JP7297840B2 - 主要組織適合遺伝子複合体一塩基多型 - Google Patents
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Description
における一塩基多型(SNP)の同定に関する。
である。MHCは、ヒト白血球抗原(HLA)をコードする遺伝子を含む、多くの免疫応答遺伝子を含有する。MHCはまた、免疫学的反応及び炎症反応に関わる多くの遺伝子も含有し、
多数の自己免疫異常及び炎症性異常と関連している。
数分裂約100回に1回の頻度で組換えが生じることが示されている。これらの組換えホットスポットの間には、長さにして数百キロベースに至るDNAのゲノムブロックが存在してい
る。従って、ある集団における多くの非血縁者は、保存されたハプロタイプか、又は、保存されたハプロタイプから組換えられたブロックを有している。保存されたハプロタイプは、「拡張ハプロタイプ(extended haplotype)」又は「祖先ハプロタイプ(ancestral haplotype)」と称される。
在、移植ドナーとレシピエントのマッチングに用いられている。HLA-DPB1は、デルタブロックとHLA-DPB1の遺伝子間で見られる高比率の組換えから、恐らくデルタブロックのセントロメア側の分離されたブロックに存在する。それにもかかわらず、HLA-DPB1は、移植マッチングのために頻繁にタイピングされる。HLAマッチングは、幹細胞移植後の予後改善
のためには非常に重要であることが示されている。なお、Petersdorfら(2007)による研究により、HLAがマッチするドナーとレシピエントがハプロタイプもマッチした場合、HLAがマッチしているがハプロタイプがミスマッチしているドナー/レシピエントのペアに比較して、非血縁幹細胞移植後の予後が改善されることが示された。この研究においては、ドナー及びレシピエントの両方からのゲノムDNAが抽出され、HLAアレル間の物理的結合を検出するために構成されたオリゴヌクレオチドプローブを含有するマイクロアレイに対してハイブリダイズさせていた。このアプローチは、ルーチン的なHLAタイピングには適して
おらず、ハプロタイプマッチングの可能性を評価又は改善するためのルーチン的試験はこれまでに記述されていない。
る物理的結合として記述される。HLA及びMHCに言及する際に、ハプロタイプという用語は、少なくともHLA-AからHLA-DQB1までに渡る、MHC全体を記述するために用いられる。この領域は、約4Mbに渡り、通常は完全なままで遺伝する。
プ/HLAがマッチしている個人間の移植片対宿主病(GVHD)が減少しているのは、ハプロタイプがマッチしている個人が完全な又は部分的な祖先ハプロタイプを共有しており、それ故、多くの独特な配列をも共有しているからである可能性がある。
それに続く。HLAハプロタイプが一致する兄弟姉妹が同定されることは比較的可能性が低
いため、しばしば、ドナーバンクを通じてアクセス可能な、適切な非血縁HLAマッチドナ
ーを同定する必要性が生じる。しかしながら、HLAがマッチするにもかかわらず、予後が
良好となる見込みは通常ハプロタイプが一致する兄弟姉妹のそれよりも低い。結果におけるこの不同性に対する1つの理由としては、ハプロタイプが一致する兄弟姉妹は、MHC中
の、移植結果に寄与し得る他の遺伝子や配列に関してマッチしているということであり得ると考えられている。
)のaGVHDを発症するリスクを低減するような、レシピエントに対する移植ドナーの同定
のための試験方法が必要とされている。
デルタブロック)間に位置する、MHCガンマブロックのコード及び非コード部分における
独特なDNA配列ヌクレオチド又は一塩基多型(SNPs)の同定を記述する。多数の同定されたSNPは、多数の祖先ハプロタイプと共通である一方で、その他の同定されたSNPはある祖先
ハプロタイプに対して特異的である。併せて使用することで、それらのSNPはガンマブロ
ックSNPプロファイル(Gamma block SNP profile、GBSP)を提供する。最も血縁関係がなくランダムな個人であり、それ故HLAがマッチする可能性が低い個人が、独特な又はミス
マッチを有するGBSPを有し、かつ、同一のGBSPを有する個人はHLAがマッチする可能性が
高いことを、本発明者らは示した。従って、これらのSNP又はGBSPは、移植の必要がある
レシピエントに対する移植ドナーの同定に用いることができる。潜在的な移植ドナー及びレシピエントの両方におけるMHCガンマブロックSNP又はGBSPをマッチさせることによって、HLAがミスマッチしている別のドナーにおいて移植レシピエントがGVHDを発症するリス
クが低減される。なお、単一のHLA型ミスマッチが存在する場合に、非血縁の潜在的な移
植ドナーとレシピエントの両方におけるMHCのSNP又はGBSPをマッチさせた場合、5年後の
生存率がかなり改善される。
エントに対する移植ドナーを同定する方法を提供する:
a)移植の必要があるレシピエントのMHCガンマブロックにおける1又は複数の一塩基多型アレルの存在を決定する工程;
b)1又は複数の潜在的な移植ドナーのMHCガンマブロックにおける1又は複数の一塩基多型アレルの存在を決定する工程;及び
c)移植ドナー及び移植の必要があるレシピエントの両方のMHCガンマブロックにお
ける1又は複数の一塩基多型アレルの存在に基づき、移植ドナーを同定する工程。
ガンマブロックにおける少なくとも24の一塩基多型アレルの存在に基づき、移植ドナーを同定する工程を含む。
a)移植の必要があるレシピエントのMHCガンマブロックにおける1又は複数の一塩基多型アレルの存在を決定する工程;
b)1又は複数の潜在的な移植ドナーのMHCガンマブロックにおける1又は複数の一塩
基多型アレルの存在を決定する工程;
ここで、移植レシピエント及び1又は複数の潜在的な移植ドナーの両方のMHCガンマブロックにおける1又は複数の一塩基多型アレルの存在又は不存在が、移植ドナーからの移植片
の移植に伴い、移植レシピエントが移植片対宿主病を発症する可能性の低減を示す。
a)移植の必要があるレシピエントのMHCガンマブロックにおける1又は複数の一塩
基多型アレルの存在を決定する工程;
b)1又は複数の潜在的な移植ドナーのMHCガンマブロックにおける1又は複数の一塩基多型アレルの存在を決定する工程;
ここで、移植レシピエント及び1又は複数の潜在的な移植ドナーの両方のMHCガンマブロックにおける1又は複数の一塩基多型アレルの存在又は不存在が、移植レシピエントが、移
植ドナーからの組織又は器官の移植後に増長した生存期間を経験することを示す。
多型アレルのそれぞれに対してマッチしているドナー及びレシピエントは、移植レシピエントが、移植ドナーからの組織又は器官の移植後に増長した生存期間を経験することを示す。
解するであろう。
