JP7189587B2 - メチル化関連酵素ｈａｔ１とｋａｔ８の阻害薬 - Google Patents

メチル化関連酵素ｈａｔ１とｋａｔ８の阻害薬 Download PDF

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Description

本発明は、悪性腫瘍の治療薬、幹細胞の生産方法、DNA損傷改善剤、又はHAT1及びKAT8阻害剤等に関する。
ヒトの死亡原因として、悪性腫瘍、心疾患、脳血管疾患などの疾患が上位に挙げられる。この中でも悪性腫瘍は、発生機序が複雑であるため、特に治療の難しい疾患といえる。近年では、nivolumabやPalbociclibなどが、新しい作用機序の抗悪性腫瘍薬として期待されている（非特許文献1）。本願発明者は、非特許文献2において、悪性腫瘍のバイオマーカーとしてhTERT mRNAを適用できることを報告している。また特許文献1、2、及び3において、特定のRNA鎖（miR-47 siRNA、has-mir-520d、ELAVL2 siRNA等）を悪性腫瘍の治療に使用できることを報告している。
一方で、近年の医療業界ではiPS細胞が注目を集めている。2012年にはiPS細胞の研究者にノーベル生理学・医学賞が贈られ、2014年には加齢黄斑変性患者に対する世界初の移植手術も行われた。このiPS細胞に関する技術としては、例えば、特許文献4に、4つの遺伝子（Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc）を細胞に導入した結果、細胞がiPS化したことが記載されている。また特許文献5には、3つの遺伝子（Oct3/4、Klf4、Sox2）と、1つのmiRNA（hsa-miR-372等）を細胞に導入することでiPS細胞を作製したことが記載されている。また本願発明者は、上記特許文献1、2、及び3において、特定のRNA鎖を細胞に導入することでiPS細胞を作製したことを報告している。
国際公開第2012/008301号 国際公開第2012/008302号 国際公開第2014/097875号 国際公開第2007/069666号 国際公開第2009/075119号
'A Review of 2014 Cancer Drug Approvals, With a Look at 2015 and Beyond' Butleret al., P T. 2015 Mar;40(3):191-205. 'A novel biomarker TERT mRNA is applicable for early detection of hepatoma.' Miura et al., BMC Gastroenterol. 2010 May 18;10:46.
しかしながら、現在も悪性腫瘍はヒトの死因の上位に位置しており、従来の治療戦略だけでは十分ではなかった。また、iPS細胞の作製技術・臨床応用は発展途上にあり、その作製手法は限られている。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、新規の悪性腫瘍の治療薬、幹細胞の生産方法、又はDNA損傷改善剤等を提供することを目的とする。
本願発明者は、後述する実施例に記載のように、悪性腫瘍細胞にHAT1及びKAT8の発現を阻害するshRNAを導入したところ、悪性腫瘍細胞が幹性化することを発見した。さらに、悪性腫瘍細胞をHAT1及びKAT8を阻害する低分子化合物で処理したところ、悪性腫瘍細胞の増殖が顕著に抑制された。加えて、紫外線照射による致命的なDNA損傷を受けた悪性腫瘍細胞を、上記低分子化合物で処理したところ、DNA損傷が顕著に改善した。そして、これらの結果に基づき、本願発明を完成させた。
即ち本発明の一態様によれば、HAT1及びKAT8阻害剤を含む、悪性腫瘍の治療薬が提供される。
また本発明の一態様によれば、HAT1阻害剤及びKAT8阻害剤を含む、悪性腫瘍の治療用キットが提供される。
また本発明の一態様によれば、HAT1阻害剤を含有する、KAT8阻害剤とHAT1阻害剤とが併用で用いられる、悪性腫瘍の治療薬が提供される。
また本発明の一態様によれば、KAT8阻害剤を含有する、HAT1阻害剤とKAT8阻害剤とが併用で用いられる、悪性腫瘍の治療薬が提供される。
また本発明の一態様によれば、HAT1及びKAT8を阻害する工程を含む、幹細胞の生産方法が提供される。
また本発明の一態様によれば、HAT1及びKAT8阻害剤を含む、幹性化誘導剤が提供される。
また本発明の一態様によれば、HAT1阻害剤及びKAT8阻害剤を含む、幹性化誘導用キットが提供される。
また本発明の一態様によれば、HAT1阻害剤を含有する、KAT8阻害剤とHAT1阻害剤とが併用で用いられる、幹性化誘導剤が提供される。
また本発明の一態様によれば、KAT8阻害剤を含有する、HAT1阻害剤とKAT8阻害剤とが併用で用いられる、幹性化誘導剤が提供される。
また本発明の一態様によれば、HAT1及びKAT8阻害剤を含む、DNA損傷改善剤が提供される。
また本発明の一態様によれば、HAT1阻害剤及びKAT8阻害剤を含む、DNA損傷改善用キットが提供される。
また本発明の一態様によれば、HAT1阻害剤を含有する、KAT8阻害剤とHAT1阻害剤とが併用で用いられる、DNA損傷改善剤が提供される。
また本発明の一態様によれば、KAT8阻害剤を含有する、HAT1阻害剤とKAT8阻害剤とが併用で用いられる、DNA損傷改善剤が提供される。
本発明によれば、例えば、悪性腫瘍の治療、幹細胞の生産、DNA損傷改善、又はHAT1及びKAT8に対する阻害を行うことができる。
図1は、shHAT1/shKAT8導入HLF細胞の細胞形態を調べた結果を表した図である。 図2は、shHAT1/shKAT8導入HLF細胞の細胞形状を調べた結果を表した図である。 図3は、shHAT1/shKAT8導入HLF細胞の幹細胞マーカーの発現解析結果を表した図である。 図4は、shHAT1/shKAT8導入HLF細胞の形質転換と分化の様子を調べた結果を表した図である。 図5は、クロルプロパミド等のCAS登録番号と、HAT1及びKAT8に対する結合力を示した図である。 図6は、クロルプロパミド等のHAT1及びKAT8に対する発現阻害効果を調べた結果を表した図である。 図7は、フォシノプリル等のCAS登録番号と、HAT1又はKAT8に対する結合力を示した図である。 図8～10は、オクスプレノロール塩酸塩等の悪性腫瘍細胞に対する増殖抑制効果を調べた結果を表した図である。 図11は、クロルプロパミドの悪性腫瘍細胞に対する増殖抑制効果を調べた結果を表した図である。 図12は、レバミピドの悪性腫瘍細胞への影響を調べた結果を表した図である。 図13は、クロルプロパミドの種々の腫瘍に対する抗腫瘍効果を調べた結果を表した図である。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑を避けるために、適宜説明を省略する。
本発明の一実施形態は、HAT1及びKAT8阻害剤を含む、悪性腫瘍の治療薬である。この治療薬を用いれば、悪性腫瘍の治療ができる。後述する実施例では、HAT1及びKAT8に対するshRNAを細胞に導入した結果、悪性腫瘍が幹細胞に形質転換している。即ち、HAT1及びKAT8の阻害は、悪性腫瘍を幹細胞に誘導することによって、抗悪性腫瘍効果を発揮した。また、HAT1及びKAT8を阻害する低分子化合物で悪性腫瘍細胞を処理した結果、悪性腫瘍の増殖が抑制された。
本発明の一実施形態において「HAT1」は、HAT1遺伝子、及びHAT1蛋白質を含む概念である。HAT1遺伝子及びHAT1蛋白質の詳細はHGNC(HUGO Gene Nomenclature Committee)又はUniProt（Universal Protein Resource）等のWEBサイトから見ることができる。HAT1遺伝子のHGNCに記載されているHGNC IDは、HGNC:4821であり、CHROMOSOMAL LOCATIONは2q31.2-q33.1である。また、HAT1はKAT1と呼ばれることもあり、そのようなHAT1と実質的に同一のものを意味する名称で表されるものも、HAT1に含まれる。また、HAT1蛋白質は、HAT1遺伝子由来の蛋白質、又はHAT1遺伝子から発現した蛋白質を含む。HAT1蛋白質の一般名称は特に限定されない。HAT1蛋白質のUniProtに記載されている名称はHistone acetyltransferase type B catalytic subunitであり、そのような名称で表されるものもHAT1蛋白質に含まれる。また、HAT1 mRNAは、例えば、配列番号1の塩基配列を含んでいてもよい。また、HAT1 mRNAはisoformとして存在してもよく、例えば、配列番号2、3、又は4の塩基配列を含んでいてもよい。
本発明の一実施形態において「KAT8」は、KAT8遺伝子、及びKAT8蛋白質を含む概念である。KAT8遺伝子及びKAT8蛋白質の詳細はHGNC(HUGO Gene Nomenclature Committee)又はUniProt（Universal Protein Resource）等のWEBサイトから見ることができる。KAT8遺伝子のHGNCに記載されているHGNC IDは、HGNC: 17933であり、CHROMOSOMAL LOCATIONは16p11.1である。また、KAT8はMYST1、FLJ14040、hMOF、MOF、又はZC2HC8と呼ばれることもあり、そのようなKAT8と実質的に同一のものを意味する名称で表されるものも、KAT8に含まれる。また、KAT8蛋白質は、KAT8遺伝子由来の蛋白質、又はKAT8遺伝子から発現した蛋白質を含む。KAT8蛋白質の一般名称は特に限定されない。KAT8蛋白質のUniProtに記載されている名称はHistone acetyltransferase KAT8であり、そのような名称で表されるものもKAT8蛋白質に含まれる。また、KAT8 mRNAは、例えば、配列番号5の塩基配列を含んでいてもよい。また、HAT1 mRNAはisoformとして存在してもよく、例えば、配列番号6、7、又は8の塩基配列を含んでいてもよい。
本発明の一実施形態において「HAT1及びKAT8阻害剤」は、HAT1及びKAT8の両方を阻害する阻害剤である。このHAT1及びKAT8阻害剤は、HAT1阻害剤及びKAT8阻害剤を含有する組成物であってもよい。HAT1及びKAT8阻害剤は、HAT1及びKAT8の両方の遺伝子発現、又は蛋白質機能を阻害する組成物を含む。HAT1及びKAT8阻害剤は、有効成分を1種類（例えば、HAT1及びKAT8の両方を阻害する成分）、又は2種類（例えば、HAT1を阻害する成分、及びKAT8を阻害する成分）含有していてもよい。
