JP7291735B2

JP7291735B2 - 高速デジタルホログラフィーを用いた毒性テストのための心拍数モニタリング方法

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Publication number: JP7291735B2
Application number: JP2021015900A
Authority: JP
Inventors: イクファンクォン; テゴルイ; サンウォンイ
Original assignee: Korea Research Institute of Standards and Science KRISS
Current assignee: Korea Research Institute of Standards and Science KRISS
Priority date: 2020-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2023-06-15
Anticipated expiration: 2041-02-03
Also published as: JP2021124731A; KR102427969B1; KR20210098829A

Description

本発明は、高速デジタルホログラフィーを用いた毒性テストのための心拍数モニタリング方法に関し、より詳細には、ミジンコ、ゼブラフィッシュ（ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）、ブラインシュリンプ（ｂｒｉｎｅｓｈｒｉｍｐ）などを含む開放型循環系水中生物の心拍数モニタリング方法に関する。

ゼブラフィッシュまたはミジンコのような水生生物の動的行動変化は、生態毒性学、環境安全およびナノ動力学分野などにおいて広範に研究されてきた。ミジンコは、狭い空間で多数を培養できる点と短い成長時間により、マイクロサイズのバイオ試験に適する。また、これらの培養環境が国際標準水中毒性評価指針に明示されていることから、共同研究にも有利な点として作用してきた。ミジンコを用いた心臓毒性評価は、ナノ粒子または、活性酸素（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）に関する興味深い結果を示しており、ミジンコを用いた心拍数の変化は、ヒトと同一でない可能性もあるが、化合物またはナノ粒子の抗酸化薬物検査のような一般的な代謝過程に対する影響を確認することができた。

ペトリディッシュまたはウェルプレート上に少量浸漬された培地に配置されたミジンコの心拍数は、通常、顕微鏡を通じて目で観察され、現在も広く使用されている。かかる方法は、実験者の動的視力によって正確度が低いという問題があり、これに対する改善が必要である。最近、位相顕微鏡を用いて前記問題点を解決しようとしているが、長時間実験中に生成されたイメージがコンピュータのメモリーおよびデータストレージを占める規模が膨大で適しないという問題があり、これに対する改善も切実になっている。

ＬｏｖｅｒｎＳＢｅｔａｌ．ＢｅｈａｖｉｏｒａｌａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌＢｅｈａｖｉｏｒａｌａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈａｎｇｅｓｉｎＤａｐｈｎｉａｍａｇｎａｗｈｅｎＥｘｐｏｓｅｄｔｏＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ（ＴｉｔａｎｉｕｍＤｉｏｘｉｄｅ，Ｎａｎｏ－Ｃ６０，ａｎｄＣ６０ＨｘＣ７０Ｈｘ）．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４１，４４６５－４４７０（２００７）．ＫｉｍＢＳｅｔａｌ．，Ｓｔｉｍｕｌｕｓ－ＲｅｓｐｏｎｓｉｖｅＡｎｔｉ－ＯｘｉｄｉｚｉｎｇＤｒｕｇＣｒｙｓｔａｌｓａｎｄｔｈｅｉｒＥｃｏｌｏｇｉｃａｌＩｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｓｍａｌｌ１５，１－１１（２０１９）．

上記のような問題を解決するために、本発明は、水中生物の心拍数を長時間実時間で測定し、これをモニタリングすることができる心拍数の実時間測定による個体反応評価方法を提供する。

また、本発明は、水中生物の動きを自然に固定させる水中環境を模擬したチャンバと、これを含む水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価装置を提供する。

本発明による水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法は、デジタルホログラフィーを用いた個体反応評価方法であって、（ａ）チャンバ（ｃｈａｍｂｅｒ）内部の下端に固定された下部固定部と、前記下部固定部と離隔して下部固定部方向またはその反対方向に移動可能な上部固定部との間に測定個体が個体反応誘導のための化合物が添加された培養用液体に浸るように配置し、前記上部固定部を個体に密着させて個体の高さを測定した後、上部固定部の位置を調整して前記個体を固定するステップと、（ｂ）前記個体に対するデジタルホログラム（ｄｉｇｉｔａｌｈｏｌｏｇｒａｍ）を連続して測定するステップと、（ｃ）前記測定により得られたデジタルホログラムを復元して、心拍数の変化を計算し、これより前記個体反応誘導のための化合物による個体反応誘発の可否を判断するステップとを含む。

本発明の一例による水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法であって、前記（ａ）ステップは、培養用液体が担持されたチャンバ（ｃｈａｍｂｅｒ）内部の下端に固定された下部固定部と、前記下部固定部と離隔して、下部固定部方向またはその反対方向に移動可能な上部固定部との間に前記液体に浸るように測定対象個体を配置し、前記上部固定部を個体に密着させて個体の高さを測定した後、上部固定部の位置を調整して前記個体を固定するステップと、前記チャンバに個体反応誘導のための化合物を添加するステップとを含むことができる。

本発明の一例による水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法であって、前記（ａ）ステップは、個体反応誘導のための化合物が添加された培養用液体が担持されたチャンバ（ｃｈａｍｂｅｒ）内部の下端に固定された下部固定部と、前記下部固定部と離隔して、下部固定部方向またはその反対方向に移動可能な上部固定部との間に前記液体に浸るように測定対象個体を配置し、前記上部固定部を個体に密着させて個体の高さを測定した後、上部固定部の位置を調整して前記個体を固定するステップとを含むことができる。

本発明の一例による水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法であって、前記上部固定部の位置を調整して固定した後、下部固定部と上部固定部との距離は、測定対象個体の高さに対して０．９２～０．９５の割合であってもよい。

本発明の一例による水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法であって、前記化合物は、有機化合物、金属、酸－アルカリ、ガス、医薬品、またはナノ粒子であってもよい。

本発明の一例による水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法であって、前記化合物は、ジメチルホルムアミド、メタノール、メチルイソブチルケトン、ベンゼン、四塩化炭素、スチレン、シクロヘキサン、アセトン、アセトアルデヒド、イソブチルアルコール、メチルクロライド、エチレングリコール、キシレン、トルエン、トルエン－２，４－ジイソシアネート、トリクロロエチレン、ｎ－ヘキサン、鉛、ニッケル、マンガン、水銀、亜鉛、アルミニウム、鉄、カドミウム、クロム、過酸化水素、酢酸、水酸化ナトリウム、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、アンモニア、塩素、オゾン、硫化水素、一酸化炭素、二酸化硫黄、二酸化窒素、医薬品、金ナノ、銀ナノ、ＳＷＣＮＴ（ｓｉｎｇｌｅ－ｗａｌｌｅｄｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅ）、ＭＷＣＮＴ（ｍｕｌｔｉ－ｗａｌｌｅｄｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅ）、フラーレン（ｆｕｌｌｅｒｅｎｅ、Ｃ_６０）、鉄ナノ粒子、カーボンブラック、二酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化セリウム、酸化亜鉛、二酸化珪素、ポリスチレン、デンドリマー、およびナノクレイから選択されてもよい。

