JP7224629B2

JP7224629B2 - 薬物代謝機能測定方法

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Publication number: JP7224629B2
Application number: JP2019026657A
Authority: JP
Inventors: 惠一川井; 正和小林; 明日香水谷
Original assignee: Kanazawa University NUC
Current assignee: Kanazawa University NUC
Priority date: 2019-02-18
Filing date: 2019-02-18
Publication date: 2023-02-20
Anticipated expiration: 2039-02-18
Also published as: JP2020134272A

Description

薬物等の代謝物を利用した薬物代謝機能測定方法に関する。

薬物は生体内で吸収（absorption）・分布（distribution）・代謝（metabolism）・排泄（excretion）と、それぞれの頭文字からＡＤＭＥと呼ばれる動態を示す。中でも、薬物代謝は生体にとって異物である医薬品を体外に排出しやすくする重要な機能である。医薬品の代謝は、生体内の様々な薬物代謝酵素によって進行する。薬物代謝酵素の活性は個人差があり、活性の高低によって代謝反応の程度が変化する。そのため、医薬品を同量投与した場合でもその薬効や副作用の発現は個々人で異なる。よって、患者個々の薬物代謝酵素の活性を定量した上で医薬品の投与量を決定することができれば、薬物療法の個別化におけるＥＢＭ（evidence based medicine）の観点から非常に有用である。現在、遺伝子多型として薬物代謝酵素の欠損や機能低下が存在することが知られており、遺伝子検査によって診断することができる。しかし、遺伝子検査によって判定できるのはあくまで個人が生来持っている個体差のみの評価である。薬物代謝酵素活性の個人差は遺伝子多型のみを要因とするものではない。ひとつの薬物代謝酵素に対してその基質となる医薬品は多数存在するため、特定の薬物代謝酵素に対してその基質となる医薬品が同時に２種類以上存在した場合、競合して代謝の阻害が起こる。このような多剤併用による薬物相互作用もまた、薬物代謝酵素の活性の個体差要因となりえる。

一般に放射性医薬品は、標的組織における滞留機序としての代謝以外には代謝反応を受けないことを前提に設計されている。心筋血流製剤であるヘキサキス（２－メトキシイソブチルイソニトリル）テクネチウム（^９９ｍＴｃ）（^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩ）は、２－メトキシイソブチルイソニトリルと放射性金属との錯体の１種であるが、当該化合物も生体内では分解されず、未変化体として腎尿路系及び肝胆道系によって排泄されると考えられている（非特許文献１）。

カーディオライト第一添付文書 2018年10月改訂 (第11版)

本発明の課題は、簡便な手段により、薬物代謝機能を測定できる薬物代謝機能測定方法を提供することである。

本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）２－メトキシイソブチルイソニトリルの放射性標識体を投与された被検者の試料に含まれる前記放射性標識体の放射性代謝物を分析することを含む薬物代謝機能の測定方法。
（２）薬物代謝機能がシトクロムＰ４５０による薬物代謝機能である前記（１）に記載の方法。
（３）シトクロムＰ４５０がＣＹＰ３Ａ４である前記（２）に記載の方法。
（４）前記放射性標識体が２－メトキシイソブチルイソニトリルと放射性金属との錯体である前記（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）２－メトキシイソブチルイソニトリルと放射性金属との錯体がヘキサキス（２－メトキシイソブチルイソニトリル）テクネチウム（^９９ｍＴｃ）である前記（４）に記載の方法。
（６）薬物の適正投与量を決定するために行う前記（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）被検者の代謝異常を検査するために行う前記（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（８）被検者の試料が血液、血清又は血漿から得られる試料である前記（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）２－メトキシイソブチルイソニトリルの放射性標識体を含有するシトクロムＰ４５０による薬物代謝機能を測定するための検査薬。
（１０）シトクロムＰ４５０がＣＹＰ３Ａ４である前記（９）に記載の検査薬。

