JP7229806B2 - Observation method - Google Patents

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Description

本発明は、観察方法に関する。 The present invention relates to an observation method.

光学顕微鏡と電子顕微鏡との間で同一箇所を観察可能とする手法が知られている（例えば、特許文献１参照）。例えば、培養細胞を光学顕微鏡で蛍光観察し、同じ場所を走査電子顕微鏡で観察することで、蛍光観察で注目した細胞を、高倍率で詳細に観察することができる。 A technique is known that enables observation of the same point between an optical microscope and an electron microscope (see, for example, Patent Document 1). For example, fluorescence observation of cultured cells with an optical microscope and observation of the same location with a scanning electron microscope enables detailed observation of the cells observed in the fluorescence observation at high magnification.

特開平８－１６２０５９号公報JP-A-8-162059

走査電子顕微鏡において生体試料を観察するためには、試料作製が必要となる。例えば、培養容器上の培養細胞を光学顕微鏡と走査電子顕微鏡で観察する場合、光学顕微鏡では細胞内部の蛍光を観察するのに対して、走査電子顕微鏡では細胞表面を観察することとなる。そのため、光学顕微鏡で得られた蛍光情報と、走査電子顕微鏡で得られた細胞表面の構造と、が一致しない。 In order to observe a biological sample with a scanning electron microscope, sample preparation is required. For example, when observing cultured cells in a culture vessel with an optical microscope and a scanning electron microscope, fluorescence inside the cells is observed with the optical microscope, whereas cell surfaces are observed with the scanning electron microscope. Therefore, the fluorescence information obtained by the optical microscope does not match the cell surface structure obtained by the scanning electron microscope.

したがって、光学顕微鏡で蛍光観察を行った後、走査電子顕微鏡で観察する前に、培養細胞の内部を観察できるように、試料を加工しなければならない。しかしながら、光学顕微鏡で観察した箇所を走査電子顕微鏡で観察可能に加工して、その位置を走査電子顕微鏡で観察することは困難であった。 Therefore, the sample must be processed so that the inside of the cultured cells can be observed after fluorescence observation with an optical microscope and before observation with a scanning electron microscope. However, it has been difficult to process a portion observed with an optical microscope so that it can be observed with a scanning electron microscope and then observe that position with a scanning electron microscope.

本発明に係る観察方法の一態様は、
第１マーカーを有する容器上で、光学顕微鏡を用いて、試料を観察する工程と、
前記光学顕微鏡で観察した位置と前記第１マーカーの位置との位置関係を求める工程と、
前記容器上で前記試料を樹脂包埋することによって、前記試料が包埋され、かつ、前記第１マーカーの痕が形成された樹脂ブロックを形成する工程と、
前記樹脂ブロックを、第２マーカーを有する試料ホルダーに取り付ける工程と、
前記光学顕微鏡で観察した位置と前記第１マーカーの位置との位置関係と、前記第１マーカーの痕の位置とに基づいて、前記樹脂ブロックが前記試料ホルダーに取り付けられた状態における前記光学顕微鏡で観察した位置を算出し、前記第２マーカーの位置と算出した前記光学顕微鏡で観察した位置との位置関係を求める工程と、
前記第２マーカーの位置と算出した前記光学顕微鏡で観察した位置との位置関係を求める工程の後に、前記試料ホルダーに取り付けられた前記樹脂ブロックを研磨する工程と、
前記試料ホルダーを、走査電子顕微鏡の試料ステージに取り付ける工程と、
前記第２マーカーの位置と算出した前記光学顕微鏡で観察した位置との位置関係と、前記試料ステージ上における前記第２マーカーの位置に基づいて、前記試料ステージ上における前記光学顕微鏡で観察した位置を求める工程と、
前記試料ステージ上における前記光学顕微鏡で観察した位置を、前記走査電子顕微鏡で観察する工程と、
を含む。 One aspect of the observation method according to the present invention is
Observing the sample using an optical microscope on the container having the first marker;
obtaining a positional relationship between the position observed by the optical microscope and the position of the first marker;
forming a resin block in which the sample is embedded and in which the trace of the first marker is formed by embedding the sample in a resin on the container;
attaching the resin block to a sample holder having a second marker;
Based on the positional relationship between the position observed with the optical microscope and the position of the first marker, and the position of the trace of the first marker , the optical microscope in the state where the resin block is attached to the sample holder a step of calculating the observed position and determining the positional relationship between the position of the second marker and the calculated position observed with the optical microscope;
After the step of determining the positional relationship between the position of the second marker and the calculated position observed with the optical microscope, polishing the resin block attached to the sample holder;
attaching the sample holder to a sample stage of a scanning electron microscope;
The position observed by the optical microscope on the sample stage based on the positional relationship between the position of the second marker and the calculated position observed by the optical microscope , and the position of the second marker on the sample stage. and
a step of observing, with the scanning electron microscope, the position observed with the optical microscope on the sample stage ;
including.

このような観察方法では、第２マーカーの位置と光学顕微鏡で観察した位置との位置関係を求めることができるため、容易に、光学顕微鏡および走査電子顕微鏡等の他の観察装置の両方で、試料の同一箇所を観察することができる。 With such an observation method, the positional relationship between the position of the second marker and the position observed with the optical microscope can be obtained, so that the sample can be easily observed with both an optical microscope and other observation devices such as a scanning electron microscope. can be observed.

