JP7239205B2 - Novel host cell and method for producing target protein using the same - Google Patents
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Description
本発明は、特定の遺伝子を不活性化することにより目的タンパク質の生産性が向上した新規宿主細胞、遺伝子を不活性化するためのベクター、該新規宿主細胞を用いた目的タンパク質の製造方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel host cell in which target protein productivity is improved by inactivating a specific gene, a vector for inactivating the gene, and a method for producing a target protein using the novel host cell.
医療及び診断用途に活用するための抗体、酵素、及びサイトカイン等の産業上有用なバイオマテリアルの生産には、遺伝子組換え法が広く用いられている。遺伝子組換え法によって目的タンパク質を生産するための宿主としては、ニワトリ等の動物、CHO等の動物細胞、カイコ等の昆虫、sf9等の昆虫細胞、並びに酵母、大腸菌、及び放線菌等の微生物が用いられている。宿主生物の中でも酵母は、安価な培地で大規模かつ高密度での培養が可能であるため、目的タンパク質を低コストで生産することができること、シグナルペプチド等を利用すれば培養液中への分泌発現も可能なため目的タンパク質の精製過程も容易となること、及び真核生物であるため糖鎖付加等の翻訳後修飾も可能であることから非常に有益であり、様々な研究が行われている。酵母において種々の目的タンパク質に対応できる革新的な生産技術を開発することができれば、生産性の劇的向上によるコスト競争力の強化に加え、幅広い産業展開が期待できる。 Recombinant methods are widely used to produce industrially useful biomaterials such as antibodies, enzymes, and cytokines for medical and diagnostic applications. Hosts for producing target proteins by genetic recombination include animals such as chickens, animal cells such as CHO, insects such as silkworms, insect cells such as sf9, and microorganisms such as yeast, Escherichia coli, and actinomycetes. used. Among host organisms, yeast can be cultured on a large scale and at high density using an inexpensive medium, so it is possible to produce the target protein at low cost. Since it can be expressed, it facilitates the purification process of the target protein, and since it is a eukaryotic organism, post-translational modifications such as glycosylation are possible. there is If we can develop an innovative production technology that can handle various target proteins in yeast, we can expect a wide range of industrial development, in addition to strengthening cost competitiveness by dramatically improving productivity.
酵母の一種であるコマガタエラ・パストリス(Komagataella pastoris)はタンパク質発現能力に優れ、工業生産上有利である安価な炭素源を活用できるメタノール資化性酵母である。例えば、非特許文献1には、コマガタエラ・パストリスを用いて、緑色蛍光タンパク質、ヒト血清アルブミン、B型肝炎ウイルス表面抗原、ヒトインシュリン、及び一本鎖抗体等の外来タンパク質を生産する方法が報告されている。酵母において外来タンパク質を生産する場合、その生産性の向上のために、シグナル配列の付加、強力なプロモーターの利用、コドン改変、シャペロン遺伝子の共発現、転写因子遺伝子の共発現、宿主酵母由来のプロテアーゼ遺伝子の不活性化、及び培養条件の検討等様々な試みがなされている。 Komagataella pastoris, a kind of yeast, is a methanol-assimilating yeast that has an excellent ability to express proteins and can utilize an inexpensive carbon source that is advantageous for industrial production. For example, Non-Patent Document 1 reports a method for producing foreign proteins such as green fluorescent protein, human serum albumin, hepatitis B virus surface antigen, human insulin, and single-chain antibodies using Komagataella pastoris. ing. Addition of signal sequence, use of strong promoter, modification of codons, co-expression of chaperone genes, co-expression of transcription factor genes, protease derived from host yeast to improve productivity when producing foreign proteins in yeast Various attempts such as gene inactivation and examination of culture conditions have been made.
本発明は、目的タンパク質の生産性を向上させる新たな手段を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a new means for improving the productivity of a target protein.
本発明者らは、コマガタエラ属酵母の染色体DNAの塩基配列の網羅的解析により、新規タンパク質を同定した。そして、該新規タンパク質をコードする遺伝子を不活性化することで、宿主細胞において目的タンパク質の分泌量が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の態様を包含する。 The present inventors identified a novel protein by comprehensive analysis of the nucleotide sequences of chromosomal DNA of yeast of the genus Komagataella. Then, the present inventors have found that the amount of target protein secreted in host cells is improved by inactivating the gene encoding the novel protein, and have completed the present invention. That is, the present invention includes the following aspects.
以下の(a)~(d)のいずれかの遺伝子が不活性化された宿主細胞:
(a)配列番号1に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号3に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号5に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号7に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号9に示す塩基配列を含む遺伝子、及び/又は配列番号11に示す塩基配列を含む遺伝子、
(b)配列番号1に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
配列番号3に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
配列番号5に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
配列番号7に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
配列番号9に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、及び/又は
配列番号11に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
(c)配列番号1に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
配列番号3に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
配列番号5に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
配列番号7に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
配列番号9に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、及び/又は
配列番号11に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
(d)配列番号2に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、
配列番号4に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、
配列番号6に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、
配列番号8に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、
配列番号10に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び/又は
配列番号12に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子。
A host cell in which any of the following genes (a) to (d) is inactivated:
(a) a gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, a gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, a gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 9 and/or a gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11,
(b) a gene comprising a nucleotide sequence of a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1;
a gene comprising a nucleotide sequence of a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3;
a gene comprising a nucleotide sequence of a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5;
a gene comprising a nucleotide sequence of a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7;
A gene comprising a nucleotide sequence of a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 and/or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 a gene comprising a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions to
(c) a gene containing a nucleotide sequence having 85% or more sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1;
a gene containing a nucleotide sequence having 85% or more sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3;
a gene comprising a nucleotide sequence having 85% or more sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5;
a gene comprising a nucleotide sequence having 85% or more sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7;
A gene comprising a nucleotide sequence having 85% or more sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9, and/or a gene comprising a nucleotide sequence having 85% or more sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11,
(d) a gene encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
a gene encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4;
a gene encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6;
a gene encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8;
A gene encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 and/or a gene encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 .
前記宿主細胞は、前記(a)~(d)のいずれかの遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記(a)~(d)のいずれかの遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び/又は前記(a)~(d)のいずれかの遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列を含有するベクターで形質転換して得られることが好ましい。 The host cell comprises a nucleotide sequence having a region homologous to any of the genes (a) to (d), a nucleotide sequence having a region homologous to the promoter of any of the genes (a) to (d), and / Or it is preferably obtained by transformation with a vector containing a nucleotide sequence having a region homologous to the terminator of any of the genes (a) to (d).
前記宿主細胞において、前記ベクターが、前記塩基配列の上流または下流に目的タンパク質をコードする塩基配列を含有することが好ましい。 In the host cell, the vector preferably contains a nucleotide sequence encoding the target protein upstream or downstream of the nucleotide sequence.
前記宿主細胞が、目的タンパク質をコードする塩基配列を含有するベクターを含むことが好ましい。 The host cell preferably contains a vector containing a nucleotide sequence encoding the protein of interest.
前記宿主細胞が、酵母、細菌、真菌、昆虫細胞、動物細胞、又は植物細胞であることが好ましい。 Preferably said host cells are yeast, bacteria, fungi, insect cells, animal cells or plant cells.
前記酵母が、メタノール資化性酵母、分裂酵母、又は出芽酵母であることが好ましい。 The yeast is preferably methanol-assimilating yeast, fission yeast, or budding yeast.
前記メタノール資化性酵母がコマガタエラ属酵母又はオガタエア属酵母であることが好ましい。 It is preferable that the methanol-assimilating yeast is a yeast belonging to the genus Komagataella or a yeast belonging to the genus Ogataea.
また、本発明は、前記宿主細胞を培養する工程、及び培養液から目的タンパク質を回収する工程を含む、目的タンパク質の製造方法に関する。 The present invention also relates to a method for producing a target protein, comprising the steps of culturing the host cell and recovering the target protein from the culture medium.
前記目的タンパク質が異種タンパク質であることが好ましい。 Preferably, said protein of interest is a heterologous protein.
前記培養工程において、グルコース、グリセロール、及びメタノールからなる群から選択される一以上の炭素源を含む培養液を用いることが好ましい。 In the culture step, it is preferable to use a culture medium containing one or more carbon sources selected from the group consisting of glucose, glycerol and methanol.
本発明に記載の遺伝子を不活性化することにより、コマガタエラ属酵母を宿主として用いる目的タンパク質の効率的な生産方法が提供される。 By inactivating the gene according to the present invention, there is provided an efficient method for producing a target protein using yeast of the genus Komagataella as a host.
以下、本発明を、好ましい実施形態を用いて詳細に説明する。 The present invention will now be described in detail using preferred embodiments.
一態様において、本発明は、以下の(a)~(d)のいずれかの遺伝子が不活性化された宿主細胞:
(a)配列番号1に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号3に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号5に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号7に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号9に示す塩基配列を含む遺伝子、及び/又は配列番号11に示す塩基配列を含む遺伝子、
(b)配列番号1に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
配列番号3に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
配列番号5に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
配列番号7に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
配列番号9に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、及び/又は
配列番号11に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
(c)配列番号1に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
配列番号3に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
配列番号5に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
配列番号7に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
配列番号9に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、及び/又は
配列番号11に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
(d)配列番号2に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、
配列番号4に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、
配列番号6に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、
配列番号8に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、
配列番号10に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び/又は
配列番号12に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、に関する。
In one aspect, the present invention provides a host cell in which any one of the following genes (a) to (d) has been inactivated:
(a) a gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, a gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, a gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 9 and/or a gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11,
(b) a gene comprising a nucleotide sequence of a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1;
a gene comprising a nucleotide sequence of a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3;
a gene comprising a nucleotide sequence of a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5;
a gene comprising a nucleotide sequence of a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7;
A gene comprising a nucleotide sequence of a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 and/or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 a gene comprising a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions to
(c) a gene containing a nucleotide sequence having 85% or more sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1;
a gene containing a nucleotide sequence having 85% or more sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3;
a gene comprising a nucleotide sequence having 85% or more sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5;
a gene comprising a nucleotide sequence having 85% or more sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7;
A gene comprising a nucleotide sequence having 85% or more sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9, and/or a gene comprising a nucleotide sequence having 85% or more sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11,
(d) a gene encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
a gene encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4;
a gene encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6;
a gene encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8;
A gene encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 and/or a gene encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 , concerning.
本発明において、2つの核酸がストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、例えば以下の意味である。例えば、核酸Xを固定化したフィルターを用いて、0.7~1.0MのNaCl存在下、65℃で核酸Yとハイブリダイゼーションを行った後、2倍濃度のSSC溶液(1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウムよりなる)を用い、65℃の条件下でフィルターを洗浄することにより、核酸Yがフィルター上に結合した核酸として取得できる場合に、核酸Yを「核酸Xとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸」と言うことができる。或いは核酸Xと核酸Yとが「ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズする」ということができる。核酸Yは、前記フィルターを、好ましくは65℃で0.5倍濃度のSSC溶液で洗浄、より好ましくは65℃で0.2倍濃度のSSC溶液で洗浄、更に好ましくは65℃で0.1倍濃度のSSC溶液で洗浄することによりフィルター上に結合した核酸として取得できる核酸である。基準となる核酸Xは、コロニー又はプラーク由来の核酸Xであってよい。 In the present invention, two nucleic acids hybridize under stringent conditions means, for example, the following. For example, using a filter immobilized with nucleic acid X, after hybridization with nucleic acid Y at 65°C in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl, a double concentration SSC solution (composition of a single concentration SSC solution consists of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate), and the filter is washed at 65°C. and a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions". Alternatively, it can be said that nucleic acid X and nucleic acid Y "hybridize with each other under stringent conditions". For nucleic acid Y, the filter is preferably washed at 65°C with a 0.5-fold concentration SSC solution, more preferably at 65°C with a 0.2-fold concentration SSC solution, and still more preferably at 65°C with a 0.1-fold concentration SSC solution. It is a nucleic acid that can be obtained as a nucleic acid bound on a filter by washing. The reference nucleic acid X may be colony- or plaque-derived nucleic acid X.
本発明において塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。例えば、BLASTアルゴリズムのblastnプログラムやblastpプログラム、FASTAアルゴリズムのfastaプログラムが挙げられる。本発明において、ある評価対象塩基配列の、塩基配列Xとの「配列同一性」とは、塩基配列Xと評価対象塩基配列とを整列(アラインメント)させ、必要に応じてギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、ギャップ部分も含んだ塩基配列において同一部位に同一の塩基が出現する頻度を%で表示した値である。本発明において、ある評価対象アミノ酸配列の、アミノ酸配列Xとの「配列同一性」とは、アミノ酸配列Xと評価対象アミノ酸配列とを整列(アラインメント)させ、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、ギャップ部分も含んだアミノ酸配列において同一部位に同一のアミノ酸が出現する頻度を%で表示した値である。前記遺伝子と配列番号1、3 、5、7、9、及び/又は11に示す塩基配列との配列同一性は、85%以上であり、90%以上が好ましく、95%以上がより好ましく、96%以上がさらにより好ましく、97%以上が特に好ましく、98%以上、又は99%以上が最も好ましい。 In the present invention, the sequence identity of base sequences and amino acid sequences can be determined using methods, sequence analysis software and the like well known to those skilled in the art. Examples thereof include the blastn program and blastp program of the BLAST algorithm, and the fasta program of the FASTA algorithm. In the present invention, the "sequence identity" of a base sequence to be evaluated with a base sequence X means that the base sequence X and the base sequence to be evaluated are aligned (aligned), gaps are introduced as necessary, It is a value expressed in % of the frequency at which the same base appears at the same site in the base sequence including the gap portion when the degree of base matching between the two is maximized. In the present invention, the "sequence identity" of a given amino acid sequence to be evaluated with an amino acid sequence X means that the amino acid sequence X and the amino acid sequence to be evaluated are aligned (aligned), gaps are introduced as necessary, It is the value expressed in % of the frequency of appearance of the same amino acid at the same site in the amino acid sequence including the gap portion when the degree of amino acid identity between the two is maximized. The sequence identity between the gene and the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, and/or 11 is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and 96 % or more is even more preferred, 97% or more is particularly preferred, and 98% or more, or 99% or more is most preferred.
本発明において「核酸」とは、「ポリヌクレオチド」と呼ぶこともでき、DNA又はRNAを指し、典型的にはDNAを指す。 In the present invention, "nucleic acid" can also be referred to as "polynucleotide" and refers to DNA or RNA, typically DNA.
本発明において「アミノ酸配列をコードする塩基配列」とは、アミノ酸配列からなるポリペプチドに対してコドン表に基づいて設計された塩基配列を指し、該塩基配列は、転写及び翻訳によってポリペプチドの生成をもたらす。 In the present invention, the term "nucleotide sequence encoding an amino acid sequence" refers to a nucleotide sequence designed based on the codon table for a polypeptide consisting of an amino acid sequence, and the nucleotide sequence is used to generate a polypeptide by transcription and translation. bring.
本発明において、「ポリペプチド」とは、2個以上のアミノ酸がペプチド結合したものを指し、タンパク質の他、ペプチドやオリゴペプチドと呼ばれる鎖長の短いものが含まれる。 In the present invention, the term "polypeptide" refers to a peptide bond of two or more amino acids, and includes proteins as well as short-chain peptides and oligopeptides.
