JP7226738B2 - Container for cell concentration - Google Patents
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Description
本発明は細胞懸濁液を収容して遠心分離により濃縮する細胞濃縮用容器に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a container for cell concentration in which a cell suspension is accommodated and concentrated by centrifugation.
従来、細胞懸濁液を収容して遠心分離する必要があることから、強度が得やすい硬質容器が多用されていたが、可撓性容器を用いて遠心分離する技術も知られている。
例えば下記特許文献１では、一部又は全部が可撓性を有する容器本体に、大きな容積の第１の収容部と、遠心沈殿物を収容するための小さな容積の第２の収容部とを設けた遠心分離用容器が提案されている。この遠心分離用容器では、第１の収容部の上部にポート部が設けられていて、遠心分離後に第１の収容部と第２の収容部との境界部分の容器壁を外側から密着させることで、ポート部と第２の収容部を非連通状態にして、第２の収容部の細胞を分離したり洗浄したりしていた。
このような容器では、第２の収容部に収容された分離後の目的細胞を第２の収容部から回収するような場合に、容器に変形等が生じると、手間を要するものであった。
Conventionally, since it is necessary to store a cell suspension and perform centrifugal separation, a hard container that is easy to obtain strength has been used in many cases, but a technique of centrifuging using a flexible container is also known.
For example, in
In such a container, if the container is deformed or the like, it is troublesome to collect the separated target cells from the second container from the second container.
下記特許文献２では、有核細胞と不要細胞とを含む細胞含有液から不要細胞を分離して回収バッグに有核細胞を回収し、または濃縮することが行われていた。この文献では、高遠心力で遠心分離するとともにフィルタによるろ過を用いて分離した後でコニカルチューブなどに移し、さらに遠心分離して単核球が回収されていた。そのため容器の移し替えなどに手間を要していた。 In Patent Document 2 below, unnecessary cells are separated from a cell-containing liquid containing nucleated cells and unnecessary cells, and the nucleated cells are collected in a collection bag or concentrated. In this document, mononuclear cells are recovered by centrifuging with a high centrifugal force and separating using filtration with a filter, transferring to a conical tube or the like, and further centrifuging. Therefore, it took time and effort to transfer the container.
下記特許文献３では、血液の血漿成分、白血球、赤血球等の分離精度を高めるために遠心分離器にかける血液バッグにおいて、容器の上端や下端、更には中腹にチューブを接続して各成分を分離して各チューブから流出させていた。そのため少量の成分の場合には、容器内や回収するまでの経路などに残留して無駄が生じ易かった。 In Patent Document 3 below, in a blood bag that is centrifuged to increase the separation accuracy of blood plasma components, white blood cells, red blood cells, etc., tubes are connected to the upper and lower ends of the container, and further to the middle of the container to separate each component. and let it flow out of each tube. Therefore, in the case of a small amount of the component, it tends to be wasteful because it remains in the container or in the route until it is collected.
さらに、下記特許文献４では、容量部Ａと容量部Ｂからなり、容量部Ａの下部に容量部Ｂがあり、容量がＡ＞Ｂで、容量部Ａと容量部Ｂが容易に分離又は分断可能に設けられた遠心分離用容器が提案されている。しかしながら、この遠心分離容器をバッグから分離した容量部Ｂの細胞をシリンジ等で取り出すようにしているため、分離後の細胞を回収するのに手間を要していた。 Furthermore, in Patent Document 4 below, a capacitor portion A and a capacitor portion B are provided, the capacitor portion B is located below the capacitor portion A, the capacitance is A>B, and the capacitor portion A and the capacitor portion B can be easily separated or divided. A possible centrifuge container has been proposed. However, since the cells in the volume part B separated from the bag of the centrifugation container are taken out with a syringe or the like, it takes time and effort to recover the separated cells.
以上のように、上記何れの技術であっても、可撓性を有する容器を用いて遠心分離により沈降する細胞を回収したり濃縮したりする従来のシステムでは、容器の移し替えなどの際に手間を要したり、無駄が生じたりし易かった。 As described above, in any of the above techniques, in a conventional system that uses a flexible container to collect and concentrate cells sedimented by centrifugation, when the container is transferred, etc. It was easy to take time and waste.
そこで本発明では、簡易な構造で閉鎖系を保ちつつ細胞濃縮を行うことができるとともに、細胞濃縮液を容易に無駄なく抜き取りし易い細胞濃縮用容器を提供することを目的とする。 SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, an object of the present invention is to provide a container for cell concentration that has a simple structure and allows cell concentration to be performed while maintaining a closed system, and from which the cell concentrate can be easily drawn out without waste.
上記目的を達成する本発明の細胞濃縮用容器は、可撓性の容器本体の一端部に排出部を有し、目的細胞を含有する細胞懸濁液が密封状態で収容されて遠心分離されることで、一端側に目的細胞が沈降して細胞濃縮液が生成される細胞濃縮用容器であって、容器本体は、第１収容部と、第１収容部の一端側の底部に第１収容部と連通して設けられて細胞濃縮液が貯留される第２収容部と、を有し、第１収容部の一端側には、第１収容部の軸に沿って幅が縮小する縮小部が設けられることで底部が第２収容部側に向けて下り勾配に形成され、第２収容部は、クリップにより外側から圧迫して密封可能であるとともに閉塞されないように曲げることが可能な可撓性チューブにより形成され、接合部を介して第１収容部の縮小部の端部に接合され、接合部は、成形体からなり、第１収容部の内側に収容されて気密に接合されるとともに第１収容部の軸方向に突出した筒部に第２収容部が外嵌して気密に接合され、排出部は、第２収容部の一端部に流路を有する硬質部材を備えていて、流路が抜取具を貫通させて細胞濃縮液を抜き取り可能な弾性部材により閉塞されていることを特徴としている。
本発明では、排出部は、弾性部材を貫通した抜取具の先端開口が弾性部材の隣接位置に配置されるように、抜取具を当接させて抜取具の挿入位置を規制可能に構成されていてもよい。
本発明では、目的細胞が単核球であって、該単核球を含有する細胞懸濁液から単核球を濃縮する細胞濃縮用容器であってもよい。
The container for cell concentration of the present invention, which achieves the above object, has a discharge part at one end of a flexible container body, and a cell suspension containing target cells is accommodated in a sealed state and centrifuged. Thus, in the cell concentration container in which the target cells are sedimented on one end side and the cell concentrate is produced, the container main body includes the first container and the first container at the bottom of the one end side of the first container. a second storage portion provided in communication with the portion and in which the cell concentrate is stored , and a reduced portion whose width is reduced along the axis of the first storage portion on one end side of the first storage portion. is provided, the bottom part is formed downwardly toward the second housing part side, and the second housing part can be sealed by pressing it from the outside with a clip, and can be bent so as not to be closed. It is formed of a sex tube and is joined to the end of the contracted portion of the first accommodation portion via a joining portion, the joining portion is made of a molded body, and is housed inside the first accommodation portion and joined airtightly. The second housing portion is fitted over and airtightly joined to the cylindrical portion protruding in the axial direction of the first housing portion, and the discharge portion includes a hard member having a flow path at one end of the second housing portion, The channel is characterized in that it is blocked by an elastic member that allows the extractor to penetrate and extract the concentrated cell solution.
