩＧＦ－１）＋ＤＭＳＯ培地と交換した。経時的にアイソジェンを用いた定法でＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを用いて逆転写反応を行った。逆転写反応で得られたｃＤＮＡ産物及びＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ｔａｑ ＩＩ試薬を用いて、β－アクチン、ＶＥＧＦ－Ａ、Ｃ、Ｄ及び ＶＥＧＦ受容体－１、２、３及びニューロピリン２の経時的なｍＲＮＡ発現変化を、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒを用いて測定した。
リアルタイムＰＣＲ反応はそれぞれβ－アクチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＦＧ－Ｄ、ＶＥＧＦ受容体－１、ＶＥＧＦ受容体－２、ＶＥＧＦ受容体－３、ニューロピリン２に関する表１のプライマーペアとＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ｔａｑ ＩＩ試薬を用いて行い、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒで検出した。
（３）結果
図６Ａに、健常者由来ｉＰＳ細胞株ＨＳＰ０００３－ＰＢＮ２＃２から分化した運動神経細胞における生存維持と神経可塑性と神経細胞の増殖と分化促進に係るタンパク質遺伝子発現促進の評価結果を示した。
コントロール群と比較して、インドリノン化合物（セマキサニブ）添加群では以下のようにそれぞれの遺伝子の発現促進効果が得られた。
１）ＶＥＧＦ－Ａの発現が約３倍に増加した（上左図）。
２）ＶＥＧＦ－Ｃ及びＶＥＧＦ－Ｄの発現が、それぞれ約９．５倍（上中図）と約１８倍（上右図）に増加した。
３）ＶＥＧＦ受容体－２の発現は神経細胞への分化に伴い減少することがこれまで観察されていたが、セマキサニブ添加により、発現が保たれた（下左図）。
４）ＶＥＧＦ受容体－３の発現が、約４倍に増加した（下中図）。
５）ＶＥＧＦ受容体－２ＶＥＧＦと受容体－３の共受容体ニューロピリン２の発現が、約４倍に増加した（下右図）。
図６Ｂに、孤発性ＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞株ＨＳＰ０１３４－ＰＢＮ２＃１から分化した運動神経細胞における生存維持と神経可塑性と神経細胞の増殖と分化促進に係るタンパク質遺伝子発現促進の評価結果を示した。
コントール群では分化後１５日までに細胞が死滅したが、セマキサニブ添加群では以下のようにそれぞれの遺伝子の発現促進効果が得られた。
１）ＶＥＧＦ－Ａの発現がｉＰＳ細胞と比較して約２倍に増加した（上左図）。
２）ＶＥＧＦ－Ｃ及びＶＥＧＦ－Ｄの発現が、ｉＰＳ細胞と比較してそれぞれ約５．５倍（上中図）と約４倍（上右図）に増加した。
３）神経細胞への分化に伴い減少するＶＥＧＦ受容体－２の発現は、セマキサニブ添加により、ｉＰＳ細胞と比較して約３０％の発現が保たれた（下左図）。
４）ＶＥＧＦ受容体－３の発現が、ｉＰＳ細胞と比較して約80％に保たれた（下中図）。
５）ＶＥＧＦ受容体－２ＶＥＧＦと受容体－３の共受容体ニューロピリン２の発現が、ｉＰＳ細胞と比較して約５倍に増加した（下右図）。
これらの結果から、セマキサニブは、ｉＰＳ細胞から分化した運動神経細胞に対してＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質の発現促進効果を有することが示された。このように、セマキサニブは、運動神経細胞に働きかけ、オートクラインとしてＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質を発現促進することが明らかとなった。
本発明の第２の態様
実施例では以下の材料を使用してｉＰＳ細胞から運動神経細胞への分化誘導を行った。
（材料・試薬）
１）健常者由来ｉＰＳ細胞（ＨＳＰ０００３、０００９、００２９）及びＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞（ＨＳＰ０２９０（家族性）、０２９２（家族性）、０１３４（孤発性）、０１４０（家族性））（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）;
２）ｉＰＳ細胞培養培地ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ 味の素（タカラバイオ）；
３）ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ニッピ（ タカラバイオ）；
４）ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２） １０ｍＭ溶液（富士フイルム和光純薬）；
５）ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャー）;
６）ヒトｉＰＳ細胞用トランスポゾンベクターｐｉｇｇｙＢａｃ，Ａｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅ ＰＢ－ＴＡＧ－ＥＲＮ（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）（Ｋｉｍら、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１３５７： １１１－１３１、２０１６）；