本発明において「不活性化」とは、遺伝子の機能が失われている状態、または機能が減少している状態を指し、当該遺伝子の転写産物であるmRNAや翻訳産物であるポリペプチドの発現量が低下している状態やmRNAやタンパク質として正常に機能しない状態も包含する。なお、mRNAの発現量はリアルタイムPCR法、RNA-Seq法、ノーザンハイブリダイゼーション又はDNAアレイを利用したハイブリダイゼーション法等を用いて定量することができ、ポリペプチドの発現量は、ポリペプチドを認識する抗体やポリペプチドと結合性を有する染色化合物等を用いて定量することができる。また、上記に挙げた定量方法以外にも、当業者で用いられている従来法であってもよい。 In the present invention, "inactivation" refers to a state in which the function of a gene is lost or reduced, and the expression level of mRNA, which is the transcription product of the gene, or polypeptide, which is the translation product It also includes a state in which the protein is reduced and a state in which it does not function normally as mRNA or protein. The expression level of mRNA can be quantified using real-time PCR, RNA-Seq, Northern hybridization, or hybridization using a DNA array. It can be quantified using an antibody, a staining compound that binds to the polypeptide, or the like. In addition to the quantification methods listed above, conventional methods used by those skilled in the art may also be used.
遺伝子を不活性化させる手段としては、薬剤や紫外線を用いたDNA変異処理、PCRを用いた部分特異的変異導入、RNAi、プロテアーゼ、相同組み換え等を利用することができる。遺伝子を不活性化させる場合は、当該遺伝子のORF内の塩基配列の改変(欠失、置換、付加、挿入)、及び/又はプロモーター領域、エンハンサー領域、ターミネーター領域などの転写開始または停止を制御する領域内の塩基配列の改変(欠失、置換、付加、挿入)により行う。なお、前記欠失、置換、付加、挿入を行う部位や、欠失、置換、付加、挿入される塩基配列は、当該遺伝子の正常な機能が欠損し得る限り、特に限定されない。不活性化させる遺伝子は、宿主細胞の染色体上の遺伝子であってもよく、宿主細胞の染色体外の遺伝子であってもよい。このうち、染色体上の遺伝子を不活性化させることが好ましい。 As means for inactivating genes, DNA mutation treatment using drugs or ultraviolet rays, partial specific mutagenesis using PCR, RNAi, protease, homologous recombination, and the like can be used. When inactivating a gene, modification (deletion, substitution, addition, insertion) of the nucleotide sequence within the ORF of the gene, and/or transcription initiation or termination of the promoter region, enhancer region, terminator region, etc. are controlled. Modification (deletion, substitution, addition, insertion) of the nucleotide sequence within the region is performed. The sites for deletion, substitution, addition, and insertion, and the base sequences to be deleted, substituted, added, and inserted, are not particularly limited as long as the normal function of the gene can be lost. The gene to be inactivated may be a gene on the chromosome of the host cell or a gene extrachromosomal in the host cell. Among these, it is preferable to inactivate the gene on the chromosome.
本発明における「塩基配列の改変」とは、相同組換えを利用した遺伝子の挿入や部位特異的変異導入の手法を使用して実施することができる。例えば、遺伝子上流プロモーターのより活性の低いプロモーターへの置換や、宿主細胞に適していないコドンへの改変等、また、欠失させたい遺伝子の上流配列、選択マーカー遺伝子配列及び欠失させたい遺伝子の下流配列を連結させたベクターの導入などが挙げられる。 "Modification of base sequence" in the present invention can be carried out using a technique of gene insertion or site-directed mutagenesis using homologous recombination. For example, replacement of the gene upstream promoter with a promoter with lower activity, modification to codons not suitable for host cells, etc. Examples include introduction of a vector linked with a downstream sequence.
本発明において発現量低下の度合は、目的タンパク質の生産性が向上すれば特に限定されないが、5%以上、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上低下していることが好ましい。なお、発現量が低下していなくとも、上述のとおり、遺伝子産物の正常な機能が欠損し得る限り、不活性化することができることは、当業者であれば周知であるから、発現量の低下の度合は、あくまで不活性化の判断基準の1つにすぎない。 In the present invention, the degree of decrease in expression level is not particularly limited as long as the productivity of the target protein is improved, but is 5% or more, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60%. It is preferable that the reduction is 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more. It is well known to those skilled in the art that even if the expression level is not reduced, as long as the normal function of the gene product can be lost, it can be inactivated as described above. The degree of is only one of the criteria for inactivation.
本明細書において、「宿主細胞」とは、ベクターが導入され形質転換される細胞をいい、「宿主」又は「形質転換体」と呼ばれる。本明細書では形質転換前及び後の宿主細胞を単に「細胞」と呼ぶ場合がある。宿主として用いる細胞はベクターを導入することの出来る細胞であれば特に限定されない。 As used herein, the term "host cell" refers to a cell into which a vector is introduced and transformed, and is also called a "host" or a "transformant". Host cells, before and after transformation, are sometimes referred to herein simply as "cells." Cells used as hosts are not particularly limited as long as they are cells into which the vector can be introduced.
「配列番号1に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号3に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号5に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号7に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号9に示す塩基配列を含む遺伝子、及び/又は配列番号11に示す塩基配列を含む遺伝子」は、コマガタエラ・パストリスの4本の染色体DNAの塩基配列(ATCC76273株:ACCESSION No. FR839628~FR839631(J. Biotechnol. 154 (4), 312-320 (2011))、及びGS115株:ACCESSION No. FN392319~FN392322(Nat. Biotechnol. 27 (6), 561-566 (2009)))の網羅的解析により見出された。具体的には、本発明者は、不活性化によって目的タンパク質の生産性が向上するポリペプチド、及びそのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを探索した。その結果、下記のポリヌクレオチドを見出した。 "Gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 9 A gene containing a nucleotide sequence and/or a gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11" is the nucleotide sequence of four chromosomal DNAs of Komagataella pastoris (ATCC76273 strain: ACCESSION No. FR839628 to FR839631 (J. Biotechnol. 154 (4), 312-320 (2011)), and GS115 strain: ACCESSION No. FN392319 to FN392322 (Nat. Biotechnol. 27 (6), 561-566 (2009))). Specifically, the present inventors searched for a polypeptide whose inactivation improves the productivity of the target protein, and a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence. As a result, the following polynucleotides were found.
ATCC76273株において配列番号2で示されるアミノ酸配列(ACCESSION No. CCA39734)で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号1で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
ATCC76273株において配列番号4で示されるアミノ酸配列(ACCESSION No. CCA38267)で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号3で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
ATCC76273株において配列番号6で示されるアミノ酸配列(ACCESSION No. CCA37956)で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号5で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
ATCC76273株において配列番号8で示されるアミノ酸配列(ACCESSION No. CCA37582)で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号7で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
ATCC76273株において配列番号10で示されるアミノ酸配列(ACCESSION No. CCA39503)で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号9で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
ATCC76273株において配列番号12で示されるアミノ酸配列(ACCESSION No. CCA38927)で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号11で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド。
A polynucleotide comprising a polypeptide represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (ACCESSION No. CCA39734) in the ATCC76273 strain, and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 encoding the polypeptide;
A polynucleotide comprising a polypeptide represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (ACCESSION No. CCA38267) in the ATCC76273 strain, and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 encoding the polypeptide;
A polynucleotide comprising a polypeptide represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (ACCESSION No. CCA37956) in the ATCC76273 strain, and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 encoding the polypeptide;
A polynucleotide comprising a polypeptide represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 (ACCESSION No. CCA37582) in the ATCC76273 strain, and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 encoding the polypeptide;
A polynucleotide comprising a polypeptide represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 (ACCESSION No. CCA39503) in the ATCC76273 strain, and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 encoding the polypeptide;
A polynucleotide comprising the polypeptide represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 (ACCESSION No. CCA38927) in strain ATCC76273 and the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 encoding the polypeptide.
後述する実施例において、本発明者らは上記の塩基配列からなる遺伝子を不活性化させるベクターを宿主に導入し、目的タンパク質の生産性が向上することを確認している。 In the examples described later, the present inventors introduced a vector that inactivates the gene consisting of the above nucleotide sequence into a host, and confirmed that the productivity of the target protein was improved.
配列番号1に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号3に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号5に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号7に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号9に示す塩基配列を含む遺伝子、及び/又は配列番号11に示す塩基配列を含む遺伝子、若しくはそれらの改変型遺伝子は、単独で不活性化されていてもよく、一つの宿主細胞で複数の遺伝子が不活性化されていてもよい。前記遺伝子の複数が不活性化される場合には、不活性化される遺伝子の個数は、2個、3個、4個、5個、6個が挙げられる。複数の遺伝子が不活性化される具体例としては、配列番号1に示す塩基配列を含む遺伝子、及び配列番号3に示す塩基配列を含む遺伝子、又はそれらの改変型遺伝子の不活性化、配列番号1に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号3に示す塩基配列を含む遺伝子、及び配列番号5に示す塩基配列を含む遺伝子、又はそれらの改変型遺伝子の不活性化、配列番号1に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号3に示す塩基配列を含む遺伝子、及び配列番号7に示す塩基配列を含む遺伝子、又はそれらの改変型遺伝子の不活性化、配列番号1に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号3に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号5に示す塩基配列を含む遺伝子、及び配列番号7に示す塩基配列を含む遺伝子、又はそれらの改変型遺伝子の不活性化が挙げられる。 Gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, base shown in SEQ ID NO: 9 A gene containing the sequence and/or a gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11, or a modified gene thereof may be inactivated singly, and multiple genes may be inactivated in one host cell. may have been When more than one of the genes is inactivated, the number of genes to be inactivated may be 2, 3, 4, 5, or 6. Specific examples of inactivation of multiple genes include inactivation of a gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, or modified genes thereof, SEQ ID NO: Inactivation of the gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, the gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, or their modified genes, and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 , the gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7, or their modified genes, the gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, the sequence Examples include inactivation of the gene containing the nucleotide sequence shown in No. 3, the gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, the gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7, or modified genes thereof.
本明細書において、宿主細胞からのタンパク質の生産量の増加は、親細胞又は野生型株におけるタンパク質の生産量に対して、例えば1.01倍、1.02倍、1.03倍、1.04倍、1.05倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、又は5倍以上、また100倍、90倍、80倍、70倍、60倍、50倍、40倍、30倍、20倍、10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、又は5倍以下であってよい。タンパク質を分泌生産する場合、細胞からの全タンパク質の分泌量は、細胞の培養上清等を用いて、当業者に公知の方法、例えばBladford法、Lowry法、及びBCA法等により容易に決定することができる。細胞からの特定のタンパク質の分泌量は、細胞の培養上清等を用いて、ELISA法等により容易に決定することができる。 As used herein, the increase in protein production from the host cell is, for example, 1.01-fold, 1.02-fold, 1.03-fold, 1.04-fold, 1.05-fold, 1.1-fold relative to the protein production in the parent cell or wild-type strain. , 1.2x, 1.3x, 1.4x, 1.5x, 1.6x, 1.7x, 1.8x, 1.9x, 2x, 2.5x, 3x, 3.5x, 4x, 4.5x, or 5x or more, or 100x It may be 90-fold, 80-fold, 70-fold, 60-fold, 50-fold, 40-fold, 30-fold, 20-fold, 10-fold, 9-fold, 8-fold, 7-fold, 6-fold, or 5-fold or less. When a protein is produced by secretion, the amount of total protein secreted from cells can be easily determined by methods known to those skilled in the art, such as the Bradford method, Lowry method, and BCA method, using cell culture supernatants and the like. be able to. The amount of a specific protein secreted from a cell can be easily determined by ELISA or the like using cell culture supernatant or the like.
本明細書において、「親細胞」、「野生型株」、又は「導入前の宿主細胞」とは、上記(a)~(d)のいずれかに示す塩基配列を含む遺伝子の発現を変化させるような処理を施していない宿主細胞又は株を意味する。したがって、本明細書に記載の「親細胞」、「野生型株」、又は「導入前の宿主細胞」には、上記(a)~(d)のいずれかに示す塩基配列を含む遺伝子以外の遺伝子を改変した宿主細胞又は株も含まれる。 As used herein, the term "parent cell", "wild-type strain", or "host cell before introduction" refers to the expression of a gene containing the nucleotide sequence shown in any of (a) to (d) above. means a host cell or strain that has not been subjected to such treatment. Therefore, the "parent cell", "wild-type strain", or "host cell before introduction" described herein includes genes other than the nucleotide sequence shown in any of (a) to (d) above. Also included are genetically modified host cells or strains.
配列番号1に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号3に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号5に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号7に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号9に示す塩基配列を含む遺伝子、及び/又は配列番号11に示す塩基配列を含む遺伝子を不活性化する例として、後述する実施例のように、当該遺伝子の上流に位置するプロモーターの相補配列と100%の配列同一性を有する塩基配列、及び当該遺伝子の下流に位置するターミネーターの相補配列と100%の配列同一性を有する塩基配列を、プライマー1~46を用いてPCR産物として調製し、該PCR産物をベクターとしてコマガタエラ属酵母に形質転換する方法が挙げられる。 Gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, base shown in SEQ ID NO: 9 As an example of inactivating the gene containing the sequence and/or the gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11, as in the examples described later, the complementary sequence and 100% sequence of the promoter located upstream of the gene A nucleotide sequence having identity and a nucleotide sequence having 100% sequence identity with the complementary sequence of the terminator located downstream of the gene are prepared as PCR products using primers 1 to 46, and the PCR products are used as vectors. Examples include a method of transforming into Komagataella yeast.
「配列番号2に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、配列番号4に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、配列番号6に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、配列番号8に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、配列番号10に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び/又は配列番号12に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子」とは、配列番号2、4、6、8、10、12に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づきコドン表を参照して設計される塩基配列からなる遺伝子、及びそれらの組み合わせのことを指す。配列番号2、4、6、8、10、12に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づきコドン表を参照して設計される塩基配列からなる遺伝子としては、例えば、それぞれ配列番号1、3、5、7、9、11に示す遺伝子が挙げられる。そして、当該遺伝子を不活性化させることで、目的タンパク質の生産量を向上することができる。前記配列同一性は、85%以上であり、90%以上が好ましく、95%以上がより好ましく、96%以上がさらにより好ましく、97%以上が特に好ましく、98%以上、又は99%以上が最も好ましい。 "Gene encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, gene encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, sequence A gene encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in No. 6, a gene encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 and/or a gene encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12" A gene consisting of a nucleotide sequence designed with reference to the codon table based on a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, and 12. , and combinations thereof. A gene consisting of a base sequence designed with reference to the codon table based on a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, and 12 include, for example, the genes represented by SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9 and 11, respectively. By inactivating the gene, the yield of the target protein can be improved. The sequence identity is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 96% or more, particularly preferably 97% or more, and most preferably 98% or more, or 99% or more. preferable.
本発明の宿主細胞は、前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び/又は前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも1つ含有するベクターを形質転換することにより得られることが好ましい。 The host cell of the present invention comprises a nucleotide sequence having a region homologous to the gene according to any one of (a) to (d) above, and a promoter and homologous region of the gene according to any one of (a) to (d) above. and / or a nucleotide sequence having a region homologous to the gene terminator according to any one of (a) to (d) above. is preferred.
本発明は、前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも1つ含有するベクターを形質転換することで、宿主細胞の染色体上における前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子を不活性化させることができる。また、ベクターは、各々の相同領域を有する塩基配列をすべて組み込んだベクターを用いても良いし、各々の相同領域を有する塩基配列を、それぞれ1つずつ組み込んだベクターを用いても良い。 The present invention provides a nucleotide sequence having a region homologous to the gene according to any one of (a) to (d) above, and a nucleotide having a region homologous to the promoter of the gene according to any one of (a) to (d) above. by transforming a vector containing at least one of the sequence and a nucleotide sequence having a region homologous to the terminator of the gene according to any one of (a) to (d) above, on the chromosome of the host cell The gene according to any one of (a) to (d) can be inactivated. A vector may be used in which all nucleotide sequences having respective homologous regions are incorporated, or vectors may be used in which each nucleotide sequence having homologous regions is incorporated one by one.
