JP7228199B2 - Compositions for gels, gels, precast gels. - Google Patents
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Description
本発明は、（メタ）アクリルアミド系モノマーと特定の架橋剤を含むゲル用組成物、上記組成物から得られるゲル、上記ゲルからなるプレキャストゲルに関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a gel composition containing a (meth)acrylamide-based monomer and a specific cross-linking agent, a gel obtained from the composition, and a precast gel comprising the gel.
ポリアクリルアミド電気泳動法（ＰＡＧＥ）は、酵素や蛋白質などの生体由来物質やこれらを人為的に合成した物質について、分子量や等電点の測定や同定、精製を行う際に多用される分析・実験手法である（非特許文献１）。ＰＡＧＥは、ゲル内部を荷電サンプル物質が移動する速度がサンプル物質の分子量や等電点に依存するという現象を用いており、サンプル物質は架橋ポリアクリルアミド分子鎖相互の網目構造内の間隙（いわゆるポア）を通過することによってゲル内を移動する。サンプル物質の移動速度は、分子量が同一ならば、ゲルの緩衝性、すなわちゲルに含まれる電解質や緩衝剤によって変動し、ＳＤＳが付加されたサンプル物質のＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、分子量によって変動する。また、ＰＡＧＥが普及するにしたがって、ＰＡＧＥの分解能や効率化、作業性向上が求められるようになっている。そこで、有利なＰＡＧＥのための材料や装置が提案されてきた（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。
Polyacrylamide electrophoresis (PAGE) is an analysis and experiment that is often used when measuring, identifying, and purifying molecular weights and isoelectric points of bio-derived substances such as enzymes and proteins, as well as artificially synthesized substances. method (Non-Patent Document 1). PAGE uses the phenomenon that the speed at which a charged sample substance moves inside a gel depends on the molecular weight and isoelectric point of the sample substance. ) through the gel. If the molecular weight is the same, the migration speed of the sample substance varies depending on the buffering property of the gel, that is, the electrolyte and buffer contained in the gel. In addition, as PAGE becomes more popular, there is a demand for improved resolution, efficiency, and workability of PAGE. Therefore, materials and apparatus for advantageous PAGE have been proposed (
その一方で、ＰＡＧＥ自体の問題点も指摘されている。ポリアクリルアミドゲルは、特に大きな分子量、例えば分子量が１００ｋＤａ以上の物質に対する分離能は低い。これは、ゲル内に存在する、架橋ポリアクリルアミド分子鎖相互の間隙の三次元的な大きさ（架橋ポリアクリルアミド分子鎖でできた網目の大きさ。いわゆるポアサイズ）が比較的小型であることに起因すると考えられる。アクリルアミドの濃度を低くしてポアサイズの拡大を試みても、高分子量のサンプル物質に対するポリアクリルアミドゲルの分離能はそれほど変化しない（非特許文献２）。主に核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の分離に用いられているアガロースゲルの場合には、ポアサイズが大きすぎて高分子量の蛋白質の分離には適さない。アクリルアミドの架橋度を上げてポアサイズを小さくすると、ゲルの透明性と形状安定性、保水性が損なわれ、電気泳動ゲルとして機能しなくなる（非特許文献３）。 On the other hand, problems with PAGE itself have also been pointed out. Polyacrylamide gels have a poor resolution, particularly for substances with large molecular weights, eg molecular weights of 100 kDa or more. This is because the three-dimensional size of the interstices between crosslinked polyacrylamide molecular chains in the gel (the size of the network made of crosslinked polyacrylamide molecular chains, so-called pore size) is relatively small. It is thought that Attempting to increase the pore size by lowering the acrylamide concentration does not significantly change the separation ability of polyacrylamide gels for high molecular weight sample substances (Non-Patent Document 2). Agarose gels, which are mainly used for separating nucleic acids (DNA, RNA), have too large pore sizes and are not suitable for separating high-molecular-weight proteins. When the degree of cross-linking of acrylamide is increased to reduce the pore size, the transparency, shape stability, and water retention of the gel are impaired, and the gel ceases to function as an electrophoresis gel (Non-Patent Document 3).
これまでに、ポリアクリルアミド自体の立体的構造を改変する様々な試みがなされている。これらの中で、ポリアクリルアミドゲルの架橋剤として最も多用されているＮ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）に替えて他の架橋剤でポリアクリルアミドを架橋した例としては、２－アクリルエチルメタクリルアミドを用いる例（特許文献５）、２－アクリルエチルメタクリルアミドなどの非対称型のアクリルアミド誘導体を用いる例（特許文献６）、ペンタメチレンビスアクリルアミドを用いる例（特許文献７）などが知られている。しかしながら、高分子量の物質に対しても高い分離能を示し、かつ、保存安定性や機械的強度、取扱性に優れる電気泳動ゲルを与えることのできる、ポリアクリルアミドを主体とするゲル材料は、未だ得られていない。 Various attempts have been made so far to modify the three-dimensional structure of polyacrylamide itself. Among these, 2-acrylethyl methacryl is an example of cross-linking polyacrylamide with another cross-linking agent instead of N,N'-methylenebisacrylamide (BIS), which is most frequently used as a cross-linking agent for polyacrylamide gels. An example using an amide (Patent Document 5), an example using an asymmetric acrylamide derivative such as 2-acrylethyl methacrylamide (Patent Document 6), an example using pentamethylenebisacrylamide (Patent Document 7), and the like are known. . However, there is still no gel material mainly composed of polyacrylamide, which exhibits high separation ability even for high-molecular-weight substances and can provide an electrophoresis gel excellent in storage stability, mechanical strength, and handleability. not obtained.
本発明者は、これまでに見出されていない、より機能性に優れるＰＡＧＥを可能とするゲル材料を求めた。すなわち、本発明者は、高分子量の物質に対しても高い分離能を示し、かつ、保存安定性や機械的強度、取扱性に優れる電気泳動ゲルを与えることのできる、ポリアクリルアミドを主体とするゲル材料の設計を試みた。 The present inventor sought a gel material that enables PAGE with superior functionality, which has not been found so far. That is, the present inventors have found that polyacrylamide, which exhibits high separation ability even for high-molecular-weight substances and can provide electrophoresis gels with excellent storage stability, mechanical strength, and handleability, is mainly composed of polyacrylamide. An attempt was made to design a gel material.
その結果、（メタ）アクリルアミド系モノマーを特定の架橋剤の存在下で重合して得られる架橋ポリ（メタ）アクリルアミドを含むゲルが、高分子量化合物に対する分離能、機械的強度、取扱性のいずれもが優れるＰＡＧＥ用ゲルとして有効であることを見出した。すなわち本発明は以下のものである。 As a result, a gel containing crosslinked poly(meth)acrylamide obtained by polymerizing a (meth)acrylamide-based monomer in the presence of a specific crosslinking agent was found to have excellent separation ability, mechanical strength, and handleability for high-molecular-weight compounds. was found to be effective as an excellent PAGE gel. That is, the present invention is as follows.
（発明１）置換基を有するか又は有さない（メタ）アクリルアミドから選ばれる少なくとも１種以上の（メタ）アクリルアミド系モノマーと、以下の式（１）で表される分子量が１８２以上１５００以下の架橋剤を含む、ゲル用組成物。 (Invention 1) At least one (meth)acrylamide-based monomer selected from (meth)acrylamides having or not having substituents, and a A gel composition comprising a cross-linking agent.