７）ｐＣＡＧ－ＰＢａｓｅ（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）;
８）Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ＩＩ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)；
９）Ｇａｔａｗａｙ ｐＥＮＴＲ１Ａ (サーモフィッシャー);
１０）ニューロジェニン－２（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ－２）遺伝子（かずさゲノムテクノロジーズ）；
１１）ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１（タカラバイオ）;
１２）５０ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８（ナカライテスク）；
１３）ドキシサイクリン １ｍｇ／ｍＬ（ＬＫＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）;
１４）ＤＭＥＭ／ＨＡＭ‘ｓ Ｆ１２培地（富士フイルム和光純薬）；
１５）Ｇｉｂｃｏ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ （ＮＢ）（サーモフィッシャー）；
１６）Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ｘ１００）（富士フイルム和光純薬）；
１７）Ｎ２サプリメント（ｘ１００）（富士フイルム和光純薬）；
１８）Ｂ２７サプリメント（ｘ５０）（サーモフィッシャー）；
１９）Ｌ－アスコルビン酸 １０ｍｇ／ｍＬ（ｘ１０００）（シグマ・アルドリッチ）；
２０）ＴＧＦβファミリー阻害剤（ＳＢ４３１５４２、富士フイルム和光純薬 ０３３－２４３１）５ｍＭ／ＤＭＳＯ；
２１）ＧＳＫ３阻害剤（ＣＨＩＲ－９９０２１、富士フイルム和光純薬）１０ｍＭ／ＤＭＳＯ；
２２）アデニル酸シクラーゼ活性化剤（ホルスコリン、富士フイルム和光純薬）１０ｍＭ／ＤＭＳＯ（ｘ３０００）；
２３）Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト（パルモルファミン、富士フイルム和光純薬）１０ｍＭ／ＤＭＳＯ；
２４）リコンビナントＢＤＮＦ １０μｇ／ｍＬ Ｄ－ＰＢＳ（－）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、コスモバイオ）；
２５）リコンビナントＧＤＮＦ １０μｇ／ｍＬ Ｄ－ＰＢＳ（－）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、コスモバイオ）；
２６）リコンビナントＩＧＦ－１ １０μｇ／ｍＬ Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬）；
２７）セマキサニブ １０ｍＭ （Ｓｅｌｌｅｃｋ）；
２８）神経細胞分化培地（以下ＮＤＭ）は、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ‘ｓ Ｆ１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍを1：1で混合したものにＮ2サプリメント、Ｂ２７サプリメント、Ｌ-グルタミン、１０μｇ／ｍＬ Ｌ-アスコルビン酸 を含有するもの;
２９）アイソジェン（ニッポンジーン）；
３０）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ）；
３１）ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ｔａｑ ＩＩ（タカラバイオ）;
３２）ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（Ｃｅｐｈｅｉｄ ＳＣ２５００Ｎ５－１）;
３３）リアルタイム用ＰＣＲプライマー（β-アクチン、ＰＡＸ６、ＨＢ９、グルタミン酸レセプター１、サバイビン）（表２）
Figure 0007300240000006
（実施例２－１）ヒトニューロジェニン２遺伝子を導入した健常者由来ｉＰＳ細胞とＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞の作製
（１）方法
かずさテクノロジーズから購入したヒトニューロジェニン２遺伝子に定法に従い塩基挿入により停止コドンを付加し、ｐＥＮＴＲ1Ａにクローニングした。Ｋｉｍら（２０１６、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．1357：111-131）に従い、ドキシサイクリンによってニューロジェニン２が一過性に発現されるｉＰＳ細胞を作成した。ただし、遺伝子導入にはエレクトロポーレーション法ではなく、ＴｒａｎｓＩＴ-ＬＴ1を用いたリバーストランスフェクション法を用いて行った。
（２）結果