本発明のベクターは環状ベクター、直鎖状ベクター、プラスミド、人工染色体等であることができる。 The vectors of the present invention can be circular vectors, linear vectors, plasmids, artificial chromosomes, and the like.
本発明においてベクターとは人為的に構築された核酸分子である。本発明のベクターを構成する核酸分子は、通常DNA、好ましくは二本鎖DNAであり、環状であっても、直鎖状であってもよい。本発明のベクターは、通常は、所定の塩基配列(上述した前記(a)~(d)のいずれかの塩基配列、前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列、或いは、これらの塩基配列のうち複数が連結(適当な長さの他の塩基配列を介して連結する場合を含む)した塩基配列)に加えて、1つ以上の制限酵素認識部位を含むクローニングサイト、Clontech社のIn-FusionクローニングシステムやNew England Biolabs社のGibson Assemblyシステム等を利用するためのオーバーラップ領域、内在性遺伝子の塩基配列、目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、選択マーカー遺伝子(栄養要求性相補遺伝子、薬剤耐性遺伝子など)の塩基配列等を含むことができる。直鎖状ベクターの例としては、URA3遺伝子、LEU2遺伝子、ADE1遺伝子、HIS4遺伝子、ARG4遺伝子等の栄養要求性相補遺伝子やG418耐性遺伝子、Zeocin(商標)耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、Clone NAT耐性遺伝子、ブラストサイジンS耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子の塩基配列を有するPCR産物、または環状ベクターやプラスミドを適当な制限酵素によって切断し、直鎖状としたものなどが挙げられる。プラスミドの例としては、YEpベクター、YRpベクター、YCpベクター、pPICHOLI(http://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/p_picholi_shuttle_vector.html)、pHIP(Journal of General Microbioiogy (1992), 138, 2405-2416. Chromosomal targeting of replicating plasmids in the yeast Hansenula polymorpha)、pHRP(pHIPについて挙げた前記文献参照)、pHARS(Molecular and General Genetics MGG February 1986, Volume 202, Issue 2, pp 302-308, Transformation of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha by autonomous replication and integration vectors)、大腸菌由来プラスミドベクター(pUC18、pUC19、pBR322、pBluescript、pQE)、枯草菌由来プラスミドベクター(pHY300PLK、pMTLBS72)等を使用することができる。人工染色体の例としては、一般に、セントロメアDNA配列、テロメアDNA配列、自律複製配列(ARS)を含む人工染色体ベクターを指し、酵母であれば酵母人工染色体(YACベクター)などが挙げられ、Saccharomyces cerevisiaeやSchizosaccharomyces pombeなどにおいて開発されている。コマガタエラ・パストリスにおいては国際公開第2016/088824号に記載されているセントロメアDNA配列を用いることによって人工染色体を構築することができる。 A vector in the present invention is an artificially constructed nucleic acid molecule. A nucleic acid molecule constituting a vector of the present invention is usually DNA, preferably double-stranded DNA, and may be circular or linear. The vector of the present invention usually has a predetermined base sequence (the base sequence of any of the above (a) to (d), homologous to the promoter of the gene of any of the above (a) to (d)). A base sequence having a region, a base sequence having a region homologous to the gene terminator described in any one of (a) to (d) above, or a plurality of these base sequences linked together (other Cloning site containing one or more restriction enzyme recognition sites, In-Fusion cloning system from Clontech, Gibson Assembly system from New England Biolabs, etc. Overlapping region for utilizing , base sequence of endogenous gene, base sequence encoding polypeptide consisting of target protein amino acid sequence, base sequence of selectable marker gene (auxotrophic complementary gene, drug resistance gene, etc.), etc. can include Examples of linear vectors include auxotrophic complementary genes such as URA3 gene, LEU2 gene, ADE1 gene, HIS4 gene, ARG4 gene, G418 resistance gene, Zeocin (trademark) resistance gene, hygromycin resistance gene, Clone NAT resistance. DNA, a PCR product having a base sequence of a drug-resistant gene such as a blasticidin S-resistant gene, or a circular vector or plasmid cleaved with an appropriate restriction enzyme to form a linear chain. Examples of plasmids include YEp vector, YRp vector, YCp vector, pPICHOLI (http://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/p_piccholi_shuttle_vector.html), pHIP (Journal of General Microbioogy (1992), 138, 2405-2416. Chromosomal targeting of replicating plasmids in the yeast Hansenula polymorpha), pHRP (see above references cited for pHIP), pHARS (Molecular and General Genetics MGG February 1986, Volume 202, Issue 2, pp 302-308, Transformation of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha by autonomous replication and integration vectors), Escherichia coli-derived plasmid vectors (pUC18, pUC19, pBR322, pBluescript, pQE), Bacillus subtilis-derived plasmid vectors (pHY300PLK, pMTLBS72), and the like can be used. Examples of artificial chromosomes generally refer to artificial chromosome vectors containing centromere DNA sequences, telomere DNA sequences, autonomously replicating sequences (ARS), and yeast artificial chromosomes (YAC vectors) for yeast, such as Saccharomyces cerevisiae and Developed in Schizosaccharomyces pombe and others. In Komagataella pastoris, an artificial chromosome can be constructed by using the centromere DNA sequence described in WO 2016/088824.
本発明において「形質転換」とは、上記ベクターを細胞に導入することを指す。ベクターを宿主細胞へ導入する方法、すなわち形質転換法は公知の方法を適宜用いることができ、例えば宿主として酵母細胞を用いる場合、エレクトロポレーション法、酢酸リチウム法、スフェロプラスト法等が挙げられるが特にこれらに限定されるものではない。例えば、コマガタエラ・パストリスの形質転換法としては、High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithiumacetate and dithiothreitol(Biotechniques. 2004 Jan;36(1):152-4.)に記載されているエレクトロポレーション法が一般的である。 In the present invention, "transformation" refers to introduction of the vector into cells. A method for introducing a vector into a host cell, that is, a transformation method, can appropriately use known methods. For example, when yeast cells are used as a host, electroporation method, lithium acetate method, spheroplast method, etc. are not particularly limited to these. For example, as a transformation method of Komagataera pastoris, the electroporation method described in High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithiumacetate and dithiothreitol (Biotechniques. 2004 Jan;36(1):152-4.) is common.
本発明において、ベクターをコマガタエラ属酵母に形質転換する場合、栄養要求性相補遺伝子または薬剤耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子を用いることが好ましい。選択マーカーは特に限定されないが、コマガタエラ属酵母であれば、URA3遺伝子、LEU2遺伝子、ADE1遺伝子、HIS4遺伝子、ARG4遺伝子などの栄養要求性相補遺伝子であれば、それぞれウラシル、ロイシン、アデニン、ヒスチジン、アルギニンの栄養要求性株において原栄養株表現型の回復により形質転換体を選択することができる。また、G418耐性遺伝子、Zeocin(商標)耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、Clone NAT耐性遺伝子、ブラストサイジンS耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子であれば、それぞれG418、Zeocin(商標)、ハイグロマイシン、Clone NAT、ブラストサイジンSを含む培地上における耐性により形質転換体を選択することができる。なお、酵母宿主を作製するときに用いる栄養要求性選択マーカーは、宿主において該選択マーカーが破壊されていない場合は、用いることができない。この場合、宿主において該選択マーカーを破壊すればよく、方法は当業者には公知の方法を用いることができる。 In the present invention, when a vector is transformed into a yeast of the genus Komagataella, it is preferable to use a selectable marker gene such as an auxotrophic complementary gene or a drug resistance gene. Selection markers are not particularly limited, but in the case of yeast of the genus Komagata, uracil, leucine, adenine, histidine, and arginine in the case of auxotrophic complementary genes such as URA3 gene, LEU2 gene, ADE1 gene, HIS4 gene, and ARG4 gene, respectively. Transformants can be selected by restoration of the prototrophic strain phenotype in an auxotrophic strain of . For drug resistance genes such as G418 resistance gene, Zeocin (trademark) resistance gene, hygromycin resistance gene, Clone NAT resistance gene, blasticidin S resistance gene, G418, Zeocin (trademark), hygromycin, Clone Transformants can be selected by resistance on a medium containing NAT, blasticidin S. The auxotrophic selectable marker used when producing the yeast host cannot be used unless the selectable marker is destroyed in the host. In this case, the selection marker may be destroyed in the host, and methods known to those skilled in the art can be used.
本発明において、ベクターを染色体に組み込む場合、本実施例のように染色体の相同領域を同時に有するDNAとして作製することが好ましい。染色体上へのベクターの組み込みの方法は、相同領域を利用しない非特異的な組み込みでもよいし、1箇所の相同領域を利用した組み込みでもよいし、2箇所の相同領域を利用したダブルクロスオーバー型の組み込みでもよい。 In the present invention, when a vector is to be integrated into a chromosome, it is preferably prepared as a DNA having a chromosomal homologous region at the same time as in this example. The method of vector integration onto the chromosome may be non-specific integration without using a homologous region, integration using a single homologous region, or double crossover type using two homologous regions. may be incorporated.
本発明において、相同領域を利用した組み込みの場合、例えば本実施例のように、選択マーカー遺伝子配列の両末端に相同領域が来るようにして形質転換を行うことが出来る。例えば、遺伝子欠失させたい場合、選択マーカー遺伝子の上流に欠失させたい遺伝子のプロモーター、下流には欠失させたい遺伝子のターミネーターを連結させたベクターを利用して組み込むことが出来る。 In the present invention, in the case of integration using homologous regions, transformation can be carried out with homologous regions at both ends of the selectable marker gene sequence, as in this example. For example, when a gene is desired to be deleted, it can be incorporated using a vector in which the promoter of the gene to be deleted is linked upstream of the selectable marker gene and the terminator of the gene to be deleted is linked downstream.
本発明において、染色体あたりのベクターのコピー数は特に限定されない。また、染色体上にベクターが組み込まれている位置は、本発明の遺伝子が不活性化されている限り、特に限定されない。なお、2コピー以上のベクターが組み込まれている形質転換体の組み込み位置については、同じ位置に複数が組み込まれている状態でもよいし、異なる位置に1コピー以上ずつ組み込まれている状態でもよい。 In the present invention, the number of copies of the vector per chromosome is not particularly limited. In addition, the position on the chromosome where the vector is integrated is not particularly limited as long as the gene of the present invention is inactivated. Regarding the integration sites of transformants in which two or more copies of the vector are integrated, a plurality of vectors may be integrated at the same site, or one or more copies may be integrated at different sites.
本発明の「相同領域を有する塩基配列」とは、目的とする塩基配列の少なくとも一部の塩基配列を有し、50%以上の配列同一性を有する塩基配列であればよく、より好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、特に好ましくは85%以上、よりさらに好ましくは90%以上、より特に好ましくは95%以上、最も好ましくは100%である。また、該相同領域を有する塩基配列の長さは、目的とする塩基配列と相同領域を有する20bp以上の塩基配列であれば、相同組み換えすることができるため特に限定されないが、具体的には、目的とする塩基配列の長さの0.1%以上が好ましく、0.5%以上、1%以上、1.5%以上、2%以上、2.5%以上、3%以上、3.5%以上、4%以上、4.5%以上、5%以上、5.5%以上、6%以上、6.5%以上、7%以上、7.5%以上、8%以上、8.5%以上、9%以上、9.5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、100%が好ましい。 The "nucleotide sequence having a homologous region" of the present invention may be a nucleotide sequence having at least a part of the nucleotide sequence of the target nucleotide sequence and having a sequence identity of 50% or more, more preferably 70 % or more, more preferably 80% or more, particularly preferably 85% or more, even more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, most preferably 100%. In addition, the length of the base sequence having the homologous region is not particularly limited as long as it is a base sequence of 20 bp or more having the homologous region with the target base sequence because homologous recombination can be performed. 0.1% or more of the length of the target base sequence is preferable, 0.5% or more, 1% or more, 1.5% or more, 2% or more, 2.5% or more, 3% or more, 3.5% or more % or more, 4% or more, 4.5% or more, 5% or more, 5.5% or more, 6% or more, 6.5% or more, 7% or more, 7.5% or more, 8% or more, 8.5 % or more, 9% or more, 9.5% or more, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35% or more, 40% or more, 45% or more, 50% or more, 55 % or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 100%.
本発明の「(a)~(d)のいずれかの遺伝子のプロモーター」とは、染色体上で(a)~(d)のいずれかの遺伝子の上流に存在し、該遺伝子産物の発現量を調整する塩基配列であり、具体的には、(a)~(d)のいずれかの遺伝子の開始コドンより上流の5000bpまでの塩基配列を指す。 The "promoter of any of the genes (a) to (d)" of the present invention is present upstream of any of the genes (a) to (d) on the chromosome and increases the expression level of the gene product. A nucleotide sequence to be adjusted, specifically, a nucleotide sequence up to 5000 bp upstream from the initiation codon of any of genes (a) to (d).
本発明の「(a)~(d)のいずれかの遺伝子のターミネーター」とは、染色体上で(a)~(d)のいずれかの遺伝子の下流に存在し、該遺伝子産物の発現量を調整する塩基配列であり、具体的には、(a)~(d)のいずれかの遺伝子の終始コドンより下流の5000bpまでの塩基配列を指す。 The "terminator of any of the genes (a) to (d)" of the present invention is present downstream of any of the genes (a) to (d) on the chromosome and regulates the expression level of the gene product. A nucleotide sequence to be adjusted, specifically, a nucleotide sequence up to 5000 bp downstream from the termination codon of any of genes (a) to (d).
本発明の宿主細胞は、前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び/又は前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも1つ含有し、該塩基配列の上流または下流に目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターを形質転換することにより得られることが好ましい。 The host cell of the present invention comprises a nucleotide sequence having a region homologous to the gene according to any one of (a) to (d) above, and a promoter and homologous region of the gene according to any one of (a) to (d) above. and / or a nucleotide sequence having a region homologous to the gene terminator according to any one of (a) to (d) above, upstream or downstream of the nucleotide sequence It is preferably obtained by transforming a vector containing a nucleotide sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of the target protein.
前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び/又は前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列の上流又は下流に目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列が配置されたベクターを形質転換することで、目的タンパク質の生産性が向上した宿主細胞を得ることができる。さらに、各々の相同領域を有する塩基配列を含有したベクターに、該塩基配列の上流及び/又は下流に目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を配置することで、形質転換の操作性を向上させることができる。 A nucleotide sequence having a region homologous to the gene according to any one of (a) to (d), a nucleotide sequence having a region homologous to the promoter of the gene according to any one of (a) to (d), and/ Alternatively, a vector in which a nucleotide sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of the target protein is arranged upstream or downstream of the nucleotide sequence having a region homologous to the terminator of the gene according to any one of (a) to (d). A host cell with improved productivity of the target protein can be obtained by transformation. Furthermore, a transformation operation is performed by placing a nucleotide sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of the target protein upstream and/or downstream of the nucleotide sequence in a vector containing the nucleotide sequence having each homologous region. can improve sexuality.
