JP7207643B2 - Screening method for continuous culture conditions - Google Patents

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Description

本発明は、連続培養条件のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a method for screening continuous culture conditions.

抗体医薬などのバイオ医薬品は、医薬品タンパクを産生する細胞を培養し、細胞から分泌された医薬品タンパクを精製することで製造される。医薬品タンパク製造用の細胞株の構築では、一般的に、対象となる医薬品タンパクをコードする遺伝子を細胞に導入し、増やして集めた細胞プールから、培養上清中に高効率で医薬品を放出する高効率産生細胞を選別している。 Biopharmaceuticals such as antibody drugs are manufactured by culturing cells that produce pharmaceutical proteins and purifying the pharmaceutical proteins secreted from the cells. In the construction of cell lines for the production of pharmaceutical proteins, a gene encoding the target pharmaceutical protein is generally introduced into cells, and the pooled cells are expanded and collected, and the drug is released into the culture supernatant with high efficiency. Selecting highly efficient producing cells.

医薬品タンパクを製造する細胞の培養方法は、回分培養、流加培養（もしくは半回分培養）、連続培養（もしくは灌流培養）に分類される。
回分培養は、一回ごとに新たな培地を用意し、そこへ細胞株を植えて収穫まで培地を加えない培養法である。回分培養には、培養ごとに品質はバラつくが、コンタミネーションのリスクを分散・低減できるという特徴がある。
流加培養は、培養中に、培地自体や培地中の特定の成分を添加し、培養終了時までその生産物を抜き取らない培養方法である。
連続培養は、連続的に培養系に培地を供給すると同時に同量の培養液を抜き取る培養法である。連続培養には、培養環境を常に一定に保ちやすく、生産性が安定するという特徴がある。 Cell culture methods for producing pharmaceutical proteins are classified into batch culture, fed-batch culture (or semi-batch culture), and continuous culture (or perfusion culture).
Batch culture is a culture method in which a new medium is prepared each time, a cell line is planted there, and no medium is added until harvest. Batch culture has the characteristic of dispersing and reducing the risk of contamination, although the quality varies from culture to culture.
Fed-batch culture is a culture method in which the medium itself or specific components in the medium are added during the culture, and the product is not withdrawn until the end of the culture.
Continuous culture is a culture method in which a culture medium is continuously supplied to a culture system and at the same time, the same amount of culture medium is withdrawn. Continuous culture is characterized by the ability to maintain a constant culture environment and stable productivity.

培養に用いられる細胞株のスクリーニング（選抜・選別）は、実生産に用いられるそれぞれの培養法に合わせ、かつ実生産での培養装置をスケールダウンした培養スクリーニング装置を用いて行うことが望ましい。一般的に、細胞株のスクリーニングは、クローンライブラリーごとに培養試験を行い、それぞれの株の生育率と、目的生産物の産生能力とをあわせたトータルの生産性で評価し、決定される。 Screening (selection/sorting) of cell lines to be used for culture is desirably performed using a culture screening device adapted to each culture method used for commercial production and scaled down from the culture device for commercial production. In general, cell line screening is determined by performing a culture test for each clone library and evaluating the total productivity, which is a combination of the growth rate of each strain and the ability to produce the target product.

培養に用いられる細胞（細胞株）として、例えば、接着系培養細胞であるチャイニーズハムスター卵巣細胞がある。そして、このチャイニーズハムスター卵巣細胞を用いた培養法が、例えば、特許文献１に記載されている。 Cells (cell lines) used for culture include, for example, Chinese hamster ovary cells, which are adherent cultured cells. A culture method using this Chinese hamster ovary cell is described in Patent Document 1, for example.

具体的に、この特許文献１には、タンパク質の製造のためのチャイニーズハムスター卵巣細胞において、その増殖相と製造相とが互いに分離されていることを特徴とする旨が記載されている。また、この特許文献１には、前記細胞が担体表面を集密的に覆った後に遺伝物質の導入を実施する旨や、前記細胞は、特定の生産物の最大の分泌がＧ１相（Ｇ１期）に行われる点で優れている旨記載されている。さらに、この特許文献１には、細胞を多孔質の担体材料上に細胞周期のＧ１期で固定化することによってトラップした後に遺伝物質の導入を実施することが重要である旨記載されている。 Specifically, this Patent Document 1 describes that Chinese hamster ovary cells for protein production are characterized in that their growth phase and production phase are separated from each other. In addition, this Patent Document 1 describes that the genetic material is introduced after the cells confluently cover the surface of the carrier, and that the maximum secretion of a specific product is in the G1 phase (G1 phase). ), it is described that it is superior in that it is performed in Furthermore, this document states that it is important to carry out introduction of genetic material after trapping cells by immobilizing them on a porous carrier material in the G1 phase of the cell cycle.

一方、培養に用いられる細胞（細胞株）として、接着系培養細胞とは別に、浮遊系培養細胞も知られている。浮遊系培養細胞は、前記したような担体材料上に接着しないので、細胞を固定化させることによる細胞周期の制御はできない。浮遊系培養細胞を用いた培養系では、細胞培養を行って細胞を増殖させつつ特定の生産物の生成が行われる。そのため、浮遊系培養細胞を用いた培養系では一般的に、培養中に細胞を含む培養液をサンプリングし、生育率として細胞数および生存率の経時変化を測定し、生産物の生成能力として生産物の濃度の経時変化を測定している。そして、それぞれ細胞増殖速度、生産物生成速度に換算して指標とすることで細胞株の評価を行っている。 On the other hand, in addition to adherent cultured cells, suspension cultured cells are also known as cells (cell lines) used for culture. Suspension-type cultured cells do not adhere to the carrier material as described above, so the cell cycle cannot be controlled by immobilizing the cells. In a culture system using suspension-cultured cells, cell culture is performed to proliferate the cells while producing a specific product. Therefore, in a culture system using suspension-cultured cells, in general, the culture solution containing the cells is sampled during the culture, and the change in cell number and survival rate over time is measured as the growth rate, and the production capacity is measured as the production capacity. It measures changes in the concentration of substances over time. Then, the cell lines are evaluated by converting them into the cell proliferation rate and product production rate, respectively, and using them as indicators.

このような状況下、現在、接着系培養細胞および浮遊系培養細胞について、回分培養および流加培養に対応したスクリーニング用培養装置が各種開発され、広く使用されている。また、回分培養および流加培養では、細胞数密度の低い状態から高い状態まで細胞数を増殖させる。生産物生成速度が同じであれば、増殖が速い方が生産性を示す式１の値が大きくなるので、生産物生成速度および細胞増殖速度ともに高い細胞株が好まれる。そのため、回分培養および流加培養では、細胞増殖速度および生産物生成速度の指標を用いた式１の生産性が最大となる細胞株を選別している。

（生産性）＝∫（生産物生成速度）×（細胞数）ｄｔ ・・・式１
Under such circumstances, currently, various types of screening culturing apparatuses for batch culture and fed-batch culture have been developed and are widely used for adherent cultured cells and suspension cultured cells. In addition, in batch culture and fed-batch culture, the cell number is grown from a state of low cell number density to a state of high cell number density. If the product production rate is the same, the faster the growth, the larger the value of Equation 1, which indicates productivity. Therefore, in batch culture and fed-batch culture, cell lines that maximize the productivity of Equation 1 using the indices of cell growth rate and product production rate are selected.

(Productivity) = ∫ (product production rate) × (number of cells) dt Equation 1

特表２００２－５２７０５７号公報Japanese Patent Publication No. 2002-527057

回分培養および流加培養は、細胞を増殖させながら一定の細胞密度に到達後、生産物を回収する。そのため、細胞株と培養条件のスクリーニングは上記培養期間内で行うことができる。一方、連続培養は、細胞増殖期が終わってから、細胞の状態および生産物の生成が定常状態となり（生産物生成期となり）、その後、生産物回収期が来る。従って、回分培養および流加培養と比較して、生産性のよい連続培養用細胞株と連続培養条件のスクリーニングに長期間を要していた。そのため、連続培養に好適に用いられる細胞株、すなわち、定常状態に達した後の細胞増殖が少なく、細胞増殖速度に対して生産物生成速度が高い細胞株のスクリーニング（最適化した細胞株の選別）は、事実上、困難であった。従って、連続培養の検討においては、前記細胞株の選別とこれに適した連続培養条件を選別する最適化は試みられていなかった。
なお、連続培養において定常状態に達した後の細胞増殖には、余剰細胞の分解によって不純物が増加するだけでなく、細胞分裂回数増加によって変異が発生する可能性があるという問題がある。また、細胞増殖のために必要以上の培地栄養成分と酸素供給が要求される一方で、老廃物と二酸化炭素を除去する必要があるという問題がある。 Batch and fed-batch cultures grow the cells and harvest the product after reaching a certain cell density. Therefore, screening of cell lines and culture conditions can be performed within the above culture period. On the other hand, in continuous culture, after the cell growth phase ends, the state of the cells and the production of products reach a steady state (become a product production phase), and then the product recovery phase comes. Therefore, screening of cell lines for continuous culture with good productivity and continuous culture conditions required a long period of time compared to batch culture and fed-batch culture. Therefore, screening of cell lines suitable for continuous culture, i.e. cell lines with low cell growth after reaching steady state and high product production rate relative to cell growth rate (selection of optimized cell lines ) was practically difficult. Therefore, in the study of continuous culture, no attempt was made to select the cell line and to optimize continuous culture conditions suitable for this.
In continuous culture, cell proliferation after reaching a steady state has the problem that not only impurities increase due to decomposition of surplus cells, but also mutations may occur due to an increase in the number of cell divisions. In addition, there is a problem that waste products and carbon dioxide need to be removed while medium nutrients and oxygen supply more than necessary are required for cell growth.

本発明は前記状況に鑑みてなされたものであり、定常状態に達した後の細胞増殖が少なく、細胞増殖速度に対して生産物生成速度が高い連続培養用細胞株とこれに適した連続培養条件を選別することができる連続培養条件のスクリーニング方法を提供することを課題とする。 The present invention has been made in view of the above-mentioned circumstances, and a cell line for continuous culture that exhibits little cell proliferation after reaching a steady state and has a high product production rate relative to the cell growth rate, and a continuous culture suitable for this An object of the present invention is to provide a screening method for continuous culture conditions that enables selection of conditions.

前記課題を解決するため本発明者等が鋭意検討した結果、生産物生成速度が最大で、かつ不要な細胞増殖を行わない性質を持つ連続培養用細胞株およびこれに適した連続培養条件を選別することで、連続培養による目的物質の生産において生産性が高く、かつ品質が安定している生産物を得ることができることを見出した。すなわち、｛（生産物生成速度）／（細胞増殖速度）｝が大きいことや、細胞周期のＧ０期およびＧ１期の合計期間が最も長いこと、代謝フラックスの分析によって決定された代謝経路の数が最も少ないことなどをスクリーニング時の指標とすることで、連続培養による目的物質の生産において生産性が高く、かつ品質が安定している生産物を得ることができることを見出した。また、スクリーニングの際、定常状態となった後に上記指標を測定することで、製造で行われる培養でも同様の状態を再現させることが可能であることを見出した。本発明はこれらの知見を見出すことにより完成するに至ったものである。 As a result of intensive studies by the present inventors in order to solve the above problems, a cell line for continuous culture that has the property of maximizing the product production rate and does not cause unnecessary cell proliferation and continuous culture conditions suitable for this are selected. By doing so, it was found that a product with high productivity and stable quality can be obtained in the production of the target substance by continuous culture. That is, {(product formation rate)/(cell growth rate)} is large, the total duration of the G0 and G1 phases of the cell cycle is the longest, and the number of metabolic pathways determined by metabolic flux analysis The inventors have found that by using the minimum of , etc. as an index for screening, it is possible to obtain a product with high productivity and stable quality in the production of the target substance by continuous culture. In addition, the present inventors have found that, during screening, by measuring the above indicators after reaching a steady state, it is possible to reproduce a similar state in the culture performed in production. The present invention has been completed by discovering these findings.

本発明に係る前記課題は以下の手段により解決される。
本発明に係る連続培養条件のスクリーニング方法は、｛（生産物生成速度）／（細胞増殖速度）｝が最大になるという指標、前記細胞周期のＧ０期およびＧ１期の合計期間が最も長いという指標、および、前記代謝フラックスの分析によって決定された代謝経路の数が最も少ないという指標のうちから選択される少なくとも一つの指標に基づいて連続培養用浮遊系細胞株を選別するものであり、細胞が定常状態となった後に、前記細胞周期のＧ０期およびＧ１期の合計期間、または、前記代謝フラックスの解析を行う。 The above problems related to the present invention are solved by the following means.
The screening method for continuous culture conditions according to the present invention includes an index that {(product production rate)/(cell growth rate)} is maximized, and an index that the total period of the G0 phase and G1 phase of the cell cycle is the longest. , and the indicator that the number of metabolic pathways determined by the analysis of the metabolic flux is the smallest, selecting a suspension cell line for continuous culture based on at least one indicator , After reaching a steady state, the total duration of the G0 and G1 phases of the cell cycle or the metabolic flux is analyzed .