（Ｂは炭素数が１以上４以下の直鎖または分岐アルキレン基を表す。Ｒ１及びＲ２は水素原子（Ｈ）またはメチル基（ＣＨ３）を表す。ｌ，ｍ，ｎはそれぞれ１，２，３から選ばれ、ｌ，ｍ，ｎは互いに異なっていてもよく、ｌ，ｍ，ｎのうちの２つが同一でもよく、ｌ，ｍ，ｎの全てが同一でもよく、１≦ｌ＋ｍ＋ｎである。ｐ，ｑ，ｒは０≦ｐ，０≦ｑ，０≦ｒ，０≦ｐ＋ｑ＋ｒである。）
（発明２）上記架橋剤が以下の化合物ＣＬ－１及び／又はＣＬ－２から選ばれる少なくとも１以上である、発明１のゲル用組成物。
(B represents a linear or branched alkylene group having 1 to 4 carbon atoms; R1 and R2 represent a hydrogen atom (H) or a methyl group ( CH3 ); 3, l, m, n may be different from each other, two of l, m, n may be the same, all of l, m, n may be the same, and 1≤l+m+n. p, q, r are 0≤p, 0≤q, 0≤r, 0≤p+q+r.)
(Invention 2) The gel composition of
（発明３）置換基を有するか又は有さない（メタ）アクリルアミドから選ばれる少なくとも１種以上の（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する繰り返し単位と、以下の式（１）で表される分子量が１８２以上１５００以下の架橋剤に由来する単位とを有する、架橋（メタ）アクリルアミドを含む、ゲル。 (Invention 3) A repeating unit derived from at least one (meth)acrylamide-based monomer selected from (meth)acrylamides having or not having a substituent and a molecular weight represented by the following formula (1) A gel comprising crosslinked (meth)acrylamide having 182 or more and 1500 or less units derived from a crosslinking agent.
（Ｂは炭素数が１以上４以下の直鎖または分岐アルキレン基を表す。Ｒ１及びＲ２は水素原子（Ｈ）またはメチル基（ＣＨ３）を表す。ｌ，ｍ，ｎはそれぞれ１，２，３から選ばれ、ｌ，ｍ，ｎは互いに異なっていてもよく、ｌ，ｍ，ｎのうちの２つが同一でもよく、ｌ，ｍ，ｎの全てが同一でもよく、１≦ｌ＋ｍ＋ｎである。ｐ，ｑ，ｒは０≦ｐ，０≦ｑ，０≦ｒ，０≦ｐ＋ｑ＋ｒである。）
（発明４）上記架橋剤が以下の化合物ＣＬ－１及び／又はＣＬ－２から選ばれる少なくとも１以上である、発明３のゲル。
(B represents a linear or branched alkylene group having 1 to 4 carbon atoms; R1 and R2 represent a hydrogen atom (H) or a methyl group ( CH3 ); 3, l, m, n may be different from each other, two of l, m, n may be the same, all of l, m, n may be the same, and 1≤l+m+n. p, q, r are 0≤p, 0≤q, 0≤r, 0≤p+q+r.)
(Invention 4) The gel of
（発明５）置換基を有するか又は有さない（メタ）アクリルアミドから選ばれる少なくとも１種以上の（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する繰り返し単位と、以下の式（１）で表される分子量が１８２以上１５００以下の架橋剤に由来する単位とを有する、架橋（メタ）アクリルアミドを含む、ゲル からなるプレキャストゲル。 (Invention 5) A repeating unit derived from at least one (meth)acrylamide-based monomer selected from (meth)acrylamides having or not having a substituent and a molecular weight represented by the following formula (1) A precast gel comprising a crosslinked (meth)acrylamide having 182 or more and 1500 or less units derived from a crosslinking agent.
（Ｂは炭素数が１以上４以下の直鎖または分岐アルキレン基を表す。Ｒ１及びＲ２は水素原子（Ｈ）またはメチル基（ＣＨ３）を表す。ｌ，ｍ，ｎはそれぞれ１，２，３から選ばれ、ｌ，ｍ，ｎは互いに異なっていてもよく、ｌ，ｍ，ｎのうちの２つが同一でもよく、ｌ，ｍ，ｎの全てが同一でもよく、１≦ｌ＋ｍ＋ｎである。ｐ，ｑ，ｒは０≦ｐ，０≦ｑ，０≦ｒ，０≦ｐ＋ｑ＋ｒである。）
（発明６）上記架橋剤が以下の化合物ＣＬ－１及び／又はＣＬ－２から選ばれる少なくとも１以上である、請求項５に記載のプレキャストゲル。
(B represents a linear or branched alkylene group having 1 to 4 carbon atoms; R1 and R2 represent a hydrogen atom (H) or a methyl group ( CH3 ); 3, l, m, n may be different from each other, two of l, m, n may be the same, all of l, m, n may be the same, and 1≤l+m+n. p, q, r are 0≤p, 0≤q, 0≤r, 0≤p+q+r.)
(Invention 6) The precast gel according to Claim 5, wherein the cross-linking agent is at least one selected from the following compounds CL-1 and/or CL-2.
本発明のゲル用組成物を用いて製造された架橋（メタ）アクリルアミドを含む電気泳動ゲルは、高分子量化合物に対する分離能、機械的強度、取扱性のいずれもが優れる。 An electrophoretic gel containing crosslinked (meth)acrylamide produced using the gel composition of the present invention is excellent in all of separation performance, mechanical strength and handleability for high-molecular-weight compounds.
［ゲル用組成物］ 本発明のゲル用組成物は、（メタ）アクリルアミド系モノマーと、特定の架橋剤を含む。 [Gel composition] The gel composition of the present invention contains a (meth)acrylamide-based monomer and a specific cross-linking agent.
［（メタ）アクリルアミド系モノマー］ 本発明において「（メタ）アクリルアミド」はメタアクリルアミド（メタクリルアミド）とアクリルアミドとの両方を意味する。上記（メタ）アクリルアミド系モノマーは、置換基を有する（メタ）アクリルアミドと置換基を有さない（メタ）アクリルアミドの両方を意味する。このような（メタ）アクリルアミド系モノマーとしては、（メタ）アクリルアミド、Ｎ－メチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－エチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ′－ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ′－ジエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－（ヒドロキシメチル）（メタ）アクリルアミド、ジアセトン（メタ）アクリルアミド、Ｎ′－アクリロイルアミノプロパノール等を使用することができる。本発明で用いる（メタ）アクリルアミド系モノマーは、上記（メタ）アクリルアミド類から選ばれる１種以上を用いることができる。上記（メタ）アクリルアミド系モノマーとして好ましい化合物はアクリルアミドである。本発明では、好ましくは、アクリルアミドを主成分とする（メタ）アクリルアミド系モノマーを用いる。この場合、上記（メタ）アクリルアミド系モノマーを、その総量に対して７０重量％以上、好ましくは８０重量％以上、さらに好ましくは９０重量％以上のアクリルアミドと、残余の割合のアクリルアミド以外の（メタ）アクリルアミド類で構成する。本発明では、さらに好ましくは、アクリルアミドからなる（メタ）アクリルアミド系モノマーを使用する。 [(Meth)acrylamide Monomer] In the present invention, “(meth)acrylamide” means both methacrylamide (methacrylamide) and acrylamide. The above (meth)acrylamide-based monomer means both (meth)acrylamide having a substituent and (meth)acrylamide having no substituent. Such (meth)acrylamide-based monomers include (meth)acrylamide, N-methyl(meth)acrylamide, N-ethyl(meth)acrylamide, N-isopropyl(meth)acrylamide, N,N′-dimethyl(meth) Acrylamide, N,N'-diethyl(meth)acrylamide, N-(hydroxymethyl)(meth)acrylamide, diacetone(meth)acrylamide, N'-acryloylaminopropanol and the like can be used. As the (meth)acrylamide-based monomer used in the present invention, one or more selected from the above (meth)acrylamides can be used. A preferred compound for the (meth)acrylamide-based monomer is acrylamide. In the present invention, a (meth)acrylamide-based monomer containing acrylamide as a main component is preferably used. In this case, 70% by weight or more, preferably 80% by weight or more, more preferably 90% by weight or more of the (meth)acrylamide-based monomer based on the total amount of the acrylamide, and the remainder of the (meth)acrylamide-based monomer other than acrylamide Composed of acrylamides. In the present invention, more preferably, a (meth)acrylamide-based monomer composed of acrylamide is used.