本発明において「目的タンパク質」とは、本発明のベクターが導入された細胞が生産するタンパク質であって、宿主の内在性タンパク質であってもよいし、異種タンパク質であってもよい。目的タンパク質の例として、微生物由来の酵素類、多細胞生物である動物や植物が産生するタンパク質等が挙げられる。例えば、フィターゼ、プロテインA、プロテインG、プロテインL、アミラーゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、グルタミナーゼ、ペプチダーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、ラクターゼ、キシラナーゼ、トリプシン、ペクチナーゼ、イソメラーゼ、フィブロイン、及び蛍光タンパク質等が挙げられるが、これらに限定はされない。グルコシダーゼの具体例としてはBGL1が挙げられる。蛍光タンパク質の具体例としてはmUkG1が挙げられる。特に、ヒト及び/又は動物治療用タンパク質が好ましい。 In the present invention, the "target protein" is a protein produced by a cell into which the vector of the present invention has been introduced, and may be an endogenous protein of the host or a heterologous protein. Examples of target proteins include enzymes derived from microorganisms, proteins produced by multicellular organisms such as animals and plants, and the like. Examples include phytase, protein A, protein G, protein L, amylase, glucosidase, cellulase, lipase, protease, glutaminase, peptidase, nuclease, oxidase, lactase, xylanase, trypsin, pectinase, isomerase, fibroin, and fluorescent protein. However, it is not limited to these. A specific example of a glucosidase is BGL1. A specific example of a fluorescent protein is mUkG1. In particular, human and/or animal therapeutic proteins are preferred.
ヒト及び/又は動物治療用タンパク質として、具体的には、B型肝炎ウイルス表面抗原、ヒルジン、抗体、ヒト抗体、部分抗体、ヒト部分抗体、血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、上皮成長因子、ヒト上皮成長因子、インシュリン、成長ホルモン、エリスロポエチン、インターフェロン、血液凝固第VIII因子、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、トロンボポエチン、IL-1、IL-6、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)、ウロキナーゼ、レプチン、及び幹細胞成長因子(SCF)等が挙げられる。 Specific examples of human and/or animal therapeutic proteins include hepatitis B virus surface antigen, hirudin, antibody, human antibody, partial antibody, human partial antibody, serum albumin, human serum albumin, epidermal growth factor, human epidermal growth factor, insulin, growth hormone, erythropoietin, interferon, blood coagulation factor VIII, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), thrombopoietin, IL-1, IL-6, tissue plasminogen activator (TPA), urokinase, leptin, and stem cell growth factor (SCF);
ここで「抗体」とは、L鎖とH鎖の各2本のポリペプチド鎖がジスルフィド結合して構成されるヘテロテトラマータンパク質のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。 Here, "antibody" refers to a heterotetrameric protein composed of two polypeptide chains, L chain and H chain, formed by disulfide bonds, and if it has the ability to bind to a specific antigen , is not particularly limited.
ここで「部分抗体」とは、Fab型抗体、(Fab)2型抗体、scFv型抗体、diabody型抗体や、これらの誘導体等のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。Fab型抗体とは、抗体のL鎖とFd鎖がS-S結合で結合したヘテロマータンパク質、又は抗体のL鎖とFd鎖がS-S結合を含まず会合したヘテロマータンパク質のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。部分抗体の具体例としては、抗リゾチウム一本鎖抗体が挙げられる。 Here, "partial antibody" refers to Fab-type antibody, (Fab) 2-type antibody, scFv-type antibody, diabody-type antibody, and derivatives thereof, etc., as long as they have the ability to bind to a specific antigen. is not particularly limited. Fab type antibody refers to a heteromeric protein in which the L chain and Fd chain of an antibody are bound by an S-S bond, or a heteromeric protein in which an L chain and an Fd chain of an antibody are associated without an S-S bond, and a specific antigen is not particularly limited as long as it has the ability to bind to Specific examples of partial antibodies include anti-lysozyme single-chain antibodies.
上記目的タンパク質を構成するアミノ酸は天然のものでもよいし、非天然のものでもよいし、修飾を受けていてもよい。また、タンパク質のアミノ酸配列は、人為的な改変が施されていてもよいし、de-novoで設計されたものでもよい。 Amino acids constituting the target protein may be natural or non-natural, or may be modified. In addition, the amino acid sequence of the protein may be artificially modified or designed de-novo.
本発明の宿主細胞は、前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び/又は前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも1つ含有するベクターと、目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することにより得られることが好ましい。 The host cell of the present invention comprises a nucleotide sequence having a region homologous to the gene according to any one of (a) to (d) above, and a promoter and homologous region of the gene according to any one of (a) to (d) above. and/or a vector containing at least one nucleotide sequence having a region homologous to the gene terminator according to any one of (a) to (d) above, and the amino acid sequence of the target protein It is preferably obtained by transforming a vector containing a nucleotide sequence encoding a polypeptide.
前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び/又は前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも1つ含有するベクターと、目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することで、目的タンパク質の生産性が向上した宿主細胞を得ることができる。さらに、不活性化するベクターと目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターを別にすることで、該目的タンパク質をコードする塩基配列を含有するベクターを前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子の位置以外に1コピー以上導入して発現量を増大させること、目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列が1コピー以上存在するプラスミドや人工染色体を導入して発現量を増大させること、また、育種改良において前記(a)~(d)のいずれかに記載の遺伝子の不活性化に用いた栄養要求性相補遺伝子または薬剤耐性遺伝子の破壊時に目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列も同時に破壊させてしまうことを防ぐため、効率よく目的タンパク質の生産性を向上させることができる。 A nucleotide sequence having a region homologous to the gene according to any one of (a) to (d), a nucleotide sequence having a region homologous to the promoter of the gene according to any one of (a) to (d), and/ or a vector containing at least one nucleotide sequence having a region homologous to the terminator of the gene according to any one of (a) to (d) above, and a base encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of the target protein. By transforming with a vector containing the sequence, a host cell with improved productivity of the desired protein can be obtained. Furthermore, by separating the vector to be inactivated from the vector containing the nucleotide sequence encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence of the target protein, the vector containing the nucleotide sequence encoding the target protein can be obtained from (a) to Increasing the expression level by introducing one or more copies at a position other than the position of the gene described in any of (d), Plasmids and artificials in which one or more copies of a base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of the target protein are present Introducing a chromosome to increase the expression level, and disrupting the auxotrophic complementary gene or drug resistance gene used for inactivating the gene according to any one of (a) to (d) in breeding improvement Since the base sequence encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence of the target protein is also prevented from being destroyed at the same time, the productivity of the target protein can be efficiently improved.
本発明において、「発現」とは、ポリペプチドの生成をもたらす塩基配列の転写及び翻訳を指す。また、その発現は外部刺激や生育条件等に依存せずにほぼ一定の状態でもよいし、依存してもよい。発現を駆動するプロモーターは、ポリペプチドをコードする塩基配列の発現を駆動するプロモーターであれば特に限定されない。 As used herein, "expression" refers to the transcription and translation of a nucleotide sequence that results in the production of a polypeptide. Moreover, the expression may be almost constant without depending on external stimuli, growth conditions, etc., or may depend on it. A promoter that drives expression is not particularly limited as long as it drives expression of a nucleotide sequence encoding a polypeptide.
宿主細胞の生物種は特に限定されないが、酵母、細菌、真菌、昆虫細胞、動物細胞、及び植物細胞等が挙げられ、酵母が好ましく、メタノール資化性酵母、分裂酵母、出芽酵母がより好ましく、メタノール資化性酵母がさらに好ましい。一般に、メタノール資化性酵母は、唯一の炭素源としてメタノールを利用して培養可能な酵母と定義されるが、本来メタノール資化性酵母であったが、人為的な改変あるいは変異によりメタノール資化性能を喪失した酵母も、本発明におけるメタノール資化性酵母に包含される。 The biological species of the host cell is not particularly limited, but includes yeast, bacteria, fungi, insect cells, animal cells, and plant cells. Yeast is preferred, and methanol-assimilating yeast, fission yeast, and budding yeast are more preferred. Methanol-assimilating yeast is more preferred. In general, methanol-utilizing yeast is defined as yeast that can be cultured using methanol as the sole carbon source. Yeast that has lost its performance is also included in the methanol-assimilating yeast of the present invention.
メタノール資化性酵母としては、ピキア(Pichia)属、オガタエア(Ogataea)属、キャンディダ(Candida)属、トルロプシス(Torulopsis)属、コマガタエラ(Komagataella)属等に属する酵母が挙げられる。ピキア(Pichia)属ではピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、オガタエア(Ogataea)属ではオガタエア・アングスタ(Ogataea angusta)、オガタエア・ポリモルファ(Ogataea polymorpha)、オガタエア・パラポリモルファ(Ogataea parapolymorpha)、オガタエア・ミヌータ(Ogataea minuta)、キャンディダ(Candida)属ではキャンディダ・ボイディニ(Candida boidinii)、コマガタエラ(Komagataella)属ではコマガタエラ・パストリス(Komagataella pastoris)、コマガタエラ・ファフィ(Komagataella phaffii)等が好ましい例として挙げられる。 Methanol-utilizing yeast includes yeast belonging to the genus Pichia, Ogataea, Candida, Torulopsis, Komagataella, and the like. Pichia methanolica in the genus Pichia, Ogataea angusta in the genus Ogataea, Ogataea angusta, Ogataea polymorpha, Ogataea parapolymorpha, Ogataea minuta ), Candida boidinii in the genus Candida, and Komagataella pastoris and Komagataella phaffii in the genus Komagataella.
上記のメタノール資化性酵母のなかでも、コマガタエラ属酵母又はオガタエア属酵母が特に好ましい。 Among the above methanol-assimilating yeasts, yeast of the genus Komagataella or yeast of the genus Ogataea are particularly preferred.
コマガタエラ(Komagataella)属酵母としては、コマガタエラ・パストリス(Komagataella pastoris)、コマガタエラ・ファフィ(Komagataella phaffii)が好ましい。コマガタエラ・パストリス及びコマガタエラ・ファフィはどちらもピキア・パストリス(Pichia pastoris)の別名を有する。 As the yeast of the genus Komagataella, Komagataella pastoris and Komagataella phaffii are preferred. Both Komagataera pastoris and Komagataera fafi are also known as Pichia pastoris.
具体的に宿主として使用できる菌株として、コマガタエラ・パストリスATCC76273(Y-11430、CBS7435)、コマガタエラ・パストリスX-33等の株が挙げられる。これらの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションやサーモフィッシャーサイエンティフィック社等から入手することができる。 Specific examples of strains that can be used as hosts include strains such as Komagataella pastoris ATCC76273 (Y-11430, CBS7435) and Komagataella pastoris X-33. These strains are available from the American Type Culture Collection, Thermo Fisher Scientific, and the like.
オガタエア(Ogataea)属酵母としては、オガタエア・アングスタ(Ogataea angusta)、オガタエア・ポリモルファ(Ogataea polymorpha)、オガタエア・パラポリモルファ(Ogataea parapolymorpha)が好ましい。これら3つは近縁種であり、いずれも、別名ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、又は別名ピキア・アングスタ(Pichia angusta)でも表される。 Preferred yeasts of the genus Ogataea are Ogataea angusta, Ogataea polymorpha, and Ogataea parapolymorpha. These three are closely related species, all also known as Hansenula polymorpha, or Pichia angusta.
具体的に使用できる菌株として、オガタエア・アングスタNCYC495(ATCC14754)、オガタエア・ポリモルファ8V(ATCC34438)、オガタエア・パラポリモルファDL-1(ATCC26012)等の菌株が挙げられる。これらの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション等から入手することができる。 Specific usable strains include strains such as Ogataea angusta NCYC495 (ATCC14754), Ogataea polymorpha 8V (ATCC34438), and Ogataea parapolymorpha DL-1 (ATCC26012). These strains are available from the American Type Culture Collection and the like.
また、本発明においては、これらコマガタエラ属酵母やオガタエア属酵母の菌株からの誘導株も使用でき、例えばヒスチジン要求性であればコマガタエラ・パストリスGS115株(サーモフィッシャーサイエンティフィック社より入手可能)、ロイシン要求性株であれば、NCYC495由来のBY4329、8V由来のBY5242、DL-1由来のBY5243(これらはNational BioResource Projectから分譲可能)等が挙げられる。本発明においては、これらの菌株からの誘導株等も使用できる。 In addition, in the present invention, strains derived from these strains of the genus Komagataella yeast and the genus Ogataea yeast can also be used. As auxotrophic strains, BY4329 derived from NCYC495, BY5242 derived from 8V, BY5243 derived from DL-1 (these are available from the National BioResource Project), and the like can be mentioned. In the present invention, derivative strains and the like from these strains can also be used.
一態様において、本発明は、上記に記載の細胞を培養する工程、培養液から目的タンパク質を回収する工程を含む、目的タンパク質の製造方法に関する。 In one aspect, the present invention relates to a method for producing a target protein, comprising the steps of culturing the cells described above and recovering the target protein from the culture medium.
ここで、「培養液」とは、培養上清のほか、培養細胞、培養菌体、又は細胞もしくは菌体の破砕物を意味する。よって、本発明の形質転換酵母を用いて目的タンパク質を製造する方法としては、上記に記載の細胞を培養し、その菌体中に蓄積させる方法、又は培養上清中に分泌して蓄積させる方法が挙げられ、好ましくは培養上清中に分泌して蓄積させる方法が挙げられる。 As used herein, the term "culture solution" means culture supernatant, cultured cells, cultured bacterial bodies, or disrupted cells or bacterial bodies. Therefore, as a method of producing a target protein using the transformed yeast of the present invention, a method of culturing the above-described cells and accumulating them in the cells, or a method of secreting and accumulating them in the culture supernatant. and preferably a method of secreting and accumulating in the culture supernatant.
細胞の培養条件は特に限定されず、細胞に応じて適宜選択すればよい。該培養においては、細胞が資化しうる栄養源を含む培地であれば何でも使用できる。該栄養源としては、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、メタノール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油類、又はこれらの混合物等の炭素源、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源、更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源を適宜混合・配合した通常の培地を用いることができる。また、培養はバッチ培養や連続培養のいずれでも可能である。 Cell culture conditions are not particularly limited, and may be appropriately selected according to the cells. In the culture, any medium can be used as long as it contains nutrients that can be assimilated by the cells. The nutrient sources include sugars such as glucose, sucrose and maltose, organic acids such as lactic acid, acetic acid, citric acid and propionic acid, alcohols such as methanol, ethanol and glycerol, hydrocarbons such as paraffin, soybean oil, Oils such as rapeseed oil, or carbon sources such as mixtures thereof, nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium phosphate, urea, yeast extract, meat extract, peptone, corn steep liquor, and other inorganic salts, vitamins, etc. A normal medium in which nutrients are appropriately mixed and blended can be used. In addition, the culture can be either batch culture or continuous culture.
本発明の好ましい態様として、酵母にコマガタエラ属酵母又はオガタエア属酵母を用いた場合、上記炭素源は、グルコース、グリセロール、メタノールの1種でもよく、又は2種以上であってもよい。また、これらの炭素源は培養初期から存在していてもよいし、培養途中に添加してもよい。 In a preferred embodiment of the present invention, when yeast of the genus Komagataella or yeast of the genus Ogataea is used, the carbon source may be one of glucose, glycerol, and methanol, or two or more of them. Moreover, these carbon sources may be present from the beginning of the culture, or may be added during the culture.
本発明のベクターを細胞に導入することによって得られた形質転換体を培養することで宿主中又は培養液中に目的タンパク質を蓄積させ、回収することができる。目的タンパク質の回収方法については、公知の精製法を適当に組み合わせて用いることができる。例えば、まず、当該形質転換酵母を適当な培地で培養し、培養液の遠心分離、あるいは、濾過処理により培養上清から菌体を除く。得られた培養上清を、塩析(硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿等)、溶媒沈殿(アセトン又はエタノール等による蛋白質分画沈殿法)、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、又は組み合わせて用いることにより、該培養上清から目的タンパク質を回収する。 By culturing a transformant obtained by introducing the vector of the present invention into a cell, the target protein can be accumulated in the host or in the culture medium and recovered. As for the recovery method of the target protein, known purification methods can be appropriately combined and used. For example, first, the transformed yeast is cultured in an appropriate medium, and the culture supernatant is centrifuged or filtered to remove cells from the culture supernatant. The obtained culture supernatant is subjected to salting out (ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation, etc.), solvent precipitation (protein fractionation precipitation method using acetone or ethanol, etc.), dialysis, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography. The target protein is recovered from the culture supernatant by using techniques such as lithography, affinity chromatography, reversed-phase chromatography, ultrafiltration, etc. alone or in combination.