また、本発明に係る連続培養条件のスクリーニング方法は、実生産に用いられる連続培養装置内で細胞培養するときの連続培養条件をスクリーニングする方法であり、前記連続培養条件を設定して細胞を培養する培養工程と、前記培養工程で培養している培養液をサンプリングし、生産物の濃度と培地成分を分析して分析値を得る分析工程と、前記分析値から細胞の培養状態が定常状態であるか否かを判別する判別工程と、前記培養状態が定常状態であるときに、前記分析値から生産物生成速度、細胞増殖速度、細胞周期、および代謝フラックスのうちの少なくとも１つの解析を行う解析工程と、を複数の培養細胞および連続培養条件で実施し、前記細胞増殖速度、前記細胞周期、および前記代謝フラックスのうちの少なくとも１つの解析結果に基づいて最適な連続培養条件を選定する選定工程と、前記最適な連続培養条件で培養された細胞を評価して、｛（生産物生成速度）／（細胞増殖速度）｝が最大になるという指標、前記細胞周期のＧ０期およびＧ１期の合計期間が最も長いという指標、および、前記代謝フラックスの分析によって決定された代謝経路の数が最も少ないという指標のうちから選択される少なくとも一つの指標に基づいて連続培養用細胞株を選別する選別工程と、を含み、前記細胞が定常状態となった後に、前記細胞周期のＧ０期およびＧ１期の合計期間、または、前記代謝フラックスの解析を行う。 Further, a method for screening continuous culture conditions according to the present invention is a method for screening continuous culture conditions when culturing cells in a continuous culture apparatus used for commercial production, wherein the continuous culture conditions are set and cells are cultured. a culturing step, sampling the culture solution culturing in the culturing step, analyzing the concentration of the product and the medium components to obtain an analytical value, and determining whether the cultured state of the cells is a steady state from the analytical value. and analyzing at least one of product production rate, cell growth rate, cell cycle, and metabolic flux from the analysis values when the culture state is a steady state. and an analysis step of performing an analysis step with a plurality of cultured cells and continuous culture conditions, and selecting an optimal continuous culture condition based on the analysis result of at least one of the cell growth rate, the cell cycle, and the metabolic flux. Evaluating the process and the cells cultured under the optimal continuous culture conditions, the indicator that {(product production rate) / (cell growth rate)} is maximized, the G0 phase and G1 phase of the cell cycle Selection of cell lines for continuous culture based on at least one indicator selected from the indicator that the total period is the longest and the indicator that the number of metabolic pathways determined by the metabolic flux analysis is the smallest and analyzing the total duration of the G0 and G1 phases of the cell cycle or the metabolic flux after the cell reaches a steady state .

本発明によれば、定常状態に達した後の細胞増殖が少なく、細胞増殖速度に対して生産物生成速度が高い連続培養用細胞株とこれに適した連続培養条件を選別することができる連続培養条件のスクリーニング方法を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to select a cell line for continuous culture that has low cell proliferation after reaching a steady state and a high product production rate relative to the cell growth rate and continuous culture conditions suitable for this. Methods for screening culture conditions can be provided.

本実施形態に係る連続培養条件のスクリーニング装置の一例を示す概略図である。1 is a schematic diagram showing an example of a screening device for continuous culture conditions according to this embodiment. FIG. 培養手段を複数系統備えたスクリーニング装置を示す概略図である。FIG. 2 is a schematic diagram showing a screening device equipped with a plurality of systems of culturing means. 代謝フラックスの分析方法の概念を示す説明図である。FIG. 2 is an explanatory diagram showing the concept of a metabolic flux analysis method; 真核細胞の細胞周期の概念を示す説明図である。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is an explanatory diagram showing the concept of the eukaryotic cell cycle; 生細胞のＤＮＡをＰＩ蛍光染色法で蛍光標識し、それを光学的に検出した結果を示す概念図である。It is a conceptual diagram showing the result of fluorescently labeling the DNA of living cells by a PI fluorescent staining method and optically detecting it. 本実験による細胞の増殖曲線を示すグラフである。1 is a graph showing cell growth curves in this experiment. 培養２日目および培養４日目のフローサイトメータによる細胞周期の測定結果を示すグラフである。Fig. 2 is a graph showing the results of cell cycle measurement by a flow cytometer on day 2 and day 4 of culture. 細胞周期から推定した増殖細胞数の推定値と、実際に計数して求めた増殖細胞数の実測値を示すグラフである。2 is a graph showing the estimated number of proliferating cells estimated from the cell cycle and the actual measured number of proliferating cells obtained by actual counting. 本実施形態に係る連続培養条件のスクリーニング方法の内容を説明するフローチャートである。4 is a flow chart explaining the contents of a screening method for continuous culture conditions according to the present embodiment. 本実施形態に係る連続培養条件のスクリーニング方法の詳細な手順の一例を説明するフローチャートである。1 is a flow chart illustrating an example of detailed procedures of a screening method for continuous culture conditions according to the present embodiment. 本実施形態に係る連続培養条件のスクリーニング方法の詳細な手順の他の一例を説明するフローチャートである。4 is a flowchart illustrating another example of the detailed procedure of the screening method for continuous culture conditions according to the present embodiment. 本実施形態に係る連続培養条件のスクリーニング方法の詳細な手順の他の一例を説明するフローチャートである。4 is a flowchart illustrating another example of the detailed procedure of the screening method for continuous culture conditions according to the present embodiment.

以下、適宜図面を参照して本発明に係る連続培養条件のスクリーニング方法および連続培養条件のスクリーニング装置の一実施形態について詳細に説明する。以下の説明では、まず、連続培養で必要とされる細胞株の特性について説明し、次いで、連続培養条件のスクリーニング装置の実施形態について説明した後、連続培養条件のスクリーニング方法の実施形態について説明する。 Hereinafter, one embodiment of the method for screening continuous culture conditions and the apparatus for screening continuous culture conditions according to the present invention will be described in detail with reference to the drawings as appropriate. In the following description, first, characteristics of cell lines required for continuous culture will be described, and then, embodiments of screening devices for continuous culture conditions will be described, and then embodiments of screening methods for continuous culture conditions will be described. .

［連続培養で必要とされる細胞株の特性］
前述したように、回分培養および流加培養では、細胞数密度の低い状態から高い状態まで細胞数を増殖させるので、生産物生成速度が同じであれば、増殖が速い方が生産性を示す前記式１の値が大きくなる。そのため、回分培養および流加培養では、生産物生成速度および細胞増殖速度ともに高い細胞株が好まれる。 [Characteristics of cell lines required for continuous culture]
As described above, in batch culture and fed-batch culture, the number of cells is grown from a low cell number density state to a high state, so if the product production rate is the same, faster growth indicates higher productivity. The value of Equation 1 increases. Therefore, in batch and fed-batch cultures, cell lines with high product production and cell growth rates are preferred.

連続培養は、添加培地槽から連続的に細胞培養槽に新鮮な培地を供給すると同時に、添加した新鮮な培地と同じ量の培養液を細胞分離装置から抜き取る培養法である点で、回分培養や流加培養と異なっている。細胞分離装置では、細胞と、目的とする生産物および老廃物と、が分離される。分離された細胞は細胞培養槽に戻され、生産物および老廃物などは培養液回収槽に回収される。そして、回収された生産物は精製装置で精製された後、製品となる。 Continuous culture is a culture method in which fresh medium is continuously supplied from the supplemented medium tank to the cell culture tank, and at the same time, the same amount of culture solution as the added fresh medium is withdrawn from the cell separation device. It is different from fed-batch culture. In a cell separator, cells are separated from desired products and waste products. The separated cells are returned to the cell culture tank, and the products and wastes are collected in the culture medium collection tank. The recovered product is refined by a refiner and becomes a product.

目的とする生産物の品質は、培養槽内の栄養成分の濃度や細胞から分泌される老廃物の濃度に依存するため、連続培養における生産物生成期から生産物回収期にかけては、細胞数密度が一定であることが望ましい。つまり、連続培養における生産物生成期から生産物回収期にかけては、回分培養および流加培養と違って、細胞の増殖速度が小さいことが望ましい。その一方で当然のことながら、連続培養における生産物生成期から生産物回収期にかけては、生産性を高める観点から目的とする生産物の生成速度が高いことが望ましい。 The quality of the target product depends on the concentration of nutrients in the culture tank and the concentration of waste products secreted from the cells. should be constant. In other words, from the product production period to the product recovery period in continuous culture, unlike batch culture and fed-batch culture, it is desirable that the growth rate of cells is low. On the other hand, of course, from the product production period to the product recovery period in continuous culture, it is desirable that the production rate of the target product is high from the viewpoint of increasing productivity.

そこで、連続培養用の細胞株を選別するための指標として、後記する式２を新たに定義した。スクリーニングした中で本指標Ｉが、細胞が集密的になって生産物生成期を迎えた後に最大となる細胞株を選別することで、従来と比較して連続培養における生産性が高く、かつ生産物の品質を安定させることができる。つまり、この指標Ｉによって、定常状態に達した後の細胞増殖が少なく、細胞増殖速度に対して生産物生成速度が高い連続培養用細胞株とこれに適した連続培養条件を選別できる。この指標Ｉは、接着系培養細胞を用いた連続培養系および浮遊系培養細胞を用いた連続培養系のいずれにおいても好適に適用できる。なお、この指標Ｉは、例えば、好ましくない副生産物を最小化するための連続培養条件や育種条件の選別に用いることもできる。この場合、「生産物生成速度」を「副生産物生成速度」に置き換え、指標Ｉが小さくなるように連続培養条件や育種条件を選別する。

Ｉ＝（生産物生成速度）／（細胞増殖速度） ・・・式２
Therefore, as an index for selecting cell lines for continuous culture, Formula 2, which will be described later, was newly defined. By selecting a cell line in which this indicator I is maximized after the cells become confluent and enter the product production period, the productivity in continuous culture is higher than before, and The product quality can be stabilized. In other words, this index I enables the selection of cell lines for continuous culture that have low cell growth after reaching a steady state and a high product production rate relative to the cell growth rate, and continuous culture conditions suitable for this. This index I can be suitably applied to both a continuous culture system using adherent cultured cells and a continuous culture system using suspension cultured cells. This index I can also be used, for example, to select continuous culture conditions and breeding conditions for minimizing undesirable by-products. In this case, the "product production rate" is replaced with the "by-product production rate", and the continuous culture conditions and breeding conditions are selected so that the index I becomes small.

I=(product production rate)/(cell proliferation rate) Equation 2

また、連続培養用の細胞株を選別するための指標として、細胞周期が挙げられる。具体的には、細胞が集密的になって生産物生成期を迎えた後の細胞周期において、細胞分裂を行わないＧ０期およびＧ１期の合計期間が長いことが挙げられる。細胞が集密的になって生産物生成期を迎えた後の当該合計期間が長いほど、生産物は生成するが、細胞増殖は行わないという状態を長く維持できることになる。つまり、この指標によっても、定常状態に達した後の細胞増殖が少なく、細胞増殖速度に対して生産物生成速度が高い連続培養用細胞株とこれに適した連続培養条件を選別できる。 In addition, the cell cycle can be used as an indicator for selecting cell lines for continuous culture. Specifically, in the cell cycle after the cells become confluent and enter the product-producing phase, the total period of the G0 and G1 phases during which cell division does not occur is long. The longer the total period after the cells become confluent and enter the product-producing phase, the longer the state in which the cells produce products but do not proliferate can be maintained. In other words, this index also makes it possible to select a cell line for continuous culture that has low cell proliferation after reaching a steady state and a high product production rate relative to the cell proliferation rate and continuous culture conditions suitable for this.

さらに、連続培養用の細胞株を選別するための指標として、代謝フラックスの分析が挙げられる。具体的には、細胞が集密的になって生産物生成期を迎えた後の代謝フラックスの分析によって決定された代謝経路の数が最も少ないことが挙げられる。細胞が集密的になって生産物生成期を迎えた後の代謝フラックスの分析によって決定された代謝経路の数が少ないほど、副生成物の生成量が少なくなる。そのため、生産物の生成が、副生成物による抑制等を受け難くなり、生産物生成速度が向上したり、生産物の生成量が多くなったりする（生産性が高くなる）。また、生産物の品質も安定する。つまり、この指標によっても、定常状態に達した後の細胞増殖が少なく、細胞増殖速度に対して生産物生成速度が高い連続培養用細胞株とこれに適した連続培養条件を選別できる。 Furthermore, analysis of metabolic flux is an index for selecting cell lines for continuous culture. Specifically, it has the lowest number of metabolic pathways determined by analysis of metabolic flux after cells reach confluence and enter the product-producing phase. Fewer metabolic pathways, as determined by analysis of metabolic flux after cells reach confluence and enter the product-producing phase, produce fewer by-products. Therefore, production of products is less likely to be suppressed by by-products, and the speed of production of products increases, and the amount of products produced increases (productivity increases). In addition, the quality of products is stabilized. In other words, this index also makes it possible to select a cell line for continuous culture that has low cell proliferation after reaching a steady state and a high product production rate relative to the cell proliferation rate and continuous culture conditions suitable for this.

［連続培養条件のスクリーニング装置］
図１は、本実施形態に係る連続培養条件のスクリーニング装置の一例を示す概略図である。
本実施形態に係る連続培養条件のスクリーニング装置（以下、単に「スクリーニング装置」ということがある）は、実生産に用いられる連続培養装置（図示せず）内で細胞培養するときの連続培養条件をスクリーニングする装置である。
図１に示すように、本実施形態に係るスクリーニング装置１は、培養手段２と、分析手段３と、判別手段４と、解析手段５と、選定手段６と、選別手段７とを含んでいる。 [Screening device for continuous culture conditions]
FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a screening apparatus for continuous culture conditions according to this embodiment.
The screening device for continuous culture conditions according to the present embodiment (hereinafter sometimes simply referred to as "screening device") is used for continuous culture conditions when culturing cells in a continuous culture device (not shown) used for commercial production. It is a screening device.
As shown in FIG. 1, the screening device 1 according to this embodiment includes a culture means 2, an analysis means 3, a determination means 4, an analysis means 5, a selection means 6, and a selection means 7. .