本発明の一実施形態において「悪性腫瘍」は、例えば、正常な細胞が突然変異を起こして発生する腫瘍を含む。悪性腫瘍は全身のあらゆる臓器や組織から生じ得る。この悪性腫瘍は、例えば、肺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、胆道癌、乳癌、大腸癌、小腸癌、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、前立腺癌、尿管癌、腎盂癌、尿管癌、陰茎癌、精巣癌、脳腫瘍、中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、頭頸部癌、グリオーマ、多形性膠芽腫、皮膚癌、メラノーマ、甲状腺癌、唾液腺癌、悪性リンパ腫、癌腫、肉腫、及び血液悪性腫瘍からなる群から選ばれる1種以上を含む。上記肝臓癌は、例えば、上皮性腫瘍、又は非上皮性腫瘍であってもよく、肝細胞癌、胆管細胞癌であってもよい。
本発明の一実施形態は、HAT1阻害剤及びKAT8阻害剤を含む、悪性腫瘍の治療用キットを含む。このキットを用いれば、悪性腫瘍の治療ができる。このキットは、例えば、緩衝液、有効成分情報を記載した添付文書、有効成分を収容するための容器、又はパッケージ等をさらに含んでいてもよい。
本発明の一実施形態は、HAT1阻害剤を含有する、KAT8阻害剤とHAT1阻害剤とが併用で用いられる、悪性腫瘍の治療薬を含む。この治療薬を用いれば、HAT1及びKAT8が阻害されることによって、悪性腫瘍の治療ができる。
本発明の一実施形態は、KAT8阻害剤を含有する、HAT1阻害剤とKAT8阻害剤とが併用で用いられる、悪性腫瘍の治療薬を含む。この治療薬を用いれば、HAT1及びKAT8が阻害されることによって、悪性腫瘍の治療ができる。
本発明の一実施形態において「併用で用いられる」は、HAT1阻害剤と、KAT8阻害剤とが同時に又は別々に投与されてもよい。また「併用で用いられる」は、HAT1阻害剤と、KAT8阻害剤とが合剤として投与される形態を含む。また、「併用で用いられる」は、併用療法において用いられることを含む。また、投与の順番は、HAT1阻害剤を先に投与してもよく、KAT8阻害剤を先に投与してもよい。また本発明の一実施形態は、HAT1阻害剤と、KAT8阻害剤とを含む、悪性腫瘍治療用の合剤である。また本発明の一実施形態は、HAT1阻害剤の、HAT1阻害剤とKAT8阻害剤とが併用で用いられるための悪性腫瘍治療薬の製造のための使用である。
本発明の一実施形態は、対象者のHAT1及びKAT8を阻害する工程を含む、悪性腫瘍の治療方法である。また本発明の一実施形態は、HAT1及びKAT8阻害剤、又はHAT1阻害剤もしくはKAT8阻害剤を対象者に投与する工程を含む、治療方法である。また本発明の一実施形態は、悪性腫瘍の治療薬の製造のための、HAT1及びKAT8阻害剤、又はHAT1阻害剤もしくはKAT8阻害剤の使用である。対象者は、HAT1阻害剤、又はKAT8阻害剤を投与後の患者であってもよい。
本発明の一実施形態は、HAT1及びKAT8阻害剤、又はHAT1阻害剤もしくはKAT8阻害剤を含む、悪性腫瘍細胞の増殖抑制剤である。本発明の一実施形態は、HAT1及びKAT8を阻害する工程を含む、悪性腫瘍細胞の増殖抑制方法である。
本発明の一実施形態において「細胞の増殖が抑制されている状態」は、被験細胞の増殖速度が、薬剤処理前に比べて有意に減少している状態を含む。増殖速度は、一定期間の細胞の増殖量を測定することで評価できる。増殖量の測定は、例えば、吸光度を指標にして測定しても良く、目視で行ってもよい。又は、増殖量の測定は、患者又は患者由来サンプル中の悪性腫瘍マーカーの量を指標にして測定してもよい。
本発明の一実施形態において「治療」は、患者の疾患、もしくは疾患に伴う1つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることを含む。本発明の一実施形態において「治療薬」は、薬理学的に許容される1つもしくはそれ以上の担体を含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、例えば有効成分と上記担体とを混合し、製剤学の技術分野において知られる任意の方法により製造できる。また治療薬は、治療のために用いられる物であれば使用形態は限定されず、有効成分単独であってもよいし、有効成分と任意の成分との混合物であってもよい。また上記担体の形状は特に限定されず、例えば、固体又は液体（例えば、緩衝液）であってもよい。なお悪性腫瘍の治療薬は、悪性腫瘍の予防のために用いられる薬物（予防薬）、又は悪性腫瘍の良性化誘導剤もしくは正常幹細胞化誘導剤を含む。治療は、老化性の皮膚科病変の治療、抗悪性腫瘍薬によるDNA損傷の治療を含む。この抗悪性腫瘍薬は、例えば、DNA損傷誘発性の抗悪性腫瘍薬であってもよい。
治療薬の投与経路は、治療に際して効果的なものを使用するのが好ましく、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、又は経口投与等であってもよい。投与形態としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤等であってもよい。ポリヌクレオチドを治療薬として投与する場合には、注射剤として用いることが効果的である。注射用の水溶液は、例えば、バイアル、又はステンレス容器で保存してもよい。また注射用の水溶液は、例えば生理食塩水、糖(例えばトレハロース)、NaCl、又はNaOH等を配合してもよい。また治療薬は、例えば、緩衝剤(例えばリン酸塩緩衝液)、安定剤等を配合してもよい。
投与量は特に限定されないが、例えば、1回又は1日あたり0.0001、0.001、0.01、0.1、1、2、3、4、5、10、50、100、150、200mg/kg体重であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。又は、例えば、1回又は1日あたり0.01、0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000、15000、20000、又は40000mg/人であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。投与間隔は特に限定されないが、例えば、1、2、7、10、14、又は30日に1回投与であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。投与量、投与間隔、投与方法は、対象者の年齢や体重、症状、対象臓器等により、適宜選択することが可能である。また、他の適切な化学療法薬と併用で投与してもよい。また治療薬は、治療有効量、又は所望の作用を発揮する有効量の有効成分を含むことが好ましい。悪性腫瘍のマーカーが、投与後に減少した場合に、治療効果があったと判断してもよい。
投与量は、悪性腫瘍の効率的な治療を実現する観点、及び安全性の観点からは、対象者に有効成分を投与後の有効成分の血中濃度が、最高有効血中濃度以下となる投与量であることが好ましい。又は、有効血中濃度内となる量であることが好ましい。有効血中濃度（最高有効血中濃度、又は最小有効血中濃度を含む）は、薬が有効に作用し、且つ副作用が出にくい血中濃度を含む。有効血中濃度は、医薬品のインタビューフォームに記載の値を採用できる。又は、有効成分をヒトに投与し、十分な薬効があり、且つ副作用が出にくい投与量を調べることによって算出してもよい。又は、臨床試験で得られた値をもとに算出してもよい。上記治療薬は、悪性腫瘍の治療薬を除く治療用途（例えば、抗菌剤等）における最高有効血中濃度が同定されている治療薬であってもよく、治療薬投与後の有効成分の血中濃度が、上記最高有効血中濃度以下又は有効血中濃度内となるように投与されるための、治療薬であってもよい。
本発明の一実施形態において「最高有効血中濃度」は、例えば、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、又は500μg/mlであってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。本発明の一実施形態において「最小有効血中濃度」は、例えば、0.001、0.01、0.1、1、10、100、500、1000、2500、5000、1.0×104、1.0×105、1.0×106、又は1.0×107pg/mlであってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。
投与量は、後述の実施例2に記載のクロルプロパミド、バンコマイシン塩酸塩、ベタキソロール塩酸塩、硫酸コリスチン、フマル酸ビソプロロール、臭化ピナベリウム、オクスプレノロール塩酸塩、塩化メチルベンゼトニウム、臭化デメカリウム、セリプロロール塩酸塩、アミカシン水和物、及びアルプレノロール塩酸塩（以下、クロルプロパミド等と称することもある）を有効成分とする市販の医薬品（但し、悪性腫瘍以外の適応症に対する医薬品）のインタビューフォームに記載されている投与量であってもよい。このインタビューフォームに記載されている投与量は、順に、500 mg/人、2.0 g/人、200 mg/人、400,000単位、10.2 mg/人、200 mg/人、300 mg/人、120 mg/人、10%、0.25%、198 mg/人、400 mg/人、及び150 mg/人である。
なお、上記のクロルプロパミド等を有効成分とする市販の医薬品の適応症は、順に、2型糖尿病、MRSA感染症、本態性高血圧症・腎実質性高血圧症・狭心症・緑内障・高眼圧症、大腸菌・赤痢菌・多剤耐性緑膿菌・感染性腸炎、本態性高血圧症・狭心症・虚血性心疾患・拡張型心筋症に基づく慢性心不全、過敏性腸症候群、頻脈性不整脈・狭心症、皮膚や粘膜の感染症、緑内障、本態性高血圧症・腎実質性高血圧症・狭心症、敗血症肺炎・肺膿瘍・慢性呼吸器病変の二次感染・膀胱炎・腎盂腎炎・腹膜炎、狭心症,・頻脈性不整脈である。また、インタビューフォームに記載されている最高有効血中濃度(Cmax)は、順に、30μg/ml、30μg/ml、41.8ng/ml、4.4μg/ml、100ng/ml、1μg/ml、30μg/μl、0.3% (1.93 μg/mL)、0.25%、300 ng/mL、25μg/mL、120 ng/mLである。