本発明の一例による水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法であって、固体は、０．０１～０．１０ｍＭの濃度の化合物で処理してもよい。

本発明の一例による水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法であって、前記復元のためのアルゴリズムは、二次元復元された時間差相対位相地図（２Ｄ－ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ－ｒｅｌａｔｉｖｅｐｈａｓｅｍａｐ）を実時間で表示し、心拍数（ｈｅａｒｔｒａｔｅ）を同時に格納するステップをさらに含んでもよい。

本発明の一例による水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法であって、前記心拍数は、ａ）確保したデジタルホログラムで心臓領域に相当するピクセルを選別するステップと、ｂ）それぞれのリフレッシュ間隔（ｒｅｆｒｅｓｈｉｎｇｉｎｔｅｒｖａｌ）にフーリエスペクトル方法（Ｆｏｕｒｉｅｒｓｐｅｃｔｒｕｍｍｅｔｈｏｄ）を適用するステップと、ｃ）それぞれのリフレッシュ間隔（ｒｅｆｒｅｓｈｉｎｇｉｎｔｅｒｖａｌ）で最多頻度の心拍数（ｍｏｓｔｆｒｅｑｕｅｎｔｈｅａｒｔｒａｔｅ）を検索するステップと、ｄ）前記最多頻度の心拍数から１分当たりの心拍数を計算するステップとを含む分析方法により得られることができる。

本発明の一例による水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法であって、前記フーリエスペクトル方法を適用するステップは、下記の数学式によるｋ－空間（ｋ－ｓｐａｃｅ）角スペクトル法（ａｎｇｕｌａｒｓｐｅｃｔｒｕｍｍｅｔｈｏｄ）による値に基づいて得られてもよい。
［数学式ＩＩ］

［数学式ＩＩＩ］

本発明の一例による水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法であって、前記心拍数の変化は、最初心拍数（ｏｒｉｇｉｎａｌｈｅａｒｔｒａｔｅ、ＯＨＲ）および下記数学式による弛緩心拍数（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎｈｅａｒｔｒａｔｅ、ＲＨＲ）を計算して得られてもよい。
［数学式ＩＶ］

ここで、ｔ_ｉおよびｔ_ｆは、弛緩状態で最初および最後時間ドメインを意味する。

本発明による水中生物の心拍数の実時間（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）測定による個体反応評価装置は、デジタルホログラフィーを用いた水中生物の心拍数の実時間（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）測定による個体反応評価装置であって、前記個体反応評価装置は、培養用液体が担持されたチャンバと、下部固定部と、前記下部固定部と離隔された上部固定部と、前記上部固定部の位置を制御する制御部とを含み、前記下部固定部は、前記チャンバ内部の下端に固定され、前記上部固定部との間に測定対象個体が配置され、前記上部固定部は、前記チャンバの一側面に固定されて上下に移動可能であり、前記制御部は、前記上部固定部を個体に密着させて個体の高さを測定した後、上部固定部の位置を調整して前記個体を固定する。

本発明の一例による水中生物の心拍数の実時間（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）測定による個体反応評価装置であって、前記個体反応評価装置は、光源部と、参照光を生成する参照光生成部と、物体光を生成する物体光生成部と、前記参照光と物体光を結合してホログラムを記録するＣＣＤと、前記記録されたホログラムの干渉縞を数値的に分析する演算部と、前記演算部により数値的に分析されたデジタルホログラムを表示するディスプレイ部と、前記分析されたデジタルホログラムから心拍数分析を行う心拍数分析部とをさらに含み、前記演算部は、ＣＣＤに記録されたホログラムに対して多数個の位相復元相を取得し、これより振幅（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）および角度（ａｎｇｌｅ）を計算してディスプレイ部に伝達し、前記ディスプレイ部は、ＣＣＤに記録されたホログラムの復元イメージを実時間で表示した後、心拍数分析部に伝達し、前記心拍数分析では、最多頻度の心拍数から１分当たりの心拍数を計算することができる。

本発明の一例による水中生物の心拍数の実時間（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）測定による個体反応評価装置であって、前記制御部は、下部固定部と上部固定部との距離を測定対象個体の高さに対して０．８７～０．９５の割合で調整してもよい。

本発明の一例による水中生物の心拍数の実時間（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）測定による個体反応評価装置であって、前記制御部は、下部固定部と上部固定部との距離を測定対象個体の高さに対して０．９２～０．９５の割合で調整してもよい。

本発明の一例による水中生物の心拍数の実時間（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）測定による個体反応評価装置であって、前記個体反応評価装置は、水中生物の実時間心拍数、下部固定部と上部固定部の離隔間隔、時間差相対位相イメージの実時間ディスプレイ、弛緩心拍数（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎｈｅａｒｔｒａｔｅ）からなる群から選択される一つ以上のデータを同時に測定可能であってもよい。

本発明の一例による水中生物の心拍数の実時間（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）測定による個体反応評価装置であって、前記個体反応評価装置により同時に測定されたデータは、人工知能技法（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅｍｅｔｈｏｄ）を適用して繰り返し学習により蓄積させてもよい。

本発明の一例による水中生物の心拍数の実時間（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）測定による個体反応評価装置であって、前記繰り返し学習により高等生物での心拍数の変化を予測するために使用されてもよい。

本発明による水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法および水中生物の心拍数の実時間（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）測定による個体反応評価装置は、水中生物の心拍数の実時間測定のために、水中生物の生体に影響を与えず、動かないように効果的に固定することができ、これをデジタルホログラフィーを用いて測定して、心拍数をディスプレイしながら、当該データを長時間格納することができるデータフォーマットを構成することで、個体反応を誘導するための化合物で固体を処理した後、実時間で心拍数の変化を映像処理により確保した後、個体反応の誘導による有害性の有無を効果的に判別できるという効果がある。