＜培養手段＞
本実施形態における培養手段２は、実生産に用いられる連続培養装置（図示せず）内で細胞を培養するときの連続培養条件を設定して（模擬して）、細胞培養を行う槽である。設定される連続培養条件としては、例えば、温度、溶存酸素濃度、培地組成、攪拌回転数などが挙げられる。培養手段２では、スクリーニングされる細胞株も設定（選定）される。培養手段２は、細胞培養に必要な設備として当該培養手段２に付随して、培地添加手段２１、細胞分離手段２２および回収手段２３を有している。
培地添加手段２１から培養手段２へは配管Ｔ１で、培養手段２から細胞分離手段２２へは配管Ｔ２で、細胞分離手段２２から回収手段２３へは配管Ｔ３で、細胞分離手段２２から培養手段２へは配管Ｔ４でそれぞれ接続されている。また、これらの配管のうち、配管Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３の任意の箇所にポンプＰ１～Ｐ３が設置されている。
ここで、前記した図示しない実生産に用いられる連続培養装置も、培地添加手段、培養手段、細胞分離手段および回収手段を有して構成されている。当該連続培養装置におけるこれらの構成要素は、スクリーニング装置１の培地添加手段２１、培養手段２、細胞分離手段２２および回収手段２３にそれぞれ相当し、同様の構成とすることができる。 <Culturing means>
The culturing means 2 in the present embodiment is a tank for culturing cells by setting (simulating) continuous culturing conditions for culturing cells in a continuous culturing apparatus (not shown) used for commercial production. . Continuous culture conditions to be set include, for example, temperature, dissolved oxygen concentration, medium composition, stirring rotation speed, and the like. In the culture means 2, a cell line to be screened is also set (selected). The culture means 2 has medium addition means 21, cell separation means 22 and collection means 23 attached to the culture means 2 as equipment necessary for cell culture.
From the medium addition means 21 to the culture means 2 is a pipe T1, from the culture means 2 to the cell separation means 22 is a pipe T2, from the cell separation means 22 to the recovery means 23 is a pipe T3, and from the cell separation means 22 to the culture means 2. are connected to each other by pipes T4. Further, among these pipes, pumps P1 to P3 are installed at arbitrary positions of pipes T1, T2 and T3.
Here, the continuous culturing apparatus (not shown) used for actual production is also configured to have a medium adding means, a culturing means, a cell separating means and a collecting means. These components of the continuous culture apparatus correspond to the medium addition means 21, culture means 2, cell separation means 22 and recovery means 23 of the screening apparatus 1, respectively, and can have the same configuration.

培養手段２には、細胞を攪拌するための攪拌翼２４および攪拌動力２５が設けられている。また、培養手段２には、液中通気のための散気管２６、温度調整のためのウォータージャケット２７と、ｐＨ、溶存酸素（ＤＯ）、溶存二酸化炭素（ＤＣＯ２）、温度等の培養環境をモニタリングするための各種センサ（図示せず）とを備えている。なお、センサは計測対象ごとに個別に備えられている。 The culture means 2 is provided with a stirring blade 24 and a stirring power 25 for stirring cells. The culture means 2 includes an air diffuser 26 for aeration in the liquid, a water jacket 27 for temperature control, and a culture environment such as pH, dissolved oxygen (DO), dissolved carbon dioxide (DCO 2 ), and temperature. and various sensors (not shown) for monitoring. A sensor is individually provided for each measurement target.

また、図示はしないが、培養手段２は、ｐＨ、ＤＯを所定の設定範囲に制御するためにアルカリ溶液添加用の配管や炭酸ガス、空気、純酸素、窒素などの（液面、液中）通気配管を備えている。また、同じく図示はしないが、培養手段２は、前記したセンサで得られた値に基づいて前記培養環境を所定の設定範囲に維持するためにアルカリ添加やガス通気を制御するための装置も備えている。 Although not shown, the culturing means 2 includes piping for adding an alkaline solution, carbon dioxide gas, air, pure oxygen, nitrogen, etc. (on the liquid surface and in the liquid) in order to control the pH and DO within a predetermined set range. Equipped with ventilation pipes. Also, although not shown, the culturing means 2 also includes a device for controlling alkali addition and gas ventilation in order to maintain the culturing environment within a predetermined set range based on the values obtained by the sensors. ing.

ここで、図２は、培養手段２を複数系統備えたスクリーニング装置１Ａを示す概略図である。
図１は、培養手段２を１つだけ備えた１系統のスクリーニング装置１を図示している。一般的に、遺伝子組換えを行った細胞は複数の候補細胞株（細胞株プール）として保存される。従って、スクリーニングの効率を向上させるため、図２に示すように、培養手段２を複数系統備えたスクリーニング装置１Ａとするのが望ましい。
図２に示すスクリーニング装置１Ａは、例えば、容量が１００ｍＬである培養手段２（具体的には細胞培養槽）を８つ備えており、それぞれ培養手段２ａ～２ｈとしている。なお、図２において図示はしないが、スクリーニング装置１Ａは、スクリーニング装置１と同様、それぞれの培養手段２ａ～２ｈに付随して、培地添加手段２１、細胞分離手段２２および回収手段２３を有している。 Here, FIG. 2 is a schematic diagram showing a screening apparatus 1A having a plurality of systems of culture means 2. As shown in FIG.
FIG. 1 illustrates a screening apparatus 1 of one system provided with only one culturing means 2 . Generally, genetically modified cells are stored as multiple candidate cell lines (cell line pool). Therefore, in order to improve screening efficiency, it is desirable to use a screening apparatus 1A having a plurality of culture means 2 as shown in FIG.
The screening apparatus 1A shown in FIG. 2 includes, for example, eight culturing means 2 (specifically, cell culture tanks) each having a capacity of 100 mL, which are designated as culturing means 2a to 2h. Although not shown in FIG. 2, the screening device 1A, like the screening device 1, has medium addition means 21, cell separation means 22 and collection means 23 associated with the respective culture means 2a to 2h. there is

また、培養手段２ａ～２ｈは、いずれも図１に示す培養手段２の構成を有している。従って、培養手段２ａ～２ｈはそれぞれが培養制御パラメータとして、攪拌回転数、温度、ｐＨ、ＤＯ、ＤＣＯ２などが挙げられ、これらを測定して制御することが可能である。また、培養手段２ａ～２ｈはそれぞれが培養制御パラメータとして、培養手段２から細胞分離手段２２を経由して培養手段２に戻る循環速度、細胞分離手段２２から回収手段２３に送液する送液速度、培地添加手段２１から培養手段２内に新鮮な培地を添加する添加速度および培地組成が挙げられ、これらを測定して制御することが可能である。 Moreover, each of the culturing means 2a to 2h has the structure of the culturing means 2 shown in FIG. Therefore, culture control parameters of the culture means 2a to 2h include agitation speed, temperature, pH, DO, DCO 2 , etc., and can be controlled by measuring these parameters. In addition, the culture means 2a to 2h each have, as culture control parameters, a circulation speed returning from the culture means 2 to the culture means 2 via the cell separation means 22, a liquid feeding speed from the cell separation means 22 to the recovery means 23, , the rate of addition of fresh medium from the medium addition means 21 into the culture means 2 and the composition of the medium, which can be measured and controlled.

培養手段２ａ～２ｈは、これらの培養制御パラメータを連続培養条件のスクリーニング対象とすることができる。生産性の高い細胞株を選別するには、候補細胞株とその細胞株に適した連続培養条件とをセットで検討する必要がある。そのため、本実施形態においては、培養手段２ａ～２ｈは、１つの系統で１つの候補細胞株を種々の条件で培養することが望ましい。この点、図２に示すスクリーニング装置１Ａは、培養手段２ａ～２ｈのうちの１つの培養手段で１つの系統の細胞株を培養できるだけでなく、前記１つの系統の細胞株の連続培養条件の設定値を変えて種々の連続培養条件における細胞増殖速度や生産物生成速度などを計測できる。 The culture means 2a to 2h can use these culture control parameters as screening targets for continuous culture conditions. In order to select cell lines with high productivity, it is necessary to examine candidate cell lines and continuous culture conditions suitable for the cell line as a set. Therefore, in this embodiment, it is desirable that the culturing means 2a to 2h culture one candidate cell line in one system under various conditions. In this regard, the screening apparatus 1A shown in FIG. 2 can not only culture one lineage of cell lines with one of the culture means 2a to 2h, but also set continuous culture conditions for the one lineage of cell lines. By changing the value, it is possible to measure the cell growth rate, product production rate, etc. under various continuous culture conditions.

＜培地添加手段＞
培地添加手段２１は、培養手段２内において細胞が消費した液体培地中の栄養成分を補うため、新鮮な液体培地を一時的に貯留しておく槽である。培地添加手段２１は、新鮮な液体培地を一時的に貯留しておくことができる槽であればどのようなものも用いることができる。培地添加手段２１は、培養手段２に添加する新鮮な培地を貯留できればよく、槽の数は特に限定されない。培地添加手段２１における槽の数は１つでもよいし、複数でもよい。培地添加手段２１は、ポンプＰ１の出力とバルブＶの開閉・開度によって新鮮な液体培地の添加速度を調節することができる。なお、新鮮な液体培地は、培養しようとする細胞に応じて適宜に選択・調製することができる。 <Medium Addition Means>
The medium addition means 21 is a tank for temporarily storing fresh liquid medium in order to supplement the nutrient components in the liquid medium consumed by the cells in the culture means 2 . Any tank can be used as the medium adding means 21 as long as it can temporarily store a fresh liquid medium. The medium addition means 21 only needs to store fresh medium to be added to the culture means 2, and the number of tanks is not particularly limited. The number of tanks in the medium addition means 21 may be one or plural. The medium addition means 21 can adjust the addition speed of the fresh liquid medium by the output of the pump P1 and the opening/closing/opening degree of the valve V. FIG. A fresh liquid medium can be appropriately selected and prepared according to the cells to be cultured.

＜細胞分離手段＞
細胞分離手段２２は、培養手段２の培養液から培養細胞と、生産物および老廃物と、を分離する装置である。細胞分離手段２２は、配管Ｔ４を通じて培養細胞を培養手段２に戻し、配管Ｔ３を通じて生産物および老廃物を回収手段２３へ移送する。細胞分離手段２２としては、例えば、重力沈降法、遠心分離法、超音波凝集法、ろ過分離法などが挙げられ、本実施形態ではいずれの手法を用いてもよい。なお、生産物としては、例えば、抗体タンパクや各種の生理活性物質などが挙げられ、老廃物としては、例えば、乳酸やアンモニアなどが挙げられる。 <Cell separation means>
The cell separation means 22 is a device that separates cultured cells, products and wastes from the culture medium of the culture means 2 . The cell separating means 22 returns the cultured cells to the culturing means 2 through the pipe T4, and transfers the products and wastes to the collecting means 23 through the pipe T3. Examples of the cell separation means 22 include a gravity sedimentation method, a centrifugal separation method, an ultrasonic flocculation method, a filtration separation method, and the like, and any method may be used in this embodiment. Examples of products include antibody proteins and various physiologically active substances, and examples of waste products include lactic acid and ammonia.

＜回収手段＞
回収手段２３は、前記したように、細胞分離手段２２で分離された生産物および老廃物を一時的に貯留しておく槽である。回収手段２３は、生産物および老廃物を一時的に貯留しておくことができる槽であればどのようなものも用いることができる。 <Collection means>
The collection means 23 is a tank for temporarily storing the products and wastes separated by the cell separation means 22, as described above. Any tank can be used as the collecting means 23 as long as it can temporarily store the product and the waste.

＜分析手段＞
スクリーニング装置１では、例えば、細胞の細胞増殖期（対数増殖期）中や、細胞増殖期が過ぎて生産物生成期に入った後（定常状態に達した後）など、適宜のタイミングで培養手段２から培養液をサンプリングし、分析手段３で生産物の濃度と培地成分を分析して、細胞の状態を分析する。具体的には、分析した細胞の状態を反映する生産物生成速度、細胞増殖速度、細胞周期、細胞内の代謝の流れ（代謝フラックス）、栄養基質消費速度、老廃物などの副生成物分泌速度などを少なくとも１つ分析する。分析手段３の分析対象として挙げたこれらの項目は任意に選択可能であり、少なくとも一つを分析すればよい。ただし、後記する選別手段８で｛（生産物生成速度）／（細胞増殖速度）｝、細胞周期、代謝フラックスのうちから選択される少なくとも一つの指標に基づいて連続培養用細胞株を選別することから、生産物生成速度および細胞増殖速度と、細胞周期と、代謝フラックスとのうちの少なくとも一つは分析しておくのが好ましい。分析手段３は、得られた分析値を解析制御手段８に送信する。分析手段３で分析され得るこれらの分析対象に関する分析方法等は以下のようなものである。 <Analysis method>
In the screening device 1, for example, during the cell growth phase (logarithmic growth phase), or after the cell growth phase has passed and the product generation phase has started (after the steady state is reached), the culture means is cultured at an appropriate timing. The culture solution is sampled from 2, and the concentration of the product and the medium components are analyzed by the analysis means 3 to analyze the state of the cells. Specifically, the product production rate, cell growth rate, cell cycle, intracellular metabolic flow (metabolic flux), nutrient substrate consumption rate, and byproduct secretion rate such as waste products reflect the state of the analyzed cell. Analyze at least one of These items listed as the analysis targets of the analysis means 3 can be arbitrarily selected, and at least one should be analyzed. However, the cell line for continuous culture is selected based on at least one index selected from {(product production rate)/(cell growth rate)}, cell cycle, and metabolic flux in the selection means 8 described later. Therefore, it is preferable to analyze at least one of product production rate and cell growth rate, cell cycle, and metabolic flux. The analysis means 3 transmits the obtained analysis values to the analysis control means 8 . Analysis methods and the like for these analysis objects that can be analyzed by the analysis means 3 are as follows.