［架橋剤］ 上記架橋剤は、以下の式（１）で表され、１８２以上１５００以下、好ましくは２００以上１０００以下、さらに好ましくは２００以上７００以下の分子量を有する。 [Crosslinking agent] The above crosslinking agent is represented by the following formula (1) and has a molecular weight of 182 to 1,500, preferably 200 to 1,000, more preferably 200 to 700.
式（１），（２）における基：Ｂ，Ｒ１，Ｒ２と数：ｌ，ｍ，ｎ，ｐ，ｑ，ｒは以下のように定義される。Ｂは炭素数が１以上４以下の直鎖または分岐アルキレン基を表す。Ｒ１及びＲ２は水素原子（Ｈ）またはメチル基（ＣＨ３）を表す。ｌ，ｍ，ｎはそれぞれ１，２，３から選ばれ、ｌ，ｍ，ｎは互いに異なっていてもよく、ｌ，ｍ，ｎのうちの２つが同一でもよく、ｌ，ｍ，ｎの全てが同一でもよく、１≦ｌ＋ｍ＋ｎである。ｐ，ｑ，ｒは０≦ｐ，０≦ｑ，０≦ｒ，０≦ｐ＋ｑ＋ｒである。好ましいｐ，ｑ，ｒは０≦ｐ，０≦ｑ，０≦ｒであって、さらに１≦ｐ＋ｑ＋ｒである。
上記基Ａは、好ましくは以下の式（３－１），（３－２），（３ー３）で表される。
Groups: B, R1, R2 and numbers: l, m, n, p, q, r in formulas (1) and (2) are defined as follows. B represents a linear or branched alkylene group having 1 to 4 carbon atoms. R1 and R2 represent a hydrogen atom (H) or a methyl group ( CH3 ). l, m and n are each selected from 1, 2 and 3, l, m and n may be different from each other, two of l, m and n may be the same, all of l, m and n may be the same, and 1≤l+m+n. p, q, r are 0≤p, 0≤q, 0≤r, 0≤p+q+r. Preferred p, q, r are 0≤p, 0≤q, 0≤r, and further 1≤p+q+r.
The group A is preferably represented by the following formulas (3-1), (3-2) and (3-3).
式（３－１），（３－２），（３－３）中の基Ｂの定義は上述の通りである。式（３－１），（３－２），（３－３）で、繰り返し数ｓは、０≦ｓであり、式（３－１），（３－２），（３－３）で表される基Ａを有する上記架橋剤の分子量が１８２以上１５００以下、好ましくは２００以上１０００以下、さらに好ましくは２００以上７００以下の分子量を有するような値であれば、制限されない。本発明で用いる架橋剤として、以下の化合物：ＣＬ－１、ＣＬ－２が最も好ましい。
The definition of group B in formulas (3-1), (3-2) and (3-3) is as described above. In formulas (3-1), (3-2) and (3-3), the repetition number s is 0 ≤ s, and in formulas (3-1), (3-2) and (3-3) There is no limitation as long as the molecular weight of the cross-linking agent having the represented group A is 182 or more and 1500 or less, preferably 200 or more and 1000 or less, more preferably 200 or more and 700 or less. As the cross-linking agent used in the present invention, the following compounds: CL-1, CL-2 are most preferred.
本発明では、上記架橋剤の２種以上を併用することができる。本発明のゲル組成物には、上記架橋剤に加えて例えばＢＩＳのような公知の架橋剤を追加することもできる。また、本発明のゲル用組成物の性能を損なわない限り、ゲルに通常用いられる添加剤を制限なく配合することができる。例えば、ゲルの強度や弾力性を調節するために、アガロースなどの増粘多糖類、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリメチルビニルエーテルなどの水溶性ポリマーを添加することができる。 In the present invention, two or more of the above crosslinking agents can be used in combination. A known cross-linking agent such as BIS may be added to the gel composition of the present invention in addition to the cross-linking agent described above. Additives commonly used in gels can be added without limitation as long as they do not impair the performance of the gel composition of the present invention. For example, thickening polysaccharides such as agarose, water-soluble polymers such as polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, and polymethyl vinyl ether can be added to adjust the strength and elasticity of the gel.
本発明のゲル用組成物において、上記（メタ）アクリルアミド系モノマーと上記架橋剤との合計に対する上記架橋剤の割合は、通常１重量％以上３０重量％以下、好ましくは２重量％以上２５重量％以下、さらに好ましくは３重量％以上２０重量％以下とする。 In the gel composition of the present invention, the ratio of the cross-linking agent to the sum of the (meth)acrylamide-based monomer and the cross-linking agent is usually 1% by weight or more and 30% by weight or less, preferably 2% by weight or more and 25% by weight. Below, it is more preferably 3% by weight or more and 20% by weight or less.
本発明のゲル用組成物は、ゲル作製を容易にするために、高濃度の水溶液の形態をとることができる。このような水溶液状のゲル用組成物は一般に「ストック溶液」と呼ばれる。本発明のゲル用組成物をストック溶液として製造する場合には、（メタ）アクリルアミド系モノマーと上記架橋剤とを、これらの合計量がストック溶液の全量に対して、通常は１０重量％以上６０重量％以下、好ましくは１０重量％以上５０重量％以下、さらに好ましくは１０重量％以上４０重量％以下となるように、水に溶解する。この場合、本発明のゲル用組成物の一形態である上記ストック溶液は、ゲル製造直前に希釈される。ゲル製造直前の本発明のゲル組成物における（メタ）アクリルアミド系モノマーと上記架橋剤との合計量は、通常は１重量％以上４０重量％以下、好ましくは２重量％以上３０重量％以下、さらに好ましくは４重量％以上２５重量％以下の範囲にある。 The gel composition of the present invention can take the form of a highly concentrated aqueous solution to facilitate gel formation. Such aqueous gel compositions are commonly referred to as "stock solutions." When the gel composition of the present invention is produced as a stock solution, the total amount of the (meth)acrylamide-based monomer and the cross-linking agent is usually 10% by weight or more and 60% of the total amount of the stock solution. % by weight or less, preferably 10% by weight or more and 50% by weight or less, more preferably 10% by weight or more and 40% by weight or less. In this case, the stock solution, which is one form of the gel composition of the present invention, is diluted immediately before gel production. The total amount of the (meth)acrylamide-based monomer and the cross-linking agent in the gel composition of the present invention immediately before gel production is usually 1% by weight or more and 40% by weight or less, preferably 2% by weight or more and 30% by weight or less. It is preferably in the range of 4% by weight or more and 25% by weight or less.
本発明のゲル用組成物には、ゲル製造時に重合開始試薬を配合する。上記重合開始試薬としては、一般に重合開始剤，重合促進剤，触媒，ラジカル安定化剤などと呼ばれるゲル製造用試薬を制限なく使用することができる。典型的には、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）とＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）からなる重合開始剤が用いられる。リボフラビンなどの光重合開始剤を用いることもできる。上記重合開始試薬の濃度は常法に従う。 A polymerization initiation reagent is added to the composition for gel of the present invention at the time of gel production. As the polymerization initiation reagent, gel-producing reagents generally called polymerization initiators, polymerization accelerators, catalysts, radical stabilizers, etc. can be used without limitation. A polymerization initiator consisting of ammonium persulfate (APS) and N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) is typically used. Photoinitiators such as riboflavin can also be used. The concentration of the polymerization initiation reagent follows a conventional method.