本発明による水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法に関するフローチャートである。本発明による水中生物の心拍数の実時間測定のための個体反応評価装置のうち核心要素であるチャンバの構成に関する図である。本発明による水中生物の心拍数の実時間測定のための個体反応評価装置の概略図および具現例に関する概略図であり、（ａ）は、軸外デジタルホログラフィーであり、マッハ・ツェンダ（ＭａｃｈＺｅｈｎｄｅｒ）干渉計に基づくホログラフィー設定例、（ｂ）は、チャンバ、（ｃ）は、水中生物の心拍数の実時間測定のための個体反応装置の具現されたハードウェアを示す。本発明による水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法において、空間フィルタ方法を使用したデジタルホログラフィーの数値再構成過程に関する図である。本発明による水中生物の心拍数の実時間測定のための個体反応評価装置であり、再構成された時間分解位相分布（ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｉｍｅｒｅｓｏｌｖｅｄｐｈａｓｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を用いてミジンコの心拍数を分析した図である。本発明による水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法に関するフローチャートの段階別の詳細プロセスに関する図である。本発明による水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法により、過酸化水素０．００ｍＭ（青色）、０．０３ｍＭ（オレンジ色）、および０．０６ｍＭ（赤色）処理後、２時間経過したミジンコの心拍数を測定した結果を示す図である。本発明による水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法により、濃度別に２４時間露出後、弛緩心拍数（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎｈｅａｒｔｒａｔｅ、ＲＨＲ）の分析結果を示す図である。本発明による水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法と、従来通常使用されていた方法の相違点に関する比較結果を示す図である。

以下、添付の表または図面を参照して、本発明の水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法について詳細に説明する。

図面が示されている場合、これは、当業者に本発明の思想が充分に伝達されるようにするために例として提供されるものである。したがって、本発明は、提示される図面に限定されず、他の形態で具体化されてもよく、前記図面は、本発明の思想を明確にするために誇張して図示され得る。

第１、第２などの用語は、様々な構成要素を説明するために使用され得るが、前記構成要素は、前記用語によって限定されてはならない。前記用語は、一つの構成要素を他の構成要素から区別するためだけに使用される。例えば、本発明の権利範囲から逸脱しないとともに、第１構成要素は第２構成要素と称され得、同様に、第２構成要素も第１構成要素と称され得る。

この際、使用される技術用語および科学用語において他の定義がなければ、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が通常理解している意味を有し、下記の説明および添付の図面において本発明の要旨を不明瞭にし得る公知の機能および構成に関する説明は省略する。一般的に使用されている予め定義されているような用語は、関連技術の文脈上有する意味と一致する意味を有するものと解釈しなければならず、本出願で明白に定義されない限り、理想的であるか過剰に形式的な意味に解釈されない。

また、本発明の明細書で使用される単数形態は、文脈で特別な指示がない限り複数形態も含むことを意図し得る。

また、本発明の明細書で特別な言及なしに使用された単位は、重量を基準とし、一例として％または比の単位は、重量％または重量比を意味する。

また、本発明の明細書において、「含む」という表現は、「備える」、「含有する」、「有する」または「特徴とする」などの表現と等価の意味を有する開放型記載であり、さらに列挙されていない要素、材料または工程を排除しない。また、「実質的に…で構成される」という表現は、特定の要素、材料または工程とともに列挙されていなかった他の要素、材料または工程が発明の少なくとも一つの基本的で新規の技術的思想に許容できないほど著しい影響を及ぼさない量で存在し得ることを意味する。また、「構成される」という表現は、記載の要素、材料または工程のみが存在することを意味する。

本発明の明細書で使用されている用語、「成分」、「組成物」、「化合物の組成物」、「化合物」、「薬物」、「薬学的活性剤」、「活性剤」、「治癒」、「治療法」、「治療」または「薬剤」は、対象体（ヒトまたは動物）に投与される時に局所および／または全身作用によって所望の薬学的および／または生理学的効果を誘導する化合物または化合物（等）または物質の組成物を意味するために相互交換的に使用される。

本発明において、「サンプル」または「試料」は、分析のための対象を示すものであり、明細書にわたり同じ意味で使用されている。

以下、本発明の内容を実施例により、さらに具体的に説明する。実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の権利範囲は、これらによって限定されない。

以下、本発明の水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法について詳細に説明する。

前記（ａ）ステップは、培養用液体が担持されたチャンバ（ｃｈａｍｂｅｒ）内部の下端に固定された下部固定部と、前記下部固定部と離隔して、下部固定部方向またはその反対方向に移動可能な上部固定部との間に前記液体に浸るように測定対象個体を配置し、前記上部固定部を個体に密着させて個体の高さを測定した後、上部固定部の位置を調整して前記個体を固定するステップと、前記チャンバに個体反応誘導のための化合物を添加するステップとを含むことができ、また、前記（ａ）ステップは、個体反応誘導のための化合物が添加された培養用液体が担持されたチャンバ（ｃｈａｍｂｅｒ）内部の下端に固定された下部固定部と、前記下部固定部と離隔して、下部固定部方向またはその反対方向に移動可能な上部固定部との間に前記液体に浸るように測定対象個体を配置し、前記上部固定部を個体に密着させて個体の高さを測定した後、上部固定部の位置を調整して前記個体を固定するステップとを含むことができる。

この際、前記上部固定部の位置を調整して固定した後、下部固定部と上部固定部との距離は、測定対象個体の高さに対して、０．８７～０．９５、好ましくは０．８９～０．９５、さらに好ましくは０．９２～０．９５の割合であってもよい。

前記化合物は、有機化合物、金属、酸－アルカリ、ガス、医薬品、またはナノ粒子であってもよく、より具体的な一例示によると、ジメチルホルムアミド、メタノール、メチルイソブチルケトン、ベンゼン、四塩化炭素、スチレン、シクロヘキサン、アセトン、アセトアルデヒド、イソブチルアルコール、メチルクロライド、エチレングリコール、キシレン、トルエン、トルエン－２，４－ジイソシアネート、トリクロロエチレン、ｎ－ヘキサン、鉛、ニッケル、マンガン、水銀、亜鉛、アルミニウム、鉄、カドミウム、クロム、過酸化水素、酢酸、水酸化ナトリウム、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、アンモニア、塩素、オゾン、硫化水素、一酸化炭素、二酸化硫黄、二酸化窒素、医薬品、金ナノ、銀ナノ、ＳＷＣＮＴ（ｓｉｎｇｌｅ－ｗａｌｌｅｄｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅ）、ＭＷＣＮＴ（ｍｕｌｔｉ－ｗａｌｌｅｄｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅ）、フラーレン（ｆｕｌｌｅｒｅｎｅ、Ｃ_６０）、鉄ナノ粒子、カーボンブラック、二酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化セリウム、酸化亜鉛、二酸化珪素、ポリスチレン、デンドリマー、およびナノクレイなどから選択されてもよいが、これに限定されるものではなく、個体に対する細胞毒性を測定できるものであれば、その種類に関係なく適宜選択して使用することができる。

