JP7266804B2 - Selenium reduction treatment method using selenium-contaminated sample containing selenium-reducing bacteria - Google Patents
Selenium reduction treatment method using selenium-contaminated sample containing selenium-reducing bacteria Download PDFInfo
- Publication number
- JP7266804B2 JP7266804B2 JP2019066412A JP2019066412A JP7266804B2 JP 7266804 B2 JP7266804 B2 JP 7266804B2 JP 2019066412 A JP2019066412 A JP 2019066412A JP 2019066412 A JP2019066412 A JP 2019066412A JP 7266804 B2 JP7266804 B2 JP 7266804B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- selenium
- reducing
- seq
- identity
- rrna gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Processing Of Solid Wastes (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
- Treatment Of Sludge (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、新規セレン還元菌を含むセレン汚染試料を用いたセレンの還元処理方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a selenium reduction treatment method using a selenium-contaminated sample containing a novel selenium-reducing bacterium.
セレンは自然界に存在する元素であり、硫化物又は硫黄の鉱床に含有されている。当該元素は人体にとって必須元素の一つである一方、多量に摂取した場合には健康被害をもたらすことから、環境基本法の水質汚濁に係る環境基準や土壌汚染対策法の第二種特定有害物質に指定されている。そのため、基準値以上の汚染地下水やセレンが溶出する汚染土壌への対策として、原位置における汚染水の浄化処理や不溶化処理の措置が取られる場合がある。自然由来のセレンが問題となるケースの一つとして、トンネル工事において発生する掘削ずりや、涌水等により発生するトンネルの廃水処理、搬出や運搬及び保管中に掘削ずりから飛散や流出したことによる周辺土壌や地下水及び河川の汚染対策、産廃処理場や汚泥処理等のプラントで処理する際の廃水の処理が挙げられる。しかし、既存の処理材のセレンに対する効果は低く、また汚染水を浄化するためには煩雑な処理設備が必要となるため、セレン汚染試料に対する効果の高い処理技術が求められている。 Selenium is a naturally occurring element, contained in sulfide or sulfur deposits. While this element is one of the essential elements for the human body, it is harmful to health if taken in large amounts. specified. Therefore, in-situ purification and insolubilization of contaminated water may be taken as countermeasures against contaminated groundwater exceeding the standard value and contaminated soil from which selenium is eluted. One of the cases where naturally occurring selenium becomes a problem is excavation mud generated during tunnel construction, wastewater treatment of tunnels generated by flood water, etc. Examples include countermeasures against pollution of soil, groundwater, and rivers, and treatment of wastewater at plants such as industrial waste treatment plants and sludge treatment. However, the effect of existing treatment materials on selenium is low, and complex treatment equipment is required to purify contaminated water. Therefore, a highly effective treatment technique for selenium-contaminated samples is desired.
自然環境中のセレンの形態は４価の亜セレン酸（ＳｅＯ３ ２-）或いは６価のセレン酸（ＳｅＯ４ ２-）であり、自然環境下では混在しているケースが多い。このうち６価セレンの還元処理が難しいことが、セレンの処理を困難にしていると考えられている。６価セレンを処理する場合、まず４価セレンに還元してから処理する方法が一般的であるが（例えば特許文献１）、二段階の処理が必要になるため、いずれの価数にも効果的な還元処理方法が望まれている。 The form of selenium in the natural environment is tetravalent selenious acid (SeO 3 2- ) or hexavalent selenium acid (SeO 4 2- ), and they are often mixed in the natural environment. It is considered that the difficulty in the reduction treatment of hexavalent selenium makes the treatment of selenium difficult. When treating hexavalent selenium, it is common to first reduce it to tetravalent selenium and then treat it (for example, Patent Document 1). There is a demand for a more efficient reduction treatment method.
本発明は、新規なセレン還元菌を含むセレン汚染試料を利用したセレンの還元処理方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for reducing selenium using a selenium-contaminated sample containing a novel selenium-reducing bacterium.
本発明者らは、セレンの還元処理について鋭意検討を行ったところ、新規なセレン還元菌を含むセレン汚染試料を、嫌気的条件下で静置又は撹拌することにより、極めて低い相対存在量（％）である当該セレン還元菌が活動することで、４及び６価のセレンを還元できるという知見を得、この知見に基づき、本発明を完成させるに至った。 The present inventors have made intensive studies on selenium reduction treatment, and have found that a selenium-contaminated sample containing a novel selenium-reducing bacterium can be left to stand or stirred under anaerobic conditions to achieve an extremely low relative abundance (% ) can reduce tetravalent and hexavalent selenium by the activity of the selenium-reducing bacteria. Based on this knowledge, the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の１）～８）に係るものである。
１）セレン還元菌を含むセレン汚染試料を、嫌気的条件下で静置又は撹拌する、セレン汚染試料のセレンの還元処理方法であって、セレン還元菌が、配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ａ、配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｂ、配列番号：３の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｃ、及び配列番号：４の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｄからなる群から選択される少なくとも１種である、方法。
２）嫌気的条件の下で１０～４０℃で、１２時間以上静置又は撹拌する工程を含む、１）に記載の方法。
３）セレン還元菌が、配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ａ及び配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｂの少なくとも一方を含む、１）又は２）に記載の方法。
４）セレン還元菌が、配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ａ、配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｂ及び配列番号：３との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｃを含む、１）～３）のいずれかに記載の方法。
５）セレン還元菌が、配列番号：４の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｄ、配列番号：５の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｅ、配列番号：６の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｆ、及び配列番号：７の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｇからなる群から選択される１種以上をさらに含む、１）～４）のいずれかに記載の方法。
６）処理されるセレン汚染試料が、セレンを含む掘削ずり、土砂、汚泥、水、焼却灰及び工場廃水から選ばれる１種以上である、１）～５）のいずれかに記載の方法。
７）処理されるセレン汚染試料にリン酸、有機酸、アルコール類及び糖類から選ばれる１種以上を加える工程を含む、１）～６）のいずれかに記載の方法。
８）セレン汚染試料のセレン還元化能を評価する方法であって、試料中の配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ａ、配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｂ及び配列番号：３の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｃ、配列番号：４の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｄ、配列番号：５の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｅ、配列番号：６の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｆ、及び配列番号：７の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｇからなる群から選択される少なくとも１種の存在を確認する工程を含む、方法。
That is, the present invention relates to the following 1) to 8).
1) A method for reducing selenium in a selenium-contaminated sample by standing or stirring a selenium-contaminated sample containing a selenium-reducing bacterium under anaerobic conditions, wherein the selenium-reducing bacterium has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. A selenium-reducing bacterium A having a 16S rRNA gene with an identity of 97% or more, a selenium-reducing bacterium B having a 16S rRNA gene with an identity of 97% or more with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 From selenium-reducing bacterium C having a 16S rRNA gene with 97% or more identity with the nucleotide sequence and selenium-reducing bacterium D having a 16S rRNA gene with 97% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 A method which is at least one selected from the group consisting of
2) The method according to 1), which includes the step of standing or stirring at 10 to 40°C under anaerobic conditions for 12 hours or more.
3) The selenium-reducing bacterium has a 16S rRNA gene with an identity of 97% or more with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a selenium-reducing bacterium A with an identity of 97% or more with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 The method according to 1) or 2), comprising at least one of selenium-reducing bacteria B having a certain 16S rRNA gene.
4) The selenium-reducing bacterium has a 16S rRNA gene with 97% or more identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and 97% or more identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. The method according to any one of 1) to 3), comprising selenium-reducing bacterium B having a certain 16S rRNA gene and selenium-reducing bacterium C having a 16S rRNA gene with 97% or more identity to SEQ ID NO:3.
5) The selenium-reducing bacterium D has a 16S rRNA gene that has 97% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and 97% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5. A selenium-reducing bacterium E having a certain 16S rRNA gene, a selenium-reducing bacterium F having a 16S rRNA gene having an identity of 97% or more with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, and an identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 The method according to any one of 1) to 4), further comprising one or more species selected from the group consisting of selenium-reducing bacteria G having a 16S rRNA gene with a rRNA gene of 97% or more.