投与量は、後述の実施例2に記載のフォシノプリル、トシル酸クロフィリウム、スプロフェン、塩酸エスモロール、アトラクチロシドカリウム塩、イミペネム、エチフェニン、セフィキシム、ベンズブロマロン、セフォペラゾン二水和物、ピナシジル、ニセルゴリン、オキセサゼイン、及びアンチピリン（以下、フォシノプリル等と称することもある）を有効成分とする市販の医薬品（但し、悪性腫瘍以外の適応症に対する医薬品）のインタビューフォームに記載されている投与量であってもよい。このインタビューフォームに記載されている投与量は、順に、40.2 mg/人、27.36 g/人、10 g/day、100 mg/人、300 mg/人、1.0 g/人、400 mg/人、100 mg/人、150 mg/人、4.0 g/人、24 mg/人、15 mg/人、15 mg/人、1.0 g/人である。
なお、上記のフォシノプリル等を有効成分とする市販の医薬品の適応症は、順に、高血圧・心不全、心不全・不整脈、炎症疾患・痛みを伴う疾患、不整脈・高血圧、糖尿病・肥満症、細菌感染症、動脈硬化・血栓症、細菌感染症、高尿酸血症・痛風、高血圧、脳血管微小循環異常症、消化性潰瘍・逆流性食道炎・胃痛症、痛みを伴う疾患、頭痛・リウマチ・月経痛である。また、フォシノプリル等を有効成分とする市販の医薬品のインタビューフォームに記載されている最高有効血中濃度(Cmax)は、順に、4μg/mL、110 ng/mL、1%外用、2.7μg/mL、60μg/mL、82.8μg/mL、5.0μg/mL、3.97μg/mL、3.1μg/mL、1,000 ng/ml、2.5μg/mL、96 ng eq./mL、1μg/mL、50μg/mLである。
投与量は、後述の実施例2に記載のメルブロミン、グリコピロレート、メトプロロール-(+,-)(+)-酒石酸塩、メシル酸ペルゴリド、及びブメタニド（以下、メルブロミン等と称することもある）を有効成分とする市販の医薬品（但し、悪性腫瘍以外の適応症に対する医薬品）のインタビューフォームに記載されている投与量であってもよい。このインタビューフォームに記載されている投与量は、順に、100 mg/人、50μg/day、120 mg/人、252μg/人、4.0 g/人である。
なお、上記のメルブロミン等を有効成分とする市販の医薬品の適応症は、順に、感染症、過敏性腸症候群・麻酔前処置・気管支閉塞症、高血圧、パーキンソン病、浮腫・心不全である。また、メルブロミン等を有効成分とする市販の医薬品のインタビューフォームに記載されている最高有効血中濃度(Cmax)は、順に、2%(外用溶液濃度)、40 ng/ml、77 ng/ml、26μg/L、882 ng/mlである。
悪性腫瘍の治療効果は、画像検査、内視鏡検査、生研、又は悪性腫瘍マーカーの検出により評価してもよい。各治療効果は、対象者又は対象者由来サンプル（例えば、組織、細胞、細胞集団、又は血液）中のマーカー量が、治療薬投与後に有意に減少した場合に、治療効果があったと判断してもよい。このとき、治療薬投与後のマーカー量は、投与前（又はコントロール）に比べて、0.7、0.5、0.3、又は0.1倍以下に減少していてもよい。又は、対象者由来サンプル中のマーカー陽性細胞数が、治療薬投与後に有意に減少した場合に、治療効果があったと判断してもよい。このとき、治療薬投与後のマーカー陽性細胞数は、投与前（又はコントロール）に比べて、0.7、0.5、0.3、又は0.1倍以下に減少していてもよい。
本発明の一実施形態において「対象者」は、健常人、被験者、又は患者を含む。対象者は、ヒト、又はヒトを除く哺乳動物（例えば、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ネズミ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、マーモセット、サル、又はチンパンジー等の1種以上）を含む。また患者は、悪性腫瘍を発症していると判断又は診断された患者であってもよい。又は、患者は、悪性腫瘍の治療を必要としている患者であってもよい。又は、患者は、紫外線損傷を有する対象者、又は紫外線損傷改善もしくはDNA損傷改善を必要としている対象者であってもよい。又は、患者は、抗癌剤を投与後の対象者、又は投与予定の対象者であってもよい。なお、判断又は診断は、画像検査、内視鏡検査、生研、又は各種マーカーを検出することにより行ってもよい。
本発明の一実施形態は、HAT1及びKAT8を阻害する工程を含む、幹細胞の生産方法を含む。この生産方法によれば、簡便に幹細胞を生産することができる。また、複雑な操作を必ずしも必要とせず、効率、及びコストの面から優れている。
本発明の一実施形態は、HAT1及びKAT8阻害剤を含む、幹性化誘導剤を含む。また別の実施形態は、HAT1阻害剤及びKAT8阻害剤を含む、幹性化誘導用キットである。また別の実施形態は、HAT1阻害剤を含有する、KAT8阻害剤とHAT1阻害剤とが併用で用いられる、幹性化誘導剤である。また別の実施形態は、KAT8阻害剤を含有する、HAT1阻害剤とKAT8阻害剤とが併用で用いられる、幹性化誘導剤である。また別の実施形態は、HAT1及びKAT8を阻害する工程を含む、細胞を幹性化する方法である。これらによれば、簡便に幹細胞を生産することができる。また別の実施形態は、細胞にHAT1及びKAT8阻害剤、又はHAT1阻害剤もしくはKAT8阻害剤を接触させる工程を含む、細胞を幹性化する方法である。幹性化は、幹細胞化を含む。
また上記方法は、HAT1及びKAT8阻害剤を細胞又は細胞集団に接触させる工程を含んでいてもよい。接触させる工程は、導入する工程を含んでいてもよい。また、HAT1阻害剤及びKAT8阻害剤、を細胞又は細胞集団に導入する工程を含んでいてもよい。また、上記阻害剤が導入された細胞又は細胞集団から、幹細胞又は幹細胞集団を回収する工程を含んでいてもよい。また、幹細胞マーカーを検出する工程を含んでいてもよい。また、細胞を幹細胞用培地で培養する工程を含んでいてもよい。また、細胞を、例えば、細胞増殖因子、又は細胞接着分子を含む培地で培養する工程を含んでいてもよい。上記細胞増殖因子は、例えば、basic FGF、bFGF、又はFGF-bを含む。上記細胞接着分子は、例えば、VTN-Nを含む。培養時間は、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、又は100日以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。上記回収は、細胞形態、又は遺伝子発現を指標にして回収してもよい。上記回収は、分離又は単離する操作を含む。
本発明の一実施形態は、上記幹細胞を培養する工程を含む、再生医療用材料の生産方法である。再生医療用材料は、例えば、再生医療用臓器である。また別の実施形態は、幹細胞を培養して得られる、再生医療用材料である。また別の実施形態は、幹細胞又は幹細胞集団を損傷部位に導入する工程を含む、損傷組織の治療方法である。また別の実施形態は、幹細胞又は幹細胞集団を含む、損傷組織を治療するための治療薬である。
本発明の一実施形態は、HAT1及びKAT8を阻害する工程を含む、幹細胞マーカー発現細胞の生産方法を含む。幹細胞マーカーは、例えば、Klf4、c-Myc、Oct4、Sox2、PROM1、Nanog、SSEA-1、ALP、eRas、Esg1、Ecat1、Fgf4、Gdf3、又はREX-1を含む。幹細胞マーカーは、未分化マーカー、又は多能性幹細胞マーカーを含む。
本発明の一実施形態において「幹細胞」は、自己複製能と、別の種類の細胞に分化する能力とを有する細胞を含む。この幹細胞は、多能性幹細胞を含む。本発明の一実施形態において「多能性幹細胞」は、多能性を有している幹細胞である。多能性幹細胞は、例えば、ヒト人工多能性幹細胞であるhiPSC（HPS0002 253G1）に比べて、いずれかの未分化マーカーを同程度かそれ以上発現している細胞を含む。人工的に作製した多能性幹細胞は、iPS細胞と称されることもある。また、上述の実施形態の生産方法によって得られた幹細胞は、p53を高発現していてもよい。このp53の発現量は、例えば、コントロール試料（例えば、hiPSC（HPS0002 253G1）、p53ノックアウト細胞、正常細胞、またはそれらに由来する試料等）のp53発現量に対して、有意に高発現していることが好ましい。またこのp53の発現量は、例えば、コントロール試料のp53発現量に対して、1.05、1.1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、3.0、4.0、5.0、10、100、又は1000倍以上であってもよい。p53の発現量の測定方法は、測定精度及び簡便性の面からリアルタイムPCRが好ましい。
本発明の一実施形態において「細胞」は、体細胞であってもよい。体細胞は、例えば、皮膚、心臓、肝臓、肺、胃、腸、腎臓、子宮、大動脈外膜、又は間葉系組織由来の細胞であってもよい。
本発明の一実施形態は、HAT1及びKAT8に対する阻害剤を、細胞集団に接触させる工程を含む、細胞集団中の幹細胞の割合を増加させる方法である。また別の実施形態は、HAT1及びKAT8に対する阻害剤を、細胞集団に接触させる工程を含む、幹細胞の割合が増加した細胞集団の生産方法である。また別の実施形態は、HAT1阻害剤及びKAT8阻害剤を、細胞集団に接触させる工程を含む、細胞集団中の幹細胞の割合を増加させる方法である。また別の実施形態は、HAT1阻害剤及びKAT8阻害剤を、細胞集団に接触させる工程を含む、幹細胞の割合が増加した細胞集団の生産方法である。
本発明の一実施形態において「細胞集団」は、複数の細胞を含む集団である。この細胞集団は、例えば、実質的に均一な細胞を含む集団であってもよい。また細胞集団は、細胞調製物であってもよい。細胞調製物は、例えば、細胞と、緩衝液又は培地成分とを含んでいてもよい。幹細胞細団は、幹細胞を、例えば、80、90、95、96、97、98、99、又は100％以上含んでいてもよく、それらいずれか2つの値の範囲内含んでいてもよい。
本発明の一実施形態は、上記の阻害剤を含む、研究用又は医療用キットである。このキットは、例えば、幹細胞作成用、人工臓器作成用、又は治療用のキットであってもよい。
本発明の一実施形態は、HAT1又はKAT8の発現又は機能を低下させる被検物質を選抜する工程を含む、幹細胞誘導剤、悪性腫瘍の治療薬、又はDNA損傷改善剤のスクリーニング方法である。この方法によれば、効率的に幹細胞誘導剤、悪性腫瘍の治療薬、又はDNA損傷改善剤を得ることができる。この方法は、細胞に被検物質を導入する工程と、HAT1又はKAT8の発現又は機能量を測定する工程と、を含んでいてもよい。