処理の際、前記化合物の濃度は特に制限されるものではないが、具体的な一例として、０．００１～０．５０ｍＭ、好ましくは０．００５～０．３０ｍＭ、さらに好ましくは０．０１～０．１０ｍＭの濃度で処理してもよい。

前記復元のためのアルゴリズムは、二次元分解された時間差相対位相地図（２Ｄ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ－ｒｅｌａｔｉｖｅｐｈａｓｅｍａｐ）を実時間で表示し、心拍数（ｈｅａｒｔｒａｔｅ）を同時に格納するステップをさらに含んでもよい。

前記心拍数は、ａ）確保したデジタルホログラムで心臓領域に相当するピクセルを選別するステップと、ｂ）それぞれのリフレッシュ間隔（ｒｅｆｒｅｓｈｉｎｇｉｎｔｅｒｖａｌ）にフーリエスペクトル方法（Ｆｏｕｒｉｅｒｓｐｅｃｔｒｕｍｍｅｔｈｏｄ）を適用するステップと、ｃ）それぞれのリフレッシュ間隔（ｒｅｆｒｅｓｈｉｎｇｉｎｔｅｒｖａｌ）で最多頻度の心拍数（ｍｏｓｔｆｒｅｑｕｅｎｔｈｅａｒｔｒａｔｅ）を検索するステップと、ｄ）前記最多頻度の心拍数から１分当たりの心拍数を計算するステップとを含む分析方法により得ることができる。

前記確保したデジタルホログラムＩ（ｘ、ｙ）は、物体光と干渉との光干渉信号を示す。本発明の一実施形態による空間マスキング方法（ｓｐａｃｉａｌｍａｓｋｉｎｇｍｅｔｈｏｄ）により、ホログラムイメージの二次元ＦＦＴ（ｆａｓｔＦｏｕｒｉｅｒｔｒａｎｓｆｏｒｍ）方法による個体波動場（ｏｂｊｅｃｔｗａｖｅ－ｆｉｅｌｄ）を定義する。

［数学式Ｉ］

前記式中、Ｕ_ｏおよびＵ_ｒは、それぞれ個体と参照の波動－場を示し、＊（ａｓｔｅｒｉｓｋ）は、共役複素数値（ｃｏｍｐｌｅｘｃｏｎｊｕｇａｔｅｖａｌｕｅ）と関連する。前記数学式Ｉを構成する４種の項のうち、前の二つの項は自己相関値（ａｕｔｏｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｔｅｒｍ）、三番目の項は実数イメージ項（ｒｅａｌｉｍａｇｅｔｅｒｍ）、四番目の項は虚数イメージ項（ｖｉｒｔｕａｌｉｍａｇｅｔｅｒｍ）をそれぞれ示す。前記方法を適用したことに関しては、本発明の一実施形態による図４の（ｂ）に記述した。

ホログラムにおいて距離ｚによる個体波動－場（ｏｂｊｅｃｔｗａｖｅ－ｆｉｅｌｄ）は、角度スペクトル方法（ａｎｇｕｌａｒｓｐｅｃｔｒｕｍｍｅｔｈｏｄ）を用いて数学的に計算可能であり、前記方法は、フーリエ変換により得られたホログラム平面Ｈと位相伝播因子（ｐｈａｓｅｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ）ｅｘｐ［ｉｋｚ］による波動伝播方法（ｗａｖｅｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）で取得することができる。

前記フーリエスペクトル方法を適用するステップは、下記の数学式によるｋ－空間（ｋ－ｓｐａｃｅ）角スペクトル法（ａｎｇｕｌａｒｓｐｅｃｔｒｕｍｍｅｔｈｏｄ）による値に基づいて得られ得る。

［数学式ＩＩ］

［数学式ＩＩＩ］

前記心拍数の変化は、最初心拍数（ｏｒｉｇｉｎａｌｈｅａｒｔｒａｔｅ、ＯＨＲ）および下記数学式による弛緩心拍数（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎｈｅａｒｔｒａｔｅ、ＲＨＲ）を計算して得られ得る。

［数学式ＩＶ］

様々な定量的位相イメージング方法のうち、デジタルホログラフィック顕微鏡（ｄｉｇｉｔａｌｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＤＨＭ）は、干渉イメージで物体波動場の振幅および位相情報を含む複雑な振幅で表現される地形情報を再構成できる。かかるデジタルホログラフィック顕微鏡の能力は、高速カメラで与えられた生物学的標本に存在する屈折率分布に対する再構成された位相情報を生成できることから実時間生物学的現象の測定に有利である。

図１には前記水中生物の実時間測定による個体反応評価方法に関する概略的なフローチャートが図示されている。

前記図面を参照すると、前記水中生物の実時間測定による個体反応評価方法は、設置ステップ（Ｓ１０１）と、イメージ確保ステップ（Ｓ１０２）と、データ演算ステップ（Ｓ１０３）と、ディスプレイステップ（Ｓ１０４）と、心拍数分析ステップ（Ｓ１０５）とを含む。

設置ステップ（Ｓ１０１）は、検査対象の水中生物をチャンバ内の下部固定部と上部固定部との間に位置させた後、固定するステップである。前記設置ステップ（Ｓ１０１）が完了した後、デジタルホログラフィー顕微鏡（ＤｉｇｉｔａｌＨｏｌｏｇｒａｐｈｉｃＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって前記水中生物に対する連続したイメージを取得し、ホログラムを作成する。

イメージ確保ステップ（Ｓ１０２）は、個体を通過した物体光（ｏｂｊｅｃｔｂｅａｍ）と光源部から照射された参照光（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｂｅａｍ）から生成された光干渉信号をＣＣＤカメラなどのユニットで撮影してホログラムを生成するステップを含む。光源部を作動させて物体光および参照光を生成し、ビームスプリッタを通じて生成された光干渉信号を撮影し、ホログラム映像を取得する。

データ演算ステップ（Ｓ１０３）は、取得したホログラム映像を復元し、複素振幅値を取得する。この際、複素振幅の変位（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）と位相角（ｐｈａｓｅａｎｇｌｅ）を計算する方法は、特に制限されるものではないが、一例として、角度スペクトル方法（Ａｎｇｕｌａｒｓｐｅｃｔｒｕｍｍｅｔｈｏｄ）を適用することができる。前記方法で復元されたデータに対する時間差位相値を計算する。