本実施形態に係る観察方法の一例を示すフローチャート。4 is a flowchart showing an example of an observation method according to the embodiment; 培養細胞を光学顕微鏡で観察している様子を示す図。The figure which shows a mode that cultured cells are observed with an optical microscope. 培養容器を培養容器の底から見た図。The figure which looked at the culture container from the bottom of the culture container. 細胞を樹脂包埋する工程を説明するための図。The figure for demonstrating the process of embedding a cell in resin. 細胞を樹脂包埋する工程を説明するための図。The figure for demonstrating the process of embedding a cell in resin. 樹脂ブロックを模式的に示す図。The figure which shows a resin block typically. 樹脂ブロックを試料ホルダーに取り付ける様子を模式的に示す図。The figure which shows typically a mode that a resin block is attached to a sample holder. 樹脂ブロックを試料ホルダーに取り付けた状態を模式的に示す図。The figure which shows typically the state which attached the resin block to the sample holder. 樹脂ブロックを研磨する工程を説明するための図。The figure for demonstrating the process of grind|polishing a resin block. 樹脂ブロックを研磨する工程を説明するための図。The figure for demonstrating the process of grind|polishing a resin block. 走査電子顕微鏡の試料ステージに試料ホルダーを取り付けた状態を模式的に示す図。The figure which shows typically the state which attached the sample holder to the sample stage of the scanning electron microscope.

以下、本発明の好適な実施形態について図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。 Preferred embodiments of the present invention will be described in detail below with reference to the drawings. It should be noted that the embodiments described below do not unduly limit the scope of the invention described in the claims. Moreover, not all the configurations described below are essential constituent elements of the present invention.

１． 観察方法
まず、本実施形態に係る観察方法について、図面を参照しながら説明する。 1. Observation Method First, an observation method according to the present embodiment will be described with reference to the drawings.

本実施形態に係る観察方法は、第１マーカーを有する容器上で、光学顕微鏡を用いて、試料を観察する工程と、光学顕微鏡で観察した位置と第１マーカーの位置との位置関係を求める工程と、容器上で試料を樹脂包埋することによって、試料が包埋され、かつ、第１マーカーの痕が形成された樹脂ブロックを形成する工程と、樹脂ブロックを、第２マーカーを有する試料ホルダーに取り付ける工程と、光学顕微鏡で観察した位置と第１マーカーの位置との位置関係に基づいて、第２マーカーの位置と光学顕微鏡で観察した位置との位置関係を求める工程と、を含む。 The observation method according to the present embodiment includes a step of observing a sample on a container having a first marker using an optical microscope, and a step of determining the positional relationship between the position observed with the optical microscope and the position of the first marker. a step of embedding the sample in resin on the container to form a resin block in which the sample is embedded and a trace of the first marker is formed; and placing the resin block in a sample holder having a second marker. and obtaining the positional relationship between the position of the second marker and the position observed with the optical microscope based on the positional relationship between the position observed with the optical microscope and the position of the first marker.

図１は、本実施形態に係る観察方法の一例を示すフローチャートである。以下では、培養細胞を、光学顕微鏡および走査電子顕微鏡で観察する場合について説明する。 FIG. 1 is a flowchart showing an example of an observation method according to this embodiment. Observation of cultured cells with an optical microscope and a scanning electron microscope will be described below.

（１）光学顕微鏡観察（Ｓ１０）
図２は、細胞２を光学顕微鏡２０で観察している様子を示す図である。図３は、培養容器１０を模式的に示す平面図である。なお、図３は、培養容器１０を、培養容器１０の底から見た図である。 (1) Optical microscope observation (S10)
FIG. 2 is a diagram showing how cells 2 are observed with an optical microscope 20. As shown in FIG. FIG. 3 is a plan view schematically showing the culture vessel 10. FIG. 3 is a diagram of the culture container 10 as seen from the bottom of the culture container 10. FIG.

図２に示すように、培養容器１０上で培養された細胞２を、光学顕微鏡２０で観察する。 As shown in FIG. 2, the cells 2 cultured on the culture vessel 10 are observed with an optical microscope 20. As shown in FIG.

培養容器１０としては、培養ディッシュ（シャーレ）や、ガラス板などを用いることができる。図３に示すように、培養容器１０上には、観察した位置を特定するためのマーカー１２が設けられている。マーカー１２は、複数設けられている。図３に示す例では、９つのマーカー１２が、３行３列に配置されている。隣り合うマーカー１２の間隔は、例えば、２ｍｍ程度である。なお、マーカー１２の配置は特に限定されない。 As the culture container 10, a culture dish (petri dish), a glass plate, or the like can be used. As shown in FIG. 3, a marker 12 is provided on the culture vessel 10 to specify the observed position. A plurality of markers 12 are provided. In the example shown in FIG. 3, nine markers 12 are arranged in 3 rows and 3 columns. The interval between adjacent markers 12 is, for example, about 2 mm. Note that the arrangement of the markers 12 is not particularly limited.