本発明の薬物代謝機能測定方法は、代謝物の構造等が不明であっても適用でき、かつ適用範囲が広い。

図１は医薬品の代謝に関与する各ＣＹＰ分子種の割合を示す。図２はヒト肝ミクロゾーム中での^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩ代謝実験の結果を示す。図３はヒト肝ミクロゾーム中の^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩ放射性代謝物ＴＬＣ分析における未変化体と代謝物の経時変化を示す。図４はヒト肝ミクロゾームを用いた^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩ代謝実験における各種阻害剤負荷時の未変化体及び放射性代謝物の生成量の変化を示す（左：１５分、右：６０分）。図５はＣＹＰ３Ａ４特異的阻害剤ketoconazole負荷濃度における代謝物の生成量変化を示す。

本発明の薬物代謝機能の測定方法に用いる放射性標識体としては、２－メトキシイソブチルイソニトリルの放射性標識体であれば、特に制限はなく、例えば、シトクロムＰ４５０により代謝され、放射性代謝物を生じるもの、好ましくは、ＣＹＰ３Ａ４により代謝され、放射性代謝物を生じるものが挙げられる。

ＣＹＰ３Ａ４により代謝され、放射性代謝物を生じる放射性標識体としては、例えば、２－メトキシイソブチルイソニトリルと放射性金属との錯体、２－メトキシイソブチルイソニトリルに放射性核種を導入した放射性標識体が挙げられる。

前記２－メトキシイソブチルイソニトリルと放射性金属との錯体の製造に用いる放射性金属としては、例えば^５１Ｃｒ、^５９Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^４７Ｓｃ、^８８Ｙ、^８６Ｙ、^９０Ｙ、^８１Ｒｂ、^８９Ｓｒ、^９７Ｒｕ、^９９ｍＴｃ、^１０３Ｒｕ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１１１Ｉｎ、^１１７ｍＳｎ、^１４１Ｃｅ、^１４０Ｌａ、^１４９Ｐｍ、^１５３Ｓｍ、^１６１Ｔｂ、^１６５Ｄｙ、^１６６Ｄｙ、^１６６Ｈｏ、^１６７Ｔｍ、^１６８Ｙｂ、^１７５Ｙｂ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２０１Ｔｌ、^２０３Ｐｂ、^２１１Ｂｉ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２１４Ｂｉ及び^２２５Ａｃが挙げられる。

前記錯体以外の放射性標識体を合成するために用いる放射性核種としては、例えば^３Ｈ、^１１Ｃ、^１４Ｃ、^１５Ｏ、^１８Ｆ、^３２Ｐ、^８１ｍＫｒ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１３３Ｘｅ及び^２１１Ａｔが挙げられる。

本発明に用いる放射性標識体としては、心筋疾患診断薬等として市販されており、安全性が確認されている点から、ヘキサキス（２－メトキシイソブチルイソニトリル）テクネチウム（^９９ｍＴｃ）が好ましい。

本発明の薬物代謝機能の測定方法においては、目的に応じて、基質となる放射性標識体を１種又は２種以上を用いる。

分析対象物である放射性代謝物の形態としては、有機物、無機物、イオンのいずれでもよいが、分析の容易性の点で有機物が好ましい。

本発明における放射性標識体の投与経路としては、静脈内、皮内、皮下、経口、経粘膜、及び直腸投与などが挙げられる。被検者の試料としては、例えば血液、血清、血漿、尿、唾液又はその他体液、好ましくは血液、血清、血漿が挙げられる。

放射性標識体の投与形態としては、投与経路に適した剤形であれば、注射剤、液剤、錠剤等から適宜選択すればよく、本発明の作用及び効果を損なわない限り、薬学的に許容される担体、又は剤形によって当該技術分野において一般的に使用される添加剤を更に含んでもよい。添加剤として、例えば、着色剤、保存剤、風味剤、香り改善剤、呈味改善剤、甘味剤、又は安定剤、その他薬学的に許容される添加剤を含有することができる。

放射性標識体の投与量は、投与方法、投与する化合物ならびに患者の年齢、性別及び体重によって、適宜決定すればよい。

本発明の測定方法においては、放射性標識体を投与した被検者の試料に含まれる前記放射性標識体の放射性代謝物を分析する。前記放射性代謝物の分析は、例えば、親化合物（未変化体）の放射性標識体と前記放射性代謝物とを分離して、前記放射性代謝物の放射能を測定することにより行うことができる。