6) The method according to any one of 1) to 5), wherein the selenium-contaminated sample to be treated is one or more selected from selenium-containing excavation muck, earth and sand, sludge, water, incineration ash, and industrial wastewater.
7) The method according to any one of 1) to 6), which includes the step of adding one or more selected from phosphoric acid, organic acids, alcohols and sugars to the selenium-contaminated sample to be treated.
8) A method for evaluating the selenium-reducing ability of a selenium-contaminated sample, comprising a selenium-reducing bacterium A having a 16S rRNA gene having 97% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the sample, SEQ ID NO: : selenium-reducing bacterium B having a 16S rRNA gene having 97% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and selenium-reducing bacterium having a 16S rRNA gene having 97% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 C, a selenium-reducing bacterium having a 16S rRNA gene with 97% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and a 16S rRNA gene with 97% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 selenium-reducing bacterium E having 97% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 6, selenium-reducing bacterium F having 16S rRNA gene with 97% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 7 A method comprising confirming the presence of at least one species selected from the group consisting of selenium-reducing bacteria G having a certain 16S rRNA gene.
本発明によれば、セレン汚染試料中のセレン還元菌に基づくセレン還元力を利用することにより、処理材を用いることなくセレンの還元処理が可能になる。 According to the present invention, by utilizing the selenium-reducing power of selenium-reducing bacteria in a selenium-contaminated sample, selenium can be reduced without using a treatment material.
本明細書において、範囲を示す「Ｘ～Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作及び物性等の測定は室温ｃｖ（２０～２５℃）／相対湿度４０～５０％ＲＨの条件で測定する。
In this specification, "X to Y" indicating a range means "X or more and Y or less". Unless otherwise specified, measurements of operations and physical properties are performed under the conditions of room temperature cv (20 to 25° C.)/
後述する実施例に記載のとおり、異なる２箇所のトンネル建設現場から採掘された掘削ずりにおける微生物群集の状態と４及び６価セレンの還元活性との関係を検討したところ、微生物群集から、セレンの還元に関与する新規な４菌種を含む７種の微生物（セレン還元菌）が同定された。これらのセレン還元菌は、微生物群集全体に対して、極めて低い相対存在量（例えば１％以下）であったが、その相対存在量が増加することにより、当該掘削ずりのセレン還元活性が上昇することが見出された。
したがって、７種のセレン還元菌を含むセレン汚染試料は、セレン還元能を有していると考えられ、試料中の当該セレン還元菌のセレン還元力を利用することによりセレンの還元処理が可能となる。また、試料中のセレン還元菌の存在を指標として、当該試料のセレン還元能を評価することができる。
As described in the examples below, when the relationship between the state of the microbial community and the reducing activity of tetravalent and hexavalent selenium in excavated muck mined from two different tunnel construction sites was examined, it was found that selenium was reduced from the microbial community. Seven species of microorganisms (selenium-reducing bacteria) were identified, including four novel species involved in reduction. These selenium-reducing bacteria have a very low relative abundance (for example, 1% or less) in the entire microbial community, but an increase in the relative abundance increases the selenium-reducing activity of the excavation muck. It was found that
Therefore, a selenium-contaminated sample containing seven types of selenium-reducing bacteria is considered to have selenium-reducing ability, and selenium reduction treatment is possible by utilizing the selenium-reducing ability of the selenium-reducing bacteria in the sample. Become. In addition, the presence of selenium-reducing bacteria in a sample can be used as an index to evaluate the selenium-reducing ability of the sample.
［セレン還元菌］
本発明において、セレン還元菌とは、４及び６価セレンを電子受容体基質として還元できる菌を意味する。
本発明に係るセレン還元菌としては、配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する菌Ａ（本明細書中、単に「セレン還元菌Ａ」とも称す）、配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する菌Ｂ（本明細書中、単に「セレン還元菌Ｂ」とも称す）及び配列番号：３の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する菌Ｃ（本明細書中、単に「セレン還元菌Ｃ」とも称す）からなる群から選択される少なくとも１種の他、配列番号：４～７の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する菌Ｄ～Ｇ（本明細書中、それぞれ「セレン還元菌Ｄ」、「セレン還元菌Ｅ」、「セレン還元菌Ｆ」、「セレン還元菌Ｇ」とも称す）から選択された菌が挙げられる。
[Selenium reducing bacteria]
In the present invention, a selenium-reducing bacterium means a bacterium capable of reducing tetravalent and hexavalent selenium as an electron acceptor substrate.
As the selenium-reducing bacterium according to the present invention, a bacterium A having a 16S rRNA gene having 97% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (also referred to herein simply as "selenium-reducing bacterium A") , a bacterium B having a 16S rRNA gene having 97% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 (also referred to herein simply as "selenium-reducing bacterium B") and SEQ ID NO: 3 with the nucleotide sequence At least one selected from the group consisting of bacteria C having a 16S rRNA gene having an identity of 97% or more (herein, also simply referred to as "selenium-reducing bacteria C"), and SEQ ID NO: 4 to Bacteria D to G having a 16S rRNA gene having 97% or more identity with the base sequence of 7 (in this specification, "selenium-reducing bacteria D", "selenium-reducing bacteria E", and "selenium-reducing bacteria F", respectively) , also referred to as “selenium-reducing bacteria G”).
本発明において、塩基配列との同一性とは、特に記載した場合を除き、いずれの塩基配列においても、２つの配列を最適の態様で整列させた場合に、２つの配列間で共有する一致したヌクレオチドの個数の百分率を意味する。すなわち、同一性（％）＝（一致した位置の数／位置の全数）×１００で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(1990)403-410に記載されるＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム中に組込まれている。より詳細には、塩基配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズム又はプログラム（例えばＢＬＡＳＴＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷなど）により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメータは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。 In the present invention, the identity with a base sequence means that, unless otherwise specified, in any base sequence, when the two sequences are aligned in an optimal manner, the two sequences are shared and matched. It means the percentage of the number of nucleotides. That is, identity (%)=(number of matched positions/total number of positions)×100, and can be calculated using a commercially available algorithm. Also, such algorithms are incorporated into the NBLAST and XBLAST programs described in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410. More specifically, searches and analyzes for nucleotide sequence identity can be performed by algorithms or programs well known to those skilled in the art (eg, BLASTN, ClustalW, etc.). Parameters when using programs can be appropriately set by those skilled in the art, and default parameters of each program may be used. Specific techniques of these analysis methods are also well known to those skilled in the art.
配列番号：１～７の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌を表１に示す。これらのセレン還元菌は、後述する「セレン還元菌を同定」で示した方法により同定された菌である。下記表１において、「相同性（％）」は、配列番号：１～７の塩基配列について、ＮＣＢＩ（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎ）の塩基配列データベースのＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定した。 Table 1 shows selenium-reducing bacteria having 16S rRNA genes containing the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-7. These selenium-reducing bacteria are bacteria identified by the method shown in "Identification of selenium-reducing bacteria" described later. In Table 1 below, "homology (%)" was determined for the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 7 using the BLAST program of the nucleotide sequence database of NCBI (The National Center for Biotechnology Information).
配列番号：６及び配列番号：７の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌（ＯＴＵ７０９１及びＯＴＵ４６５７）は、それぞれデサルフォスポロサエナス・フラクトシボランス（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｉｖｏｒａｎｓ）及びデサルフォスポロサエナス・ブルネンシス（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ ｂｕｒｅｎｓｉｓ）であると考えられる。デサルフォスポロサエナス（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ）属の微生物は、嫌気性の硫酸還元菌である。 Selenium-reducing bacteria (OTU7091 and OTU4657) having 16S rRNA genes containing the base sequences of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 are Desulfosporosaenas fructosivorans and Desulfosporosaenas fructosivorans, respectively. Believed to be Desulfosporosinus burensis. Microorganisms belonging to the genus Desulfosporosinus are anaerobic sulfate-reducing bacteria.