In the present invention, the discharge part is configured to allow the extraction tool to come into contact and regulate the insertion position of the extraction tool so that the tip opening of the extraction tool passing through the elastic member is arranged at a position adjacent to the elastic member. may
In the present invention, the target cells are mononuclear cells, and a cell concentration container for concentrating mononuclear cells from a cell suspension containing the mononuclear cells may be used.
本発明の細胞濃縮用容器は、弾性部材にスリットが設けられているのが好適である。
上記目的を達成する本発明の細胞濃縮方法は、上記の細胞濃縮用容器を用いた細胞濃縮方法であって、細胞濃縮用容器に細胞懸濁液を収容して密封し、第１収容部の側周面を支持する内周面と、第１収容部の縮小部を支持する傾斜面と、第２収容部及び排出部を配置する内部配置部と、を有するアダプタに細胞濃縮用容器を支持させて遠心分離機に装着し、遠心分離を行って第２収容部に細胞濃縮液を生成させ、第２収容部内の細胞濃縮液を抜取具の先端開口を弾性部材の隣接位置に配置して抜き取ることで細胞濃縮液を得ることを特徴としている。
本発明の細胞濃縮方法では、目的細胞が単核球であって、この単核球を含有する細胞懸濁液から単核球を濃縮してもよい。
It is preferable that the cell concentration container of the present invention is provided with a slit in the elastic member.
The cell concentration method of the present invention for achieving the above object is a cell concentration method using the above cell concentration container, wherein the cell suspension is contained in the cell concentration container and sealed, and the first container is The cell concentration container is supported by the adapter having an inner peripheral surface that supports the side peripheral surface, an inclined surface that supports the contracted portion of the first accommodating portion, and an internal arrangement portion that arranges the second accommodating portion and the discharge portion. and attach it to a centrifuge, perform centrifugation to generate a concentrated cell solution in the second container, and dispose the concentrated cell solution in the second container so that the tip opening of the extraction tool is adjacent to the elastic member. It is characterized by obtaining a cell concentrate by extracting.
In the cell enrichment method of the present invention, the target cells are mononuclear cells, and the mononuclear cells may be enriched from the cell suspension containing the mononuclear cells.
本発明の細胞濃縮用容器によれば、容器本体が可撓性を有するので、密封状態で容積を増減でき、簡易な構造で閉鎖系を保ちつつ細胞濃縮のための各操作を行うことができる。
そして、容器本体には、第１収容部の一端側の底部に第２収容部が連通して設けられ、第１収容部の一端側の底部が第２収容部側に下り勾配で形成され、さらに第２収容部の一端部に排出部が設けられて先端から細胞濃縮液を抜き取り可能に閉塞されている。
そのため、遠心分離により目的細胞が一端側に沈降して集まることで、第２収容部における排出部の先端から抜き取り易い位置に細胞濃縮液が生成される。従って、この細胞濃縮液を直接無駄なく抜き取ることができる。しかも、細胞濃縮液を第２収容部、すなわち、細胞濃縮液の集積部位の先端から抜き取るため、可撓性で変形し易い容器本体であっても変形を抑えて抜き取り操作を行い易い。
よって、本発明にあっては、簡易な構造で閉鎖系を保ちつつ細胞濃縮を行うことができるとともに、細胞濃縮液を容易に無駄なく確実に抜き取ることが可能な細胞濃縮用容器を提供することができる。
According to the container for cell concentration of the present invention, since the container body has flexibility, the volume can be increased and decreased in a sealed state, and each operation for cell concentration can be performed while maintaining a closed system with a simple structure. .
Then, the container body is provided with a second storage portion communicating with a bottom portion on one end side of the first storage portion, and the bottom portion on one end side of the first storage portion is formed with a downward slope toward the second storage portion side, Furthermore, a discharge part is provided at one end of the second storage part and is closed so that the cell concentrate can be extracted from the tip.
Therefore, the target cells are sedimented and collected at one end side by centrifugation, and a cell concentrate is generated at a position where it is easy to extract from the tip of the discharge section in the second storage section. Therefore, this cell concentrate can be drawn directly without waste. In addition, since the cell concentrate is extracted from the second storage portion, that is, the tip of the accumulation portion of the cell concentrate, even if the container body is flexible and easily deformable, deformation can be suppressed and the extracting operation can be easily performed.
Therefore, according to the present invention, it is an object of the present invention to provide a container for cell concentration that can concentrate cells while maintaining a closed system with a simple structure and from which the cell concentrate can be easily and reliably extracted without waste. can be done.
本発明の細胞濃縮用容器において、目的細胞が単核球であって、単核球を含有する細胞懸濁液から単核球を濃縮すれば、細胞濃縮液を無駄なく抜き取って有効に使用することができる。
本発明の細胞濃縮用容器において、第２収容部が可撓性チューブにより形成され、排出部が第２収容部を外側から加圧して閉塞する構成であれば、外側から第２収容部を容易に開閉して細胞濃縮液を抜き取ることができ、操作性がよい。
In the container for cell concentration of the present invention, when the target cells are mononuclear cells and the mononuclear cells are concentrated from the cell suspension containing the mononuclear cells, the cell concentrate can be extracted without waste and used effectively. be able to.