（分析対象１：生産物の濃度および生産物生成速度）
生産物生成速度を求めるために、まず培養手段２内の生産物の濃度を分析する。例えば、目的とする生産物がタンパク質である場合におけるタンパク質の濃度は以下のようにして分析することができる。
タンパク質の定量ではＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）法を用いることができる。ＥＬＩＳＡ法は、測定対象のタンパク質と抗原抗体反応を示す抗体を用い、結合した抗体の蛍光もしくは酵素活性により、測定対象のタンパクの濃度を算出する。ＥＬＩＳＡ法には、直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法などの方法があるが、いずれの方法で測定しても構わない。
培養におけるタンパク質の濃度の経時変化を測定し、単位時間、単位細胞数あたりの生成量に換算することで、生産物生成速度を求めることができる。 (Analysis object 1: product concentration and product formation rate)
To determine the product production rate, the concentration of the product in the culture means 2 is first analyzed. For example, when the desired product is protein, the protein concentration can be analyzed as follows.
An ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) method can be used for protein quantification. The ELISA method uses an antibody that exhibits an antigen-antibody reaction with a protein to be measured, and calculates the concentration of the protein to be measured from the fluorescence or enzymatic activity of the bound antibody. The ELISA method includes methods such as a direct method, an indirect method, a sandwich method, and a competitive method, and any method may be used for measurement.
The product production rate can be obtained by measuring the change in protein concentration over time in the culture and converting it into the production amount per unit time and unit cell number.

（分析対象２：培地成分、栄養基質消費速度および副生成物分泌速度）
栄養基質消費速度および副生成物分泌速度を求めるために培地成分を分析する。具体的には、培養手段２内の栄養基質濃度および副生成物濃度を分析する。なお、栄養基質とは、培地成分のうち、細胞の成長や生産物の生成に必要なものをいい、例えば、無機成分、炭素源、ビタミン類、アミノ酸類などが挙げられる。また、副生成物とは、細胞が成長したり、生産物を生成したりする過程において、副産物として生成されるものをいい、例えば、炭酸ガス、乳酸、アンモニア、ピルビン酸、クエン酸などが挙げられる。 (Analysis object 2: medium components, nutrient substrate consumption rate and by-product secretion rate)
Media components are analyzed to determine nutrient substrate consumption and byproduct secretion rates. Specifically, the nutrient substrate concentration and the by-product concentration in the culture means 2 are analyzed. Note that the nutrient substrate refers to a medium component that is necessary for cell growth and production of products, and includes, for example, inorganic components, carbon sources, vitamins, amino acids, and the like. In addition, by-products refer to those produced as by-products in the process of cell growth and production of products, examples of which include carbon dioxide, lactic acid, ammonia, pyruvic acid, and citric acid. be done.

栄養基質濃度および副生成物濃度の測定は、例えば、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフ－タンデム質量分析計（ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ）、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）、ガスクロマトグラフ－タンデム質量分析計（ＧＣ／ＭＳ－ＭＳ）等を用いて、細胞を除いた培養液中の成分を測定する。これらの分析法はいずれも、培養液中の多項目の成分を一度に測定することができる。
培養における培地成分、具体的には、栄養基質濃度および副生成物濃度の経時変化をそれぞれ測定し、単位時間あたりの消費量および生成量に換算することで、栄養基質消費速度および副生成物分泌速度をそれぞれ求めることができる。 Nutrient substrate concentration and by-product concentration can be measured by, for example, high-performance liquid chromatograph (HPLC), liquid chromatograph-mass spectrometer (LC/MS), liquid chromatograph-tandem mass spectrometer (LC/MS-MS), Using a gas chromatograph-mass spectrometer (GC/MS), a gas chromatograph-tandem mass spectrometer (GC/MS-MS), or the like, components in the culture solution excluding cells are measured. All of these analytical methods can simultaneously measure multiple components in the culture medium.
By measuring changes over time in medium components in culture, specifically, nutrient substrate concentration and by-product concentration, respectively, and converting them into amounts consumed and produced per unit time, the nutrient substrate consumption rate and by-product secretion were calculated. The velocity can be calculated for each.

（分析対象３：代謝フラックス）
代謝フラックスの分析方法の一例を以下に説明する。図３は、代謝フラックスの分析方法の概念を示す説明図である。図３に示すシミュレーションでは最初にランダムな代謝フラックスの値（代謝反応速度初期値（乱数））（図３のＲ１～Ｒ８）を与え、代謝経路モデルを基に、定常状態での細胞内の各代謝物質に含まれる同位体炭素の数の比を計算する。この計算値と実験で測定した細胞内代謝物質の同位体炭素数比との比較を行う。そして、同位体比率分布について統計学的に有意差がない場合（一致する場合）は、推定代謝フラックスと決定される（代謝反応速度決定）。一方、同位体比率分布について統計学的に有意に差がある場合（不一致となる場合）は、シミュレーションによる代謝物質中の同位体数炭素比の値を実験による代謝物質中の同位体炭素数比の値との平均自乗誤差が最小となるようにシミュレーションによる代謝フラックスの値を補正する。この補正は、例えば、ＱＰ（Quadratic Programming）部分問題法を適用することにより行うことができる。ＱＰ部分問題法は、生成された特定の代謝物１～３の同位体炭素数比と、シミュレーションによる特定の代謝物１～３の同位体炭素数比と間に統計学的な有意差が生じる場合に、両者間の平均自乗誤差が予め設定された所定範囲内に収まり、最小となるように、先にシミュレーションにより得た代謝経路Ｒ１～Ｒ８におけるそれぞれの代謝フラックスの値の中で、当該誤差に関係する代謝経路Ｒ１～Ｒ８における代謝フラックスの値を補正するというものである。前記したように、シミュレーションによる結果が不一致となる場合、補正した代謝フラックスで同位体炭素比を計算し、同位体比率分布について統計学的な有意差がなくなるまで実験による代謝物質中の同位体炭素数比の値を比較するという操作を繰り返す。シミュレーションによる結果が一致する場合、その結果により代謝反応速度（代謝フラックス）を決定する。 (Analysis target 3: metabolic flux)
An example of a method for analyzing metabolic flux is described below. FIG. 3 is an explanatory diagram showing the concept of the metabolic flux analysis method. In the simulation shown in FIG. 3, first, random metabolic flux values (metabolic reaction rate initial values (random numbers)) (R1 to R8 in FIG. 3) are given, and based on the metabolic pathway model, each intracellular Calculate the ratio of the number of carbon isotopes contained in metabolites. This calculated value is compared with the isotope carbon number ratio of the intracellular metabolite measured in the experiment. Then, when there is no statistically significant difference in the isotope ratio distributions (when they match), the estimated metabolic flux is determined (metabolic reaction rate determination). On the other hand, if there is a statistically significant difference in the isotope ratio distribution (if there is a mismatch), the value of the isotope number carbon number ratio in the metabolite obtained from the simulation is replaced with the isotope carbon number ratio in the metabolite obtained from the experiment. Correct the simulated metabolic flux values so that the mean squared error with the value of is minimized. This correction can be performed, for example, by applying a QP (Quadratic Programming) subproblem method. The QP partial problem method produces a statistically significant difference between the isotope carbon number ratios of the specific metabolites 1 to 3 generated and the isotope carbon number ratios of the specific metabolites 1 to 3 by simulation. In this case, the error It corrects the values of metabolic fluxes in metabolic pathways R1-R8 related to . As described above, if the simulation results are inconsistent, the isotope carbon ratios are calculated with corrected metabolic fluxes, and the isotope carbon ratios in the experimental metabolites are calculated until there is no statistically significant difference in the Repeat the operation of comparing the values of the numerical ratios. If the simulation results agree, the results determine the metabolic reaction rate (metabolic flux).

同位体標識基質を用いた培養実験については、例えば、１３Ｃで標識したグルコースを添加した液体培地で細胞培養を行う。そして、培養槽から細胞をサンプリングし、細胞を固定した後、分析に必要な中間代謝物を抽出し、２％methoxyamine hydrochlorideを加え、５５℃で２時間反応させる。その後、ＭＢＴＳＴＦＡ＋１％ＴＢＤＭＣＳ（(N-methyl-N-(tert-butyldimethylsilyl)trifluoroacetamide + 1% tertbutyldimetheylchlorosilane)）溶液を４５μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた後、ＧＣ／ＭＳで分析する。ＧＣ／ＭＳで用いるカラムとしては、例えば、３０ｍ ＤＢ－３５ＭＳ キャピラリーカラムを使用することができ、分析条件はカラム温度を１００℃から３００℃に勾配３．５℃／ｍｉｎで昇温することが挙げられる。また、注入口温度を２７０℃とし、キャリアガスはヘリウムガス（流量１ｍＬ／ｍｉｎ）で分析を行うことが挙げられる。 For culture experiments using isotope-labeled substrates, for example, cells are cultured in a liquid medium supplemented with 13 C-labeled glucose. Cells are then sampled from the culture tank, fixed, intermediate metabolites necessary for analysis are extracted, 2% methoxyamine hydrochloride is added, and reacted at 55° C. for 2 hours. After that, MBTSTFA + 1% TBDMCS ((N-methyl-N-(tert-butyldimethylsilyl)trifluoroacetamide + 1% tertbutyldimethylchlorosilane)) solution is added in 45 µL portions, reacted at 37°C for 1 hour, and then analyzed by GC/MS. As the column used in GC/MS, for example, a 30m DB-35MS capillary column can be used, and the analysis conditions include increasing the column temperature from 100°C to 300°C at a gradient of 3.5°C/min. . In addition, the injection port temperature is set to 270° C., and the carrier gas is helium gas (flow rate: 1 mL/min).

（分析対象４：細胞増殖速度）
細胞増殖速度を求めるために、まず培養手段２内の細胞数を分析（測定）する。細胞数の測定は、トリパンブルー染色法および血球計算盤を用いた顕微鏡観察により行うことができる。なお、細胞数の測定は、乾燥菌体重量法、濁度法、静電容量法、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）測定、フローサイトメトリー法等の他の方法を用いて行うこともできる。
ここで、生細胞数をＸ、比増殖速度をμ、時間をｔとすると、式３の関係になる。

μＸ＝ｄＸ／ｄｔ ・・・式３
(Analysis object 4: cell growth rate)
In order to obtain the cell growth rate, first, the number of cells in the culture means 2 is analyzed (measured). Cell count can be measured by trypan blue staining and microscopic observation using a hemacytometer. The cell count can also be measured using other methods such as dry cell weight method, turbidity method, capacitance method, nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) measurement, and flow cytometry.
Here, when the number of viable cells is X, the specific growth rate is μ, and the time is t, the relationship of Equation 3 is obtained.

μX=dX/dt Expression 3

異なる時間の２点の生細胞数が分かれば、式３を用いて比増殖速度を求めることができる。なお、異なる時間の２点のデータから比増殖速度を求めた際に、誤差の影響が無視できなくなった場合は、対数増殖している培養液を経時的にサンプリングし、より多くのデータを基に比増殖速度を推定してもよい。例えば、培養時間を横軸、生細胞数の対数値を縦軸として散布図にプロットし、その傾きを最小二乗法により計算する。このグラフが直線で得られない場合は、対象の細胞は指数増殖しておらず、培養期間中に何らかの制限因子が存在することを意味している。 Knowing the number of viable cells at two different time points, Equation 3 can be used to determine the specific growth rate. If the effect of error cannot be ignored when the specific growth rate is calculated from two data points at different times, sample the culture solution that is growing logarithmically over time and obtain more data. You may estimate the specific growth rate to For example, the culture time is plotted on the horizontal axis and the logarithmic value of the number of viable cells is plotted on the vertical axis on a scatter diagram, and the slope is calculated by the least-squares method. If this graph does not yield a straight line, it means that the cells of interest are not growing exponentially and some limiting factor exists during the culture period.

（分析対象５：細胞周期）
図４は、真核細胞の細胞周期の概念を示す説明図である。細胞周期は、１つの細胞が分裂して２つの細胞になるために必要な期間であり、図４に示すように、細胞分裂期（有糸分裂期、Ｍ期）と、それ以外の細胞分裂間期（間期）からなる。間期は、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期からなる。真核細胞は細胞周期を繰り返すことで増殖する。典型的な動物の細胞では、１細胞周期にかかる時間は１６～２４時間であり、Ｍ期は１時間、Ｇ２期は２～６時間、Ｓ期は６～８時間である。なお、Ｇ１期は細胞株の種類や連続培養条件によって相違する。Ｍ期、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期の時間比はおよそ１：５：７：３である。また、連続培養条件等の様々な要因により、Ｇ１期において、細胞周期から離脱し静止状態になることがある。これをＧ０期という。Ｇ０期の長さおよび含有比は不定である。従って、Ｇ０期の細胞を含む場合には、Ｍ期、Ｇ１期（およびＧ０期）、Ｓ期、Ｇ２期の時間比は不定である。 (Analysis target 5: cell cycle)
FIG. 4 is an explanatory diagram showing the concept of the eukaryotic cell cycle. The cell cycle is the period required for one cell to divide and become two cells, and as shown in FIG. Consists of interphase (interphase). Interphase consists of G1, S and G2 phases. Eukaryotic cells proliferate by repeating the cell cycle. In a typical animal cell, one cell cycle takes 16-24 hours, with M phase of 1 hour, G2 phase of 2-6 hours, and S phase of 6-8 hours. The G1 phase differs depending on the type of cell line and continuous culture conditions. The time ratio of M, G1, S and G2 phases is approximately 1:5:7:3. In addition, due to various factors such as continuous culture conditions, cells may exit the cell cycle and become quiescent in the G1 phase. This is called the G0 phase. The length and content ratio of the G0 phase are indefinite. Therefore, when cells in the G0 phase are included, the time ratio of the M phase, G1 phase (and G0 phase), S phase, and G2 phase is indefinite.