ディスプレイステップ（Ｓ１０４）は、前記データ演算ステップで復元されたデータの伝達を受けてこれをディスプレイ画面に実時間で表示し、心臓部位に相当する部位の場合、心拍数分析ステップに伝達され、１分当たりの心拍数の計算に活用される。

心拍数分析ステップ（Ｓ１０５）は、前記ディスプレイステップ（Ｓ１０４）で心臓部位に相当するものと判別されたデータの伝達を受け、１分当たりの心拍数を計算する。

本発明による水中生物の心拍数の実時間（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）測定による個体反応評価装置は、デジタルホログラフィーを用いた水中生物の心拍数の実時間（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）測定による個体反応評価装置であって、前記個体反応評価装置は、培養用液体が担持されたチャンバと、下部固定部と、前記下部固定部と離隔された上部固定部と、前記上部固定部の位置を制御する制御部とを含み、前記下部固定部は、前記チャンバ内部の下端に固定され、前記上部固定部との間に測定対象個体が配置され、前記上部固定部は、前記チャンバの一側面に固定され上下に移動可能であり、前記制御部は、前記上部固定部を個体に密着させて個体の高さを測定した後、上部固定部の位置を調整して前記個体を固定する。

前記個体反応評価装置は、光源部と、参照光を生成する参照光生成部と、物体光を生成する物体光生成部と、前記参照光と物体光を結合してホログラムを記録するＣＣＤと、前記記録されたホログラムの干渉縞を数値的に分析する演算部と、前記演算部により数値的に分析されたデジタルホログラムを表示するディスプレイ部と、前記分析されたデジタルホログラムから心拍数分析を行う心拍数分析部とをさらに含み、前記演算部は、ＣＣＤに記録されたホログラムに対して多数個の位相再生相を取得し、これより振幅（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）および角度（ａｎｇｌｅ）を計算してディスプレイ部に伝達し、前記ディスプレイ部は、ＣＣＤに記録されたすべてのホログラムに関する分析が完了するまで、相当するデジタルホログラムを選別して表示した後、心拍数分析部に伝達し、前記心拍数分析では、最多頻度の心拍数から１分当たりの心拍数を計算することができる。

前記制御部は、下部固定部と上部固定部との距離を測定対象個体の高さに対して、０．８７～０．９５の割合、好ましくは０．９２～０．９５の割合に調整してもよい。前記の割合で個体を固定することで、個体の血液循環などの新陳代謝に影響を与えないとともに、下部固定部と上部固定部との間に効率的に個体固定が可能な利点があるため好ましい。

前記個体反応評価装置は、水中生物の実時間心拍数、下部固定部と上部固定部の離隔間隔、心拍数位相の実時間ディスプレイ、弛緩心拍数（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎｈｅａｒｔｒａｔｅ）からなる群から選択される一つ以上のデータを同時に測定可能なものであってもよい。

前記個体反応評価装置により同時に測定されたデータは、人工知能技法（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅｍｅｔｈｏｄ）を適用して繰り返し学習により蓄積させてもよい。

前記繰り返し学習により高等生物での心拍数の変化を予測するために使用されてもよい。

図面により前記個体反応評価装置の核心の構成要素であるチャンバについてより詳細に説明すると、以下のとおりである。

図２の本発明による個体反応評価装置は、チャンバ１００内で、下部構造部１１０と上部構造部１２０との間に水中生物を固定可能にし、前記上部構造部は、制御部１３０によって水中生物に対する心拍数測定に影響を与えない範囲で、前記水中生物が動かないように上下に移動し、水中生物と密着する形態で固定される。

前記下部構造部１１０と上部構造部１２０は、物体光が透過され得る素材で形成され、ホログラム生成のための光の透過が行われる。

光源部は、図面に図示されていないが、チャンバの下方、下部構造部の下方に設置され、前記固定された個体に向かって物体光（ｏｂｊｅｃｔｂｅａｍ）を照射する物体光生成部（第１光源）と、前記物体光の光路上に参照光（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｂｅａｍ）を照射する参照光生成部（第２光源）とを備える。前記第１光源および第２光源は、一例として、レーザを使用することができるが、これに限定されるものではなく、前記レーザの波長も正常なホログラムを形成することができれば、その波長の範囲は、制限されるものではなく、一例として、６３３．２ｎｍであるレーザを使用することができる。

前記物体光と参照光の光路が互いに交差する地点にはビームスプリッタ（ｂｅａｍｓｐｌｉｔｔｅｒ）が設置され、前記個体と対物レンズを透過した物体光と前記参照光から光干渉信号を生成する。前記ビームスプリッタは、物体光と参照光との間に光干渉信号を生成するために、従来、デジタルホログラフィー顕微鏡に使用されるビームスプリッタであるため、これに関する詳細な説明は省略する。

前記ビームスプリッタの上側に光干渉信号の撮影のためのユニットが設置され、一例として、ＣＣＤカメラを使用することができるが、これに限定されるものではない。

図３は本発明による個体反応評価装置の例示として、軸外デジタルホログラフィーを使用する実時間心拍数モニタリングシステムを示す。

（ａ）は、マッハ・ツェンダ（Ｍａｃｈ－Ｚｅｈｎｄｅｒ）干渉計（Ｍａｃｈ－Ｚｅｈｎｄｅｒｉｎｔｅｒｏｍｅｔｅｒ）に基づく軸外デジタルホログラフィー設定の概略図を示し、光源としては、５ｍＷ出力の６３３．２ｎｍ波長のヘリウム－ネオンレーザ（Ｈｅ－Ｎｅｌａｓｅｒ；Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を使用する。対物レンズ（ｍｉｃｒｏｏｂｊｅｃｔｉｖｅｌｅｎｓ；１０ｘ／Ｎ．Ａ．０．３０、Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＵＭＰＬＦＬＮ１０ＸＷ）は、水中浸漬形態で使用され、３．５ｍＭの作動距離を有する。

物体光と干渉光の光干渉信号を撮影するＣＣＤカメラ（ａｃａ２０４０－１８０ｋｍ、Ｂａｓｌｅｒ）は、工場出荷基準解像度２０４８×２０４８およびピクセルサイズ５．５μｍ×５．５μｍにセットされて使用され、外部に連結されたデータ確保装置に連結されて露出時間２．５ｍｓで撮影に活用された。

［実施例］
チャンバにミジンコの浸漬および固定
前記図３の（ｂ）のような概略図を有するチャンバとデジタルホログラフィー装置を連結して（ｃ）のように具現した本発明による個体反応評価装置を用いて、ミジンコに対する毒性反応を試験した。