さらに本発明のゲル用組成物には、ゲルの使用形態に応じて公知の添加剤、例えば、中性緩衝剤などを配合することができる。 Further, the composition for gel of the present invention can be blended with known additives such as neutral buffers depending on the form of use of the gel.
［架橋（メタ）アクリルアミドを含むゲル］本発明のゲルは、上記（メタ）アクリルアミド系モノマーを上記架橋剤と上記重合開始剤の存在下に水中で重合させて得られたものである。上記ゲルは、上記（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する繰り返し単位と、上記架橋剤に由来する単位とを有する、架橋（メタ）アクリルアミドを含み、上記架橋（メタ）アクリルアミドの分子鎖がマトリックスの水中に適度な間隙（ポア）を形成するように三次元の網のように分散している。 [Gel Containing Crosslinked (Meth)acrylamide] The gel of the present invention is obtained by polymerizing the above (meth)acrylamide monomer in water in the presence of the above crosslinking agent and the above polymerization initiator. The gel contains a crosslinked (meth)acrylamide having a repeating unit derived from the (meth)acrylamide-based monomer and a unit derived from the crosslinker, and the molecular chains of the crosslinked (meth)acrylamide are in a matrix of water. are distributed like a three-dimensional net so as to form moderate gaps (pores) in the
上記式（１），（２），（３－１），（３－２），（３－３）、化合物 （ＣＬ－１），（ＣＬ－２）が示すように、本発明で用いる架橋剤は末端基の構造が同一であって対称性が高く、親水性の鎖状構造：Ａを有する。このような構造によって、本発明のゲルでは（メタ）アクリルアミド分子鎖に架橋点が均一に生じ、上記架橋剤に由来する分子鎖が凝集することなく分布すると考えられる。すなわち、本発明のゲルでは、架橋（メタ）アクリルアミド分子鎖でできた目（ポアサイズ）の大きな網がゲル内に均一に分散していると考えられる。本発明のゲルのポアサイズは従来のアクリルアミドゲルに比べて大きくかつ均一で、高分子量物質に対する優れた分離能を発揮する。ゲルを構成する上記架橋（メタ）アクリルアミドの全体構造を一般式や標準化された指標で定義することは困難であるが、本発明のゲルは、これを構成する架橋（メタ）アクリルアミドの全体構造の点で、従来のゲルとは異なるものである。 As shown by the above formulas (1), (2), (3-1), (3-2), (3-3) and compounds (CL-1) and (CL-2), the crosslinked used in the present invention The agents have the same terminal group structure, high symmetry, and a hydrophilic chain structure: A. It is believed that due to such a structure, in the gel of the present invention, cross-linking points are uniformly generated in the (meth)acrylamide molecular chains, and the molecular chains derived from the cross-linking agent are distributed without aggregation. That is, it is considered that in the gel of the present invention, networks with large pores (pore sizes) made up of crosslinked (meth)acrylamide molecular chains are uniformly dispersed in the gel. The pore size of the gel of the present invention is larger and more uniform than that of conventional acrylamide gels, and exhibits excellent separation ability for high molecular weight substances. Although it is difficult to define the overall structure of the crosslinked (meth)acrylamide that constitutes the gel by a general formula or a standardized index, the gel of the present invention has the overall structure of the crosslinked (meth)acrylamide that constitutes the gel. This is different from conventional gels in that respect.
本発明のゲルは、特に高分子量の物質を対象としたＰＡＧＥに有効である。本発明のゲルは、公知の電気泳動（ＰＡＧＥ）に用いる装置に制限なく使用することができる。 The gel of the present invention is particularly effective for PAGE of high molecular weight substances. The gel of the present invention can be used without limitation in devices used for known electrophoresis (PAGE).
本発明のゲルとともに電気泳動槽に注入される緩衝液、ｐＨ調整剤、比重調整剤、界面活性剤は制限されない。これらは泳動させる物質や、泳動方法に応じて適宜選択される。例えば、ＤＮＡや蛋白質の混合物からなるサンプルから特定分子量画分を分離する場合には、アミン化合物や双性イオン化合物の組み合わせを含む緩衝液が使用される。この場合には界面活性剤やキレート化合物を添加してもよい。例えば、トリス－ほう酸－ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＢＥ）、トリス－リン酸－ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＰＥ）などのＰＡＧＥ用緩衝液を使用することができる。 The buffer solution, pH adjuster, specific gravity adjuster, and surfactant that are injected into the electrophoresis tank together with the gel of the present invention are not limited. These are appropriately selected according to the substance to be migrated and the migration method. For example, when separating a specific molecular weight fraction from a sample consisting of a mixture of DNA and proteins, a buffer containing a combination of amine compounds and zwitterion compounds is used. In this case, a surfactant or chelate compound may be added. For example, PAGE buffers such as Tris-borate-EDTA buffer (TBE) and Tris-phosphate-EDTA buffer (TPE) can be used.
［プレキャストゲル］ 本発明のゲルは、各種電気泳動装置に応じて予め成形されたプレキャストゲルとして使用することができる。本発明のプレキャストゲルの濃度や形状は、分離対象や分析目的、電気泳動装置の種類に応じて、様々に調整することができる。本発明のプレキャストゲルを量産タイプとすれば、各種電気泳動装置を用いた分離・分析精度の均一化、再現性の向上、作業コストの低減が期待できる。 [Precast Gel] The gel of the present invention can be used as a precast gel that is preformed according to various electrophoresis devices. The concentration and shape of the precast gel of the present invention can be variously adjusted according to the object to be separated, the purpose of analysis, and the type of electrophoresis apparatus. If the precast gel of the present invention is mass-produced, uniform separation/analysis accuracy, improved reproducibility, and reduced operating costs can be expected using various electrophoresis devices.
［材料・装置］ 以下の材料と装置、条件を用いた。＊は比較用の材料である。 [Materials/Apparatus] The following materials, apparatus, and conditions were used. * indicates materials for comparison.
