JP7295163B2 - 除草剤耐性遺伝子及びその使用方法 - Google Patents
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- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/11—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with 2-oxoglutarate as one donor, and incorporation of one atom each of oxygen into both donors (1.14.11)
- C12Y114/11033—DNA oxidative demethylase (1.14.11.33)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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Description
本願は、2014年10月15日に出願された米国仮出願第62/064,343号の
利益を主張し、その全体を参照として本明細書に援用する。
2015年9月25日に作成した118,364バイト(MS‐WINDOWS(登録
商標)で測定)の「MONS378WO_ST25」という名称のファイルに含めた配列
表を、電子提出によって本明細書とともに提出し、及びこれを参照として本明細書に援用
する。
本発明は、一般に、バイオテクノロジーの分野に関する。より詳細には、本発明は、除
草剤を分解する酵素をコードする組換えDNA分子に関する。本発明はまた、組換えDN
A分子を保有するトランスジェニック植物、部分、種子、細胞、及び植物部分、ならびに
それらを使用する方法にも関する。
農作物の生産は、しばしば、バイオテクノロジーの方法を用いて作製したトランスジェ
ニック形質を利用する。トランスジーンとしても知られる異種遺伝子を植物に導入して遺
伝子組換え形質を作成する。植物内のトランスジーンの発現は、除草剤耐性のような望ま
しい形質を植物に付与する。トランスジェニック除草剤耐性形質の例としては、グリホサ
ート耐性、グルホシネート耐性、及びジカンバ耐性が挙げられる。最も汎用される除草剤
に耐性を示す雑草種の増加に伴い、この分野において新規除草剤耐性形質が必要とされて
いる。特に重要な除草剤は、アリールオキシフェノキシプロピオン酸(AOPP)除草剤
、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤である。AOPP除草剤、フェノ
キシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤は、グリホサート耐性雑草に対する殺草ス
ペクトルを提供し、したがって、他の除草剤耐性形質(複数可)と組み合わせた栽培体系
において特に有用な耐性を付与する形質を作り出す。
gobium herbicidovorans菌株は、様々なフィエノキシアルカン酸
(phyenoxyalkanoic acid)除草剤のエーテル結合を切断すること
ができ、これを生長のための唯一の炭素及びエネルギー源として利用していることが同定
された(HPE Kohler,Journal of Industrial Mic
robiology&Biotechnology(1999)23:336‐340)
。除草剤の異化は、2種の異なるエナンチオ選択的αケトグルタル酸依存性ジオキシゲナ
ーゼRdpA(R‐ジクロロプロップ・ジオキシゲナーゼ)及びSdpA(S‐ジクロロ
プロップ・ジオキシゲナーゼ)によって行われる。(A Westendorf,et
al.,Microbiological Research(2002)157:31
7‐322;Westendorf,et al.,Acta Biotechnolo
gica(2003)23(1):3‐17)。RdpAは、Sphingobium
herbicidovorans(GenBank受託番号AF516752(DNA)
及びAAM90965(タンパク質))及びDelftia acidovorans(
GenBank受託番号NG_036924(DNA)及びYP_009083283(
タンパク質))から単離されている(TA Mueller,et al.,Appli
ed and Environmental Microbiology(2004)7
0(10):6066‐6075)。RdpA及びSdpA遺伝子は、作物への除草剤耐
性を付与するための植物形質転換に用いられている(TR Wright,et al.
,Proceedings of the National Academy of
Sciences USA,(2010)107(47):20240‐5)。タンパク
質工学技術を用いてRdpA酵素の活性を改善し、トランスジェニック植物で使用するた
めのタンパク質を産生することにより、除草剤の大量散布が可能になり、したがってトラ
ンスジェニック作物の安全性及び雑草防除方法を改善することができる。
34、37、40、43、及び46~52からなる群から選択されるアミノ酸配列に対し
て少なくとも約92%の配列同一性を有するポリペプチドを提供する。一実施形態では、
ポリペプチドは、AOPP除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤
からなる群から選択される少なくとも一つの除草剤に対してオキシゲナーゼ活性を有する
。
34、37、40、43、及び46~52からなる群から選択されるアミノ酸配列と少な
くとも約92%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換えD
NA分子を提供する。一実施形態では、組換えDNA分子は、配列番号:2、3、5、6
、8、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、2
6、27、29、30、32、33、35、36、38、39、41、42、44、45
、及び53~59からなる群から選択される核酸配列を含む。別の実施形態では、組換え
DNA分子は、AOPP除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤か
らなる群から選択される少なくとも一種の除草剤に対するオキシゲナーゼ活性を有するポ
リペプチドをコードする。別の実施形態において、組換えDNA分子は、植物細胞内で機
能する異種プロモーターに作動可能に連結する。別の実施形態では、組換えDNA分子は
、作動可能に連結したポリペプチドを細胞内に局在化させる働きを有する葉緑体輸送ペプ
チドをコードするDNA分子に作動可能に連結する。
34、37、40、43、及び46~52からなる群から選択されるアミノ酸配列に少な
くとも約92%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換えD
NA分子と、それに作動可能に連結した植物細胞内で機能する異種プロモーターとを含む
DNA構築物を提供する。一実施形態では、組換えDNA分子は、作動可能に連結したポ
リペプチドを細胞内に局在化させるように機能する葉緑体輸送ペプチドをコードするDN
A分子に作動可能に連結する。別の実施形態では、組換えDNA分子は、配列番号:1、
4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43、及
び46~52からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、
トランスジェニック植物内におけるこのポリペプチドの発現は、除草剤耐性を植物に付与
する。別の実施形態において、DNA構築物は、トランスジェニック植物のゲノムに存在
する。
34、37、40、43、及び46~52からなる群から選択されるアミノ酸配列に対し
て少なくとも約92%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組
換えDNA分子を保有するトランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分を提供
する。一実施形態では、トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分は、AO
PP除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤からなる群から選択さ
れる少なくとも一種の除草剤に対する耐性のためのトランスジェニック形質を含む。別の
実施形態では、トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分は、本発明のDN
A構築物を保有する。別の実施形態において、トランスジェニック植物、種子、細胞、ま
たは植物部分は、本発明のポリペプチドを保有する。
とを含む、植物、種子、細胞、または植物部分への除草剤耐性の付与方法を提供する。一
実施形態において、除草剤耐性付与方法は、本発明の組換えDNA分子を含むトランスジ
ェニック形質を含むトランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分と共に使用す
る。一実施形態において、除草剤耐性付与方法は、AOPP除草剤、フェノキシ酸除草剤
、及びピリジニルオキシ酸除草剤からなる群から選択される除草剤と共に使用する。
てAOPP除草剤、フェノキシ酸除草剤、ピリジニルオキシ酸除草剤からなる群から選択
される少なくとも一種の除草剤への耐性を備えた植物を再生することを含む植物形質転換
の方法を提供する。一実施形態では、植物形質転換の方法は、再生植物をそれ自体または
第二の植物と交配させ、交配から種子を回収することを含む。
PP除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤からなる群から選択さ
れる少なくとも一種の除草剤を接触させることによって、植物栽培区域の雑草を防除する
方法を提供し、そこにおいては、トランスジェニック植物または種子は、除草剤に対して
耐性を有する。
配列番号:1~3は、MON‐HT51のアミノ酸配列、細菌コドンポリヌクレオチド配
列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
配列である。
ド配列である。
ド配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
配列、単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列、及び双子葉植物コドン最適化ポリ
ヌクレオチド配列である。
配列、単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列、及び双子葉植物コドン最適化ポリ
ヌクレオチド配列である。
配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
ド配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
ON‐HT15、MON‐HT16、MON‐HT17、及びMON‐HT18のアミノ
酸配列である。
ON‐HT15、MON‐HT16、MON‐HT17、及びMON‐HT18の双子葉
植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
生型RdpAのアミノ酸配列である。
本発明をより良く定義し、当業者に本発明の実施における指針を与えるために、以下の
定義及び方法を提供する。特記しない限り、用語は、当業者による従来の使用に従って理
解すべきである。
ク質、及びそれらをコードする組換えDNA分子、ならびにこれらを使用する組成物及び
方法を提供することによって、先行技術の限界を克服する。MON‐HTタンパク質は、
アリールオキシフェノキシプロピオン酸(AOPP)除草剤、フェノキシ酸除草剤、及び
ピリジニルオキシ酸除草剤を不活性化することができるオキシゲナーゼである。本明細書
中で使用する場合、除草剤を不活性化するとは、除草剤が、植物に対してもはや除草活性
を有さないようにすることを意味する。MON‐HTタンパク質は、新規基質選択性、有
用な酵素反応速度、及び高温における酵素安定性の増加を示す。MON‐HTタンパク質
を発現するトランスジェニック植物は、AOPP、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニル
オキシ酸除草剤の散布に対し、向上した耐性を示す。
本発明は、新規遺伝子改変タンパク質及びそれらをコードする組換えDNA分子を提供
する。本明細書中で使用する場合、用語「改変」とは、天然には通常見出されず、人間が
介入して創造した非天然のDNA、タンパク質、または生物を指す。「改変タンパク質」
とは、そのポリペプチド配列を、部位特異的突然変異誘発を用いたタンパク質デザイン及
びランダム突然変異誘発及びDNAシャッフリングを用いた定向進化のような1つ以上の
タンパク質工学技術を用いて、実験室において考案及び作成したタンパク質のことである
。例えば、改変タンパク質は、野生型タンパク質のコード配列に対して1つ以上の欠失、
挿入、または置換を有する場合があり、各欠失、挿入または置換は、1つ以上のアミノ酸
からなっていてもよい。改変タンパク質の例を、本明細書において、配列番号:1、4、
7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43、及び4
6~52として提供する。
本明細書中で使用する場合、用語「オキシゲナーゼ活性」とは、酸素分子から酸素を、基
質、副生物または中間体に移動させることによって基質を酸化する能力を意味する。本発
明によって提供する改変タンパク質のオキシゲナーゼ活性は、AOPP除草剤、フェノキ
シ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤の1つ以上を不活性化することができる。
書中で使用する場合、「野生型DNA分子」、「野生型ポリペプチド」、または「野生型
タンパク質」とは、天然に存在するDNA分子、ポリペプチド、またはタンパク質、すな
わち、すでに天然に存在するDNA分子、ポリペプチド、またはタンパク質のことである
。ポリペプチド、タンパク質、またはDNA分子の野生型バージョンは、改変タンパク質
または遺伝子との比較において有用である場合がある。本発明によって提供する改変タン
パク質との比較において有用な野生型タンパク質の例として、Sphingobium