マーカー１２は、光学顕微鏡および電子顕微鏡の観察方向から見て、同心円の形状を有している。そのため、光学顕微鏡観察および走査電子顕微鏡観察の両方において、マーカー１２の中心の位置を特定しやすい。なお、マーカー１２の形状は、同心円に限定されず、例えば、同心多角形であってもよい。 The marker 12 has a shape of concentric circles when viewed from the observation direction of the optical microscope and the electron microscope. Therefore, it is easy to specify the position of the center of the marker 12 in both optical microscope observation and scanning electron microscope observation. The shape of the marker 12 is not limited to concentric circles, and may be, for example, concentric polygons.

マーカー１２には、それぞれマーカー１２を特定するための番号が付されている。図２に示す例では、９つのマーカー１２に対して、それぞれ、Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３，Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３の番号が付されている。 Each marker 12 is assigned a number for identifying the marker 12 . In the example shown in FIG. 2, the nine markers 12 are numbered A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1, C2 and C3, respectively.

培養容器１０は、例えば、ガラスである。マーカー１２は、培養容器１０に成膜された金属膜である。例えば、培養容器１０上に金属蒸着することによって、マーカー１２を形成することができる。金属膜の厚さは、例えば、数十ｎｍ程度である。マーカー１２は、光学顕微鏡および走査電子顕微鏡の両方で観察可能であって、かつ、後述するように樹脂包埋されたときに樹脂にマーカーが転写可能に構成されていれば、金属膜に限定されない。 The culture vessel 10 is, for example, glass. The marker 12 is a metal film formed on the culture container 10 . For example, the markers 12 can be formed by metal deposition on the culture vessel 10 . The thickness of the metal film is, for example, about several tens of nm. The marker 12 is not limited to a metal film as long as it is observable with both an optical microscope and a scanning electron microscope and can be transferred to the resin when the marker is embedded in the resin as described later. .

細胞２の観察は、例えば、光学顕微鏡２０による蛍光観察によって行われる。具体的には、細胞２を蛍光色素等で標識して、光学顕微鏡２０で蛍光観察を行う。これにより、細胞や、細胞内小器官などの細胞を構成する構造の局在を観察することができる。光学顕微鏡２０による観察は、図２に示す例では、倒立顕微鏡を用いて、培養容器１０を底から観察している。なお、光学顕微鏡２０による観察は、図示はしないが、正立顕微鏡を用いて、培養容器１０の上から観察してもよい。 Observation of the cells 2 is performed, for example, by fluorescence observation using an optical microscope 20 . Specifically, cells 2 are labeled with a fluorescent dye or the like, and fluorescence observation is performed with an optical microscope 20 . This makes it possible to observe the localization of cells and structures that constitute cells such as intracellular organelles. In the example shown in FIG. 2, the observation with the optical microscope 20 uses an inverted microscope to observe the culture vessel 10 from the bottom. Although not shown, the observation with the optical microscope 20 may be performed from above the culture vessel 10 using an upright microscope.

（２）観察位置とマーカーの位置との位置関係を求める（Ｓ１２）
光学顕微鏡２０で細胞２を観察した位置（以下、「光顕観察位置」ともいう）とマーカー１２の位置との位置関係を求める。具体的には、光学顕微鏡２０の座標系において、光顕観察位置の座標（Ｘ１，Ｙ１）とマーカー１２の座標（Ｘ２，Ｙ２）を記録する。 (2) Determine the positional relationship between the observation position and the position of the marker (S12)
The positional relationship between the position where the cell 2 is observed with the optical microscope 20 (hereinafter also referred to as "optical microscope observation position") and the position of the marker 12 is obtained. Specifically, in the coordinate system of the optical microscope 20, the coordinates (X1, Y1) of the optical microscope observation position and the coordinates (X2, Y2) of the marker 12 are recorded.

例えば、光学顕微鏡２０の試料ステージの座標を読み取ることで、光顕観察位置の座標（Ｘ１，Ｙ１）と、マーカー１２の座標（Ｘ２，Ｙ２）と、を取得する。そして、取得した光顕観察位置の座標（Ｘ１，Ｙ１）と、マーカー１２の座標（Ｘ２，Ｙ２）と、を記録する。このとき、光顕観察位置の座標（Ｘ１，Ｙ１）とともに複数のマーカー１２の座標（Ｘ２，Ｙ２）を取得してもよい。このようにして、光顕観察位置とマーカー１２の位置との位置関係を求めることができる。以下では、工程Ｓ１２において、光顕観察位置の座標（Ｘ１，Ｙ１）と、Ａ１の番号が付されたマーカー１２（以下、「Ａ１マーカー」ともいう）の座標（Ｘ２，Ｙ２）が記録された場合について説明する。 For example, by reading the coordinates of the sample stage of the optical microscope 20, the coordinates (X1, Y1) of the optical microscope observation position and the coordinates (X2, Y2) of the marker 12 are acquired. Then, the obtained coordinates (X1, Y1) of the optical microscope observation position and the coordinates (X2, Y2) of the marker 12 are recorded. At this time, the coordinates (X2, Y2) of the plurality of markers 12 may be acquired together with the coordinates (X1, Y1) of the optical microscope observation position. In this way, the positional relationship between the optical microscope observation position and the position of the marker 12 can be obtained. Below, in step S12, the coordinates (X1, Y1) of the observation position under the optical microscope and the coordinates (X2, Y2) of the marker 12 numbered A1 (hereinafter also referred to as "A1 marker") are recorded. will be explained.