本発明の一実施形態において「遺伝子の発現を阻害すること」は、例えば、遺伝子からmRNAへの転写機構を阻害、又はmRNAから蛋白質もしくはポリペプチドへの翻訳機構を阻害することを含む。また、例えば、遺伝子、mRNA、蛋白質の分解を誘導することで阻害することを含む。また生化学分野において、遺伝子の役目は、例えば、その遺伝子由来のmRNAを生成すること、その遺伝子由来の蛋白質を生成すること、その遺伝子由来の蛋白質に活性を発揮させることが挙げられる。そのため、本発明の一実施形態において「遺伝子の機能を阻害すること」は、遺伝子の発現を阻害した結果、mRNA又は蛋白質の生成量が低下することを含む。又は、「遺伝子の機能を阻害すること」は、その遺伝子由来のmRNA、又はその遺伝子由来の蛋白質の有する活性を低下させることを含む。
本発明の一実施形態において「発現が阻害されている状態」は、発現量が、正常時に比べて有意に減少している状態を含む。上記「有意に減少」とは、例えば、発現量が0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.01、又は0倍以下に減少している状態であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内まで減少している状態であってもよい。悪性腫瘍細胞の増殖を効率的に抑制する観点、又は幹細胞を安定的に生産する観点からは、0.2倍以下が好ましく、0.1倍以下がさらに好ましい。なお発現量はmRNA量、又は蛋白質量を指標としてもよい。また本発明の一実施形態において「有意に」は、例えば統計学的有意差をスチューデントのt検定(片側又は両側)を使用して評価し、p＜0.05であるときを含んでいてもよい。又は、実質的に差異が生じている状態を含む。なお、「機能が阻害されている状態」の阻害強度についても、発現阻害の阻害強度の実施形態と同様のことがいえる。
本発明の一実施形態において「阻害剤」の形態は特に限定されず、例えば、ポリヌクレオチド（例えば、RNA鎖、DNA鎖を含む）、低分子化合物（例えば、低分子有機化合物を含む）、抗体、もしくはポリペプチド（例えば、酵素を含む）、又はそれらを含有する組成物であってもよい。上記RNA鎖は、例えば、HAT1又はKAT8に対する翻訳抑制性RNA分子であってもよい。翻訳抑制性RNA分子は、遺伝子から蛋白質への翻訳を抑制する作用を有するRNA分子を含む。翻訳抑制性RNA分子は、例えば、RNAi分子、又はmiRNA関連分子を含む。翻訳抑制作用の確認は、リアルタイムRT-PCRによるRNA鎖発現量の定量によって行なうことができる。または、ノザンブロットによるRNA鎖発現量の解析や、ウェスタンブロットによる蛋白量の解析・表現型の観察等の方法でも行うことができる。また、特定の遺伝子に対する翻訳抑制性RNA分子を生成するプラスミドは、例えば、受託会社（例えば、タカラバイオ（株）等）から購入することができる。上記DNA鎖としては、上記RNA鎖をコードするDNA鎖を使用できる。このDNA鎖の形態は、例えば、ベクターであってもよい。上記抗体は、公知の抗体作製法（例えば、Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-628.に記載の方法）により作製してもよいし、受託会社（例えば、Abcam plc）から購入してもよい。このとき、抗体ライブラリを作製し、阻害活性の高いものを選択することが好ましい。上記ポリペプチドは、受託会社（例えば、Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）から購入してもよい。
上記低分子化合物は、例えば、FDA library screeningによって得ることができる。又は、コンビナトリアルケミストリーやHTS（ハイスループットスクリーニング）を活用することで、得ることができる。コンビナトリアルケミストリーには、例えば、自動合成装置L-COSシリーズ（昭光サイエンティフィック社）を使用してもよい。HTSには、例えば、Octetシステム（ForteBio社）を使用してもよい。阻害剤のスクリーニングは、例えば、被験物質と被験細胞とを接触させた後、mRNAの発現量、又は蛋白質の機能を調べる工程、コントロール（例えば、緩衝液）を使用した場合に比べて、上記発現量又は機能が0.2倍以下に低下ししている場合に被験物質が阻害剤であると評価する工程、を経て行ってもよい。上記低分子化合物は、悪性腫瘍細胞の増殖をより効果的に抑制する観点、幹細胞を効率的に生産する観点、又はDNA損傷をより効果的に改善する観点からは、クロルプロパミド、バンコマイシン、ベタキソロール、コリスチン、ビソプロロール、臭化ピナベリウム、オクスプレノロール、塩化メチルベンゼトニウム、臭化デメカリウム、セリプロロール、アミカシン、及びアルプレノロールからなる群から選ばれる1種以上の化合物、その塩、又はそれらの溶媒和物が好ましい。また、上記低分子化合物は、HAT1を阻害する観点からは、フォシノプリル、クロフィリウム、スプロフェン、エスモロール、アトラクチロシド、イミペネム、エチフェニン、セフィキシム、ベンズブロマロン、セフォペラゾン、ピナシジル、ニセルゴリン、オキセサゼイン、及びアンチピリンからなる群から選ばれる1種以上の化合物、その塩、又はそれらの溶媒和物が好ましい。また、上記低分子化合物は、KAT8を阻害する観点からは、メルブロミン、グリコピロレート、メトプロロール、ペルゴリド、及びブメタニドからなる群から選ばれる1種以上の化合物、その塩、又はそれらの溶媒和物が好ましい。
また、阻害剤は、HAT1又はKAT8に対する分子間結合力が、Avg KD (M)で1.0×10-5、5.0×10-6、1.0×10-6、5.0×10-7、1.0×10-7、5.0×10-8、1.0×10-8、5.0×10-9、1.0×10-9、1.0×10-10、1.0×10-11、又は1.0×10-12以下であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。この値は、悪性腫瘍細胞の増殖を効率的に抑制する観点、幹細胞を安定的に生産する観点、又はDNA損傷の改善効率を高める観点からは、5.0×10-6以下が好ましく、1.0×10-7以下がより好ましく、1.0×10-8以下がより好ましく、5.0×10-9以下がさらに好ましい。また、阻害剤は、HAT1又はKAT8に対する分子間結合力が、Avg Kon (1/Ms)で5.0×10、1.0×102、5.0×102、1.0×103、5.0×103、1.0×104、5.0×104、1.0×105、5.0×105、又は1.0×106以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。この値は、悪性腫瘍細胞の増殖を効率的に抑制する観点、幹細胞を安定的に生産する観点、又はDNA損傷の改善効率を高める観点からは、1.0×102以上が好ましく、1.0×103以上がより好ましく、5.0×103以上がより好ましく、1.0×104以上がさらに好ましい。また、阻害剤は、HAT1又はKAT8に対する分子間結合力が、Avg Koff (1/s)で1.0×10-2、5.0×10-3、1.0×10-3、5.0×10-4、1.0×10-4、5.0×10-5、1.0×10-5、5.0×10-6、1.0×10-6、1.0×10-7、又は1.0×10-8以下であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。この値は、悪性腫瘍細胞の増殖を効率的に抑制する観点、幹細胞を安定的に生産する観点、又はDNA損傷の改善効率を高める観点からは、5.0×10-3以下が好ましく、1.0×10-3以下がより好ましく、4.0×10-5以下がより好ましく、5.0×10-5以下がさらに好ましい。分子間結合力は、例えば、表面プラズモン共鳴分析法で測定できる。表面プラズモン共鳴分析法は、例えば、Biacoreシステム（例えば、Biacore T100）を使用してもよい。又は、受託会社に分子間結合力の解析を委托してもよい。
また、阻害剤は、悪性腫瘍細胞の増殖をより効果的に抑制する観点、幹細胞を効率的に生産する観点、又はDNA損傷をより効果的に改善する観点からは、翻訳抑制性RNA分子、又は低分子化合物であることが好ましい。阻害剤は、対象の発現を阻害する物質、又は機能を阻害する物質を含む。阻害剤は、細胞毒性が低い、又は実質的に細胞毒性を有さない物質であることが好ましい。この場合、阻害剤を生体内に投与したときに、副作用を抑えることができる。なお、特に指定した場合には、阻害剤の形態からhsa-miR-520d-5p、その成熟miRNAを含む核酸、それらに実質的に同等な核酸、又はそれらを発現する核酸を除いてもよい。
本発明の一実施形態において「剤」は、例えば、治療薬、医薬部外品、外用薬、美容剤、化粧料、又は薬用化粧料を含む。この剤は、有効成分と、薬理学的又は美容学的に許容される1つもしくはそれ以上の担体とを含む組成物であってもよい。使用量、使用間隔、使用方法は、対象者の年齢や体重、症状、対象部位等により、適宜選択してもよい。剤は、in vitro又はin vivoで使用できる。剤は、治療有効量、美容有効量、又は所望の作用を発揮する有効量の有効成分を含むことが好ましい。
上記阻害剤の細胞への導入、及びその細胞の培養方法は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。細胞への導入は、例えば、ウイルスベクターを用いた感染導入、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、又はマイクロインジェクションなどを使用できる。また薬剤耐性やセルソーター等を利用して、導入された細胞のみを選択することができる。培地は、例えば、細胞増殖因子を含む培地であってもよい。又は培地は、未分化維持用培地（例えば、多能性幹細胞用培地、ReproStem、霊長類ES細胞用培地（コスモ・バイオ社））、又は通常のヒト細胞用の培地（例えば、DMEMやRPMIベースの培地）等を使用してもよい。例えば、ReproStemで37℃、5％ CO2、10％ FBSの条件で培養可能してもよい。この数値は、例えば、プラスマイナス10、20、又は30％の範囲で前後させてもよい。フィーダー細胞の非存在下で樹立、又は培養してもよい。上記RNA鎖を細胞に導入する場合、複数のRNA鎖を細胞に併用導入してもよい。また、上記DNA鎖を細胞に導入する場合、複数のDNA鎖を細胞に導入してもよい。ここで、「複数のRNA鎖」又は「複数のDNA鎖」は、2、3、4、5、10、又は20個以上のRNA鎖又はDNA鎖であってもよい。