herbicidovorans MH株由来のRdpA酵素が挙げられる。本発明によ
って提供する組換えDNA分子との比較において有用な野生型DNA分子の例として、S
phingobium herbicidovorans MH株由来のRdpA遺伝子
が挙げられる。野生型タンパク質またはDNA分子は、実験の対照として有用である場合
がある。
する。例えば、トランスジェニック植物分析における対照植物は、実験植物(すなわち、
試験対象の植物)と同じ型の植物であるが、実験植物の遺伝子組換え用挿入断片、組換え
DNA分子、またはDNA構築物を保有していない。トランスジェニック・トウモロコシ
植物との比較に有用な対照植物の例として、非トランスジェニックLH244トウモロコ
シ(米国特許第6,252,148号)が挙げられ、トランスジェニック・ダイズ植物と
の比較では、非トランスジェニックA3555ダイズ(米国特許第7,700,846号
)が挙げられる。
然界には見出されず、人間が介入して創造する非天然DNA、ポリペプチド、またはタン
パク質を指す。「組換えDNA分子」は、天然には生じないDNA配列を含むDNA分子
であり、人間の介入による産物であるDNA分子、例えば改変タンパク質をコードするD
NA分子である。別の例は、タンパク質コードDNA分子及び作動可能に連結した異種プ
ロモーターのような、互いに異種である少なくとも2つのDNA分子の組み合わせからな
るDNA分子である。組換えDNA分子の一例は、配列番号:2、3、5、6、8、10
、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、26、27、
29、30、32、33、35、36、38、39、41、42、44、45及び53~
59から選択される少なくとも一つの配列を含むDNA分子である。「組換えポリペプチ
ド」または「組換えタンパク質」は、天然に存在しないアミノ酸配列を含むポリペプチド
またはタンパク質であり、人間の介入による産物、例えば改変タンパク質などである。
て生物のゲノムに人工的に組み込まれたDNA分子を指す。本明細書中で使用する場合、
用語「トランスジェニック」は、トランスジーンを含むことを意味し、例えば「トランス
ジェニック植物」とは、ゲノムにトランスジーンを保有する植物を指し、「トランスジェ
ニック形質」とは、植物ゲノムに組み込まれたトランスジーンの存在により、導入または
供与された特徴または形質を指す。このようなゲノム改変の結果として、トランスジェニ
ック植物は、関連する野生型植物とは明らかに異なっており、また、トランスジェニック
形質は、野生型植物に天然には見出されない形質である。本発明のトランスジェニック植
物は、本発明によって提供する組換えDNA分子及び改変タンパク質を保有する。
質的に通常は関連しない2つ以上のものの間の関係を指す。例えば、タンパク質をコード
する組換えDNA分子は、作動可能に連結するプロモーターに対して、そのような組み合
わせが通常天然には見出されない場合、異種である。さらに、特定の組換えDNA分子は
、それがその特定の細胞または生物において天然に生じない場合には、それが挿入される
細胞または生物に対して異種であり得る。
ドコードDNA分子」とは、タンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列を含むDNA分子を指す。「タンパク質コード配列」または「ポリペプチドコード配列
」とは、タンパク質またはポリペプチドをコードするDNA配列を意味する。「配列」と
は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の連続配列を意味する。タンパク質コード配列またはポ
リペプチドコード配列の境界は、通常、5′末端の翻訳開始コドン及び3′末端の翻訳終
止コドンによって決定される。タンパク質コード分子またはポリペプチドコード分子は、
タンパク質またはポリペプチド配列をコードするDNA配列を含み得る。本明細書中で使
用する場合、「トランスジーン発現(transgene expression)」、
「トランスジーンの発現(expressing a transgene)」、「タン
パク質発現(protein expression)」、「ポリペプチド発現(pol
ypeptide expression)」、「タンパク質の発現(expressi
ng a protein)」及び「ポリペプチドの発現(expressing a
polypeptide)」とは、DNA分子をメッセンジャーRNA(mRNA)に転
写し、そのmRNAをポリペプチド鎖に翻訳し、それを最終的にタンパク質へと折り畳む
プロセスを介したタンパク質またはポリペプチドの産生を意味する。タンパク質コードD
NA分子またはポリペプチドコードDNA分子は、組換えDNA分子で形質転換した細胞
中でのタンパク質またはポリペプチドの発現に使用するために、DNA構築物中の異種プ
ロモーターに作動可能に連結させてもよい。本明細書中で使用する場合、「作動可能に連
結」とは、一方が他方の機能に影響を及ぼすように、2つのDNA分子が連結しているこ
とを意味する。作動可能に連結したDNA分子は、単一の隣接分子の一部であってもよく
、隣接していてもいなくてもよい。例えば、DNA構築物中のタンパク質コードDNA分
子またはポリペプチドコードDNA分子にプロモーターを作動可能に連結し、そこにおい
て、プロモーターがトランスジーンの発現に影響を与え得るように2つのDNA分子を位
置決めする。
組換えDNA分子である。DNA構築物は、トランスジーンの発現に有用であり、ベクタ
ー及びプラスミドに組み込んでもよい。DNA構築物は、トランスジェニック植物及び細
胞を産生するために、形質転換の目的で、すなわち、異種DNAを宿主細胞に導入するた
めにベクターにおいて使用してもよく、同様に、トランスジェニック植物、種子、細胞、
または植物部分のプラスチドDNAまたはゲノムDNAに組み込んでもよい。本明細書中
で使用する場合、「ベクター」とは、植物形質転換の目的で使用してもよい任意の組換え
DNA分子を意味する。配列表に示すような組換えDNA分子は、例えば、植物中で機能
するプロモーターに作動可能に連結した組換えDNA分子を有する構築物の一部としてベ
クターに挿入され、組換えDNA分子がコードする改変タンパク質の発現を駆動する。D
NA構築物及びベクターを構築するための方法は、当技術分野において周知である。DN
A構築物、またはDNA構築物を含むベクターの構成要素は、一般に、以下の1つ以上の
ものを含むが、必ずしもこれらに限定するものではない:作動可能に連結したDNAの発
現用の適切なプロモーター、作動可能に連結したタンパク質コードDNA分子、及び3′
非翻訳領域(3′‐UTR)。本発明の実施に有用なプロモーターとしては、作動可能に
連結したポリヌクレオチドを発現するために植物において機能するプロモーターが挙げら
れる。そのようなプロモーターには様々なものがあり、当技術分野において周知であり、
誘導性、ウイルス性、合成性、構成的、時間的調節性、空間的調節性、及び/または時間
空間的調節性のものを含む。追加の任意の成分としては、以下の1つ以上の要素が挙げら
れるが、必ずしもこれらに限定するものではない:5′‐UTR、エンハンサー、リーダ
ー、シス作用エレメント、イントロン、葉緑体輸送ペプチド(CTP)、及び1つ以上の
選択マーカーのトランスジーン。
に連結したCTP分子を組み込んでもよい。本発明を実施するのに有用なCTPとしては
、改変タンパク質分子の細胞内局在化を促進するように機能するものが挙げられる。前記
CTPは、細胞内でのタンパク質局在化の促進により、改変タンパク質の蓄積を増加させ
、タンパク質分解からタンパク質を保護し、除草剤耐性のレベルを高め、それにより除草
剤散布後の薬害度を低減し得る。本発明で使用するためのCTP分子は当該分野で公知で
あり、Arabidopsis thaliana EPSPS CTP(Klee e
t al.,1987)、Petunia hybrida EPSPS CTP(de
lla‐Cioppa et al.,1986)、トウモロコシcab‐m7シグナル
配列(Becker et al.,1992;PCT WO 97/41228)及び
エンドウ・グルタチオン還元酵素のシグナル配列(Creissen et al.,1
991;PCT WO 97/41228)が挙げられるが、必ずしもこれらに限定する
ものではない。
えベースのクローニング部位など)、植物に好適な配列(植物コドン利用またはコザック
コンセンサス配列など)、またはDNA構築物の設計に有用な配列(スペーサーまたはリ
ンカー配列など)を提供することが望ましい場合に、当技術分野で公知の方法によって、
完全または部分的に合成及び修飾してもよい。本発明は、本明細書において提供する任意
の組換えDNA分子または改変タンパク質、例えば、配列番号:2、3、5、6、8、1
0、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、26、27
、29、30、32、33、35、36、38、39、41、42、44、45、及び5
3~59からなる群から選択される配列を含む組換えDNA分子に対し、少なくとも約8
0%(%)の配列同一性、約85%の配列同一性、約90%の配列同一性、約91%の配
列同一性、約92%の配列同一性、約93%の配列同一性、約94%の配列同一性、約9
5%の配列同一性、約96%の配列同一性、約97%の配列同一性、約98%の配列同一
性、及び約99%の配列同一性を有する組換えDNA分子及び改変タンパク質を含む。本
明細書中で使用する場合、用語「パーセント配列同一性」または「%配列同一性」とは、
2つの配列を最適に整列させた(参照配列が適切なヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入、
欠失またはギャップを、比較のウインドウにわたって合計20%未満で有する)場合に、
試験(「対象」)配列(またはその相補鎖)と比較した参照(「クエリー」)配列(また
はその相補鎖)の直鎖ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列における同一のヌクレオ
チドまたはアミノ酸の百分率のことを指す。比較ウインドウを整列させるための配列の最
適なアラインメントは、当業者に周知であり、例えばSmith及びWatermanの
局所相同性アルゴリズム、Needleman及びWunschの相同性アラインメント
・アルゴリズム、Pearson及びLipmanの類似性探索法などのツールによって
、ならびに、これらのアルゴリズムをコンピュータ上で実装した、GCG(登録商標)W
isconsinPackage(登録商標)(Accelrys社、サンディエゴ、カ
リフォルニア)、MEGAlign(DNAStar社、1228 サウスパークストリ
ート、マディソン、ウィスコンシン.53715)及びMUSCLE(バージョン3.6
)(RC Edgar、Nucleic Acids Research(2004)3
2(5):1792‐1797)配列解析ソフトウェアパッケージの一部として利用可能
なGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTAなどにより、既定のパラメー
タを用いて実行してもよい。試験配列及び参照配列のアラインメントしたセグメントの「
同一フラクション」は、位置合わせした2つの配列が共有する同一の構成要素の数を、参
照配列セグメント中の構成要素の総数、すなわち参照配列全体、または参照配列内のより
小さな規定部分で除したものである。パーセント配列同一性は、同一フラクションを10
0倍化したものとして表される。1つ以上の配列の比較は、完全長配列もしくはその一部
、またはより長い配列に対して行ってもよい。
質安定性などの有用なタンパク質特性の新規組み合わせを用いて野生型タンパク質を変化
させる(すなわち改変する)ことによって産生してもよい。修飾は、タンパク質中の特定
のアミノ酸位置で行ってもよく、天然(すなわち、野生型タンパク質)のその位置で見出
されるアミノ酸とは異なるアミノ酸への置換であってもよい。タンパク質改変に有用な野
生型タンパク質RdpA(配列番号:60)のタンパク質配列と比較したアミノ酸位置の
例を図3に示す。図6A、6B、6C、6D、6Eは、野生型RdpAタンパク質配列と
、配列番号:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37
、40、43、及び46~52の改変タンパク質配列とのマルチ配列アラインメント結果
を提供する。改変タンパク質は、配列番号:1、4、7、9、11、14、18、22、
25、28、31、34、37、40、43、及び46~52からなる群から選択される
アミノ酸配列と少なくとも約92%の配列同一性を有するように、及びこれらのアミノ酸
変異の少なくとも1つを含むように設計することができる。したがって、本発明が提供す
る改変タンパク質は、自然界に見出される野生型タンパク質と比較して、1つ以上の変化
したタンパク質特性を有する新規タンパク質を提供する。本発明の一実施形態では、改変
タンパク質は、類似の野生型タンパク質と比較して、1つ以上の除草剤に対する活性の改
善または低下などのタンパク質特性の変化、もしくはタンパク質安定性の向上、またはそ
のような特性の任意の組み合わせを有する。一実施形態では、本発明は、配列番号:1、
4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43、及
び46~52からなる群から選択される改変タンパク質配列に対し、少なくとも約80%
の配列同一性、約85%の配列同一性、約90%の配列同一性、約91%の配列同一性、
約92%の配列同一性、約93%の配列同一性、約94%の配列同一性、約95%の配列
同一性、約96%の配列同一性、約97%の配列同一性、約98%の配列同一性、及び約
99%の配列同一性を有する改変タンパク質、及びそれをコードする組換えDNA分子を
提供する。アミノ酸突然変異は、タンパク質における単一のアミノ酸置換として、または
1つ以上の他のアミノ酸置換(複数可)、欠失、または追加などの1つ以上の他の突然変
異(複数可)との組み合わせとして作成してもよい。突然変異は、本明細書中に記載する
ように、または当業者に公知の他の任意の方法によって作成してもよい。
本発明の態様は、本発明で提供する組換えDNA分子及び改変タンパク質を含むトラン
スジェニック植物細胞、トランスジェニック植物組織、トランスジェニック植物、及びト
ランスジェニック種子を含む。組換えDNA分子及び改変タンパク質を含むこれらの細胞
、組織、植物及び種子は、アリールオキシフェノキシプロピオン酸(AOPP)除草剤、
フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤の1種以上に対する除草剤耐性を示
す。
きる任意の方法(例えば、組換えDNA構築物を植物染色体に安定に組み込む)を含み、
これらの方法は当該分野で公知である。組換えDNA構築物を植物に導入するための例示
的かつ広範に利用されている方法は、当業者に周知のAgrobacterium形質転
換系である。形質転換した植物細胞から、植物細胞培養の方法によってトランスジェニッ
ク植物を再生できる。それ自身と単一のトランスジーン対立遺伝子とを含むトランスジェ
ニック植物、例えばR0植物を自家受粉(自殖)させ、R1種子を産生することにより、
トランスジーン(すなわち、トランスジーンの2つの対立遺伝子コピー)に関してホモ接
合性であるトランスジェニック植物を得ることができる。産生するR1種子の4分の1は
、トランスジーンに関してホモ接合性である。発芽するR1種子から生長する植物は、通
常、SNPアッセイ、DNA配列決定、または接合アッセイと呼ばれるヘテロ接合体とホ
モ接合体とを区別可能にする熱増幅アッセイを用いて、接合性について試験することがで
きる。
ェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシル酸除草剤の1種以上に対して除草剤耐性を示
す。AOPP除草剤は、脂肪酸生合成経路の一部である植物のアセチル補酵素Aカルボキ
シラーゼ(ACCase)を標的とする。草木植物は、それらの色素体及びサイトゾルに
除草剤感受性ACCaseを有するため、これらの除草剤に感受性である。AOPP除草
剤は当該技術分野において周知であり、市販されている。AOPP除草剤の例として、ク
ロジナホップ、シハロホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ、フェノキサプロップ
‐P、フェンチアプロップ、フルアジホップ、フルアジポップ‐P、ハロキシホップ、イ
ソキサピリホップ、メタミホップ、プロパキザホップ、キザロホップ、キザロホップ‐P
、及びトリホップが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。フェノキシ
酸及びピリジニルオキシ酸除草剤は、植物成長ホルモンインドール酢酸(IAA)に類似
した合成オーキシン類である。広葉植物は、これらの除草剤に感受性であり、これらの除
草剤は、急速で抑制のない生長を誘導し、最終的に植物を枯死させる。フェノキシ酸除草
剤の例として、2,4‐D;2,4‐DB;クロメプロップ;ジクロルプロップ;フェノ
プロップ;MCPA;MCPB、及びメコプロップが挙げられるが、必ずしもこれらに限
定するものではない。ピリジニルオキシ酸除草剤の例として、トリクロピル;フルロキシ
ピル;アミノピラリド、クロピラリド、及びピクロラムが挙げられるが、必ずしもこれら
に限定するものではない。
物栽培区域に散布してもよい。本発明で提供する植物及び種子は、除草剤耐性形質を有し
、1種以上のAOPP除草剤、またはフェノキシ酸除草剤、またはピリジニルオキシル酸
除草剤の散布に耐性を示す。除草剤の散布は、推奨商業量(1倍量)もしくはその一部、
またはその複数倍、例えば推奨商業量の2倍(2倍量)などであってもよい。除草剤の割
合は、1エーカー当たりの1ポンド当たり酸当量(lb ae/ac)または1エーカー
あたりの有効成分のポンド(lb ai/ac)として表す場合がある。除草剤の散布は
、AOPP除草剤及びフェノキシ酸除草剤及びピリジニルオキシ酸除草剤からなる群から
選択される少なくとも1種の除草剤を含む。植物栽培区域は、除草剤の散布時に、雑草植
物を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよい。雑草を防除するために前記区域で
使用するAOPP除草剤の除草有効量は、生育期にわたって約0.01lb ai/ac
~約16lb ai/acの範囲からなるべきである。例えば、キザロホップ‐Pの1倍
量は、0.08lb ai/acの割合である。雑草を防除するために前記区域で使用す
るフェノキシ酸除草剤の除草有効量は、生育期にわたって約0.01lb ae/ac~
約16lb ae/acの範囲からなるべきである。例えば、2,4‐Dの1倍量は、約
0.75lb ae/ac~1.0lb ae/acの割合である。雑草を防除するため
に前記区域で使用するピリジニルオキシ酸除草剤の除草有効量は、生育期にわたって約0
.01lb ae/ac~約16lb ae/acの範囲からなるべきである。例えば、
フルロキシピルの1倍量は、約0.13~0.48lb ae/acの割合である。
もしくは任意の他の適合する除草剤のうちの1つ、2つ、またはいくつかの組み合わせを
連続的に、またはタンク内混合して行ってもよい。広範囲の双子葉雑草、単子葉雑草、ま
たはその両方を防除するために、生育期にわたって、本発明のトランスジェニック植物を
含む区域に、1つの除草剤または2つ以上の除草剤を、組み合わせまたは単独で、複数回
の散布、例えば、2回の散布(植え付け前の散布と出芽後の散布、もしくは出芽前の散布
と出芽後の散布など)または3回の散布(植え付け前の散布、出芽前の散布、及び出芽後
の散布、もしくは出芽前の散布と2回の出芽後の散布など)を利用してもよい。
複数可)の毒性効果に抵抗する植物、種子、植物組織、植物部分、または細胞の能力を意
味する。植物、種子、植物組織、植物部分、または細胞の除草剤耐性は、植物、種子、植
物組織、植物部分、または細胞を適切な対照と比較することによって測定し得る。例えば
、除草剤耐性を与え得るタンパク質をコードする組換えDNA分子を保有する植物(試験
植物)、及び除草剤耐性を与え得るタンパク質をコードする組換えDNA分子を有さない
植物(対照植物)に除草剤を散布し、2種の植物の植物薬害度を比較することによって、
除草剤耐性を測定または評価してもよく、試験植物の除草剤耐性は、対照植物の薬害度に
比べて低下した薬害度によって示される。除草剤耐性植物、種子、植物組織、植物部分、
または細胞は、対照植物、種子、植物組織、植物部分、または細胞に比べ、除草剤の毒性
作用に対する応答性が低い。本明細書中で使用する場合、「除草剤耐性形質」とは、野生
型植物または対照植物に比べて高い除草剤耐性を植物に付与するトランスジェニック形質
である。
以上の追加のトランスジェニック形質を含み得る。追加のトランスジェニック形質は、本
発明で提供する組換えDNA分子を含むトランスジーンを保有する植物を、追加のトラン
スジェニック形質(複数可)を有する別の植物と交配することによって導入してもよい。
本明細書中で使用する場合、「交配する」とは、2つの別個の植物を育種し、子孫植物を
産生することを意味する。したがって、2つのトランスジェニック植物を交配して、トラ
ンスジェニック形質を有する子孫を産生してもよい。本明細書中で使用する場合、「子孫
」とは、親植物の任意の世代の子孫を意味し、トランスジェニック子孫は、少なくとも1
つの親植物から継承された本発明で提供するDNA構築物を有する。あるいは、追加のト
ランスジェニック形質(複数可)のDNA構築物を、本発明で提供する組換えDNA分子
を含むDNA構築物(例えば、植物形質転換用に使用する同一ベクターの一部として表さ
れるすべてのDNA構築物)と共形質転換することによって、または本発明で提供するD
NA構築物を含むトランスジェニック植物に追加の形質(複数可)を挿入することによっ
て、もしくはその逆によって(例えば、トランスジェニック植物または植物細胞に、いず
れかのトランスジェニック植物形質転換法を使用することによって)追加のトランスジェ
ニック形質(複数可)を導入してもよい。そのような追加のトランスジェニック形質とし
て、耐虫性の向上、水分利用効率の向上、収量の増加、耐乾性の向上、種子品質の向上、
栄養品質の改善、ハイブリッド種子産生、及び除草剤耐性が挙げられるが、必ずしもこれ
らに限定するものではない。なお、前記形質は野生型植物または対照植物に関して測定し
てのものである。そのような追加のトランスジェニック形質は、当業者に公知であり、例
えば、そのような形質のリストが、米国農務省(USDA)の動植物検疫局(APHIS
)に提供され、そのウェブサイト(www.aphis.usda.gov)で閲覧可能
である。
当技術分野で一般的に公知の任意の育種方法と共に使用してもよい。2種以上のトランス
ジェニック形質を含む植物系統において、トランスジェニック形質は、個々に分離してい
るか、関連しているか、または3種以上のトランスジェニック形質を含む植物系統におい
ては両方の組み合わせであってもよい。親植物との戻し交配及び非トランスジェニック植
物との外交配も、栄養繁殖と同様に考慮される。異なる形質及び作物に一般的に用いる育
種方法の記載は、当業者に周知である。特定の植物または種子中のトランスジーン(複数
可)の存在を確認するために、様々なアッセイを行ってもよい。このようなアッセイとし
ては、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、PCR、ならびにDNA配列決定な
どの分子生物学的アッセイ;例えば免疫学的手段(ELISA及びウェスタンブロッティ
ング)または酵素的機能によってタンパク質産物の存在を検出するなどの生化学的アッセ
イ;葉または根アッセイなどの植物部分アッセイ;及び、植物全体の表現型の分析が挙げ
られる。
伝子移入が達成される。トランスジェニック形質を遺伝子移入した植物遺伝子型は、戻し
交配変換遺伝子型、系統、近交系、またはハイブリッドと呼ぶ場合がある。同様に、所望
のトランスジェニック形質を欠く植物遺伝子型は、未変換遺伝子型、系統、近交系、また
はハイブリッドと呼ぶ場合がある。
れに限定するものではない」を意味する。
者らが見出した代表的技術に基づく本実施例に開示する技術が、本発明の実施において良
好に機能し、したがって、その実施における好ましい形態を構成すると考え得ることを理
解すべきである。しかしながら、当業者は、本開示を参照して、本発明の概念、趣旨、及
び範囲を逸脱することなく、開示する特定の実施形態における多くの変更を加えることが
可能であり、その場合でも類似または同様の結果が得られることを理解すべきである。よ
り具体的には、化学的及び生理学的に関連する特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤に置
き換えて、同一または類似の結果を達成し得ることは明らかである。当業者に明らかなこ
のような類似の置換及び修飾はすべて、添付の特許請求の範囲によって規定する本発明の
趣旨、範囲、及び概念の範囲内にあるとみなされる。
これらのタンパク質をコードする新規改変タンパク質及び組換えDNA分子を、研究室
において考案し、及びタンパク質工学技術を用いて作製した。改変タンパク質は、オキシ
ゲナーゼ活性を有する酵素であり、野生型タンパク質との比較においてAOPP除草剤、
フェノキシ酸除草剤、またはその両方を不活性化する能力が変化するようにこれらを改変
した。
ンサスホモロジー配列アラインメントを作成した。これを構造情報に基づいた解析と組み
合わせ、合理的設計戦略における情報として用いた。これらの解析をもとに、本明細書で
「アイランド」と呼ぶ13~21アミノ酸長の5つの領域を突然変異誘発のために選択し
た。これらの領域の各々における突然変異は、当業者に公知の技術、例えばアラニンスキ
ャニング突然変異;相同性スキャニング突然変異;Pro/Glyスキャニング突然変異
;領域置換または突然変異;及びこれらの様々な技術の組み合わせなどを用いて作成する
。(M Lehmann and M Wyss,Current Opinion i
n Biotechnology(2001)12(4):371‐375;B Van
den Burg and VGH Eijsink,Current Opinio
n in Biotechnology(2002)13(4):333‐337;及び
Weiss et al.,Proc Natl Acad Sci USA(2000
)97(16):8950‐8954参照)。これらの方法を用いて、1,200種を超
えるユニークな改変タンパク質及びそれをコードする組換えDNA分子を、さらなる分析
及び特徴付けのために生成した。試験用に生成した改変タンパク質の数の多さ、及び各タ
ンパク質の酵素活性を試験及び比較する必要があることから、粗精製細菌抽出物を用いた
高速分析のためのハイスループット細菌タンパク質発現及び酵素アッセイ系を開発した。
に作動可能に連結したC末端ヒスチジンタグ(Hisタグ)を有する細菌発現ベクターに
クローニングすることにより、ハイスループットな細菌タンパク質発現を達成した。ベク
ターを用いてEscherichia coli(E.coli)を形質転換し、改変タ
ンパク質の細菌発現を誘導した。E.coli培養物を96ウェルプレートで一晩増殖さ
せ、培養物を遠心分離して細菌をペレット化した。100ulの溶解マスターミックス(
10mlの細菌タンパク質抽出試薬(B‐PER(登録商標))II(ピアス・バイオテ
クノロジー、ロックフォード、イリノイ;カタログ番号78260);10ulのリゾチ
ーム(終濃度10ug/ml;リゾチーム アメリカン・バイオアナリティカル、ネイテ
ィック、マサチューセッツ;カタログ番号AB011780‐00005);及び40u
lのBenzonase(登録商標)ヌクレアーゼ(終濃度100ユニット/ml、ノバ
ジェン、ダルムシュタット、ドイツ;カタログ番号71206‐3))を各ウェルに添加
し、細菌ペレットを溶解した。プレートをボルテックスし、次いで4℃で30分間インキ
ュベートした。400ulのMOPS緩衝液(pH6.57)を各ウェルに添加し、細胞
片を遠心分離によってペレット化した。溶解物上清を慎重に除去し、その後の酵素分析の
ための粗精製細菌抽出物として使用した。
な除草剤に対する改変タンパク質の酵素活性を分析した。改変タンパク質のオキシゲナー
ゼ活性(すなわち、その酵素の酵素活性)は、4‐アミノアンチピリン及びフェリシアン
化カリウムによる510nmでの吸光度測定によるフェノール生成物の検出を利用したエ
ンドポイント比色分析法によって測定した。このアッセイは、Fukomori and
Hausinger,Journal of Biological Chemist
ry(1993)268(32):24311‐24317に記載のアッセイに基づく。
酵素反応は、96ウェルプレート内において、20mMのMOPS(pH6.75)、5
0~200uMのNH4FeSO4、50~200uMのアスコルビン酸ナトリウム、1
mMのαケトグルタル酸(aKG)、発現した改変タンパク質を含有する10ulのE.