（３）樹脂包埋（Ｓ１４）
次に、細胞２を固定、脱水、および樹脂包埋する。 (3) Resin embedding (S14)
Cells 2 are then fixed, dehydrated and resin-embedded.

図４および図５は、細胞２を樹脂包埋する工程を説明するための図である。 4 and 5 are diagrams for explaining the process of embedding the cells 2 in resin.

図４に示すように、培養容器１０上に液状の樹脂４を流し込み、細胞２に包埋用容器３０を被せ、包埋用容器３０のなかで樹脂４を硬化させる。次に、図５に示すように、培養容器１０から硬化した樹脂４を引きはがす。これにより、細胞２が包埋された樹脂ブロック４０を形成できる。 As shown in FIG. 4 , a liquid resin 4 is poured onto the culture vessel 10 , the cells 2 are covered with the embedding vessel 30 , and the resin 4 is cured in the embedding vessel 30 . Next, as shown in FIG. 5, the hardened resin 4 is peeled off from the culture vessel 10 . Thereby, the resin block 40 in which the cells 2 are embedded can be formed.

図６は、樹脂ブロック４０を模式的に示す図である。 FIG. 6 is a diagram schematically showing the resin block 40. As shown in FIG.

マーカー１２を構成する金属膜およびマーカー１２に付した番号を構成する金属膜は、培養容器１０の底面との間に段差を形成する。そのため、図６に示すように、樹脂ブロック４０には、マーカー１２およびマーカー１２に付した番号が転写される。この結果、樹脂ブロック４０には、マーカー１２の痕４２およびマーカー１２に付した番号の痕が形成される。 The metal film forming the marker 12 and the metal film forming the number assigned to the marker 12 form a step with the bottom surface of the culture container 10 . Therefore, as shown in FIG. 6, the marker 12 and the number assigned to the marker 12 are transferred to the resin block 40 . As a result, marks 42 of the markers 12 and marks of the numbers attached to the markers 12 are formed on the resin block 40 .

（４）樹脂ブロックの試料ホルダーへの取り付け（Ｓ１６）
樹脂ブロック４０を、試料ホルダー５０に取り付ける。 (4) Attaching the resin block to the sample holder (S16)
A resin block 40 is attached to the sample holder 50 .

図７は、樹脂ブロック４０を、試料ホルダー５０に取り付ける様子を模式的に示す図である。図８は、樹脂ブロック４０を、試料ホルダー５０に取り付けた状態を模式的に示す図である。 FIG. 7 is a diagram schematically showing how the resin block 40 is attached to the sample holder 50. As shown in FIG. FIG. 8 is a diagram schematically showing a state in which the resin block 40 is attached to the sample holder 50. As shown in FIG.

図７および図８に示すように、試料ホルダー５０は、マーカー５２を有している。図７および図８に示す例では、試料ホルダー５０は、複数（図示の例では３つ）のマーカー５２を有している。なお、マーカー５２の配置は特に限定されない。マーカー５２は、光学顕微鏡および走査電子顕微鏡の両方で確認可能であれば、その形状および大きさは特に限定されない。 As shown in FIGS. 7 and 8, sample holder 50 has markers 52 . In the example shown in FIGS. 7 and 8, the sample holder 50 has a plurality of (three in the shown example) markers 52 . Note that the arrangement of the markers 52 is not particularly limited. The shape and size of the marker 52 are not particularly limited as long as they can be confirmed with both an optical microscope and a scanning electron microscope.

図７および図８に示す例では、樹脂ブロック４０を試料ホルダー５０の孔に挿入することで、樹脂ブロック４０を試料ホルダー５０に取り付けている。なお、樹脂ブロック４０の試料ホルダー５０への取り付け方法は特に限定されない。 In the examples shown in FIGS. 7 and 8 , the resin block 40 is attached to the sample holder 50 by inserting the resin block 40 into the hole of the sample holder 50 . The method of attaching the resin block 40 to the sample holder 50 is not particularly limited.

（５）観察位置と試料ホルダーのマーカーとの位置関係を求める（Ｓ１８）
次に、光顕観察位置とマーカー１２の位置との位置関係に基づいて、光顕観察位置と試料ホルダー５０のマーカー５２の位置との位置関係を求める。具体的には、樹脂ブロック４０が試料ホルダー５０に取り付けられた状態において、光顕観察位置の座標（Ｘ１´，Ｙ１´）とマーカー５２の座標（Ｘ３，Ｙ３）を記録する。 (5) Determine the positional relationship between the observation position and the marker of the sample holder (S18)
Next, based on the positional relationship between the optical microscope observation position and the position of the marker 12, the positional relationship between the optical microscope observation position and the position of the marker 52 of the sample holder 50 is obtained. Specifically, with the resin block 40 attached to the sample holder 50, the coordinates (X1', Y1') of the optical microscope observation position and the coordinates (X3, Y3) of the marker 52 are recorded.