配列番号：５の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌（ＯＴＵ１０７１）は、単環芳香族炭化水素の分解に伴って鉄（ＩＩＩ）を還元する嫌気性微生物として知られるデサルフィトバクテリウム・アロマティシボランス（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）に対して、配列相同性が９７．６％であり、デサルフィトバクテリウム・アロマティシボランスの近縁種であると考えられる。 A selenium-reducing bacterium (OTU1071) having a 16S rRNA gene containing the base sequence of SEQ ID NO: 5 is Desulphytobacterium known as an anaerobic microorganism that reduces iron (III) as it decomposes monocyclic aromatic hydrocarbons. - It has a sequence homology of 97.6% to Desulfitobacterium aromaticivorans and is considered to be a closely related species of Desulfitobacterium aromaticivorans.
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌（ＯＴＵ８４８９、ＯＴＵ２０５０１、ＯＴＵ１８２５０及びＯＴＵ２１９）は、データベース上で最も近縁な微生物種に対して、配列相同性がそれぞれ８７．７％、８８．６％、８９．０％及び９０．９％である。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いた解析では、既知種と相同性９７％以上を示す場合、同種であると定義できる。つまり、これらのセレン還元菌は、既知の微生物種とは種が異なる微生物であると考えられる。 Selenium-reducing bacteria (OTU8489, OTU20501, OTU18250 and OTU219) having 16S rRNA genes containing the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 are the closest relatives on the database. The sequence homology to the microbial species is 87.7%, 88.6%, 89.0% and 90.9% respectively. In the analysis using the base sequence of the 16S rRNA gene, if it shows 97% or more homology with a known species, it can be defined as being of the same species. In other words, these selenium-reducing bacteria are considered to be microorganisms different in species from known microorganism species.
本発明のセレン還元菌を含むセレン汚染試料は、その微生物群集中に、上記のセレン還元菌を含むものである。
本発明のセレン還元菌を含むセレン汚染試料は、本発明のセレン還元菌を含む限りその由来は限定されないが、当該セレン還元菌の生育に適した環境、すなわちセレンを含有し嫌気状態が維持され得る地下水、地盤や岩盤等の土壌（具体的にはトンネル等の地中構造物を建設する際の掘削ずり）、及び地下構造物の建設工事で発生する土砂や汚泥、廃水が挙げられる。本発明のセレン還元菌を含むセレン汚染試料は、上記セレン還元菌を含む微生物群集を含んでいれば、細菌に加えて糸状菌、原生動物が混在していてもよい。
The selenium-contaminated sample containing the selenium-reducing bacteria of the present invention contains the above selenium-reducing bacteria in the microbial community.
The selenium-contaminated sample containing the selenium-reducing bacterium of the present invention is not limited in its origin as long as it contains the selenium-reducing bacterium of the present invention. Examples include groundwater obtained, soil such as ground and bedrock (specifically, excavated mud when constructing underground structures such as tunnels), and earth and sand, sludge, and wastewater generated during construction work of underground structures. The selenium-contaminated sample containing the selenium-reducing bacteria of the present invention may contain filamentous fungi and protozoa in addition to bacteria, as long as it contains a microbial community containing the selenium-reducing bacteria.
本発明のセレン還元菌を含むセレン汚染試料は、一態様として、配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ａ、配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｂ、配列番号：３の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｃ、及び配列番号：４の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｄからなる群から選択される少なくとも１種を含む。 In one aspect, the selenium-contaminated sample containing the selenium-reducing bacterium of the present invention comprises a selenium-reducing bacterium A having a 16S rRNA gene with 97% or more identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the base of SEQ ID NO: 2 A selenium-reducing bacterium B having a 16S rRNA gene with 97% or more identity with the sequence, a selenium-reducing bacterium C having a 16S rRNA gene with 97% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and the sequence No.: At least one species selected from the group consisting of selenium-reducing bacteria D having a 16S rRNA gene having 97% or more identity with the base sequence of 4.
また、好ましい実施形態として、セレン汚染試料は、セレン還元能の観点から、セレン還元菌Ａ及びセレン還元菌Ｂの少なくとも一方を含み、より好ましくはセレン還元菌Ａ、セレン還元菌Ｂ及びセレン還元菌Ｃをすべて含むものが挙げられる。 In a preferred embodiment, the selenium-contaminated sample contains at least one of selenium-reducing bacteria A and selenium-reducing bacteria B, more preferably selenium-reducing bacteria A, selenium-reducing bacteria B, and selenium-reducing bacteria Those containing all C are mentioned.
また、さらに好ましい実施形態として、セレン汚染試料は、上記実施形態のセレン還元菌に加えて、セレン還元能の観点から、配列番号：４の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｄ、配列番号：５の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｅ、及び配列番号：６の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｆ、及び配列番号：７の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｇからなる群から選択される１種以上をさらに含むものが挙げられる。 In a further preferred embodiment, the selenium-contaminated sample includes, in addition to the selenium-reducing bacteria of the above-described embodiments, 16S rRNA having 97% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 4 from the viewpoint of selenium-reducing ability. A selenium-reducing bacterium D having a gene, a selenium-reducing bacterium E having a 16S rRNA gene having an identity of 97% or more with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, and an identity of 97% with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 One or more species selected from the group consisting of selenium-reducing bacterium F having a 16S rRNA gene that is above and selenium-reducing bacterium G having a 16S rRNA gene that has 97% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 Further includes.
本発明のセレン還元菌を含むセレン汚染試料には、約４，０００種～約５，０００種の微生物種が含まれ、これらの微生物種において、本発明の上記セレン還元菌の相対存在量は特に制限されず、微生物種全体に対して、極めて低くてもよい。セレン還元菌の相対存在量（％）は、微生物群集全体に対して、例えば０．００１％以下～０．８％である。相対存在量の値は、実施例に記載の方法により求めた値である。 A selenium-contaminated sample containing the selenium-reducing bacteria of the present invention contains about 4,000 to about 5,000 microbial species, and among these microbial species, the relative abundance of the selenium-reducing bacteria of the present invention is There is no particular limitation, and it may be extremely low for all microbial species. The relative abundance (%) of selenium-reducing bacteria is, for example, 0.001% or less to 0.8% with respect to the entire microbial community. The value of relative abundance is the value determined by the method described in Examples.
なお、上記セレン還元菌は、試料中の存在量が極めて少ないため、これらを単離することは、技術的理由により困難である。そのため、寄託機関に寄託を行っていない。しかし、本出願人は、本発明に係るセレン還元菌を含むセレン汚染試料について、日本国特許法施行規則第２７条の３各号に該当する場合、各法令の順守を条件に、第三者に分譲することを保証する。 Since the selenium-reducing bacteria are present in extremely small amounts in samples, it is difficult to isolate them for technical reasons. Therefore, it has not been deposited with a depository institution. However, if the selenium-contaminated sample containing the selenium-reducing bacteria according to the present invention falls under each item of Article 27-3 of the Enforcement Regulations of the Japanese Patent Law, the applicant has requested that a third party guarantee that the property will be distributed to
［セレン還元菌の同定］
複数の微生物を含む試料（例えばセレン汚染土壌）中のセレン還元菌の同定は、以下に示す工程Ａ～Ｃによって行うことができる。
工程Ａ：セレンを含有する未培養の試料から核酸を回収すること；及び、当該核酸に存在する標的遺伝子の塩基配列を次世代シークエンサーにより解析し、各微生物の相対存在量（１）を求める工程、
工程Ｂ：４及び６価セレンの存在下で前記試料の培養を開始し、培養物を得ること；当該培養物から核酸を回収すること；及び、当該核酸に存在する標的遺伝子の塩基配列を次世代シークエンサーにより解析し、各微生物の相対存在量（２）を求める工程、
工程Ｃ：前記相対存在量（２）が前記相対存在量（１）より多い微生物をセレン還元菌であると判断する工程。
[Identification of selenium-reducing bacteria]
Identification of selenium-reducing bacteria in a sample containing a plurality of microorganisms (eg, selenium-contaminated soil) can be performed by steps A to C shown below.