coli細胞溶解物、及び基質(AOPP除草剤またはフェノキシ酸除草剤のいずれか)
を含む合計量150ul中で分析した。基質との反応の開始時に、プレートを様々な温度
で様々な時間インキュベートし、EDTAを終濃度6.25mMになるように添加するか
、または15ulのpH10緩衝液(50mMのホウ酸、50mMのKCl)、続いて1
5ulの0.2%の4‐アミノアンチピリン及び15ulの0.8%フェリシアン化カリ
ウムを添加することによりクエンチ(終結)した。吸光度測定は、標準的な実験室分光計
で行った。必要に応じてアッセイをスケーリングし、スループットを高めた。精製タンパ
ク質または製品標準を用いて標準曲線を作成した。
の改変タンパク質の活性を、選択した野生型タンパク質RdpAの活性と比較して測定し
た。96ウェルプレートアッセイにおいて、3つの対照(改変タンパク質を有さない粗精
製細菌抽出物)及び3つの陽性対照(野生型タンパク質を有する粗精製細菌抽出物)を設
けた。ウェルの吸光度を測定し、タンパク質活性を以下の式を用いて計算した:
bsorbanceWTは野生型酵素を発現するE.coli由来抽出物を含むウェルの
吸光度、AbsorbancepETは改変タンパク質を有さないE.coli由来抽出
物を含むウェルの吸光度である。ユニークな各改変タンパク質の活性を2回測定し、2回
の測定の平均として報告した。
タンパク質を、精製改変タンパク質を用いるさらなる分析のために選択した。精製改変タ
ンパク質調製アッセイにおいて、製造元のプロトコールに従ってQUIAGEN(登録商
標)Ni‐NTAアガロース(キアゲン、バレンシア、カリフォルニア、カタログ番号3
0230)を用いて粗精製細菌発現溶解物を調製した。
を用いて、精製改変タンパク質を分析した。精製改変タンパク質アッセイの結果は、ハイ
スループット酵素アッセイの結果を大部分裏付けるものであった。約545種の改変タン
パク質のうちの7種について、本アッセイ結果を表1に示す。ここで、酵素活性は、野生
型RdpA酵素の活性(本実施例1に記載のように計算した)に対する試料の活性として
表す。これらのアッセイからのこれらのデータは、特定の突然変異の組合せが他のものよ
りも有意に良好に作用し、改変タンパク質の酵素活性を有意に変化させ得ることを実証し
た驚くべき結果をもたらした。
の改変タンパク質を産生し、これらを本実施例1に記載のように試験した。これらの追加
のタンパク質のうちの5種について、キザロホップ‐Pを基質として用いたハイスループ
ット酵素アッセイの結果を表2に示す。
なるタンパク質特性決定を実施した。この詳細な分析のために、精製タンパク質を以下の
ように調製した:所与のMON‐HTタンパク質をコードするトランスジーンを発現する
E.coliの一晩培養物2mlを用いて、500mlのブロスに播種し、37℃で4時
間増殖させた後、15℃で約36時間培養した。次いで、500mlの細菌培養物のうち
、250mlを遠心分離によってペレット化し、25mlの抽出用緩衝液(20mMのト
リス(pH7.8)、300mMのNaCl、5mMのβメルカプトエタノール(BME
)、20mMのイミダゾール(フルカ/シグマ・アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ
)、125ユニット/mlのベンゾナーゼ及び10Kユニット/mlのリゾチーム(ノバ
ジェン、ダルムシュタット、ドイツ)に再懸濁した。細胞懸濁液を細胞破砕器に2000
0psiで1回通過させ、次いでこの細胞溶解物を、4℃で20分間35,000×gで
遠心分離して清澄化した。可溶性Hisタグ付きタンパク質の上清を、タンパク質精製に
用いた。この精製のために、AKTaxpress(商標)システム(GEヘルスケア、
ピスカタウェイ、ニュージャージー)を用い、製造元の標準的なプロトコールに従って、
上清を1mlのHisTrap(商標)FFカラム(ニッケル・セファロース)(GEヘ
ルスケア、ピスカタウェイ、ニュージャージー)にアプライした。洗浄緩衝液は:20m
Mのトリス(pH7.8)、300mMのNaCl、20mMのイミダゾール及び5mM
のBMEからなっていた。溶出緩衝液は、500mMのイミダゾールを用いた以外は、洗
浄緩衝液と同じであった。ニッケルカラムからの溶出液を、Quick Spin Pr
otein Sephadex G‐25ファインカラム(ロシュ・アプライド・サイエ
ンス、インディアナポリス、インディアナ)上で製造元のプロトコールに従って脱塩した
。溶出したタンパク質は:20mMのトリス(pH7.8)、50mMのNaCl及び5
mMのBMEからなる緩衝液中に存在した。SDS‐PAGE分析によってタンパク質抽
出物の純度を評価した。バイオラッドProtein Assay色素試薬(バイオラッ
ド、ハーキュリーズ、カリフォルニア、カタログ番号500‐0006)を用いたブラッ
ドフォード・アッセイによってタンパク質濃度を測定した。
除草剤:キザロホップ‐P、ハロキシホップ、フェノキサプロップ、及びフルアジホップ
を用いて、前記5種の改変タンパク質の精製タンパク質を分析した。一般的なフェノール
標準曲線を作成するために用いる2,4‐ジクロロフェノール(2,4‐DCP)を用い
て標準曲線を作成した。改変タンパク質によるアッセイでの生成フェノール量を、この標
準曲線に基づいて計算した。対照は、精製した野生型酵素、酵素なし、及び基質なしであ
った。0、20、40、80、160、320、640、または1280μMのキザロホ
ップ‐P、ハロキシホップ、フェノキサプロップ、またはフルアジホップ除草剤を用いて
、5種の改変タンパク質の酵素反応速度の測定を行った。表3は、5種のタンパク質につ
いて、4種のAOPP除草剤基質を用いて測定したKm及びVmax(相対値として表す
)を示す。基質として4種のAOPP除草剤のそれぞれを用いたこれらの5種の改変タン
パク質のタンパク質特性は、改変タンパク質の酵素活性、すなわちKm及びVmaxがタ
ンパク質改変によって有意に変化し得ることを示した。
単子葉植物での発現に最適化したタンパク質コード配列を有する3つの改変タンパク質
、MON‐HT51(配列番号:3)、MON‐HT52(配列番号:6)、及びMON
‐HT55(配列番号:13)のうち、各々1つをコードする組換えDNA分子を含む植
物形質転換ベクターを構築した。ベクターは、プロモーター、リーダー、イントロン、及
び3′UTRの異なる組み合わせを用いるとともに、タンパク質コード配列に作動可能に
連結したCTPの存在下及び非存在下で作製した。また、グリホサート耐性用にトランス
ジェニック植物において使用するためのcp4‐EPSPSコード配列を含む第二のDN
Aカセットをベクターに組み込んだ。Agrobacterium tumefacie
ns及び当該分野で公知の標準的な方法を用いて、未成熟トウモロコシ(LH244)胚
をこれらのベクターで形質転換した。再生R0トランスジェニック幼植物体を温室内で栽
培し、およそV2~V4の生育段階において、それぞれ約0.5倍及び1倍量を表わす0
.04または0.08lb ai/acのキザロホップ‐P(Assure(商標)II
、E.I.デュポン)をこれらに噴霧した。葉の試料を使用して、単一コピーのトランス
ジェニックDNAインサート(すなわち、単一事象の植物)を保有するトランスジェニッ
ク植物を同定した。単一コピーのみを含み、0.5倍または1倍量のキザロホップ‐P噴
霧試験に合格したR0植物を自家受粉させ、R1種子を産生した。MON‐HT52を含
む構築物では事象は得られなかった。CTPを含むMON‐HT51を含む構築物及びC
TPを含まないMON‐HT51を含む構築物から、1つの事象のみが再生した。MON
‐HT55を含む2組のベクターを形質転換した。各組は、CTPを含むか否かのみが異
なる。
温室内で栽培し、V2生育段階において、キザロホップ‐P除草剤を0.08lb ae
/ac(1倍)の割合で散布した。処置後11日目に植物の薬害度を評価した。R1植物
は一般的なメンデル比で形質を分離させており、予想数(約25%)の除草剤処理で生存
しなかったヌル分離個体(トランスジェニック形質を含まない子孫植物)が認められた。
作動可能に連結したCTPを含むMON‐HT55を発現するすべてのR1トランスジェ
ニック植物は、1つの事象を表すものを除いて、キザロホップ‐Pの散布後に最も若い露
出した葉に軽微な萎黄病の小斑点を示したのみであった。これらの植物では、除草剤散布
後に5%を超える薬害スコアを記録することはなかった。同様に、未噴霧のトランスジェ
ニック植物は、未噴霧の対照植物と表現型の上で異なってはいなかった。図1Aは、キザ
ロホップ‐P散布18日後の対照LH244植物及びMON‐HT55(配列番号:13
)保有トランスジェニック植物を示す。
るために、タンパク質コード配列に作動可能に連結したCTPを含む及び含まないトラン
スジーンインサートを保有するトランスジェニック植物を比較した。タンパク質コード配
列に作動可能に連結したCTPを保有する植物は、CTPを含まないものと比較して、キ
ザロホップ‐Pに対してより良好な耐性を示した。本実施例2に記載のR1温室試験にお
いて、タンパク質コード配列に作動可能に連結したCTPを保有するトランスジェニック
植物の大部分は、キザロホップ‐Pに対して完全な耐性を示した。タンパク質コード配列
に作動可能に連結したCTPを保有しない植物は、キザロホップ‐P耐性を示したものの
、中程度の薬害表現型を示した。これらの結果は、CTPを使用して改変タンパク質を植
物細胞葉緑体に標的化することが、トランスジェニック植物のキザロホップ‐P耐性を高
めることを示した。この予期しない発見を、タンパク質コード配列に作動可能に連結した
CTPを含むもしくは含まないMON‐HT51またはタンパク質コード配列に作動可能
に連結したCTPを含むもしくは含まないMON‐HT55を保有するR1植物を用いた
形質有効性圃場試験において再び試験した。これらのR1植物は単一コピーであったが、
依然として遺伝的に分離していた。この圃場試験では、種子を圃場に植え、以下のように
処理した:植え付け前に2倍量(0.16lb ai/ac)のキザロホップ‐P処理、
V4生育段階において2倍量(0.14lb ai/ac)のハロキシホップ処理、及び
V8生育段階において2倍量のキザロホップ‐P処理。タンパク質コード配列に作動可能
に連結したCTPを保有しない植物に比べ、タンパク質コード配列に作動可能に連結した
CTPを保有する植物は、より高い割合で、キザロホップ‐P及びハロキシホップの散布
に耐え、薬害スコアが低かった。データを表4に提供する。これは、タンパク質コード配
列に作動可能に連結したCTPが、改変タンパク質に、除草剤の散布に対する高い植物耐
性を付与するという予想外の発見を裏付けるものであった。
剤に対する耐性及びシクロヘキサンジオン(CHD)除草剤に対する感受性を評価した。
ホモ接合性トランスジェニックR1植物を自家受粉させ、種子を採取してR2近交系植物
を生成した。R2近交系植物は、CTPを含むもしくは含まないMON‐HT55または
CTPを含むMON‐HT51を保有する近交系植物であり、これらを2つの圃場地点で
評価した。除草剤処理は、PRE(植え付け後だが出芽前)に0.16lb ai/ac
の2倍量キザロホップ‐Pを散布し、続いてV4生育段階に0.16lb ai/acの
キザロホップ‐Pを散布し、続いてV8生育段階に0.16lb ai/acのキザロホ
ップ‐Pを散布した。除草剤散布の7~10日後に、0~100のスケール上で作物薬害
度についてプロットを評価した。ここで0は薬害なしであり、100は作物の完全死であ
る。すべてのデータを、LSD(0.05)で分離される分散及び平均の分析に供した。
近交系R1植物のほとんどは薬害を示さず、このことからCTPを含むまたは含まないM
ON‐HT55及びMON‐HT51の両方が、トウモロコシに対してキザロホップ‐P
耐性を付与することを確認した。自生植物防除での使用に望ましいCHD除草剤に対する
感受性を試験するために、植物をV8生育段階において1倍量のクレトジム(0.25l
b ai/ac)で処理した。1倍量のクレトジムを用いた自生植物防除は、試験した全
てのトランスジェニック植物に対して100%有効であった。ハイブリッド形質有効性圃
場試験を実施し、ハイブリッド・バックグラウンドでのAOPP除草剤に対する耐性及び
シクロヘキサンジオン(CHD)除草剤に対する感受性を評価した。R1近交系植物を非
トランスジェニック植物と交配させ、種子を採取することにより、F1ハイブリッド植物
を産生した。結果として得られた、CTPを含むもしくは含まないMON‐HT55(配