のMHCガンマブロック一塩基多型アレル情報及び/又はMHCガンマブロックハプロタイプ情
報を獲得する工程を含む。
在を決定するために、レシピエントからの、及び/又は、潜在的なドナーからの核酸試料
を分析する工程を含む。
在又は不存在を決定するために用いられ得る。例えば、一態様において、核酸試料を分析する工程には、PCR-SSPアッセイ、アレル特異的プローブハイブリダイゼーション、アレ
ル特異的プライマーエクステンション法、アレル特異的増幅、核酸配列決定、5’ヌクレ
アーゼ消化、分子ビーコンアッセイ、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、サイズ分析、一本鎖高次構造多型分析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、及び、直接ヌクレオチド配列決定の1又は複数から選択される技術を実施する工程を含む。
的試料を獲得する工程及びその生物学的試料から核酸を単離する工程が含まれる。別態様において、核酸試料は潜在的な移植ドナー及び/又はレシピエントから獲得された生物学
的試料から単離される。生物学的試料は、ゲノムDNAが抽出され得るあらゆる適切な細胞
又は組織であり得、例えば、生物学的試料は、リンパ球、全血、口腔の拭き取り検体、生検、又は、凍結組織であり得る。
含む。
多型アレルはC4A遺伝子及びC4B遺伝子の両方に存在する。
i)潜在的な移植ドナー及びレシピエントのMHCガンマブロックにおける1又は複数の一塩基多型アレルの存在、又は
ii)MHCガンマブロックにおける1又は複数の一塩基多型アレルの存在、及び、潜在的
な移植ドナーにおける1又は複数の他のHLAアレル及び/又はHLAハプロタイプの存在。
i)本発明の方法により移植ドナーを選択する工程、
ii)移植ドナーからドナー移植片を取り出す工程、及び
iii)移植片をレシピエントへ移植する工程。
a)MHCガンマブロックにおける1又は複数の一塩基多型アレルを検出するための核酸試薬;及び
b)1又は複数の一塩基多型アレルを検出するための説明書。
プローブなどの、1又は複数のオリゴヌクレオチドプローブであり得る。特定の一態様に
おいて、オリゴヌクレオチドプローブは、C4遺伝子における1又は複数の一塩基多型アレ
ルに対して特異的である。
ルに対して特異的である。
588及びA20170のそれぞれに対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含む。
塩基多型アレルを増幅するためのものである。
さらに含む。
リゴヌクレオチドプライマーを含む。
て特異的である。
を含む。
を検出するための1又は複数のPCR-SSPアッセイを実施する方法を提供する:
i)DNA-ポリメラーゼ混合物を形成するために、ゲノムDNAとDNAポリメラーゼを混合する工程、
ii)DNA-ポリメラーゼ混合物と、MHCガンマブロックからの一塩基多型アレルを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーとを混合することによって、反応混合物を形成する工程、
iii)増幅産物を生産するために、反応混合物をサーマルサイクルへ供する工程、及び、
iv)一塩基多型を検出するために、増幅産物を分析する工程。
一塩基多型アレルはC4遺伝子に存在する。
、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、G12749、A12877、A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、C16954、T17316、T19588及び/又はA20170から選択される。
それぞれに対してマッチしている。
レオチドアレイの使用を提供する。
る(comprising)」などの派生語は、既定された要素、整数若しくは工程、又は、要素、整数又は工程のグループの包含を意味するが、あらゆるその他の要素、整数若しくは工程、又は、要素、整数又は工程のグループの除外を意味しないと理解される。
配列番号:1-C4Aアイソタイプ特異的アミノ酸残基。
配列番号:2-C4Bアイソタイプ特異的アミノ酸残基。
配列番号:3~50-オリゴヌクレオチドプライマー。
特に別に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術的及び科学的用語は当技術分野(例えば、分子遺伝学、生化学、及び免疫学)の当業者によって通常理解されるものと同一の意味と解釈されるべきである。
の方法及び/又は商業的に利用可能なキットを用いて、例えば、QIAGENにより提供されるQIAamp DNA blood Mini Kit又はDNeasy Blood & Tissue Kitを用いることにより、又は、
フェノール/クロロホルム抽出法及びエタノール沈殿法などの方法を用いることにより、
細胞から抽出し得る。
組織原料を分子的遺伝子型同定に用いることができ、例えば、末梢血液からのリンパ球が最もよく使用される。非侵襲性の手段を通じて、例えば、口腔粘膜検体採取法又は唾液ベースのDNA採取法によって得られた試料を利用することも可能である。そのような材料か
らDNAを抽出するために適切な様々な方法が当技術分野において公知である。これらは、
有機溶媒抽出からシリカをコートしたビーズ上への吸収、及び、陰イオン交換カラムと多岐にわたる。DNA抽出のための自動システムも商用的に利用可能であり、良好な質、高い
純度のDNAを提供し得る。
は、ある個体(ドナー)から得られた組織又は細胞を別の個体(レシピエント)の身体中又は身体上へ移植(grafting)又は導入することを指す。ドナーから取り出され、レシピエントへ移植された細胞又は組織は、「移植片」と称される。通常移植される組織の例は、骨髄、造血幹細胞、肝臓、心臓、皮膚、膀胱、肺、腎臓、角膜、膵臓、膵島、脳組織、骨、及び、腸などの器官である。一態様において、移植は、造血幹細胞移植である。
本明細書において用いられる場合、用語「MHCガンマブロック」は、6番染色体の短腕上の主要組織適合遺伝子複合体(MHC)のHLA-B/Cブロック(デルタブロック)及びHLA-DRB/DQB
ブロック(デルタブロック)の間に位置するゲノム領域を指す(図1)。MHCガンマブロックに位置する遺伝子は、TNXB (OMIM 600985)、CYP21A2 (OMIM 613815)、C4A (OMIM 120810)、STK19 (OMIM 604977)、C4B (OMIM 120820)、DOM3Z (OMIM 605996)、SKIVL2 (OMIM 600478)、RDBP (OMIM 154040)、CFB (OMIM 138470)、C2 (OMIM 613927)及びEHMT2 (OMIM 604599)が含まれるが、これらに限定されない。