連続培養においては、細胞が集密的になって生産物生成期を迎えた後は、分裂をしないＧ０期およびＧ１期の割合が多い細胞を選別するのが好ましい。細胞周期の計測は、フローサイトメータを用いたＰＩ蛍光染色法で行うことができる。ＰＩ蛍光染色法は、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム：Propidium Iodide）を用いる蛍光染色法であり、細胞周期を計測する際によく用いられている手法である。 In continuous culture, after the cells become confluent and enter the product-producing stage, it is preferable to select cells having a large ratio of non-dividing G0 and G1 phases. The cell cycle can be measured by PI fluorescence staining using a flow cytometer. The PI fluorescence staining method is a fluorescence staining method using PI (Propidium Iodide), and is a method often used when measuring the cell cycle.

図５は、生細胞のＤＮＡをＰＩ蛍光染色法で蛍光標識し、それを光学的に検出した結果を示す概念図である。なお、図５の縦軸は細胞数を表し、横軸はＰＩ蛍光強度（∝ＤＮＡ量）を表している。縦軸は上にいくほど細胞数が多くなり、横軸は右にいくほどＰＩ蛍光強度が高くなる。
図５中の曲線Ｃ１１は、Ｇ０期とＧ１期の細胞を示す。Ｇ０期とＧ１期の細胞からは比較的強度が低い蛍光が検出される。曲線Ｃ１２は、Ｓ期の細胞を示す。Ｓ期の細胞からは、広い範囲の強度の蛍光が検出される。曲線Ｃ１３は、Ｇ２期とＭ期の細胞を示す。Ｇ２期とＭ期の細胞からは比較的強度が高い蛍光が検出される。 FIG. 5 is a conceptual diagram showing the result of optically detecting the DNA of living cells that was fluorescently labeled by the PI fluorescent staining method. The vertical axis in FIG. 5 represents the number of cells, and the horizontal axis represents the PI fluorescence intensity (∝DNA amount). As the vertical axis goes upward, the number of cells increases, and as the horizontal axis goes to the right, the PI fluorescence intensity increases.
Curve C11 in FIG. 5 indicates cells in the G0 and G1 phases. Relatively low-intensity fluorescence is detected from cells in the G0 and G1 phases. Curve C12 represents cells in S phase. A wide range of intensities of fluorescence is detected from cells in S phase. Curve C13 represents cells in G2 and M phases. Fluorescence with relatively high intensity is detected from cells in the G2 phase and M phase.

図５の３つの曲線Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３は度数分布曲線である。従って、この曲線を所定の範囲について積分することによって、その範囲の細胞数が求められる。すなわち、これらの曲線の下側の面積は細胞数を示し、面積比は細胞数比を表す。例えば、曲線Ｃ１３の下側の面積を測定することによって、Ｇ２期とＭ期の細胞数が得られる。また、曲線Ｃ１３の下側の面積を他の曲線の下側の面積と比較することにより、Ｇ２期とＭ期の細胞数と他の期の細胞数の比が求められる。
細胞増殖速度の測定は、細胞の増殖を待つ必要があり、数日かかるのに対し、細胞周期の測定は１時間程度で解析できる。そのため、細胞周期を測定する場合、スクリーニングにおける時間短縮を図ることができる。
なお、細胞周期から細胞数を推定することもできる。細胞周期からの細胞数の推定は以下のようにして行う。 Three curves C11, C12, and C13 in FIG. 5 are frequency distribution curves. Therefore, by integrating this curve over a given range, the number of cells in that range is determined. That is, the area under these curves indicates the cell number, and the area ratio represents the cell number ratio. For example, the number of cells in G2 and M phases can be obtained by measuring the area under curve C13. Also, by comparing the area under the curve C13 with the area under the other curves, the ratio of the number of cells in the G2 phase and M phase to the number of cells in the other phases can be obtained.
Measurement of cell proliferation rate requires waiting for cell proliferation and takes several days, while measurement of cell cycle can be analyzed in about one hour. Therefore, when measuring the cell cycle, it is possible to shorten the screening time.
In addition, the cell number can also be estimated from the cell cycle. Estimation of the number of cells from the cell cycle is performed as follows.

（細胞周期から細胞数を推定する方法）
細胞周期について、Ｍ期は１時間、Ｇ２期は２時間であると仮定する。ある時刻ｔ＝ｔ0で培養液をサンプリングすると生細胞数Ｎ0が得られ、そのときのＭ期の細胞の割合をＰMとする。Ｍ期の細胞は１時間後に分裂を完了するので、生細胞の増加数は、Ｎ0×ＰMとなる。従って、１時間後の生細胞数Ｎ1および細胞増殖速度μ1（ｈ-1）はそれぞれ式４、式５で表すことができる。

Ｎ1＝Ｎ0＋Ｎ0×ＰM＝Ｎ0×（１＋ＰM） ・・・式４

μ1＝ｌｎ Ｎ1－ｌｎ Ｎ0 ・・・式５
(Method for estimating cell number from cell cycle)
For the cell cycle, assume that the M phase is 1 hour and the G2 phase is 2 hours. When the culture medium is sampled at a certain time t=t 0 , the number of viable cells N 0 is obtained, and the ratio of cells in the M phase at that time is defined as P M . Since cells in M phase complete division after 1 hour, the increased number of viable cells is N 0 ×P M . Therefore, the viable cell number N 1 and cell growth rate μ 1 (h −1 ) after 1 hour can be expressed by Equations 4 and 5, respectively.

N1= N0 + N0 * PM = N0 *( 1 + PM ) Equation 4

μ 1 = ln N 1 - ln N 0 Equation 5

一般的に、Ｍ期の細胞の割合ＰMのみを計測することは困難であるが、Ｇ２期の細胞とＭ期の細胞の合計の割合ＰM+G2は計測することが可能である。そこで、Ｇ２期の細胞とＭ期の細胞の合計の割合ＰM+G2を用いて、サンプリングから数時間後の生細胞数を算出する。ある時刻ｔ＝ｔ0でサンプリングを行い、生細胞数Ｎ0が得られたとする。サンプリングした生細胞におけるＧ２期の細胞とＭ期の細胞の合計の割合をＰM+G2とする。サンプリング時にＭ期およびＧ２期であった細胞は、３時間後には、全てＭ期およびＧ２期を経て分裂を完了する。従って、３時間後における生細胞の増加数は、Ｎ0×ＰM+G2である。すなわち、３時間後の生細胞数Ｎ2および細胞増殖速度μ2（ｈ-1）はそれぞれ式６、式７で表すことができる。

Ｎ2＝Ｎ0＋Ｎ0×ＰM+G2＝Ｎ0×(１＋ＰM+G2) ・・・式６

μ2＝(ｌｎ Ｎ2－ｌｎ Ｎ0)／３＝ｌｎ(１＋ＰM+G2)／３ ・・・式７
Generally, it is difficult to measure only the proportion P M of cells in the M phase, but it is possible to measure the total proportion P M+G2 of the cells in the G2 phase and the cells in the M phase. Therefore, the total number of cells in G2 phase and cells in M phase, P M +G2 , is used to calculate the number of viable cells several hours after sampling. Suppose that sampling is performed at a certain time t=t 0 and the number of living cells N 0 is obtained. Let P M +G2 be the total ratio of cells in the G2 phase and cells in the M phase in the sampled viable cells. Cells that were in M and G2 phases at the time of sampling all completed division through M and G2 phases after 3 hours. Therefore, the increased number of viable cells after 3 hours is N 0 ×P M +G2 . That is, the viable cell number N 2 and cell growth rate μ 2 (h −1 ) after 3 hours can be expressed by Equations 6 and 7, respectively.

N 2 =N 0 +N 0 ×P M+G2 =N 0 ×(1+P M+G2 ) Equation 6

μ 2 =(ln N 2 -ln N 0 )/3=ln(1+P M+G2 )/3 Equation 7

なお、上記説明では、Ｍ期は１時間、Ｇ２期を２時間と仮定したが、より一般的にＭ期とＧ２期の合計の時間をＴM+G2時間で表すと、細胞増殖速度μ3（ｈ-1）は式８で表すことができる。

μ3＝(ｌｎ Ｎ2－ｌｎ Ｎ0)／ＴM+G2＝ｌｎ(１＋ＰM+G2)／ＴM+G2 ・・・式８
In the above explanation, it was assumed that the M phase was 1 hour and the G2 phase was 2 hours. (h −1 ) can be represented by Equation 8.

μ 3 =(ln N 2 -ln N 0 )/T M+G2 =ln(1+P M+G2 )/T M+G2 Equation 8

以下にＧ２期の細胞とＭ期の細胞の合計の割合ＰM+G2の計測方法および導出方法の一例について説明する。
サンプリングした培養液中に含まれる細胞に対してＰＩで染色し、フローサイトメータで各細胞のＰＩ蛍光強度を計測すると、前述した図５と同じ結果を得ることができる。前述したように、図５中の曲線Ｃ１１はＧ０期とＧ１期の細胞を示し、曲線Ｃ１２はＳ期の細胞を示し、曲線Ｃ１３はＧ２期とＭ期の細胞を示す。３つの曲線Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３は度数分布曲線であるため、この曲線を所定の範囲について積分することによって、その範囲の細胞数が求められる。すなわち、これらの曲線の下側の面積は細胞数を示し、面積比は細胞数比を表す。例えば、曲線Ｃ１３の下側の面積を測定することによって、Ｇ２期とＭ期の細胞数が得られる。また、曲線Ｃ１３の下側の面積を他の曲線の下側の面積と比較することによって、Ｇ２期とＭ期の細胞数と他の期の細胞数との比が求められる。 An example of a method for measuring and deriving the total ratio P M+G2 of cells in the G2 phase and cells in the M phase will be described below.
When the cells contained in the sampled culture medium are stained with PI and the PI fluorescence intensity of each cell is measured with a flow cytometer, the same results as in FIG. 5 described above can be obtained. As described above, curve C11 in FIG. 5 indicates G0 and G1 phase cells, curve C12 indicates S phase cells, and curve C13 indicates G2 and M phase cells. Since the three curves C11, C12, and C13 are frequency distribution curves, the number of cells in that range can be obtained by integrating these curves over a predetermined range. That is, the area under these curves indicates the cell number, and the area ratio represents the cell number ratio. For example, the number of cells in G2 and M phases can be obtained by measuring the area under curve C13. Also, by comparing the area under the curve C13 with the area under the other curves, the ratio between the number of cells in the G2 phase and the M phase and the number of cells in the other phases can be obtained.

（生細胞数の推定実験）
前述した（細胞周期から細胞数を推定する方法）に基づいて、生細胞数の推定実験を行った。
Chinese Hamster Ovary（ＣＨＯ）細胞の培養において、細胞周期測定により細胞増殖速度を推定した。ＣＤ－ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）を用い、ＣＨＯ細胞をスピナーフラスコ（１５０ｍｌ）で培養した。培養２日目と培養４日目はサンプリングを３時間おきに行い、それ以外の日は一日一度サンプリングを行った。サンプリングした細胞について、生細胞数およびＧ２期＋Ｍ期の細胞割合を測定した。生細胞数の計測には、製品名Ｖｉ－Ｃｅｌｌ（ベックマン・コールター社製）を用いた。Ｇ２期の細胞とＭ期の細胞の合計の割合の計測には、Cell Cycle Phase Determination Kitを用い、添付のプロトコルに従い細胞を蛍光色素で標識し、フローサイトメータ（ベックマン・コールター社製）により測定を行った。 (Experiment for estimating the number of viable cells)
An experiment for estimating the number of viable cells was performed based on the method described above (method for estimating cell number from cell cycle).
Cell proliferation rates were estimated by cell cycle measurements in cultures of Chinese Hamster Ovary (CHO) cells. CHO cells were cultured in spinner flasks (150 ml) using CD-CHO medium (Gibco). Sampling was performed every 3 hours on the 2nd and 4th days of culture, and once a day on other days. For the sampled cells, the number of viable cells and the percentage of cells in G2+M phase were measured. Vi-Cell (product name: Beckman Coulter, Inc.) was used to measure the number of viable cells. Cell Cycle Phase Determination Kit was used to measure the total ratio of G2 phase cells and M phase cells, cells were labeled with a fluorescent dye according to the attached protocol, and measured with a flow cytometer (manufactured by Beckman Coulter). did