（ゲル作成用材料）
・アクリルアミド
・架橋剤：ＣＬ－１（分子量３２８）（表１に示す化合物）
・架橋剤：ＣＬ－２（分子量２８２）（表１に示す化合物）
・架橋剤＊：ＢＩＳ（Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド，分子量１５４）（表１に示す化合物）
・中性ゲル緩衝液：アトー社製ＥｚＧｅｌＡｃｅ，ＷＳＥ－７３１０
・重合開始剤：０．０５％ＡＰＳ及び０．０５％ＴＥＭＥＤ
（電気泳動用薬剤、装置）
・ゲル作成用泳動プレートの厚み：１ｍｍ
・泳動用緩衝液：２５ｍＭトリス－１９２ｍＭグリシン－０．１％ＳＤＳ
・泳動装置：アトー社製 ラピダス・ミニスラブ電気泳動槽 ＡＥ－６５３０
・電気泳動用電源：アトー社製 ＰｏｗｅｒＳｔａｔｉｏｎ ＧｈｉｂｌｉＩ ＷＳＥ－３１００
・泳動条件：３００Ｖ定電圧、通電時間３５分
（分子量マーカー）
・アトー社製 ＥｚＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ ＷＳＥ－７０２０
・アトー社製 ＥｚＳｔａｎｄａｒｄ ＡＥ－１４４０
・Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 社製 ＨｉＭａｒｋＴＭ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ ＬＣ５６８８
・アトー社製 ＥｚＡｐｐｌｙ ＡＥ－１４３０ により調製したニワトリ筋抽出液
・ＨｅＬａ細胞抽出液
（染色剤）
・アトー社製 ＥｚＳｔａｉｎ ＡＱｕａ ＡＥ－１３４０
（ＤＮＡ泳動用）
・アトー社製ＤＮＡラダーマーカー ＥｚＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ ＷＳＥ－７０３０
・ＤＮＡ断片Φ１７４／ＨｉｎｃＩＩ
・ＤＮＡ断片λ／ＨｉｎｄＩＩＩ
・泳動用緩衝液：２５ｍＭトリス－１４４ｍＭグリシンバッファー
・泳動条件：２０ｍＡ定電流
・アトー社製 蛍光試薬ＥｚＦｌｕｏｒｏＳｔａｉｎ ＤＮＡ ＷＳＥ－７１３０
（等電点・二次元目泳動用）
・ＨｅＬａ細胞抽出液
・泳動装置：アトー社製 等電点電気泳動装置 ＤｉｓｃＲｕｎ Ａｃｅ ＷＳＥ－１５１０
・アトー社製 ５～２０％濃度勾配ゲル Ｅ－Ｄ５２０Ｌ
（染色剤）
・アトー社製 ＥｚＳｔａｉｎ ＡＱｕａ ＡＥ－１３４０
（泳動ゲル撮影装置）
・アトー社製 撮影装置ＬｕｍｉｎｏＧｒａｐｈＩＩＩ ＷＳＥ－６３００
(Material for making gel)
· Acrylamide · Cross-linking agent: CL-1 (molecular weight 328) (compound shown in Table 1)
· Cross-linking agent: CL-2 (molecular weight 282) (compound shown in Table 1)
· Cross-linking agent *: BIS (N,N'-methylenebisacrylamide, molecular weight 154) (compound shown in Table 1)
・ Neutral gel buffer: EzGelAce manufactured by Atto, WSE-7310
・Polymerization initiator: 0.05% APS and 0.05% TEMED
(Electrophoresis agent, device)
・Thickness of electrophoresis plate for gel preparation: 1 mm
・ Running buffer: 25 mM Tris-192 mM glycine-0.1% SDS
・Electrophoresis device: Rapidus mini slab electrophoresis tank AE-6530 manufactured by Atto
・ Electrophoresis power supply: PowerStation GhibliI WSE-3100 manufactured by Atto
・Electrophoresis conditions: 300 V constant voltage, 35 minutes of energizing time (molecular weight marker)
・Atto EzProteinLadder WSE-7020
・ EzStandard AE-1440 manufactured by Atto
・HiMark ™ Unstained Protein Standard LC5688 manufactured by Thermo Fisher Scientific
・ Chicken muscle extract prepared by Atto EzApply AE-1430 ・ HeLa cell extract (staining agent)
・Atto EzStain AQua AE-1340
(for DNA electrophoresis)
・ DNA ladder marker EzDNA Ladder WSE-7030 manufactured by Atto
・DNA fragment Φ174/HincII
・DNA fragment λ/HindIII
- Electrophoresis buffer: 25 mM Tris-144 mM glycine buffer - Electrophoresis conditions: 20 mA constant current - Fluorescent reagent EzFluoroStain DNA WSE-7130 manufactured by ATTO
(For isoelectric point and second dimension electrophoresis)
・HeLa cell extract ・Electrophoresis device: Isoelectric focusing device DiscRun Ace WSE-1510 manufactured by Atto
・ 5-20% concentration gradient gel E-D520L manufactured by Atto
(dyeing agent)
・Atto EzStain AQua AE-1340
(Migration gel imager)
・ Photographic device LuminoGraphIII WSE-6300 manufactured by Atto
［相対移動度Ｒｆ（％）］ 電気泳動後のゲルのスキャナー画像をアトー社製ＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ で解析した。相対移動度Ｒｆ（％）を以下の式で求めた。
Ｒｆ（％）＝（ゲル上端から各バンドまでの距離）÷（ゲル上端から泳動先端までの距離）×１００
［ゲル用組成物（ストック溶液）の製造］ 上記材料を表２に示すように配合し、ストック溶液としてゲル用組成物（ストック溶液）を製造した。表２に示す、本発明のゲル用組成物（ストック溶液）（実施例１～４）と比較用のゲル用組成物（ストック溶液）（比較例１，２）が得られた。表２で、「濃度Ｔｓ」は、ストック溶液全量に対するモノマーと架橋剤との合計量の割合を示す。表２で、「濃度Ｃ」は、モノマーと架橋剤との合計量に対する架橋剤の割合を示す。表２で、「Ｍ／ＣＬ（モル比）」はストック溶液に含まれるモノマーと架橋剤の量比（モノマーのモル数÷架橋剤のモル数）を表す。
[Relative Mobility Rf (%)] A scanner image of the gel after electrophoresis was analyzed using ATTO's CS Analyzer. A relative mobility Rf (%) was obtained by the following formula.
Rf (%) = (distance from top of gel to each band)/(distance from top of gel to tip of electrophoresis) x 100
[Production of gel composition (stock solution)] The above materials were blended as shown in Table 2 to produce a gel composition (stock solution) as a stock solution. The gel compositions (stock solutions) of the present invention (Examples 1 to 4) and comparative gel compositions (stock solutions) (Comparative Examples 1 and 2) shown in Table 2 were obtained. In Table 2, "concentration Ts" indicates the ratio of the total amount of monomer and crosslinker to the total amount of stock solution. In Table 2, "Concentration C" indicates the ratio of cross-linking agent to the total amount of monomer and cross-linking agent. In Table 2, "M/CL (molar ratio)" represents the amount ratio of the monomer and crosslinker contained in the stock solution (moles of monomer÷moles of crosslinker).
［ゲル用組成物（重合直前）の製造］ 表２に示すストック溶液Ｓ１，Ｓ３，Ｓ１＊に、上述の中性ゲル緩衝液、重合開始剤を添加して重合直前のゲル用組成物を作製した。表３に示す重合直前のゲル用組成物（実施例５，実施例６，比較例３）が得られた。表３において、「濃度Ｔｍｃ」は、重合直前のゲル用組成物に含まれるモノマーと架橋剤との合計量の割合を示す。表３において、「濃度Ｃ」はモノマーと架橋剤との合計量に対する架橋剤の割合を示し、ストック溶液の濃度Ｃが維持されている。 [Production of gel composition (immediately before polymerization)] To the stock solutions S1, S3, and S1* shown in Table 2, the neutral gel buffer solution and the polymerization initiator were added to prepare a gel composition immediately before polymerization. bottom. Gel compositions immediately before polymerization shown in Table 3 (Example 5, Example 6, Comparative Example 3) were obtained. In Table 3, "concentration Tmc" indicates the ratio of the total amount of the monomer and the cross-linking agent contained in the gel composition immediately before polymerization. In Table 3, "Concentration C" indicates the ratio of crosslinker to the total amount of monomer and crosslinker, maintaining the concentration C of the stock solution.
［ゲルの製造］ 得られた重合直前のゲル用組成物のモノマーを架橋剤の存在下に重合（ゲル化）した。表３に示す、本発明のゲル（実施例５、実施例６）と比較用のゲル（比較例３）が得られた。表３において、「濃度Ｔｐ」は、得られたゲルに含まれる架橋ポリアクリルアミドの割合を示し、上記濃度Ｔｍｃが維持されている。表３において、「濃度ｃ」はモノマーと架橋剤との合計量に対する架橋剤の割合を示し、ストック溶液の濃度Ｃが維持されている。 [Production of Gel] The monomers of the resulting composition for gel immediately before polymerization were polymerized (gelled) in the presence of a cross-linking agent. The gels of the present invention (Examples 5 and 6) and the comparative gel (Comparative Example 3) shown in Table 3 were obtained. In Table 3, "concentration Tp" indicates the ratio of crosslinked polyacrylamide contained in the obtained gel, and the above concentration Tmc is maintained. In Table 3, "Concentration c" indicates the ratio of crosslinker to the total amount of monomer and crosslinker, maintaining the concentration C of the stock solution.