本発明の一実施形態において「ベクター」は、ウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、又はHIV等）ベクター、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pBR322）、枯草菌由来のプラスミド（例、pUB110）、酵母由来プラスミド（例、pSH19）、λファージなどのバクテリオファージ、psiCHECK-2、pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo、pSUPER（OligoEngine社）、BLOCK-it Inducible H1 RNAi Entry Vector（インビトロジェン社）、pRNATin-H1.4/Lenti (GenScript, corp., NJ, USA)などを用いることができる。上記ベクターは、プロモーター、複製開始点、又は抗生物質耐性遺伝子など、DNA鎖の発現に必要な構成要素を含んでいてもよい。上記ベクターはいわゆる発現ベクターであってもよい。
また、上記RNA鎖は、安定的にHAT1又はKAT8の発現を抑制する観点からは、HAT1 mRNA又はKAT8 mRNAの一部をターゲットシークエンスとする翻訳抑制性RNA分子であることが好ましい。また上記RNA鎖は、安定的にHAT1及びKAT8の発現を抑制する観点からは、HAT1 mRNA又はKAT8 mRNAの一部に対して相補的な塩基配列を含むことが好ましい。また上記RNA鎖は、ガイド鎖を含んでいてもよい。上記「一部」は、例えば、5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、又は50塩基以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。後述の実施例1では、HAT1及びKAT8のそれぞれについて、抑制保証付きshRNAレンチウィルスベクターセットを使用した。
後述する実施例1で使用したHAT1 shRNA発現レンチウイルス粒子（psi-LVRU6GP for HAT1 mixture, Genecopoeia社）、は、標的遺伝子に対するshRNAをコードする4種類のプラスミドから生成される。カタログナンバーは、それぞれHSH021144-31-LVRU6GP、HSH021144-32-LVRU6GP、HSH021144-33-LVRU6GP、HSH021144-34-LVRU6GPである。上記4種類のプラスミドから4種類のshRNAが生成される。この4種類のshRNAのターゲットシークエンスは、それぞれ配列番号10(5'-CCAACACAGCAAUUGAACUAA-3')、11(5'-GCCAUUCGGAACCUUACUUCA-3')、12(5'-GCUUUCGAGAAUAUCAUGAAA-3')、13(5'-GCUAGAAGGGUUUAUGAAAUU-3')である。この4つのshRNAからsiRNAが生じた場合、ガイド鎖は配列番号14(GGUUGUGUCGUUAACUUGAUU)、15(CGGUAAGCCUUGGAAUGAAGU)、16(CGAAAGCUCUUAUAGUACUUU)、又は17(CGAUCUUCCCAAAUACUUUAA)の塩基配列をそれぞれ含む。また、パッセンジャー鎖は配列番号18、19、20、21の塩基配列をそれぞれ含む。
後述する実施例1で使用したKAT8 shRNA発現レンチウイルス粒子（psi-LVRU6GP for KAT8 mixture, Genecopoeia社）は、標的遺伝子に対するshRNAをコードする4種類のプラスミドから生成される。カタログナンバーは、それぞれHSH020510-31-LVRU6GP、HSH020510-32-LVRU6GP、HSH020510-33-LVRU6GP、HSH020510-34-LVRU6GPである。この4種類のプラスミドから4種類のshRNAが生成される。この4種類のshRNAのターゲットシークエンスは、それぞれ配列番号22(5'-CCGAGAGGAAUUCUAUGUACA-3')、23(5'-GGGAACUACGAAAUUGAUGCC-3')、24(5'-CACCAAGGUGAAGUAUGUGGA-3')、25(5'-GUACUGCCUCAAGUACAUGAA-3')である。この4つのshRNAからsiRNAが生じた場合、ガイド鎖は配列番号26(GGCUCUCCUUAAGAUACAUGU)、27(CCCUUGAUGCUUUAACUACGG)、28(GUGGUUCCACUUCAUACACCU)、又は29(CAUGACGGAGUUCAUGUACUU)の塩基配列をそれぞれ含む。また、パッセンジャー鎖は配列番号30、31、32、33の塩基配列をそれぞれ含む。
本発明の一実施形態において、配列番号10～33で示される塩基配列は、所望の効果を有する限り、（a）いずれかの塩基配列において、1又は複数個の塩基配列が欠失、置換、挿入、もしくは付加している塩基配列、及び（b）いずれかの塩基配列に対して、90％以上の相同性を有する塩基配列、からなる群から選ばれる1つ以上の塩基配列であってもよい。
本発明の一実施形態において「複数個」は、例えば、10、8、6、5、4、3、又は2個であってもよく、それらいずれかの値以下であってもよい。悪性腫瘍細胞の増殖をより効果的に抑制する観点、幹細胞を効率的に生産する観点、又はDNA損傷をより効果的に改善する観点からは、3個以下が好ましく、2個以下がより好ましい。
本発明の一実施形態において「90％以上」は、例えば、90、95、96、97、98、99、又は100％以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。上記「相同性」は、2つもしくは複数間の塩基配列において相同な塩基数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定してもよい。割合を算定する前には、比較する塩基配列群の塩基配列を整列させ、同一塩基の割合を最大にするために必要である場合は塩基配列の一部に間隙を導入する。整列のための方法、割合の算定方法、比較方法、及びそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られている(例えば、BLAST、GENETYX等)。相同性（％）は、Blastnのデフォルト設定によって測定された値で表してもよい。又は相同性（％）は、（相同な塩基数/比較元の塩基配列の塩基数）×100で表してもよい。
本発明の一実施形態において「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドもしくは塩基、またはそれらの等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。ポリヌクレオチドは、例えば、化学修飾を受けたポリヌクレオチド、塩を形成したポリヌクレオチド、溶媒和物を形成したポリヌクレオチド、化学物質結合性のポリヌクレオチドを含む概念である。化学修飾は、例えば、メチル化を含む。化学物質は、細胞取込促進物質（例えば、PEG又はその誘導体）、標識タグ（例えば、蛍光標識タグ等）、又はリンカー（例えば、ヌクレオチドドリンカー等）を含む。ヌクレオチドは、例えば、非化学修飾もしくは化学修飾のRNA塩基又はDNA塩基を含む概念である。等価物は、ヌクレオチドアナログを含む。ヌクレオチドアナログは、非天然のヌクレオチドを含む。「RNA鎖」は、非化学修飾もしくは化学修飾のRNA塩基、又はその等価物が2個以上連結した形態を含む。ポリヌクレオチドは、1本鎖又は2本鎖ポリヌクレオチドを含む。塩基配列は、例えば、A（アデニン）、G（グアニン）、C（シトシン）、T（チミン）によって表すことができる。また、TとU（ウラシル）は、用途に合わせて互いに読み替えてもよい。このように表された塩基配列中の塩基は、非化学修飾又は化学修飾のA、G、C、Tを含む。
ポリヌクレオチドの塩基数は、例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、又は500であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、DNA/RNA合成装置を用いて合成可能である。その他、DNA塩基又はRNA塩基合成の受託会社（例えば、インビトロジェン社やタカラバイオ社等）から購入することもできる。また、ベクターの合成も各メーカーに委託することができる。
本発明の一実施形態において「miRNA関連分子」は、例えば、miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAを含む。miRNA関連分子は、標的RNA鎖の翻訳抑制に寄与することが知られている。また、miRNAは部分的にしか結合せずにミスマッチを含む不完全な相補鎖でも翻訳阻害を引きこすことが知られている。
本発明の一実施形態において「RNAi分子」は、RNAi作用を有するRNA鎖であり、例えば、siRNA、shRNA、又はRNAi作用を有するsmall RNA等を挙げることができる。RNAi分子のデザインには、例えば、siDirect 2.0（Naito et al., BMC Bioinformatics. 2009 Nov 30;10:392.）等を使用できる。また、受託会社（例えば、タカラバイオ（株）等）に委託してもよい。
本発明の一実施形態において「RNAi」は、siRNA、shRNA、短鎖もしくは長鎖の1もしくは2本鎖RNA、又はそれらの修飾物等の1つ以上によって、標的遺伝子もしくはmRNA等の機能が抑制、又はサイレンシングされる現象を含む。
本発明の一実施形態において「siRNA」は、RNAiを誘導可能なRNA鎖を含む。一般的にsiRNAの2本鎖はガイド鎖とパッセンジャー鎖に分けることができ、ガイド鎖がRISCに取り込まれる。RISCに取り込まれたガイド鎖は、標的RNAを認識するために使われる。RNAi研究では主に人工的に作成したものが使用されるが、生体内において内在的に存在するものも知られている。RNA鎖は15塩基以上のRNAから構成されていてもよい。15塩基以上の場合、標的のポリヌクレオチドに対して精度よく結合できる可能性が高まる。また、RNA鎖は40塩基以下のRNAから構成されていてもよい。40塩基以下の場合、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクがより低くなる。