細胞の培養は通常一般の条件により行なうことができ、例えば、酵母の場合、pH2.5~10.0、温度範囲10℃~48℃の範囲で、好気的に10時間~10日間培養することにより行うことができる。 Cells can be cultured under general conditions. For example, yeast is cultured aerobically at a pH of 2.5 to 10.0 and a temperature range of 10°C to 48°C for 10 hours to 10 days. It can be done by
回収された目的タンパク質は、そのまま使用することもできるが、その後PEG化等の薬理学的な変化をもたらす修飾、酵素やアイソトープ等の機能を付加する修飾を加えて使用することもできる。また、各種の製剤化処理を使用してもよい。 The recovered target protein can be used as it is, or can be used after being subjected to modifications such as PEGylation that bring about pharmacological changes, and modifications that add functions such as enzymes and isotopes. Various formulation processes may also be used.
分泌性でない目的タンパク質を菌体外に分泌させる場合には、該目的タンパク質遺伝子の5'末端にシグナル配列をコードする塩基配列を導入すればよい。シグナル配列をコードする塩基配列は、酵母が分泌発現できるシグナル配列をコードする塩基配列であれば特に限定されないが、サッカロマイセス・セレビシエのMating Factor α(MFα)やオガタエア・アングスタの酸性ホスファターゼ(PHO1)、コマガタエラ・パストリスの酸性ホスファターゼ(PHO1)、サッカロマイセス・セレビシエのインベルターゼ(SUC2)、サッカロマイセス・セレビシエのPLB1、牛血清アルブミン(BSA)、ヒト血清アルブミン(HSA)、及び免疫グロブリンのシグナル配列をコードする塩基配列等が挙げられる。 When a non-secretable target protein is to be extracellularly secreted, a nucleotide sequence encoding a signal sequence may be introduced into the 5' end of the target protein gene. The nucleotide sequence encoding the signal sequence is not particularly limited as long as it encodes a signal sequence that can be secreted and expressed by yeast. Nucleotide sequences encoding Komagataella pastoris acid phosphatase (PHO1), Saccharomyces cerevisiae invertase (SUC2), Saccharomyces cerevisiae PLB1, bovine serum albumin (BSA), human serum albumin (HSA), and immunoglobulin signal sequences etc.
本明細書において、生産量を増加させる「目的タンパク質」は、宿主の内在性タンパク質であってもよいし、異種タンパク質又は外来タンパク質であってもよい。本明細書において、「内在性タンパク質」とは、遺伝子改変を行っていない宿主細胞が培養の間に産生するタンパク質をいう。これに対し、本明細書において「異種タンパク質」又は「外来タンパク質」とは、遺伝子改変を行っていない宿主細胞が通常発現しないか、あるいは発現してもその発現量又は生産量が十分でないタンパク質をいう。 As used herein, the "target protein" that increases production may be an endogenous protein of the host, a heterologous protein, or a foreign protein. As used herein, the term "endogenous protein" refers to a protein produced by a non-genetically modified host cell during culture. On the other hand, the term "heterologous protein" or "foreign protein" as used herein refers to a protein that is not normally expressed in host cells that have not undergone genetic modification, or that, even if expressed, the amount of expression or production is insufficient. say.
目的タンパク質を発現させるプロモーターは、選択した炭素源にて発現が起こりうるプロモーターを適切に使用すればよく、特に限定されない。 The promoter that expresses the target protein is not particularly limited, as long as a promoter that allows expression with the selected carbon source is appropriately used.
炭素源がメタノールの場合、ポリペプチドを発現させるプロモーターは、AOX1プロモーター、AOX2プロモーター、CATプロモーター、DHASプロモーター、FDHプロモーター、FMDプロモーター、GAPプロモーター、MOXプロモーター等が挙げられるが、特にこれらに限定されない。 When the carbon source is methanol, the promoter for expressing the polypeptide includes, but is not limited to, AOX1 promoter, AOX2 promoter, CAT promoter, DHAS promoter, FDH promoter, FMD promoter, GAP promoter, MOX promoter and the like.
炭素源がグルコースやグリセロールの場合、ポリペプチドを発現させるプロモーターは、GAPプロモーター、TEFプロモーター、LEU2プロモーター、URA3プロモーター、ADEプロモーター、ADH1プロモーター、PGK1プロモーター等が挙げられるが、特にこれらに限定されない。 When the carbon source is glucose or glycerol, promoters for polypeptide expression include, but are not limited to, GAP promoter, TEF promoter, LEU2 promoter, URA3 promoter, ADE promoter, ADH1 promoter, PGK1 promoter, and the like.
ここで、「プロモーター」とは、上記の所定の塩基配列の上流に位置する塩基配列領域をいい、RNAポリメラーゼのほか、転写の促進や抑制に関わる様々な転写調節因子が該領域に結合又は作用することによって鋳型である上記の所定の塩基配列を読み取って相補的なRNAを合成(転写)する。 As used herein, the term "promoter" refers to a nucleotide sequence region located upstream of the above-described predetermined nucleotide sequence, and RNA polymerase and various transcriptional regulatory factors involved in the promotion and suppression of transcription bind to or act on the region. By doing so, the above-mentioned predetermined nucleotide sequence, which is a template, is read and complementary RNA is synthesized (transcribed).
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in detail below with reference to Examples, but the present invention is not limited to these.
<実施例1:ベクターの調製に用いた各種遺伝子の調製>
以下の実施例において用いた組換えDNA技術に関する詳細な操作方法等は、次の成書に記載されている:Molecular Cloning 2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)。
<Example 1: Preparation of various genes used for vector preparation>
Detailed operating procedures for the recombinant DNA techniques used in the following examples are described in the following publications: Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), Current Protocols in Molecular Biology (Greene et al., 1989). Publishing Associates and Wiley-Interscience).
また、以下の実施例において、酵母の形質転換に用いるプラスミドは、構築したベクターを大腸菌E.coli DH5αコンピテントセル(タカラバイオ社製)に導入し、得られた形質転換体を培養して増幅することによって調製した。プラスミド保持株からのプラスミドの調製は、FastGene Plasmid Mini Kit(日本ジェネティクス社製)を用いて行った。 In addition, in the following examples, the plasmid used for yeast transformation was obtained by introducing the constructed vector into Escherichia coli E. coli DH5α competent cells (manufactured by Takara Bio Inc.) and culturing the resulting transformant for amplification. It was prepared by A plasmid was prepared from the plasmid-carrying strain using FastGene Plasmid Mini Kit (manufactured by Nippon Genetics).
ベクターの構築において利用したAOX1プロモーター(配列番号71)、AOX1ターミネーター(配列番号72)、GAPプロモーター(配列番号73)、CCA38473ターミネーター(配列番号74)はコマガタエラ・パストリスATCC76273株の染色体DNA(塩基配列はEMBL (The European Molecular Biology Laboratory) ACCESSION No. FR839628~FR839631に記載)混合物をテンプレートにしてPCRで調製した。AOX1プロモーターはプライマー59(配列番号77)及びプライマー60(配列番号78)、AOX1ターミネーターはプライマー61(配列番号79)及びプライマー62(配列番号80)、GAPプロモーターはプライマー63(配列番号81)及びプライマー64(配列番号82)、CCA38473ターミネーターはプライマー65(配列番号83)及びプライマー66(配列番号84)、を用いてPCRで調製した。 The AOX1 promoter (SEQ ID NO: 71), AOX1 terminator (SEQ ID NO: 72), GAP promoter (SEQ ID NO: 73), and CCA38473 terminator (SEQ ID NO: 74) used in the construction of the vector are the chromosomal DNA of Komagataella pastoris ATCC76273 strain (nucleotide sequence is EMBL (The European Molecular Biology Laboratory) ACCESSION No. FR839628 to FR839631) mixture was used as a template and prepared by PCR. AOX1 promoter is primer 59 (SEQ ID NO: 77) and primer 60 (SEQ ID NO: 78), AOX1 terminator is primer 61 (SEQ ID NO: 79) and primer 62 (SEQ ID NO: 80), GAP promoter is primer 63 (SEQ ID NO: 81) and primer 64 (SEQ ID NO: 82), the CCA38473 terminator was prepared by PCR using primer 65 (SEQ ID NO: 83) and primer 66 (SEQ ID NO: 84).
ベクターの構築において利用した、プロモーターで制御されたZeocin(商標)耐性遺伝子(配列番号75)は合成DNAをテンプレートにしてPCRで調製した。ベクターの構築において利用した、プロモーターで制御されたG418耐性遺伝子(配列番号76)は合成DNAをテンプレートにしてPCRで調製した。ベクターの構築において利用した、プロモーターで制御されたハイグロマイシン耐性遺伝子(配列番号92)は合成DNAをテンプレートにしてPCRで調製した。ベクターの構築において利用した、プロモーターで制御されたClone NAT耐性遺伝子(配列番号93)は合成DNAをテンプレートにしてPCRで調製した。ベクターの構築において利用した、プロモーターで制御されたブラストサイジンS耐性遺伝子(配列番号94)は合成DNAをテンプレートにしてPCRで調製した。ベクターの構築において利用した、Mating Factorαプレプロシグナル配列が付与された抗リゾチウム一本鎖抗体遺伝子(配列番号89)は合成DNAをテンプレートにしてPCRで調製した。ベクターの構築において利用した、Mating Factorαプレプロシグナル配列が付与されたBGL1遺伝子(配列番号90)は合成DNAをテンプレートにしてPCRで調製した。ベクターの構築において利用した、Mating Factorαプレプロシグナル配列が付与されたmUkG1遺伝子(配列番号91)は合成DNAをテンプレートにしてPCRで調製した。 A promoter-controlled Zeocin™ resistance gene (SEQ ID NO: 75) used in the construction of the vector was prepared by PCR using synthetic DNA as a template. A promoter-controlled G418 resistance gene (SEQ ID NO: 76) used in the construction of the vector was prepared by PCR using synthetic DNA as a template. A promoter-controlled hygromycin resistance gene (SEQ ID NO: 92) used in the construction of the vector was prepared by PCR using synthetic DNA as a template. A promoter-controlled Clone NAT resistance gene (SEQ ID NO: 93) used in the construction of the vector was prepared by PCR using synthetic DNA as a template. A promoter-controlled blasticidin S resistance gene (SEQ ID NO: 94) used in the construction of the vector was prepared by PCR using synthetic DNA as a template. The anti-lysodium single-chain antibody gene (SEQ ID NO: 89) having a mating factor α pre-pro signal sequence, which was used in constructing the vector, was prepared by PCR using a synthetic DNA as a template. The BGL1 gene (SEQ ID NO: 90) having a mating factor α pre-pro signal sequence, which was used in constructing the vector, was prepared by PCR using synthetic DNA as a template. The mUkG1 gene (SEQ ID NO: 91) having a mating factor α pre-pro signal sequence, which was used in constructing the vector, was prepared by PCR using synthetic DNA as a template.
PCRにはPrime STAR HS DNA Polymerase(タカラバイオ社製)等を用い、反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。染色体DNAの調製は、コマガタエラ・パストリスATCC76273株からカネカ 簡易DNA抽出キット version 2(カネカ社製)等を用いて、これに記載の条件で実施した。 Prime STAR HS DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) or the like was used for PCR, and the reaction conditions were performed according to the method described in the attached manual. Chromosomal DNA was prepared from Komagataella pastoris ATCC76273 strain using Kaneka Simple DNA Extraction Kit version 2 (manufactured by Kaneka) or the like under the conditions described therein.
<実施例2:抗リゾチウム一本鎖抗体発現ベクター、BGL1発現ベクター、mUkG1発現ベクターの構築>
HindIII-BamHI-BglII-XbaI-EcoRIのマルチクローニングサイトをもつ遺伝子断片(配列番号95)を全合成し、これをpUC19(タカラバイオ社製、Code No. 3219)のHindIII-EcoRIサイト間に挿入して、pUC-1を構築した。
<Example 2: Construction of anti-lysozyme single-chain antibody expression vector, BGL1 expression vector, and mUkG1 expression vector>
A gene fragment (SEQ ID NO: 95) having a HindIII-BamHI-BglII-XbaI-EcoRI multicloning site was totally synthesized and inserted between the HindIII-EcoRI sites of pUC19 (Takara Bio Inc., Code No. 3219). and constructed pUC-1.
また、AOX1プロモーター(配列番号71)の両側にBamHI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー59(配列番号77)及び60(配列番号78)を用いたPCRにより調製し、BamHI処理後にpUC-1のBamHIサイトに挿入して、pUC-Paoxを構築した。 In addition, a nucleic acid fragment with BamHI recognition sequences added to both sides of the AOX1 promoter (SEQ ID NO: 71) was prepared by PCR using primers 59 (SEQ ID NO: 77) and 60 (SEQ ID NO: 78). was inserted into the BamHI site to construct pUC-Paox.
また、GAPプロモーター(配列番号73)の両側にBamHI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー63(配列番号81)及び64(配列番号82)を用いたPCRにより調製し、BamHI処理後にpUC-1のBamHIサイトに挿入して、pUC-Pgapを構築した。 In addition, a nucleic acid fragment with BamHI recognition sequences added to both sides of the GAP promoter (SEQ ID NO: 73) was prepared by PCR using primers 63 (SEQ ID NO: 81) and 64 (SEQ ID NO: 82), and treated with BamHI. was inserted into the BamHI site to construct pUC-Pgap.
次に、プロモーターで制御されたG418耐性遺伝子(配列番号76)の両側にEcoRI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー69(配列番号87)及び70(配列番号88)を用いたPCRにより調製し、EcoRI処理後にpUC-PaoxまたはpUC-PgapのEcoRIサイトに挿入して、pUC-PaoxG418またはpUC-PgapG418を構築した。 Next, a nucleic acid fragment with EcoRI recognition sequences added to both sides of the promoter-controlled G418 resistance gene (SEQ ID NO: 76) was prepared by PCR using primers 69 (SEQ ID NO: 87) and 70 (SEQ ID NO: 88). , was inserted into the EcoRI site of pUC-Paox or pUC-Pgap after EcoRI treatment to construct pUC-PaoxG418 or pUC-PgapG418.
次に、CCA38473ターミネーター(配列番号74)にXbaIとSpeI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー65(配列番号83)及び66(配列番号84)を用いたPCRにより調製し、XbaIとSpeI処理後にpUC-PaoxG418またはpUC-PgapG418のXbaIサイトに挿入して、pUC-PaoxT38473G418またはpUC-PgapT38473G418を構築した。 Next, a nucleic acid fragment having XbaI and SpeI recognition sequences added to the CCA38473 terminator (SEQ ID NO: 74) was prepared by PCR using primers 65 (SEQ ID NO: 83) and 66 (SEQ ID NO: 84), and treated with XbaI and SpeI. It was inserted into the XbaI site of pUC-PaoxG418 or pUC-PgapG418 to construct pUC-PaoxT38473G418 or pUC-PgapT38473G418.