［電気泳動］ 得られたゲル、上記装置、材料、条件を用いて、上記分子量マーカーを電気泳動した。マーカーの分子量に対する相対移動度（Ｒｆ）を表３に示す。表３の濃度Ｔｐはゲル全量に対するモノマーと架橋剤との合計量の割合を示す。表３の濃度Ｃはモノマーと架橋剤との合計量に対する架橋剤の割合であり、ストック溶液（表１）に記載した濃度Ｃに等しい。ストック溶液に含まれるモノマーと架橋剤のモル比はゲル組成物でも維持される（モノマー：架橋剤（モル）＝８１：１）。図１に、実施例５、実施例６、比較例３のＲｆ値をグラフで示した。 [Electrophoresis] Using the obtained gel, the apparatus, materials, and conditions described above, the molecular weight markers were subjected to electrophoresis. Table 3 shows the relative mobility (Rf) versus the molecular weight of the marker. The concentration Tp in Table 3 indicates the ratio of the total amount of monomer and cross-linking agent to the total amount of gel. The concentration C in Table 3 is the ratio of crosslinker to the total amount of monomer and crosslinker and is equal to the concentration C given in the stock solution (Table 1). The molar ratio of monomer to crosslinker contained in the stock solution is maintained in the gel composition (monomer:crosslinker (mol)=81:1). The Rf values of Example 5, Example 6, and Comparative Example 3 are shown graphically in FIG.
［分離能］ 表３と図１に示されるように、分子量１００ｋＤａ以上の泳動物質に対するＲｆ値は、実施例５、実施例６の値の方が比較例３の値よりも大きい。特に実施例５では分子量１４０ｋＤａ以上の泳動物質に対する分離能が高いことが理解できる。 [Separation Performance] As shown in Table 3 and FIG. 1, the Rf values of Examples 5 and 6 are higher than those of Comparative Example 3 with respect to migration substances having a molecular weight of 100 kDa or more. In particular, in Example 5, it can be seen that the separating ability for electrophoretic substances with a molecular weight of 140 kDa or more is high.
同じゲルのニワトリ筋抽出液サンプルレーンの泳動パターンを画像解析ソフトで解析した。図２に、２４５ｋＤａ付近（ミオシンバンド）のプロファイルを示す。図２（ａ）は解析に使用したレーンの泳動パターンであり、レーン１＊は比較例３、レーン２は実施例５、レーン３は実施例６のゲルを示す。図２（ｂ）に示されるように、実施例５（架橋剤ＣＬ－１を使用）と実施例６（架橋剤ＣＬ－２を使用）のいずれもが、比較例３（架橋剤ＢＩＳを使用）よりもピーク幅が狭くシャープである。すなわち、実施例５と実施例６では泳動バンドがより明瞭である。このことから、本発明のゲルを用いたＰＡＧＥでは高分子量サンプルを精密に分離できることが分かる。
The migration pattern of the chicken muscle extract sample lane of the same gel was analyzed with image analysis software. FIG. 2 shows the profile around 245 kDa (myosin band). FIG. 2(a) shows the electrophoresis patterns of the lanes used for analysis,
［引張強度（Ｍ／ＣＬ：８１，Ｔｐ：６％）の測定］ 実施例５、実施例６、比較例３のゲルから縦４０ｍｍ×横３０ｍｍの試験片を切り出し、引張強度を測定した。ＴＡインスツルメンツ社製動的粘弾性試験機ＲＳＡ－Ｇ２を用いた。試験は移動速度：１ｍｍ／分で行った。３サンプルの測定値の平均値を求めた。表３に、得られた引張破壊応力（ｋＰａ）と引張破壊歪み（％）を表３に示す。表３に示すように、比較例のゲルは実施例に比べて引張強度が劣る。 [Measurement of Tensile Strength (M/CL: 81, Tp: 6%)] From the gels of Examples 5, 6, and Comparative Example 3, test pieces of 40 mm long and 30 mm wide were cut out, and the tensile strength was measured. A dynamic viscoelasticity tester RSA-G2 manufactured by TA Instruments was used. The test was performed at a moving speed of 1 mm/min. The average value of the measured values of 3 samples was obtained. Table 3 shows the obtained tensile breaking stress (kPa) and tensile breaking strain (%). As shown in Table 3, the gels of Comparative Examples are inferior in tensile strength to those of Examples.
さらに、実施例５、実施例６、比較例３のゲルの硬度を測定した。アスカー社製ゴム硬度計を使用した。表３にそれぞれのゲルの最大針押圧力（ｍＮ）を示す。表３に示すように、比較例のゲルは実施例のゲルに比べて硬い。 Furthermore, the hardness of the gels of Examples 5, 6 and Comparative Example 3 was measured. A rubber hardness tester manufactured by Asker was used. Table 3 shows the maximum needle pressing force (mN) for each gel. As shown in Table 3, the gels of the comparative examples are harder than the gels of the examples.
これらの結果から、架橋剤としてＣＬ－１あるいはＣＬ－２を用いた架橋ポリアクリルアミドを含む本発明のゲルは、従来の架橋剤としてＢＩＳを用いた架橋ポリアクリルアミドを含むゲルよりも、引張力に対して強靭で高弾性であることが分かる。このような本発明のゲルは、保存、輸送、使用の際の破損のリスクが低く、品質安定性と取扱性に優れると言える。ゆえに本発明のゲルは、電気泳動用プレキャストゲルとして適している。 These results indicate that the gels of the present invention containing cross-linked polyacrylamide using CL-1 or CL-2 as a cross-linking agent are more resistant to tensile forces than gels containing cross-linked polyacrylamide using BIS as a conventional cross-linking agent. It is found to be tough and highly elastic. It can be said that such a gel of the present invention has a low risk of breakage during storage, transportation and use, and is excellent in quality stability and handleability. The gel of the invention is therefore suitable as a precast gel for electrophoresis.
［引張強度（Ｍ／ＣＬ：８１，Ｔｐ：５％～１０％）の測定］ 実施例５、実施例６、比較例３のゲル作製方法に従い、架橋剤濃度（Ｍ／ＣＬ）を８１に維持して架橋ポリアクリルアミド濃度（Ｔｐ）が異なるゲルを作製した。得られたゲルについて、上記方法に従い引張破壊応力と引張破壊歪みを測定した。結果を表４と表５に示す。表４の実施例８（Ｔｐ：６％）は、表３に示す実施例５と同じものである。表５の比較例５（Ｔｐ：６％）は、表３に示す比較例３と同じものである。表４，表５に示されるように、ゲルに含まれる架橋ポリアクリルアミドの濃度（Ｔｐ）の高低に関わらず、実施例７～１０のゲルは比較例４～７のゲルに比べて引張強度が優れる。 [Measurement of tensile strength (M/CL: 81, Tp: 5% to 10%)] According to the gel preparation method of Example 5, Example 6, and Comparative Example 3, the cross-linking agent concentration (M/CL) was maintained at 81. Gels with different crosslinked polyacrylamide concentrations (Tp) were prepared. The resulting gel was measured for tensile breaking stress and tensile breaking strain according to the above method. Tables 4 and 5 show the results. Example 8 (Tp: 6%) in Table 4 is the same as Example 5 shown in Table 3. Comparative Example 5 (Tp: 6%) in Table 5 is the same as Comparative Example 3 shown in Table 3. As shown in Tables 4 and 5, regardless of the concentration (Tp) of crosslinked polyacrylamide contained in the gel, the gels of Examples 7-10 had higher tensile strength than the gels of Comparative Examples 4-7. Excellent.