脂溶性の放射性標識体は、代謝されることにより水溶性の放射性代謝物を生じることが多く、このような場合には、例えばオクタノール抽出法により親化合物（未変化体）の放射性標識体と前記放射性代謝物とを分離することができる。また、薄層クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー等によっても、親化合物（未変化体）の放射性標識体と前記放射性代謝物とを分離することができる。

本発明の測定方法によれば、一般的な放射性診断薬においては夾雑物とされている放射性代謝物を解析することにより、各種代謝異常、例えばＣＹＰ、特にＣＹＰ３Ａ４の異常を見つけることができ、また、代謝物を見ることにより、ＣＹＰ分子種ごとの遺伝子を調べることなく、ＣＹＰファミリー全体として代謝プロファイルができ、また薬物の適正投与量を決定できる。

本発明の測定方法は、放射性代謝物を分析するので、非標識代謝物を分析する場合に比較して、非常に低い投与量でも十分な効果を発揮することができ、更に、内因性の代謝物と容易に区別することもできる。

本発明に用いる放射性標識体はＣＹＰ３Ａ４により選択的に代謝される。したがって、本発明に用いる放射性標識体は、ＣＹＰ、特にＣＹＰ３Ａ４による薬物代謝機能を測定するための検査薬として用いることができる。

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
Ｉ．実験材料と方法
（Ａ）ヒト肝ミクロゾーム中での^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩ代謝実験
グルコース－６－リン酸（ナカライテスク）及びβ－ＮＡＤＰ^＋（ナカライテスク）を、精製水にそれぞれ１３３．３ｍＭ、１２．２ｍＭとなるように溶解した。ＭｇＣｌ_２（ナカライテスク）を１．０Ｍに調整した。グルコース－６－リン酸水溶液５３６μＬ、β－ＮＡＤＰ^＋水溶液４８２．４μＬを混合し、１．０ＭＭｇＣｌ_２５３．６μＬ及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ナカライテスク）１０．７２μＬを添加した。これらをＮＡＤＰＨ生成系とし、混和後は使用まで氷冷した。ＮＡＤＰＨはＣＹＰによる代謝のエネルギー源となるため、ＮＡＤＰＨ生成系添加の有無により代謝物のＮＡＤＰＨ依存性を判断することで、代謝反応のＣＹＰの関与を明らかにできる。

１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、ヒト肝ミクロゾーム（50-donor pool, BD Biosciences）、ＮＡＤＰＨ生成系、精製水を表１に示した組成に調整してよく混和し、ＮＡＤＰＨ生成系を添加したものをＮＡＤＰＨ（＋）サンプルとした。一方、ＮＡＤＰＨ生成系を加えず、精製水で置き換えたサンプルを同様に用意し、ＮＡＤＰＨ（－）サンプルとした。それぞれに１．５ＭＢｑ／１０μＬとなるように調整した^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩ（日本メジフィジックス）を加えた後、３７℃で加温して反応させた。反応時間は、５、１５、３０、６０分とし、エタノール５０μＬを加えて反応を停止させた。

各サンプルを１５０００ｒｐｍ、４℃で５分遠心分離し、その上清を分取した。この上清をtotal countsが等しくなるように固定相：シリカゲル薄層板（Silica gel 60 RP-18 F_254s, Merck）、移動相：アセトニトリル：メタノール：０．５Ｍ酢酸アンモニウム：ＴＨＦ＝４：３：２：１でＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）により分析した。また、あらかじめ、エタノールを添加して酵素を失活させたサンプルに^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩとその標識原料である^９９ｍＴｃＯ_４ ^－を同様にＴＬＣ分析したものを標準としてＲｆ値を比較した。

（Ｂ）ヒト肝ミクロゾーム中での^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩ代謝阻害実験
図１に医薬品の代謝に関与する各ＣＹＰ分子種の割合を示す（文献２：Williams JA, Hyland R, Jones BC, et al: Drug-drug interactions for UDP-glucuronosyltransferase substrates: a pharmacokinetic explanation for typically observed low exposure (AUCi/AUC) ratios. Drug Metab Dispos 32 (11): 1201-1208, 2004）。本実験では、現在臨床利用されている医薬品の８割以上の代謝に関わるＣＹＰ分子種５０種類以上存在する中でも、図１に示す医薬品代謝の９割以上を占めるＣＹＰ分子種６種類の評価を行った。それぞれのＣＹＰ分子種に対する特異的阻害剤を表２に示す。各種阻害剤は１０μＭ（ジメチルスルホキシド０．８％ｖ／ｖ終濃度）になるようにそれぞれ調整した（文献３－１１）。また、ＣＹＰ３Ａ４阻害剤であるketoconazoleは０．１、１μＬ（ジメチルスルホキシド０．８％ｖ／ｖ終濃度）となるように別に調製した。