次に、AOX1ターミネーター(配列番号72)の両側にXbaI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー61(配列番号79)及び62(配列番号80)を用いたPCRにより調製し、XbaI処理後にpUC-PaoxT38473またはpUC-PgapT38473G418のXbaIサイトに挿入して、pUC-PaoxTaoxT38473G418またはpUC-PgapTaoxT38473G418を構築した。 Next, a nucleic acid fragment with XbaI recognition sequences added to both sides of the AOX1 terminator (SEQ ID NO: 72) was prepared by PCR using primers 61 (SEQ ID NO: 79) and 62 (SEQ ID NO: 80). It was inserted into the XbaI site of PaoxT38473 or pUC-PgapT38473G418 to construct pUC-PaoxTaoxT38473G418 or pUC-PgapTaoxT38473G418.
次に、Mating Factorαプレプロシグナル配列が付与された抗リゾチウム一本鎖抗体遺伝子(配列番号89)の両側にBglII認識配列を付加した核酸断片を、プライマー67(配列番号85)及び68(配列番号86)を用いたPCRにより調製し、BglII処理後にpUC-PaoxTaoxT38473G418またはpUC-PgapTaoxT38473G418のBglIIサイトに挿入して、pUC-PaoxscFvTaoxT38473G418またはpUC-PgapscFvTaoxT38473G418を構築した。このpUC-PaoxscFvTaoxT38473G418は、抗リゾチウム一本鎖抗体がAOX1プロモーター制御下で発現するように設計されている。このpUC-PgapscFvTaoxT38473G418は、抗リゾチウム一本鎖抗体がGAPプロモーター制御下で発現するように設計されている。 Next, a nucleic acid fragment with BglII recognition sequences added to both sides of the anti-lysozyme single-chain antibody gene (SEQ ID NO: 89) to which the mating factor α pre-pro signal sequence was added was used with primers 67 (SEQ ID NO: 85) and 68 (SEQ ID NO: 86). ), and inserted into the BglII site of pUC-PaoxTaoxT38473G418 or pUC-PgapTaoxT38473G418 after BglII treatment to construct pUC-PaoxscFvTaoxT38473G418 or pUC-PgapscFvTaoxT38473G418. This pUC-PaoxscFvTaoxT38473G418 is designed to express an anti-lysozyme single chain antibody under control of the AOX1 promoter. This pUC-PgapscFvTaoxT38473G418 is designed to express an anti-lysodium single chain antibody under the control of the GAP promoter.
次に、Mating Factorαプレプロシグナル配列が付与されたBGL1遺伝子(配列番号90)の両側にBglII認識配列を付加した核酸断片を、プライマー67(配列番号85)及び71(配列番号96)を用いたPCRにより調製し、BglII処理後にpUC-PaoxTaoxT38473G418のBglIIサイトに挿入して、pUC-PaoxBGL1TaoxT38473G418を構築した。このpUC-PaoxBGL1TaoxT38473G418は、BGL1がAOX1プロモーター制御下で発現するように設計されている。 Next, a nucleic acid fragment having BglII recognition sequences added to both sides of the BGL1 gene (SEQ ID NO: 90) to which the mating factor α prepro signal sequence was added was subjected to PCR using primers 67 (SEQ ID NO: 85) and 71 (SEQ ID NO: 96). and inserted into the BglII site of pUC-PaoxTaoxT38473G418 after BglII treatment to construct pUC-PaoxBGL1TaoxT38473G418. This pUC-PaoxBGL1TaoxT38473G418 is designed to express BGL1 under the control of the AOX1 promoter.
次に、Mating Factorαプレプロシグナル配列が付与されたmUkG1遺伝子(配列番号91)の両側にBglII認識配列を付加した核酸断片を、プライマー67(配列番号85)及び72(配列番号97)を用いたPCRにより調製し、BglII処理後にpUC-PaoxTaoxT38473G418のBglIIサイトに挿入して、pUC-PaoxmUkG1TaoxT38473G418を構築した。このpUC-PaoxmUkG1TaoxT38473G418は、mUkG1がAOX1プロモーター制御下で発現するように設計されている。 Next, a nucleic acid fragment with BglII recognition sequences added to both sides of the mUkG1 gene (SEQ ID NO: 91) to which the mating factor α prepro signal sequence was added was subjected to PCR using primers 67 (SEQ ID NO: 85) and 72 (SEQ ID NO: 97). and inserted into the BglII site of pUC-PaoxTaoxT38473G418 after BglII treatment to construct pUC-PaoxmUkG1TaoxT38473G418. This pUC-PaoxmUkG1TaoxT38473G418 is designed to express mUkG1 under the control of the AOX1 promoter.
<実施例3:配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクターの構築>
各遺伝子の上流配列(プロモーター)をコマガタエラ・パストリスATCC76273株の染色体DNA混合物をテンプレートにしてPCRで調製した。ベクターID、不活性化させるポリペプチドのACCESSION No.、ポリペプチドのアミノ酸配列、ポリペプチドをコードする塩基配列、核酸断片の増幅に用いたプライマー(Fw及びRe)の番号及び配列を表1に示す。
<Example 3: Construction of gene inactivation vector consisting of nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 11>
The upstream sequence (promoter) of each gene was prepared by PCR using a chromosomal DNA mixture of Komagataella pastoris ATCC76273 strain as a template. Table 1 shows the vector ID, the ACCESSION No. of the polypeptide to be inactivated, the amino acid sequence of the polypeptide, the nucleotide sequence encoding the polypeptide, and the numbers and sequences of the primers (Fw and Re) used to amplify the nucleic acid fragment. .
次に、各遺伝子の下流配列(ターミネーター)をコマガタエラ・パストリスATCC76273株の染色体DNA混合物をテンプレートにしてPCRで調製した。ベクターID、不活性化させるポリペプチドのACCESSION No.、核酸断片の増幅に用いたプライマー(Fw及びRe)の番号及び配列を表2に示す。 Next, downstream sequences (terminators) of each gene were prepared by PCR using a chromosomal DNA mixture of Komagataella pastoris ATCC76273 strain as a template. Table 2 shows the vector ID, the ACCESSION No. of the polypeptide to be inactivated, and the numbers and sequences of the primers (Fw and Re) used to amplify the nucleic acid fragment.
次に、薬剤耐性遺伝子として、プロモーターで制御されたハイグロマイシン耐性遺伝子(配列番号92)、プロモーターで制御されたClone NAT耐性遺伝子(配列番号93)、プロモーターで制御されたブラストサイジンS耐性遺伝子(配列番号94)、プロモーターで制御されたZeocin(商標)耐性遺伝子(配列番号75)をテンプレートにして、両側にオーバーラップPCRのための遺伝子上流配列及び下流配列の相同領域を付加した遺伝子断片を、PCRで調製した。ベクターID、不活性化させるポリペプチドのACCESSION No.、核酸断片の増幅に用いたプライマー(Fw及びRe)の番号及び配列、テンプレートを表3に示す。 Next, as drug resistance genes, a promoter-controlled hygromycin resistance gene (SEQ ID NO: 92), a promoter-controlled Clone NAT resistance gene (SEQ ID NO: 93), a promoter-controlled blasticidin S resistance gene ( SEQ ID NO: 94), a promoter-controlled Zeocin (trademark) resistance gene (SEQ ID NO: 75) as a template, and homologous regions of the gene upstream sequence and downstream sequence for overlap PCR are added to both sides of the gene fragment, Prepared by PCR. Table 3 shows the vector ID, the ACCESSION No. of the polypeptide to be inactivated, the numbers and sequences of the primers (Fw and Re) used to amplify the nucleic acid fragment, and the template.
次に、上記で得られた上流核酸断片、下流核酸断片、遺伝子断片をベクターIDごとに混合し、その混合物をテンプレートとして、両側に形質転換のための遺伝子上流配列及び下流配列の相同領域を更に付加した遺伝子断片を、オーバーラップPCRで調製した。ベクターID、不活性化させるポリペプチドのACCESSION No.、核酸断片の増幅に用いたプライマー(Fw及びRe)の番号及び配列を表4に示す。 Next, the upstream nucleic acid fragment, downstream nucleic acid fragment, and gene fragment obtained above are mixed for each vector ID, and the mixture is used as a template, and homologous regions of the gene upstream sequence and downstream sequence for transformation are further added on both sides. The added gene fragment was prepared by overlap PCR. Table 4 shows the vector ID, the ACCESSION No. of the polypeptide to be inactivated, and the numbers and sequences of the primers (Fw and Re) used to amplify the nucleic acid fragment.
本ベクターはコマガタエラ・パストリスATCC76273株の配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11に示す塩基配列からなる遺伝子の上流塩基配列(プロモーター)及び下流塩基配列(ターミネーター)を相同領域として、プロモーターで制御された薬剤耐性遺伝子の両側に付加されたベクターであり、宿主細胞に形質転換することで配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化されるように設計されている。 This vector is the upstream nucleotide sequence (promoter) and downstream nucleotide sequence of the gene consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 11 of Komagataella pastoris ATCC76273 strain. (terminator) as a homologous region, a vector added to both sides of a promoter-controlled drug resistance gene. It is designed to inactivate the genes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 11.
<実施例4:形質転換酵母の取得>
実施例2で構築した抗リゾチウム一本鎖抗体発現ベクターpUC-PaoxscFvTaoxT38473G418またはpUC-PgapscFvTaoxT38473G418、BGL1発現ベクターpUC-PaoxBGL1TaoxT38473G418、mUkG1発現ベクターpUC-PaoxmUkG1TaoxT38473G418を用いて、以下のようにコマガタエラ・パストリスを形質転換した。
<Example 4: Acquisition of transformed yeast>
Using the anti-lysozyme single-chain antibody expression vector pUC-PaoxscFvTaoxT38473G418 or pUC-PgapscFvTaoxT38473G418, the BGL1 expression vector pUC-PaoxBGL1TaoxT38473G418, and the mUkG1 expression vector pUC-PaoxmUkG1TaoxT38473G418 constructed in Example 2, Komagataella pastis was transformed as follows. .
コマガタエラ・パストリスATCC76273株を3mlのYPD培地(1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、2% glucose)に接種し、30℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液500μlを50mlのYPD培地に接種し、OD600が1~1.5になるまで振盪培養後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、250μlの1M DTT(終濃度25mM)を含む10mlの50mMリン酸カリウムバッファー, pH7.5に再懸濁した。 Komagataella pastoris ATCC76273 strain was inoculated into 3 ml of YPD medium (1% yeast extract bacto (Becton Dickinson), 2% polypeptone (Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), 2% glucose) and cultured overnight at 30°C with shaking. , to obtain a pre-culture. 500 μl of the resulting preculture was inoculated into 50 ml of YPD medium, cultured with shaking until OD600 reached 1 to 1.5, harvested (3000×g, 10 minutes, 20°C), and added to 250 μl of 1M DTT (final concentration 25 mM) in 10 ml of 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5.
この懸濁液を30℃で15分インキュベート後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、予め氷冷した50mlのSTMバッファー(270mMスクロース、10mM Tris-HCl、1mM塩化マグネシウム、pH7.5)で洗浄した。洗浄液を集菌(3000×g、10分、4℃)し、25 mlのSTMバッファーで再度洗浄したのち、集菌(3000×g、10分、4℃)した。最終的に、250μlの氷冷STMバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。 After incubating this suspension at 30°C for 15 minutes, the cells were harvested (3000 x g, 10 minutes, 20°C) and added to 50 ml of ice-cooled STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7). .5). The washed solution was collected (3000×g, 10 minutes, 4° C.), washed again with 25 ml of STM buffer, and collected (3000×g, 10 minutes, 4° C.). Finally, they were suspended in 250 μl of ice-cold STM buffer to obtain a competent cell solution.
実施例2で構築した抗リゾチウム一本鎖抗体発現ベクターpUC-PaoxscFvTaoxT38473G418またはpUC-PgapscFvTaoxT38473G418を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を5mlのアンピシリン含有2YT培地(1.6% tryptone bacto(Becton Dickinson社製)、1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、0.5% 塩化ナトリウム、0.01%アンピシリンナトリウム(和光純薬工業社製))で培養し、得られた菌体からFastGene Plasmid Mini Kit(日本ジェネティクス社製)を用いて、pUC-PaoxscFvTaoxT38473G418またはpUC-PgapscFvTaoxT38473G418を取得した。本プラスミドを制限酵素処理により直鎖状にした。 E. coli was transformed with the anti-lysodium single-chain antibody expression vector pUC-PaoxscFvTaoxT38473G418 or pUC-PgapscFvTaoxT38473G418 constructed in Example 2, and the resulting transformant was added to 5 ml of ampicillin-containing 2YT medium (1.6% tryptone bacto (Becton Dickinson), 1% yeast extract bacto (Becton Dickinson), 0.5% sodium chloride, 0.01% ampicillin sodium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)), and the resulting cells were extracted with the FastGene Plasmid Mini Kit ( Nippon Genetics) was used to obtain pUC-PaoxscFvTaoxT38473G418 or pUC-PgapscFvTaoxT38473G418. This plasmid was linearized by restriction enzyme treatment.
このコンピテントセル溶液60μlと直鎖状のpUC-PaoxscFvTaoxT38473G418溶液1μlまたはpUC-PgapscFvTaoxT38473G418溶液1μlを混合し、エレクトロポレーション用キュベット(ディスポキュベット電極、電極間隔2mm(ビーエム機器社製))に移し入れ、7.5kV/cm、25μF、200Ωに供した後、菌体を1mlのYPD培地で懸濁し、30℃で1時間静置した。1時間静置後、集菌(3000×g、5分、20℃)し、上清961μlを廃棄した。残った溶液で再懸濁後、YPDG418選択寒天プレート(1% yeast extract(Becton Dickinson社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、2% glucose、1.5%アガロース、0.05% G418二硫酸塩(ナカライテスク社製))に塗布し、30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、抗リゾチウム一本鎖抗体発現酵母を取得した。 60 μl of this competent cell solution and 1 μl of linear pUC-PaoxscFvTaoxT38473G418 solution or 1 μl of pUC-PgapscFvTaoxT38473G418 solution were mixed and transferred into an electroporation cuvette (disposable cuvette electrode, electrode spacing 2 mm (manufactured by BM Instruments)), After being subjected to 7.5 kV/cm, 25 μF and 200 Ω, the cells were suspended in 1 ml of YPD medium and allowed to stand at 30° C. for 1 hour. After standing for 1 hour, cells were collected (3000×g, 5 minutes, 20° C.), and 961 μl of the supernatant was discarded. After resuspension with the remaining solution, YPDG418 selective agar plate (1% yeast extract (Becton Dickinson), 2% polypeptone (Nihon Pharmaceutical), 2% glucose, 1.5% agarose, 0.05% G418 disulfate ( manufactured by Nacalai Tesque)), and strains that grow in stationary culture at 30°C for 3 days were selected to obtain anti-lysozyme single-chain antibody-expressing yeast.
同様にして、BGL1発現ベクターpUC-PaoxBGL1TaoxT38473G418を用いてBGL1発現酵母を、mUkG1発現ベクターpUC-PaoxmUkG1TaoxT38473G418を用いてmUkG1発現酵母を取得した。 Similarly, BGL1-expressing yeast was obtained using BGL1-expressing vector pUC-PaoxBGL1TaoxT38473G418, and mUkG1-expressing yeast was obtained using mUkG1-expressing vector pUC-PaoxmUkG1TaoxT38473G418.
続いて、実施例3で構築した配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクター(CCA39734_Hyg、CCA38267_Hyg、CCA37956_Hyg、CCA37582_Hyg、CCA39503_Hyg、CCA38927_Hyg)を用いて、以下のように抗リゾチウム一本鎖抗体発現酵母、BGL1発現酵母、mUkG1発現酵母を形質転換した。 Subsequently, gene inactivation vectors (CCA39734_Hyg, CCA38267_Hyg, CCA38267_Hyg, CCA37956_Hyg, CCA37582_Hyg, CCA39503_Hyg, CCA38927_Hyg) were used to transform anti-lysozyme single-chain antibody-expressing yeast, BGL1-expressing yeast, and mUkG1-expressing yeast as follows.