ベクターが組み込まれたｉＰＳ細胞は、Ｇ４１８（５０μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬまで漸次増加）により選択し、限界希釈法によりそれぞれのｉＰＳ細胞株から、ドキシサイクリンによりニューロジェニン２発現を一過性に誘導できる細胞株として、正常人由来ｉＰＳ細胞からｉＰＳ０００３-ＰＢＮ２＃１，２、３,４,５、ｉＰＳ０００９-ＰＢＮ２＃１，２、３、４、５、ｉＰＳ００２９-ＰＢＮ２＃１，２、３、４、５を樹立した。また、同様にＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞からｉＰＳ０２９０-ＰＢＮ２＃１，２、３、４、５、ｉＰＳ０２９２-ＰＢＮ２＃１，２、３、４、５、ｉＰＳ０１３４-ＰＢＮ２＃１，２、３、４、５、ｉＰＳ０１４０-ＰＢＮ２＃１，２、３、４、５を樹立した（以下ドキシサイクリンによってニューロジェニン２が一過性に発現されるｉＰＳ細胞を総称してｉＰＳ-ＰＢＮ２とよぶ）。
（実施例２－２）ヒトニューロジェニン２遺伝子を導入した健常者由来ｉＰＳ細胞の分化開始
（１）方法
Ｄ－ＰＢＳ（－）を１ｍＬいれた６０ｍｍ培養ディッシュにｉＭａｔｒｉｘ－５１１を２０μｌ加え、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で６０分以上反応させてラミニンコーティングを行った。次に溶液を除去し、ＳｔｅｍＦｉｔ培地に入れ替え、インキュベーターに入れてなじませておく。必要量（４ｍＬ培養ディッシュ）のＳｔｅｍＦｉｔ培地に終濃度１０μＭ になるようにＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）を加え、インキュベーターに入れておき、実施例１で得られた各ｉＰＳ-ＰＢＮ２を懸濁し、ＳｔｅｍＦｉｔ培地を除去したラミニンコーティングした培養ディッシュに播種した。
分化誘導には、上記したようにラミニンコーティングした６０ｍｍ培養ディッシュ１枚につき５ｘ１０４個のｉＰＳ－ＰＢＮ２細胞を４ｍＬの（ＳｔｅｍＦｉｔ＋Ｙ）＋１μｇ／ｍＬドキシサイクリン（ＤＯＸ）に懸濁し、播種して１６時間培養した。
（２）結果
分化誘導開始から１６時間培養した健常者由来ｉＰＳ細胞ｉＰＳ０００３-ＰＢＮ２＃２は、図８の位相差顕微鏡写真の右図に示されるように、ほとんどのｉＰＳ細胞が突起を伸ばし、神経前駆細胞様に形態変化をしている。更にＤＯＸ存在下で２４時間培養しても、図９の右図に示されるように、神経前駆細胞様に形態が維持されていた。
なお、ＤＯＸを添加したまま４８時間経過すると、周囲のぼやけた丸い大きめの細胞が現れてくる。ＤＯＸを添加したまま５日経過すると、形態の変化したコロニーに変わる。従って、ＤＯＸによるニューロジェニン２の誘導時間は１６～２０時間が必要十分であり、長期にわたるニューロジェニン２の誘導時間は神経細胞への分化にマイナスに働くことが明らかとなった。
（実施例２－２）健常者由来ｉＰＳ細胞からの神経幹細胞様の細胞から神経細胞への分化誘導
（１）方法
実施例２の１６時間ＤＯＸ存在下で培養した、そのままの培養ディッシュで、次のように培地を交換し、神経細胞に分化誘導した。
ａ）一次培養
神経前駆細胞様の細胞の培地を、ＲＯＣＫ阻害剤（１０μＭ Ｙ－２７６３２）＋ＴＧＦβファミリー阻害剤（３μＭ ＳＢ４３１５４２）＋ＧＳＫ３阻害剤（３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１）＋アデニル酸シクラーゼ活性化剤（３μＭホルスコリン）を含有するＮＤＭ培地に交換した。ドキシサイクリン添加による分化開始から４日目までに神経前駆細胞が盛んに増殖し培養面積の７０％ほどに達した。培養ディッシュからＮＤＭ＋１０μＭ Ｙ－２７６３２＋３μＭ ＳＢ４３１５４２＋３μＭ ＣＨＩＡ９９０２１＋３μＭホルスコリン培地を除去した後、４ｍＬのＤ－ＰＢＳ（－）で１回洗浄し、１ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを加えて３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で９分間反応させた後、４ｍｌのＮＤＭ培地を加えてピペッティングしてよく分散させ、遠心管に移し、遠心分離により細胞を集めた。集めた細胞を１ｍｌのＮＤＭ培地に分散させて細胞数を計数した。
ｂ）二次培養
上記の集めた細胞を６０ｍｍ培養ディッシュあたり２ｘ１０５個となるようにＲＯＣＫ阻害剤（１０μＭ Ｙ－２７６３２）＋アデニル酸シクラーゼ活性化剤（３μＭホルスコリン）＋Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト（３μＭパルモルファミン）を含有するＮＤＭ培地４ｍLに懸濁し、ラミニンコートした６０ｍｍ培養ディッシュに播種した。このまま分化誘導６日目まで培養を続けた。
ｃ）三次培養（最終分化培養）
分化誘導６日目の二次培養後にそのままの培養ディッシュで培地を、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）＋神経栄養因子（１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＢＤＮＦ＋１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＧＤＮＦ＋１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＩＧＦ－１）を含有するＮＤＭ培地に交換した。その後３日目ごとに培地を神経栄養因子を含有する新しいＮＤＭ培地と交換した。