図６は、本実験による細胞の増殖曲線を示すグラフである。図６の縦軸は、細胞数密度であり、単位は×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。横軸は培養時間（日）である。図６に示すように、培養時間の経過に伴い、細胞数密度も高くなった。
また、図７は、培養２日目および培養４日目のフローサイトメータによる細胞周期の測定結果を示すグラフである。図７の縦軸は細胞数を示し、横軸はＰＩ蛍光強度（∝ＤＮＡ量）を示す。破線の折れ線は、培養２日目の細胞数を示し、実線の折れ線は、培養４日目の細胞数を示す。これらの折れ線の左側の山はＧ０期とＧ１期の細胞を示し、中央部分の折れ線部分はＳ期の細胞を示し、右側の折れ線の山はＧ２期とＭ期の細胞を示す（図５参照）。図７の折れ線グラフから、培養２日目および培養４日目の単位時間あたりの増殖細胞数を推定した。
図８は、前記した細胞周期から推定した増殖細胞数の推定値と、実際に計数して求めた増殖細胞数の実測値を示すグラフである。培養２日目も培養４日目も、前記推定値と実際に計数して求めた増殖細胞数とは同等の値となることが確認された。つまり、細胞周期から増殖細胞数を推定可能であることが確認された。すなわち、前記した推定値を前記した式８に適用することで比増殖速度（細胞増殖速度）を求められることが確認された。 FIG. 6 is a graph showing cell growth curves in this experiment. The vertical axis in FIG. 6 is the cell number density, and the unit is ×10 6 cells/mL. The horizontal axis is culture time (days). As shown in FIG. 6, the cell number density increased with the passage of culture time.
Moreover, FIG. 7 is a graph showing the measurement results of the cell cycle by a flow cytometer on the second day and the fourth day of culture. The vertical axis in FIG. 7 indicates the number of cells, and the horizontal axis indicates the PI fluorescence intensity (∝DNA amount). The dashed polygonal line indicates the number of cells on day 2 of culture, and the solid polygonal line indicates the number of cells on day 4 of culture. The peaks on the left side of these lines indicate cells in the G0 and G1 phases, the peaks in the middle portion indicate cells in the S phase, and the peaks on the right side indicate cells in the G2 and M phases (see FIG. 5). ). From the line graph in FIG. 7, the number of proliferating cells per unit time on the second day and the fourth day of culture was estimated.
FIG. 8 is a graph showing the estimated number of proliferating cells estimated from the cell cycle and the actually measured number of proliferating cells. It was confirmed that the above-mentioned estimated value and the number of proliferating cells obtained by actually counting were equivalent values on both the 2nd day and the 4th day of culture. In other words, it was confirmed that the number of proliferating cells can be estimated from the cell cycle. That is, it was confirmed that the specific growth rate (cell growth rate) can be obtained by applying the estimated value described above to Equation 8 described above.

＜解析制御手段＞
図１に戻って説明を続ける。解析制御手段８は、ＣＰＵやハードディスクドライブなどの記憶媒体を備えた汎用コンピュータやパーソナルコンピュータなどである。解析制御手段８は、当該記憶媒体に所定のプログラムを記憶させておき、これを読み出すことで解析制御手段８（コンピュータ）を所定の手段として機能させることができる。所定の手段としては、判別手段４、解析手段５、選定手段６、選別手段７が挙げられる。これらの手段については後述する。 <Analysis control means>
Returning to FIG. 1, the description continues. The analysis control means 8 is a general-purpose computer or personal computer equipped with a storage medium such as a CPU and a hard disk drive. The analysis control means 8 stores a predetermined program in the storage medium, and by reading the program, the analysis control means 8 (computer) can function as the predetermined means. As the predetermined means, a determination means 4, an analysis means 5, a selection means 6, and a selection means 7 are listed. These means will be described later.

また、解析制御手段８は、分析手段３から送られてきた前記情報に基づいて、攪拌翼２４の回転数やウォータージャケット２７の温度などを制御する。また、解析制御手段８は、前記情報に基づいて、ポンプＰ１～Ｐ３の圧力を適宜調整して培地添加手段２１から培養手段２への新鮮な培地を添加したり、培養手段２から細胞分離手段２２に培養液を送ったり、細胞分離手段２２から回収手段２３に生産物や老廃物等を含む培養液（細胞分離手段２２によって培養細胞が分離された培養液）を送ったりする。 Based on the information sent from the analysis means 3, the analysis control means 8 controls the rotational speed of the stirring blade 24, the temperature of the water jacket 27, and the like. Further, based on the information, the analysis control means 8 appropriately adjusts the pressure of the pumps P1 to P3 to add fresh medium from the medium addition means 21 to the culture means 2, or to add fresh medium from the culture means 2 to the cell separation means. 22, or from the cell separation means 22 to the recovery means 23, the culture solution containing products, waste products, etc. (culture solution from which the cultured cells have been separated by the cell separation means 22) is sent.

＜判別手段＞
前記したように、解析制御手段８は、判別手段４として機能することで、分析手段３で得られた分析値から細胞の培養状態が定常状態であるか否かを判別する。前記した定常状態の判別指標としては、細胞の栄養基質消費速度、細胞の副生成物分泌速度、細胞の代謝フラックス、および細胞の細胞呼吸速度のうちのいずれか１つ、または２つ以上を組み合わせたものであることが好ましい。これらの指標は、前記したセンサと分析手段３によって、例えば、グルコースやグルタミンなどの特定の栄養成分、乳酸やアンモニアなどの特定の代謝分泌物、ピルビン酸やクエン酸などの特定の細胞内代謝物、培養手段２内のＤＯおよびＤＣＯ２を適宜測定することで把握することができる。これらの判別指標を用いれば、細胞が定常状態であるか否か容易に且つ的確に判別することができる。 <Determination means>
As described above, the analysis control means 8 functions as the determination means 4 to determine from the analysis values obtained by the analysis means 3 whether or not the culture state of the cells is in a steady state. As the steady-state discriminant index, any one of the nutrient substrate consumption rate of the cell, the secretion rate of the by-product of the cell, the metabolic flux of the cell, and the cellular respiration rate of the cell, or a combination of two or more It is preferable that the These indicators are obtained by the sensor and analysis means 3 described above, for example, specific nutritional components such as glucose and glutamine, specific metabolic secretions such as lactic acid and ammonia, specific intracellular metabolites such as pyruvic acid and citric acid , can be determined by appropriately measuring DO and DCO 2 in the culture means 2 . By using these discrimination indices, it is possible to easily and accurately discriminate whether or not cells are in a steady state.

本実施形態においては、判別手段４で培養状態（細胞）が定常状態であると判別した後、すなわち、生産物生成期となった後に、前記｛（生産物生成速度）／（細胞増殖速度）｝、前記細胞周期のＧ０期およびＧ１期の合計期間、または、前記代謝フラックスの解析を行うのが好ましい。このようにすると、生産物を生成するのに好適な連続培養条件を選別することができる。 In the present embodiment, after determining that the culture state (cells) is in a steady state by the determining means 4, that is, after entering the product-producing stage, the {(product-producing rate)/(cell growth rate) }, the total duration of the G0 and G1 phases of the cell cycle, or the metabolic flux is preferably analyzed. In this way, suitable continuous culture conditions can be selected to produce the product.

＜解析手段＞
解析制御手段８は、解析手段５として機能することで、細胞の培養状態が定常状態であるときに、前記分析手段３で分析され、送信されてきた分析値から、細胞増殖速度、細胞周期、および代謝フラックスのうちの少なくとも１つの解析を行う。培養状態が定常状態であるときの細胞についてこれらの解析を行うことで、生産物生成期における好ましい連続培養条件を選別することが可能となる。 <Analysis means>
The analysis control means 8, by functioning as the analysis means 5, analyzes by the analysis means 3 when the culture state of the cells is in a steady state, and from the transmitted analysis values, the cell growth rate, the cell cycle, and metabolic flux. By performing these analyzes on cells when the culture state is in a steady state, it becomes possible to select preferable continuous culture conditions in the product production period.

＜選定手段＞
解析制御手段８は、選定手段６として機能することで、細胞増殖速度、細胞周期、および代謝フラックスのうちの少なくとも１つの解析結果に基づいて最適な連続培養条件を選定する。このように、スクリーニング装置１で設定した複数の細胞株とこれに関する連続培養条件について、これらの解析結果に基づいて最適な連続培養条件を選定するので、定常状態に達した後の細胞増殖が少なく、細胞増殖速度に対して生産物生成速度が高い連続培養用細胞株に適した連続培養条件を得ることが可能となる。 <Selection method>
The analysis control means 8 functions as the selection means 6 to select optimum continuous culture conditions based on the analysis result of at least one of cell growth rate, cell cycle, and metabolic flux. In this way, the optimum continuous culture conditions are selected based on the analysis results of the plurality of cell lines set in the screening device 1 and the continuous culture conditions related thereto, so that cell proliferation after reaching a steady state is small. , it is possible to obtain continuous culture conditions suitable for continuous culture cell lines with a high product production rate relative to the cell growth rate.

ここで、本実施形態では、選定手段６において、｛（生産物生成速度）／（細胞増殖速度）｝が最大になるという指標、前記細胞周期のＧ０期およびＧ１期の合計期間が最も長いという指標、および、前記代謝フラックスの分析によって決定された代謝経路の数が最も少ないという指標のうちから選択される少なくとも一つの指標に基づいて培地組成を決定するのが好ましい。前記したように、候補細胞株とその細胞株に適した連続培養条件とをセットで検討する必要があるので、このような決定を行うことによって、最適な連続培養条件を選定することができる。なお、この培地組成は、前記した培養手段２で設定した連続培養条件の中から決定される。 Here, in this embodiment, in the selection means 6, the indicator that {(product production rate) / (cell growth rate)} is maximized, and the total period of the G0 phase and G1 phase of the cell cycle is the longest. It is preferable to determine the medium composition based on at least one indicator selected from the indicator and the indicator that the number of metabolic pathways determined by the metabolic flux analysis is the smallest. As described above, it is necessary to examine a candidate cell line and continuous culture conditions suitable for that cell line as a set. By making such a determination, optimal continuous culture conditions can be selected. The medium composition is determined from the continuous culture conditions set in the culture means 2 described above.

また、本実施形態では、選定手段６において、｛（生産物生成速度）／（細胞増殖速度）｝が最大になるという指標、前記細胞周期のＧ０期およびＧ１期の合計期間が最も長いという指標、および、前記代謝フラックスの分析によって決定された代謝経路の数が最も少ないという指標のうちから選択される少なくとも一つの指標に基づいて細胞代謝経路を決定することが好ましい。ここで、細胞代謝経路を決定するとは、細胞代謝経路に含まれる種々の代謝経路に対して適切な代謝フラックス群を決定することをいう。このようにすると、細胞増殖に関する代謝系に対して生産物の生成に関する代謝系が優位な細胞のスクリーニングが可能となるため、品質にばらつきが少なく、高い生産性で生産物を生成できる連続培養条件を得ることができる。 Further, in the present embodiment, in the selection means 6, the indicator that {(product production rate)/(cell growth rate)} is maximized, the indicator that the total period of the G0 phase and G1 phase of the cell cycle is the longest , and that the number of metabolic pathways determined by the metabolic flux analysis is the smallest. Here, determining a cell metabolic pathway means determining an appropriate metabolic flux group for various metabolic pathways included in the cell metabolic pathway. By doing so, it is possible to screen cells in which the metabolic system related to product production is superior to the metabolic system related to cell growth, so continuous culture conditions that can produce products with little variation in quality and high productivity. can be obtained.

さらに、本実施形態では、選定手段６において、前記式２に示す（細胞増殖速度）が、指標として細胞周期を測定したものであることが好ましい。このようにすると、より確実に定常状態に達した後の細胞増殖が少ない細胞株を選別することができる。また、このようにすると、細胞周期の測定は１時間程度で解析できるため、スクリーニングにおける時間短縮を図ることができる。なお、細胞周期から細胞増殖速度を求めるには、前記したように式８などを用いるとよい。 Furthermore, in the present embodiment, in the selection means 6, it is preferable that the (cell growth rate) shown in Equation 2 is obtained by measuring the cell cycle as an index. In this way, it is possible to more reliably select cell lines with less cell proliferation after reaching a steady state. Moreover, in this way, the cell cycle can be measured and analyzed in about one hour, so that the time required for screening can be shortened. In order to obtain the cell growth rate from the cell cycle, Equation 8 or the like may be used as described above.

＜選別手段＞
そして、解析制御手段８は、選別手段７として機能することで、最適な連続培養条件で培養された細胞の細胞増殖速度または細胞周期と、その生産物生成速度と、を評価して、連続培養用細胞株を選別する。具体的には、｛（生産物生成速度）／（細胞増殖速度）｝が最大になるという指標、前記細胞周期のＧ０期およびＧ１期の合計期間が最も長いという指標、および、前記代謝フラックスの分析によって決定された代謝経路の数が最も少ないという指標のうちから選択される少なくとも一つの指標に基づいて連続培養用細胞株を選別する。このように、スクリーニング装置１で設定した複数の細胞株とこれに関する連続培養条件について、これらの解析結果に基づいて評価するので、定常状態に達した後の細胞増殖が少なく、細胞増殖速度に対して生産物生成速度が高い細胞株を選別することができる。 <Sorting means>
By functioning as the selection means 7, the analysis control means 8 evaluates the cell growth rate or cell cycle of the cells cultured under the optimal continuous culture conditions and the product production rate thereof, and continuously cultures Select cell lines for Specifically, an index that {(product production rate) / (cell growth rate)} is maximized, an index that the total period of the G0 phase and G1 phase of the cell cycle is the longest, and the metabolic flux A cell line for continuous culture is selected based on at least one indicator selected from the indicators that the number of metabolic pathways determined by analysis is the smallest. In this way, the multiple cell lines set in the screening device 1 and the continuous culture conditions related thereto are evaluated based on these analysis results. can be used to select cell lines with high product production rates.