Step A: recovering nucleic acid from an uncultured sample containing selenium; and analyzing the base sequence of the target gene present in the nucleic acid by a next-generation sequencer to determine the relative abundance (1) of each microorganism. ,
Step B: Initiating culture of the sample in the presence of tetravalent and hexavalent selenium to obtain a culture; recovering nucleic acid from the culture; A step of analyzing with a generation sequencer and determining the relative abundance (2) of each microorganism;
Step C: A step of judging microorganisms in which the relative abundance (2) is greater than the relative abundance (1) to be selenium-reducing bacteria.
４及び６価セレンを還元したセレン還元菌は、還元が起こる前に比べて相対存在量が大きくなる。すなわち、未培養時点の試料と４及び６価セレンによる培養した試料とを用意し、それぞれの試料から得られたＤＮＡの解析・比較を行う。未培養時点の試料のＤＮＡにおける相対存在量よりも、４及び６価セレンによる培養後の試料における相対存在量が大きい微生物は、４及び６価セレンを還元して生育した微生物であると解される。これにより、４及び６価セレンを還元する微生物（セレン還元菌）を同定することができる。 The relative abundance of selenium-reducing bacteria that have reduced tetravalent and hexavalent selenium is greater than before the reduction occurs. That is, an uncultured sample and samples cultured with tetravalent and hexavalent selenium are prepared, and the DNA obtained from each sample is analyzed and compared. A microorganism whose relative abundance in the sample after culture with tetravalent selenium and hexavalent selenium is greater than the relative abundance in the DNA of the uncultivated sample is considered to be a microorganism grown by reducing tetravalent selenium and hexavalent selenium. be. As a result, microorganisms (selenium-reducing bacteria) that reduce tetravalent and hexavalent selenium can be identified.
工程Ａ及び工程Ｂにおいて、セレン含有試料中の微生物の相対存在量を求めるには、以下の３つの工程が行われる。
（ｉ）４及び６価セレンをセレン含有試料に追添加して、試料に含まれる微生物を培養すること；
（ｉｉ）未培養時点と４及び６価セレンによる培養後のそれぞれの試料から核酸（例えばＤＮＡ）を回収すること；
（ｉｉｉ）回収した核酸に存在する標的遺伝子（例えば１６Ｓ ｒＲＮＡ）の塩基配列を次世代シークエンサーにより解析すること。
In steps A and B, the following three steps are performed to determine the relative abundance of microorganisms in the selenium-containing sample.
(i) additionally adding 4- and 6-valent selenium to the selenium-containing sample and culturing the microorganisms contained in the sample;
(ii) recovering nucleic acid (e.g. DNA) from each sample at the unincubated time point and after incubation with 4- and 6-valent selenium;
(iii) analyzing the nucleotide sequence of the target gene (eg, 16S rRNA) present in the recovered nucleic acid using a next-generation sequencer;
以下、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）について具体的に説明する。
（ｉ）４及び６価セレンをセレン含有試料に添加して、試料に含まれる微生物を培養すること
培養に用いるセレン含有試料は、微生物と４及び６価セレンとの反応性を良くするとの観点から、水分を添加するのが好ましい。
微生物の培養は、還元的な雰囲気、すなわち嫌気的条件を形成するとの観点から、ＣＯ２／Ｎ２、又はＮ２で曝気をした後に、気密容器内で行われる。これにより生物学的なセレン還元が誘導される。
The above (i) to (iii) will be specifically described below.
(i) Adding 4- and 6-valent selenium to a selenium-containing sample to culture microorganisms contained in the sample The selenium-containing sample used for culturing improves the reactivity between the microorganism and 4- and 6-valent selenium. Therefore, it is preferable to add water.
Cultivation of microorganisms is carried out in an airtight container after aeration with CO 2 /N 2 or N 2 from the viewpoint of creating a reducing atmosphere, ie anaerobic conditions. This induces biological selenium reduction.
微生物の培養は、セレン含有試料と４及び６価セレンとを混合して、４及び６価セレンの存在下で行う。
微生物の培養は、微生物群集の状態を維持できるとの観点から、セレン含有試料に対して、４及び６価セレンを添加して培養することが挙げられるが、必要に応じて、リン酸等その他の成分を適宜添加してもよい。特に、リン酸（リン酸水素カリウム等）、有機酸（乳酸等）、アルコール類（エタノール等）、糖類（グルコース等）を添加することがセレン還元菌の増殖に好ましい。
Microorganisms are cultured in the presence of tetravalent and hexavalent selenium by mixing a selenium-containing sample with tetravalent and hexavalent selenium.
From the viewpoint of maintaining the state of the microbial community, culturing of microorganisms includes culturing by adding tetravalent and hexavalent selenium to the selenium-containing sample. may be added as appropriate. In particular, addition of phosphoric acid (potassium hydrogen phosphate, etc.), organic acids (lactic acid, etc.), alcohols (ethanol, etc.), and sugars (glucose, etc.) is preferable for the growth of selenium-reducing bacteria.
４及び６価セレンは、実環境での濃度変動（０．００００１５～０．０４ｍＭ）を踏まえて、適宜調整することができる。本発明の一実施形態では、０．０００１２７～０．０２ｍＭの４及び６価セレンの存在下で前記複数の微生物の培養を開始することが挙げられる。未培養の時点において、前記４及び６価セレンの濃度が０．０００１２７ｍＭ以上であることにより、セレン還元菌が下記の好ましい培養時間においても、４及び６価セレンを還元できる。前記４及び６価セレンの濃度が０．０２ｍＭ以下であることにより、微生物群集の状態変化を抑制できる。よって、本発明のセレン還元菌を同定する方法において、０．０００１２７～０．０２ｍＭの前記４及び６価セレンの存在下で前記の微生物の培養を開始することが好ましい。 The 4- and 6-valent selenium can be appropriately adjusted based on concentration fluctuations (0.000015 to 0.04 mM) in the actual environment. An embodiment of the present invention includes initiating culture of said plurality of microorganisms in the presence of 0.000127-0.02 mM tetravalent and hexavalent selenium. When the concentration of tetravalent selenium and hexavalent selenium is 0.000127 mM or more at the time of uncultivation, the selenium-reducing bacteria can reduce tetravalent selenium and hexavalent selenium even during the preferred culture time described below. When the concentrations of the tetravalent and hexavalent selenium are 0.02 mM or less, it is possible to suppress changes in the state of the microbial community. Therefore, in the method of identifying a selenium-reducing bacterium of the present invention, it is preferable to start culturing the microorganism in the presence of 0.000127 to 0.02 mM of the tetravalent and hexavalent selenium.
微生物の培養温度は、実環境での年間温度変化を踏まえて、設定すればよい。微生物の培養温度は、実環境で活動するセレン還元菌を検出できるとの観点から、好ましくは１０～４０℃の範囲、より好ましくは２０～３０℃である。培養温度が１０℃以上であることにより、４及び６価セレンの還元を確認できる。培養温度が４０℃以下であることにより、微生物群集の変化を抑制できる。 The temperature for culturing microorganisms may be set based on annual temperature changes in the actual environment. The temperature for culturing microorganisms is preferably in the range of 10 to 40°C, more preferably 20 to 30°C, from the viewpoint that selenium-reducing bacteria that are active in the actual environment can be detected. Reduction of tetravalent and hexavalent selenium can be confirmed when the culture temperature is 10° C. or higher. When the culture temperature is 40° C. or lower, changes in the microbial community can be suppressed.
微生物を培養する間、培養液を静置又は撹拌してもよい。微生物の培養には、従来公知の培養器具を用いることができる。
微生物の培養時間は、例えば１２時間以上であり、好ましくは２４時間以上である。
The culture solution may be left still or agitated while the microorganism is being cultured. Conventionally known culture instruments can be used for culturing microorganisms.
The culture time of microorganisms is, for example, 12 hours or longer, preferably 24 hours or longer.