経時的（典型的にはドキシサイクリン添加を行わない１日目をコントロール、ドキシサイクリン添加後１日目、４日目、１５日目、１８日目、２２日目、３３日目など）にアイソジェンを用いた定法でＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを用いて逆転写反応を行った。逆転写反応で得られたｃＤＮＡ産物及びＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ｔａｑ ＩＩ試薬を用いて、β-アクチン、ＰＡＸ６、ＨＢ９、ＧｌｕＡ１のｍＲＮＡ発現変化をＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒを用いて測定した。
（２）結果
図１０の位相差顕微鏡写真に示す通り、分化誘導１日目にはすべての細胞から神経突起の伸長がはじまった（上右図ｂ）。３日目には細胞が増殖しており、さらなる神経突起の発達がみられた（下左図ｃ）。分化誘導３２日目には、神経突起の発達した神経細胞が観察された（下右図ｄ）。
図１１に神経細胞分化マーカーｍＲＮＡの発現動態を示す。神経幹細胞マーカーＰＡＸ６の発現がまず急激に増加し、分化の進行とともに減少して行った（上図ａ）。続いて運動神経細胞マーカーＨＢ９の発現が急激に増加し、分化の進行とともに漸増しながら高い発現量を保つ（中図ｂ）。成熟神経細胞のマーカーとしてＧｌｕＡ１の発現を調べたところ、ＰＡＸ６の発現が減少に転じた１８日目の時点でＧｌｕＡ１が急激に増加し、そのまま高い発現を保った（下図ｃ）。分化した神経細胞は、最長４か月間観察できた。
このように、分化誘導開始後、１８日目以降になると、分化した神経細胞が大多数となり、約1か月になると成熟した神経細胞になって分化誘導が完了すると考えられる。
（実施例２－３）ヒトニューロジェニン２遺伝子を導入したＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞の分化開始
（１）方法
Ｄ－ＰＢＳ（－）を１ｍＬいれた６０ｍｍ培養ディッシュにｉＭａｔｒｉｘ－５１１を２０μｌ加え、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で６０分以上反応させてラミニンコーティングを行った。次に溶液を除去し、ＳｔｅｍＦｉｔ培地に入れ替え、インキュベーターに入れてなじませた。必要量（４ｍＬ／シャーレ）のＳｔｅｍＦｉｔ培地に終濃度１０μＭ になるようにＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）を加え、インキュベーターに入れておき、実施例１で得られた孤発性ＡＬＳ患者由来ｉＰＳ０１３４-ＰＢＮ２＃１をインキュベーターに入れておいたＳｔｅｍＦｉｔ＋Ｙ－２７６３２培地に懸濁して、ラミニンコーティングを行った培養ディッシュに播種した。
分化誘導には、上記したようにラミニンコーティングした６０ｍｍ培養ディッシュ１枚につき５ｘ１０４個のＡＬＳ患者由来ｉＰＳ０１３４－ＰＢＮ２＃１細胞を４ｍＬの（ＳｔｅｍＦｉｔ＋Ｙ）＋１μｇ／ｍＬドキシサイクリン（ＤＯＸ）に懸濁し、播種して１６時間培養した。この時、インドリノン化合物（セマキサニブ）添加群（２．５μＭ）とインドリノン化合物無添加群（ＤＭＳＯ添加）を作成した。
（２）結果
分化誘導後１６時間培養したＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞は、図１２の位相差顕微鏡写真のｂ）に示されるように、インドリノン化合物無添加群（左図）とインドリノン化合物（セマキサニブ）添加群（右図）で共にほとんどのｉＰＳ細胞が神経前駆細胞様に形態変化をしている。
（実施例２－４）ＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞からの神経前駆細胞様の細胞から神経細胞への分化誘導
（１）方法
細胞として孤発性ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ０１３４-ＰＢＮ２＃１を用い、インドリノン化合物（セマキサニブ）添加群と無添加群を作った他は、実施例２に従って分化誘導を開始した。インドリノン化合物（セマキサニブ）添加群ではドキシサイクリン（ＤＯＸ）添加による分化開始に同時に最終濃度２．５μＭを添加した。１６時間ＤＯＸ存在下で培養した、そのままの培養ディッシュで、次のように培地を交換し、神経細胞に分化誘導した。
ａ）一次培養
神経幹細胞様の細胞の培地を、ＲＯＣＫ阻害剤（１０μＭ Ｙ－２７６３２）＋ＴＧＦβファミリー阻害剤（３μＭ ＳＢ４３１５４２）＋ＧＳＫ３阻害剤（３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１）＋アデニル酸シクラーゼ活性化剤（３μＭホルスコリン）を含有するＮＤＭ培地に交換した。インドリノン化合物（セマキサニブ）添加群では最終濃度２．５μＭを添加した。ＤＯＸ添加による分化開始から４日目までに神経前駆細胞が盛んに増殖し培養面積の７０％ほどに達した。培養ディッシュからＮＤＭ＋１０μＭ Ｙ－２７６３２＋３μＭ ＳＢ４３１５４２＋３μＭ ＣＨＩＡ９９０２１＋３μＭホルスコリン培地を除去した後、４ｍＬのＤ－ＰＢＳ（－）で１回洗浄し、１ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを加えて３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で９分間反応させた後、４ｍｌのＮＤＭ培地を加えてピペッティングしてよく分散させ、遠心管に移し、遠心分離により細胞を集めた。集めた細胞を１ｍｌのＮＤＭ培地に分散させて細胞数を計数した。