本実施形態では、この選別手段７において、スクリーニングを行った複数の系統の細胞株について求めた｛（生産物生成速度）／（細胞増殖速度）｝が最大となるという指標、前記細胞周期のＧ０期およびＧ１期の合計期間が最も長いという指標、および、前記代謝フラックスの分析によって決定された代謝経路の数が最も少ないという指標のうちから選択される少なくとも一つの指標に基づいて連続培養用細胞株を選別する。なお、この細胞株は、接着系細胞株であってもよいし、浮遊系細胞株であってもよい。このようにすると、定常状態に達した後の細胞増殖が少なく、細胞増殖速度に対して生産物生成速度が高い細胞株（例えば、浮遊系細胞株）を選別することができる。 In this embodiment, in this selection means 7, the index that {(product production rate) / (cell growth rate)} obtained for the screened cell lines of a plurality of lines is maximized, the G0 of the cell cycle For continuous culture based on at least one index selected from the index that the total period of the phase and G1 phase is the longest, and the index that the number of metabolic pathways determined by the analysis of the metabolic flux is the smallest Sort cell lines. This cell line may be an adherent cell line or a suspension cell line. In this way, it is possible to select a cell line (for example, a suspension cell line) that exhibits less cell proliferation after reaching a steady state and a high product production rate relative to the cell growth rate.

また、本実施形態では、選別手段７において、前記式２に示す（細胞増殖速度）が遅い細胞株を選別するのが好ましい。このようにすると、定常状態に達した後の細胞増殖が少ないので、余剰細胞の分解による不純物、細胞分裂回数増加による変異、細胞増殖のための培地栄養成分と酸素供給、老廃物、二酸化炭素などを抑制できる。また、このようにすると、｛（生産物生成速度）／（細胞増殖速度）｝が大きくなり易く、好適である。 Further, in the present embodiment, it is preferable that the selection means 7 selects a cell line having a slow (cell growth rate) shown in Equation 2 above. In this way, there is little cell growth after reaching a steady state, so impurities due to the decomposition of surplus cells, mutations due to an increase in the number of cell divisions, medium nutrients and oxygen supply for cell growth, waste products, carbon dioxide, etc. can be suppressed. In addition, this is preferable because {(product production rate)/(cell growth rate)} tends to increase.

［連続培養条件のスクリーニング方法］
次に、図９を参照して本実施形態に係る連続培養条件のスクリーニング方法（以下、単に「スクリーニング方法」ということがある）について説明する。なお、図９は、スクリーニング方法の内容を説明するフローチャートである。以下の説明において、スクリーニング装置１と同じ要素については同じ符号を付して詳細な説明は省略する。 [Screening method for continuous culture conditions]
Next, a method for screening continuous culture conditions according to the present embodiment (hereinafter sometimes simply referred to as "screening method") will be described with reference to FIG. Note that FIG. 9 is a flowchart for explaining the contents of the screening method. In the following description, the same elements as those of the screening device 1 are denoted by the same reference numerals, and detailed description thereof is omitted.

本実施形態に係るスクリーニング方法は、実生産に用いられる連続培養装置（図示せず）内で細胞培養するときの連続培養条件をスクリーニングする方法である。
本スクリーニング方法は、図９に示すように、培養工程Ｓ１と、分析工程Ｓ２と、判別工程Ｓ３と、解析工程Ｓ４と、を複数の培養細胞および連続培養条件で実施するものであり、選定工程Ｓ５と、選別工程Ｓ６と、を含んでいる。培養工程Ｓ１から選別工程Ｓ６はこの順で行うのが好ましい。 The screening method according to the present embodiment is a method of screening continuous culture conditions when culturing cells in a continuous culture apparatus (not shown) used for commercial production.
In this screening method, as shown in FIG. 9, a culture step S1, an analysis step S2, a discrimination step S3, and an analysis step S4 are performed with a plurality of cultured cells under continuous culture conditions. S5 and a sorting step S6 are included. The culture step S1 to the selection step S6 are preferably performed in this order.

培養工程Ｓ１は、図示しない連続培養装置内で細胞を培養するときの連続培養条件を設定して細胞を培養する工程である。この培養工程Ｓ１は、前記した培養手段２で行われる。 The culturing step S1 is a step of culturing cells by setting continuous culture conditions for culturing cells in a continuous culture device (not shown). This culturing step S1 is performed by the culturing means 2 described above.

分析工程Ｓ２は、培養工程Ｓ１で培養している培養液をサンプリングし、生産物の濃度と培地成分を分析して分析値を得る工程である。この分析工程Ｓ２は、前記した分析手段３で行われる。 The analysis step S2 is a step of sampling the culture medium being cultured in the culture step S1 and analyzing the concentration of the product and the medium components to obtain analytical values. This analysis step S2 is performed by the analysis means 3 described above.

判別工程Ｓ３は、前記した分析値から細胞の培養状態が定常状態であるか否かを判別する工程である。この判別工程Ｓ３は、前記した判別手段４で行われる。 The discriminating step S3 is a step of discriminating whether or not the culture state of the cells is in a steady state from the above-described analysis value. This discrimination step S3 is performed by the discrimination means 4 described above.

解析工程Ｓ４は、培養状態が定常状態であるときに、前記分析値から生産物生成速度、細胞増殖速度、細胞周期、および代謝フラックスのうちの少なくとも１つの解析を行う工程である。この解析工程Ｓ４は、前記した解析手段５で行われる。 The analysis step S4 is a step of analyzing at least one of product production rate, cell growth rate, cell cycle, and metabolic flux from the analysis values when the culture is in a steady state. This analysis step S4 is performed by the analysis means 5 described above.

選定工程Ｓ５は、前記した細胞増殖速度、前記した細胞周期、および前記した代謝フラックスのうちの少なくとも１つの解析結果に基づいて最適な連続培養条件を選定する工程である。この選定工程Ｓ５は、前記した選定手段６で行われる。 The selection step S5 is a step of selecting optimum continuous culture conditions based on the analysis results of at least one of the cell proliferation rate, the cell cycle, and the metabolic flux. This selection step S5 is performed by the selection means 6 described above.

選別工程Ｓ６は、前記した最適な連続培養条件で培養された細胞を評価して、｛（生産物生成速度）／（細胞増殖速度）｝が最大になるという指標、細胞周期のＧ０期およびＧ１期の合計期間が最も長いという指標、および、代謝フラックスの分析によって決定された代謝経路の数が最も少ないという指標のうちから選択される少なくとも一つの指標に基づいて連続培養用細胞株を選別する工程である。この選別工程Ｓ６は、前記した選別手段７で行われる。 In the selection step S6, the cells cultured under the optimum continuous culture conditions described above are evaluated, and the index that {(product production rate)/(cell growth rate)} is maximized, the G0 and G1 phases of the cell cycle. Selecting cell lines for continuous culture based on at least one index selected from the index that the total phase duration is the longest and the index that the number of metabolic pathways determined by metabolic flux analysis is the smallest It is a process to do. This sorting step S6 is performed by the sorting means 7 described above.

次に、図１０を参照してスクリーニング方法の詳細な手順の一例を説明する。図１０は、スクリーニング方法の詳細な手順の一例を説明するフローチャートである。
図１０に示すように、スクリーニング方法は、最初に、調査すべき連続培養条件（温度、溶存酸素濃度、培地組成、攪拌回転数などの制御値）と培養試験を行う順番を設定する（培養条件設定、ステップＳ１１）。そして、スクリーニング装置１に最初の連続培養条件を設定し（培養条件設定、ステップＳ１１）、培養を開始する（ステップＳ１２）。なお、培養開始直後は、細胞は非定常状態であるため、定刻ごとに細胞培養液のサンプリングを行う（ステップＳ１３）。これらステップＳ１１、１２は培養工程Ｓ１で行い、ステップＳ１３は分析工程Ｓ２で行う。 Next, an example of detailed procedures of the screening method will be described with reference to FIG. FIG. 10 is a flowchart illustrating an example of detailed procedures of the screening method.
As shown in FIG. 10, in the screening method, first, continuous culture conditions to be investigated (temperature, dissolved oxygen concentration, medium composition, control values such as stirring rotation speed) and the order of performing culture tests are set (culture conditions setting, step S11). Then, initial continuous culture conditions are set in the screening device 1 (culture condition setting, step S11), and culture is started (step S12). Since the cells are in a non-stationary state immediately after the culture is started, the cell culture solution is sampled at regular intervals (step S13). These steps S11 and S12 are performed in the culture step S1, and step S13 is performed in the analysis step S2.

そして、生産物の濃度と培地成分を分析する。具体的には、細胞の状態を反映する生産物生成速度、細胞増殖速度、細胞周期、代謝フラックス、栄養基質消費速度、副生成物分泌速度などを少なくとも１つ分析する（生産物生成速度などの分析、ステップＳ１４）。このステップＳ１４も分析工程Ｓ２で行う。 The product concentration and medium components are then analyzed. Specifically, at least one of the product production rate, cell growth rate, cell cycle, metabolic flux, nutrient substrate consumption rate, by-product secretion rate, etc. that reflects the state of the cell is analyzed. Analysis, step S14). This step S14 is also performed in the analysis step S2.

ステップＳ１４における分析値について経時変化等がなく、ほぼ一定値となったときを定常状態と見なす（ステップＳ１５で“定常”）。一方、前回サンプリング時と比較して生産物生成速度、栄養基質消費速度、副生成物分泌速度、細胞内代謝フラックスなどの値が経時変化していれば、定常状態に達していないと判断する（ステップＳ１５で“非定常”）。なお、ステップＳ１４における分析値に関して、対数増殖期においては細胞数の増加に伴って栄養基質消費量や副生成物分泌量などが変化する。一方、対数増殖期を過ぎて定常状態となると、培地添加手段２１からの新鮮な液体培地の添加と細胞分離手段２２による老廃物の回収とにより、栄養基質消費量や副生成物分泌量などがほぼ一定となり、分析値について経時変化があまり生じない状態となる。そして、非定常の期間を分析し（ステップＳ１６）、当該期間が所定値を超えている場合、例えば、設定したサンプリング回数（もしくは培養時間）を経過しても定常状態が得られない場合（ステップＳ１６で“＞設定値”）、アラートを表示する。この場合、手動もしくは自動で培養を中止してもよく、または、手動もしくは自動で計画された次の連続培養条件に移行してもよい（この場合、図示はしないが、ステップＳ１１に戻る）。一方、非定常の期間を分析し（ステップＳ１６）、当該期間が所定値以下である場合（ステップＳ１６で“≦設定値”）ステップＳ１２に戻って培養を継続する。これらステップＳ１５、Ｓ１６は判別工程Ｓ３で行う。 When the analysis value in step S14 does not change over time and becomes a substantially constant value, it is regarded as a steady state ("steady" in step S15). On the other hand, if values such as product production rate, nutrient substrate consumption rate, by-product secretion rate, and intracellular metabolic flux change over time compared to the time of the previous sampling, it is judged that the steady state has not been reached ( "unsteady" in step S15). Regarding the values analyzed in step S14, the consumption of nutrient substrates, the secretion of by-products, and the like change as the number of cells increases in the logarithmic growth phase. On the other hand, when the logarithmic growth phase is passed and the steady state is reached, the addition of fresh liquid medium from the medium addition means 21 and the collection of waste products by the cell separation means 22 result in the consumption of nutrient substrates, the secretion of by-products, and the like. It becomes almost constant, and the analytical value does not change much over time. Then, the unsteady period is analyzed (step S16), and if the period exceeds a predetermined value, for example, if a steady state is not obtained even after the set number of sampling times (or culture time) has passed (step ">set value" in S16), an alert is displayed. In this case, the culture may be stopped manually or automatically, or the next continuous culture condition planned manually or automatically may be performed (in this case, although not shown, the process returns to step S11). On the other hand, an unsteady period is analyzed (step S16), and if the period is equal to or less than a predetermined value ("≤set value" in step S16), the process returns to step S12 to continue culturing. These steps S15 and S16 are performed in the discrimination step S3.

一方、定常状態である場合（ステップＳ１５で“定常”）、生産物生成速度、細胞増殖速度、細胞周期、代謝フラックスなどを解析する（ステップＳ１７）。このステップＳ１７は解析工程Ｓ４で行う。 On the other hand, if it is in a steady state ("steady" in step S15), the product production rate, cell growth rate, cell cycle, metabolic flux, etc. are analyzed (step S17). This step S17 is performed in the analysis step S4.

そして、解析結果を記録した後、実験条件の選定を行う。このとき、計画が未完であり、次の連続培養条件が計画されている場合には（ステップＳ１８で“計画未完”）、連続培養条件の設定を変更して、再度、ステップＳ１１から一連の手順を行う。
一方、解析結果を記録した後、計画が完了していたら培養を終了する（ステップＳ１８で“計画完了”）。このステップＳ１８も解析工程Ｓ４で行う。 After recording the analysis results, the experimental conditions are selected. At this time, if the plan is incomplete and the next continuous culture conditions are planned ("plan incomplete" in step S18), the setting of the continuous culture conditions is changed, and the series of procedures is repeated from step S11. I do.
On the other hand, after recording the analysis result, if the planning is completed, the cultivation is terminated ("Complete planning" in step S18). This step S18 is also performed in the analysis step S4.