。C4遺伝子は2つの形態のいずれかにより存在する:C4A(酸性)(OMIMレファレンス: 120810)又はC4B(塩基性)(OMIMレファレンス: 120820)で、各々がそれ自身における多型である。本明細書において用いられる場合、用語「C4遺伝子」は、C4A又はC4B遺伝子形態のいずれかであり得るポリヌクレオチド配列を指す。
、これは1120位から1125位に存在する4つのアイソタイプ特異的なアミノ酸残基の原因と
なっている:C4AでのPCPVLD(配列番号:1)及びC4BでのLSPVIH(配列番号:2)。C4A及びC4Bタンパク質は化学反応性において異なる。C4Aは、アミノ基に選択的に結合し、免疫複合
体の様なタンパク質とアミド結合を形成する。C4Bは、C4Aと比較してある種の免疫学的検定においてより強い溶血活性を呈し、ヒドロキシル基に対してより高い親和性を有する。C4遺伝子はサイズにおいても異なり得、ロングフォーム(C4L)又はショートフォーム(C4S)を生じる。C4遺伝子のロング(21 kb)フォーム又はショート(14.6 kb)フォームは、イントロン9へのヒト内在性レトロウイルスHERV-K(C4)の6.4 kbの挿入の存在又は不存
在によって決定される。
ロックにおける一塩基多型アレルと、移植の必要があるレシピエントにおけるMHCガンマ
ブロックにおける1又は複数の一塩基多型アレルとマッチさせることによる、患者におけ
るaGVHDの発生の可能性及び/又は移植患者の生存期間を決定することに関する。従って
、本発明の方法は、様々な用途における使用が見いだされる。例えば、本発明の方法は、レシピエントの一塩基多型アレルと比較的少ない一塩基多型アレルでしかマッチしない移植ドナーと比較した場合に、ドナーからの移植片が、aGVHD、特に、重篤なaGVHDをレシピエントにおいてもたらし難い、移植レシピエントに対する候補ドナーを同定するために用いられ得る。
一塩基多型アレルのマッチングにより、レシピエントが重篤な急性移植片対宿主病を発症するリスクを低減することを見出した。従って、一態様において、方法は、潜在的な移植ドナー及びレシピエントの両方における一つの一塩基多型アレルの存在を決定する工程を含む。本発明者らはまた、潜在的な移植ドナー及びレシピエントを、MHCガンマブロック
におけるさらなる一塩基多型アレルに対してマッチングすることにより、ドナーが急性移植片対宿主病、及び、特に、重篤な急性移植片対宿主病を発症するリスクをさらに低減することも見出した。従って、一態様において、方法は、潜在的な移植ドナー及びレシピエント両方のMHCガンマブロックにおける2又はそれ以上、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30又はそれ以上の一塩基多型アレルの存在を決定する工程を含む。特定の一態様にお
いて、方法は、潜在的な移植ドナー及びレシピエントの両方における24又は25の一塩基多型アレルの存在を決定することを含む。
ック遺伝子のコード領域又は非コード領域における1又は複数のSNPアレルの存在を決定することを含む。
決定することを含む。当業者であれば、これらのSNPアレルの位置が、C4遺伝子の開始コ
ドンの第一塩基に対するものであることが理解されるであろう。
数のさらなるSNPを検出することを含む。
する最も適切な治療形態であるかに関する決定に影響を与え得る。時には、患者に対してより良い予後をもたらす利用可能な別の治療形態があり得る。また、aGVHDの可能性の予
測は、複数の治療計画、或いは、他に推奨されるものよりも場合によっては積極的な治療計画の必要性を示し得る。そのような積極的な治療法はしばしば望まない副作用を有し、それゆえ好ましくは予後がそれらの必要性を示さない限り使用されない。例えば、抗TNF
α中和モノクローナル抗体による患者の治療は、aGVHDの寛解をもたらすことができるが
感染症のリスクも増加させ得る。様々な積極的な抗炎症治療もまた利用可能である。
すべての生命体のゲノムは、その連続的な進化の過程において自然発生的な突然変異を受けており、祖先の遺伝的配列のバリアント形態が生み出されている。遺伝的配列の複数の形態の共存は、一塩基多型(或いは「SNP」としても知られる)を含む、遺伝的多型を
もたらす。明白な機能を有さないSNPがゲノム領域中に生じることもあり得るが、そのよ
うなSNPはゲノムにおけるバリアント配列に遺伝的に連鎖している可能性がある。従って
、そのようなSNPは、どの程度遺伝的連鎖が密かどうかに依存して、ゲノムのバリアント
配列に密接に関連がある可能性がある。
在する、DNAにおける単一塩基の位置である。例えば、異なる個体由来の2つの配列決定
されたDNA断片、AAGCCTAとAAGCTTAは単一のヌクレオチドにおいて一つの相違を含有して
いる。この場合において、2つのアレルが存在するという。最もありふれたSNPは2つのア
レルのみを有する。
、遺伝コードの退縮の結果、生産されるタンパク質のアミノ酸配列を必ずしも変化させない。
シング、転写因子結合、メッセンジャーRNA分解、又は非コードRNAの配列に影響を与え得る。このタイプのSNPによって影響を受ける遺伝子発現は、eSNP(expression SNP)と呼
ばれ、遺伝子の上流又は下流に存在し得る。
一塩基に対する言及により決定し得る。
試料中の一塩基多型の定性的及び/又は定量的な評価が可能となる当技術分野において公知のあらゆる適切な技術が使用され得る。加えて、比較は、標準的な対照又は対照試料に対する参照によって行い得る。
反応」(「PCR」)は、「フォワード」及び「リバース」プライマーからなる「プライマ
ーのペア」又は「プライマーのセット」、及び、DNAポリメラーゼ及び典型的には熱安定
性ポリメラーゼ酵素などのポリメライゼーションの触媒を用いて、複製コピーを標的ポリヌクレオチドから作製する反応である。PCRの方法は当技術分野において公知であり、例
えば、「PCR」(Ed. MJ. McPherson and S.G Moller (2000) BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford)において教示される。PCRは生物学的試料から単離されたmRNAを逆転写することにより得られるcDNAにおいて実施することができる。
分子、例えば、少なくとも50若しくは100又はそれ以上のヌクレオチド長の核酸分子もま
た、プライマーとして使用され得る。アンプリコン、又はPCR産物、又はPCR断片、又は増幅産物は、プライマー及び新たに合成された標的配列のコピーを含む伸長産物である。多重PCR系は、複数のアンプリコンの同時生産をもたらす複数のプライマーセットを含有す
る。プライマーはまた、アンプリコンの捕捉又は検出を促進するために、付加的な配列及び/又は修飾された、若しくは標識されたヌクレオチドを含有し得る。DNAの熱変性、相