列番号:13)またはCTPを含まないMON‐HT51(配列番号:3)を保有するF
1植物を、6か所の圃場で評価した。圃場の季節の間の高熱及び干ばつ条件を含む環境条
件の範囲の下で、ハイブリッド形質有効性圃場試験を6カ所で実施した。こうすることに
より、トウモロコシにおいて、高熱及び水ストレス条件下で改変タンパク質を評価するこ
とを可能とした。データを表5に示す。2倍量のキザロホップ‐P散布に由来する最初の
薬害は、散布後7~10日目において所望よりも高かった(>10%の薬害度)。植物は
、最終的に大部分の薬害から脱して生長した。一般的にはV4生育段階での散布に比べて
V8生育段階での散布のほうが、より薬害の程度は少なかった。過度の薬害は、キザロホ
ップ‐Pを非常に早期に散布した場合(例えば、VE~V2生育段階)にも認められた。
T51を発現するハイブリッド植物が、キザロホップ‐P散布に感受性であるという知見
を、植物ベースのアッセイを用いて確認した。植物ベースのアッセイは、圃場試験の前に
、生育室におけるF1ハイブリッドのキザロホップ‐Pに対する耐性を試験するように設
計した。このアッセイは、トウモロコシ事象NK603(米国特許第8,273,959
号)×MON89034(米国特許第8,581,047号)を保有する植物のF1ハイ
ブリッド、及びMON‐HT55×MON89034を保有する植物のF1ハイブリッド
を用いて開発した。F1ハイブリッド種子を生育室内で1週間発芽させた後、3つの異な
る生育室のうちの1つに移動し、2倍量(0.16lb ai/ac)のキザロホップ‐
Pを散布する前に、20℃/20℃、28℃/20℃、及び38℃/30℃の昼/夜温度
で2日間、順化させた。予想どおり、すべての温度レジメンでMON‐HT55を保有し
ない植物は、2倍量のキザロホップ‐P散布によって重篤な薬害を受けた(図1B)。M
ON‐HT55を保有するトランスジェニック植物は、20℃/20℃または28℃/2
0℃の昼/夜温度に順化させた場合、2倍量のキザロホップ‐P散布に対して良好な耐性
を示したが、38℃/30℃の昼/夜温度で順化させた場合は、有意な感受性を示した(
図1C)。このことは、植物ベースのアッセイを用いて、温度感受性活性に関して、生育
室内の植物のタンパク質をスクリーニングできることを裏付けた。
えることができること、及び未噴霧の対照植物に比べて未噴霧のトランスジェニック植物
が表現型の上で異なっていないことを示した。前記データはまた、植物内で改変タンパク
質を発現させることにより、自生植物防除のためにCHD除草剤を使用することが可能に
なることを裏付けた。予期しないことに、前記データは、改変タンパク質の葉緑体標的化
のためにCTPを使用することが除草剤耐性形質を高めること、及び改変タンパク質が提
供する除草剤耐性が温度感受性であり、高温条件下では低下することを示した。
高温の圃場条件下で栽培した場合、改変タンパク質MON‐HT55またはMON‐H
T51を発現するハイブリッド事象がキザロホップ‐P散布に感受性であるという知見は
、驚くべきことであり、タンパク質改変によって変更可能な追加のタンパク質特性を提供
した。高温に対する感受性についてタンパク質を試験するための一連の新規生体外酵素ア
ッセイ及び植物ベースの酵素活性アッセイを開発した。
初の2ラウンドで使用したタンパク質モチーフ分析を、いくつかの改変タンパク質の結晶
構造データと組み合わせた。これらを情報として用いて、前記のように実施する追加のラ
ウンドの突然変異誘発を行い、そのようにして約1400種の追加の改変タンパク質を生
成した。これらを、実施例1に記載の約1200種の改変タンパク質と組み合わせ、新規
温度感受性アッセイを用いてより高温での活性に最適化したタンパク質を同定するための
スクリーニングを行うための合計約2600種の改変タンパク質を得た。
素アッセイを改変して、成分の混合前にすべてのアッセイ成分を所望の温度に5分間予熱
し、反応の間は、所望の温度に維持するように仕様を定めた。アッセイ測定値を正規化す
るために、キザロホップ‐Pを反応の基質として使用し、25℃の測定値に基づいて酵素
活性を正規化した。これらのパラメータを用いて、酵素活性が最大値の半分(T1/2)
になる温度を計算した。MON‐HT55のT1/2を29℃と算出し、野生型RdpA
のT1/2を38℃と算出した(図2A)。
したように、粗精製細菌溶解物を用いたハイスループット細菌タンパク質発現及び酵素ア
ッセイ系を使用し、ただし、25℃及び40℃の所望の温度で実施し、クエンチ後の発色
を25℃で行うように変更した。本スクリーニングにより約1250種の改変タンパク質
を選択し、次工程に移行させた。2次スクリーニングを同様に行ったが、ただし、試料間
のタンパク質の正規化を組み入れた。本スクリーンにより、94種の改変タンパク質を選
択し、次工程に移行させた。3次スクリーニングは、実施例1に記載したように、精製タ
ンパク質ならびに除草剤分解酵素アッセイを使用し、ただし、25℃及び40℃の所望の
温度で実施し、クエンチ後の発色を25℃で行うように変更した。本スクリーニングによ
り、47種の改変タンパク質を選択し、次工程に移行させた。4次スクリーニングは、精
製タンパク質を用いて行い、タンパク質濃度を正規化した。また、前記スクリーニングは
、23℃及び40℃で行うエンドポイント・アッセイに、基質としてキザロホップ‐P及
び(タンパク質変異体のサブセットについては)2,4‐Dを含んでいた。本スクリーニ
ングにより、13種の改変タンパク質を選択し、次工程に移行させた。
各々について、組換えタンパク質を合成及び精製した。本生化学分析は:(1)反応速度
論分析(Vmax及びKm)、(2)温度範囲にわたる活性アッセイ、(3)タンパク質
融解分析、(4)追加のAOPP除草剤基質に対する活性、及び(5)同一性を確認する
ためのペプチドの質量分析を含んでいた。比較のために、精製組換え野生型タンパク質及
びMON‐HT55タンパク質に対しても生化学分析を行った。反応速度論分析について
は、基質としてキザロホップ‐Pまたは2,4‐Dのいずれかを用いて23℃で非エンド
ポイント・アッセイを行った。これらのアッセイ用の組換えタンパク質を細菌中で産生し
、タンパク質のC末端に融合した6‐Hisタグを用いて精製した。10種の改変タンパ
ク質、野生型タンパク質、及びMON‐HT55タンパク質について、キザロホップ‐P
または2,4‐Dのいずれかを基質として用いた反応速度論分析の結果を表7に示す(標
準誤差を括弧内に示す)。Vmaxは比活性、umol除草剤製品mg酵素-1分-1とし
て表し;KmはmM除草剤基質として表す。NDBは、より高濃度の除草剤では酵素活性
が明らかである可能性があるが、試験した濃度における活性は、適切な速度論的特徴付け
を提供するのに十分なロバスト性を有していないことを示している。MON‐HT55に
ついては、2,4‐Dを基質として用いた場合の活性レベル(Vmax)が低かったため
、報告値の信頼性は低いものとなった。MON‐HT7は、キザロホップ‐Pを用いた場
合のVmaxが野生型酵素よりも約40%高く、2,4‐Dに対するVmaxは野生型酵
素の約半分に過ぎなかった。MON‐HT1は、キザロホップ‐Pに対しては、野生型酵
素の約半分のVmax、及び2,4‐Dに対しては野生型酵素より9.5倍高いVmax
を有していた。MON‐HT1とMON‐HT7とは、わずかに4つのアミノ酸が異なる
のみであることから、このMON‐HT1とMON‐HT7のタンパク質反応速度の差異
は驚くべきものであった。具体的には、MON‐HT1は示す位置に以下のアミノ酸を有
し:I82;F105;T112;及びV273、ならびにMON‐HT7は示す位置に
以下のアミノ酸を有する:L82;V105;S112;及びA273。
る範囲の温度にわたっての酵素活性を詳細に分析した。これらのアッセイは上記のように
行った。これらの反応の基質としてキザロホップ‐Pまたは2,4‐Dを使用し、25℃
での野生型酵素の活性に基づいて活性を正規化した。得られた活性曲線を図2B(基質と
してキザロホップ‐Pを使用)及び図2C(基質として2,4‐Dを使用)に示す。基質
としてキザロホップ‐Pを使用した場合、MON‐HT55は最も温度感受性が高く、T
1/2は29℃であった。野生型酵素のT1/2は38℃であった。MON‐HT1及び
MON‐HT8は、野生型酵素よりも温度感受性が低く、それぞれT1/2は42℃及び
41℃であり、これらの温度下では野生型酵素は90%不活性である。MON‐HT2及
びMON‐HT7は、温度感受性がはるかに低く、それぞれT1/2は46℃及び47℃
であり、これらの温度下では野生型酵素は完全に不活性である。基質として2,4‐Dを
用いた場合、野生型酵素のT1/2は36℃であった。MON‐HT2、MON‐HT7
、及びMON‐HT8はいずれも、わずかに温度感受性が高く、野生型酵素よりT1/2
が低かった。MON‐HT1は、わずかに温度感受性が低く、野生型酵素よりT1/2が
約1℃高かった。
uMのFe2+及び1.0mMのaKGを含むかまたは含まない標準保存緩衝液(30m
Mのトリス(pH7.5)、150mMのNaCl)中の96ウェルマイクロタイタープ
レートに添加した。次いでタンパク質のアンフォールディングを、SYPRO(登録商標
)オレンジタンパク質ゲル染色試薬(Invitrogen(商標)カタログ#S665
1、ライフテクノロジーズ、グランド・アイランド、ニューヨーク)を用いて、バイオラ
ッドCFX96(商標)リアルタイムPCR装置(バイオラッド、ハーキュリーズ、カリ
フォルニア)中で10℃~95℃まで0.5℃ステップで測定しながら検出した。T1/
2(ここでは、タンパク質の50%が折り畳まれていない温度)を表8に示す。野生型酵
素は、50uMのFe2+及び1.0mMのaKGで安定化を示した。対照的に、50u
MのFe2+及び1.0mMのaKGでは、いずれの改変タンパク質の安定性にもほとん
ど影響を与えなかった。MON‐HT55、MON‐HT3、MON‐HT4、MON‐
HT6、及びMON‐HT10の融解温度は、野生型酵素の融解温度より低い41℃~4
8℃の範囲にあった。MON‐HT1、MON‐HT2、MON‐HT5、MON‐HT
7、MON‐HT8、及びMON‐HT9の融解温度は58℃~67℃であり、野生型酵
素より8~17℃高かった。MON‐HT7及びMON‐HT1について、融解点の差異
は、Fe2+及びaKGを含まない緩衝液中では11℃、Fe2+及びaKGを含む緩衝
液中では8℃であった。2つの酵素の間には、わずかに4つのアミノ酸の相違があるのみ
であることから、これは驚くべきことであった。酵素の融解点に関するこのデータは、改
変タンパク質が、より高温でのタンパク質安定性に最適化されていることを裏付けた。こ
のデータはまた、異なる温度で実施したタンパク質の酵素活性アッセイの結果と一致する
。
とするMON‐HTタンパク質変異体の酵素活性を、精製酵素を用いて23℃で酵素活性
アッセイを実施して測定した。測定した活性を最大活性とし、野生型酵素の活性を100
%と設定した場合の百分率として、前記活性を記録した。データを表9に示す。MON‐
HT55、MON‐HT3、MON‐HT4、MON‐HT5、及びMON‐HT9は、
同じ基質に対する野生型酵素の最大活性を下回るかまたは同等の最大活性を、4種の基質
すべてについて有していた。ハロキシホップを基質とした場合、MON‐HT1、MON
‐HT2、MON‐HT7、及びMON‐HT10は、野生型酵素よりも高い最大活性を
有していた。フェノキサプロップを基質とした場合、MON‐HT1、MON‐HT2、
MON‐HT6、MON‐HT7、MON‐HT8、及びMON‐HT10は、野生型酵
素よりも高い最大活性を有していた。フルアジホップを基質とした場合、MON‐HT2
及びMON‐HT7は、野生型酵素よりも高い最大活性を有していた。ジクロルプロップ
を基質とした場合、MON‐HT1、MON‐HT7、及びMON‐HT8は、野生型酵
素よりも高い最大活性を有していた。
Eゲル上で分離し、染色した。次いで、染色したバンドを切り取り、脱染色し、及びトリ
プシン消化を標準的なプロトコールを用いて行った。トリプシン消化したタンパク質調製
物を、Dionox UltiMat(登録商標)3000 RSLCnano LCシ
ステム(サーモサイエンティフィック、サニーベール、カリフォルニア)において、Th
ermo Scientific(商標)AQUASIL(商標)C‐18 Javel
in(商標)Guardカラムを標準条件で使用して分離し、Thermo Scien
tific(商標)Q Exactive(商標)ハイブリッド四重極型オービトラップ