［引張強度（Ｍ／ＣＬ：６３，Ｔｐ：５％～１０％）］ 表２に示すストック溶液Ｓ２，Ｓ４，Ｓ２＊を用いて、上述のゲルと同様の方法で、架橋剤濃度（Ｍ／ＣＬ）を６３に変更して架橋ポリアクリルアミド濃度（Ｔｐ）が異なるゲルを作製した。得られたゲルについて、上記方法に従い引張破壊応力と引張破壊歪みを測定した。結果を表６と表７に示す。表６，表７に示されるように、架橋剤濃度（Ｍ／ＣＬ）が６３の場合でも、ゲルに含まれる架橋ポリアクリルアミドの濃度（Ｔｐ）の高低に関わらず、実施例１１～１４のゲルは比較例８～１１に比べて引張強度が優れる。このような結果からも、本発明のゲルがプレキャストゲルとして有効であると言える。 [Tensile strength (M/CL: 63, Tp: 5% to 10%)] Using the stock solutions S2, S4, and S2* shown in Table 2, the cross-linking agent concentration (M/ CL) was changed to 63 to prepare gels with different crosslinked polyacrylamide concentrations (Tp). The resulting gel was measured for tensile breaking stress and tensile breaking strain according to the above method. The results are shown in Tables 6 and 7. As shown in Tables 6 and 7, even when the cross-linking agent concentration (M/CL) was 63, the gels of Examples 11 to 14 were is superior in tensile strength compared to Comparative Examples 8-11. From these results as well, it can be said that the gel of the present invention is effective as a precast gel.
［ゲルの機械的強度］ このように、架橋剤としてＣＬ－１あるいはＣＬ－２を用いた架橋ポリアクリルアミドを含む本発明のゲルは、従来の架橋剤としてＢＩＳを用いた架橋ポリアクリルアミドを含むゲルよりも、強靭で高弾性であることが分かる。このような本発明のゲルは、使用中の破損のリスクが低く、取扱性に優れると言える。この結果も、本発明のゲルがプレキャストゲルとして有効であることを示している。 [Mechanical Strength of Gel] As described above, the gel of the present invention containing cross-linked polyacrylamide using CL-1 or CL-2 as a cross-linking agent is different from the conventional gel containing cross-linked polyacrylamide using BIS as a cross-linking agent. It is found to be tougher and more elastic than It can be said that such a gel of the present invention has a low risk of breakage during use and is excellent in handleability. This result also indicates that the gel of the present invention is effective as a precast gel.
［保存安定性（４℃）］ 実施例５と比較例３で作製したゲルを４℃で長期保存した場合の引張破壊応力（ｋＰａ）と引張破壊歪み（％）を表８に示す。表８に示すように、４℃で１８０日間保存した状態でも本発明のゲルは比較例のゲルに比べて優れた引張強度を示す。この結果も、本発明のゲルがプレキャストゲルとして有効であることを示している。 [Storage Stability (4°C)] Table 8 shows the tensile breaking stress (kPa) and tensile breaking strain (%) when the gels prepared in Example 5 and Comparative Example 3 were stored at 4°C for a long period of time. As shown in Table 8, even after being stored at 4°C for 180 days, the gels of the present invention exhibit superior tensile strength compared to the gels of the comparative examples. This result also indicates that the gel of the present invention is effective as a precast gel.
［保存安定性（３７℃）］ 実施例５と比較例３で作製したゲルを３７℃に加温した状態で保存した場合の引張破壊応力（ｋＰａ）と引張破壊歪み（％）を表９に示す。表９に示すように、３７℃に加温した状態で１４日保存した時点で、実施例５で製造したゲルの引張強度は維持されているか、あるいは、むしろ向上している。これに対して、比較例３で製造したゲルの引張強度は低下傾向にある。この結果も、本発明のゲルがプレキャストゲルとして有効であることを示している。 [Storage stability (37°C)] Table 9 shows the tensile breaking stress (kPa) and tensile breaking strain (%) when the gels prepared in Example 5 and Comparative Example 3 were stored while being heated to 37°C. show. As shown in Table 9, the tensile strength of the gel produced in Example 5 is maintained or even improved after 14 days storage at 37°C. In contrast, the tensile strength of the gel produced in Comparative Example 3 tends to decrease. This result also indicates that the gel of the present invention is effective as a precast gel.
［保存安定性の評価］ ３７℃で１日保存したゲルが受ける熱履歴は、４℃で約１ヶ月保存した場合に相当すると言われている。すると、本発明のゲルは４℃程度の低温下であれば、１年以上の間、機械的強度を損なうことなく保存することができると言える。このような本発明のゲルは、プレキャストゲルとして、使用前に長期保存することができる。 [Evaluation of Storage Stability] It is said that the thermal history received by a gel stored at 37° C. for one day corresponds to that of a gel stored at 4° C. for about one month. Then, it can be said that the gel of the present invention can be stored at a low temperature of about 4° C. for one year or more without losing its mechanical strength. Such gels of the present invention can be stored for long periods before use as precast gels.
［ＤＮＡ分離能］ ストック溶液Ｓ１、Ｓ１＊を用いて、上述の手順に従い、濃度Ｔｐが７．５％、Ｍ／ＣＬ（モル比）が８１のゲル（実施例１５，比較例１２）を作製した。得られたゲルと、上記ＤＮＡ泳動用材料、装置を用いてＰＡＧＥを行なった。図３に、泳動後のゲルを示す。図３（ａ）は実施例１５のゲルを示す。図３（ｂ）は比較例１２のゲルを示す。図４に、泳動後のゲルから算出したＲｆを示す。図３、図４から、塩基対数（ｂｐ）が５００前後のＤＮＡマーカーのＲｆは実施例１５の方が大きいことがわかる。このことから本発明のゲルはＤＮＡのＰＡＧＥにも有効であり、かつ、より大型のＤＮＡ断片に対する分離能に優れると言える。 [DNA Separation Ability] Gels (Example 15, Comparative Example 12) having a concentration Tp of 7.5% and an M/CL (molar ratio) of 81 were prepared using the stock solutions S1 and S1* according to the procedure described above. bottom. PAGE was carried out using the obtained gel, the materials for DNA electrophoresis and the equipment described above. FIG. 3 shows the gel after electrophoresis. FIG. 3(a) shows the gel of Example 15. FIG. FIG. 3(b) shows the gel of Comparative Example 12. FIG. FIG. 4 shows the Rf calculated from the gel after electrophoresis. From FIGS. 3 and 4, it can be seen that Example 15 has a higher Rf for a DNA marker with a base pair number (bp) of around 500. FIG. From this, it can be said that the gel of the present invention is also effective for PAGE of DNA and has excellent separation ability for larger DNA fragments.