補的配列へのプライマーのアニーリング、及び、アニールしたプライマーのポリメラーゼによる伸長の反復サイクルは、標的配列の指数関数的増幅をもたらす。標的、又は、標的配列、又はテンプレートという用語は増幅される核酸配列を指す。
法を記載している。
)において多型の検出が可能となることから、遺伝子型同定において有用な技術である。この方法は、遺伝子型同定の迅速かつ比較的簡便な方法として、特にHLA遺伝子型同定応
用及びABO遺伝子型同定のような他の複雑な遺伝子型同定応用の分野における多数の応用
によって普及してきた。
、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28
、29、30、若しくはそれ以上のプライマー又はフォワード/リバースプライマーのペアを含み得る。特にそのようなプライマーは、C4遺伝子における1又は複数の一塩基多型アレ
ル遺伝子座を増幅するためのものである。
出を含むものであり、検出は核酸分子の標識化やそのような標識から生じるシグナルの観察を含む、様々な方法において達成される。ハイブリダイゼーション技術は、以下からなるもののいずれかを含み得る:ノーザンブロッティング及びサザンブロッティング、サイクリングプローブ反応、分岐DNA法、インベーダーアッセイ、及びハイブリッドキャプチ
ャー法。ハイブリダイゼーション技術はまた、試料を調査するための既知の核酸配列から
なるマイクロアレイを使用することによって試料中に存在する核酸の特定配列を同定するためにも用いられ得る。アレイ技術は、既知の一本鎖核酸を用い得るものであり、それぞれ独特な短鎖が、既知の特定の場所に付着しており、その後試料の核酸を加え、試料中に存在する配列が固定化された鎖にハイブリダイズできるようにする。このハイブリダイゼーションの検出は、ハイブリダイゼーションの前に、検出される試料の断片を例えば末端標識などで標識することによって、その後に実行される。さらに、ハイブリダイゼーションは、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション技術の使用により決定し得る。
(arrayed primer extension)、ホモジニアスプライマーエクステンション(homogeneous primer extension)アッセイ、質量分析による検出を伴うプライマーエクステンション、ピロシーケンス、遺伝子アレイに基づき分類された多重プライマーエクステンション、ライゲーションローリングサークル(ligation with rolling circle)増幅、ホモジニアスライゲーション、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)、遺伝子アレイに
基づき分類された多重ライゲーション反応、制限断片長多型、一塩基伸長タグアッセイ、及びインベーダーアッセイ。そのような方法は、例えば、発光又は化学発光検出、蛍光検出、時間分解蛍光検出、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光偏光、質量分析、及び電気的検出などの検出機構との組合せにおいて使用され得る。
ッセイとしても知られる、TaqManアッセイを用いて実施される。TaqManアッセイは、PCR
間の特定の増幅産物の蓄積を検出する。TaqManアッセイは、蛍光レポーターダイとクエンチャーダイで標識されたオリゴヌクレオチドプローブを利用する。レポーターダイは、適切な波長での照射によって励起され、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)と呼ばれるプロセスを介して同一プローブ内のクエンチャーダイへエネルギーを転移させる。プローブへ結合しているとき、励起されたレポーターダイはシグナルを発しない。完全なプローブにおいてクエンチャーダイがレポーターダイへ近接するとレポーターの蛍光の減少が維持される。レポーターダイとクエンチャーダイは、5’最末端及び3’最末端にそれぞれ存在し得るし、逆もまた然りである。選択的に、レポーターダイを5’最末端又は3’最末端に存在させ、クエンチャーダイを内部のヌクレオチドに結合させ得るし、逆もまた然りである。
レポーターダイとクエンチャーダイが分離し、レポーターの蛍光の増加がもたらされる。PCR産物の蓄積は、レポーターダイの蛍光の増加をモニタリングすることによって直接的
に検出される。PCRの間に増幅される標的SNPを含有するテンプレートにプローブがハイブリダイズする場合にのみ、DNAポリメラーゼはレポーターダイとクエンチャーダイの間の
プローブを切断し、また、特定のSNPアレルが存在する場合にのみ標的SNP部位へハイブリダイズするように当該プローブは設計される。
る核酸配列情報を用いて容易に決定することができる。Primer Express (Applied Biosys
tems, Foster City, California)などの多くのコンピュータプログラムを最適化されたプライマー/プローブセットを迅速に得るために使用することができる。SNPアレルを検出するためのそのようなプライマー及びプローブは、本発明の方法において有用であり、キット形態へ容易に組み込むことができることが当業者には明らかであろう。
核酸のセグメントにハイブリダイズさせ、その3’最末端を当該核酸部位に整列させる。
第二のプローブは、標的核酸分子の、第一のプローブの3’にすぐ隣接するセグメントに
ハイブリダイズする。並置された2つのプローブは、標的核酸分子にハイブリダイズし、
第一のプローブの最も3’側のヌクレオチドと核酸部位との間に完全な相補性があれば、
リガーゼなどの連結剤の存在下でライゲートされる。ミスマッチがある場合、効率的なライゲーションは生じない。反応後に、ライゲートしたプローブを標的核酸分子から分離し、核酸配列の存在の指標として検出する。OLAはまた、ジップコード配列をハイブリダイ
ゼーションプローブの一つへ組込むことができ、結果として生じる産物すなわち増幅産物がユニバーサルジップコードアレイにハイブリダイズする、ユニバーサルアレイを用いた核酸検出を実施するためにも用い得る。選択的に、OLAは、ジップコードをOLAプローブに組込み、増幅PCR産物を電気泳動又はユニバーサルジップコードアレイ読み取り(readout)によって決定する場合に用いられ得る。
ウェアを使用し得、この場合、ジップコードをOLAプローブに組み込み、増幅PCR産物をzipchute試薬とハイブリダイズし、SNPの同一性をそのzipchuteの電気泳動の読み取り値か
ら決定する。いくつかの態様においては、OLAは、PCR(又は別の核酸増幅法)の前に実行される。他の態様において、PCR(又は別の核酸増幅法)がOLAの前に実行される。
ての、分子量の極めて正確な決定に好ましい。遺伝子型分析への多数のアプローチが質量分析に基づいて開発されている。質量分析に基づく好ましい核酸遺伝子型同定法には、プライマーエクステンションアッセイが含まれ、これは従来のゲルに基づく形式及びマイクロアレイといった他のアプローチと組み合わせて利用することもできる。