In the container for cell concentration of the present invention, if the second storage part is formed of a flexible tube and the discharge part is configured to pressurize the second storage part from the outside to close it, the second storage part can be easily opened from the outside. The cell concentrate can be extracted by opening and closing the lid, and the operability is good.
本発明の細胞濃縮用容器において、排出部が先端に流路を有する硬質部材を備え、抜取具を貫通させることができる弾性部材により流路が閉塞されていれば、抜取具を貫通させることで容易に細胞濃縮液を抜き取ることができ、しかも抜取具を貫通させる際に硬質部材を支持して操作することができるため操作性がよい。また、硬質部材の内径に弾性部材を装着するため、嵌合代、すなわち、硬質部材の内径に対する弾性部材の封止力をコントロールすることが容易となり、確実な封止を行うことができる。なお、弾性部材にスリットが設けられていれば、抜取具が太くても弾性部材を貫通させることができ、細胞濃縮液をより大径の流路から抜き取ることができ、抜き取る際に細胞に損傷等を与えることを防止できる。よって、確実な封止力を得ながら、細胞濃縮液の抜き取りを容易に行うことができる。
さらに、弾性部材を貫通した抜取具の先端開口を弾性部材の隣接位置に配置可能に構成していれば、細胞濃縮液を抜取具により抜き取る際、内部に細胞濃縮液が残留し難く、無駄なく抜き取ることができる。
In the container for cell concentration of the present invention, if the discharging part has a rigid member having a flow path at the tip thereof, and the flow path is blocked by an elastic member through which the extraction tool can be passed, the extraction tool can be passed through. The cell concentrate can be easily extracted, and the hard member can be supported and operated when the extractor is passed through, resulting in good operability. Moreover, since the elastic member is attached to the inner diameter of the hard member, it becomes easy to control the fitting allowance, that is, the sealing force of the elastic member with respect to the inner diameter of the hard member, so that reliable sealing can be achieved. In addition, if the elastic member is provided with a slit, the elastic member can be penetrated even if the extractor is thick, and the cell concentrate can be extracted from a channel with a larger diameter, and the cells are damaged during extraction. etc. can be prevented. Therefore, it is possible to easily extract the cell concentrate while obtaining a reliable sealing force.
Furthermore, if the tip opening of the extractor penetrating the elastic member can be arranged at a position adjacent to the elastic member, when the cell concentrate is extracted by the extractor, it is difficult for the concentrated cell solution to remain inside the extractor without waste. can be extracted.
以下、本発明の実施形態について図を用いて詳細に説明する。
本実施形態の遠心分離用容器は、目的細胞を含有する細胞懸濁液を密封状態で収容して遠心分離することで、目的細胞が一端側に沈降して濃縮されて細胞濃縮液が生成される容器である。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
In the container for centrifugation of the present embodiment, the cell suspension containing the target cells is housed in a sealed state and centrifuged, so that the target cells are sedimented at one end and concentrated to generate a cell concentrate. It is a container that
本実施形態の細胞懸濁液は、生体から採取されて目的細胞を含有する懸濁液であり、生体から採取された液、又は、生体から採取された液を遠心分離、濾過等の各種の方法で分離して得られた一部の成分からなる液やその希釈液などである。本実施形態では、髄液や末梢血などから赤血球が分離されて目的細胞としての単核球が含有された液である。 The cell suspension of the present embodiment is a suspension containing target cells collected from a living body, and the liquid collected from the living body or the liquid collected from the living body is subjected to various methods such as centrifugation and filtration. It is a liquid consisting of a part of the components obtained by separation by the method, a diluted liquid thereof, and the like. In this embodiment, it is a liquid containing mononuclear cells as target cells obtained by separating erythrocytes from cerebrospinal fluid, peripheral blood, or the like.
本実施形態の細胞濃縮用容器１０は、図１に示すように、可撓性の容器本体１１と、容器本体１１の一端部に設けられた細胞濃縮液の排出部１２と、他端部に接続された連結チューブ１３と、他端部に設けられた懸垂部１５とを備えている。