まず、樹脂ブロック４０が取り付けられた試料ホルダー５０を光学顕微鏡２０の試料ステージにセットする。次に、光学顕微鏡２０でマーカー１２の痕を見つける。マーカー１２の痕４２は、観察した細胞２との位置関係を求めたマーカー１２によって樹脂ブロック４０に形成されたマーカー１２の痕４２である。すなわち、ここではＡ１マーカー１２の痕である。そして、Ａ１マーカー１２の痕４２の座標（Ｘ２´，Ｙ２´）を、光学顕微鏡２０の試料ステージの座標を読み取ることで取得する。 First, the sample holder 50 to which the resin block 40 is attached is set on the sample stage of the optical microscope 20 . Next, traces of the marker 12 are found with an optical microscope 20 . The mark 42 of the marker 12 is the mark 42 of the marker 12 formed on the resin block 40 by the marker 12 whose positional relationship with the observed cell 2 is obtained. That is, here it is the trace of the A1 marker 12 . Then, the coordinates (X2', Y2') of the trace 42 of the A1 marker 12 are obtained by reading the coordinates of the sample stage of the optical microscope 20. FIG.

次に、取得したＡ１マーカー１２の痕４２の座標（Ｘ２´，Ｙ２´）と、工程Ｓ１２で記録したＡ１マーカー１２の座標（Ｘ２，Ｙ２）と、に基づいて、工程Ｓ１２における座標系と工程Ｓ１８における座標系との間の座標変換を行うための変換式を求める。次に、求めた変換式と、工程Ｓ１２で記録した光顕観察位置の座標（Ｘ１，Ｙ１）と、を用いて、光顕観察位置の座標（Ｘ１´，Ｙ１´）を求める。 Next, based on the acquired coordinates (X2′, Y2′) of the trace 42 of the A1 marker 12 and the coordinates (X2, Y2) of the A1 marker 12 recorded in step S12, the coordinate system in step S12 and the step A conversion formula for coordinate conversion with the coordinate system in S18 is obtained. Next, the coordinates (X1', Y1') of the optical microscope observation position are obtained using the obtained conversion formula and the coordinates (X1, Y1) of the optical microscope observation position recorded in step S12.

次に、マーカー５２の座標（Ｘ３，Ｙ３）を、光学顕微鏡２０の試料ステージの座標を読み取ることで取得する。以上の工程により、光顕観察位置の座標（Ｘ１´，Ｙ１´）とマーカー５２の座標（Ｘ３，Ｙ３）を取得できる。なお、本工程において、複数のマーカー５２の座標を取得してもよい。 Next, the coordinates (X3, Y3) of the marker 52 are obtained by reading the coordinates of the sample stage of the optical microscope 20. FIG. Through the above steps, the coordinates (X1', Y1') of the optical microscope observation position and the coordinates (X3, Y3) of the marker 52 can be obtained. Note that coordinates of a plurality of markers 52 may be obtained in this step.

（６）樹脂ブロックの研磨（Ｓ２０）
次に、樹脂ブロック４０を研磨する。樹脂ブロック４０の研磨は、試料ホルダー５０に取り付けられた状態で行われる。 (6) Polishing the resin block (S20)
Next, the resin block 40 is polished. Polishing of the resin block 40 is performed while it is attached to the sample holder 50 .

図９および図１０は、樹脂ブロック４０を研磨する工程を説明するための図である。樹脂ブロック４０の研磨は、図９に示すように、研磨装置６を用いた機械研磨であってもよいし、図１０に示すように、イオンビームＩＢを用いた研磨であってもよい。樹脂ブロック４０を研磨することによって、細胞２の内部を樹脂ブロック４０の表面に露出させることができる。 9 and 10 are diagrams for explaining the process of polishing the resin block 40. FIG. The polishing of the resin block 40 may be mechanical polishing using a polishing device 6 as shown in FIG. 9, or polishing using an ion beam IB as shown in FIG. By polishing the resin block 40 , the inside of the cell 2 can be exposed on the surface of the resin block 40 .

なお、樹脂ブロック４０の研磨により、樹脂ブロック４０に形成されたマーカーの痕４２が消失する場合がある。このような場合でも、光顕観察位置の座標（Ｘ１´，Ｙ１´）
とマーカー５２の座標（Ｘ３，Ｙ３）が記録されているため、光顕観察位置を見失わない。 Note that the mark 42 of the marker formed on the resin block 40 may disappear due to the polishing of the resin block 40 . Even in such a case, the coordinates (X1', Y1') of the optical microscope observation position
, and the coordinates (X3, Y3) of the marker 52 are recorded, the optical microscope observation position is not lost.

（７）走査電子顕微鏡観察（Ｓ２２）
図１１は、走査電子顕微鏡６０の試料ステージ６２に試料ホルダー５０を取り付けた状態を模式的に示す図である。 (7) Scanning electron microscope observation (S22)
FIG. 11 is a diagram schematically showing a state in which the sample holder 50 is attached to the sample stage 62 of the scanning electron microscope 60. As shown in FIG.

次に、樹脂ブロック４０が取り付けられた試料ホルダー５０を走査電子顕微鏡６０の試料ステージ６２にセットして、光学顕微鏡２０で観察した位置で走査電子顕微鏡観察を行う。 Next, the sample holder 50 to which the resin block 40 is attached is set on the sample stage 62 of the scanning electron microscope 60, and scanning electron microscope observation is performed at the position observed by the optical microscope 20. FIG.