抗リゾチウム一本鎖抗体発現酵母、BGL1発現酵母、mUkG1発現酵母を3mlのYPD培地(1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、2% glucose)に接種し、30℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液500μlを50mlのYPD培地に接種し、OD600が1~1.5になるまで振盪培養後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、250μlの1M DTT(終濃度25mM)を含む10mlの50mMリン酸カリウムバッファー, pH7.5に再懸濁した。 Inoculate 3 ml of YPD medium (1% yeast extract bacto (Becton Dickinson), 2% polypeptone (Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), 2% glucose) with anti-lysozyme single-chain antibody-expressing yeast, BGL1-expressing yeast, and mUkG1-expressing yeast. and cultured with shaking overnight at 30°C to obtain a preculture. 500 μl of the resulting preculture was inoculated into 50 ml of YPD medium, cultured with shaking until OD600 reached 1 to 1.5, harvested (3000×g, 10 minutes, 20°C), and added to 250 μl of 1M DTT (final concentration 25 mM) in 10 ml of 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5.
この懸濁液を30℃で15分インキュベート後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、予め氷冷した50mlのSTMバッファー(270mMスクロース、10mM Tris-HCl、1mM塩化マグネシウム、pH7.5)で洗浄した。洗浄液を集菌(3000×g、10分、4℃)し、25 mlのSTMバッファーで再度洗浄したのち、集菌(3000×g、10分、4℃)した。最終的に、250μlの氷冷STMバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。 After incubating this suspension at 30°C for 15 minutes, the cells were harvested (3000 x g, 10 minutes, 20°C) and added to 50 ml of ice-cooled STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7). .5). The washed solution was collected (3000×g, 10 minutes, 4° C.), washed again with 25 ml of STM buffer, and collected (3000×g, 10 minutes, 4° C.). Finally, they were suspended in 250 μl of ice-cold STM buffer to obtain a competent cell solution.
このコンピテントセル溶液60μlと実施例3で構築した配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクター(CCA39734_Hyg、CCA38267_Hyg、CCA37956_Hyg、CCA37582_Hyg、CCA39503_Hyg、CCA38927_Hyg)3μlを混合し、エレクトロポレーション用キュベット(ディスポキュベット電極、電極間隔2mm(ビーエム機器社製)に移し入れ、7.5kV/cm、25μF、200Ωに供した後、菌体を1mlのYPD培地で懸濁し、30℃で1時間静置した。1時間静置後、集菌(3000×g、5分、20℃)し、上清963μlを廃棄した。残った溶液で再懸濁後、YPDHyg選択寒天プレート(1% yeast extract(Becton Dickinson社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、2% glucose、1.5%アガロース、100mg/L ハイグロマイシンB(和光純薬社製))に塗布し、30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化された抗リゾチウム一本鎖抗体発現酵母、BGL1発現酵母、mUkG1発現酵母を取得した。 60 μl of this competent cell solution and a gene inactivation vector consisting of the base sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 11 constructed in Example 3 ( 3 μl of CCA39734_Hyg, CCA38267_Hyg, CCA37956_Hyg, CCA37582_Hyg, CCA39503_Hyg, CCA38927_Hyg) was mixed, transferred to an electroporation cuvette (disposable cuvette electrode, electrode spacing 2 mm (manufactured by BM Co., Ltd.), and subjected to 7.5 kV/cm, 25 μF, 200 Ω. After that, the cells were suspended in 1 ml of YPD medium and allowed to stand for 1 hour at 30° C. After standing for 1 hour, the cells were harvested (3000×g, 5 minutes, 20° C.), and 963 μl of the supernatant was discarded. After resuspension with the remaining solution, YPDHyg selective agar plate (1% yeast extract (Becton Dickinson), 2% polypeptone (Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), 2% glucose, 1.5% agarose, 100 mg/L hygromycin B (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)) and select strains that grow in static culture at 30 ° C. for 3 days. Anti-lysozyme single-chain antibody-expressing yeast, BGL1-expressing yeast, and mUkG1-expressing yeast in which the gene consisting of the nucleotide sequence shown in No. 11 was inactivated were obtained.
続いて、実施例3で構築した配列番号1、配列番号5、配列番号7、配列番号9に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクター(CCA39734_NAT、CCA37956_bsd、CCA37582_Zeo、CCA39503_bsd)を用いて、以下のように抗リゾチウム一本鎖抗体発現酵母、BGL1発現酵母、mUkG1発現酵母を更に形質転換した。 Subsequently, using the gene inactivation vectors (CCA39734_NAT, CCA37956_bsd, CCA37582_Zeo, CCA39503_bsd) consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 9 constructed in Example 3, Anti-lysozyme single-chain antibody-expressing yeast, BGL1-expressing yeast, and mUkG1-expressing yeast were further transformed as follows.
上記と同様に配列番号3に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化された抗リゾチウム一本鎖抗体発現酵母、BGL1発現酵母、mUkG1発現酵母を3mlのYPD培地(1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、2% glucose)に接種し、30℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液500μlを50mlのYPD培地に接種し、OD600が1~1.5になるまで振盪培養後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、250μlの1M DTT(終濃度25mM)を含む10mlの50mMリン酸カリウムバッファー, pH7.5に再懸濁した。 3 ml of YPD medium (1% yeast extract bacto (Becton Dickinson company), 2% polypeptone (manufactured by Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), 2% glucose) and cultured with shaking overnight at 30°C to obtain a preculture solution. 500 μl of the resulting preculture was inoculated into 50 ml of YPD medium, cultured with shaking until OD600 reached 1 to 1.5, harvested (3000×g, 10 minutes, 20°C), and added to 250 μl of 1M DTT (final concentration 25 mM) in 10 ml of 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5.
この懸濁液を30℃で15分インキュベート後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、予め氷冷した50mlのSTMバッファー(270mMスクロース、10mM Tris-HCl、1mM塩化マグネシウム、pH7.5)で洗浄した。洗浄液を集菌(3000×g、10分、4℃)し、25 mlのSTMバッファーで再度洗浄したのち、集菌(3000×g、10分、4℃)した。最終的に、250μlの氷冷STMバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。 After incubating this suspension at 30°C for 15 minutes, the cells were harvested (3000 x g, 10 minutes, 20°C) and added to 50 ml of ice-cooled STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7). .5). The washed solution was collected (3000×g, 10 minutes, 4° C.), washed again with 25 ml of STM buffer, and collected (3000×g, 10 minutes, 4° C.). Finally, they were suspended in 250 μl of ice-cold STM buffer to obtain a competent cell solution.
このコンピテントセル溶液60μlと実施例3で構築した配列番号1、配列番号5、配列番号7、配列番号9に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクター(CCA39734_NAT、CCA37956_bsd、CCA37582_Zeo、CCA39503_bsd)3μlを混合し、エレクトロポレーション用キュベット(ディスポキュベット電極、電極間隔2mm(ビーエム機器社製))に移し入れ、7.5kV/cm、25μF、200Ωに供した後、菌体を1mlのYPD培地で懸濁し、30℃で1時間静置した。1時間静置後、集菌(3000×g、5分、20℃)し、上清963μlを廃棄した。残った溶液で再懸濁後、YPDNAT選択寒天プレート(1% yeast extract(Becton Dickinson社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、2% glucose、1.5%アガロース、100mg/L clone NAT(Werner BioAgent社製))またはYPDbsd選択寒天プレート(1% yeast extract(Becton Dickinson社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、2% glucose、1.5%アガロース、500mg/LブラストサイジンS(和光純薬社製))またはYPDZeo選択寒天プレート(1% yeast extract(Becton Dickinson社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、2% glucose、1.5%アガロース、100mg/L Zeocin(商標)(InvivoGen社製))に塗布し、30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、配列番号1、配列番号5、配列番号7、配列番号9に示す塩基配列からなる遺伝子が更に不活性化された抗リゾチウム一本鎖抗体発現酵母、BGL1発現酵母、mUkG1発現酵母を取得した。 60 μl of this competent cell solution and a gene inactivation vector (CCA39734_NAT, CCA37956_bsd, CCA37582_Zeo, CCA39503_bsd) consisting of the base sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 9 constructed in Example 3 3 μl was mixed, transferred to an electroporation cuvette (disposable cuvette electrode, electrode spacing 2 mm (manufactured by BM Equipment Co., Ltd.)), subjected to 7.5 kV/cm, 25 μF, 200 Ω, and then the cells were added to 1 ml of YPD medium. It was suspended and allowed to stand at 30°C for 1 hour. After standing for 1 hour, cells were collected (3000×g, 5 minutes, 20° C.), and 963 μl of the supernatant was discarded. After resuspending with the remaining solution, YPDNAT selective agar plate (1% yeast extract (Becton Dickinson), 2% polypeptone (Nihon Pharmaceutical), 2% glucose, 1.5% agarose, 100mg/L clone NAT (Werner BioAgent)) or YPDbsd selective agar plate (1% yeast extract (Becton Dickinson), 2% polypeptone (Nihon Pharmaceutical), 2% glucose, 1.5% agarose, 500 mg/L Blasticidin S (Wako Jun) Pharmaceutical company)) or YPDZeo selective agar plate (1% yeast extract (Becton Dickinson), 2% polypeptone (Nihon Pharmaceutical), 2% glucose, 1.5% agarose, 100mg/L Zeocin (trademark) (InvivoGen) (manufactured)), and select strains that grow in static culture at 30 ° C for 3 days, and the genes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 9 are further inactivated. Anti-lysozyme single-chain antibody-expressing yeast, BGL1-expressing yeast, and mUkG1-expressing yeast were obtained.
表5に、取得した形質転換酵母を形質転換酵母ID、用いた発現ベクター、用いた遺伝子の不活性化用ベクターで纏めて示す。 Table 5 summarizes the obtained transformed yeast by transformed yeast ID, expression vector used, and gene inactivation vector used.
<実施例5:遺伝子不活性化の確認>
実施例4で取得した形質転換酵母の染色体DNAをカネカ簡易DNA抽出キット version 2(カネカ社製)を用いて調製した。調製した染色体DNA混合物をテンプレートにして遺伝子不活性化の確認をPCRで行った。形質転換に用いた遺伝子の不活性化用ベクターのID、核酸断片の増幅に用いたプライマー(Fw及びRe)の番号及び配列を表6に示す。
<Example 5: Confirmation of gene inactivation>
The chromosomal DNA of the transformed yeast obtained in Example 4 was prepared using Kaneka Simple DNA Extraction Kit version 2 (manufactured by Kaneka). Using the prepared chromosomal DNA mixture as a template, gene inactivation was confirmed by PCR. Table 6 shows the IDs of the gene-inactivating vectors used for transformation, and the numbers and sequences of the primers (Fw and Re) used to amplify the nucleic acid fragments.
遺伝子不活性化の確認は増幅核酸断片の断片長や内部配列の配列解析等にて行った。その結果、実施例4で取得した形質転換酵母の全てにおいて、所望の遺伝子が不活性化されていることを確認した。 Confirmation of gene inactivation was performed by sequence analysis of the fragment length of the amplified nucleic acid fragment and the internal sequence. As a result, it was confirmed that the desired gene was inactivated in all of the transformed yeast obtained in Example 4.
<実施例6:形質転換酵母の培養>
実施例4で得られた抗リゾチウム一本鎖抗体発現酵母(AOXscFv_1~7)を2mlのBMGY培地(1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate(Becton Dickinson社製)、1% Ammonium Sulfate、0.4mg/l Biotin、100mM リン酸カリウム(pH6.0)、2% Glycerol)に接種し、これを30℃、170rpm、24時間振盪培養後、前培養液を得た。続いて前培養液の菌体濃度をOD600にて測定し、初期OD600が0.5となるように25mlのBMMY培地(1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate(Becton Dickinson社製)、1% Ammonium Sulfate、0.4mg/l Biotin、100mM リン酸カリウム(pH6.0)、2% Methanol)に接種し、これを30℃、170rpm、48時間振盪培養後、遠心分離(12000rpm、5分、4℃)により培養上清を回収した。
<Example 6: Culture of transformed yeast>
2 ml of BMGY medium (1% yeast extract bacto (manufactured by Becton Dickinson), 2% polypeptone (manufactured by Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate (manufactured by Becton Dickinson), 1% Ammonium Sulfate, 0.4 mg/l Biotin, 100 mM potassium phosphate (pH 6.0), 2% Glycerol), After shaking culture at 170 rpm for 24 hours, a preculture was obtained. Subsequently, the cell concentration of the pre-culture solution was measured at OD600, and the initial OD600 was 0.5. , 0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate (manufactured by Becton Dickinson), 1% Ammonium Sulfate, 0.4mg/l Biotin, 100mM potassium phosphate (pH6.0), 2% Methanol). After shaking culture at 30°C, 170 rpm for 48 hours, the culture supernatant was collected by centrifugation (12000 rpm, 5 minutes, 4°C).
実施例4で得られた抗リゾチウム一本鎖抗体発現酵母(AOXscFv_1~5、AOXscFv_8~10)、BGL1発現酵母(AOXBGL1_1~5)、mUkG1発現酵母(AOXmUkG1_1~4)を2mlのBMGY培地(1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate(Becton Dickinson社製)、1% Ammonium Sulfate、0.4mg/l Biotin、100mM リン酸カリウム(pH6.0)、2% Glycerol)に接種し、これを30℃、170rpm、24時間振盪培養後、前培養液を得た。2mlのBMMY培地(1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate(Becton Dickinson社製)、1% Ammonium Sulfate、0.4mg/l Biotin、100mM リン酸カリウム(pH6.0)、2% Methanol)に前培養液を200μl植継ぎ、これを30℃、170rpm、72時間振盪培養後、遠心分離(12000rpm、5分、4℃)により培養上清を回収した。 2 ml of BMGY medium (1% yeast extract bacto (manufactured by Becton Dickinson), 2% polypeptone (manufactured by Nihon Pharmaceutical), 0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate (manufactured by Becton Dickinson), 1% Ammonium Sulfate, 0.4mg/l Biotin, 100mM Potassium phosphate (pH 6.0, 2% Glycerol) was inoculated, and shake culture was carried out at 30° C., 170 rpm for 24 hours to obtain a preculture solution. 2 ml of BMMY medium (1% yeast extract bacto (manufactured by Becton Dickinson), 2% polypeptone (manufactured by Nihon Pharmaceutical), 0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate (manufactured by Becton Dickinson), 1% Ammonium Sulfate, 200 μl of the pre-culture solution was transferred to 0.4 mg/l Biotin, 100 mM potassium phosphate (pH 6.0), 2% Methanol), shake cultured at 30° C., 170 rpm for 72 hours, and then centrifuged (12000 rpm, 5 minutes, 4°C) to collect the culture supernatant.