を、テンプレートを含有する反応混合物へ添加する。例えば、いくつかの態様において、これは、PCRなどによって典型的に増幅されたSNP含有核酸分子である。プライマー及びDNAポリメラーゼをさらに添加し得る。混合物中のddNTPの1つに相補的なヌクレオチドが出
現するテンプレート内の最初の位置で、プライマーの伸長は停止する。プライマーは、その核酸位置にすぐ隣接する(すなわち、プライマーの3’末端のヌクレオチドが、標的SNP部位の隣のヌクレオチドにハイブリダイズする)場合もあり、又は、その核酸位置から2
ヌクレオチド以上隔たっている場合もある。プライマーが、標的核酸位置から数ヌクレオチド隔たっている場合、唯一の制限は、プライマーの3’末端と核酸位置の間のテンプレ
ート配列が、検出すべきものと同じタイプのヌクレオチドを含有できないことであり、またそうでなければ、これは、伸長プライマーの早期停止を生じさせるであろう。
マーは、標的SNP位置に対応する1ヌクレオチドだけ常に伸長することとなる。この場合、プライマーを、SNP位置の1ヌクレオチド上流に結合する(すなわち、プライマーの3’末
端のヌクレオチドが、標的SNP部位の5’側の標的SNP部位にすぐ隣接するヌクレオチドに
ハイブリダイズする)ように設計する。1ヌクレオチドのみの伸長が望ましく、その理由
は、これにより伸長されたプライマーの全質量が最小となり、その結果として、代替SNP
ヌクレオチド間の質量差の分解能が増すからである。さらに、プライマーエクステンション反応において、未修飾ddNTPの代わりに質量タグ付きddNTPを用いることができる。これは、これらのddNTPで伸長されたプライマー間の質量差を増加させ、その結果、感度及び
精度上昇をもたらし、ヘテロ接合塩基位置のタイピングに特に有用である。質量タグ付け(Mass-tagging)もまた、集中的な試料調製手順の必要性を軽減し、質量分析計の必要分解能を減少させる。
的SNP位置に存在するヌクレオチドの同一性を決定することができる。1つの分析方法に
おいては、プライマーエクステンション反応からの産物を、マトリックスを構成する吸光結晶と併用する。その後、レーザーなどのエネルギー源をマトリクスにあてて、核酸分子をイオン化し、気相に脱離させる。その後、それらのイオン化した分子は飛行管に放出され、その管を下って検出器に向かって加速する。レーザーパルスなどのイオン化事象と検出器での分子の衝突との間の時間が、その分子の飛行時間である。飛行時間は、イオン化された分子の質量対電荷比(m/z)と正確な相関関係がある。小さいm/zを有するイオンのほうが、大きいm/zを有するイオンより速くその管を進み、それ故、より軽いイオンのほう
が、より重いイオンより前に検出器に到達する。その後、その飛行時間を、対応する、非常に正確なm/zへ変換する。このように、単一塩基位置に異なるヌクレオチドを有する核
酸分子に固有の、質量のわずかな差、及び対応する飛行時間の相違に基づいて、SNPを同
定することができる。
を含む、様々な自動配列決定手順を用いることができる。本明細書の教示に照らせば、当業者は、そのような自動配列決定手順のための配列決定用プライマーを容易に設計できる。市販の機器装備、例えば、Applied Biosystems 377、3100、3700、3730、及び3730x1 DNA Analyzers(Foster City, California)が、自動配列決定の分野において一般に用い
られている。SpectruMedixシステムなどのハイスループット変異スクリーニングシステムを利用することによって、核酸配列を決定することもできる。
装置稼働毎に1014キロベースペア(kbp)超のDNAの配列決定が可能である装置が含まれる。配列決定では、典型的に、非常に多数の独立した読み込み(read)が作成され、それぞれが核酸の10~1000塩基のどこかを示している。核酸は、確実性の観点から、一般的にはカバレッジと称される単位領域当たりの反復(すなわち、「10xカバレッジ」又は「100x
カバレッジ」)と共に、重畳的に配列決定される。次世代配列決定法は当技術分野において公知であり、例えば、Metzker (2010)において記載される。
定」との用語は、個々の核酸分子(例えば、単一の分子の配列決定における)、又は、ハイスループット様式における個々の核酸分子に対するクローン的に拡張された代用物(clonally expanded proxy)(例えば、103、104、105又はそれ以上を超える分子が同時に配列決定される)のいずれかのヌクレオチド配列を決定するあらゆる配列決定法を指す。
S) FLXシステム、Illumina/Solexaのゲノムアナライザ(GA)、Life/APGのサポートオリゴ
ヌクレオチドライゲーション検出 (SOLiD)システム、Polonatorの G.007 システム、Helicos BioSciencesの HeliScope 遺伝子配列決定システム及びPacific BiosciencesのPacBio RS システムが含まれるが、これらに限定されない。
とも称される)を含む。そのような標的強化技術は、配列決定の前に、DNA試料から候補
ゲノム領域を捕捉するために一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを利用する(例えば、Shen et al., 2013を参照されたい)。現在、コストを低減しつつ同時に高い精度及び網羅
性で候補ゲノム領域を捕捉するとの共通の目的を有するいくつかの標的強化戦略が存在する。最も広範に用いられている方法は、多重PCR増幅、ハイブリッドキャプチャー法、選
択的標的環状化法(selective target circularization)、及び、オリゴヌクレオチド選択的配列決定(oligonucleotide-selective sequencing)が利用されている。
当業者は、本発明の方法がHLAタイピングと併用して用いられ得ることを理解するであ
ろう。HLA-アレルに関して用いられる場合の「タイピング」との用語は、アレルの同定、すなわち、アレルの検出、及び、同一の遺伝子座の他のアレルから、そのアレルを区別することを指す。従って、本発明の方法は、C4以外の遺伝子における1又は複数のHLA SNP
の存在を決定すること、又は、潜在的な移植ドナー及び/又はレシピエントにおけるC4遺伝子以外の1又は複数の遺伝子のHLAハプロタイプを決定することをさらに含み得る。本明細書において用いられる場合、「ハプロタイプ」との用語は、通常一緒になって遺伝する遺伝的バリアント又はマーカー(「アレル」)のあらゆる組合せを指す。
幅は、使用する技術に依存して、遺伝子座特定的、アレルグループ特異的、又はアレル特異的とすることができる。アンプリコンは、特定のHLAアレルを定義する配列、又は、特