まず、樹脂ブロック４０が取り付けられた試料ホルダー５０を走査電子顕微鏡６０の試料ステージ６２にセットする。次に、試料ホルダー５０のマーカー５２の座標（ｘ３，ｙ３）を、試料ステージの座標を読み取ることで取得する。 First, the sample holder 50 to which the resin block 40 is attached is set on the sample stage 62 of the scanning electron microscope 60 . Next, the coordinates (x3, y3) of the marker 52 of the sample holder 50 are obtained by reading the coordinates of the sample stage.

次に、取得したマーカー５２の座標（ｘ３，ｙ３）と、工程Ｓ１８で記録されたマーカー５２の座標（Ｘ３，Ｙ３）とに基づいて、光学顕微鏡２０の座標系と走査電子顕微鏡６０の座標系との間の座標変換を行うための変換式を求める。 Next, based on the acquired coordinates (x3, y3) of the marker 52 and the coordinates (X3, Y3) of the marker 52 recorded in step S18, the coordinate system of the optical microscope 20 and the coordinate system of the scanning electron microscope 60 are A conversion formula for performing coordinate conversion between and is obtained.

次に、求めた変換式と、工程Ｓ１８で記録した光顕観察位置の座標（Ｘ１´，Ｙ１´）と、を用いて、走査電子顕微鏡６０の座標系（試料ステージ６２上）における光顕観察位置の座標（ｘ１，ｙ１）を求める。そして、求めた座標（ｘ１，ｙ１）に試料ステージ６２を移動させる。これにより、光顕観察位置を、走査電子顕微鏡６０で観察することができる。 Next, using the obtained conversion formula and the coordinates (X1', Y1') of the optical microscope observation position recorded in step S18, the optical microscope observation position in the coordinate system (on the sample stage 62) of the scanning electron microscope 60 is calculated. Find the coordinates (x1, y1). Then, the sample stage 62 is moved to the determined coordinates (x1, y1). Thereby, the optical microscope observation position can be observed with the scanning electron microscope 60 .

上記のように、樹脂ブロック４０を研磨することによって細胞２の内部が樹脂ブロック４０の表面に露出している。そのため、走査電子顕微鏡６０において、細胞２の内部の構造を観察できる。したがって、本実施形態によれば、蛍光観察により観察した細胞２の内部の現象と、走査電子顕微鏡６０で観察した細胞２の内部の構造と、を比較することができる。 As described above, the inside of the cell 2 is exposed on the surface of the resin block 40 by polishing the resin block 40 . Therefore, in the scanning electron microscope 60, the internal structure of the cell 2 can be observed. Therefore, according to this embodiment, the phenomenon inside the cell 2 observed by fluorescence observation and the structure inside the cell 2 observed by the scanning electron microscope 60 can be compared.

以上の工程により、光学顕微鏡２０および走査電子顕微鏡６０の両方で、同一箇所を観察することができる。 Through the above steps, the same point can be observed with both the optical microscope 20 and the scanning electron microscope 60 .

本実施形態に係る観察方法は、例えば、以下の特徴を有する。 The observation method according to this embodiment has, for example, the following features.

本実施形態に係る観察方法は、マーカー１２を有する培養容器１０上で、光学顕微鏡２０を用いて、試料を観察する工程と、光学顕微鏡２０で観察した位置とマーカー１２の位置との位置関係を求める工程と、培養容器１０上で試料を樹脂包埋することによって、試料が包埋され、かつ、マーカー１２の痕４２が形成された樹脂ブロック４０を形成する工程と、樹脂ブロック４０を、マーカー５２を有する試料ホルダー５０に取り付ける工程と、光学顕微鏡で観察した位置とマーカー１２の位置との位置関係に基づいて、マーカー５２の位置と光学顕微鏡で観察した位置との位置関係を求める工程と、を含む。 The observation method according to the present embodiment includes a step of observing a sample using an optical microscope 20 on a culture container 10 having a marker 12, and determining the positional relationship between the position observed with the optical microscope 20 and the position of the marker 12. a step of embedding the sample in resin on the culture vessel 10 to form a resin block 40 in which the sample is embedded and a mark 42 of the marker 12 is formed; 52, determining the positional relationship between the position of the marker 52 and the position observed with the optical microscope based on the positional relationship between the position observed with the optical microscope and the position of the marker 12; including.

さらに、本実施形態に係る観察方法では、試料ホルダー５０を、走査電子顕微鏡６０の試料ステージ６２に取り付ける工程と、マーカー５２の位置と光学顕微鏡２０で観察した位置との位置関係に基づいて、試料ステージ６２上におけるマーカー５２の位置から、試料ステージ６２上における光学顕微鏡２０で観察した位置を求める工程と、光学顕微鏡２０で観察した位置を走査電子顕微鏡６０で観察する工程と、を含む。 Furthermore, in the observation method according to the present embodiment, the sample holder 50 is attached to the sample stage 62 of the scanning electron microscope 60, and based on the positional relationship between the position of the marker 52 and the position observed with the optical microscope 20, the sample A step of obtaining the position observed by the optical microscope 20 on the sample stage 62 from the position of the marker 52 on the stage 62 and a step of observing the position observed by the optical microscope 20 by the scanning electron microscope 60 are included.