図２の１０～１５℃のアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅｇｅｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（または他の培地に代替可能）が担持されたチャンバ１００の下部構造部１１０と上部構造部１２０との間にミジンコを慎重に配置し、制御部１３０を作動させてミジンコの高さを測定するようにした後、前記ミジンコの高さの０．９５％になるように上部構造部の高さを制御して位置させた。この際、ミジンコの高さは５３８μｍと測定された。

デジタルホログラフィー顕微鏡を用いた心拍信号の生成
前記個体反応装置で外側デジタルホログラフィー方法を用いてＣＣＤカメラでミジンコのホログラムを撮影した。

その結果を図４に図示した。

イメージは、ピクセルサイズが０．５μｍ×０．５μｍであり、８ビットの解像度１０２４×１０２４で設定して撮影した。オレンジ色の点線の円で表示された心臓領域の最大信号強度の割合は０．０４７（ＳＲ＜５％）と測定された（図４の（ａ））。干渉イメージの二次元フーリエ変換（２ＤＦｏｕｒｉｅｒｔｒａｎｓｆｏｍ）によるｋ－ｓｐａｃｅイメージを得（図４の（ｂ））、ホログラムから７．６μｍで数値的に再構成された個体波動場強度分布（ｏｂｊｅｃｔｗａｖｅ－ｆｉｅｌｄｉｎｔｅｎｓｉｔｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を確保した。この際、前記再構成アルゴリズムは、角度スペクトル方法を使用した（図４の（ｃ））。図４の（ｄ）は数値的に再構成された物体（上）とミジンコなしに撮影された参照（下）個体波動場強度分布（ｏｂｊｅｃｔｗａｖｅ－ｆｉｅｌｄｉｎｔｅｎｓｉｔｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を示す。

参照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）波動場で個体波動－場を結合した後、ミジンコの位相分布を得た（図４の（ｅ））。この際、位相は、－πから＋πまでの範囲をカバーする。空間位相（ｓｐａｔｉａｌｐｈａｓｅ）は、試験片の厚さ（ｓｐｅｃｉｍｅｎｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）と屈折率（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅｉｎｄｅｘ）に比例するため、これよりミジンコ心臓領域の時間分解相対位相分布（ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄｒｅｌａｔｉｖｅｐｈａｓｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を得、これをオレンジ色の長方形で表示した（図４の（ｆ）図４の（ｈ））。

再構成された時間分解位相分布を使用したミジンコの心拍数分析
前記方法により得た心拍信号から、再構成された時間分解位相分布（ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｉｍｅｒｅｓｏｌｖｅｄｐｈａｓｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ）によってミジンコの心拍数を分析した。

その結果を図５に図示した。

２５フレーム間隔（０．１２５秒）で強度（上）、位相（中）、相対位相（下）分布から時間分解イメージセット（ｔｉｍｅｒｅｓｏｌｖｅｄｉｍａｇｅｓｅｔｓ）を比較した（図５の（ａ））。結果によると、ホログラムに比べて空間位相地図でミジンコの様子をより明確に認識することはできるが、ホログラムに比べて空間位相地図で心臓領域を区分することは難しい。

次いで、時間分解１次元心拍信号のラッピング（ＷＰ）、アンラッピング（ＵＷＰ）および相対的アンラッピング（ｒｅｌａｔｉｖｅｕｎｗａｐｐｅｄ）位相を比較した（図５の（ｂ））。結果によると、心臓領域がより明確に見え、これは、ミジンコをチャンバの下部構造部１１０と上部構造部１２０との間にミジンコの高さの９５％で固定することで、甲羅の空間位相が消滅したためと推測される。

心拍数分析は、周期的特性を評価するためにフーリエスペクトル方法（Ｆｏｕｒｉｅｒｓｐｅｃｔｒｕｍｍｅｔｈｏｄ）を使用した。図５の（ｃ）は１０００フレームセットの各ピクセルに対して繰り返した一次元フーリエスペクトル方法を使用してミジンコの二次元周波数分布（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を計算した。内部に含まれた図面は７．８Ｈｚ（白色の矢印）を有する地点でのフーリエスペクトルプロットであり、５秒間の心拍数は３８である。

実時間デジタルホログラフィーモニタリングシステムの具現
前記実施例１と同じ心拍数処理装置のフレームの割合（ｆｒａｍｅｒａｔｅ）に合致するように、実時間デジタルホログラフィーを観察することができる高性能のコンピュータシステムを構築した。

このために、３段階で行われるＦＦＴ（ｆａｓｔＦｏｕｒｉｅｒｔｒａｎｓｆｏｒｍ）演算に基づく畳み込み方法（ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）でデジタルホログラフィー再構成アルゴリズムを開発した。

前記アルゴリズムは、二次元時間－分解相対位相地図を実時間でディスプレイすることができるＧＵＩ（ｇｒａｐｈｉｃａｌｕｓｅｒｉｎｔｅｒｆａｃｅ）を備え、心拍信号をＧＰＵ（ｇｒａｐｈｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｕｎｉｔ）を用いた高速演算により格納するようにした（図６参照）。

前記ＧＰＵを用いた演算は、ｎＶｉｄｉａ社で支援するＣＵＤＡＦＦＴライブラリ（ｃｕＦＦＴ）を用いた並列コンピュータ演算方法により処理速度を極大化した。これにより、処理された時間分解相対位相地図を実時間でディスプレイ可能にした。

前記実時間デジタルホログラフィーモニタリングシステムの性能は、下記表１のとおりである。

また、本発明では、全体の干渉計イメージセット（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｉｃｉｍａｇｅｓｅｔｓ）の情報を要する従来のデジタルホログラフィー方法とは異なり、時間分解された心拍信号（ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄｈｅａｒｔｂｅａｔｓｉｇｎａｌ）のみを要することから、１０×１０ｐｉｘｅｌｓサイズの心臓領域の同じ心拍信号を格納するのに必要なデータ格納領域の時間当りのサイズを７０３ＧＢ／時間から３．４３ＭＢ／時間に２００，０００倍以上減少させるという驚くべき空間節約効果を果たし、これにより、長時間実時間デジタルホログラフィーをモニタリングできるという新たな効果が得られた。

過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）露出によるミジンコの心拍数モニタリング
前記実施例において、９０ｍＬＭ４培地が担持されたチャンバ１００にミジンコを前記のような方法で固定させた後、観察した。