１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、ヒト肝ミクロゾーム、ＮＡＤＰＨ生成系、精製水、阻害剤溶液を表１に示した組成に調整してよく混和し、１．５ＭＢｑ／１０μＬとなるように調整した^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩを添加した後、３７℃で加温して反応させた。反応時間は、１５、６０分とし、エタノール５０μＬを加えて反応を停止させた。

各サンプルを１５０００ｒｐｍ、４℃で５分遠心分離し、その上清を分取した。この上清を前記（Ａ）と同様の条件でＴＬＣ分析した。

文献３－１１：
3) Kim MJ, Kim H, Cha IJ, et al: High-throughput screening of inhibitory potential of nine cytochrome P450 enzymes in vitro using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 19 (18): 2651-2658, 2005.
4) Bourrie M, Meunier V, Berger Y, et al: Role of cytochrome P-450 2C9 in irbesartan oxidation by human liver microsomes. Drug Metab Dispos 27 (2): 288-296, 1999.
5) Dinger J, Meyer MR, Maurer HH: Development of an in vitro cytochrome P450 cocktail inhibition assay for assessing the inhibition risk of drugs of abuse. Toxicol Lett 230 (1): 28-35, 2014.
6) Xu C, Desta Z: In vitro analysis and quantitative prediction of efavirenz inhibition of eight cytochrome P450 (CYP) enzymes: major effects on CYPs 2B6, 2C8, 2C9 and 2C19. Drug Metab Pharmacokinet 28 (4): 362-371, 2013.
7) Turpeinen M, Uusitalo J, Jalonen J, et al: Multiple P450 substrates in a single run: rapid and comprehensive in vitro interaction assay. Eur J Pharm Sci 24 (1): 123-132, 2005.
8) Zhao XJ, Koyama E, Ishizaki T: An in vitro study on the metabolism and possible drug interactions of rokitamycin, a macrolide antibiotic, using human liver microsomes. Drug Metab Dispos 27 (7): 776-785, 1999.
9) Cho DY, Bae SH, Lee JK, et al: Selective inhibition of cytochrome P450 2D6 by Sarpogrelate and its active metabolite, M-1, in human liver microsomes. Drug Metab Dispos 42 (1): 33-39, 2014.
10) Wang L, Zhang D, Raghavan N, et al: In vitro assessment of metabolic drug-drug interaction potential of apixaban through cytochrome P450 phenotyping, inhibition, and induction studies. Drug Metab Dispos 38 (3): 448-458, 2010.
11) Zhou XW, Ma Z, Geng T, et al: Evaluation of in vitro inhibition and induction of cytochrome P450 activities by hydrolyzed ginkgolides. J Ethnopharmacol 158PtA: 132-139, 2014.

II．結果と考察
（Ａ）ヒト肝ミクロゾーム中での^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩ代謝実験
１５、６０分反応させたＮＡＤＰＨ（＋）サンプル及びＮＡＤＰＨ（－）サンプルをＴＬＣ分析した結果をそれぞれ図２（ａ）、（ｂ）に示す。^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩ、^９９ｍＴｃＯ_４ ^－のＲｆ値確認のために標準サンプルを展開した結果、Ｒｆ値はそれぞれ０．２５～０．３０、０．９０～０．９５であった。図２（ａ）より、反応１５分ではＲｆ値０．４０～０．５５と０．６０～０．７５に放射性代謝物の画分が確認できた。６０分ではＲｆ値０．６０～０．８０に放射性代謝物の画分が確認できた。代謝物のうち、Ｒｆ値が０．５付近の画分をＭ１、０．７付近の画分をＭ２と呼ぶこととする。また図２（ｂ）より、ＮＡＤＰＨ（－）サンプルでは代謝物の画分は確認できなかった。以上の結果から^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩの代謝物生成にはＮＡＤＰＨ依存性があることから、^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩの代謝にＣＹＰの関与が確認された。未変化体と代謝物の経時変化を図３に示す。一度生成されたＭ１が１５分を境に減少するとともにＭ２は時間経過に伴い増加することから、^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩの代謝反応が１段階目にＭ１へと代謝され、２段階目にＭ２へと代謝される直列型であることが推測された。