（ｉｉ）培養物から核酸を回収すること
（ｉ）で得られた培養物から核酸を回収する方法は、特に制限されず、従来公知の方法を用いることができる。回収する核酸としては、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれであってもよい。
ＤＮＡを回収する方法としては、例えば、ビーズ（ガラスビーズ、ジルコニアとシリカの混合ビーズなど）による物理的破砕方法、超音波処理による破砕方法、フレンチプレスによる破砕方法、液体窒素で凍結した試料を乳鉢と乳棒とで破砕する方法などを用いて、微生物細胞を破壊し、その後、従来公知の方法（フェノール・クロロホルム抽出など）を用いて、タンパク質を除去し、ＲＮａｓｅを用いてＲＮＡを消化し、ＤＮＡを回収することが挙げられる。
(ii) recovering nucleic acids from the culture The method for recovering nucleic acids from the culture obtained in (i) is not particularly limited, and conventionally known methods can be used. The nucleic acid to be recovered may be either DNA or RNA.
Methods for recovering DNA include, for example, a physical disruption method using beads (glass beads, mixed beads of zirconia and silica, etc.), a disruption method by ultrasonic treatment, a disruption method by French press, and a sample frozen in liquid nitrogen in a mortar. Destroy the microbial cells using a method of crushing with a pestle and the like, then remove proteins using a conventionally known method (phenol/chloroform extraction, etc.), digest RNA using RNase, and DNA can be collected.
（ｉｉｉ）回収した核酸に存在する標的遺伝子の塩基配列を次世代シークエンサーにより解析すること
セレン還元菌を同定するために用いる標的遺伝子としては、大規模な系統解析に適するとの観点から、好ましくは１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子Ｖ４領域である。
次世代シークエンサーとは、サンガー法を利用した蛍光キャピラリーシークエンサーである「第１世代シークエンサー」と対比させて用いられている用語であり、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼによる逐次的ＤＮＡ合成法を用いて、数千万から数億のＤＮＡ断片に対して数十～数千ｂｐのリード長の断片を網羅的に解析することによって超並列的に塩基配列を決定するための装置を意味する。次世代シークエンサーでは、ジデオキシヌクレオチドを用いてＤＮＡポリメラーゼの伸長を止めるサンガー法を用いた第１世代シークエンサーと異なるシーケンシング原理が用いられている。このような原理として、合成シーケンシング法、パイロシーケンシング法、リガーゼ反応シーケンシング法などが挙げられる。これまでに、多くの企業や研究機関などから、多様な次世代シークエンサーが提供されており、例えば、ＨｉＳｅｑ２５００（イルミナ株式会社）、ＭｉＳｅｑ（イルミナ株式会社）、５５００ｘｌ ＳＯＬｉＤ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、Ｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、Ｉｏｎ ＰＧＭ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＧＳ ＦＬＸ＋（ロシュ・ダイアグノスティックス社）などが挙げられる。
次世代シークエンサーによる解析方法としては、付属説明書に従って実施することができる。これにより、数万から数十万の微生物種（ＯＴＵ）を同定、及び各微生物種の相対存在量（％）を解析できる。
(iii) Analyzing the base sequence of the target gene present in the recovered nucleic acid using a next-generation sequencer. The target gene used for identifying selenium-reducing bacteria is preferably suitable for large-scale phylogenetic analysis. 16S rRNA gene V4 region.
The next-generation sequencer is a term used in contrast to the "first-generation sequencer", which is a fluorescent capillary sequencer that uses the Sanger method. It means an apparatus for massively parallel base sequence determination by exhaustively analyzing fragments with read lengths of tens to thousands of bp for tens to hundreds of millions of DNA fragments. Next-generation sequencers use a different sequencing principle than first-generation sequencers, which use the Sanger method, which uses dideoxynucleotides to stop the elongation of DNA polymerases. Such principles include synthetic sequencing methods, pyrosequencing methods, ligase reaction sequencing methods, and the like. So far, many companies and research institutes have provided various next-generation sequencers. Typic), Ion Proton (registered trademark) (Thermo Fisher Scientific), Ion PGM (registered trademark) (Thermo Fisher Scientific), GS FLX+ (Roche Diagnostics) and the like.
An analysis method using a next-generation sequencer can be carried out according to the attached instructions. This allows tens to hundreds of thousands of microbial species (OTUs) to be identified and the relative abundance (%) of each microbial species to be analyzed.
工程Ｃのセレン還元菌であるとの判断は、未培養の時点における微生物の相対存在量（１）と４及び６価セレンによる培養後における微生物の相対存在量（２）とを対比することで行うことができる。
例えば、ＯＴＵのうち、セレン還元が観察された培養物において、培養後で培養開始時点よりも３００倍以上に上昇している微生物を特定する。
４及び６価セレン還元が観察された培養物において、未培養の時点よりも３００倍以上に上昇している微生物は、４及び６価セレンを還元して生育したため、そのような微生物をセレン還元菌であると判断できる。
Judgment that it is a selenium-reducing bacterium in step C is made by comparing the relative abundance of microorganisms at the time of uncultivation (1) and the relative abundance of microorganisms after culture with tetravalent and hexavalent selenium (2). It can be carried out.
For example, among OTUs, in a culture in which selenium reduction is observed, a microorganism whose selenium reduction is increased by 300 times or more after culturing compared to that at the start of culturing is specified.
In the cultures in which 4- and 6-valent selenium reduction was observed, microorganisms that increased 300-fold or more compared to the uncultured time reduced 4- and 6-valent selenium and grew. It can be determined that it is a bacterium.
［セレン汚染試料のセレンの還元処理]
本発明によれば、上記本発明のセレン還元菌を含むセレン汚染試料を、嫌気的条件下で静置又は撹拌する工程を含む、セレン汚染試料のセレンの還元処理方法が提供される。
ここで、処理されるセレン汚染試料としては、前述したセレン還元菌を含むセレン汚染試料自体であってもよく、それとは別のセレン汚染試料（例えば、セレン還元菌を含まない別のセレン汚染試料、本発明のセレン還元菌とは異なるセレン還元菌を含む別のセレン汚染試料）が含まれていてもよい。また、単離・抽出し培養した上記セレン還元菌を、セレン汚染試料（例えば、セレン還元菌を含まない別のセレン汚染試料、本発明のセレン還元菌とは異なるセレン還元菌を含む別のセレン汚染試料）に添加したものでもよい。
ここで、セレン汚染試料としては、セレンが含まれるものであれば特に限定されず、掘削ずり、土砂、汚泥、水、焼却灰等の廃棄物、工場廃水等いずれでもよい。
[Selenium reduction treatment of selenium-contaminated sample]
According to the present invention, there is provided a method for reducing selenium in a selenium-contaminated sample, comprising the step of standing or stirring the selenium-contaminated sample containing the selenium-reducing bacteria of the present invention under anaerobic conditions.
Here, the selenium-contaminated sample to be processed may be the selenium-contaminated sample itself containing the selenium-reducing bacteria described above, or a different selenium-contaminated sample (for example, another selenium-contaminated sample containing no selenium-reducing bacteria). , another selenium-contaminated sample containing selenium-reducing bacteria different from the selenium-reducing bacteria of the present invention). Alternatively, the isolated, extracted and cultured selenium-reducing bacteria may be used as a selenium-contaminated sample (for example, another selenium-contaminated sample that does not contain selenium-reducing bacteria, another selenium-reducing bacterium that contains selenium-reducing bacteria different from the selenium-reducing bacteria of the present invention). contaminated sample).
Here, the selenium-contaminated sample is not particularly limited as long as it contains selenium, and may be excavation muck, earth and sand, sludge, water, waste such as incineration ash, factory wastewater, or the like.