ｂ）二次培養
上記の集めた細胞を６０ｍｍ培養ディッシュあたり２ｘ１０５個となるようにＲＯＣＫ阻害剤（１μＭ Ｙ－２７６３２）＋アデニル酸シクラーゼ活性化剤（３μＭホルスコリン）＋Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト（３μＭパルモルファミン）を含有するＮＤＭ培地４ｍLに懸濁し、ラミニンコートした６０ｍｍ培養ディッシュに播種した。インドリノン化合物（セマキサニブ）添加群では最終濃度２．５μＭを添加した。このまま分化誘導６日目まで培養を続けた。
ｃ）三次培養（最終分化培養）
分化誘導６日目までの二次培養後に、そのままの培養ディッシュで培地を、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）＋神経栄養因子（１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＢＤＮＦ＋１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＧＤＮＦ＋１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントＩＧＦ－１）を含有するＮＤＭ培地に交換した。インドリノン化合物（セマキサニブ）添加群では最終濃度２．５μＭを添加した。３日目ごとに培地を神経栄養因子を含有する新しいＮＤＭ培地と交換した。分化誘導開始から２８日目まで観察を継続した。経時的（Ｄｏｘ添加なしのコントロール1日目、Ｄｏｘ添加後１日目、４日目、２１日目）にアイソジェンを用いた定法でＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを用いて逆転写反応を行った。逆転写反応で得られたｃＤＮＡ産物及びＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ｔａｑ ＩＩ試薬を用いて、β-アクチン、ＰＡＸ６、ＨＢ９、ＧｌｕＲ１のｍＲＮＡ発現変化をＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒを用いて測定した。
（２）結果
図１２の位相差顕微鏡写真ｃ）に示す通り、分化誘導１５日目には、インドリノン化合物非添加群（左図）は死滅したが、インドリノン化合物（セマキサニブ）添加群（右図）は生存し、さらに神経突起が伸長し、ｄ）に示す通り、分化誘導２６日目には、インドリノン化合物添加群で神経突起の発達した神経細胞が観察された。なお、インドリノン化合物無添加群では、分化誘導１５日目には死滅しているため、d）の左図には掲示しなかった。
（実施例２－５）インドリノン化合物（セマキサニブ）によるサバイビン遺伝子の発現促進効果
（１）方法
実施例５と同様に、インドリノン化合物（セマキサニブ）添加群と無添加群を作り、健常者由来ｉＰＳ細胞ｉＰＳ０００３-ＰＢＮ２＃２と孤発性ＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞ｉＰＳ０１３４-ＰＢＮ２＃１を神経細胞に分化させた。経時的にアイソジェンを用いた定法でＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを用いて逆転写反応を行った。逆転写反応で得られたｃＤＮＡ産物及びＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ｔａｑ ＩＩ試薬を用いて、サバイビンのｍＲＮＡ発現変化をＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒを用いて測定した。
（２）結果
健常者由来ｉＰＳ細胞とＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞において、ｉＰＳ細胞の継代培養の過程では目立った差は認められなかった。しかし、アポトーシス阻害タンパク質サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）遺伝子の発現を評価したところ、ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞では顕著にサイバビンの発現が低下していた（健常者由来ｉＰＳ細胞の約１８％）（図１３）。
そこで、インドリノン化合物（セマキサニブ）の添加を行い、健常者由来ｉＰＳ細胞とＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞の分化誘導を行い、神経細胞に分化させた。インドリノン化合物（セマキサニブ）無添加の場合、実施例２－５に記載のように、ＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞から分化誘導された神経細胞は、分化誘導１５日目には死滅したが、インドリノン化合物（セマキサニブ）を添加した場合には、図１２ｄ）に示すように、分化誘導２１日目でもＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞から分化誘導された神経細胞は生存維持されており、図１３に示すようにサバイビンの遺伝子発現が増大していた（ＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞と比較して約３倍、インドリノン化合物を添加しない健常者由来神経細胞の約８０％まで発現増加）。同様に、健常者由来神経細胞から分化誘導された神経細胞についても、分化誘導２２日目において、サバイビンの遺伝子発現が２．７倍増大していた。