質量分析計(サーモサイエンティフィック、サニーベール、カリフォルニア)を用いたM
S‐MS分析を行うために注入した。
いくつかの改変タンパク質の結晶構造に対し、コンピュータ上でタンパク質改変を行った
。これらの情報をもとに、前記のように実施する追加のラウンドの突然変異誘発を行い、
ただし、初期配列として、タンパク質配列MON‐HT1(配列番号:14)をコードす
るバクテリア配列、配列番号:15を使用した。およそ472種の追加の改変タンパク質
を生成した。これらを実施例1及び表6に記載の約2600種の改変タンパク質と組み合
わせて、合計約3072種の改変タンパク質とし、2,4‐D存在下での活性に関して最
適化されたタンパク質を同定した。新規変異体の1次スクリーニングは、実施例1に記載
したような粗精製細菌溶解物を用いたハイスループット(HTP)細菌タンパク質発現及
び酵素アッセイ系であり、ただし、25℃及び40℃の所望の温度で実施し、クエンチ後
の発色を25℃で行うように変更した。このHTPスクリーニングの後、およそ34種の
改変タンパク質を選択し、これらをスクリーニングに供するとともに、すべての試料間で
タンパク質を正規化した。このスクリーニングから12種の改変タンパク質を選択し、そ
れらを、実施例1に記載したように精製タンパク質を用いて除草剤分解酵素アッセイで分
析するスクリーニングに移行させた。酵素熱安定性を、タンパク質限定融解アッセイで分
析した。このスクリーニングから7種の改変タンパク質を選択し、それらを植物内試験に
移行させた。3種の酵素変異体を、精製タンパク質を用いた詳細な特徴付けのために選択
し、そこにおいてタンパク質濃度は正規化し、スクリーニングは、基質としてキザロホッ
プ‐P及び2,4‐Dを、ならびに表10及び表12に示す追加の除草剤及びタンパク質
融解特徴を含んでいた。
T15、及びMON‐HT17の精製タンパク質に対して、23℃での非エンドポイント
・アッセイを用いた反応速度論分析を実施し、基質としてキザロホップ‐Pまたは2,4
‐Dのいずれかを用いた。データは、2,4‐Dを基質として試験した場合に、MON‐
HT13、MON‐HT15、及びMON‐HT17の酵素活性が、野生型RdpA酵素
及びMON‐HT1酵素の両方に比べて、有意かつ予想外に増強したことを示した。具体
的には、3種すべての変異体で、MON‐HT1と比較して活性(Vmax)が約2.5
~3倍増加したことを示した。キザロホップを基質とした場合のMON‐HT13、MO
N‐HT15、及びMON‐HT17変異体の酵素活性は、MON‐HT1の活性とおお
よそ同等であった。表10参照。
及びMON‐HT17の融解温度はMON‐HT1の融解温度と同等であり、緩衝液中で
T1/2は55~58℃の範囲にあり、及びFe2+及びaKGを含む緩衝液中ではT1
/2は60~62℃の範囲にあった。これらのデータは、MON‐HT13、MON‐H
T15、及びMON‐HT17変異体が、MON‐HT1と比較して同等の酵素熱安定性
を有することを示している。酵素変異体の融解点に関するこのデータは、改変タンパク質
が高温でのタンパク質安定性のために最適化されていることを裏付けるものである。表1
1参照。
N‐HTタンパク質変異体の酵素活性を、精製酵素を用いて23℃で酵素活性アッセイを
実施して測定した。測定した活性を最大活性とし、野生型酵素の活性を100%と設定し
た場合の百分率として、前記活性を記録した。データを表12に示す。除草剤トリクロピ
ル及びフルロキシピルを基質として分析した各タンパク質(MON‐HT1、MON‐H
T13、MON‐HT15、及びMON‐HT17)は、特に改変タンパク質において検
出可能な活性を有していたものの、活性には定量化できるほどのロバスト性がなかった。
除草剤MCPBを基質として分析した各タンパク質(MON‐HT1、MON‐HT13
、MON‐HT15、及びMON‐HT17)には、検出可能な活性はなかった。メコプ
ロップを基質とした場合の酵素活性は、MON‐HT1、MON‐HT13、MON‐H
T15及びMON‐HT17変異体の各々について、野生型RdpA酵素に比べて低かっ
た。予想外の結果として、MCPAを基質とした場合の酵素活性は、MON‐HT1につ
いては野生型RdpA酵素に比べて約6倍高く、MON‐HT13、MON‐HT15、
及びMON‐HT17については約10倍高かった。表12参照。
より高温での活性に関して最適化した10種のユニークな改変タンパク質を、植物にお
けるトウモロコシの形質転換及び分析のために選択した。単子葉植物での発現用に最適化
したコドン使用頻度を用いてこれらの改変タンパク質を発現させるために、当業者に公知
の方法を用いてDNA構築物を作成した。これらのDNA構築物中において、改変タンパ
ク質とともに、エンハンサー、プロモーター、リーダー、イントロン、CTP、及び3′
UTRを様々な組み合わせで試した。DNA構築物は、Agrobacterium t
umefaciens及び当該分野で公知の標準的方法を使用して未成熟トウモロコシ(
LH244)胚をそれらのベクターで形質転換するために用いた。再生したR0トランス
ジェニック幼植物体を温室内で栽培した。
ップ‐P(2倍)+2,4‐D(2倍)を散布することにより、トランスジェニックR0
トウモロコシ植物をスクリーニングした。試験した全ての構築物は、R0スクリーニング
を通過したユニークな事象を保有する植物を産生した。R0植物を自家受粉させてR1ホ
モ接合性種子を生成し、R0を雄性植物としても使用して、トウモロコシ事象MON89
034を有する近交系植物と交配させ、有効性圃場試験のための分離F1ハイブリッド種
子を生成した。
物を用いて、有効性圃場試験を実施した。2つの除草剤散布レジメンを使用してキザロホ
ップ‐P(2倍)+2,4‐D(2倍)に対する耐性を評価した:(1)0.16lb
ai/ac(2倍)キザロホップ‐P(Assure II)+0.25体積%非イオン
性界面活性剤(NIS)をVE~V2生育段階に散布し、続いて同じものをV4生育段階
に、続いて同じものをV8生育段階に散布する。(2)2lb ae/ac(2倍)の2
,4‐Dアミン+0.04lb ai/ac(0.5倍)のキザロホップ‐P+0.25
体積%のNISをVE~V2生育段階に散布し、続いて2lb ae/ac(2倍)の2
,4‐Dアミン+0.25体積%のNISをV4生育段階に、続いて同じものをV8生育
段階に散布した。トランスジーンがヌルであった50%の植物は、VE~V2生育段階で
の最初のキザロホップ‐P散布によって除去された。散布後10~14日目に、作物薬害
について0~100のスケールでプロットを視覚的に評価した。「0」は無し、「100
」は作物の完全破壊であった。表13は、両方の噴霧レジメンのV4及びV8生育段階に
おける平均薬害度を示す。10%未満の薬害度は非常に良好な耐性と考えられ、20%未
満の薬害度は良~可の耐性と考えられた。V8生育段階での2,4‐Dの2倍量散布によ
る薬害度は、上が40%~下が0の範囲にあった。同様に、V8生育段階での2倍量のキ
ザロホップ‐Pの散布による薬害度は、上が90%~下が0であった。同一タンパク質を
発現する植物の間での薬害度のバラツキは、構築物の設計またはトランスジーンの挿入位
置のバラツキによるものである可能性が高い。このデータは、改変タンパク質を発現する
植物が、2,4‐D及びキザロホップ除草剤の2倍量での散布に対し、耐性を示したこと
を裏付けた。
質を有するトランスジェニック植物の除草剤耐性に対する生育温度上昇の影響を測定した
。上昇した生育温度でのキザロホップ‐P耐性を試験するために、F1ハイブリッド(M
ON‐HTタンパク質の1つを発現するR1ホモ接合性植物と近交系トウモロコシ事象M
ON89034とを交配して産生した)トウモロコシ種子を、生育室内で10日間、日中
温度28℃及び夜間温度20℃、湿度50%の下で栽培した。10日後に植物を移動させ
、下記の3つの異なる昼夜温度レジメンのうちの1つで3日間順化させた:(1)昼夜温
度をいずれも20℃に設定;(2)日中温度が28℃及び夜間温度が20℃;または(3
)日中温度が38℃及び夜間温度が30℃。順化期間の終了時、植物は一般的にV4生育
段階にあり、2倍量のキザロホップ‐Pをこれらに噴霧した。処置の10日後に、植物に
対し1~5の評定尺度で薬害度を採点した。ここで、『0』は目視レベルでの薬害なし、
『1』は萎黄病の小斑点、『2』は退緑条斑、『3』は葉隙または破れ有り、『4』は発
育不良及び/またはねじれた葉を有する植物、及び『5』は枯死した植物または生長が認
められない、である。結果を図4に示す。MON‐HT55を発現するF1ハイブリッド
・トウモロコシ植物は、昼/夜温度が20℃/20℃(図4A)または28℃/20℃(
図4B)であった場合に、F1ハイブリッド対照植物(トウモロコシ事象NK603×M
ON89034)(薬害度5)に比べて、噴霧処理に対する良好な耐性(薬害度2前後)
を示した。昼/夜温度が38℃/30℃の場合、F1ハイブリッド対照植物の薬害度は5
、MON‐HT55を発現するF1ハイブリッド植物の平均薬害度は3、及びMON‐H
T1、MON‐HT2、MON‐HT3、MON‐HT4、またはMON‐HT7を発現
するF1ハイブリッド植物は、薬害度≦1であった(図4C)。より高温での活性に最適
化された前記改変タンパク質は、これらの改変タンパク質を発現する植物を高温に曝した
場合にAOPP除草剤耐性を示した。
、MON‐HT3、MON‐HT4、MON‐HT7、またはMON‐HT55を保有す
るR1植物と、トウモロコシ事象MON89034を保有する近交系植物との交配により
、F1ハイブリッド植物を産生した。F1ハイブリッド植物を温室内で最低温度20℃、
最高温度28℃、湿度50~80%で1週間栽培した。1週間後、植物を移動させ、2つ
の異なる昼夜温度レジメンのいずれかで3日間順化させた:(1)昼夜温度をいずれも2
0℃に設定、または(2)日中温度38℃及び夜間温度30℃。順化期間の終了時、植物
は一般的にV4生育段階にあり、4倍量の2,4‐Dアミンをこれらに噴霧した。処置の
10日後に、0~100の薬害尺度を用いて薬害度を採点した。「0」は薬害なし、「1
00」は枯死した植物である。4倍量の2,4‐Dアミンを散布する前に20℃/20℃
の昼/夜温度で植物を順化させた場合、MON‐HT1、MON‐HT2、MON‐HT
3、MON‐HT4、MON‐HT7、またはMON‐HT55を保有するF1植物は、
薬害度平均<10%であり、対照植物は、薬害度平均<20%であった(図4D)。4倍
量の2,4‐Dアミンを散布する前に昼/夜温度38℃/30℃で順化させた場合、MO
N‐HT4またはMON‐HT7を保有するF1植物は、薬害度平均<20%、MON‐
HT1、MON‐HT2、またはMON‐HT3を保有するF1植物は、薬害度平均<1
0%(図4E)、ならびに対照植物及びMON‐HT55を保有するF1植物は、50%
の薬害度平均を有していた(図4E)。これらの結果は、より高温での活性に最適化され
た改変タンパク質が、これらの改変タンパク質を発現する植物を高温に曝した場合に2,
4‐D除草剤耐性を示すことを実証した。
シ事象MON89034を保有する近交系植物と、MON‐HT55(CTP有り)、M
ON‐HT1(CTP有りまたは無し)、MON‐HT2(CTP有りまたは無し)、M
ON‐HT3(CTP有り)、MON‐HT4(CTP有り)、MON‐HT5(CTP
有り)、MON‐HT6(CTP有り)、またはMON‐HT7(CTP有り)を保有す
るR1植物とを交配することによって産生したF1ハイブリッド・トランスジェニック植
物を各々に用いて、2箇所で実施した。トウモロコシ事象NK603×MON89034
を保有するトランスジェニックF1ハイブリッド植物を比較用に対照として使用した。
剤処理のうちの1つを使用した:(1)0.32lb ai/ac(4倍)のキザロホッ
プ‐P(Assure II)+0.25体積%の非イオン性界面活性剤(NIS)をV
E~V2生育段階において散布し、続いて同じものをV4生育段階に、続いて同じものを
V8生育段階において散布する;(2)0.64lb ai/ac(8倍)のキザロホッ
プ‐P+0.25体積%のNISを、VE~V2生育段階において散布し、続いて同じも
のをV4生育段階に、続いて同じものをV8生育段階において散布する;(3)1.28
lb ai/ac(16倍)のキザロホップ‐P+0.25体積%のNISを、VE~V
2生育段階において散布し、続いて同じものをV4生育段階に、続いて同じものをV8生
育段階において散布する;または(4)0.25lb ai/ac(1倍)のクレトジム