定のHLA抗原をコードする関連アレルのグループを定義する配列といった、特定の多型配
列を検出するためにさらに試験される。
現する。HLAクラスI分子に関して、DNAタイピング法は、HLA-A、B、及びCw重鎖の第1及
び第2ドメインをコードする、エキソン2及び3にフォーカスしている。クラスII分子に関
して、ペプチド結合部位は、それらの各遺伝子のエキソン2によりコードされるアルファ
及びベータ鎖の第1ドメインから構成される。
、DRB1遺伝子座のアレルは血清学的に定義されたDR抗原1-18をコードしており、一方、DRB3-5遺伝子座は、それぞれ、DR52、DR53及びDR51抗原をコードしているということである。すべての個体はDRB1遺伝子を保有するが、DRB3-5遺伝子の存在は、異なるDRB1遺伝子を保有する特定のハプロタイプによって変化する。それ故、個体はわずか1つのDR抗原だけを有する場合(もし彼らがDR1、8、又は10においてホモ接合性である場合)があり得、又、4つものDR抗原を有する場合(例えば、DR15、DR17、DR51、DR52)もあり得る。アルフ
ァ及びベータ鎖の両方に特異的なHLA抗体に関する報告に起因して、近年、HLA-DQ及びDP
抗原にさらなる注目が集中している。結果的に、HLA-DQ及びDPの完全なタイピングには、多型を有するアルファ鎖のエキソン2を考慮することも必須である。
本発明は、レシピエントのために移植ドナーを同定するためのキットを提供する。そのようなキットは、核酸種の検出に適切なものであり得、又は、選択的に、ポリペプチド遺伝子産物の検出のためのものであり得る。
含有するバイアル若しくはプラスチックチューブ又はマイクロタイタープレートのような第1の容器を含有し得る。キットは、プライマーを保持する第2の容器を任意に含有し得
る。プローブは、一塩基多型遺伝子座を含むDNAにハイブリダイズ可能であり得、又は、
複数の一塩基多型遺伝子座にハイブリダイズすることができる複数のプローブを含有し得る。固体支持物上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブを含有するキットは、例えばアレイを使用して作製することもでき得る。
補的である核酸プライマーがキットに含まれ得る。プライマーのセットは、典型的には、DNAの特異的増幅が可能である少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含む。定量的PCR決
定を可能とする蛍光標識されたオリゴヌクレオチドが含まれ得る(例えば、TaqManケミストリー、分子ビーコンなど)。DNA増幅のための適切な酵素もまた含まれ得る。
配列特異的プライマー(SSP)が、補体C4遺伝子における8.1祖先ハプロタイプ(AH)特異的SNPペアを検出するために用いられた(図2)。試料1は、8.1 AHのアルファ、ベータ及びデルタブロックマーカーを有し、ガンマブロックSNPマーカーに対して試験陽性であ
る。試料2、3、及び4は、8.1 AHのあらゆるマーカーを有さず、ガンマブロックSNPマーカーに対するSSP試験に対して陰性である。
固有に表れるものもある(祖先ハプロタイプ)。このデータは、SNPプロファイルは試料
のMHC祖先ハプロタイプのガンマブロックに対するマーカーであり、試料のアロタイプの
マーカーではないことを示唆している。ガンマタイプアッセイ#8及び#15は、C4A及びC4B
に対する対照SSPアッセイであり、記載していない。
本発明者らは、重篤な急性移植片対宿主病のリスクを低減するための、患者及びドナーのマッチングのためのPCRアッセイキットを開発した。PCRキットは、PCRバッファー、dNTP、MgCl2、及び配列特異的プライマー、並びに単一バイアルのDNAポリメラーゼを含有す
る26の混合物を含む。C4遺伝子一塩基多型を増幅するための混合物のそれぞれは、880μlの単一のバイアルにおいて提供される。アッセイにおいて増幅される一塩基多型は;A13189、T14952、G12749、A13950-A14483、G12071、A11483、T9763、A12152、A14831、T14757、C16954、T9881、C9796、A12568-A12837、T19588、T10289、A11437、T14563、A20170、T17316、C10676、G15108、T10309、及び/又はC13193の1又は複数である。アッセイキット
は、C4A及びC4B遺伝子内部断片を増幅するための対照混合物をさらに含む。
1. すべてのPCRアッセイ混合物を試験する各試料に対して準備する。
2. アッセイ混合物を室温で急速に解凍する。解凍したら、混合物を手短にボルテック
スする。
3. 7.85μlの各混合物を反応ウェルへ加える。試験する各試料に対する非増幅対照に対しても7.85μl加える。
4. DNA(64μl)及びDNAポリメラーゼ(4.8μl)の混合物を、アッセイにおいてタイピングする各試料に対して調製する。
5. 2.15μlのDNA/ポリメラーゼ混合物を各反応ウェルへ分注する。
6. 反応ウェルをシールし、ボルテックス及び手短な遠心分離により穏やかに混合する
。
7. 反応ウェルをサーマルサイクラー中に配置し、以下の増幅条件に供する:
8. PCRの完了時に、増幅プレートをサーマルサイクラーから取り出し、すぐにゲル電気
泳動へ進めるか、又は必要となるまで4℃で保存する。
1. 内部標準及び標的アンプリコンの増幅を、5μlのローディングバッファー(別量を
使用可能である)を混合した2μlの各PCR産物を用いて、アガロースゲル電気泳動により
確認する。1%アガロースゲルの使用が推奨される。
2. 試験する各試料に対しての非増幅対照においては、PCR産物が生じてはならない。もしバンドが明確に存在する場合、ある程度でのコンタミネーションが生じた可能性があり、試行をやり直さなければならない。
3. すべての陰性反応では、内部標準アンプリコンが増幅されるはずである。
4. すべての陽性配列特異的PCR(SSP)では、標的アンプリコンの増幅がもたらされる
。アンプリコンの予想サイズを表1に記載する。
PCR-SSPアッセイを用いて、患者及びドナーをSNPのパネルに対してタイピングした。パネルの26のSNPの少なくとも1つのSNPについて、ドナー又は患者が陽性であって、相手の
ドナー/患者は陽性ではない場合に、患者/ドナーのペアがミスマッチであると定義した(図4及び図5)。図4は、ガンマタイプミスマッチが重篤なaGVHDのリスクの増加をもたらすことを示す。ガンマタイプに対してマッチ(M)する患者(X)及びミスマッチする患者(MM)、並びに、患者が急性GVHDと診断されたかどうか及び急性GVHDのグレード。
図5は、ガンマタイプマッチングが長期間生存率の改善をもたらすことを示す。