As shown in FIG. 1, the
容器本体１１は、第１収容部１７と、第１収容部１７の一端側の底部１９に第１収容部１７と連通して設けられ、遠心分離時に細胞濃縮液が生成して集積される第２収容部２１と、を有している。本実施形態では、第１収容部１７と第２収容部２１とが接合部２３を介して接合されている。
The
第１収容部１７は可撓性フィルムが互いに対向して周囲で密封されることでバッグ状に形成されている。第１収容部１７の一端側には、第１収容部１７の軸Ｌに沿って幅が縮小する縮小部２５が設けられている。縮小部２５の端部には接合部２３を介して第２収容部２１が接合されていて、第１収容部１７の底部１９が第２収容部２１側に向けて下り勾配に形成されている。
The
第１収容部１７の他端部側には、細胞懸濁液を第１収容部１７内に供給したり、分離液や洗浄液等を排出したりするために他の器具と連結可能な複数の連結チューブ１３が連結されるともに、細胞濃縮用容器１０を他の部材に安定して吊り下げるための懸垂部１５が設けられて密封されている。
On the other end side of the
第２収容部２１は、可撓性チューブにより形成されていて、接合部２３を介して第１収容部１７に接合され、第１収容部１７から軸Ｌに沿って一端側へ延びている。
接合部２３は、成形体からなり、外周面が第１収容部１７における縮小部２５の内側に収容されて気密に接合され、軸Ｌ方向に突出した筒部２７に第２収容部２１が外嵌して気密に接合されている。
接合部２３の内部には第２収容部２１の一部を構成する貫通孔が軸Ｌ方向に設けられていて、第２収容部２１が第１収容部１７と連通している。すなわち、接合部２３、筒部２７の内部容積を含めて、第２収容部２１と見做すこともできる。
The
The
A through hole forming a part of the
排出部１２は、第２収容部２１の一端部に設けられ、第２収容部２１の一端部を気密に閉塞するとともに、先端２９から細胞濃縮液を抜き取り可能に構成されている。
この排出部１２は、図２に示すように、可撓性チューブ状の第２収容部２１が外嵌して気密に接合されるとともに、内部に第２収容部２１の内部と連通する流路３１を有する成形体からなる硬質部材３３と、流路３１を気密に閉塞する弾性部材３５と、弾性部材３５及び硬質部材３３の先端を外側から囲んで加圧したうえで閉塞可能なキャップ３７と、硬質部材３３の近接位置で第２収容部２１を外側から圧迫して密封するクレンメ等のクリップ３９と、を有する。硬質部材３３は少なくとも第１収容部１７及び第２収容部２１よりも硬質に形成されている。
The
As shown in FIG. 2 , the
本実施形態では、弾性部材３５はシリンジの針管や筒先など、各種の抜取具４１が貫通可能に形成されている。この弾性部材３５には、軸Ｌ方向にスリット４３が設けられることで、より太い抜取具４１が貫通し易くされている。この弾性部材３５は、硬質部材３３の流路３１に配置された状態で、キャップ３７が締め込まれることで硬質部材３３を介して外周側から加圧圧縮されて密封されるように構成されている。
In this embodiment, the
本実施形態の排出部１２は、遠心分離時に閉塞状態を維持するために、クリップ３９により第２収容部２１の下端を外側から加圧して閉鎖するとともに、第２収容部２１の端部でキャップ３７を締め込むことにより、外側から加圧して流路３１を密封している。
In order to maintain the closed state during centrifugation, the
また本実施形態の排出部１２は、抜取具４１を排出部１２に貫通させた際、抜取具４１が硬質部材３３やキャップ３７等に当接して第２収容部２１内への挿入位置が規制されており、抜取具４１の先端開口４１ａが第２収容部２１の内部における弾性部材３５の隣接位置、すなわち、本実施形態においては、第２収容部２１の下方内壁を構成する弾性部材３５の第２収容部２１内部への露出面近傍に配置することが可能となっている。
Further, in the
本実施形態の細胞濃縮用容器１０では、第１収容部１７、接合部２３、第２収容部２１、及び硬質部材３３がそれぞれ同一の樹脂又は互いに熱溶着可能な樹脂であって、収容される細胞懸濁液及び細胞濃縮液に対してより安全な樹脂により構成されており、各接合部分が熱溶着されている。
In the
本実施形態において、より具体的には、第１収容部１７は、エチレン－酢酸ビニル共重合樹脂フィルムから袋状に形成し、接合部２３は、エチレン－酢酸ビニル共重合樹脂成形体等から形成し、第２収容部２１は、主として、エチレン－酢酸ビニル共重合樹脂製チューブ等から略管状に形成し、硬質部材３３は、エチレン－酢酸ビニル共重合樹脂成形体等から構成される。上記の他、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、エチレン－プロピレン共重合樹脂、ポリブタジエン樹脂、スチレン－ブタジエン共重合樹脂およびそれらの水素添加樹脂、ポリウレタン樹脂、ならびにそれらの樹脂の混合物などが用途に合わせて使用可能であるが、密着性、熱溶着性を考慮して適用する。密閉性、無菌状態維持、揮発性ガスの発生などを考慮すれば、熱溶着による接合が好ましく、熱溶着性のよい同一素材によって形成することが好ましい。
More specifically, in the present embodiment, the
このような細胞濃縮用容器１０を用いて細胞懸濁液中の目的細胞を濃縮して細胞濃縮液を得るには、予め細胞濃縮用容器１０を連結チューブ１３及び排出部１２を閉塞した状態で滅菌しておき、連結チューブ１３から細胞濃縮液と、適宜混合する成分や液と、をシリンジ等の抜取具４１を用いて収容して密封する。
In order to obtain a cell concentrate by concentrating the target cells in the cell suspension using such a
この細胞濃縮用容器１０を、例えば図３（ａ）（ｂ）に示すようなアダプタ４５を用いて遠心分離機に装着する。アダプタ４５は、遠心分離機の収容位置に設けられた治具４６に細胞濃縮用容器１０を安定して配置するもので、治具４６の内面に対応した外周面４７を有し、内側には第１収容部１７の側周部を支持する内周面４８ａと、第１収容部１７の一端側の縮小部２５を支持する傾斜面４８ｂとを有する。傾斜面４８ｂの一端側には、軸方向に貫通して第２収容部２１及び排出部１２を安定して配置可能な内部配置部４９が設けられている。内部配置部４９は、第１収容部１９の筒部２７が配置される小径部４９ａと、第２収容部２１が閉塞されないように例えば巻回するように曲げて収容される大径部４９ｂと、を備えている。
This
このアダプタ４５を用いて細胞濃縮用容器１０を遠心分離機に装着した状態で、遠心分離を行う。
これにより目的細胞が沈降し、順次第２収容部２１の排出部１２側に集積され、細胞濃縮液が生成される。細胞濃縮液の生成量が第２収容部２１の容積より多い場合には、第１収容部１７の縮小部２５等にも細胞濃縮液が収容されてもよい。後述するクランプ５１などで第１収容部１７と第２収容部２１を仕切る場合には、生成される細胞濃縮液の全量が収まる大きさの第２収容部２１を用意して、第２収容部２１に収容することが望ましい。
Centrifugation is performed in a state in which the
As a result, the target cells are sedimented and sequentially accumulated on the
所定時間の遠心分離が終了した後、沈殿した細胞が散らないよう注意し、懸垂部１５を利用して細胞濃縮用容器１０を吊り下げ、図１中に仮想線で示すように、第１収容部１７又は第２収容部２１の外側からクランプ５１で横断する位置を挟むことで、第１収容部１７の内部と第２収容部２１の内部とを液密に仕切る。
連結チューブ１３からクランプ５１より第１収容部１７の他端部に収容された上清液を抜き取って排出する。