+0.25体積%のNISを、V8生育段階において散布する。作物薬害の適用後10~
14日目に、0~100のスケールでプロットを視覚的に評価した。「0」は無し、「1
00」は作物の完全破壊である。表14及び15は、それぞれV4またはV8生育段階に
おける除草剤散布後の平均薬害度を示す。
、MON‐HT6、またはMON‐HT7(いずれもCTPに作動可能に連結)を保有す
る植物は、キザロホップ‐Pに対する非常に良好な耐性を示し、V4及びV8の両方の生
育段階において、すべての散布量にわたって15%未満の薬害度を示す。CTPに作動可
能に連結したMON‐HT55を保有する植物は、中程度~弱い耐性を示し、0.8~7
8.8%の薬害度であった。キザロホップ‐P散布後の対照植物の薬害度は99.5%で
あった。これらの結果は、CTPに作動可能に連結したMON‐HT1、MON‐HT2
、MON‐HT3、MON‐HT4、MON‐HT5、MON‐HT6またはMON‐H
T7を保有する植物が、キザロホップ‐Pの連続的な散布に対する極めて良好な耐性を有
することを示している。
は、作動可能に連結したCTPを含まないMON‐HT1またはMON‐HT2を保有す
る植物よりもキザロホップ‐Pに対する耐性がより良好であった。すべてのキザロホップ
‐P散布にわたって、作動可能に連結したCTPを含まないMON‐HT1を保有する植
物の薬害度が3.3%~18.8%であったのに対し、作動可能に連結したCTPを含む
MON‐HT1を保有する植物の薬害度は0~5.5%であった。すべてのキザロホップ
‐P散布にわたって、作動可能に連結したCTPを含まないMON‐HT2を保有する植
物の薬害度が16.3%~82.5%であったのに対し、作動可能に連結したCTPを含
むMON‐HT2を保有する植物は1.5%~10%であった。図5は、キザロホップ‐
P散布(処理3)の10~14日後に1.28lb ai/ac(16倍)のキザロホッ
プ‐P+0.25体積%のNISを、VE~V2生育段階において散布し、続いて同じも
のをV4生育段階に、続いて同じものをV8生育段階に散布した場合の、CTPを作動可
能に連結したMON‐HT2を保有する植物(図5A)及びCTPを含まないMON‐H
T2を保有する植物(図5B)を示す。対照植物は生存せず、CTPを含まないMON‐
HT2を保有する植物は中程度~低い耐性を有し、CTPに作動可能に連結したMON‐
HT2を保有する植物は、キザロホップ‐P散布に対して頑健な耐性を有していた。これ
らの結果は、作動可能に連結したCTPの使用が、キザロホップ‐P耐性を大きく向上さ
せることを裏付けた。
ム(0.25lb ai/ac)の散布に対し、90%を超える薬害度を有していた。こ
のことは、改変タンパク質を有するトランスジェニック植物において、この除草剤を、自
生植物防除のために使用できることを示している。
使用した:(1)2lb ae/ac(2倍)の2,4‐Dアミン+0.25体積%の非
イオン性界面活性剤(NIS)を、VE~V2に、続いてV4に、続いてV8に散布する
;(2)4lb ae/ac(4倍)の2,4‐Dアミン+0.25体積%のNISを、
VE~V2に、続いてV4に、続いてV8に散布する;(3)8lb ae/ac(8倍
)の2,4‐Dアミン+0.25体積%のNISを、VE~V2に、続いてV4に、続い
てV8のトウモロコシに散布する;または(4)16lb ae/ac(16倍)の2,
4‐Dアミン+0.25体積%のNISを、VE~V2に、続いてV4に、続いてV8に
散布する。上記のように、プロットを視覚的に評価した。表14及び15は、それぞれV
4またはV8生育段階における除草剤散布後の平均薬害度を示す。
に連結)を保有する植物は2,4‐Dに対して非常に良好な耐性を示し、V4及びV8生
育段階において、すべての散布量にわたって、それぞれ10%未満及び17%未満の薬害
度であった。MON‐HT3、MON‐HT4、MON‐HT5、またはMON‐HT7
(すべて作動可能にCTPに連結)を保有する植物は2,4‐Dに対する良好な耐性を示
し、V4及びV8生育段階において、すべての散布量にわたって、それぞれ20%未満及
び22%未満の薬害度であった。CTPに作動可能に連結したMON‐HT55を保有す
る植物は、中程度~低い耐性を示し、7.5%~66%の薬害度であった。2,4‐D散
布後の対照植物の薬害度は、40%~82.2%の範囲内にあった。これらの結果は、M
ON‐HT1、MON‐HT2、MON‐HT3、MON‐HT4、MON‐HT5、M
ON‐HT6、またはMON‐HT7を保有する植物が2,4‐Dの連続散布に対して良
好な耐性を有することを示している。
は、全般的に、作動可能に連結したCTPを含まないMON‐HT1またはMON‐HT
2を保有する植物と比較して、キザロホップ‐P散布で認められたような顕著な差異を2
,4‐D耐性において示さなかった。すべての2,4‐D散布にわたって、作動可能に連
結したCTPを含まないMON‐HT1を保有する植物の薬害度が0~13.8%であっ
たのに対し、作動可能に連結したCTPを含むMON‐HT1を保有する植物の薬害度は
、0~16.3%であった。すべての2,4‐D散布にわたって、作動可能に連結したC
TPを含まないMON‐HT2を保有する植物の薬害度が1.3~21.3%であったの
に対し、作動可能に連結したCTPを含むMON‐HT2を保有する植物の薬害度は、1
.3~15%であった。しかしながら、V4生育段階における2,4‐D散布後の、作動
可能に連結したCTPを含むMON‐HT2を保有する植物(8倍量において4.5%、
16倍量において7.5%の薬害度)と、CTPを含まない植物(8倍量において13.
75%、16倍量において21.25%の薬害度)との差異は注目に値する。
チドの評価
各種の葉緑体標的化ペプチド(CTP)を評価するために、単子葉植物での発現用に最
適化したMON‐HT1(配列番号:16)、MON‐HT2(配列番号:20)、及び
MON‐HT8(配列番号:39)、MON‐HT9(配列番号:42)、またはMON
‐HT10(配列番号:45)をコードする組換えDNA分子を含む植物形質転換ベクタ
ーを構築した。ベクターは、同一の組合せのプロモーター、リーダー、イントロン、及び
3′‐UTRを用いて作製し、ただし、3種の別個のCTP(A、B、またはC)のうち
の1種をタンパク質コード配列に作動可能に連結するか、またはCTPを連結せずに作製
した。表16参照。このDNA構築物を使用して、Agrobacterium tum
efaciens及び当技術分野で公知の標準的方法を用いて未成熟トウモロコシ(LH
244)胚を形質転換した。再生したR0トランスジェニック幼植物体を温室内で栽培し
た。R0植物を自家受粉させ、R1ホモ接合性種子を生成した。R0植物は、トウモロコ
シ事象MON89034を有する近交系植物と交配させるための雄性植物としても使用し
、形質有効性圃場試験のための分離F1ハイブリッド種子を生成した。
交系トランスジェニック植物(R2またはR4世代)を用いて2箇所で実施した。これら
の圃場試験では、下記の2種の除草剤処理のうちの一方を使用した:(1)0.16lb
ai/ac(2倍)のキザロホップ‐P(Assure II)+0.25体積%の非
イオン性界面活性剤(NIS)を、V4生育段階に散布し、続いて同じものをV8生育段
階に散布する;または(2)2lb ae/ac(2倍)の2,4‐Dアミン+0.25
体積%の非イオン性界面活性剤(NIS)をV4に、続いてV8に散布する。V4及びV
8散布の10~14日後に、薬害度(V4(CIPV4)またはV8(CIPV8)にお
ける作物薬害の割合)を測定した。誤差はLSD(0.05)を用いて計算した。その結
果、これらの植物が、V4及びV8散布に続く2倍量のキザロホップ‐Pまたは2,4‐
Dの連続散布に対して耐性を有し、10%未満の薬害度であったことが明らかになった。
表16参照。
T8をコードするトランスジーン・カセットを保有する植物から葉試料を採取し、改変タ
ンパク質をコードするトランスジーン・カセットから転写されたmRNAの発現を測定し
た。葉試料抽出物に対してQuantigene(登録商標)分析を行い、トランスジー
ン・カセットのmRNA発現を測定した。これらのアッセイでは、プローブは、トランス
ジェニック植物を作製するために使用する各発現カセットに存在する共通の3′‐UTR
配列に対してのものであった。相対的発現を、トウモロコシ・ハウスキーピング遺伝子に
対して正規化することによって計算した。トランスジェニック植物の作製に使用する各構
築体構成に関し、8つの植物のそれぞれから葉試料を採集した。報告する相対的mRNA
発現データは、8つの試料の平均であり、標準誤差を有する。
かをコードするトランスジーン構築物を保有する植物では、『A』または『B』のCTP
のいずれかを含む構築物が、CTPを含まない構築物や『C』のCTPを含む構築物に比
べて、より高い相対的トランスジーンmRNA発現を有していた。MON‐HT8(配列
番号:37)をコードするトランスジーン構築物を保有する植物では、3つのCTP(A
、B、またはC)のいずれかを含む構築物が、同様の高い相対的トランスジーンmRNA
発現を有していた。表17参照。
試験を、トウモロコシ事象MON89034を保有する近交系植物と、作動可能に連結し
たCTP配列を含むMON‐HT1、MON‐HT2、MON‐HT8、MON‐HT9
、及びMON‐HT10を保有するR1植物とを交配させることによって産生したF1ハ
イブリッド・トランスジェニック植物をそれぞれ用いて、1カ所で実施した。トウモロコ
シ事象NK603×MON89034を保有するトランスジェニックF1ハイブリッド植
物を比較用に対照として使用した。
用した:(1)0.32lb ai/ac(4倍)のキザロホップ‐P(Assure
II)+0.25体積%の非イオン性界面活性剤(NIS)を、VE~V2生育段階で散
布し、続いて同じものをV4生育段階に、続いて同じものをV8生育段階に散布する;(
2)0.64lb ai/ac(8倍)キザロホップ‐P+0.25体積%のNISを、
VE~V2生育段階で散布し、続いて同じものをV4生育段階に、続いて同じものをV8
生育段階に散布する;または(3)1.28lb ai/ac(16倍)のキザロホップ
‐P+0.25体積%のNISを、VE~V2生育段階で散布し、続いて同じものをV4
生育段階に、続いて同じものをV8生育段階で散布する。上記のように、プロットを視覚
的に評価した。表18は、V4(CIPV4)またはV8(CIPV8)生育段階におけ
る除草剤散布後の平均薬害度をそれぞれ示す。すべてのキザロホップ‐P散布後の対照植
物の薬害度は100%であった。誤差はLSD(0.05)を用いて計算した。
1を保有する植物は、作動可能に連結したCTPを含まないMON‐HT1を保有する植
物よりもキザロホップ‐Pに対する耐性がより良好であった。作動可能に連結した『A』
のCTPを含むMON‐HT1を保有する植物は、すべてのキザロホップ‐P散布におい
て0~15%の薬害度を有していた。作動可能に連結した『B』のCTPを含むMON‐
HT1を保有する植物は、すべてのキザロホップ‐P散布において2.5~20%の薬害
度を有していた。すべてのキザロホップ‐P散布において2.5%~37.5%の薬害度
を有していた作動可能に連結したCTPを含まないMON‐HT1を保有する植物に対し
、作動可能に連結した『C』のCTPを含むMON‐HT1を保有する植物は、すべての
キザロホップ‐Pの散布において0~20%の薬害度を有していた。
2を保有する植物は、作動可能に連結したCTPを含まないMON‐HT2を保有する植
物よりもキザロホップ‐Pに対する耐性がより良好であった。作動可能に連結した『A』
のCTPを含むMON‐HT2を保有する植物は、すべてのキザロホップ‐P散布におい
て0~15%の薬害度を有していた。作動可能に連結した『B』のCTPを含むMON‐
HT2を保有する植物は、すべてのキザロホップ‐P散布において0~20%の薬害度を
有していた。作動可能に連結した『C』のCTPを含むMON‐HT2を保有する植物は
、すべてのキザロホップ‐P散布において0~20%の薬害度を有していた。それに対し
、作動可能に連結したCTPを含まないMON‐HT2を保有する植物は、すべてのキザ
ロホップ‐P散布において35~70%の薬害度を有していた。
有する植物は、作動可能に連結した『C』のCTPを含むMON‐HT8を保有する植物
よりもキザロホップ‐Pに対する耐性がより良好であった。作動可能に連結した『A』の
CTPを含むMON‐HT8を保有する植物は、すべてのキザロホップ‐P散布において