本発明の一実施形態において「shRNA」は、RNAiを誘導可能で、且つヘアピン状に折りたたまれた構造（ヘアピン様構造）を形成可能な1本鎖のRNA鎖を含む。典型的には、shRNAは細胞内でDicerによって切断され、siRNAが切り出される。このsiRNAによって標的RNAの切断が生じることが知られている。上記shRNAは35以上のヌクレオチドから構成されていてもよい。35以上の場合、shRNAに特有のへアピン様構造を精度よく形成できる可能性が高まる。また、上記shRNAは100塩基以下のRNAから構成されていてもよい。100塩基以下の場合、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低くなる。但し、一般的にshRNAと構造および機能が類似しているpre-miRNAの多くが、100ヌクレオチド程度またはそれ以上の長さを有していることから、shRNAの長さは必ずしも100塩基以下でなくても、shRNAとして機能できると考えられる。
本発明の一実施形態において「small RNA」とは、比較的小さいRNA鎖をいい、例えば、siRNA、shRNA、miRNA関連分子、アンチセンスRNA、1または2本鎖の低分子RNAなどを挙げることができる。
翻訳抑制性RNA分子は、翻訳抑制効率を上昇させる観点からは、5'末端又は3'末端に1～5塩基からなるオーバーハングを含んでいてもよい。この数は、例えば、5、4、3、2、または1塩基であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。また翻訳抑制性RNA分子が2本鎖のとき、各RNA鎖間にミスマッチRNAが存在していてもよい。その数は、例えば、1、2、3、4、5、又は10個以下であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。また翻訳抑制性RNA分子は、ヘアピンループを含んでいてもよい、ヘアピンループの塩基数は、例えば、10、8、6、5、4、又は3塩基であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。なお、各塩基配列の表記は、左側が5'末端、右側が3'末端である。
翻訳抑制性RNA分子の長さは、例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、又は500であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。この数は、翻訳抑制効率を高める観点からは、15以上、又は100以下が好ましい。
本発明の一実施形態は、HAT1及びKAT8阻害剤を含む、DNA損傷改善剤である。このDNA損傷改善剤は、DNA損傷を改善することができる。後述する実施例では、HAT1及びKAT8を阻害する低分子化合物で、紫外線照射による致命的なDNA損傷を受けた細胞を処理した結果、DNA損傷が顕著に改善していた。
このDNA損傷改善剤は、DNA損傷改善効果を高める観点からは、対象者が紫外線を受けた後に使用されることが好ましい。又は、このDNA損傷改善剤は、DNA損傷改善効果を高める観点からは、夜間に使用されることが好ましい。夜間は、日没から就寝前の間、又は18～26時を含む。18～26時は、18、19、20、21。22、23、24、25、又は26時であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。
本発明の一実施形態において「改善剤」は、美容用の組成物であってもよい。また、美容用の組成物は化粧用に用いられる組成物を含む。また改善剤は、研究用、又は再生医療用の組成物であってもよい。また改善剤は、治療用の組成物であってもよい。また損傷改善剤は、損傷修復用組成物を含む。修復用組成物は修復促進用組成物を含む。
またDNA損傷改善剤は、経皮吸収用組成物であってもよい。DNA損傷改善剤は、皮膚に塗布することで使用してもよい。DNA損傷改善剤の剤型は、例えば、クリーム剤、又は液剤あってもよい。
本発明の一実施形態において「DNA損傷」は、例えば、DNA一本鎖の切断、DNA二本鎖の切断、DNA塩基の化学的変異を含む。組成物によるDNA損傷の改善効果は、DNA損傷によって低下した細胞増殖が、組成物による処理によって増加したことによって評価してもよい。又は、市販のキット（例えば、OxiSelect（COSMO BIO co.,ltd.）、CometAssay Kit（Funakoshi Co., Ltd.））を使用することよって評価してもよい。
本発明の一実施形態において「紫外線」は、波長が10～400 nmの電磁波を含む。この波長は、例えば、10、50、100、200、250、280、300、315、350、又は400であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。美容促進の観点からは、近紫外線（200～380nm）による損傷を改善することが好ましい。近紫外線は、UVA (315～400nm)、UVB(280～315nm)、UVC (280 nm未満) に分けることもできる。紫外線照射量は、例えば、0.01、0.1、0.5、1、5、15、20、25、又は30J/cm2であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。
本発明の一実施形態において「美容」は、容姿を美しくすることを含む。美容は、例えば、UV照射により損傷を受けた肌に対して、整肌効果を発揮することを含む。
本発明の一実施形態において「研究用」、又は「再生医療用」の組成物は、例えば、研究又は再生医療で使用される材料（例えば、細胞、又は組織）に対する、紫外線、又はDNA損傷誘発性の物質に起因する材料の損傷、又は増殖抑制を改善するために使用されてもよい。これにより、研究用又は再生医療用材料を効率よく使用できる。
本発明の一実施形態は、HAT1及びKAT8阻害剤、又はHAT1阻害剤もしくはKAT8阻害剤を含有する、紫外線損傷改善剤である。この紫外線損傷改善剤は、紫外線による細胞の損傷を改善することができる。この紫外線損傷改善剤は、UVを受けて実質的に細胞死に至った細胞に対しても、紫外線損傷のサルベージ効果を発揮し得る。
本発明の一実施形態は、HAT1及びKAT8阻害剤、又はHAT1阻害剤もしくはKAT8阻害剤を含有する、美容剤又は化粧料である。この美容剤又は化粧料は、紫外線による細胞の損傷を改善することができる。美容剤又は化粧料は、例えば、美白成分（例えば、アルブチン等）、保湿成分（例えば、ワセリン、ヒアルロン酸Na等）、又は美肌成分（例えば、ビタミンC等）を含有していてもよい。また美容剤又は化粧料は、例えば、美容用容器又は化粧用容器内に含有されている美容剤又は化粧料であってもよい。美容用容器又は化粧用容器は、例えば、チューブ、ポンプ式容器、広口ジャー容器、又は細口ボトル容器を含む。
本発明の一実施形態は、HAT1及びKAT8阻害剤、又はHAT1阻害剤もしくはKAT8阻害剤を含有する組成物を対象者に投与する工程を含む、美容方法である。この方法によれば、DNA損傷を受けた対象者の細胞を改善することができる。本発明の一実施形態において「改善」は、損傷を受けた状態をもとの状態に近づける作用を含み、例えば、修復又は治療を含む。また、剤を対象者に投与する工程は、剤を対象者の皮膚に投与する工程を含んでいてもよい。また美容方法は、皮膚を洗浄する工程、又は皮膚を消毒する工程を含んでいてもよい。
本発明の一実施形態は、HAT1及びKAT8阻害剤、又はHAT1阻害剤もしくはKAT8阻害剤を対象者に投与する工程を含む、DNA損傷改善方法である。また本発明の一実施形態は、HAT1及びKAT8阻害剤、又はHAT1阻害剤もしくはKAT8阻害剤を対象者に投与する工程を含む、紫外線損傷改善方法である。投与する工程は、対象者の皮膚に塗布する工程を含んでいてもよい。また以上のいずれかの方法は、皮膚に組成物を投与する工程、皮膚を洗浄する工程、又は皮膚を消毒する工程を含んでいてもよい。また以上のいずれかの方法は、対象者に抗癌剤を投与する工程を含んでいてもよい。本発明の一実施形態は、HAT1及びKAT8阻害剤、又はHAT1阻害剤もしくはKAT8阻害剤の、DNA損傷改善剤又は紫外線損傷改善剤の製造のための使用である。
本発明の一実施形態は、HAT1及びKAT8阻害剤、又はHAT1阻害剤もしくはKAT8阻害剤を研究又は再生医療用材料に接触させる工程を含む、DNA損傷改善方法、又は紫外線損傷改善方法である。
本発明の一実施形態は、クロルプロパミド、バンコマイシン、ベタキソロール、コリスチン、ビソプロロール、臭化ピナベリウム、オクスプレノロール、塩化メチルベンゼトニウム、臭化デメカリウム、セリプロロール、アミカシン、及びアルプレノロールからなる群から選ばれる1種以上の化合物、その塩、又はそれらの溶媒和物を含む、悪性腫瘍の治療薬、幹性化誘導剤、又はDNA損傷改善剤を含む。これらによれば、悪性腫瘍の治療、幹性化誘導、又はDNA損傷改善ができる。
本発明の一実施形態は、クロルプロパミド、バンコマイシン、ベタキソロール、コリスチン、ビソプロロール、臭化ピナベリウム、オクスプレノロール、塩化メチルベンゼトニウム、臭化デメカリウム、セリプロロール、アミカシン、及びアルプレノロールからなる群から選ばれる1種以上の化合物、その塩、又はそれらの溶媒和物を含む、HAT1及びKAT8阻害剤を含む。この阻害剤によれば、HAT1及びKAT8の阻害をすることができる。
この阻害剤は、HAT1及びKAT8の阻害効率を高める観点からは、クロルプロパミド、バンコマイシン塩酸塩、ベタキソロール塩酸塩、硫酸コリスチン、フマル酸ビソプロロール、臭化ピナベリウム、オクスプレノロール塩酸塩、塩化メチルベンゼトニウム、臭化デメカリウム、セリプロロール塩酸塩、アミカシン水和物、及びアルプレノロール塩酸塩から選ばれる1種以上の化合物を含むことが好ましい。