このように、インドリノン化合物（セマキサニブ）は、分化開始時から添加することにより健常者由来ｉＰＳ細胞とＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞のどちらでも誘導された神経細胞におけるサイバビン遺伝子の発現を促進させることが分かった。更に、分化誘導時においてサイバビン遺伝子の発現促進効果によるため、神経細胞分化誘導のストレスに脆弱で死滅しやすいＡＬＳ患者由来の神経細胞分化誘導後細胞の死滅を抑制できることが示された。
本発明の第１の態様
本発明のインドリノン化合物は、運動神経細胞に働きかけ、オートクラインとしてＢＤＮＦ及び／又はＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質の発現を促進する効果を有している。従って、本発明のインドリノン化合物は、幅広い精神神経系疾患に極めて有用な治療薬剤となることが明らかとなった。更に、セマキサニブに示されるように、ＢＤＮＦとＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質の同時発現促進効果を持つインドリノン化合物の場合には、ＢＤＮＦとＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質が共役して生理学的機能を果たす場合（うつ病など、非特許文献７）及び／または相乗効果により、更に神経細胞維持、神経可塑性の向上を示し、神経幹細胞の増殖と分化が促進されることになり、運動神経細胞の生物学的動態を活性化できる。本発明のインドリノン化合物のオートクラインとしてのＢＤＮＦ及び／又はＶＥＧＦシグナル伝達系タンパク質の発現促進により、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、加齢に伴う神経障害（認知症など）、うつ病、統合失調症、双極性障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、不安障害、パニック障害、自閉症スペクトラム障害、発達障害、レット症候群、ダウン症候群、脳卒中後の症状回復、脊髄損傷後の機能回復などの幅広い精神神経系疾患に極めて有用な治療薬剤になり、また神経幹細胞移植による再生医療の優れた補助薬としてパーキンソン病やアルツハイマー病、および脊髄損傷治療への臨床応用が可能となり、再生医療推進が可能となった。喫緊の課題である健康寿命の延伸にも貢献する。
本発明の第２の態様
本発明のサイバビン発現促進剤により、ｉＰＳ細胞の細胞活動度が弱く、サイバビン遺伝子の発現が低下していて、分化誘導時に死滅しやすい細胞であっても、最終分化可能であることが見出された。例えば、ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞では、サイバビン遺伝子の発現が顕著に低下しているが、分化誘導時において、インドリノン化合物を添加することにより、サバイビンの発現が改善され、早期の細胞死滅がなく、分化した神経細胞が作製可能になった。
また、本発明の分化誘導方法により、人工多能性幹細胞から神経細胞の効率的な分化と分化神経細胞の長期にわたる培養が可能となった。また、フィーダー細胞、マウス肉腫由来マトリジェル、牛血清などのヒト以外の生物由来のロット差のある未同定成分を含まないゼノフリー培養系での分化誘導が可能になった。本発明の分化誘導方法により、例えばＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞から容易にＡＬＳに特有の神経細胞を作製できるので、ＡＬＳ治療用の化合物（たとえば医薬化合物、溶媒、小分子、ペプチド、またはポリヌクレオチド）のスクリーニングを行うことが可能になった。また、ゼノフリー培養系であることから、スクリーニング結果に、未同定成分による影響を受けることがなくなり、より正確なスクリーニングができるようになった。更に個々の患者由来のｉＰＳ細胞から神経細胞を分化誘導することによって、個々の患者の神経疾患に対する薬剤の治療効果を事前に評価できるようになった。また、ゼノフリー培養系における長期における神経細胞培養維持が可能になったことにより、神経疾患による経時的変化の評価と治療薬のスクリーニングがより詳細に可能となった。
加えて、健康な脳活動の維持に重要な役割を果たすサバイビンの発現を促進する本発明のサイバビン発現促進剤は、成人海馬における神経新生を活性化させ、特に外傷性脳損傷後の成人の海馬における神経新生と外傷性脳損傷後の回復にサバイビンが大きな役割を果たすことから（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，３００：２１９－２２８，２０１５）、治療薬の一端を担うものと期待される。また、学習・記憶に重要な役割を果たす成人の海馬における神経新生能が、加齢とともに衰えるという知見が２０１８年に発表されたが（Ｓｏｒｒｅｌｌｓら、Ｎａｔｕｒｅ （２０１８）５５５：３７７）、動物実験でサバイビンの発現増強により海馬の神経新生能が回復することから（Ｍｉｒａｎｄａ ＣＪら， Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ （２０１２） １１；５４２－５５２）、本発明のサイバビン発現促進剤が健康寿命の延伸への貢献する薬剤開発の端緒になると期待される。