このとき予め容器本体１１の側面に、懸垂部１５で吊り下げたときの液面の位置を測定する目盛を設けておけば、この目盛りを基準にしてクランプ５１により仕切ることで、排出する液量を調整することが可能である。
その後、必要に応じて、他の連結チューブ１３から生理食塩水を添加し、同様に懸濁及び遠心分離してクランプ５１で仕切って上清液を抜き取ることにより、細胞洗浄を行ってもよい。
After the centrifugation for a predetermined period of time is completed, the
The supernatant liquid stored in the other end of the
At this time, if a scale for measuring the position of the liquid surface when suspended by the
Thereafter, if necessary, cells may be washed by adding physiological saline from another connecting
最終の遠心分離を行った後、クランプ５１を外して濃縮細胞をタッピング等で外部から解して懸濁させる。
この状態で、シリンジ等の抜取具４１を排出部１２の先端から挿入して弾性部材３５を貫通させ、抜取具４１の先端開口４１ａを第２収容部２１の内部における弾性部材３５の隣接位置に配置し、第２収容部２１内の液を抜き取ることで細胞濃縮液を得ることができる。
After the final centrifugation, the
In this state, an
以上のような本実施形態の細胞濃縮用容器１０によれば、容器本体１１が可撓性を有するので、密封状態で容積を増減でき、簡易な構造で閉鎖系を保ちつつ細胞濃縮のための各操作を行うことができる。
According to the
本実施形態の細胞濃縮用容器１０では、容器本体１１には、第１収容部１７の一端側の底部１９に第２収容部２１が連通して設けられ、第１収容部１７の一端側の底部１９が第２収容部２１側に下り勾配で設けられ、さらに第２収容部２１の一端部に排出部１２が設けられて先端２９から細胞濃縮液を抜き取り可能に閉塞している。
In the
そのため、遠心分離により目的細胞が一端側に沈降して集まることで、第２収容部２１における排出部１２の先端２９から抜き取り易い位置に細胞濃縮液が生成する。よって、この細胞濃縮液を短い距離で容易に且つ無駄なく抜き取ることができる。しかも細胞濃縮液を先端２９から直接抜き取るため、可撓性で変形し易い容器本体１１であってもこの変形に影響されずに抜き取り操作を行うことができる。
従って、本実施形態の細胞濃縮用容器１０によれば、簡易な構造で閉鎖系を保ちつつ細胞濃縮を行うことができるとともに、細胞濃縮液を容易に無駄なく確実に抜き取ることが可能である。
Therefore, the target cells are sedimented and gathered at one end side by centrifugation, so that a cell concentrate is generated at a position in the
Therefore, according to the
本実施形態では、細胞濃縮用容器１０で多量の細胞懸濁液から少量の細胞濃縮液を生成するため、可撓性の容器本体１１が大きくて取り扱う際に各種の変形が生じ易く、その一方で第２収容部２１が小さく形成されている。そのため、第２収容部２１の一端部に設けられた排出部１２の先端２９から、抜取具４１により細胞濃縮液を抜き取ることで、大きく変形し易い第１収容部１７に関係なく、細胞濃縮液を抜き取り操作することができ、細胞濃縮液を容易に無駄なく抜き取ることが可能である。ここでは目的細胞が単核球であり、単核球が濃縮された細胞濃縮液を無駄なく抜き取って有効に使用することができる。
In this embodiment, since a small amount of cell concentrate is produced from a large amount of cell suspension in the
本実施形態の細胞濃縮用容器１０によれば、第２収容部２１が可撓性チューブにより形成され、排出部１２が第２収容部２１を外側から加圧して閉塞する構成であれば、外側から第２収容部２１を容易に開閉して細胞濃縮液を抜き取ることができ、操作性がよい。
According to the
本実施形態の細胞濃縮用容器１０によれば、排出部１２が先端２９に流路３１を有する硬質部材３３を備え、抜取具４１が貫通可能な弾性部材３５により流路３１が閉塞されている。そのため、抜取具４１を弾性部材３５に貫通させることで容易に細胞濃縮液を抜き取ることができ、その際、硬質部材３３を支持して操作することができるので、操作性を向上できる。
また、硬質部材３３の内径からなる流路３１に弾性部材３５を装着しているので、嵌合代、すなわち、硬質部材３３の内径に対する弾性部材３５の封止力をコントロールすることが容易であり、確実な封止を行うことができる。これにより排出部１２に高い遠心力がかかる場合にも確実な封止が可能である。
According to the
Further, since the
本実施形態の細胞濃縮用容器１０では、弾性部材３５にスリット４３が設けられているため、抜取具４１が太くても弾性部材３５を貫通させることができ、細胞濃縮液をより大径の流路３１から抜き取ることができ、抜き取る際に細胞に損傷等を与えることを防止できる。
In the
本実施形態の細胞濃縮用容器１０によれば、弾性部材３５を貫通した抜取具４１の先端開口４１ａが弾性部材３５の隣接位置に配置可能に構成されている。そのため細胞濃縮液を抜取具４１により抜き取る際、第２収容部２１の細胞濃縮液を底まで抜き取ることができ、細胞濃縮液が内部に残留し難く、無駄なく抜き取ることができる。
According to the
なお上記実施形態は、本発明の範囲内において適宜変更可能である。
上記実施形態では、目的細胞の例として単核球の例について説明したが、細胞懸濁液を遠心分離することで、沈降して細胞濃縮可能な細胞であれば特に限定されない。例えば浮遊系の細胞であっても接着性細胞であってもよく、また各種の手法により培養された培養細胞であっても、各種の細胞スフェロイド等であってもよい。
また上記実施形態では、細胞濃縮用容器１０の容器本体１１として、第１収容部１７が可撓性フィルムからなるバッグにより構成され、第２収容部２１がチューブにより構成され、両者が接合された例について説明したが、第１収容部１７及び第２収容部２１が連続した可撓性フィルムにより一体に形成された容器であってよい。例えば第１収容部１７の一端側に縮小部２５が設けられるとともに、縮小部２５の下端に第１収容部１７より幅狭の第２収容部２１が設けられた連続したフィルムからなる容器本体１１を構成することも可能である。その場合、第２収容部２１の一方側の端部に、例えば硬質部材３３を気密に接合して貫通流路３１を第２収容部２１の内部と連通させてもよい。
It should be noted that the above embodiment can be appropriately modified within the scope of the present invention.
In the above embodiments, mononuclear cells were described as an example of target cells, but there is no particular limitation as long as the cells can be sedimented and cell-concentrated by centrifuging the cell suspension. For example, they may be floating cells or adherent cells, cultured cells cultured by various techniques, or various cell spheroids.