本発明者らは、重篤な急性GVHDのリスクを低減するための、患者及びドナーのマッチングのためのさらなるPCRアッセイキットを開発した。PCRキットは、PCRバッファー、dNTP
、MgCl2、並びに配列特異的プライマー、非増幅対照混合物、及び単一のバイアルのDNAポリメラーゼを含有する、25の混合物を含む。C4遺伝子一塩基多型を増幅するための各混合物は、32ウェルプレートの個別のウェル中において提供される。アッセイにおいて増幅される一塩基多型は、A13189、T14952、G12749、G12071、A11483、T9763、A12152、A14831
、T14757、C16954、T9881、C9796、A12568-A12837、T19588、T10289、A11437、T14563、A20170、T17316、C10676、G15108、T10309及び/又はC13193の1又は複数である。アッセイキットは、C4A及びC4B遺伝子内部断片を増幅するための対照混合物をさらに含む。
1. PCR準備
1.1 各32ウェル反応プレートは、単一の試料に対して充分なガンマタイプ混合物を含
有する。ガンマタイプ混合物/反応プレートを室温で素早く解凍する。解凍したら、手短にボルテックスし、32ウェルプレートをスピンして、全ての混合物を確実にウェル底へ移動させる。
1.2 以下の表2に従い、タイピングする各試料に対して、ゲノムDNA及びDNAポリメラーゼ((DNA POL - GAMMA-TYPE)の混合物を調製する。これは、全ての新規PCRに対して新鮮に調製するべきである。混合のために溶液を3~4回パルスボルテックスする。
1.4 反応ウェルをサーマルサイクラーに配置し、以下のサーマルサイクル条件に従っ
て増幅する。
1.5 増幅は完了までにおよそ2.5時間必要である。PCRが完了したら、プレートをサー
マルサイクラーから取り出し、産物をすぐにゲル電気泳動により分析するか、必要となるまで4℃で保存する。
2.1 内部標準及び標的アンプリコンの増幅を、5μlのローディングバッファー(別量
のローディングバッファーは使用前に検証すべきである)を混合した2μlの各PCR産物を
用いて、アガロースゲル電気泳動により確認する。2%アガロースゲルの使用が推奨される。
2.2 試験する各試料に対しての陰性対照のウェル(mix 26)においては、PCR産物が生じてはならない。もしバンドが明確に存在する場合、ある程度でのコンタミネーションが生じた可能性があり、試行をやり直さなければならない。
2.3 すべての陰性ガンマタイプ反応では、内部標準アンプリコンが増幅されるはずで
ある。もし、標的も内部標準アンプリコンも明らかでない場合、その反応は解釈することができず、関連するガンマタイプワークシートに不成功(0)と記録すべきである。
2.4 標的アンプリコンが増幅される場合、陽性ガンマタイプ反応が観察されており、
記録される。反応をスコア化する場合は、各標的アンプリコンの予想サイズを表1に対し
て確認する。陽性反応は、内部標準が極めて薄いか又は存在しない状況で、濃い標的アンプリコンを有し得る。これは許容される陽性反応である。反応をスコア化する場合は、陰性反応に対しては数字「1」を、陽性反応については「2」を用いて結果を記録する。(ポイント2.3で記載したような)あらゆる不成功反応は、「0」として記録されるべきである。
2.5 ガンマブロックマッチングの予測を補助するために、患者のガンマタイププロフ
ァイルとドナーのガンマタイププロファイルとを比較し得る。これを行うために、氏名、試料ID、及びDNA濃度を含む関連試料情報を、試験される各患者及び潜在的なドナーに関
して、ワークシートに記録すべきである。ガンマタイプゲルイメージのコピーをワークシートにインポートし得る。その後、ゲルイメージは、標的バンドが「2」として存在する
陽性反応、及び、内部標準バンドのみが「1」として存在する陰性反応をスコア化するこ
とによって解釈することができる。不成功、すなわち「非増幅」反応では、標的及び内部標準が共に存在せず、「0」とスコア化する。これらの結果は、患者及びドナーに関して
ワークシートに入力すべきである。
2.6 すべての結果を入力してスコア化した後、結果を比較して、タイピングされた/
入力されたドナーのいずれかが患者にマッチしたガンマタイプであるかについて確認する。もしコンタミネーションが検出され、又はあらゆる反応が不成功である場合は、試験をやり直す必要があり得る。
るガンマタイプPCR SSP解析を示す。
3か所のブラジルのセンターにおいて、1996年から2005年までに実施された移植に由来
する225の非血縁の造血幹細胞移植(HSCT)ドナー‐レシピエントペアにおいて遡及的研
究を実施した。移植ペアにおける各個人は、Luminexテクノロジーを使用して、HLA(A、B、C、DRB1、DQB1)をタイピングした。PCR-SSP解析による23のSNPに加えて、C4A及びC4B
アイソタイプ特異的なSNPを用いてガンマタイプアッセイを実施した。移植/レシピエン
トペアにおいて、ガンマタイプSNPプロファイルにおける完全なマッチがあった場合に、
ガンマタイプマッチを記録した。SNPプロファイルに少なくとも1つのSNPの相違があった場合に、ガンマタイプミスマッチを記録した。
ペアにおけるガンマタイプマッチングでは、有意に生存率が改善することが示され、これは疾患の再発とGvHDとのバランスが図られた結果であり得る。この点において、本発明者らは、ガンマタイプがマッチし、HLAが9/10マッチする患者の生存率が、ガンマタイプが
マッチし、かつHLAが10/10マッチする患者の生存率を上回ることを見出した。
響を与えることを見出した。これは、ガンマタイプマッチング及び高分解能HLAタイピン
グにより、造血幹細胞移植の予後に対して決定的である非HLA遺伝子座のマッチングがも
たらされることを示唆している。従って、本発明のガンマタイプアッセイは、非血縁HSCTに伴う予後改善のための、最適なドナー決定に使用することができる。
Fernando et al. (2010) Hum Mutat, 31(7):866-874
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Claims (18)
- MHCガンマブロックにおける一塩基多型アレルに対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含む、移植レシピエントが移植片対宿主病を発症する可能性を決定するための組成物であって、
ここで、一塩基多型アレルがC4遺伝子において存在し、及び