Claims (9)

  1. 一般式（１）
    Figure 0007300240000007
     ［式中、Ｒ1、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、メチル基、エチル基、ホルミル基、アセチル基、カルボキシル基、エチルオキシカルボニル基、メトキシカルボニルメチル基、エトキシカルボニルメチル基、２－カルボシキエチル基、２－メトキシカルボニルエチル基、２－エトキシカルボニルエチル基、又は２－ジエチルアミノエチルアミド基である。Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はニトロ基である。］で表されるインドリノン化合物もしくはその薬学上許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする、神経細胞賦活化剤。
  2. Ｒ1、Ｒ２およびＲ３におけるハロゲン原子が、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子であり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７におけるハロゲン原子がフッ素原子、又は塩素原子である、請求項１に記載の神経細胞賦活化剤。
  3. Ｒ1およびＲ３がメチル基、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が水素原子である、請求項１又は２に記載の神経細胞賦活化剤。
  4. 神経細胞賦活化が、神経細胞の生存維持の活性化である、請求項1～３のいずれかに記載の神経細胞賦活化剤。
  5. 神経細胞が、中枢神経系及び末梢神経系神経細胞である、請求項1～４のいずれかに記載の神経細胞賦活化剤。
  6. 神経細胞が、再生医療における移植神経幹細胞である、請求項1～５のいずれかに記載の神経細胞賦活化剤。
  7. 神経細胞賦活化が、ＢＤＮＦ及び／又はＶＥＧＦシグナル伝達系タンパクの発現促進を介したものである、請求項1～６のいずれかに記載の神経細胞賦活化剤。
  8. 一般式（１）
    Figure 0007300240000008
    ［式中、Ｒ 1 およびＲ ３ は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、メチル基、エチル基、ホルミル基、アセチル基、カルボキシル基、エチルオキシカルボニル基、メトキシカルボニルメチル基、エトキシカルボニルメチル基、２－カルボシキエチル基、２－メトキシカルボニルエチル基、２－エトキシカルボニルエチル基、又は２－ジエチルアミノエチルアミド基である。Ｒ ２ は、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、エチル基、ホルミル基、アセチル基、カルボキシル基、エチルオキシカルボニル基、メトキシカルボニルメチル基、エトキシカルボニルメチル基、２－カルボシキエチル基、２－メトキシカルボニルエチル基、又は２－エトキシカルボニルエチル基である。Ｒ ４ 、Ｒ ５ 、Ｒ ６ 及びＲ ７ は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、又はニトロ基である。］で表されるインドリノン化合物もしくはその薬学上許容される塩を有効成分として含有する、精神神経系疾患治療剤。
  9. 精神神経系疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、加齢に伴う神経障害（認知症など）、うつ病、統合失調症、双極性障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、不安障害、パニック障害、自閉症スペクトラム障害、発達障害、レット症候群、ダウン症候群、脳虚血障害、又は脊髄損傷である、請求項８に記載の精神神経系疾患治療剤。
JP2022557466A 2020-10-16 2021-10-14 神経細胞賦活化剤 Active JP7300240B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023099848A JP2023116733A (ja) 2020-10-16 2023-06-19 神経細胞賦活化剤