In the above-described embodiment, as the
さらに上記実施形態では、排出部１２として、硬質部材３３の流路３１を弾性部材３５で閉塞してキャップ３７で密封した構造と、クレンメ等のクリップ３９で第２収容部２１の端部を加圧して閉鎖した構造と、との両方を設けた例について説明したが、何れか一方の構造のみを設けることも可能である。
また排出部１２は開閉可能な構成としてもよく、例えばスクリューキャップによる開閉機構、針通栓、閉塞栓付コネクタなどとし、排出部１２と第２収容部２１との間で外側から閉塞する構成とすることも可能である。その場合、排出部からの漏れを確実に防止することができ、排出部１２に高い遠心力がかかる場合に有効である。
さらに、上記実施形態では、第２収容部２１の長さが比較的短いものについて説明したが、第２収容部２１を主として可撓性チューブで構成する場合、第２収容部２１として、より長い可撓性チューブを採用することも可能である。遠心分離機にセットするときには、可撓性チューブからなる第２収容部２１が閉塞されないように曲げて、排出部１２を容器の上方や遠心分離時の回転中心側の位置に保持し、その状態で遠心分離するようにしても良い。この場合、排出部１２が容器上方や遠心分離時の回転中心方向に位置するので、排出部１２に掛かる遠心力を緩和することができる。
Furthermore, in the above-described embodiment, the
The
Furthermore, in the above-described embodiment, the length of the
次に、本発明の実施例について説明する。
図１に示すような細胞濃縮用容器１０を用い、末梢血から単核球を濃縮及び回収した。
細胞濃縮用容器１０は、第１収容部１７がエチレン酢酸ビニル共重合体のフィルムからなり、第２収容部２１がポリ塩化ビニルのチューブからなり、接合部２３がポリエチレンの成形体からなる。この細胞濃縮用容器１０は予めガンマ線照射により滅菌した。
Next, examples of the present invention will be described.
Mononuclear cells were concentrated and recovered from peripheral blood using a
In the
針２１ＧセーフタッチＰＳＶセット（商標）を用いて、ＣＰＤＡ液入り血液バッグに１２０ｍＬ末梢血を採取した。なお、ＣＰＤＡ液入り血液バッグには、ＣＰＤＡ液１６．８ｍＬが入っていた。
末梢血５ｍＬをサンプリングして血液成分測定を行い、白血球数、リンパ球数、単球数を測定した。白血球数、リンパ球数から末梢血１１０ｍＬ中の総単核球数を計算したところ、有核細胞数は６７００ｃｅｌｌｓ／μＬで、１２０ｍＬ中では８０４ｃｅｌｌｓ×１０６／１２０ｍＬであった。また単核球数は２７７０ｃｅｌｌｓ／μＬで、１２０ｍＬ中で３３２．４ｃｅｌｌｓ×１０６／１２０ｍＬであった。
120 mL peripheral blood was collected into blood bags containing CPDA fluid using a needle 21G SafeTouch PSV Set™. The blood bag containing the CPDA liquid contained 16.8 mL of the CPDA liquid.
5 mL of peripheral blood was sampled to measure blood components, and white blood cell count, lymphocyte count, and monocyte count were measured. When the total mononuclear cell count in 110 mL of peripheral blood was calculated from the white blood cell count and lymphocyte count, the nucleated cell count was 6700 cells/μL, and 804 cells×10 6 /120 mL in 120 mL. The mononuclear cell count was 2770 cells/μL, which was 332.4 cells×10 6 /120 mL in 120 mL.
ＣＰＤＡ液入り血液バッグのＣＰＤＡ液含有末梢血１３６．８ｍＬから、１２０ｍＬを遠心分離機（ＳＥＰＡＸ２、商標）の分離に用いることから、遠心分離機（ＳＥＰＡＸ２、商標）での分離前の末梢血１１０ｍＬに含まれる細胞数は、それぞれ有核細胞数が６４６．５ｃｅｌｌｓ×１０６／１１０ｍＬで、単核球数が２６７．３ ｃｅｌｌｓ×１０６／１１０ｍＬとなった。 From 136.8 mL of CPDA liquid-containing peripheral blood in the blood bag containing CPDA liquid, 120 mL is used for separation by the centrifuge (SEPAX2, trademark), so that 110 mL of peripheral blood before separation by the centrifuge (SEPAX2, trademark) The number of cells contained was 646.5 cells×10 6 /110 mL for nucleated cells and 267.3 cells×10 6 /110 mL for mononuclear cells.
遠心分離機（ＳＥＰＡＸ２、商標）により単核球の分離及び回収を行った。
ＣＰＤＡ液含有末梢血１２０ｍＬ（末梢血量は１１０ｍＬ）、ヒトリンパ球分離用媒体（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ １．０７３、ＧＥヘルスケア社製、商標）１００ ｍＬ、生理食塩水１０００ｍＬを用いて、遠心分離機（ＳＥＰＡＸ２、商標）にセットし、単核球の分離の工程プログラムを実行して、回収用バッグに４５ｍＬの単核球懸濁液を回収した。
Separation and recovery of mononuclear cells was performed by a centrifuge (SEPAX2™).
CPDA solution-containing peripheral blood 120 mL (peripheral blood volume is 110 mL), human lymphocyte separation medium (Ficoll-Paque PREMIUM 1.073, GE Healthcare, trademark) 100 mL, physiological saline 1000 mL, centrifuge (SEPAX2™), the mononuclear cell isolation process program was run, and 45 mL of mononuclear cell suspension was collected in a collection bag.
詳細には、ヒトリンパ球分離用媒体９１ｍＬを遠心チャンバーへ導入し、ＣＰＤＡ液含有末梢血を遠心チャンバーに導入し、合計量２１１ｍＬとし、１５分間、所定の遠心力を印加し、遠心分離を行った。バフィーコート及び血漿を退避用バッグへ一時退避させて、赤血球を廃棄した。 Specifically, 91 mL of the human lymphocyte separation medium was introduced into the centrifugation chamber, the peripheral blood containing the CPDA solution was introduced into the centrifugation chamber, the total amount was 211 mL, and a predetermined centrifugal force was applied for 15 minutes to perform centrifugation. . The buffy coat and plasma were temporarily evacuated to the evacuation bag, and red blood cells were discarded.
その後、生理食塩水で遠心チャンバーを洗浄した後、退避用バッグからバフィーコート及び血漿を遠心チャンバーへ戻して生理食塩水を加えて遠心分離し、上清みを廃棄した。遠心チャンバーの洗浄及び生理食塩水を加えた遠心分離の操作を２回繰り返した。
生成物に生理食塩水を加えて４５ｍＬにして回収用バッグに収容した。
回収用バッグからシリンジで細胞懸濁液４５ｍＬを回収し、細胞懸濁液２ｍＬを無菌試験用容器にサンプリングして無菌試験に供した。その結果、菌の検出は認められなかった。
Thereafter, after washing the centrifugation chamber with physiological saline, the buffy coat and plasma were returned from the evacuation bag to the centrifugal chamber, physiological saline was added, centrifugation was performed, and the supernatant was discarded. The operation of washing the centrifugation chamber and centrifugation with physiological saline was repeated twice.