［二次元電気泳動］ ストック溶液Ｓ２、Ｓ２＊を用いて、濃度Ｔｐが４％、Ｍ／ＣＬ（モル比）が６３のゲル（実施例１６，比較例１３）を製造した。得られたゲルと上記等電点泳動用材料、装置を用いて、常法に従いＯ’Ｆａｒｒｅｌｌの二次元電気泳動を行った。図５に結果を示す。図５（ａ）は実施例１６、図５（ｂ）は比較例１３の結果を示す。矢印は泳動方向を表す。図５から、実施例１６のゲルでは高分子領域に対応するより多くのスポットが出現していることが分かる。また実施例１６のゲルのスポットはより集束した形状を示している。このことから、本発明のゲルは二次元電気泳動の分離精度をさらに向上すると期待される。 [Two-Dimensional Electrophoresis] Gels (Example 16, Comparative Example 13) having a concentration Tp of 4% and an M/CL (molar ratio) of 63 were prepared using the stock solutions S2 and S2*. O'Farrell's two-dimensional electrophoresis was carried out according to a conventional method using the resulting gel, the above materials for isoelectric focusing, and the apparatus. The results are shown in FIG. 5(a) shows the results of Example 16, and FIG. 5(b) shows the results of Comparative Example 13. FIG. Arrows indicate the direction of migration. From FIG. 5, it can be seen that the gel of Example 16 has more spots corresponding to the high molecular weight regions. The gel spots of Example 16 also show a more focused shape. From this, the gel of the present invention is expected to further improve the separation accuracy of two-dimensional electrophoresis.
本発明のゲル用組成物を用いて製造したゲルはＰＡＧＥに有用であり、鮮明な泳動パターンを示す。本発明のゲル用組成物を用いて製造したゲルは、特に高分子量のたんぱく質やＤＮＡなどの分離能に優れる。さらに、本発明のゲル用組成物を用いて製造したゲルは、濃度に関わらず強靭で弾力性に優れ、作業時の破損が起こりにくい。しかも、本発明のゲル用組成物を用いて製造したゲルは長期保存安定性にも優れる。したがって、本発明のゲルはプレキャストゲルとして有用である。本発明のゲル用組成物を用いて製造したゲルは、従来のＰＡＧＥ用架橋ポリアクリルアミドゲルに比べて格段に性能が向上している。本発明のゲル用組成物、ゲル、プレキャストゲルを使用することによって、ＰＡＧＥの利用範囲の拡大、ＰＡＧＥを用いた分析精度の向上、ＰＡＧＥの作業性向上、ＰＡＧＥの作業効率化とコスト低減が可能となる。 A gel produced using the gel composition of the present invention is useful for PAGE and exhibits a clear migration pattern. A gel produced using the gel composition of the present invention is particularly excellent in the ability to separate high-molecular-weight proteins, DNA, and the like. Furthermore, the gel produced using the composition for gel of the present invention is tough and has excellent elasticity regardless of the concentration, and is less likely to break during operation. Moreover, the gel produced using the composition for gel of the present invention is also excellent in long-term storage stability. Therefore, the gel of the present invention is useful as a precast gel. A gel produced using the gel composition of the present invention has significantly improved performance compared to conventional crosslinked polyacrylamide gels for PAGE. By using the gel composition, gel, and precast gel of the present invention, it is possible to expand the range of use of PAGE, improve the accuracy of analysis using PAGE, improve the workability of PAGE, improve the work efficiency of PAGE, and reduce costs. becomes.
１ 比較例３のレーン
２ 実施例５のレーン
３ 実施例６のレーン
４ 実施例１６のスポットの例
５ 比較例１３のスポットの例
1
Claims (6)
（Ｂは炭素数が１以上４以下の直鎖または分岐アルキレン基を表す。Ｒ１は互いに同一で水素原子（Ｈ）またはメチル基（ＣＨ ３ ）を表し、Ｒ２は互いに同一で水素原子（Ｈ）またはメチル基（ＣＨ ３ ）を表す。ｌ，ｍ，ｎはそれぞれ１，２，３から選ばれ、ｌ，ｍ，ｎは互いに異なっていてもよく、ｌ，ｍ，ｎのうちの２つが同一でもよく、ｌ，ｍ，ｎの全てが同一でもよく、１≦ｌ＋ｍ＋ｎである。ｐ，ｑ，ｒは０≦ｐ，０≦ｑ，０≦ｒ，０≦ｐ＋ｑ＋ｒである。） At least one (meth)acrylamide-based monomer selected from (meth)acrylamides with or without substituents, and a crosslinking agent having a molecular weight of 182 to 1500 represented by the following formula (1) , compositions for gels.
(B represents a linear or branched alkylene group having 1 to 4 carbon atoms. R1 are the same and represent a hydrogen atom (H) or a methyl group (CH3), R2 are the same and represent a hydrogen atom (H ) or represents a methyl group (CH 3 ) l, m, n are each selected from 1, 2, 3, l, m, n may be different from each other, two of l, m, n are the same may be the same, and l, m, and n may all be the same, and 1 ≤ l + m + n. p, q, and r are 0 ≤ p, 0 ≤ q, 0 ≤ r, 0 ≤ p + q + r.)
（Ｂは炭素数が１以上４以下の直鎖または分岐アルキレン基を表す。Ｒ１は互いに同一で水素原子（Ｈ）またはメチル基（ＣＨ ３ ）を表し、Ｒ２は互いに同一で水素原子（Ｈ）またはメチル基（ＣＨ ３ ）を表す。ｌ，ｍ，ｎはそれぞれ１，２，３から選ばれ、ｌ，ｍ，ｎは互いに異なっていてもよく、ｌ，ｍ，ｎのうちの２つが同一でもよく、ｌ，ｍ，ｎの全てが同一でもよく、１≦ｌ＋ｍ＋ｎである。ｐ，ｑ，ｒは０≦ｐ，０≦ｑ，０≦ｒ，０≦ｐ＋ｑ＋ｒである。） A repeating unit derived from at least one (meth)acrylamide-based monomer selected from (meth)acrylamides with or without substituents, and a molecular weight represented by the following formula (1) of 182 to 1500 A gel comprising cross-linked (meth)acrylamide having units derived from a cross-linking agent of
(B represents a linear or branched alkylene group having 1 to 4 carbon atoms. R1 are the same and represent a hydrogen atom (H) or a methyl group (CH3), R2 are the same and represent a hydrogen atom (H ) or represents a methyl group (CH 3 ) l, m, n are each selected from 1, 2, 3, l, m, n may be different from each other, two of l, m, n are the same may be the same, and l, m, and n may all be the same, and 1 ≤ l + m + n. p, q, and r are 0 ≤ p, 0 ≤ q, 0 ≤ r, 0 ≤ p + q + r.)
からなるプレキャストゲル。
（Ｂは炭素数が１以上４以下の直鎖または分岐アルキレン基を表す。Ｒ１は互いに同一で水素原子（Ｈ）またはメチル基（ＣＨ ３ ）を表し、Ｒ２は互いに同一で水素原子（Ｈ）またはメチル基（ＣＨ ３ ）を表す。ｌ，ｍ，ｎはそれぞれ１，２，３から選ばれ、ｌ，ｍ，ｎは互いに異なっていてもよく、ｌ，ｍ，ｎのうちの２つが同一でもよく、ｌ，ｍ，ｎの全てが同一でもよく、１≦ｌ＋ｍ＋ｎである。ｐ，ｑ，ｒは０≦ｐ，０≦ｑ，０≦ｒ，０≦ｐ＋ｑ＋ｒである。） A repeating unit derived from at least one (meth)acrylamide-based monomer selected from (meth)acrylamides with or without substituents, and a molecular weight represented by the following formula (1) of 182 to 1500 A precast gel comprising a gel containing crosslinked (meth)acrylamide having units derived from a crosslinking agent of
(B represents a linear or branched alkylene group having 1 to 4 carbon atoms. R1 are the same and represent a hydrogen atom (H) or a methyl group (CH3), R2 are the same and represent a hydrogen atom (H ) or represents a methyl group (CH 3 ) l, m, n are each selected from 1, 2, 3, l, m, n may be different from each other, two of l, m, n are the same may be the same, and l, m, and n may all be the same, and 1 ≤ l + m + n. p, q, and r are 0 ≤ p, 0 ≤ q, 0 ≤ r, 0 ≤ p + q + r.)
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