観察２時間経過後、濃度がそれぞれ０．００ｍＭ、０．０３ｍＭおよび０．０６ｍＭである過酸化水素１９ｍＬを実験回次別にそれぞれ混合して、ミジンコが前記過酸化水素に露出するように繰り返し実験した。この際、陰性対照群である０．００ｍＭ処理時に、体積を統一するために１０ｍＬＭ４培地をさらに混合した。

観察の際、過酸化水素に露出する前と後に区間を分けて心拍数分析を行った。

図７にその結果を図示した。

図７の（ｂ）の心拍数傾向を表現するために、図７の（ａ）では３０分おきに移動平均方法（ｍｏｖｉｎｇａｖｅｒａｇｅｍｅｔｈｏｄ）で最初心拍数（ｏｒｉｇｉｎａｌｈｅａｒｔｒａｔｅ、ＯＨＲ）を平坦化した。

これより、各試験群に対する心拍数とＯＨＲとの間の標準偏差（単位：ＢＰＭ、ｂｅａｔｐｅｒｍｉｎｕｔｅ）を測定したところ、過酸化水素濃度別に１８ＢＰＭ、１１ＢＰＭ、および１４ＢＰＭに現れることを確認した。

図７の（ｃ）は初期ＲＨＲに対して正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を行った結果であり、心臓に対する毒性を評価するための毒性物質への露出による心拍数の変化を測定した結果である。陰性対照群以外の０．０３ｍＭおよび０．０６ｍＭの過酸化水素をそれぞれ処理した試料に対して、最終ＲＨＲを測定した結果、最初心拍数（ＯＨＲ）に対する心拍数がそれぞれ３．３％（－１３ＢＰＭ）、２２．７％（－１０９ＢＰＭ）減少することを確認した。

前記正規化による心拍数の比較結果、陰性対照群は、ＯＨＲと同じ最終ＲＨＲを有する一方、過酸化水素を処理した二つの試験群の場合、心拍数の減少を確認した。

前記正規化した結果に対してｔ－検定方法を適用して前記減少の有意性を測定したところ、０．０３ｍＭの過酸化水素を処理した試験群の場合、Ｆ値が０．８９を示し、分散の異分散性（ｈｅｔｅｒｏｓｃｅｄａｓｔｉｃｉｔｙｏｆｖａｒｉａｎｃｅ）および０．０５より大きい有意確率を示した。これより、不均一分散を仮定したｔ－検定結果は０．０１より小さく、これより、０．０３ｍＭ過酸化水素処理時に最終ＲＨＲはＯＨＲに対して有意な差を示すことを確認した。

本発明において、前記各実験群に対する測定は、３個のミジンコ試験群に対して同時に処理することもでき、陰性対照群および過酸化水素処理試験群に対する弛緩心拍数測定結果を下記表２にまとめた。

前記結果から、０．０３ｍＭを処理した場合と同様、０．０６ｍＭ過酸化水素を処理した結果のｔ－検定を行った結果、また０．０１よりも小さい値を得、これより、０．０６ｍＭ処理の時にも最終ＲＨＲは、ＯＨＲに対して有意な差を示すことを確認した。

図８に前記表２の露出グループ（ｅｘｐｏｓｕｒｅｇｒｏｕｐ）に対する平均ＲＨＲを分析した結果を図示した。図８の（ａ）の正規化していない比較結果、その差は有意でないことが認められた一方、正規化を行った後の図８の（ｂ）および図８の（ｃ）の場合、陰性対照群は、２４時間経過後、０．４２％の心拍数増加だけが発生した一方、０．０３ｍＭおよび０．０６ｍＭを処理した試験群グループの場合、２４時間経過後、それぞれ７．１６％および２５．９７％の心拍数減少が生じたことを確認した。

図８の（ｄ）は過酸化水素処理による活性酸素種（ＲＯＳ、ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）レベルを測定した結果である。その結果、０．０６ｍＭ処理した試験群の場合、０．０３ｍＭ処理群に対して７．８倍であり、著しく増加した活性酸素種レベルを示すことを確認した。これより、活性酸素種レベル測定により、過酸化水素露出による心拍数の減少と活性酸素種のレベルの相関関係を検証した。

提示された実施例に関する説明は、任意の本発明の技術分野において通常の知識を有する者が本発明を用いるかまたは実施できるように提供する。かかる実施例に対する様々な変形は、本発明の技術分野において通常の知識を有する者に明白であり、ここに定義された一般的な原理は、本発明の範囲から逸脱することなく他の実施例に適用され得る。これにより、本発明は、これに提示された実施例に限定されるものではなく、ここに提示された原理および新規の特徴と一貫する最広義の範囲で解釈されなければならない。

Ｓ１０１設置ステップ
Ｓ１０２イメージ確保ステップ
Ｓ１０３データ演算ステップ
Ｓ１０４ディスプレイステップ
Ｓ１０５心拍数分析ステップ
１００チャンバ
１１０下部固定部
１２０上部固定部
１３０制御部