ここで、特異的な一塩基多型アレルがT9763、C9796、T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568-A12837、G12749、A13189、C13193、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、C16954、T17316、T19588、及びA20170である、前記組成物。 - 移植レシピエントが移植片対宿主病を発症する可能性を決定するための組成物であって、前記移植レシピエントが移植片対宿主病を発症する可能性を決定することが:
a)移植の必要があるレシピエントのMHCガンマブロックにおける一塩基多型アレルの存在を、MHCガンマブロックにおける一塩基多型アレルをオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることにより決定する工程;
b)1又は複数の潜在的な移植ドナーのMHCガンマブロックにおいて一塩基多型アレルの存在を、MHCガンマブロックにおける一塩基多型アレルをオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることにより決定する工程;を含み、
ここで、該移植レシピエント及び該潜在的な移植ドナーの両方のMHCガンマブロックにおける一塩基多型アレルの存在が、該移植ドナーからの移植片の移植に伴い、該移植レシピエントが移植片対宿主病を発症する可能性の低減を示し、
ここで、一塩基多型アレルがC4遺伝子において存在し、及び
ここで、特異的な一塩基多型アレルがT9763、C9796、T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568-A12837、G12749、A13189、C13193、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、C16954、T17316、T19588、及びA20170である、前記組成物。 - 移植の必要があるレシピエント及び/又は潜在的なドナーのMHCガンマブロックにおける一塩基多型アレルの存在を決定する工程が、既定のMHCガンマブロック一塩基多型アレル情報及び/又はMHCガンマブロックハプロタイプ情報を獲得する工程を含む、請求項1又は2記載の組成物。
- 潜在的な移植ドナーのレシピエントのMHCガンマブロックにおける一塩基多型アレルの存在を決定する工程が、一塩基多型アレルの存在を決定するために、レシピエントからの、及び/又は潜在的ドナーからの核酸試料を分析する工程を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の組成物。
- 核酸試料を分析する工程が、PCR-SSPアッセイ、アレル特異的プローブハイブリダイゼーション、アレル特異的プライマーエクステンション法、アレル特異的増幅、核酸配列決定、5’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコンアッセイ、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、サイズ分析、一本鎖高次構造多型分析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、及び、直接ヌクレオチド配列決定の1又は複数から選択される技術を実施する工程を含む、請求項4記載の組成物。
- 潜在的な移植ドナー及び/又はレシピエントからの生物学的試料を獲得する工程、及び、該生物学的試料から核酸を単離する工程を含む、請求項4又は5記載の組成物。
- 核酸試料が、潜在的な移植ドナー及び/又はレシピエントから獲得された生物学的試料から単離される、請求項4又は請求項5記載の組成物。
- オリゴヌクレオチドプローブがHLAアレル間の物理的結合を検出するために構成される、請求項1~7のいずれか一項記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが配列番号3、配列番号4、及び配列番号9を含む、請求項1~8のいずれか一項記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが配列番号10をさらに含む、請求項9記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが配列番号5~8及び10~50のうちの1又は複数をさらに含む、請求項10記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが検出可能に標識されている、請求項1~11のいずれか一項記載の組成物。
- 以下を含む、移植レシピエントが移植片対宿主病を発症する可能性を決定するためのキット:
a) MHCガンマブロックにおける一塩基多型アレルを検出するための核酸試薬;及び
b) 該一塩基多型アレルを検出するための説明書
であって、
ここで、一塩基多型アレルがC4遺伝子において存在し、及び
ここで、特異的な一塩基多型アレルがT9763、C9796、T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568-A12837、G12749、A13189、C13193、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、C16954、T17316、T19588、及びA20170である、前記キット。 - MHCガンマブロックにおける一塩基多型アレルに対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項13記載のキット。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが検出可能に標識されている、請求項14記載のキット。
- MHCガンマブロックにおける一塩基多型アレルを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項13~15のいずれか1項記載のキット。
- PCR-SSPアッセイを実施するために適切なものである、請求項13~16のいずれか1項記載のキット。
- MHCガンマブロックにおける一塩基多型アレルに対して特異的なプローブを含む、移植レシピエントが移植片対宿主病を発症する可能性を決定するためのヌクレオチドアレイであって、
ここで、一塩基多型アレルがC4遺伝子において存在し、及び
ここで、特異的な一塩基多型アレルがT9763、C9796、T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568-A12837、G12749、A13189、C13193、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、C16954、T17316、T19588、及びA20170である、前記ヌクレオチドアレイ。
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