本発明の一実施形態において「塩」は、特に限定されないが、例えば任意の酸性（例えばカルボキシル）基で形成されるアニオン塩、又は任意の塩基性（例えばアミノ）基で形成されるカチオン塩を含む。塩類には無機塩および有機塩を含み、[Berge,BighleyおよびMonkhouse, J.Pharm.Sci., 1977, 66, 1-19]に記載されている塩が含まれる。例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性又は酸性アミノ酸との塩等が挙げられる。金属塩は、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等）、アルミニウム塩等が挙げられる。有機塩基との塩は、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、2，6-ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、N，N'-ジベンジルエチレンジアミン等との塩が挙げられる。無機酸との塩は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等との塩が挙げられる。有機酸との塩は、例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、メシル酸、トシル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸等との塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩は、例えば、アルギニン、リジン、オルニチン等との塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩は、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等との塩が挙げられる。
本発明の一実施形態において「溶媒和物」は、溶質および溶媒によって形成される化合物である。溶媒和物については例えば、[J.Honig et al., The Van Nostrand Chemist's Dictionary P650 (1953)]を参照できる。溶媒が水であれば形成される溶媒和物は水和物である。この溶媒は、溶質の生物活性を妨げないものが好ましい。そのような好ましい溶媒の例として、限定するものではないが、水、エタノール、および酢酸が挙げられる。最も好ましい溶媒は、水（例えば、一水和物、二水和物、三水和物を含む）である。本発明に係る化合物又はその塩は、大気に触れるか又は再結晶するときに水分を吸収し、場合によっては吸湿水を有するか又は水和物となりうる。
本明細書において引用しているあらゆる刊行物、公報類（特許、又は特許出願）は、その全体を参照により援用する。
本明細書において「又は」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。本明細書において「A～B」は、A以上B以下を意味するものとする。
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。また、上記実施形態に記載の構成を組み合わせて採用することもできる。
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜実施例1＞
1.1 HAT1及びKAT8に対するshRNAによる阻害
HAT1 shRNA発現レンチウイルス粒子（psi-LVRU6GP for HAT1 mixture, Genecopoeia社）、及びKAT8 shRNA発現レンチウイルス粒子（psi-LVRU6GP for KAT8 mixture, Genecopoeia社）の両方（以下、shHAT1/shKAT8と称することもある。）を、HLF細胞（肝癌細胞）に対して各1細胞1コピーで感染導入した後、RT-PCRで標的遺伝子の発現量を調べた。その結果、HAT1遺伝子及びKAT8遺伝子の有意な抑制効果を確認した。shHAT1/shKAT8導入HLF細胞をRPMI1640培地で7日培養したときの細胞形態を図1に示す。HLF細胞へのshRNAの導入細胞は形態変化を呈し、球状化した（左下）。さらに7日培養すると、放射状にネットワークする独特なHLF細胞の形態と全く異なる形態を呈した（右下）。これは、HLF細胞が幹性化した後に、分化したことを示している。
また上記とは別に、HAT1遺伝子又はKAT8遺伝子の一方に対するshRNAを単独でHLF細胞に感染導入させた。その結果、単独投与では有意な細胞の形態変化は見られなかった。
1.2 細胞の形状
shHAT1/shKAT8導入HLF細胞をRPMI1640培地で7日培養した後、形状をセルソーターを用いて調べた。その結果を図2下段に示す。図2上段は、スクランブル（コントロールの核酸）をHLF細胞に導入した場合である。この解析法は、細胞の正面と側面からの測定結果を示しており、球状であれば(d)の下段赤の弧（矢印）の方向に細胞集団が多く示される。また、(e)において右側のピークは、球状の脂肪が存在することを意味している。この実験により、shHAT1/shKAT8を導入したHLF細胞のほとんどが球状を呈していることが確認された。
1.3 幹細胞マーカーの発現解析
shHAT1/shKAT8導入HLF細胞をRPMI1640培地で7日培養した後、間葉系幹細胞培地で7日間培養し、細胞免疫染色で蛋白質発現を調べた。その結果を図3に示す。多能性細胞マーカーNanog及び間葉系幹細胞マーカーCD105が発現していた。このことは、shHAT1/shKAT8導入HLF細胞はHLF細胞とは異なる細胞になり、かつ幹細胞系へ形質転換したことを示している。GFP発現はベクターが導入された細胞であることを示す。
1.4 細胞の形質転換と分化
shHAT1/shKAT8導入HLF細胞をRPMI1640培地で7日培養した後、間葉系幹細胞培地で7日間培養し、肝分化マーカーCD13で細胞免疫染色をした。その結果を図4に示す。図4上段に示すように、肝分化マーカーCD13の発現が見られた。このことは、間葉系幹細胞への形質転換が生じ、肝分化系に分化途上過程であることを示している（上段右）。さらに、分化可能培養液（RPMI1640）で7日培養すると、幹細胞マーカーは有意な発現を示さず、細胞内に脂肪を多量に産生する細胞（下段:中と右）への分化をOil Red O染色（中段:左）と蛍光観察（下段:左）で確認できた。DAPI染色（中段:右）は、球状の細胞が小細胞の集団であることを示しており、これらの結果は、肝癌細胞が幹細胞への形質転換を示したことを示している。
1.5 免疫不全マウスへの投与
shHAT1/shKAT8導入HLF細胞を5x107個/匹で8匹のKSN/Slcマウスの右背部に200μlで皮下注射し、2か月間腫瘍径を観察記録した。移植1週間後-3週間後は10mm大であったが、すべての移植腫瘍が徐々に縮小化し、2か月後には消失した。
＜実施例2＞
2.1 HAT1及びKAT8に対する低分子化合物による阻害
FDA library screening (委托解析、PLEXERA社、Woodinville, WA, USA)）によって、HAT1及びKAT8の両方の機能を阻害する低分子化合物を12種類同定した。化合物名はクロルプロパミド（Chlorpropamide）、バンコマイシン塩酸塩（Vancomycin hydrochloride）、ベタキソロール塩酸塩（Betaxolol hydrochloride）、硫酸コリスチン（Colistin sulfate）、フマル酸ビソプロロール（Bisoprolol fumarate）、臭化ピナベリウム（Pinaverium bromide）、オクスプレノロール塩酸塩（Oxprenolol hydrochloride）、塩化メチルベンゼトニウム（Methyl benzethonium chloride）、臭化デメカリウム（Demecarium bromide）、セリプロロール塩酸塩（Celiprolol HCl）、アミカシン水和物（Amikacin hydrate）、及びアルプレノロール塩酸塩（Alprenolol hydrochloride）（以下、クロルプロパミド等と称することもある）である。これらを有効成分とする医薬品（但し、悪性腫瘍以外の適応症に対する医薬品）は、既に市販されている。そのため、これらの化合物は安全性が高い。。
各低分子化合物のCAS登録番号と、HAT1及びKAT8に対する結合力を図5に示す。各低分子化合物は、HAT1及びKATに対して強い分子間結合力を示していた。
さらに、各低分子化合物のHAT1及びKAT8に対する発現阻害効果をRT-PCRで調べたところ、クロルプロパミド等の全てがHAT1及びKAT8の両方の発現阻害効果を示した。図6に、クロルプロパミド、臭化ピナベリウム、塩化メチルベンゼトニウム、硫酸コリスチンによる阻害結果を代表例として示す。図中、(1)はクロルプロパミド、(2)は臭化ピナベリウム、(3)は塩化メチルベンゼトニウム、(4)は硫酸コリスチンを意味する。
また、FDA library screening (委托解析、PLEXERA社、Woodinville, WA, USA)）によって、HAT1のみを阻害する低分子化合物を14種類、KAT8のみを阻害する低分子化合物を5種類同定した。化合物名は、HAT1のみを阻害する低分子化合物が、フォシノプリル（Fosinopril）、トシル酸クロフィリウム（Clofilium tosylate）、スプロフェン（Suprofen）、塩酸エスモロール（Esmolol hydrochloride）、アトラクチロシドカリウム塩（Atractyloside potassium salt）、イミペネム（Imipenem）、エチフェニン（Etifenin）、セフィキシム（Cefixime）、ベンズブロマロン（Benzbromarone）、セフォペラゾン二水和物（Cefoperazone dihydrate）、ピナシジル（Pinacidil）、ニセルゴリン（Nicergoline）、オキセサゼイン（Oxethazaine）、及びアンチピリン（Antipyrine）（以下、フォシノプリル等と称することもある）である。また、KAT8のみを阻害する低分子化合物が、メルブロミン（Merbromin）、グリコピロレート（Glycopyrrolate）、メトプロロール-(+,-)(+)-酒石酸塩（Metoprolol-(+,-) (+)-tartrate salt）、メシル酸ペルゴリド（Pergolide mesylate）、及びブメタニド（Bumetanide）（以下、メルブロミン等と称することもある）である。
各低分子化合物のCAS登録番号と、HAT1又はKAT8に対する結合力を図7に示す。HAT1のみを阻害する低分子化合物と、KAT8のみを阻害する低分子化合物とを併用使用することで、HAT1及びKAT8の両方の機能を阻害することができる。また、これらを有効成分とする医薬品（但し、悪性腫瘍以外の適応症に対する医薬品）は、既に市販されている。そのため、これらの化合物は安全性が高い。
2.2 細胞増殖抑制