The product was made up to 45 mL with saline and placed in a collection bag.
45 mL of the cell suspension was recovered from the recovery bag with a syringe, and 2 mL of the cell suspension was sampled in a sterile test container and subjected to a sterility test. As a result, no bacteria were detected.
また細胞懸濁液１ｍＬをサンプリングし、多項目自動血球分析装置（ＸＮ－Ｓｅｒｉｅｓ、シメックス社製、商標）で血液成分測定を行い、リンパ球数、単球数を測定した。上記データを用いて細胞回収率を算出し、トリパンブルー試薬を用いて細胞生存率を計測した。
その結果、有核細胞数は４２０８ｃｅｌｌｓ／μＬで、４５ｍＬ中では１８９．４ｃｅｌｌｓ×１０６／４５ｍＬであった。単核球数は３９７０ｃｅｌｌｓ／μＬで、４５ｍＬ中では１７８．７ｃｅｌｌｓ×１０６／４５ｍＬ、４２ｍＬ中では１６６．７ｃｅｌｌｓ×１０６／４２ｍＬであった。
In addition, 1 mL of the cell suspension was sampled, and blood components were measured using a multi-item automatic blood cell analyzer (XN-Series, Simex Co., Ltd., trademark) to measure the lymphocyte count and monocyte count. Cell recovery was calculated using the above data, and cell viability was measured using trypan blue reagent.
As a result, the number of nucleated cells was 4208 cells/μL, and 189.4 cells×10 6 /45 mL in 45 mL. The mononuclear cell count was 3970 cells/μL, 178.7 cells×10 6 /45 mL in 45 mL and 166.7 cells×10 6 /42 mL in 42 mL.
細胞回収率を計算すると（１７８．７ ｃｅｌｌｓ×１０６）／（２６７．３ｃｅｌｌｓ×１０６）×１００で６６．８％となった。また生存率は９９．５％であった。
なお細胞懸濁液４５ｍＬの一部を無菌試験用容器にサンプリングして無菌試験に供したところ、菌の検出は認められなかった。
The cell recovery rate was calculated as (178.7 cells×10 6 )/(267.3 cells×10 6 )×100, which was 66.8%. Moreover, the survival rate was 99.5%.
When a portion of 45 mL of the cell suspension was sampled in a sterility test container and subjected to a sterility test, no bacteria were detected.
次に、図１に示すような細胞濃縮用容器１０を用いて細胞濃縮を行った。
細胞懸濁液４２ｍＬを収容した細胞濃縮用容器１０に８３ｍＬの生理食塩水を注入し、全量１２５ｍＬとした。細胞濃縮用容器１０を図３に示す形状保持アダプタを装着してテーブルトップ冷却遠心機 ５５００（株式会社久保田製作所製）にセットし、２０度に設定したうえで、６５０Ｇで１０分間遠心分離して細胞濃縮を行った。細胞濃縮後に液漏れがないことを確認した。
Next, cell concentration was performed using a
83 mL of physiological saline was injected into the
細胞濃縮後、沈殿した細胞が散らないよう注意し、懸垂部１５を利用して細胞濃縮用容器１０を吊り下げ、第１収容部１７の外側からクランプ５１で図１に仮想線で示すように横断する位置を挟むことで、第１収容部１７の内部と第２収容部２１の内部とを液密に仕切り、第２収容部２１に細胞濃縮液を収容した。
このときクランプ５１から排出部１２までの第２収容部２１に収容される細胞濃縮液の液量が４ｍＬ以下になるようにした。
After cell concentration, be careful not to scatter the precipitated cells, suspend the
At this time, the liquid volume of the cell concentrate stored in the
第１収容部１７の他端部に設けられた連結チューブ１３からクランプ５１上部の上清みを抜き取った。
この上清みからエンドトキシン測定用サンプルを回収し、エンドトキシン測定システム（Ｅｎｄｏｓａｆｅ(R)－ＰＴＳ （ＰＴＳ１００）、登録商標、和研薬株式会社製）によりエンドトキシン量を測定したところ、測定値が０．０５ ＥＵ／ｍＬ未満であり、日本薬局方の髄腔に投与する医薬品の基準のエンドトキシン値を満足するものであった。なおＳａｍｐｌｅ ＲＴ ＣＶは０％、Ｓｐｉｋｅ ＲＴ ＣＶは１０．６％、Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙは９２％であった。
The supernatant above the
A sample for endotoxin measurement was collected from this supernatant, and the amount of endotoxin was measured using an endotoxin measurement system (Endosafe(R)-PTS (PTS100), registered trademark, manufactured by Wakenyaku Co., Ltd.), and the measured value was 0.00. 05 EU/mL, which satisfies the Japanese Pharmacopoeia standard endotoxin value for drugs administered into the intrathecal cavity. Sample RT CV was 0%, Spike RT CV was 10.6%, and Spike Recovery was 92%.
その後、クランプ５１を外して濃縮細胞をタッピング等で外部から解して懸濁させた。
シリンジを排出部１２の先端から挿入して弾性部材３５を貫通させ、シリンジの先端開口４１ａを第２収容部２１の内部における弾性部材３５の隣接位置に配置し、細胞懸濁液をシリンジで抜き取った。シリンジ内の細胞懸濁液の体積を測定したところ、採取量は４ｍＬであった。
After that, the
A syringe is inserted from the tip of the
得られた細胞濃縮液の単核球数を測定した。
シリンジ内の細胞懸濁液の一部をサンプリングし、多項目自動血球分析装置（ＸＮ－Ｓｅｒｉｅｓ、シメックス社製、商標）で血液成分測定を行い、リンパ球数、単球数を測定した。上記データを用いて単核球の細胞回収率を算出し、トリパンブルー試薬を用いて細胞生存率を計測した。
その結果、有核細胞数は４０３０４ｃｅｌｌｓ／μＬで、４ｍＬ中では１６１．２ｃｅｌｌｓ×１０６／４ｍＬであった。単核球数は３７８５１ｃｅｌｌｓ／μＬで、４ｍＬ中では１５１．４ｃｅｌｌｓ×１０６／４ｍＬであった。
The mononuclear cell count of the obtained cell concentrate was measured.