このように、本実施形態に係る観察方法では、マーカー５２の位置と光学顕微鏡２０で観察した位置との位置関係を求めることができるため、容易に、光学顕微鏡２０および走査電子顕微鏡６０の両方で、試料の同一箇所を観察することができる。 Thus, in the observation method according to the present embodiment, the positional relationship between the position of the marker 52 and the position observed with the optical microscope 20 can be obtained. , the same part of the sample can be observed.

本実施形態に係る観察方法は、試料ホルダー５０に取り付けられた樹脂ブロック４０を研磨する工程を含む。本実施形態に係る観察方法では、マーカー５２の位置と光学顕微鏡２０で観察した位置との位置関係を求めることができるため、研磨により樹脂ブロック４０に形成されたマーカー１２の痕４２が消えても、光学顕微鏡２０で観察した位置を特定できる。 The observation method according to this embodiment includes a step of polishing the resin block 40 attached to the sample holder 50 . In the observation method according to the present embodiment, the positional relationship between the position of the marker 52 and the position observed by the optical microscope 20 can be determined. , the position observed by the optical microscope 20 can be identified.

さらに、本実施形態に係る観察方法では、研磨によって試料の断面加工が可能であるため、例えば、ダイヤモンドナイフによる切片作製等と比べて、樹脂ブロック４０の広い範囲を観察可能である。さらに、例えば、ダイヤモンドナイフで切片を作製する場合、樹脂ブロックをトリミングする必要があるが、トリミングの作業は熟練が必要であり、長時間の作業が必要となる。これに対して、研磨による断面加工は、容易であり、短時間で加工ができる。 Furthermore, in the observation method according to the present embodiment, the cross-section of the sample can be processed by polishing, so that a wider range of the resin block 40 can be observed than, for example, preparation of a slice using a diamond knife. Furthermore, for example, when producing a section with a diamond knife, it is necessary to trim the resin block, but the trimming work requires skill and requires a long time. On the other hand, cross-sectional processing by polishing is easy and can be processed in a short time.

本実施形態に係る観察方法では、マーカー１２は、培養容器１０上に形成された金属膜である。そのため、樹脂ブロック４０の引きはがしが容易である。例えば、マーカーとして、培養容器１０に溝を形成した場合、溝に樹脂が入り込むため、樹脂ブロック４０を引きはがし難い。また、例えば、マーカー１２を疎に形成することによって、より容易に樹脂ブロック４０を引きはがすことができる。 In the observation method according to this embodiment, the marker 12 is a metal film formed on the culture container 10 . Therefore, the resin block 40 can be easily peeled off. For example, when a groove is formed in the culture container 10 as a marker, the resin block 40 is difficult to peel off because the resin enters the groove. Further, for example, by forming the markers 12 sparsely, the resin block 40 can be peeled off more easily.

２． 変形例
なお、本発明は上述した実施形態に限定されず、本発明の要旨の範囲内で種々の変形実施が可能である。 2. Modifications The present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications can be made within the scope of the gist of the present invention.

２．１． 第１変形例
例えば、工程Ｓ１２において、光顕観察位置とＡ１マーカー１２の位置との位置関係を求めたにも関わらず、樹脂ブロック４０に傷が入るなどして、Ａ１マーカー１２の痕４２の位置の特定が困難になる場合がある。このような場合には、Ａ１マーカー１２以外の他のマーカー１２の痕４２の座標からＡ１マーカー１２の座標を推測することができる。 2.1. First Modification For example, in step S12, although the positional relationship between the optical microscope observation position and the position of the A1 marker 12 is determined, the resin block 40 may be scratched and the position of the trace 42 of the A1 marker 12 may be changed. can be difficult to identify. In such a case, the coordinates of the A1 marker 12 can be estimated from the coordinates of the marks 42 of the markers 12 other than the A1 marker 12 .

第１変形例では、マーカー１２の位置と光顕観察位置との位置関係を求める工程では、Ａ１マーカー１２以外の他のマーカー１２の位置からＡ１マーカー１２の位置を求め、Ａ１マーカー１２と光顕観察位置との位置関係を求める。そのため、第１変形例では、容易に、光学顕微鏡２０および走査電子顕微鏡６０の両方で、試料の同一箇所を観察することができる。 In the first modification, in the step of obtaining the positional relationship between the position of the marker 12 and the optical microscope observation position, the position of the A1 marker 12 is obtained from the positions of the markers 12 other than the A1 marker 12, and the A1 marker 12 and the optical microscope observation position are obtained. Find the positional relationship with Therefore, in the first modified example, the same portion of the sample can be easily observed with both the optical microscope 20 and the scanning electron microscope 60 .

２．２． 第２変形例
上記の実施形態では、樹脂ブロック４０の研磨の後に、走査電子顕微鏡観察を行ったが、樹脂ブロック４０の研磨と走査電子顕微鏡観察を繰り返してもよい。これにより、細胞２の深さ方向の情報を取得することができる。また、例えば、細胞２の３次元再構築像を得ることができる。 2.2. Second Modification In the above-described embodiment, the scanning electron microscope observation is performed after polishing the resin block 40, but the polishing of the resin block 40 and the scanning electron microscope observation may be repeated. Thereby, the information of the depth direction of the cell 2 can be acquired. Also, for example, a three-dimensional reconstructed image of the cell 2 can be obtained.