実施例4で得られた抗リゾチウム一本鎖抗体発現酵母(GAPscFv_1~5)を2mlのBMGY培地(1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate(Becton Dickinson社製)、1% Ammonium Sulfate、0.4mg/l Biotin、100mM リン酸カリウム(pH6.0)、2% Glycerol)に接種し、これを30℃、170rpm、24時間振盪培養後、前培養液を得た。2mlのBMGY培地(1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate(Becton Dickinson社製)、1% Ammonium Sulfate、0.4mg/l Biotin、100mM リン酸カリウム(pH6.0)、2% Glycerol)に前培養液を200μl植継ぎ、これを30℃、170rpm、72時間振盪培養後、遠心分離(12000rpm、5分、4℃)により培養上清を回収した。 2 ml of BMGY medium (1% yeast extract bacto (manufactured by Becton Dickinson), 2% polypeptone (manufactured by Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate (manufactured by Becton Dickinson), 1% Ammonium Sulfate, 0.4 mg/l Biotin, 100 mM potassium phosphate (pH 6.0), 2% Glycerol), After shaking culture at 170 rpm for 24 hours, a preculture was obtained. 2 ml of BMGY medium (1% yeast extract bacto (manufactured by Becton Dickinson), 2% polypeptone (manufactured by Nihon Pharmaceutical), 0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate (manufactured by Becton Dickinson), 1% Ammonium Sulfate, 0.4mg/l Biotin, 100mM potassium phosphate (pH6.0), 2% Glycerol) was transferred to 200μl of the pre-culture solution, cultured with shaking at 30°C, 170rpm for 72 hours, and then centrifuged (12000rpm, 5 minutes, 4°C) to collect the culture supernatant.
<実施例7:ELISA法による抗リゾチウム一本鎖抗体の分泌量の測定>
実施例6で得られた培養上清への抗リゾチウム一本鎖抗体分泌発現量は、サンドイッチELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)法により以下に示す方法で行った。
<Example 7: Measurement of secretion amount of anti-lysodium single-chain antibody by ELISA>
The expression level of anti-lysozyme single chain antibody secretion into the culture supernatant obtained in Example 6 was determined by the sandwich ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method according to the following method.
ELISA用プレート(Coaster Assay Plate, 96well Clear, EasywashTM(コーニング社製))に固定化バッファー(8g/L 塩化ナトリウム、0.2g/L 塩化カリウム、1.15g/L リン酸一水素ナトリウム(無水)、0.2g/L リン酸二水素カリウム(無水)、1mM 塩化マグネシウム)にて1μM/mLとなるように溶解したリゾチウム(和光純薬社製)を各ウェル50μlずつ添加し、終夜4℃でインキュベートした。インキュベート後、ウェル中の溶液を除去し、イムノブロック(大日本住友製薬社製)200μlでブロッキングし、室温で1時間静置した。PBSTバッファー(8g/L 塩化ナトリウム、0.2g/L 塩化カリウム、1.15g/L リン酸一水素ナトリウム(無水)、0.2g/L リン酸二水素カリウム(無水)、0.1% Tween20)で3回洗浄後、系列希釈した標準抗リゾチウム一本鎖抗体と希釈した培養上清を各ウェル50μlずつ添加し、室温で1時間反応した。PBSTバッファーで3回洗浄後、PBSTバッファーにて120,000倍希釈した二次抗体溶液(二次抗体:Anti-6X His tag antibody (HRP)(アブカム社製))を各ウェル50μlずつ添加し、室温で1時間反応させた。PBSTバッファーで3回洗浄後、50μlのTMB-1 Component Microwell Peroxidase Substrate SureBlue(KPL社製)を添加し、室温で3分静置した。50μlのTMB Stop Solution(KPL社製)を添加して反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー(Envison;パーキンエルマー社製)で450nmの吸光度を測定した。培養上清中の抗リゾチウム一本鎖抗体の定量は、標準抗リゾチウム一本鎖抗体の検量線を用いて行った。この方法により得られた抗リゾチウム一本鎖抗体分泌発現量と各々の菌体濃度(OD660)を表7~9に示した。 Immobilization buffer ( 8 g/L sodium chloride, 0.2 g/L potassium chloride, 1.15 g/L sodium monohydrogen phosphate (anhydrous), 50 μl of lysotium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dissolved in 0.2 g/L potassium dihydrogen phosphate (anhydrous), 1 mM magnesium chloride) to 1 μM/mL was added to each well and incubated overnight at 4°C. . After incubation, the solution in the wells was removed, blocked with 200 μl of Immunoblock (manufactured by Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.), and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Wash three times with PBST buffer (8g/L sodium chloride, 0.2g/L potassium chloride, 1.15g/L sodium monohydrogen phosphate (anhydrous), 0.2g/L potassium dihydrogen phosphate (anhydrous), 0.1% Tween20) After that, 50 μl of serially diluted standard anti-lysodium single chain antibody and diluted culture supernatant were added to each well and reacted at room temperature for 1 hour. After washing three times with PBST buffer, add 50 μl of secondary antibody solution (secondary antibody: Anti-6X His tag antibody (HRP) (manufactured by Abcam)) diluted 120,000-fold with PBST buffer and keep at room temperature. React for 1 hour. After washing three times with PBST buffer, 50 µl of TMB-1 Component Microwell Peroxidase Substrate SureBlue (manufactured by KPL) was added and allowed to stand at room temperature for 3 minutes. After stopping the reaction by adding 50 μl of TMB Stop Solution (manufactured by KPL), the absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader (Envison; manufactured by PerkinElmer). Quantification of the anti-lysodium single-chain antibody in the culture supernatant was performed using a standard anti-lysodium single-chain antibody calibration curve. Tables 7 to 9 show the amount of anti-lysozyme single-chain antibody secretion expression obtained by this method and the concentration of each cell (OD660).
表7は実施例4で得られた抗リゾチウム一本鎖抗体発現酵母(AOXscFv_1~7)を実施例6の通り25mlのBMMY培地で培養した培養上清の抗リゾチウム一本鎖抗体の分泌発現量の結果を示す。表8は実施例4で得られた抗リゾチウム一本鎖抗体発現酵母(AOXscFv_1~5、AOXscFv_8~10)を実施例6の通り2mlのBMMY培地で培養した培養上清の抗リゾチウム一本鎖抗体の分泌発現量の結果を示す。表9は実施例4で得られた抗リゾチウム一本鎖抗体発現酵母(GAPscFv_1~5)を実施例6の通り2mlのBMGY培地で培養した培養上清の抗リゾチウム一本鎖抗体の分泌発現量の結果を示す。 Table 7 shows the amount of anti-lysodium single-chain antibody secreted in the culture supernatant obtained by culturing the anti-lysodium single-chain antibody-expressing yeast (AOXscFv_1-7) obtained in Example 4 in 25 ml of BMMY medium as in Example 6. shows the results of Table 8 shows the anti-lysodium single-chain antibody of the culture supernatant obtained by culturing the anti-lysodium single-chain antibody-expressing yeast (AOXscFv_1-5, AOXscFv_8-10) obtained in Example 4 in 2 ml of BMMY medium as in Example 6. shows the results of the secretion expression level of Table 9 shows the secretion expression level of the anti-lysodium single-chain antibody in the culture supernatant obtained by culturing the anti-lysodium single-chain antibody-expressing yeast (GAPscFv_1-5) obtained in Example 4 in 2 ml of BMGY medium as in Example 6. shows the results of
その結果、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11に示す塩基配列からなる遺伝子を不活性化した株(AOX1scFv_2~7)の抗リゾチウム抗体分泌発現量は、不活性化していない株(AOX1scFv_1)と比較して、約1.2倍~2倍増加した(表7)。配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7に示す塩基配列からなる遺伝子を更に不活性化した株(AOX1scFv_8~10)は、不活性化した遺伝子が増えるごとに抗リゾチウム一本鎖抗体の分泌発現量が増加した(表8)。また配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7に示す塩基配列からなる遺伝子をすべて不活性化した株(AOX1scFv_10)は、不活性化していない株(AOX1scFv_1)と比較して、分泌発現量が約3倍増加した(表8)。抗リゾチウム一本鎖抗体がGAPプロモーター制御下で発現する株においても、不活性化していない株(GAPscFv_1)と比較して、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7に示す塩基配列からなる遺伝子を不活性化した株(GAPscFv_2~5)において、上記と同様に、抗リゾチウム一本鎖抗体の分泌発現量が増加した(表9)。 As a result, strains (AOX1scFv_2-7) in which the gene consisting of the base sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 11 were inactivated, expressed anti-lysozyme antibody secretion. Amounts increased approximately 1.2- to 2-fold compared to the non-inactivated strain (AOX1scFv_1) (Table 7). Strains (AOX1scFv_8-10) in which the genes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 7 were further inactivated, the anti-lysozyme single chain increased as the number of inactivated genes increased. Antibody secretion expression increased (Table 8). In addition, the strain (AOX1scFv_10) in which all the genes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 7 were inactivated compared to the non-inactivated strain (AOX1scFv_1), secreted The expression level increased about 3-fold (Table 8). In the strain expressing the anti-lysozyme single-chain antibody under the control of the GAP promoter, the nucleotides shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 7 were compared with the non-inactivated strain (GAPscFv_1). In the strains (GAPscFv_2-5) in which the gene consisting of the sequence was inactivated, the amount of secretory expression of the anti-lysozyme single chain antibody was increased in the same manner as above (Table 9).
<実施例8:pNPGを発色基質とした比色分析によるBGL1の分泌量の測定>
実施例6で得られた培養上清へのBGL1分泌発現量は、pNitrophenyl-β-D-glucopyranoside(pNPG)を発色基質とした比色分析法により以下に示す方法で行った。
<Example 8: Measurement of secretion amount of BGL1 by colorimetric analysis using pNPG as a chromogenic substrate>
The expression level of BGL1 secreted into the culture supernatant obtained in Example 6 was determined by a colorimetric analysis method using pNitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG) as a chromogenic substrate by the method shown below.
96ウェルプレート(アッセイプレート(中結合能)(IWAKI社製))に基質溶液(50mM クエン酸緩衝液(pH 5.0)、2mM pNPG)を各ウェルに97.5μlずつ添加後、培養上清2.5μlを加えて25℃にて10分間反応した。3M炭酸ナトリウム水溶液を100μl添加して反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー(Envision;パーキンエルマー社製)で405nmの吸光度を測定した。この方法により得られた吸光度と各々の菌体濃度(OD660)を表10に示した。各吸光度は、BGL1遺伝子を持たない野生型株の吸光度にて補正した。 After adding 97.5 μl of substrate solution (50 mM citrate buffer (pH 5.0), 2 mM pNPG) to each well of a 96-well plate (assay plate (medium binding capacity) (manufactured by IWAKI)), add 2.5 μl of the culture supernatant. In addition, the mixture was reacted at 25°C for 10 minutes. After 100 μl of 3M sodium carbonate aqueous solution was added to stop the reaction, the absorbance at 405 nm was measured with a microplate reader (Envision; manufactured by PerkinElmer). Table 10 shows the absorbance and each cell concentration (OD660) obtained by this method. Each absorbance was corrected with the absorbance of the wild-type strain without the BGL1 gene.
その結果、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7に示す塩基配列からなる遺伝子を不活性化した株(AOXBGL1_2~5)は、不活性化していない株(AOX1scFv_1)と比較して、不活性化した遺伝子が増えるごとに吸光度が増加していた。吸光度はBGL1の酵素活性の指標であり、すべての酵母で同じ配列のBGL1遺伝子を使用していることから、吸光度の増加は、BGL1の分泌発現量の増加を示している。 As a result, the strains (AOXBGL1_2-5) in which the genes consisting of the base sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 7 were inactivated were compared with the non-inactivated strain (AOX1scFv_1). , the absorbance increased with each inactivated gene. Absorbance is a measure of the enzymatic activity of BGL1, and since all yeasts use the same sequence of the BGL1 gene, an increase in absorbance indicates an increase in secreted expression of BGL1.
<実施例9:培養上清の蛍光強度測定によるmUkG1の分泌量の測定>
実施例6で得られた培養上清へのmUkG1分泌発現量は、培養上清の蛍光分析法により以下に示す方法で行った。
黒色96ウェルプレート(マイクロフルオロ1ブラック(IWAKI社製))の各ウェルに実施例6で得られた培養上清150μlを添加し、マイクロプレートリーダー(Envision;パーキンエルマー社製)で蛍光強度(励起波長485nm 蛍光波長510nm)を測定した。この方法により得られた相対蛍光強度と各々の菌体濃度(OD660)を表11に示した。相対蛍光強度は、mUkG1遺伝子を持たない野生型株の蛍光強度で補正し、mUkG1発現酵母株(AOXmUkG1_1)の蛍光強度を1として算出した。
<Example 9: Measurement of secretion amount of mUkG1 by fluorescence intensity measurement of culture supernatant>
The expression level of mUkG1 secreted into the culture supernatant obtained in Example 6 was determined by fluorescence analysis of the culture supernatant by the method shown below.
150 μl of the culture supernatant obtained in Example 6 was added to each well of a black 96-well plate (Microfluoro 1 Black (manufactured by IWAKI)), and fluorescence intensity (excitation wavelength 485 nm fluorescence wavelength 510 nm) was measured. Table 11 shows the relative fluorescence intensity and each cell concentration (OD660) obtained by this method. The relative fluorescence intensity was corrected by the fluorescence intensity of the wild-type strain without the mUkG1 gene, and calculated with the fluorescence intensity of the mUkG1-expressing yeast strain (AOXmUkG1_1) as 1.
その結果、配列番号1、配列番号3に示す塩基配列からなる遺伝子を不活性化した株(AOXmUkG1_2~3)は、不活性化していない株(AOXmUkG1_1)と比較して、相対蛍光強度が増加していた。更に、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7に示す塩基配列からなる遺伝子をすべて不活性化した株(AOXmUkG1_4)は、配列番号1または配列番号3に示す塩基配列からなる遺伝子を不活性化した株(AOXmUkG1_2または3)よりも相対蛍光強度は高く、不活性化してない株(AOXmUkG1_1)と比較して、2倍の蛍光強度を示した。緑色蛍光タンパク質mUkG1は、タンパク質の分子数と蛍光強度が相関していることから、蛍光強度の増加は分泌発現量の増加を示している。 As a result, strains (AOXmUkG1_2-3) in which the genes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 were inactivated showed an increase in relative fluorescence intensity compared to the non-inactivated strain (AOXmUkG1_1). was Furthermore, the strain (AOXmUkG1_4) in which all the genes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 7 were inactivated, the gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 The relative fluorescence intensity was higher than that of the inactivated strain (AOXmUkG1_2 or 3), and was twice that of the non-inactivated strain (AOXmUkG1_1). For the green fluorescent protein mUkG1, the number of protein molecules correlates with the fluorescence intensity, so an increase in fluorescence intensity indicates an increase in the amount of secretory expression.
Claims (8)
目的タンパク質をコードする塩基配列を含有するベクターを含み、
酵母、細菌、真菌、又は昆虫細胞である宿主細胞:
(a)配列番号3に示す塩基配列を含む遺伝子、
(b)配列番号3に示す塩基配列を含む遺伝子によりコードされるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードし、配列番号3に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
(c)配列番号3に示す塩基配列を含む遺伝子によりコードされるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードし、配列番号3に示す塩基配列と90%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
(d)配列番号3に示す塩基配列を含む遺伝子によりコードされるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードし、配列番号4に示すアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子。 any of the following genes (a) to (d) are inactivated,
A vector containing a nucleotide sequence encoding a protein of interest,
Host cells that are yeast, bacterial, fungal, or insect cells:
(a) a gene comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 3;
(b) under stringent conditions for a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, which encodes a protein having a function equivalent to that encoded by the gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3; a gene comprising a base sequence of hybridizing nucleic acids;
(c) contains a nucleotide sequence that encodes a protein having the same function as the protein encoded by the gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:3 and has 90 % or more sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:3 gene,
(d) encodes a protein having a function equivalent to the protein encoded by the gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, and encodes an amino acid sequence having 90 % or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4; gene to
請求項1に記載の宿主細胞。 The production amount of the target protein is increased compared to before the inactivation of the gene,
A host cell according to claim 1 .
8. The method according to claim 6 or 7 , wherein the culturing step uses a culture medium containing one or more carbon sources selected from the group consisting of glucose, glycerol and methanol.
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