Claims

デジタルホログラフィーを用いた個体反応評価方法であって、
（ａ）チャンバ（ｃｈａｍｂｅｒ）内部の下端に固定された下部固定部と、前記下部固定部と離隔して上下に移動可能な上部固定部との間に測定個体が培養用液体に浸るように配置し、前記上部固定部を個体に密着させて個体の高さを測定した後、上部固定部の位置を調整して前記個体を固定するステップと、
（ｂ）前記個体に対するデジタルホログラム（ｄｉｇｉｔａｌｈｏｌｏｇｒａｍ）を連続して測定するステップと、
（ｃ）前記測定により得られたデジタルホログラムを復元して、心拍数の変化を計算し、これより個体反応誘導のための化合物による個体反応誘発の可否を判断するステップとを含む、水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法であり、
前記個体反応は、個体を化合物で処理したときの心拍数の変化であり、
前記水中生物は、ミジンコ、ゼブラフィッシュ（ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）またはブラインシュリンプ（ｂｒｉｎｅｓｈｒｉｍｐ）であり、
前記復元のためのアルゴリズムは、二次元分解された相対位相地図（２Ｄ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ－ｒｅｌａｔｉｖｅｐｈａｓｅｍａｐ）を実時間で表示し、心拍数（ｈｅａｒｔｒａｔｅ）を同時に格納するステップをさらに含み、
前記心拍数は、
ａ）確保したデジタルホログラムで心臓領域に相当するピクセルを選別するステップと、
ｂ）それぞれのリフレッシュ間隔（ｒｅｆｒｅｓｈｉｎｇｉｎｔｅｒｖａｌ）にフーリエスペクトル方法（Ｆｏｕｒｉｅｒｓｐｅｃｔｒｕｍｍｅｔｈｏｄ）を適用するステップと、
ｃ）それぞれのリフレッシュ間隔で最多頻度の心拍数（ｍｏｓｔｆｒｅｑｕｅｎｔｈｅａｒｔｒａｔｅ）を検索するステップと、
ｄ）前記最多頻度の心拍数から１分当たりの心拍数を計算するステップとを含む分析方法により得られる、水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法。
前記（ａ）ステップは、培養用液体が担持されたチャンバ内部の下端に固定された下部固定部と、前記上部固定部との間に前記培養用液体に浸るように測定対象個体を配置し、前記上部固定部を個体の上部に接触させ、下部固定部と上部固定部との離隔距離である個体の高さを測定した後、上部固定部の位置を調整して前記個体を固定するステップと、前記チャンバに個体反応誘導のための化合物を添加するステップとを含む、請求項１に記載の水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法。
前記（ａ）ステップは、個体反応誘導のための化合物が添加された培養用液体が担持されたチャンバ内部の下端に固定された下部固定部と、前記上部固定部との間に前記培養用液体に浸るように測定対象個体を配置し、前記上部固定部を個体に密着させて個体の高さを測定した後、上部固定部の位置を調整して前記個体を固定するステップとを含む、請求項１に記載の水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法。
前記上部固定部の位置を調整して固定した後、下部固定部と上部固定部との距離は、測定対象個体の高さに対して０．８７～０．９５の割合である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法。
前記上部固定部の位置を調整して固定した後、下部固定部と上部固定部との距離は、測定対象個体の高さに対して０．９２～０．９５の割合である、請求項４に記載の水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法。
前記化合物は、有機化合物、金属、酸－アルカリ、ガス、医薬品、またはナノ粒子である、請求項１に記載の水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法。
前記化合物は、ジメチルホルムアミド、メタノール、メチルイソブチルケトン、ベンゼン、四塩化炭素、スチレン、シクロヘキサン、アセトン、アセトアルデヒド、イソブチルアルコール、メチルクロライド、エチレングリコール、キシレン、トルエン、トルエン－２，４－ジイソシアネート、トリクロロエチレン、ｎ－ヘキサン、鉛、ニッケル、マンガン、水銀、亜鉛、アルミニウム、鉄、カドミウム、クロム、過酸化水素、酢酸、水酸化ナトリウム、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、アンモニア、塩素、オゾン、硫化水素、一酸化炭素、二酸化硫黄、二酸化窒素、医薬品、金ナノ、銀ナノ、ＳＷＣＮＴ（ｓｉｎｇｌｅ－ｗａｌｌｅｄｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅ）、ＭＷＣＮＴ（ｍｕｌｔｉ－ｗａｌｌｅｄｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅ）、フラーレン（ｆｕｌｌｅｒｅｎｅ、Ｃ_６０）、鉄ナノ粒子、カーボンブラック、二酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化セリウム、酸化亜鉛、二酸化珪素、ポリスチレン、デンドリマー、およびナノクレイから選択される、請求項６に記載の水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法。
固体は、０．０１～０．１０ｍＭの濃度の化合物で処理する、請求項６に記載の水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法。
前記心拍数の変化は、最初心拍数（ｏｒｉｇｉｎａｌｈｅａｒｔｒａｔｅ、ＯＨＲ）および下記数学式による弛緩心拍数（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎｈｅａｒｔｒａｔｅ、ＲＨＲ）を計算して得られる、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価方法。
［数学式ＩＶ］

ここで、ｔ_ｉおよびｔ_ｆは、弛緩状態で最初および最後時間ドメインを意味する。
デジタルホログラフィーを用いた水中生物の心拍数の実時間（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）測定による個体反応評価装置であって、
前記個体反応評価装置は、培養用液体が担持されたチャンバと、下部固定部と、前記下部固定部と離隔された上部固定部と、前記上部固定部の位置を制御する制御部とを含み、
前記下部固定部は、前記チャンバ内部の下端に固定され、前記上部固定部との間に測定対象個体が配置され、前記上部固定部は、前記チャンバの一側面に固定されて上下に移動可能であり、前記制御部は、前記上部固定部を個体の上部に接触させ、下部固定部と上部固定部との離隔距離である個体の高さを測定した後、上部固定部の位置を調整して前記個体を固定する、水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価装置であり、
前記個体反応は、個体を化合物で処理したときの心拍数の変化であり、
前記水中生物は、ミジンコ、ゼブラフィッシュ（ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）またはブラインシュリンプ（ｂｒｉｎｅｓｈｒｉｍｐ）であり、
前記個体反応評価装置は、光源部と、参照光を生成する参照光生成部と、物体光を生成する物体光生成部と、前記参照光と物体光を結合してホログラムを記録するＣＣＤと、前記記録されたホログラムの干渉縞を数値的に分析する演算部と、前記演算部により数値的に分析されたデジタルホログラムを表示するディスプレイ部と、前記分析されたデジタルホログラムから心拍数分析を行う心拍数分析部とをさらに含み、
前記演算部は、ＣＣＤに記録されたホログラムに対して多数個の位相復元相を取得し、これより振幅（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）および角度（ａｎｇｌｅ）を計算してディスプレイ部に伝達し、前記ディスプレイ部は、ＣＣＤに記録されたすべてのホログラムに対する分析が完了するまで相当するデジタルホログラムを選別して表示した後、心拍数分析部に伝達し、前記心拍数分析では、最多頻度の心拍数から１分当たりの心拍数を計算する、水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価装置。
前記制御部は、下部固定部と上部固定部との距離を測定対象個体の高さに対して０．８７～０．９５の割合で調整する、請求項１０に記載の水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価装置。
前記制御部は、下部固定部と上部固定部との距離を測定対象個体の高さに対して０．９２～０．９５の割合で調整する、請求項１１に記載の水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価装置。
請求項１０に記載のデジタルホログラフィーを用いた水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価装置であって、
前記個体反応評価装置は、水中生物の実時間心拍数、下部固定部と上部固定部の離隔間隔、心拍数位相の実時間ディスプレイ、弛緩心拍数（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎｈｅａｒｔｒａｔｅ）からなる群から選択される一つ以上のデータを同時に測定可能である、水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価装置。
前記個体反応評価装置により同時に測定されたデータは、人工知能技法（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅｍｅｔｈｏｄ）を適用して繰り返し学習により蓄積させる、請求項１３に記載の水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価装置。
前記繰り返し学習により高等生物での心拍数の変化を予測するために使用される、請求項１４に記載の水中生物の心拍数の実時間測定による個体反応評価装置。