次いで、例えば、最適な連続培養条件で培養された細胞を評価して、｛（生産物生成速度）／（細胞増殖速度）｝が最大となるという指標、前記細胞周期のＧ０期およびＧ１期の合計期間が最も長いという指標、および、前記代謝フラックスの分析によって決定された代謝経路の数が最も少ないという指標のうちから選択される少なくとも一つの指標に基づいて、連続培養条件の選定と、連続培養用細胞株の選別とを行う（ステップＳ１９）。このステップＳ１９は、選定工程Ｓ５および選別工程Ｓ６で行う。
他の候補細胞株がある場合、さらに他の候補細胞株での結果と比較し、最終的に生産性が最も良い細胞株および連続培養条件を選定・選別し、スクリーニングを完了する。 Then, for example, cells cultured under optimal continuous culture conditions are evaluated, and the index that {(product production rate) / (cell growth rate)} is maximized, the G0 phase and G1 phase of the cell cycle. selection of continuous culture conditions based on at least one index selected from the index that the total period is the longest and the index that the number of metabolic pathways determined by the metabolic flux analysis is the smallest; Selection of cell lines for continuous culture is performed (step S19). This step S19 is performed in the selection process S5 and the sorting process S6.
If there are other candidate cell lines, the results of other candidate cell lines are compared, and finally the cell line with the highest productivity and continuous culture conditions are selected and screened to complete the screening.

上記手順は一例である。ここで、図１１は、スクリーニング方法の詳細な手順の他の一例を説明するフローチャートである。図１１に示す他の一例では、細胞培養液のサンプリングを行った後に（ステップＳ１３）、生産物生成速度、細胞増殖速度、細胞周期、代謝フラックスなどの解析を行う（ステップＳ１７）。そして、このステップＳ１７の後に、生産物の濃度と培地成分を分析し、具体的には、細胞の状態を反映する生産物生成速度、栄養基質消費速度、副生成物分泌速度、細胞内代謝フラックスなどをいずれか１つ以上の分析を行っている（ステップＳ１４）。
つまり、図１１に示す他の一例では、ステップＳ１３とステップＳ１４の間でステップＳ１７を行っている点で、図１０に示す一例とは相違している。このようにすると、非定常の期間の生産物生成速度、細胞増殖速度などの解析を行うことができるので、非定常の期間の連続培養条件での細胞状態を把握することができる。 The above procedure is an example. Here, FIG. 11 is a flow chart explaining another example of the detailed procedure of the screening method. In another example shown in FIG. 11, after sampling the cell culture medium (step S13), analysis of product production rate, cell growth rate, cell cycle, metabolic flux, etc. is performed (step S17). Then, after this step S17, the concentration of the product and the medium components are analyzed. and so on are analyzed (step S14).
That is, the other example shown in FIG. 11 differs from the example shown in FIG. 10 in that step S17 is performed between steps S13 and S14. By doing so, it is possible to analyze the product production rate, cell growth rate, etc. during the non-steady period, so that the state of cells under continuous culture conditions during the non-steady period can be grasped.

また、図１２もスクリーニング方法の詳細な手順の他の一例を説明するフローチャートである。図１２に示す他の一例では、図１０に示す例と同様にしてステップＳ１７までを行い、生産物生成速度、細胞増殖速度、細胞周期、代謝フラックスなどを解析する。
そして、その後に、｛（生産物生成速度）／（細胞増殖速度）｝が最大となるという指標、前記細胞周期のＧ０期およびＧ１期の合計期間が最も長いという指標、および、前記代謝フラックスの分析によって決定された代謝経路の数が最も少ないという指標のうちから選択される少なくとも一つの指標に基づいて連続培養条件の選定と、連続培養用細胞株の選別とを行う（ステップＳ１９）。
そして、その後、選定した連続培養条件と選別した連続培養用細胞株とが、目標条件の仕様を達成しているか否かを判断する（ステップＳ２０）。これらが目標条件の仕様を達成していない場合（ステップＳ２０で“未達”）、連続培養条件の設定を変更して、再度、ステップＳ１１から一連の手順を行う。
一方、これらが目標条件の仕様を達成している場合（ステップＳ２０で“達成”）、予め計画された実験計画を全て実行しなくともスクリーニングを終了する。
つまり、図１２に示す他の一例では、実験条件の選定を行うステップＳ１８（図１０、図１１参照）を省略している点で、図１０に示す一例とは相違している。このようにすると、目標条件の仕様を達成し次第、スクリーニングを終了するので、時間とコストを削減することができる。 FIG. 12 is also a flow chart explaining another example of the detailed procedure of the screening method. In another example shown in FIG. 12, steps up to step S17 are performed in the same manner as in the example shown in FIG. 10 to analyze product production rate, cell growth rate, cell cycle, metabolic flux, and the like.
Then, after that, an index that {(product production rate) / (cell growth rate)} is maximized, an index that the total period of the G0 phase and G1 phase of the cell cycle is the longest, and the metabolic flux Selection of continuous culture conditions and selection of cell lines for continuous culture are performed based on at least one index selected from the indices indicating that the number of metabolic pathways determined by analysis is the smallest (step S19).
After that, it is determined whether or not the selected continuous culture conditions and the selected continuous culture cell line meet the specifications of the target conditions (step S20). If these do not achieve the specifications of the target conditions ("not achieved" in step S20), the setting of the continuous culture conditions is changed, and the series of procedures are performed again from step S11.
On the other hand, if these have achieved the specifications of the target conditions ("achieved" in step S20), the screening is terminated without executing all of the previously planned experimental plans.
That is, the other example shown in FIG. 12 differs from the example shown in FIG. 10 in that step S18 (see FIGS. 10 and 11) for selecting experimental conditions is omitted. In this way, the screening is finished as soon as the specification of the target condition is achieved, so that time and cost can be reduced.

以上に説明した本実施形態に係る連続培養条件のスクリーニング方法および連続培養条件のスクリーニング装置によれば、連続培養における不必要な細胞増殖が少ない細胞株を選別することができる。これにより、余剰細胞の分解による不純物増加、細胞分解数増加による変異、細胞増殖のための必要以上の培地栄養成分、酸素供給、老廃物、二酸化炭素除去を低減することができる。本実施形態に係る連続培養条件のスクリーニング方法および連続培養条件のスクリーニング装置は、細胞周期の制御だけでなく、細胞増殖に関わる代謝系に対して生産物の生成に関わる代謝系が優位な細胞のスクリーニングが可能である。従って、本実施形態に係るスクリーニング方法および連続培養条件のスクリーニング装置で選別された細胞株を利用することで品質にばらつきが少なく、高い生産性で目的物質を得ることができる。 According to the method for screening continuous culture conditions and the apparatus for screening continuous culture conditions according to the present embodiment described above, it is possible to select a cell line that causes little unnecessary cell proliferation in continuous culture. As a result, it is possible to reduce the increase in impurities due to the decomposition of surplus cells, the mutation due to the increase in the number of cell decomposition, the nutrient components in the medium, the supply of oxygen, the waste products, and the removal of carbon dioxide that are more than necessary for cell growth. The method for screening continuous culture conditions and the apparatus for screening continuous culture conditions according to the present embodiment not only control the cell cycle, but also detect cells in which the metabolic system involved in product generation is superior to the metabolic system involved in cell growth. Screening is possible. Therefore, by using a cell line selected by the screening method and the screening device under continuous culture conditions according to the present embodiment, a target substance can be obtained with little variation in quality and high productivity.

以上、本発明に係る連続培養条件のスクリーニング方法および連続培養条件のスクリーニング装置について実施形態により詳細に説明したが、本発明は前記した実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、前記した実施形態は本発明を分かり易く説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、それぞれの実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
さらに、制御線や情報線は説明上必要と考えられるものを示しており、製品上必ずしも全ての制御線や情報線を示しているとは限らない。実際には殆ど全ての構成が相互に接続されていると考えてもよい。 As described above, the method for screening continuous culture conditions and the apparatus for screening continuous culture conditions according to the present invention have been described in detail by way of embodiments, but the present invention is not limited to the above-described embodiments, and includes various modifications. be For example, the above-described embodiments have been described in detail in order to explain the present invention in an easy-to-understand manner, and are not necessarily limited to those having all the described configurations. Also, part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment. Moreover, it is possible to add, delete, or replace a part of the configuration of each embodiment with another configuration.
Furthermore, control lines and information lines indicate those considered necessary for explanation, and not all control lines and information lines are necessarily indicated on the product. In practice, it may be considered that almost all configurations are interconnected.

Ｓ１ 培養工程
Ｓ２ 分析工程
Ｓ３ 判別工程
Ｓ４ 解析工程
Ｓ５ 選定工程
Ｓ６ 選別工程
１、１Ａ 連続培養条件のスクリーニング装置（スクリーニング装置）
２ 培養手段
３ 分析手段
４ 判別手段
５ 解析手段
６ 選定手段
７ 選別手段 S1 culture step S2 analysis step S3 discrimination step S4 analysis step S5 selection step S6 selection step 1, 1A Screening device for continuous culture conditions (screening device)
2 culture means 3 analysis means 4 discrimination means 5 analysis means 6 selection means 7 selection means

Claims (5)

細胞周期のＧ０期およびＧ１期の合計期間が最も長いという指標、および、代謝フラックスの分析によって決定された代謝経路の数が最も少ないという指標のうちから選択される少なくとも一つの指標に基づいて連続培養用浮遊系細胞株を選別するものであり、
細胞が定常状態となった後に、前記細胞周期のＧ０期およびＧ１期の合計期間、または、前記代謝フラックスの解析を行う
ことを特徴とする連続培養条件のスクリーニング方法。 Continuity based on at least one index selected from the index that the total duration of the G0 and G1 phases of the cell cycle is the longest, and the index that the number of metabolic pathways is the smallest as determined by metabolic flux analysis It selects suspension cell lines for culture ,
After the cells reach a steady state, the total period of the G0 and G1 phases of the cell cycle, or the metabolic flux is analyzed.
A screening method for continuous culture conditions, characterized by: 請求項１において、
前記細胞周期のＧ０期およびＧ１期の合計期間が最も長いという指標、および、前記代謝フラックスの分析によって決定された代謝経路の数が最も少ないという指標のうちから選択される少なくとも一つの指標に基づいて培地組成を決定することを特徴とする連続培養条件のスクリーニング方法。 In claim 1,
Based on at least one indicator selected from the indicator that the total period of the G0 phase and G1 phase of the cell cycle is the longest, and the indicator that the number of metabolic pathways determined by the analysis of the metabolic flux is the smallest A method for screening continuous culture conditions, characterized in that the medium composition is determined by 請求項１において、
前記細胞周期のＧ０期およびＧ１期の合計期間が最も長いという指標、および、前記代謝フラックスの分析によって決定された代謝経路の数が最も少ないという指標のうちから選択される少なくとも一つの指標に基づいて細胞代謝経路を決定することを特徴とする連続培養条件のスクリーニング方法。 In claim 1,
Based on at least one indicator selected from the indicator that the total period of the G0 phase and G1 phase of the cell cycle is the longest, and the indicator that the number of metabolic pathways determined by the analysis of the metabolic flux is the smallest A method for screening continuous culture conditions, characterized in that a cell metabolic pathway is determined by 請求項１において、
前記定常状態の判別指標が、前記細胞の栄養基質消費速度、前記細胞の副生成物分泌速度、前記細胞の代謝フラックス、および前記細胞の細胞呼吸速度のうちのいずれか１つ、または２つ以上を組み合わせたものであることを特徴とする連続培養条件のスクリーニング方法。 In claim 1 ,
The steady-state discriminant index is any one or more of the nutrient substrate consumption rate of the cell, the secretion rate of byproducts of the cell, the metabolic flux of the cell, and the cellular respiration rate of the cell. A method for screening continuous culture conditions, which is characterized by combining 実生産に用いられる連続培養装置内で細胞培養するときの連続培養条件をスクリーニングする方法であり、
前記連続培養条件を設定して細胞を培養する培養工程と、
前記培養工程で培養している培養液をサンプリングし、生産物の濃度と培地成分を分析して分析値を得る分析工程と、
前記分析値から細胞の培養状態が定常状態であるか否かを判別する判別工程と、
前記培養状態が定常状態であるときに、前記分析値から細胞周期および代謝フラックスのうちの少なくとも１つの解析を行う解析工程と、
を複数の培養細胞および連続培養条件で実施し、
前記細胞周期および前記代謝フラックスのうちの少なくとも１つの解析結果に基づいて最適な連続培養条件を選定する選定工程と、
前記最適な連続培養条件で培養された細胞を評価して、前記細胞周期のＧ０期およびＧ１期の合計期間が最も長いという指標、および、前記代謝フラックスの分析によって決定された代謝経路の数が最も少ないという指標のうちから選択される少なくとも一つの指標に基づいて連続培養用細胞株を選別する選別工程と、
を含み、
前記細胞が定常状態となった後に、前記細胞周期のＧ０期およびＧ１期の合計期間、または、前記代謝フラックスの解析を行う
ことを特徴とする連続培養条件のスクリーニング方法。 A method for screening continuous culture conditions when culturing cells in a continuous culture apparatus used for commercial production,
a culturing step of setting the continuous culture conditions and culturing the cells;
an analysis step of sampling the culture medium cultivated in the culture step and analyzing the concentration of the product and the medium components to obtain analytical values;
A determination step of determining whether the cell culture state is a steady state from the analysis value;
an analysis step of analyzing at least one of cell cycle and metabolic flux from the analysis values when the culture state is a steady state;
was performed in multiple cell cultures and continuous culture conditions,
a selection step of selecting optimal continuous culture conditions based on analysis results of at least one of the cell cycle and the metabolic flux;
Evaluating the cells cultured in the optimal continuous culture conditions, the indicator that the total duration of the G0 phase and the G1 phase of the cell cycle is the longest, and the number of metabolic pathways determined by the analysis of the metabolic flux A selection step of selecting a cell line for continuous culture based on at least one index selected from among the indices of lowest;
including
After the cells reach a steady state, the total period of the G0 phase and G1 phase of the cell cycle, or the metabolic flux is analyzed
A screening method for continuous culture conditions, characterized by:
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