HLF細胞をRPMI1640培地で7日培養プレートで培養した後、低分子化合物（オクスプレノロール塩酸塩、クロルプロパミド、バンコマイシン塩酸塩、ベタキソロール塩酸塩、硫酸コリスチン、フマル酸ビソプロロール、臭化ピナベリウム）を培養プレートに添加した。添加後の化合物濃度は、オクスプレノロール塩酸塩が30μg/μL、クロルプロパミドが30μg/mL、バンコマイシン塩酸塩が30 μg/mL、ベタキソロール塩酸塩が41.8 ng/mL、硫酸コリスチンが4.4μg/mL、フマル酸ビソプロロールが75ng/mL、臭化ピナベリウムが1.0μg/mLである。いすれの濃度も、各化合物を有効成分とする市販の医薬品の最高有効血中濃度以下である（各化合物を有効成分とする市販の医薬品の最高有効血中濃度は、順に、30.18μg/μl、30μg/ml、30μg/ml、41.8ng/ml、4.4μg/ml、100ng/ml、1μg/mlである）。
低分子化合物投与後、1日目、3日目、4日目、又は7日目の結果を図8～10に示す。図中Dは日数を意味する。各低分子化合物の投与後、プレート上の癌細胞数が減少していた。即ち、各低分子化合物は、有効血中濃度内又は最小有効血中濃度以下で腫瘍細胞の増殖抑制効果を示した。この結果は、各低分子化合物が有効で且つ安全な抗癌剤として使用できることを意味している。
また、クロルプロパミド、又はMG149をHLF細胞の培養プレートに添加後、3D cell culture spheroid counter Cell 3 i Mager（SCREEN社、京都）によって細胞死、細胞増殖抑制率を観察した。その結果を図11に示す。縦に培養日数を、横に化合物の種類及び濃度を示す。クロルプロパミドの濃度は、最高有効血中濃度を1としたときの割合で表記した。クロルプロパミドの最高有効血中濃度は、30μg/mlを採用した（クロルプロパミドを有効成分とする市販の医薬品のインタビューフォームに記載されている値である）。MG149は、HAT1を阻害せず、KAT8のみを阻害する化合物である。
その結果、MG149は高濃度（30μM）を使用したときに十分な細胞増殖抑制効果を示さなかった。一方で、クロルプロパミドは有効血中濃度内又は最小有効血中濃度以下の濃度を使用したときに細胞増殖抑制効果を示した。この結果は、クロルプロパミドが有効で且つ安全な抗癌剤として使用できることを意味している。
また、レバミピド（Rebamipide）をHLF細胞の培養プレートに添加後、細胞への影響を調べた。レバミピドはHAT1を阻害し、KAT8を阻害しない低分子化合物である。添加後のレバミピド濃度は360μg/Lである。レバミピドを有効成分とする医薬品（但し、悪性腫瘍以外の適応症に対する医薬品）は、既に市販されており、上記濃度は、最高有効血中濃度に相当する。3日目、又は7日目の結果を図12に示す。レバミピドは細胞増殖抑制効果を示さなかった。
また、クロルプロパミドによる種々の腫瘍に対する抗腫瘍効果を調べた。腫瘍の種類は、癌（上皮性悪性腫瘍）に分類されるものとして、甲状腺癌、悪性脳腫瘍、悪性黒色腫、肺癌、胃癌、肝癌、膵癌、大腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、神経芽細胞腫を対象とし、肉腫（非上皮性悪性腫瘍）に分類されるものとして、線維肉腫、骨肉腫を対象とした。
その結果を図13に示す。各数値は、薬物感受性試験で抗癌効果があることが確認された濃度を意味する。クロルプロパミドの濃度は、上記と同様に、最高有効血中濃度を1としている。クロルプロパミドは、有効血中濃度内又は最小有効血中濃度以下で各腫瘍の細胞増殖抑制効果を示した。この結果は、クロルプロパミドが、種々の腫瘍に対して有効で且つ安全な抗悪性腫瘍薬として使用できることを意味している。
＜実施例3＞
3.1 DNA損傷からのサルベージ効果
10cm培養シャーレでNHDF細胞（ヒト皮膚線維芽細胞）を培養し、DNA傷害性の強いUV (302nm)照射を17分間（0.5 J/cm2）行った。NHDF細胞は、照射4分で十分に細胞死に至っていた。
UV照射から3日後に、HAT1 shRNA発現レンチウイルス粒子(psi-LVRU6GP for HAT1 mixture, Genecopoeia社)、及びKAT8 shRNA発現レンチウイルス粒子（psi-LVRU6GP for KAT8 mixture, Genecopoeia社）の両方（以下、shHAT1/shKAT8と称することもある。）をNHDF細胞の培養プレートに添加した。添加濃度は、HAT1 shRNA発現レンチウイルス粒子が1 copy/cell、KAT8 shRNA発現レンチウイルス粒子が1 copy/cellである。ウイルス未導入のNHDF細胞は、UV照射によって全て細胞死を維持した。
約2週間後、 shHAT1/shKAT8を添加したNHDF細胞を含むシャーレにおいて、GFP発現の弱いスフェロイドコロニーがいくつか出現していることが観察された。そのコロニーを6ウェルプレートに移し、培養した。1ヶ月以上経ったとき、各スフェロイドコロニーは線維芽細胞様細胞を生じさせた。スフェロイドコロニーと線維芽細胞様細胞の両方でGFP発現が観察された。継代のためのトリプシン処理によって、GFPを強発現した多数のスフェロイド細胞の出現が誘導された。細胞は、照射後平均75日で老化した。その結果、細胞は細胞死していた。この結果は、HAT1 shRNA及びKAT8 shRNAにより、UVによる致命的なDNA損傷がサルベージされたことを意味している。
以上の結果は、(i)HAT1及びKAT8の両方を阻害すると、細胞の幹性化が見られること、(ii)HAT1又はKAT8の片方のみの阻害をしても、細胞の幹性化が見られないこと、を示している。また、以上の結果は、(iii)HAT1及びKAT8の両方を阻害すると、優れた悪性腫瘍の治療効果が見られること、(iv)HAT1又はKAT8の片方のみの阻害をしても、十分な悪性腫瘍の治療効果が見られないこと、を示している。このように、HAT1又はKAT8の片方の阻害では得られなかった効果が、HAT1及びKAT8の両方の阻害によって得られたことは驚くべき結果であった。
加えて、以上の結果は、HAT1及びKAT8の両方を阻害すると、DNA損傷をサルベージできることを示している。
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。

Claims (9)

  1. HAT1及びKAT8阻害剤、又はクロルプロパミド、バンコマイシン、ベタキソロール、コリスチン、ビソプロロール、ピナベリウム、メチルベンゼトニウム、デメカリウム、及びセリプロロールからなる群から選ばれる1種以上の化合物、その塩、もしくはそれらの溶媒和物を含み、
    前記HAT1及びKAT8阻害剤は、(a)HAT1を阻害するRNAi分子もしくはそれをコードするベクター、及びKAT8を阻害するRNAi分子もしくはそれをコードするベクター、の組み合わせ、又は(b)HAT1を阻害するRNAi分子及びKAT8を阻害するRNAi分子、をコードするベクターである、
    悪性腫瘍の治療薬。
  2. HAT1及びKAT8阻害剤、又はバンコマイシン、ベタキソロール、コリスチン、ビソプロロール、ピナベリウム、メチルベンゼトニウム、デメカリウム、及びセリプロロールからなる群から選ばれる1種以上の化合物、その塩、もしくはそれらの溶媒和物を含み、
    前記HAT1及びKAT8阻害剤は、(a)HAT1を阻害するRNAi分子もしくはそれをコードするベクター、及びKAT8を阻害するRNAi分子もしくはそれをコードするベクター、の組み合わせ、又は(b)HAT1を阻害するRNAi分子及びKAT8を阻害するRNAi分子、をコードするベクターである、
    請求項1に記載の悪性腫瘍の治療薬。
  3. HAT1及びKAT8阻害剤、又はクロルプロパミド、バンコマイシン、ベタキソロール、コリスチン、ビソプロロール、及びピナベリウムからなる群から選ばれる1種以上の化合物、その塩、もしくはそれらの溶媒和物を含み、
    前記HAT1及びKAT8阻害剤は、(a)HAT1を阻害するRNAi分子もしくはそれをコードするベクター、及びKAT8を阻害するRNAi分子もしくはそれをコードするベクター、の組み合わせ、又は(b)HAT1を阻害するRNAi分子及びKAT8を阻害するRNAi分子、をコードするベクターである、
    請求項1に記載の悪性腫瘍の治療薬。
  4. クロルプロパミド、バンコマイシン、ベタキソロール、コリスチン、ビソプロロール、ピナベリウム、メチルベンゼトニウム、デメカリウム、及びセリプロロールからなる群から選ばれる1種以上の化合物、その塩、もしくはそれらの溶媒和物を含む、請求項1に記載の悪性腫瘍の治療薬。
  5. 前記悪性腫瘍は、甲状腺癌、悪性脳腫瘍、悪性黒色腫、肺癌、胃癌、肝癌、膵癌、大腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、神経芽細胞腫、及び肉腫からなる群から選ばれる1種以上である、請求項1～4のいずれかに記載の悪性腫瘍の治療薬。
  6. 前記悪性腫瘍は、肝癌である、請求項1～5のいずれかに記載の悪性腫瘍の治療薬。
  7. HAT1及びKAT8阻害剤、又はクロルプロパミド、バンコマイシン、ベタキソロール、コリスチン、ビソプロロール、ピナベリウム、メチルベンゼトニウム、デメカリウム、及びセリプロロールからなる群から選ばれる1種以上の化合物、その塩、もしくはそれらの溶媒和物を含み、
    前記HAT1及びKAT8阻害剤は、(a)HAT1を阻害するRNAi分子もしくはそれをコードするベクター、及びKAT8を阻害するRNAi分子もしくはそれをコードするベクター、の組み合わせ、又は(b)HAT1を阻害するRNAi分子及びKAT8を阻害するRNAi分子、をコードするベクターである、
    悪性腫瘍の治療用キット。
  8. HAT1阻害剤を含有する悪性腫瘍の治療薬であって、前記治療はKAT8阻害剤とHAT1阻害剤とが併用で用いられ、前記KAT8阻害剤はKAT8を阻害するRNAi分子もしくはそれをコードするベクターであり、前記HAT1阻害剤はHAT1を阻害するRNAi分子もしくはそれをコードするベクターである、悪性腫瘍の治療薬。
  9. KAT8阻害剤を含有する悪性腫瘍の治療薬であって、前記治療はHAT1阻害剤とKAT8阻害剤とが併用で用いられ、前記HAT1阻害剤はHAT1を阻害するRNAi分子もしくはそれをコードするベクターであり、前記KAT8阻害剤はKAT8を阻害するRNAi分子もしくはそれをコードするベクターである、悪性腫瘍の治療薬。
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