処理条件は、本発明のセレン還元菌を含むセレン汚染試料中のセレン還元菌が増殖し還元力を発揮できる条件であればよく、嫌気的条件下で静置又は撹拌すればよいが、好ましくは、嫌気槽中、１０～４０℃で、１２時間以上、好ましくは２４時間以上静置又は撹拌することが挙げられ、また、好ましくは、４５００時間以下、より好ましくは１５００時間以下である。
また、上記セレン汚染試料には、セレン還元菌の還元力が発揮されやすいように、鉄塩や亜硫酸塩、シュウ酸、その他の還元剤を添加して、還元状態に変化させてもよい。
The treatment conditions may be any conditions under which the selenium-reducing bacteria in the selenium-contaminated sample containing the selenium-reducing bacteria of the present invention can proliferate and exhibit reducing power, and the selenium-reducing bacteria may be allowed to stand or stirred under anaerobic conditions. , in an anaerobic tank at 10 to 40° C. for 12 hours or longer, preferably 24 hours or longer, and preferably 4,500 hours or shorter, more preferably 1,500 hours or shorter.
Further, iron salts, sulfites, oxalic acid, or other reducing agents may be added to the selenium-contaminated sample so that the reducing power of the selenium-reducing bacteria can be readily exhibited, thereby changing the sample to a reduced state.
例えば、本発明のセレン還元菌を含むセレン汚染試料を嫌気槽中に収容し、１０～４０℃で、１２時間以上静置又は撹拌することにより、当該試料中のセレンを還元処理できる。また、本発明のセレン還元菌を含むセレン汚染試料を収容した嫌気槽に、それとは別のセレン汚染試料を加えることで、当該別のセレン汚染試料についてもセレンの還元処理が可能である。 For example, a selenium-contaminated sample containing the selenium-reducing bacteria of the present invention is placed in an anaerobic tank and allowed to stand or stirred at 10 to 40° C. for 12 hours or more, whereby selenium in the sample can be reduced. Further, by adding another selenium-contaminated sample to the anaerobic tank containing the selenium-contaminated sample containing the selenium-reducing bacteria of the present invention, the other selenium-contaminated sample can be subjected to selenium reduction treatment.
また、当該還元処理には、必要に応じて、リン酸等その他の成分を適宜添加してもよい。特に、リン酸（リン酸水素カリウム等）、有機酸（乳酸等）、アルコール類（エタノール等）、糖類（グルコース等）の１種以上を添加する工程を含むのがセレン還元菌の増殖を促進する点から好ましい。 Further, other components such as phosphoric acid may be appropriately added to the reduction treatment, if necessary. In particular, the step of adding one or more of phosphoric acid (potassium hydrogen phosphate, etc.), organic acid (lactic acid, etc.), alcohols (ethanol, etc.), and sugars (glucose, etc.) promotes the growth of selenium-reducing bacteria. It is preferable from the point of view of
[セレン汚染試料のセレン還元化能の評価]
本発明の一実施形態によれば、セレン汚染試料のセレン還元化能を評価する方法であって、試料中の、セレン還元菌Ａ、セレン還元菌Ｂ、セレン還元菌Ｃ、セレン還元菌Ｄ、セレン還元菌Ｅ、セレン還元菌Ｆ、及びセレン還元菌Ｇからなる群から選択される少なくとも１種の存在を確認する工程を含む、方法が提供される。
[Evaluation of selenium reduction ability of selenium-contaminated sample]
According to one embodiment of the present invention, there is provided a method for evaluating the selenium-reducing ability of a selenium-contaminated sample, comprising: A method is provided, comprising the step of confirming the presence of at least one species selected from the group consisting of selenium-reducing bacteria E, selenium-reducing bacteria F, and selenium-reducing bacteria G.
当該セレン還元菌の確認手段は、特に限定されないが、好適には、前述した菌叢ゲノムＤＮＡに含まれる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて、試料中に存在する菌種を解析する方法が挙げられる。
すなわち、上述したとおり、試料から核酸を回収し、当該核酸に存在する標的遺伝子の塩基配列を次世代シークエンサーにより解析することにより、相対存在量（％）を確認することが挙げられる。
The means for confirming the selenium-reducing bacteria is not particularly limited, but a preferred method is to analyze the species present in the sample based on the base sequence of the 16S rRNA gene contained in the bacterial flora genomic DNA described above. be done.
That is, as described above, the relative abundance (%) can be confirmed by recovering the nucleic acid from the sample and analyzing the nucleotide sequence of the target gene present in the nucleic acid using a next-generation sequencer.
これにより、セレン汚染試料のセレン還元化能を評価することができる。ここで、試料のセレン還元化能とは、当該試料が有するセレン還元菌に基づくセレン還元能を意味する。 This makes it possible to evaluate the selenium reduction ability of the selenium-contaminated sample. Here, the selenium-reducing ability of a sample means the selenium-reducing ability of the sample based on selenium-reducing bacteria.
以下に、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to Examples, but the present invention is not limited to these.
＜セレン汚染試料の評価＞
セレン汚染試料のセレン溶出量は、環境庁告示第１８号「土壌溶出量調査に係る測定方法を定める件」に記載されている方法に準拠して検液作成を行い、「ＪＩＳ Ｋ ０１０２：２０１３（工場排水試験方法）」に準拠して測定した。
<Evaluation of selenium-contaminated sample>
The selenium elution amount of the selenium-contaminated sample was prepared according to the method described in Environmental Agency Notification No. 18 "Matters to determine the measurement method related to the soil elution amount survey", and "JIS K 0102: 2013 (Factory wastewater test method)”.
実施例１ セレン還元菌の同定
（１）６価セレンによる汚染試料微生物群の培養
サンプルとして、建設工事で発生した産地が異なるトンネル掘削ずり２種を用いた。
具体的には、汚染試料５gを滅菌水またはリン酸（１ｍＭ）を添加した滅菌水で１０ｍｌ容量にして、５０ｍｌ容ガラスバイアル瓶に収容した。気相部分は窒素とした。汚染試料に対して、６価セレン溶液（亜セレン酸ナトリウム；和光純薬工業株式会社製）を６価セレンの終濃度０．０１２７ｍＭとなるように添加した。その後、２５℃、暗所にて静置培養を行った。
Example 1 Identification of Selenium-Reducing Bacteria (1) Cultivation of Contaminated Microorganisms with Hexavalent Selenium As samples, two types of tunnel excavation muck from different production areas generated during construction work were used.
Specifically, 5 g of the contaminated sample was adjusted to 10 ml with sterilized water or sterilized water containing phosphoric acid (1 mM) and placed in a 50 ml glass vial. The gas phase portion was nitrogen. A hexavalent selenium solution (sodium selenite; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the contaminated sample so that the final concentration of hexavalent selenium was 0.0127 mM. After that, stationary culture was performed at 25°C in the dark.
（２）化学分析
培養開始時点及び６価セレン培養物において液相を採取し、上記の方法により化学分析に供した。
汚染試料１及び汚染試料２において、液相のセレン濃度はそれぞれ約０．０１３ｍＭの減少を示した（図１）。これは、添加した６価セレンが還元されたと考えられる。
(2) Chemical Analysis The liquid phase was collected at the start of culture and from the hexavalent selenium culture, and subjected to chemical analysis by the method described above.
In contaminated
（３）微生物学解析
未培養時点及び６価セレンによる培養後の試料について、試料を遠心分離し、遠心沈殿物を得た。前記遠心沈殿物に対して、ジルコニアとシリカの混合ビーズ（Ｚｉｒｃｏｎｉａ／Ｓｉｌｉｃａ Ｂｅａｄｓ；平均粒子径０．１ｍｍ）を加え、シェイクマスターオート（株式会社バイオメディカルサイエンス製）を用いて固相中の微生物細胞を破砕した後、フェノールとクロロホルムとを用いた精製ステップを経ることで共存するタンパク質を除去した。その後、ＲＮａｓｅ Ａ（ベックマン社製）の処理を行うことでＲＮＡを消化し、ＤＮＡを精製した。
この精製ＤＮＡを鋳型に用い、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子Ｖ４領域（約３００塩基対）を標的として、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ・Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（NEB社）による遺伝子増幅反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ［ＰＣＲ］）を行った。得られたＰＣＲ産物をＡＭＰｕｒｅ ＸＰ キット（ベックマン・コールター社製）及びＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（プロメガ社製）を用いて精製し、その濃度をＱｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ 試薬・キット（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）と蛍光定量装置Ｎａｎｏｄｒｏｐ ３３００（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）とにより測定した。
(3) Microbiological Analysis Samples were centrifuged to obtain a centrifugal sediment at the uncultivated time point and after culturing with hexavalent selenium. Mixed beads of zirconia and silica (Zirconia/Silica beads; average particle size 0.1 mm) were added to the centrifugal sediment, and microbial cells in the solid phase were detected using Shake Master Auto (manufactured by Biomedical Science Co., Ltd.). After crushing, coexisting proteins were removed by a purification step using phenol and chloroform. After that, the RNA was digested by treatment with RNase A (manufactured by Beckman), and the DNA was purified.