（Ｂ）ヒト肝ミクロゾーム中での^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩ代謝阻害実験
ヒト肝ミクロゾームを用いた^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩ代謝実験における各種阻害剤負荷時の未変化体及び放射性代謝物の生成量の変化を図４に示す。ＮＡＤＰＨ（－）、ＣＹＰ３Ａ４特異的阻害剤であるketoconazole負荷の両サンプルにおいて代謝物生成が有意水準０．０１で有意に減少していることが確認できた。更に、図３で示した代謝物Ｍ１生成量が最大の１５分においても前記２サンプルは代謝阻害効果が顕著である。代謝終期の６０分においても同様に非常に顕著な阻害効果が確認できた。従って、直列型であると推測された^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩの代謝においてＣＹＰ３Ａ４は代謝第１段階の^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩからＭ１への代謝に関与していることが考えられた。

ＣＹＰ３Ａ４特異的阻害剤であるketoconazole負荷における代謝阻害効果が確認できたため、各負荷濃度における放射性代謝物の生成量の変化を検討し、図５に示した。ketoconazole負荷濃度の増加に伴って^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩの放射性代謝物生成が減少していることが確認できた。本実験において、ＣＹＰによる代謝を受けた^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩの放射性代謝物は、ＣＹＰ３Ａ４の特異的阻害剤であるketoconazoleを負荷することで代謝阻害を受けることが明らかとなった。更に、^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩの代謝物の生成量がＣＹＰ３Ａ４活性に依存していることから、^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩの放射性代謝物量を定量することで、ＣＹＰ３Ａ４活性を評価できると考えられた。

III．結語
^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩを用いたin vitro代謝物分析の結果、ヒト肝ミクロゾーム中においてＮＡＤＰＨ依存性の放射性代謝物の生成が確認されたため、^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩはＣＹＰによって代謝を受けることが明らかとなった。更に、ＣＹＰ分子種に対する特異的阻害剤負荷実験を行った結果、ＣＹＰ３Ａ４特異的阻害剤であるketoconazole負荷によって^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩの代謝反応が抑制されたため、^９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩの代謝第１反応がＣＹＰ３Ａ４特異的に行われていることが明らかになった。

従って、９９ｍＴｃ－ＭＩＢＩにおける代謝物の排泄経路を確認すると共に、その代謝物生成量を簡便に定量する手法を確立することで（文献１２：Nishi K, Mizutani A, Shikano N, et al: In vivo radioactive metabolite analysis for individualized medicine: A basic study of a new method of CYP activity assay using 123I-IMP. Nuclear Medicine and Biology 42 (2): 171-176, 2015）、図１に示す通り医薬品代謝のおよそ半数を占めるＣＹＰ３Ａ４活性を評価できる可能性が示された。

Claims

２－メトキシイソブチルイソニトリルの放射性標識体を投与された被検者の試料に含まれる前記放射性標識体の放射性代謝物を分析することを含む薬物代謝機能の測定方法。
薬物代謝機能がシトクロムＰ４５０による薬物代謝機能である請求項１記載の方法。
シトクロムＰ４５０がＣＹＰ３Ａ４である請求項２記載の方法。
前記放射性標識体が２－メトキシイソブチルイソニトリルと放射性金属との錯体である請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
２－メトキシイソブチルイソニトリルと放射性金属との錯体がヘキサキス（２－メトキシイソブチルイソニトリル）テクネチウム（^９９ｍＴｃ）である請求項４記載の方法。
薬物の適正投与量を決定するために行う請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
被検者の代謝異常を検査するために行う請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
被検者の試料が血液、血清又は血漿から得られる試料である請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
２－メトキシイソブチルイソニトリルの放射性標識体を含有するシトクロムＰ４５０による薬物代謝機能を測定するための検査薬。
シトクロムＰ４５０がＣＹＰ３Ａ４である請求項９記載の検査薬。