15~60%の薬害度を有していた。作動可能に連結した『B』のCTPを含むMON‐
HT8を保有する植物は、すべてのキザロホップ‐P散布において5~35%の薬害度を
有していた。それに対し、作動可能に連結した『C』のCTPを含むMON‐HT8を保
有する植物は、すべてのキザロホップ‐P散布において45%~85%の薬害度を有して
いた。
2を保有する植物、及び作動可能に連結した『A』のCTPを含むMON‐HT9または
MON0HT10を保有する植物は、3種の作動可能に連結したCTPのいずれかを含む
MON‐HT8を保有する植物よりもキザロホップ‐Pに対する耐性がより良好であった
。作動可能に連結した『A』のCTPを含むMON‐HT9またはMON‐HT10を保
有する植物は、すべての散布にわたってキザロホップ‐Pに対する耐性を有し、これは3
種の作動可能に連結したCTPのいずれかを含むMON‐HT1またはMON‐HT2を
保有する植物に匹敵するものであった。最大量(16倍)のキザロホップ散布において、
作動可能に連結した『A』のCTPを含むMON‐HT1またはMON‐HT2を保有す
る植物は、作動可能に連結した『B』または『C』のCTPを含む、MON‐HT1また
はMON‐HT2を保有する植物よりもわずかに高い耐性を有していた。
(1)4lb ae/ac(4倍)の2,4‐Dアミン+0.25体積%のNISを、V
E~V2に散布し、続いてV4に、続いてV8に散布する;(2)8lb ae/ac(
8倍)の2,4‐Dアミン+0.25体積%のNISを、VE~V2に散布し、続いてV
4に、続いてV8のトウモロコシに散布する;または(3)16lb ae/ac(16
倍)の2,4‐Dアミン+0.25体積%のNISを、VE~V2に散布し、続いてV4
に、続いてV8に散布する。上記のようにプロットを視覚的に評価した。
剤散布後のトウモロコシにおける平均薬害度をそれぞれ示す。すべての2,4‐D散布後
の対照植物の薬害度は、80%~96.25%の範囲内にあった。V8に散布した最大量
の2,4‐D(16倍)において、3種のCTP(A、B、またはC)のいずれかに作動
可能に連結したMON‐HT1またはMON‐HT2を保有する植物は、CTPに作動可
能に連結していないMON‐HT1またはMON‐HT2を保有する植物よりも良好な耐
性を有していた。試験したすべての散布にわたって、作動可能に連結したCTPを含むま
たは含まないMON‐HT1、MON‐HT2またはMON‐HT8を保有する植物は、
作動可能に連結した『A』のCTPを含むMON‐HT9またはMON‐HT10のいず
れかの植物よりも、2,4‐Dに対する耐性がより良好であった。2,4‐D散布の範囲
を超えて、耐性の相対的順位は:MON‐HT1を保有する植物がMON‐HT2を保有
する植物より良好であり、MON‐HT2を保有する植物がMON‐HT8を保有する植
物より良好であった。キザロホップ‐P加圧試験のデータと合致する点として、作動可能
に連結した『A』のCTPを含むMON‐HT1、MON‐HT2、またはMON‐HT
8を保有する植物は、数値的にわずかであり統計学的に有意とは言えないが、『B』及び
『C』の輸送ペプチドに比べ、わずかに良好であった。誤差はLSD(0.05)を用い
て計算した。
トランスジェニック・ダイズにおける分析のために、2つの改変タンパク質を選択した
。双子葉植物発現用に最適化したコドン使用頻度を用いてMON‐HT1(配列番号:1
4)及びMON‐HT2(配列番号:18)を発現させるために、当業者に公知の方法を
用いてDNA構築物を作製した。これらのDNA構築物において、エンハンサー、プロモ
ーター、リーダー、イントロン、CTP、及び3′UTRを様々な組合せで、改変タンパ
ク質に作動可能に連結した。これらのDNA構築物を使用して、Agrobacteri
um tumefaciens及び当該分野で公知の標準的な方法を用いてダイズを形質
転換した。再生したR0トランスジェニック幼植物体を温室内で栽培した。三つ葉の生育
段階1~2における形質転換から約9週間後、単一コピーのR0事象を同定し、0.5倍
(0.375lb ae/ac)、2倍(1.5lb ae/ac)、または4倍(3.
0lb ae/ac)の2,4‐D除草剤を噴霧した。除草剤散布の約2週間後、植物を
1~3のスケールで除草剤薬害度について評価した。ここで、1=軽微な薬害~薬害なし
(<20%)、2=中程度の薬害(20~50%)及び3=重度の薬害(>50%)であ
る。
害なし(<20%)または中程度の薬害(20~50%)を有していた。データを表20
に示す。これは、改変タンパク質MON‐HT1及びMON‐HT2が、ダイズ植物にお
いて2,4‐Dに対する耐性を付与し得ることを示した。
トランスジェニック・ダイズにおいて分析するために選択した。コドン使用頻度を双子葉
植物発現用に最適化させたMON‐HT13(配列番号:47)、MON‐HT14(配
列番号:48)、MON‐HT15(配列番号:49)、MON‐HT17(配列番号:
51)、及びMON‐HT18(配列番号:52)を発現するためのDNA構築物を作製
した。作動可能に連結した発現エレメント(プロモーター、リーダー、イントロン、CT
P、及び3′UTR)は、すべての構築物において同一であった。R0幼植物体から葉試
料を採取し、単一コピーの植物をPCRベースのアッセイを用いて同定した。単一コピー
のR0植物が約2~3枚の三つ葉を有する時に、これらを1.5lb ae/ac(2倍
)または3.0lb ae/ac(4倍)の2,4‐Dのいずれかで処理した。除草剤散
布の7日後、上記のように、薬害を示した植物の面積%に基づいて除草剤薬害度を採点し
た。
MON‐HT14、MON‐HT15、MON‐HT17、及びMON‐HT18)のい
ずれかを保有するダイズ植物は、単一コピー植物のうちの2種を除くすべてにおいて薬害
度が<20%であることから証明されるように、2,4‐D処理に対する優れた耐性を示
した;これらの2つの事象(一つはMON‐HT13、及びもう一つはMON‐HT18
に対してのもの)は、20~30%の薬害度を有していた。MON‐HT1を保有する1
1種の単一コピー植物の4倍量散布において、5種の植物が<20%の薬害スコアを有し
、6種の植物が20~50%の薬害スコアを有していた。MON‐HT13を保有する1
1種の単一コピー植物のうち、10種の植物が<20%の薬害スコアを有し、1種の植物
が20~50%の薬害スコアを有していた。MON‐HT14を保有する8種の単一コピ
ー植物のうち、6種の植物が<20%の薬害スコアを有し、1つの植物が20~50%の
薬害スコアを有し、1つの植物が>50%の薬害スコアを有していた。MON‐HT15
を保有する7種の単一コピー植物のうち、5種の植物が<20%の薬害スコアを有し、1
種の植物が20~50%の薬害スコアを有し、1種の植物が>50%の薬害スコアを有し
ていた。MON‐HT17を保有する11種の単一コピー植物のうち、11種の植物すべ
てが<20%の薬害スコアを有していた。MON‐HT18を保有する12種の単一コピ
ー植物のうち、9種の植物は<20%の薬害スコアを有し、3種の植物は20~50%の
薬害スコアを有していた。これらの結果は、MON‐HT1(配列番号:14)、MON
‐HT13(配列番号:47)、MON‐HT14(配列番号:48)、MON‐HT1
5(配列番号:49)、MON‐HT17(配列番号:51)、またはMON‐HT18
(配列番号:52)を保有するダイズ植物は、4倍量の散布において2,4‐Dに対する
耐性を有していたことを示している。さらに、これは、MON‐HT1(配列番号:14
)に比べて、MON‐HT13(配列番号:47)、MON‐HT14(配列番号:48
)、MON‐HT15(配列番号:49)、MON‐HT17(配列番号:51)、また
はMON‐HT18(配列番号:52)を保有するダイズ植物が、4倍量で散布した2,
4‐Dに対してより高い耐性を有していたことを示している。<20%の薬害度を有する
単一コピー植物の割合に基づいて、MON‐HT13またはMON‐HT17を保有する
ダイズ植物は、MON‐HT1、MON‐HT14、MON‐HT15、またはMON‐
HT18を保有するダイズ植物に比べ、4倍量で散布した2,4‐Dに対する耐性がより
良好であった。表21参照。
る耐性
MON‐HT1を保有するトウモロコシ及びダイズ植物の、2,4‐D、フルロキシピ
ル、トリクロピル、及びMCPAの散布に対する耐性を測定した。MON‐HT1及び『
A』のCTPを含む3種のユニークな事象のF1ハイブリッド・トウモロコシ種子と、R
2ダイズ種子とをポットに植えた。NK603×MON89034を有するハイブリッド
・トウモロコシ種子及び植物形質転換に使用したものと同じダイズ生殖質を対照として使
用した。温室で植物を栽培し、4本の植物を各処理に使用した。植物が6~8インチ(ダ
イズ)及び10~12インチ(トウモロコシ)の高さにあるときに、生育室内で除草剤を
植物に噴霧し、最適な生育条件を維持するようにプログラムされた温室に移した。
ミン4(1680g ae/ha)(2)トリクロピル(840g ae/ha、GAR
LON(登録商標));(3)フルロキシピル(840g ae/ha、Starane
(登録商標));または(4)MCPA(g ae/ha 1680)。以下のトリクロ
ピル、フルロキシピル、またはMCPAの散布後、ダイズに認められた主要な症候は、重
度の壊死及び上偏生長であった。0%~100%の評価尺度で、すべての処理について視
覚的な植物薬害度評価を行った。ここで、0%は未処理対照と同等の植物を表し、100
%は完全に枯死した植物を表していた。すべての評価は、処理後7日目に行った。3種す
べてのダイズMON‐HT1事象の植物は、2,4‐Dアミン(2,4‐D)に対して良
好な耐性を示し、対照が90~97%の作物薬害度であったのに対し、平均7%未満の作
物薬害度であった。いずれのダイズ事象も、トリクロピルまたはフルロキシピルに対して
耐性を示さず、対照の作物薬害度91%に対し、3種の事象すべてにわたって作物薬害度
は平均81~97%であった。3種のダイズ事象の1つはMCPAに対して弱い耐性を示
し、対照の薬害度90%に対し、平均薬害度は72%であったが、一方で他の2つの事象
の作物薬害度は90%であった。表22参照。
‐Dアミン4(3360g ae/ha)(2)トリクロピル(1680g ae/ha
、GARLON(登録商標));(3)フルロキシピル(1680g ae/ha、St
arane(登録商標));または(4)MCPA(g ae/ha 3360)。トリ
クロピル、フルロキシピル、またはMCPAをトウモロコシに散布した後の主な症候は、
倒伏であった。3種すべてのトウモロコシMON‐HT1事象の植物は、2,4‐Dに耐
性があり、対照の作物薬害度43%に対し、平均15%未満の薬害度であった。これら3
種のMON‐HT1トウモロコシ事象は、トリクロピルに対してある程度の弱い耐性を示
し、対照の作物薬害度47%に対し、平均26%~37%の作物薬害度を有していた。3
種のMON‐HT1トウモロコシ事象は、フルロキシピルに対してある程度の弱い耐性を
示し、対照の作物薬害度55%に対し、平均20%~21%の作物薬害度を有していた。
2種のMON‐HT1トウモロコシ事象はMCPAに対して良好な耐性を示し、対照の作
物薬害度31%に対し、平均6%未満の作物薬害度を有していた。第3のトウモロコシM
ON‐HT1事象の平均薬害度は20%であった。表23参照。トリクロピル及びフルロ
キシピルに対する弱い耐性ならびにMCPAに対する良好な耐性というこれらの結果は、
精製MON‐HT1酵素を用いた生体外での酵素データに合致するものであった。
Claims (3)
- 配列番号1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43、及び46~52からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも92%の同一性を有するポリペプチドであって、トランスジェニック植物に除草剤耐性を付与する前記ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、AOPP除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤からなる群から選択される少なくとも一種の除草剤に対してオキシゲナーゼ活性を有する、請求項1に記載のポリペプチド。
- 葉緑体輸送ペプチドに連結する、請求項1または2に記載のポリペプチド。
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