２．３． 第３変形例
なお、上記の実施形態では、光学顕微鏡２０と走査電子顕微鏡６０で同一箇所を観察する場合について説明したが、光学顕微鏡２０とその他の観察装置で同一箇所を観察する場合にも適用可能である。 2.3. Third Modification In the above embodiment, the case of observing the same point with the optical microscope 20 and the scanning electron microscope 60 has been described. It is possible.

本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。 The present invention includes configurations that are substantially the same as the configurations described in the embodiments (for example, configurations that have the same function, method, and result, or configurations that have the same purpose and effect). Moreover, the present invention includes configurations obtained by replacing non-essential portions of the configurations described in the embodiments. In addition, the present invention includes a configuration that achieves the same effects or achieves the same purpose as the configurations described in the embodiments. In addition, the present invention includes configurations obtained by adding known techniques to the configurations described in the embodiments.

２…細胞、４…樹脂、６…研磨装置、１０…培養容器、１２…マーカー、２０…光学顕微鏡、３０…包埋用容器、４０…樹脂ブロック、４２…痕、５０…試料ホルダー、５２…マーカー、６０…走査電子顕微鏡、６２…試料ステージ DESCRIPTION OF SYMBOLS 2... Cell 4... Resin 6... Polishing device 10... Culture container 12... Marker 20... Optical microscope 30... Embedding container 40... Resin block 42... Trace 50... Sample holder 52... Marker, 60... Scanning electron microscope, 62... Sample stage

Claims (5)

第１マーカーを有する容器上で、光学顕微鏡を用いて、試料を観察する工程と、
前記光学顕微鏡で観察した位置と前記第１マーカーの位置との位置関係を求める工程と、
前記容器上で前記試料を樹脂包埋することによって、前記試料が包埋され、かつ、前記第１マーカーの痕が形成された樹脂ブロックを形成する工程と、
前記樹脂ブロックを、第２マーカーを有する試料ホルダーに取り付ける工程と、
前記光学顕微鏡で観察した位置と前記第１マーカーの位置との位置関係と、前記第１マーカーの痕の位置とに基づいて、前記樹脂ブロックが前記試料ホルダーに取り付けられた状態における前記光学顕微鏡で観察した位置を算出し、前記第２マーカーの位置と算出した前記光学顕微鏡で観察した位置との位置関係を求める工程と、
前記第２マーカーの位置と算出した前記光学顕微鏡で観察した位置との位置関係を求める工程の後に、前記試料ホルダーに取り付けられた前記樹脂ブロックを研磨する工程と、
前記試料ホルダーを、走査電子顕微鏡の試料ステージに取り付ける工程と、
前記第２マーカーの位置と算出した前記光学顕微鏡で観察した位置との位置関係と、前記試料ステージ上における前記第２マーカーの位置に基づいて、前記試料ステージ上における前記光学顕微鏡で観察した位置を求める工程と、
前記試料ステージ上における前記光学顕微鏡で観察した位置を、前記走査電子顕微鏡で観察する工程と、
を含む、観察方法。 Observing the sample using an optical microscope on the container having the first marker;
obtaining a positional relationship between the position observed with the optical microscope and the position of the first marker;
forming a resin block in which the sample is embedded and in which the trace of the first marker is formed by embedding the sample in a resin on the container;
attaching the resin block to a sample holder having a second marker;
Based on the positional relationship between the position observed with the optical microscope and the position of the first marker, and the position of the trace of the first marker , the optical microscope in the state where the resin block is attached to the sample holder a step of calculating the observed position and determining the positional relationship between the position of the second marker and the calculated position observed with the optical microscope;
After the step of determining the positional relationship between the position of the second marker and the calculated position observed with the optical microscope, polishing the resin block attached to the sample holder;
attaching the sample holder to a sample stage of a scanning electron microscope;
A position observed by the optical microscope on the sample stage based on the positional relationship between the position of the second marker and the calculated position observed by the optical microscope , and the position of the second marker on the sample stage. and
a step of observing, with the scanning electron microscope, the position observed with the optical microscope on the sample stage ;
method of observation, including 請求項１において、
前記研磨は、イオンによる研磨、または機械研磨である、観察方法。 In claim 1 ,
The observation method, wherein the polishing is ion polishing or mechanical polishing. 請求項１または２において、
前記第１マーカーは、同心円、または同心多角形である、観察方法。 In claim 1 or 2 ,
The observation method, wherein the first markers are concentric circles or concentric polygons. 請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記第１マーカーは、前記容器上に形成された金属膜である、観察方法。 In any one of claims 1 to 3 ,
The observation method, wherein the first marker is a metal film formed on the container. 請求項１ないし４のいずれか１項において、
前記容器は、他の第１マーカーを有し、
前記第２マーカーの位置と算出した前記光学顕微鏡で観察した位置との位置関係を求める工程では、前記第１マーカーの痕の位置が特定できなかった場合に、前記他の第１マーカーの痕の位置から前記第１マーカーの痕の位置を求める、観察方法。 In any one of claims 1 to 4 ,
the container has another first marker;
In the step of determining the positional relationship between the position of the second marker and the calculated position observed with the optical microscope, if the position of the trace of the first marker cannot be specified, the trace of the other first marker is determined. An observation method , wherein the position of the trace of the first marker is obtained from the position .
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