Using this purified DNA as a template and targeting the 16S rRNA gene V4 region (about 300 base pairs), gene amplification reaction (Polymerase chain reaction [PCR]) with Q5 High-Fidelity DNA Polymerase/Q5 DNA polymerase (NEB) is performed. gone. The resulting PCR product was purified using AMPure XP kit (manufactured by Beckman Coulter) and Wizard (registered trademark) SV gel and PCR clean-up kit (manufactured by Promega), and the concentration was adjusted to Quant-iT PicoGreen dsDNA reagent. - Measured using a kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) and a fluorometer Nanodrop 3300 (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.).
最適量の精製産物をＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ キット３００サイクルと次世代シークエンサーＭｉＳｅｑ（イルミナ株式会社製）を用いた大規模塩基配列解析に供した。各試料から遺伝子断片を数万リード解読し、ソフトウエアｍｏｔｈuｒ（ｖｅｒ １．３１．２）を用いて、非特異的配列を除去し、ソフトウエアＱＩＩＭＥ（ｖｅｒ １．６．０）を用いて、微生物系統解析を行い、微生物種（ＯＴＵ：Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔ）の同定と相対存在量（％）の解析を行った。 An optimum amount of the purified product was subjected to large-scale nucleotide sequence analysis using MiSeq Reagent kit 300 cycles and next-generation sequencer MiSeq (manufactured by Illumina Inc.). Decode tens of thousands of gene fragments from each sample, remove non-specific sequences using software mothur (ver 1.31.2), use software QIIME (ver 1.6.0), Microbial phylogenetic analysis was performed to identify microbial species (OTU: Operational taxonomic unit) and analyze relative abundance (%).
得られたＯＴＵのうちセレン還元が観察された培養物において、培養後で未培養時点よりも３００倍以上に上昇している微生物を特定した。ＯＴＵの近縁種と遺伝子配列相同性をＮＣＢＩ塩基配列データベースのＢＬＡＳＴプログラムにより決定した。 Among the obtained OTUs, in the cultures in which selenium reduction was observed, microorganisms were identified that increased 300-fold or more after culture compared to the uncultured time. Gene sequence homology with closely related species of OTU was determined by the BLAST program of the NCBI nucleotide sequence database.
汚染試料１及び汚染試料２から６のライブラリを作成し、合計で約３３３４９７の遺伝子配列を解析した（５５３８３配列／ライブラリ）。次世代シークエンスデータを高次の微生物分類レベル（門又は綱）で系統解析した結果、セレン還元が観察された培養物では、培養開始時点に比べて微生物群集構造変化が顕著であった。特に、ファーミキューテス（Firmicutes）門に属する微生物群が汚染試料１及び汚染試料２において、培養開始時の約１６～２３６０倍高い相対存在量を示した（図２）。
Libraries were generated for contaminated
次に、微生物種（ＯＴＵ）レベルで解析したところ、セレン還元が観察された培養物で培養開始時と比べ約２３～３００倍に相対存在量が上昇するファーミキューテス（Firmicutes）門に属する７種の微生物を同定することができた（図３）。 Next, when analyzed at the microbial species (OTU) level, 7 belonging to the phylum Firmicutes, whose relative abundance increased about 23 to 300 times compared to the start of culture in cultures in which selenium reduction was observed. species of microorganisms could be identified (Fig. 3).
ＯＴＵ４６５７（セレン還元菌Ｆに属する）とＯＴＵ７０９１（セレン還元菌Ｇに属する）は、デサルフォスポロサエナス（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ）属に属する既知の硫酸還元菌であるデサルフォスポロサエナス・ブルネンシス（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ ｂｕｒｅｎｓｉｓ）及びデサルフォスポロサエナス・フラクトシボランス（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｉｖｏｒａｎｓ）と系統学的に同一又は近縁であった（それぞれ１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列相同性１００％と９９．２％とを示した）。 OTU4657 (belonging to selenium-reducing bacteria F) and OTU7091 (belonging to selenium-reducing bacteria G) are known sulfate-reducing bacteria belonging to the genus Desulfosporosinus Desulfosporosinus burensis. and Desulfosporosaenas fructosivorans phylogenetically identical or closely related (showing 100% and 99.2% 16S rRNA gene sequence homology, respectively).
ＯＴＵ１０７１（セレン還元菌Ｅに属する）は、単環芳香族炭化水素の分解に伴って鉄（ＩＩＩ）を還元する嫌気性微生物として知られるデサルフィトバクテリウム・アロマティシボランス（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）に近縁であった（遺伝子配列相同性：９７．６％）。 OTU1071 (belonging to selenium-reducing bacteria E) is closely related to Desulfitobacterium aromaticivorans, which is known as an anaerobic microorganism that reduces iron (III) accompanying the decomposition of monocyclic aromatic hydrocarbons. It was marginal (gene sequence homology: 97.6%).
ＯＴＵ２１９（セレン還元菌Ｄに属する）とＯＴＵ１８２５０（セレン還元菌Ｃに属する）は、データベース上で最も近縁な微生物種サーミコラ・カルボキシドフィラ（Ｔｈｅｒｍｉｎｃｏｌａ ｃａｒｂｏｘｙｄｉｐｈｉｌａ；ＮＲ０４３０１０）及びクロストリジウム・ノビィ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ；ＬＣ１９３８３４）に対して、低い配列相同性（９０．９％及び８９．０％）を示し、系統学的に新規な微生物であることが示唆された。 OTU219 (belonging to selenium-reducing bacteria D) and OTU18250 (belonging to selenium-reducing bacteria C) are the most closely related microbial species on the database, Thermincola carboxydiphila (NR043010) and Clostridium novyi (LC193834). ) showed low sequence homology (90.9% and 89.0%), suggesting that it is a phylogenetically novel microorganism.
ＯＴＵ２０５０１（セレン還元菌Ｂに属する）とＯＴＵ８４８９（セレン還元菌Ａに属する）は、データベース上で最も近縁な微生物種デサルフォスポロサエナス・フラクトシボランス（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｉｖｏｒａｎｓ；ＮＲ１５６９７６）及びスポロムーサ・シルバセティカ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ；ＮＲ０２６３７８）に対して、極めて低い配列相同性（８７．７％及び８８．６％）を示し、これまで報告されているいずれの微生物とも系統学的に異なり極めて新規な微生物であることが示唆された。 OTU20501 (belonging to selenium-reducing bacteria B) and OTU8489 (belonging to selenium-reducing bacteria A) are the most closely related microbial species on the database Desulfosporosaena fructosivorans (Desulfosporosinus fructosivorans; NR156976) and Sporomosa sylvathetica ( Sporomus silvacetica; NR026378), showing extremely low sequence homology (87.7% and 88.6%), and being a very novel microorganism that is phylogenetically different from any microorganisms reported so far. was suggested.