A portion of the cell suspension in the syringe was sampled, and blood components were measured using a multi-item automatic blood cell analyzer (XN-Series, manufactured by Simex Co., Ltd., trademark) to determine the number of lymphocytes and monocytes. Using the above data, the cell recovery rate of mononuclear cells was calculated, and the cell viability was measured using the trypan blue reagent.
As a result, the number of nucleated cells was 40304 cells/μL, which was 161.2 cells×10 6 /4 mL in 4 mL. The mononuclear cell count was 37851 cells/μL and 151.4 cells×10 6 /4 mL in 4 mL.
細胞回収率を計算すると、（１５１．４ｃｅｌｌｓ×１０６）／（１６６．７ｃｅｌｌｓ×１０６）×１００＝９０．８％となった。また生存率は９９％であった。
なお、シリンジ内の細胞濃縮液の一部を無菌試験用容器にサンプリングして無菌試験に供したところ、菌の検出は認められなかった。
The cell recovery rate was calculated as (151.4 cells×10 6 )/(166.7 cells×10 6 )×100=90.8%. Moreover, the survival rate was 99%.
When a portion of the cell concentrate in the syringe was sampled in a sterility test container and subjected to a sterility test, no bacteria were detected.
以上における各工程での細胞数と細胞回収率と細胞生存率とを表１にまとめた。
またエンドトキシン測定量及び無菌試験結果を表２にまとめた。
表１から明らかなように、末梢血から遠心分離機（ＳＥＰＡＸ２、商標）で単核球懸濁液を回収し、細胞濃縮用容器１０により単核球濃縮液の回収を行ったところ、４mL以下で回収することができ、細胞回収率は９０．８％と高回収率であった。
末梢血採取後、遠心分離機（ＳＥＰＡＸ２、商標）での細胞分離、細胞濃縮用容器１０での細胞濃縮、最終製品であるシリンジへの充填において、安全性の確認として、エンドトキシン測定、無菌試験を実施したが、特に問題となる結果は無かった。
As is clear from Table 1, when a mononuclear cell suspension was collected from peripheral blood with a centrifuge (SEPAX2, trademark) and a mononuclear cell concentrate was collected with the
After peripheral blood collection, cell separation in a centrifuge (SEPAX2, trademark), cell concentration in the
１０ 細胞濃縮用容器
１１ 容器本体
１２ 排出部
１３ 連結チューブ
１５ 懸垂部
１７ 第１収容部
１９ 底部
２１ 第２収容部
２３ 接合部
２５ 縮小部
２７ 筒部
２９ 先端
３１ 流路
３３ 硬質部材
３５ 弾性部材
３７ キャップ
３９ クリップ
４１ 抜取具
４１ａ 先端開口
４３ スリット
４５ アダプタ
４７ 外周面
４８ 傾斜面
４９ 内部配置部
５１ クランプ
10
Claims (6)
前記容器本体は、第１収容部と、前記第１収容部の前記一端側の底部に該第１収容部と連通して設けられて前記細胞濃縮液が貯留される第２収容部と、を有し、
前記第１収容部の一端側には、該第１収容部の軸に沿って幅が縮小する縮小部が設けられることで前記底部が前記第２収容部側に向けて下り勾配に形成され、
前記第２収容部は、クリップにより外側から圧迫して密封可能であるとともに閉塞されないように曲げることが可能な可撓性チューブにより形成され、接合部を介して前記第１収容部の前記縮小部の端部に接合され、
前記接合部は、成形体からなり、前記第１収容部の内側に収容されて気密に接合されるとともに前記第１収容部の軸方向に突出した筒部に前記第２収容部が外嵌して気密に接合され、
前記排出部は、前記第２収容部の前記一端部に流路を有する硬質部材を備えていて、前記流路が抜取具を貫通させて前記細胞濃縮液を抜き取り可能な弾性部材により閉塞されている、細胞濃縮用容器。 A flexible container body has a discharge part at one end, and a cell suspension containing target cells is contained in a sealed state and centrifuged to precipitate the target cells at one end. A cell concentration container in which a concentrate is produced,
The container body includes a first storage part, and a second storage part provided at the bottom of the first storage part on the one end side so as to communicate with the first storage part and in which the cell concentrate is stored. have
At one end side of the first housing portion, a reduced portion whose width is reduced along the axis of the first housing portion is provided so that the bottom portion slopes downward toward the second housing portion ,
The second housing portion is formed of a flexible tube that can be sealed by pressing from the outside with a clip and that can be bent so as not to be closed. is joined to the end of the
The joint portion is made of a molded body, is housed inside the first housing portion and is airtightly joined, and the second housing portion is externally fitted to a cylindrical portion protruding in the axial direction of the first housing portion. are hermetically joined,
The discharge part includes a hard member having a flow path at the one end of the second storage part, and the flow path is closed by an elastic member that allows an extraction tool to penetrate and extract the cell concentrate. A container for cell concentration.
前記細胞濃縮用容器に細胞懸濁液を収容して密封し、 housing and sealing the cell suspension in the container for cell concentration,
前記第１収容部の側周面を支持する内周面と、前記第１収容部の前記縮小部を支持する傾斜面と、前記第２収容部及び前記排出部を配置する内部配置部と、を有するアダプタに、前記第２収容部を巻回するように曲げた状態で収容するとともに前記細胞濃縮用容器を支持させて遠心分離機に装着し、 an inner peripheral surface that supports the side peripheral surface of the first accommodating portion, an inclined surface that supports the reduced portion of the first accommodating portion, an internal arrangement portion that arranges the second accommodating portion and the discharging portion; The second storage part is accommodated in a wound state in an adapter having a
遠心分離を行って前記第２収容部に細胞濃縮液を生成させ、 Centrifuging to generate a cell concentrate in the second container,
前記抜取具の先端開口を前記弾性部材の隣接位置に配置して前記第２収容部内の細胞濃縮液を抜き取ることで細胞濃縮液を得る、細胞濃縮方法。 A cell concentration method, wherein a cell concentrate is obtained by extracting the cell concentrate from the second container with the tip opening of the extraction tool positioned adjacent to the elastic member.
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