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020184701 2020-10-16
JP2020184701 2020-10-16
JP2021113829 2021-05-31
JP2021113829 2021-05-31
PCT/JP2021/038149 WO2022080473A1 (ja) 2020-10-16 2021-10-14 神経細胞賦活化剤

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023099848A Division JP2023116733A (ja) 2020-10-16 2023-06-19 神経細胞賦活化剤

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2022080473A1 JPWO2022080473A1 (ja) 2022-04-21
JP7300240B2 true JP7300240B2 (ja) 2023-06-29

Family

ID=81208068

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022557466A Active JP7300240B2 (ja) 2020-10-16 2021-10-14 神経細胞賦活化剤
JP2023099848A Pending JP2023116733A (ja) 2020-10-16 2023-06-19 神経細胞賦活化剤

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023099848A Pending JP2023116733A (ja) 2020-10-16 2023-06-19 神経細胞賦活化剤

Country Status (2)

Country Link
JP (2) JP7300240B2 (ja)
WO (1) WO2022080473A1 (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019205468A (ja) 2010-05-25 2019-12-05 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター ヒト胚性幹細胞の侵害受容器分化のための方法およびその使用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2628425B1 (fr) * 1988-03-08 1992-04-03 Rhone Poulenc Sante Derives d'isoindolinone, leurs procedes de preparation et les medicaments les contenant
CA3054120A1 (en) * 2017-02-24 2018-08-30 Koji Tanabe Nerve cell production method by introduction of inducing factor rna

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019205468A (ja) 2010-05-25 2019-12-05 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター ヒト胚性幹細胞の侵害受容器分化のための方法およびその使用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GRAMMAS, Paula et al.，A New Paradigm for the Treatment of Alzheimer's Disease: Targeting Vascular Activation， J Alzheimers Dis，2014年，40(3)，Pages 619-630，doi: 10.3233/JAD-2014-132057
Kim et al.，Inhibition of VEGF signaling reduces diabetes-exacerbated brain swelling, but not infarct size, in large cerebral infarction in mice，Transl Stroke Res.，2018年，9(5)，540-548，doi:10.1007/s12975-017-0601-z

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022080473A1 (ja) 2022-04-21
JP2023116733A (ja) 2023-08-22
JPWO2022080473A1 (ja) 2022-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200407680A1 (en) Midbrain dopamine (da) neurons for engraftment
US20210123018A1 (en) Methods of in vitro differentiation of midbrain dopamine (mda) neurons
JP2022059056A (ja) 幹細胞由来シュワン細胞を使用する薬物発見のための方法
CA3108669A1 (en) Inhibitors of sarm1
US20230233617A1 (en) Methods for differentiating stem cells into dopaminergic progenitor cells
US20220177835A1 (en) Methods of generating and isolating midbrain dopamine neurons
JP7471084B2 (ja) 幹細胞由来星状細胞、作製方法および使用方法
US7132287B2 (en) Method for neural stem cell differentiation using 5HT-1A agonists
Reumann et al. In vitro modeling of the human dopaminergic system using spatially arranged ventral midbrain–striatum–cortex assembloids
JP7300240B2 (ja) 神経細胞賦活化剤
Atefi et al. Construction and characterization of EGFP reporter plasmid harboring putative human RAX promoter for in vitro monitoring of retinal progenitor cells identity
US20220333071A1 (en) Methods of making, expanding and purifying midbrain dopaminergic progenitor cells
Kozhevnikova Generation of cell Diversity in the Developing Brainstem and its Modeling in Vitro

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20221116

A871 Explanation of circumstances concerning accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871

Effective date: 20221116

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20221115

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230124

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230314

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230515

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20230609

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20230618

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7300240

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150