汚染試料１及び汚染試料２の微生物群集において、セレン還元菌は、いずれも培養開始時点では相対存在量が１％以下（汚染試料１：０．００２％以下から０．０２％；汚染試料２：０．００２％以下から０．０８％）の稀少微生物種であることが明らかになった。
In the microbial communities of contaminated
汚染試料１では水のみのセレン添加試験区においてＯＴＵ７０９１が最大の相対存在量であった（全体に対し６３．０％）。続いてＯＴＵ１８２５０の相対存在量が大きかった（全体に対し６．９６％）。リン酸を添加した試験区ではＯＴＵ２１９が最大の相対存在量であった（全体に対し６４．７％）。続いてＯＴＵ２０５０１の相対存在量が大きかった（全体に対し１３．４％）。
In contaminated
汚染試料２では水及びリン酸を添加した試験区においてＯＴＵ４６５７が最大の相対存在量であった（全体に対し４９．８％及び３５．８％）。続いて相対存在量が大きくなったのは、水ではＯＴＵ８４８９（全体に対し１１．２％）。リン酸ではＯＴＵ１０７１（全体に対し１８．１％）であった。 In contaminated Sample 2, OTU4657 had the highest relative abundance in the water and phosphoric acid spiked plots (49.8% and 35.8% of total). OTU8489 (11.2% of the total) had the next highest relative abundance in water. Phosphate was OTU1071 (18.1% of total).
以上から、嫌気的な雰囲気にした汚染試料中のセレン還元菌は、それぞれの試料及びリン酸の有無で劇的に増加し、４及び６価セレンの還元に関与していることが強く示唆される。 From the above, the selenium-reducing bacteria in the contaminated samples in an anaerobic atmosphere increased dramatically in each sample and in the presence or absence of phosphoric acid, strongly suggesting that they are involved in the reduction of tetravalent and hexavalent selenium. be.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019066412A JP7266804B2 (en) | 2019-03-29 | 2019-03-29 | Selenium reduction treatment method using selenium-contaminated sample containing selenium-reducing bacteria |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019066412A JP7266804B2 (en) | 2019-03-29 | 2019-03-29 | Selenium reduction treatment method using selenium-contaminated sample containing selenium-reducing bacteria |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2020162487A JP2020162487A (en) | 2020-10-08 |
| JP7266804B2 true JP7266804B2 (en) | 2023-05-01 |
Family
ID=72714593
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2019066412A Active JP7266804B2 (en) | 2019-03-29 | 2019-03-29 | Selenium reduction treatment method using selenium-contaminated sample containing selenium-reducing bacteria |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7266804B2 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001346584A (en) | 2000-06-07 | 2001-12-18 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | Method for specifically detecting selenic acid reducing bacterium |
| JP2010041954A (en) | 2008-08-12 | 2010-02-25 | Central Res Inst Of Electric Power Ind | Method for treating drainage with microorganism |
| JP2014124106A (en) | 2012-12-25 | 2014-07-07 | Electric Power Dev Co Ltd | New microorganism, selenate compound-reducing agent, method for reducing selenate compound, method for removing selenate compound and method for producing metallic selenium |
-
2019
- 2019-03-29 JP JP2019066412A patent/JP7266804B2/en active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001346584A (en) | 2000-06-07 | 2001-12-18 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | Method for specifically detecting selenic acid reducing bacterium |
| JP2010041954A (en) | 2008-08-12 | 2010-02-25 | Central Res Inst Of Electric Power Ind | Method for treating drainage with microorganism |
| JP2014124106A (en) | 2012-12-25 | 2014-07-07 | Electric Power Dev Co Ltd | New microorganism, selenate compound-reducing agent, method for reducing selenate compound, method for removing selenate compound and method for producing metallic selenium |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| BENZINE, Jason et al.，Fe-phyllosilicate redox cycling organisms from a redox transition zone in Handford 300 Area sediments，Frontiers in Microbiology，2013年，Vol. 4, Article 388，p. 1-13 |
| ESWAYAH, Abdurrahman S. et al.，Microbial Transformations of Selenium Species of Relevance to Bioremediation，Applied and Environmental Microbiology，2016年，Vol. 82, No. 16，p. 4848-4859 |
| KUNAPULI, Umakanth et al.，Desulfitobacterium aromaticivorans sp. nov. and Geobacter toluenoxydans sp. nov., iron-reducing bacteria capable of anaerobic degradation of monoaromatic hydrocarbons，International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2010年，60，p. 686-695 |
| KUNAPULI, Umakanth et al.，The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation，The ISME Journal，2007年，1，p. 643-653 |
| LIU, Jinshu et al.，Removal of selenate from brine using anaerobic bacteria and zero valent iron，Journal of Environmental Management，2018年，222，P. 348-358 |
| NAVARRO Ronald. R. et al.，High-Resolution Dynamics of Microbial Communities during Dissimilatory Selenate Reduction in Anoxic Soil，Environmental Science and Technology，2015年，49，p. 7684-7691 |
| WEI, Na et al.，Influence of Ferric Iron on Complete Dechlorination of Trichloroethylene (TCE) to Ethene: Fe(III) Reduction Does Not Always Inhibit Complete Dechlorination，Environmental Science and Technology，2011年，45，p. 7422-7430 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2020162487A (en) | 2020-10-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sun et al. | Bacterial survival strategies in an alkaline tailing site and the physiological mechanisms of dominant phylotypes as revealed by metagenomic analyses | |
| Sauder et al. | Cultivation and characterization of Candidatus Nitrosocosmicus exaquare, an ammonia-oxidizing archaeon from a municipal wastewater treatment system | |
| Gruber-Dorninger et al. | Functionally relevant diversity of closely related Nitrospira in activated sludge | |
| Hubalek et al. | Connectivity to the surface determines diversity patterns in subsurface aquifers of the Fennoscandian shield | |
| Hu et al. | Contrasting Euryarchaeota communities between upland and paddy soils exhibited similar pH-impacted biogeographic patterns | |
| Lee et al. | Monitoring bacterial community structure and variability in time scale in full-scale anaerobic digesters | |
| Hamedi et al. | A study on actinobacterial diversity of Hampoeil cave and screening of their biological activities | |
| Luo et al. | Functional genes based analysis of sulfur-oxidizing bacteria community in sulfide removing bioreactor | |
| Chernyh et al. | Microbial life in Bourlyashchy, the hottest thermal pool of Uzon Caldera, Kamchatka | |
| Lloyd et al. | Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes. mSystems 3: e00055-18 | |
| Zhu et al. | Changes in clover rhizosphere microbial community and diazotrophs in mercury-contaminated soils | |
| Bagnoud et al. | A minimalistic microbial food web in an excavated deep subsurface clay rock | |
| Leandro et al. | Study of methanogenic enrichment cultures of rock cores from the deep subsurface of the Iberian Pyritic Belt | |
| You et al. | A sustainable approach for removing nitrate: studying the nitrate transformation and metabolic potential under different carbon source by microorganism | |
| CN112789351A (en) | Microorganism-decomposing bacterium, microbial preparation, method for decomposing microorganism, and decomposing apparatus | |
| Jing et al. | Single-cell Raman-activated sorting and cultivation (scRACS-Culture) for assessing and mining in situ phosphate-solubilizing microbes from nature | |
| Wu et al. | Genome and transcriptome analysis of rock-dissolving Pseudomonas sp. NLX-4 strain | |
| CN114867845A (en) | Bacteria for sludge degradation, microorganism-degrading bacteria, microorganism preparation, method for sludge degradation, and sludge degradation apparatus | |
| JP7266804B2 (en) | Selenium reduction treatment method using selenium-contaminated sample containing selenium-reducing bacteria | |
| JP7452794B2 (en) | Selenium reduction treatment method using selenium-contaminated samples containing selenium-reducing bacteria | |
| Paul et al. | Metagenomic analysis of microbial communities in the soil-mousse surrounding of an Amazonian geothermal spring in Peru | |
| Sieradzki et al. | Metagenomics and stable isotope probing offer insights into metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons degraders in chronically polluted seawater | |
| Sharma et al. | Waste water microbes and environmental “clean up”: roadmap to environmental sustainability | |
| US20070134683A2 (en) | Probes and methods for identifying polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading mycobacteria | |
| JP2023146134A (en) | Selenium reduction treatment method using selenium-contaminated samples containing selenium-reducing bacteria |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211202 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20221021 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221101 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221228 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230322 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230407 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7266804 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |