JP7171612B2 - 多成分インプラント、デバイス、構造体または材料の製造、作製、および／または生産のための方法および金型 - Google Patents

Description

本発明は、ＮＩＨによって認められたＡＲ０６７５３３の下で、政府の支援を受けて行われたものである。政府は本発明において一定の権利を有する。
関連出願
本出願は、本明細書にその全体が参照により援用される２０１７年５月１日に出願された米国特許出願第６２／４９２５３５号に対する優先権を主張するものである。

本発明は、哺乳動物への移植に適した固体ヒドロゲル、多孔性ヒドロゲル、および多孔質剛性ベースを含む多成分インプラントを作製、製造および／または生産するための改良された方法に関する。本発明はまた、固体ヒドロゲルまたは他のポリマーおよび多孔質剛性材料を含むデバイス、構造体または材料を作製、製造および／または生産する方法を提供する。本発明は、本発明の方法を実施するための金型も含む。

関節における関節軟骨の欠損は、痛みの重要な原因であり、治癒能力が限られており、変形性関節症の発症につながる可能性がある（Ｓｈｅｌｂｏｕｒｎｅ他、２００３年）。症候性軟骨欠損の外科的選択肢には、緩和的、修復的、復元的方法が含まれる（Ｃｏｌｅ ａｎｄ Ｌｅｅ、２００３年）。これらの各手順の治療アルゴリズムと外科的適応は進化し続けている（Ｍａｇｎｕｓｓｅｎ他、２００８年、Ｂｅｋｋｅｒｓ他、２００９年）。欠損部位内の関節軟骨の形成を促進することを目的とした生分解性インプラントを使用した代替治療法が開発された。しかし、これらのインプラントの機械的特性は絶えず変化しており、再生プロセス中においては天然組織の特性よりもしばしば劣っている（Ｍａｕｃｋ他、２００２年）。さらに、これらのインプラントは、制御された堅牢な細胞応答に依存しているが、これは、欠損のある関節の生物学的環境では理解しにくいことがこれまで証明されている目標であるネイティブ関節軟骨のように見え、かつそのように機械的に機能する組織化組織を再現するためである。

この臨床的問題を治療する別の方法は、移植直後と再生プロセスの間、生体内の機械的負荷に耐えることができる、十分に特性評価された非生分解性インプラントを使用することである。理想的には、非分解性の構造体は、（ｉ）隣接する組織と一体化する、（ｉｉ）インプラントの置換が意図されている天然組織の方法で多くの負荷を伝達する、（ｉｉｉ）（骨吸収を避けるために）下層の骨に荷重を伝達する、（ｉｖ）耐摩耗性を有する、（ｖ）反対側の軟骨表面を摩耗させない、（ｖｉ）周辺組織への移植と固定を容易にするものである必要がある。

共同所有の米国特許第９，５４３，３１０号に開示および特許請求されている多成分インプラントは、これらの問題を解決し、生体組織、特に筋骨格組織の欠損および損傷の治療、修復または置換のための新規多成分インプラントを提供する。

ただし、以前の方法では２つの異なる成分、すなわち固体ヒドロゲルと多孔質剛性ベースの界面でインプラントが破損するため、このようなインプラントを作製する信頼性の高い方法が必要であった。

さらに、いくつかの生物医学装置、構造体、および材料は、ヒドロゲルと多孔質剛性材料から作られている。これらの２つの非常に異なる材料の界面でも、これらのデバイス、構造体、および材料が破損する可能性がある。

したがって、当技術分野では、力に耐え、界面で破損しないヒドロゲルおよび多孔質剛性材料を含むインプラント、デバイス、構造体、および材料の作製方法が必要である。

本発明は、生体組織、より具体的には筋骨格組織の欠損および／または損傷を治療、修復、および／または置換するための多成分インプラントを作製、製造、および／または生産する、上記６つの要件を満たす新規な方法を提供することにより、当技術分野の問題を克服する。

本発明はまた、ヒドロゲルと多孔質剛性材料を含むデバイス、構造体、または材料を作製、製造および／または生産し、これら２つの非常に異なる層、すなわち当該ヒドロゲルと当該多孔質剛性材料の間に一体化を最大限にする界面を有する、新規な方法を提供する。本発明はまた、本発明の方法から作製されたデバイス、構造体、または材料を含む。

本発明はまた、弾性ポリマーと多孔質剛性材料を含むデバイス、構造体、または材料を作製、製造および／または生産し、これら２つの非常に異なる層、すなわち当該弾性ポリマーと当該多孔質剛性材料の間に一体化を最大限にする界面を有する、新規な方法を提供する。本発明はまた、本発明の方法から作製されたデバイス、構造体、または材料を含む。

そのようなデバイス、構造体または材料は、薬物送達装置、バイオセンサー装置などの生物医学的用途で使用され、組織機能を増強し、疾患と損傷を治療する。これらのデバイス、構造体、および材料は、自動車や航空機、航空宇宙技術での使用など、他の用途にも使用できる。

したがって、本発明の一実施形態は、生体組織の欠損または損傷の治療、修復または置換のために、哺乳動物への移植に適したインプラントを作製、製造および／または生産する、以下のステップを含む方法である。
ａ．多孔質剛性ベースを金型のベースのウェルに配置するステップ。
ｂ．多孔質剛性ベースの上部のウェルに多孔性ヒドロゲルを配置するステップ。
ｃ．金型に第１の蓋を配置するステップ。
ｄ．金型の底部のウェルに第１の低粘度ポリマーを導入または注入するステップ。
ｅ．金型を約－２０℃に約４～２４時間凍結し、続いてその金型を約２３℃で約４～１２時間解凍するステップ。
ｆ．第１の蓋を取り外し、余分な低粘度ポリマーを除去するステップ。
ｇ．金型に第２の蓋を配置するステップ。
ｈ．金型のベースのウェルに第２の低粘度ポリマーを導入または注入するステップ。
ｉ．金型を約－２０℃に約４～２４時間凍結し、続いてその金型を約２３℃で約４～１２時間解凍するステップ。
ｊ．第２の蓋を取り外すステップ。
ｋ．金型に、インプラント表面の湾曲を画定可能な第３の蓋を配置するステップ。
ｌ．多孔質剛性ベースを定義された距離だけ変位させるステップ。
ｍ．金型を約－２０℃に約４～２４時間凍結し、続いてその金型を約２３℃で約４～１２時間解凍し、これらを約６～１２回実施して、多孔性ヒドロゲルに囲まれた固体ヒドロゲルを伴う多孔質剛性ベースを有するインプラントを得るステップ。

いくつかの実施形態では、多孔性ヒドロゲルが製造され、以下のステップを含む。
ａ．溶媒中の非生分解性ポリマーに分解性ポリマースポンジを浸漬するステップ。
ｂ．スポンジを約－２０℃に約４～２４時間凍結し、続いてそのスポンジを約２３℃で約４～１２時間解凍するステップ。
ｃ．ステップａ．およびｂ．を実行した後、スポンジから中央部分を抜き取るステップ。

本発明の方法の結果もたらされるものは、少なくとも３つの成分、すなわち固形ヒドロゲルもしくはポリマー、固形ヒドロゲルもしくはポリマーを囲むことができる多孔性ヒドロゲルもしくはポリマー、および多孔質剛性ベースを含む新規なインプラントである。固体ヒドロゲルと多孔質剛性ベースは接合部の負荷に抵抗し、多孔性ヒドロゲルと多孔質剛性ベースはインプラントの中および周囲への細胞移動を可能にする。本発明によりもたらされるインプラントは、２つの非常に異なる層、すなわちヒドロゲルと多孔質剛性ベースの間の一体化を最大限にする界面も有することができる。

本発明のさらなる実施形態は、本明細書に記載の方法により作製、製造および／または生産された多成分インプラントである。

本発明の方法によって、以下、その全体が参照により援用される共同所有の米国特許第９，５４５，３１０号（以下、「‘３１０特許」）に説明および特許請求されている多成分インプラントがもたらされる。

本発明のさらなる実施形態は、ヒドロゲルおよび多孔質剛性材料を含むデバイス、構造体、または材料を作製、製造および／または生産する、以下のステップを含む方法である。
ａ．多孔質剛性材料を担体のウェルに配置するステップ。
ｂ．第１の低粘度ポリマーを担体に導入または注入するステップ。
ｃ．担体を約－２０℃に約４～２４時間凍結し、続いてその担体を約２３℃で約４～１２時間解凍するステップ。
ｄ．第２の低粘度ポリマーを担体に導入または注入するステップ。
ｅ．担体を約－２０℃に約４～２４時間凍結し、続いてその担体を約２３℃で約４～１２時間解凍するステップ。
ｆ．担体を約－２０℃に約４～２４時間凍結し、続いてその担体を約２３℃で約４～１２時間解凍し、これらを約６～１２回実施するステップ。

本発明の本方法の結果は、ヒドロゲルおよび多孔質剛性材料を含み、これら２つの非常に異なる層の間に一体化を最大限にする界面を有する、新規なデバイス、構造体、または材料である。

本発明のさらに別の実施形態は、界面を有する弾性ポリマーおよび多孔質剛性材料を含むデバイス、構造体、または材料を作製、製造および／または生産する方法であり、以下のステップを含む。
ａ．多孔質剛性材料を担体に配置するステップ。
ｂ．第１の低粘度ポリマーを、化学架橋剤を含む担体に導入または注入するステップ。
ｃ．第１の低粘度ポリマーを、化学架橋剤を使用して一定時間にわたり一定温度でインキュベートして、化学架橋剤が第１のポリマーを部分的に架橋して界面層を形成できるようにするステップ。
ｄ．第２の低粘度ポリマーを、化学架橋剤を含む担体に導入または注入するステップ。
ｅ．第２の低粘度ポリマーを、化学的架橋剤を使用して一定時間にわたり一定温度でインキュベートして、所望の架橋パーセンテージに到達して層状弾性ポリマーが形成されるまで化学架橋剤が第２のポリマーを架橋できるようにするステップ。
ｆ．弾性ポリマーを洗浄して、未反応の架橋剤とポリマーを除去するステップ。
本発明の本方法の結果は、弾性ポリマーおよび多孔質剛性材料を含み、これら２つの非常に異なる層の間に一体化を最大限にする、したがって破損に耐える界面を有する、新規なデバイス、構造体、または材料である。

本発明はまた、本発明の方法を実施するための型、担体、およびキットを提供する。

本発明を例示する目的で、本発明の特定の実施形態を図面に示す。ただし、本発明は、図面に示された実施形態の正確な配置および手段に限定されない。
図１は、本発明の方法により作製された１つの例示的なインプラントの側斜視図である。 図２は、各温度で乾燥した後に再構成された２０％ＰＶＡ－ＰＶＰヒドロゲルの圧縮弾性率のグラフである。ＰＶＡとＰＶＰのポリマー溶液を異なる割合で混合して、２０％（ｗ／ｖ）ヒドロゲルを作製した。 図３は、溶媒としてｄｄＨ２Ｏ（黒いバー）またはＤＭＳＯ（灰色のバー）を使用して作製した、各濃度のＰＶＡヒドロゲルの圧縮弾性率を比較したグラフである。 図４Ａおよび４Ｂは、溶媒としてＤＭＳＯを使用した場合の２５％ＰＶＡ（図４Ａに示す）および３５％ＰＶＡ（図４Ｂに示す）に関して圧縮弾性率と凍結／解凍サイクル数の増加（６、８、または１１）とを比較したグラフである。 図５は、ＤＭＳＯにおけるＰＶＡの割合（ｗ／ｖ）の増加に伴う圧縮弾性率の変化の指数曲線である。 図６は、層状ヒドロゲルのインデンテーションテストの結果のグラフである。グラフは、２つのＰＶＡ濃度（３５％と２０％）間の界面にわたるインデンテーションの結果（ドット）とＳ字フィット（線）を示している。 図７は、実施例５でせん断応力が解析された３つのピーク応力位置（点線）のグラフである。 図８Ａ～８Ｃは、２０％ＰＶＡ層と３５％ＰＶＡ層で構成され、金属ベースのマクロ多孔性フィーチャを埋める尾部構造を持つ３つの異なるインプラント構成のモデルを示している。 図９Ａ～９Ｂは、Ｔｉベース（図９Ａ）およびＰＥＥＫベース（図９Ｂ）の破損時の最大せん断応力のグラフである。 図１０は、１穴設計の摩耗テスト後の破損時の最大せん断応力のグラフである。初期値を示すテストバーは、１穴設計の実施例５のせん断テスト結果である。 図１１Ａ～１１Ｃは、本発明の１つの例示的な金型を示している。図１１Ａは、第１の蓋のある金型を示している。図１１Ｂは、第２の蓋のある金型を示している。図１１Ｃは、第３の蓋のある金型を示している。 同上。 同上。

定義
本明細書で使用される用語は、一般に、本発明の文脈および各用語が使用される特定の文脈内で、当該技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。本発明の方法およびそれらの使用方法を説明する際に追加の指針を実施者に提供するために、特定の用語を以下または本明細書の他の場所で説明する。さらに、同じことを複数の方法で言うことができることが理解されよう。したがって、本明細書で説明する用語のいずれか１つまたは複数に対して代替の言語および同義語が使用されてもよく、用語を本明細書で詳述または説明するかどうかに関して特別な意味はない。特定の用語の同義語が提供される。１つ以上の同義語を繰返し述べることにより、他の同義語の使用が除外されるわけではない。本明細書で説明される用語の例を含む、本明細書の任意の場所における例の使用は、例示のみであり、本発明または例示される用語の範囲および意味を決して限定しない。同様に、本発明はその好ましい実施形態に限定されない。

用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定される特定の値に関して許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは、値の測定または決定方法、すなわち測定システムの限界、すなわち医薬製剤などの特定の目的に必要な精度の程度に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣行により、１標準偏差内または１標準偏差以上を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、さらにより好ましくは１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。本出願および特許請求の範囲に特定の値が記載されている場合、特に明記しない限り、特定の値に関する許容誤差範囲内を意味する「約」という用語を想定する必要がある。

「インプラント」、「デバイス」、および「構造体」という用語は、本出願全体で同じ意味で使用され、体内に挿入または移植される任意の材料を意味し得る。そのようなインプラント、デバイス、および構造体の生物医学的用途には、薬物送達、バイオセンサー、組織の修復および／または置換、疾患、欠損および／または損傷の治療、および組織機能の増強が含まれるが、これらに限定されない。デバイス、構造体、および材料には、生物医学分野以外の用途がある。

本出願で使用される「多孔性」という用語は、微細な開口部として定義される細孔を持つことを意味する。

本出願で使用される「ミクロ孔」という用語は、直径が約１ｍｍ未満の細孔を意味し、「ミクロ多孔性」という用語は、直径が約１ｍｍ未満のミクロ孔または細孔を有することを意味する。

本出願で使用される「マクロ孔」という用語は、約１ｍｍを超える直径の細孔を意味し、「マクロ多孔性」という用語は、約１ｍｍを超える直径のマクロ孔または細孔を有することを意味する。

本出願で使用される「相互接続」という用語は、部品または要素間に内部接続または連続性があることを意味する。

本出願で使用される「剛性」という用語は、それが界面で接するヒドロゲルまたはポリマーよりも少なくとも約２０倍大きい弾性率を有する多孔質材料を意味する。この最小倍率差は、以前に測定された軟骨の弾性係数（７．０１ＭＰａから４０ＭＰａの範囲）（Ｄｅｎｅｗｅｔｈ他、２０１２年、Ｒａｄｉｎ他、１９７０年）および骨（７８５～１，１１５ＭＰａ）（Ｒａｄｉｎ他、１９７０年、Ｃｈｏｉ他、１９９０年）から決定された。いくつかの実施形態では、多孔質剛性ベースは、骨より大きい弾性係数を有することができる。

本出願で使用される「対象」という用語は、鳥類や哺乳類などの免疫系を持つ動物を意味する。哺乳類には、イヌ、ネコ、げっ歯類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、霊長類が含まれる。鳥類には、家禽、鳴禽、猛禽類が含まれるが、これらに限定されない。したがって、本発明は、例えば、コンパニオンアニマル、家畜、動物園の実験動物、および野生動物を治療するために、獣医学で使用することができる。本発明は、ヒトの医療用途に特に望ましい。

「治療する」、「治療」などの用語は、欠損または損傷の症状の少なくとも１つを減速、緩和、改善または軽減する手段、または発症後の欠損または損傷を元に戻す手段を指す。

「修復」などの用語は、矯正、強化、修復、治療、補償、正常化、再生、好転、補修など、機能を回復することを指す。したがって、「修復」という用語は、矯正すること、強化すること、修復すること、治療すること、補償すること、正常化すること、再生すること、好転すること、補修すること、またはその他の方法で機能を回復することも意味し得る。

「置換する」、「置換」などの用語は、代替となる、またはその代わりになる手段を指す。いくつかの実施形態において、この用語は、欠損組織または損傷組織の代替またはその代わりとなることを意味する。

「欠損」などの用語は、構造または系統の欠陥または物理的な問題、特に正しく機能することを妨げるものや医学的異常を指す。欠損には、創傷、潰瘍、火傷、先天欠損などの自然欠損、および皮膚、骨、軟骨、筋肉、腱、靭帯、半月板、顎関節、動脈および血管、臓器などの生体組織の欠損が含まれ得るが、これらに限定されない。

用語「損傷」などは、創傷または外傷、傷または怪我を指し、通常、外力によって身体に与えられる損傷に適用される。

本明細書で使用される「生体組織」という用語には、骨、腱、靭帯、軟骨、および脊椎の椎間板を含む筋骨格、動脈、血管、心臓弁などを含むがこれらに限定されない血管、表皮および真皮、皮下組織を含むがこれに限定されない結合組織、神経組織および脳と脊髄を取り巻く関連する硬膜組織、歯などが含まれるが、これらに限定されない。

「ポリマー」という用語は、多くの場合、共有化学結合によって結合された繰返し構造単位で構成される大きな分子を意味する。ポリマーは天然または合成であり得る。「生分解性ポリマー」は、酵素やその他のタンパク質などの有機体により生成される有機体または分子により分解され得るポリマーであり、「非生分解性ポリマー」はこのような酵素やタンパク質によって分解できない。本明細書で使用する非生分解性ポリマーとは、ポリマー濃度および／または凍結／解凍などの重合方法を変えることにより個別に制御できる機械的特性を有する任意のポリマーを意味する。

「分解性ポリマー」には、生分解性ポリマーのほか、酸／塩基侵食、可溶化、溶解などであるがこれらに限定されない他の方法を使用して分解できるポリマーが含まれる。

「非分解性ポリマー」は何によっても分解できない。

「ヒドロゲル」という用語は、親水性であり、大量の水を吸収できる分解性または非分解性の天然または合成のポリマーネットワークを意味する。本明細書で使用されるヒドロゲルは、ポリマーおよび水の濃度および／または凍結／解凍などのゲル化の方法を変えることによって個別に制御できる機械的特性を有する任意のヒドロゲルを意味する。

「重合」および「ゲル化」などの用語は、重合、固化、ゲル化、相互接続、一体化などを行い、ポリマーまたはヒドロゲルの三次元ネットワークを形成する手段を指す。

本出願で使用される「生体適合性」という用語は、害を引き起こすことなく生体組織または有機体と共存できることを意味する。

本明細書で使用される用語「薬剤」は、効果を生じるか生じ得る物質を意味し、化学物質、化学薬品、生物製剤、小有機分子、細胞、血液製剤、抗体、核酸、ペプチド、タンパク質を含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される用語「補助剤」は、インプラントに有益な特性を付与するためにインプラントに添加される薬剤を意味する。

多成分インプラント
‘３０１特許に記載され、図１に示す新規の多成分インプラントは、負荷に耐える固体ヒドロゲル１１０、細胞浸潤およびインプラントと組織の一体化を可能にする多孔性ヒドロゲル層１２０、および固体ヒドロゲル１１０と多孔性ヒドロゲル１２０の両方が付着している多孔質剛性ベース１３０を含む。

本発明により作製されたインプラントには多くの利点がある。インプラントと軟骨および骨組織との一体化が同時に起こる。ヒドロゲル表面に作用する荷重は、ヒドロゲル固体１１０を介して多孔質剛性ベース１３０および下にある骨に伝達される。

多成分インプラントの製造方法
本発明の目的は、ヒドロゲル－多孔質剛性ベース、 例えば 、ＰＶＡ－金属の界面を改変して、繰り返し負荷がかかる接合部におけるデバイスの機械的破損を防ぐことであった。最初に、ヒドロゲル－多孔質剛性ベース界面の強度は、界面の巨視的形状と、ヒドロゲル－多孔質剛性ベース界面でのヒドロゲルの剛性を変更することにより、生理学的ストレスに耐えるように最適化された。シミュレートされた歩行の組合せ中の界面せん断応力と引張応力に対するさまざまな設計機能の影響は、以前に開発されたヒトの膝の有限要素（ＦＥ）モデルで評価された。無傷の膝に関して表面接触応力を１０％以内に維持し、最高の安全係数（すなわち、実験的に測定された破壊応力をＦＥモデルで計算された最大界面応力で除したもの）を持つ設計を製造し、繰返し載荷条件の下で物理的にテストした。

本発明の現在の方法は、多くの点で以前の方法を改善した。最初に、同じ機械的特性を維持しながら、溶媒としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を使用して、より高濃度のＰＶＡヒドロゲルを作製できることが確認された（実施例１～３）。異なる濃度のヒドロゲルを層状にして、２つの領域間に漸進的な遷移を生じさせることができた（実施例４）。

さらに、単一のマクロ多孔性の穴を備えた多孔質剛性ベースが最適な設計として特定された（実施例８）。

最後に、本発明の金型内でインプラントを組み立てる新しい方法は、接合部の負荷により良好に耐えることができるインプラントをもたらした。インプラントの界面強度は、上部の耐荷重領域または層（例えば、２０％ＰＶＡ）から界面領域または層（例えば、３５％ＰＶＡ）に漸進的に遷移する層状ヒドロゲルを作製することで大幅に改善された。本明細書に記載されている独自の製造方法は、一貫した界面層の作製を可能にする（実施例７～１０）。

上記の基準を満たすインプラントを得るために、製造方法は以下のステップを含み得る。
ａ．多孔質剛性ベース１３０を金型２００のベース２１０のウェル２２０に配置するステップ。
ｂ．金型２００のベース２１０のウェル２２０内の多孔性ヒドロゲル１２０を、多孔質剛性ベース１３０の上部に、ウェル２２０の壁に沿って配置するステップ。
ｃ．金型２００のベース２１０上に第１の蓋２３０を配置するステップ。
ｄ．ツール３１０を使用して、金型２００のウェル２２０に第１の低粘度ポリマーを導入または注入するステップ。
ｅ．第１の蓋２３０を伴い、多孔質剛性ベース１３０、多孔性ヒドロゲル１２０を含み、低粘度ポリマーが注入された金型２００を、約－２０℃に約４～２４時間凍結し、続いてその金型２００を約２３℃で約４～１２時間解凍するステップ。
ｆ．第１の蓋２３０を取り外すステップ。
ｇ．金型２００のベース２１０上に第２の蓋２４０を配置するステップであって、金型２００のウェル２２０が多孔質剛性ベース１３０、固体ヒドロゲルの界面層１４０、および多孔性ヒドロゲル１２０を含む、配置するステップ。
ｈ．ツール３１０を使用して、金型２００のウェル２２０に第２の低粘度ポリマーを導入または注入するステップ。
ｉ．金型２００を約－２０℃に約４～２４時間凍結し、続いてその金型２００を約２３℃で約４～１２時間解凍するステップ。
ｊ．第２の蓋２４０を取り外すステップ。
ｋ．金型２００のベース２１０上に第３の蓋２５０を配置するステップであって、金型２００のウェル２２０が多孔質剛性ベース１３０、固体ヒドロゲルの界面層１４０、多孔性ヒドロゲル１２０、および固体ヒドロゲル１１０の支持層を含み、第３の蓋２５０が約０ｍｍから約２ｍｍの範囲の曲率を有する、配置するステップ。
ｌ．多孔質剛性ベース１３０を、インプラントの所望の最終曲率によって定義される距離だけ多孔質剛性ベースを変位させるツール３２０を使用して変位させるステップ。
ｍ．第３の蓋２５０を有する金型２００を凍結させるステップであって、金型２００のウェル２２０が多孔質剛性ベース１３０、多孔性ヒドロゲル１２０、固体ヒドロゲルの界面層１４０、および固体ヒドロゲル１１０の支持層を含み、約－２０℃に約４～２４時間凍結し、続いてこの金型２００を約２３℃で約４～１２時間解凍し、これらを約６から約１２回実施する、凍結させるステップ。
ｎ．第３の蓋２５０を取り外して、多孔質剛性ベース１３０、多孔性ヒドロゲル１２０、固体ヒドロゲルの界面層１４０、および固体ヒドロゲル１１０からなる支持層を有するインプラントを得るステップ。
ｏ．多孔性ヒドロゲル１２０からすべての生分解性ポリマーを除去するステップ。

多孔質剛性ベースの調製
多孔質剛性ベースは、ヒドロゲル－ベース界面の段差、これら２つの層の間の機械的連結を改善するマクロ多孔性構造、およびデバイスと欠損の位置合わせを可能にする、多孔質剛性ベースの底部のテーパーを含むが、これらに限定されない多くの異なる特徴を含むように製造することができる。

多孔質剛性ベースの好ましい材料には、骨、チタンなどの金属、ポリエーテルケトンケトン（ＰＥＫＫ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、および生物活性ガラス（例えば、酸化ケイ素、酸化ナトリウム）が含まれるが、これらに限定されない。この多孔質剛性ベースは、サイズが約１５０～５００μｍのマイクロ孔を含み得る。

多孔質剛性ベースは、穴、マクロ孔、段などの幾何学的特徴を有することができる。

マクロ孔、すなわち直径が多孔質剛性ベースの約１％～９０％の範囲であり、多孔質剛性ベースの深さの約１０％～５０％である孔は、多孔質剛性ベースの表面に作製され、マイクロ孔を有し、ヒドロゲルと多孔質剛性ベースの間の相互嵌合をさらに強化する。

インプラントの好ましい実施形態は、単一のマクロ孔または穴を備えた多孔質剛性ベースである。図８Ａ～８Ｃを参照のこと。

多孔性ヒドロゲル部分の調製
インプラントの多孔性ヒドロゲル部分を作製するための一般的な方法では、以下を実行する必要がある。
ａ．溶媒中の非生分解性ポリマーに分解性ポリマースポンジを浸漬する。
ｂ．スポンジを約－２０℃に約４～２４時間凍結し、続いてそのスポンジを約２３℃で約４～１２時間解凍する。
ｃ．ステップａ．およびｂ．を実行した後、スポンジから中央部分を抜き取る。
インプラントのヒドロゲル部分は、好ましくは、生分解性ポリマーで作られた、または生分解性ポリマーを含む相互接続されたスポンジを使用して調製される。

スポンジはまた、ゼラチン、コラーゲン、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、キトサン、および塩やポリエチレングリコールなどのアルギン酸または分解可能な物質を含むが、これらに限定されない生分解性ポリマーから作製され得るか、またはそれらを含み得る。

さらに、スポンジのサイズ、気孔率、壁の厚さは、最終的なインプラントのニーズに応じて変更できる。

スポンジは、脱イオン水に１時間から５日間、好ましくは約１２時間浸漬することにより水和される。当業者は、スポンジを水で飽和させるのに十分な時間を容易に決定することができるであろう。

次いで、スポンジは、閉じ込められた気泡を除去するために遠心分離される。好ましい方法は、一回に３０００ｇで１時間を３～５回実行し、これら遠心分離の間に穏やかに撹拌して、本来の形状を回復させることである。ただし、当業者であれば、スポンジから気泡を除去するために必要な遠心分離の程度を簡単に判断できる。別の手法は、３０分間オンと３０分間オフの真空を断続的に適用し、これら真空ステップの間に攪拌し、これを３～５回行うことである。

本発明の方法の次のステップは、スポンジ中の水を溶媒中の非生分解性ポリマーで置き換えることである。好ましい溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。

ポリ（ビニル）アルコールまたはＰＶＡが好ましいが、ポリマー濃度および／または凍結／解凍などの重合方法を変えることにより別々に制御できる機械的特性を有する任意の非生分解性ポリマーを使用できる。使用できる他の非生分解性ポリマーの例は、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリウレタン、およびそれらの組合せである。

最終デバイスの機械的特性は、デバイス内のポリマー、例えばＰＶＡの最終濃度によって決まる。一般に、デバイス内のポリマーの最終濃度が高いほど、デバイスは硬質になる。ポリマーの濃度が高いデバイスは、一般に高い負荷に耐えることができる。

実施例３に示されるように、驚くべきことに、ＤＭＳＯが溶媒であるとき、同じ機械的特性を維持しながら、ＰＶＡの量を増加させて使用できることが見出された。

ポリマーは、濃度を所望の濃度まで上げる段階において穏やかに攪拌されることでスポンジに置き換えられる。さまざまな濃度のポリマー溶液が作製され、所望の濃度が得られるまでスポンジが浸漬された。ポリマー溶液は、所望の最終濃度までの１％～４０％重量／容量の範囲の溶液であり、ポリマーの好ましい最終濃度は１０％～４０％の範囲である。好ましい最終濃度は、当業者によって決定されるように、インプラントの最終的な使用によって決まる。ポリマーの好ましい最終濃度は１０％である。

次いで、ポリマー、例えばＰＶＡヒドロゲルは、一連の凍結／解凍サイクルにかけられる。ＰＶＡは、潜在的に毒性のある架橋剤を使用する必要なく、凍結／解凍サイクルを使用して物理的に架橋されるという利点を提示する。凍結中に、溶媒（水またはＰＶＡのＤＭＳＯ）が凍結し、高ＰＶＡ架橋の領域が形成される。ＰＶＡ鎖が互いに密接に接触すると、鎖の間で微結晶の形成と水素結合が発生し得る。これらの相互作用は解凍後も損なわれず、それによって３次元ネットワークが生成される。したがって、ヒドロゲルの機械的特性は、凍結／解凍サイクルの数を増やすことによって制御でき、その結果、水素結合および微結晶形成の量を増加させることができる。凍結／解凍サイクルの増加により、構造体の強度が増加。機械的特性は、凍結および解凍の期間と速度によって制御することもできる。好ましい方法は、約－２０℃で約４～２４時間、好ましくは２０時間スポンジを凍結し、次に約２３℃で約４～１２時間、好ましくは４時間構造体を解凍することを含む。しかしながら、工程のこの部分は、構造体の機械的特性を所望通りに変えるために、当業者によって容易に変えることができる。凍結および／または解凍の両方の時間数は、サイクル数と同様に変えることができる。ＤＭＳＯ中のＰＶＡが使用される場合、凍結／解凍サイクルの好ましい数は約８～１１の範囲であり、８が好ましい。

凍結／解凍サイクルの後、多孔性ヒドロゲルを形成するためにスポンジの中心の芯を抜き取った。当業者は、最終的な多孔性ヒドロゲルの外径のサイズを決定することができ、これは一般に約１０ｍｍから約２５ｍｍの範囲であり得る。

層状固体ヒドロゲルの調製
本発明の改良された製造方法は、層状の固体ヒドロゲルの調製を含む。これは、固体ヒドロゲルが、さまざまなヒドロゲルのゾーンにおいて、さまざまな濃度の非分解性ポリマーから構成されることを意味する。好ましい実施形態では、異なる濃度のポリマーの層間を漸進的に遷移する。一実施形態では、固体ヒドロゲル中に、異なる濃度の非分解性ポリマーを含む２つの層がある。いくつかの実施形態では、固体ヒドロゲル中に３つ以上の層がある。

いくつかの実施形態では、ポリマーは溶媒中にある。好ましい溶媒はＤＭＳＯである。

いくつかの実施形態では、固体多孔質ベースに隣接する層、すなわち界面層は、固体多孔質ベースから離れた層、すなわち支持層よりも高い濃度の非分解性ポリマーで構成される。

本発明の層状固体ヒドロゲルを示す図８Ａ～８Ｃを参照する。固体多孔質ベースに隣接する固体ヒドロゲル層（界面層）１４０は、約２０％から約４０％の濃度範囲のポリマーで構成され、３５％が好ましい。固体多孔質ベースから離れた固体ヒドロゲル層（支持層）１１０は、約１０％から約３０％の濃度範囲のポリマーで構成され、２０％が好ましい。図８Ａ～８Ｃの固体ヒドロゲルモデルに示されている尾部構造は、多孔質剛性ベースの幾何学的図形を埋めている。本発明の方法により作製されたインプラントの固体ヒドロゲル部分の好ましい実施形態は、図８Ａ～８Ｃに示されており、１穴設計である。図に示されるように、固体ヒドロゲル層１４０は、層１４０と多孔質剛性ベース１３０との間の嵌合を可能にし、かつ促進する１つ以上の外側に突出する特徴を含む任意の数の異なる形状を有するように形成され得る（図１１Ａを参照）。

異なる濃度の層状ヒドロゲルを取得し、２つのゾーン間における漸進的な遷移をもたらす好ましい方法を以下に示す。

インプラントの組立て
多成分インプラントの改良された組立て方法は、本発明の新規な金型と、上部の支持層から界面層への漸進的な遷移を伴う層状ヒドロゲルを備える改善された界面強度を有するインプラントをもたらす新規な方法を利用する。この方法では、一貫した界面層を生成することもできる。本明細書に開示される特定の金型は新規であるが、本発明の方法は、任意の金型または担体を使用して実施することができる。

図１１Ａを参照すると、組立て方法の最初のステップは以下を含む。
ａ．多孔質剛性ベース１３０を金型２００のベース２１０のウェル２２０内に配置するステップ。
ｂ．多孔性ヒドロゲル１２０を、金型２００のベース２１０のウェル２２０内に、多孔質剛性ベース１３０の上部にウェル２２０の（側面）壁に沿って配置するステップ。
ｃ．第１の蓋２３０を金型２００のベース２１０上に配置するステップ。
ｄ．金型に嵌合するノズルまたはチップ３１１を備え、材料をウェル２１０に注入するように構成されたツール３１０を使用して、金型２００のウェル２１０内に第１の低粘度ポリマーを導入または注入するステップ（図１１Ａは、第１の蓋２３０はノズル３１１を受け、ノズル３１１をウェル２２０と一直線に配置するように構成された開口部を有することを示す）。
ｅ．第１の蓋２３０を伴い、多孔質剛性ベース１３０、多孔性ヒドロゲル１２０を含み、低粘度ポリマーが注入された金型２００を、約－２０℃に約４～２４時間凍結し、続いてそのベース金型スポンジを約２３℃で約４～１２時間解凍し、固体ヒドロゲル層１４０の形成をもたらすステップ。
ｆ．ベース２１０から第１の蓋２３０を取り外すステップ。
多孔質剛性ベース１３０および多孔性ヒドロゲル１２０は、商業的に、または当該技術分野で既知の方法により、または本明細書に記載のように得ることができる。本明細書に記載の方法で使用される好ましい多孔質剛性ベースは、単一のマクロ孔または穴を有する。本方法で使用される好ましい多孔性ヒドロゲルも本明細書に記載されており、約１０％～４０％のポリマー濃度を有し、好ましい濃度は約１０％である。

いくつかの実施形態では、第１の低粘度ポリマーはポリ（ビニル）アルコールまたはＰＶＡであるが、他の非生分解性ポリマーを使用することができる。使用できる他の非生分解性ポリマーの例は、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリウレタン、およびそれらの組合せである。

第１のポリマーの濃度は一般に、第２のポリマーの濃度よりも高い。第１のポリマーの濃度は、約２０％から約４０％の範囲であり、３５％が好ましい。

ＤＭＳＯを第１のポリマーの溶媒として使用することも好ましい。水も溶媒として使用できる。

低粘度ポリマーは、第１の蓋２３０が金型２００に取り付けられた後、多孔質剛性ベース１３０および多孔性ヒドロゲル１２０を既に含む金型２００のベース２１０のウェル２２０内に導入または注入される。ポリマーは、金型のウェル内にポリマーを正確に導入できる任意のツール３１０によって導入または注入することができる。そのようなツールの例は、シリンジポンプである。本明細書で説明されるように、ツール３１０は、さまざまなノズルチップを受け、さまざまな注入特性を示し、意図される用途に基づいて、またウェルのサイズや蓋の開口部のサイズなどの金型特性に基づいてノズルが選択される本体を有することができる。

最初のポリマーが金型に注入された後、金型全体が凍結／解凍サイクルにかけられる。好ましい方法は、約－２０℃で約４～２４時間、好ましくは２０時間金型を凍結し、次に約２３℃で約４～１２時間、好ましくは４時間構造体を解凍することを含む。これは、当業者によって変えることができる。凍結および／または解凍の両方の時間数は、サイクル数と同様に変えることができる。凍結／解凍サイクルの好ましい数は約１である。

金型の凍結／解凍サイクルの後、第１の蓋を取り外し、余分なポリマー、例えばＰＶＡを取り除くことができる。

図１１Ａを参照すると、方法の最初のステップの後、得られる構造体は、多孔質剛性ベース１３０、多孔性ヒドロゲル１２０、および固体ヒドロゲルの界面層１４０を含み、当該界面層は、約２０％～４０％、好ましくは約３５％のポリマー濃度を有する。図１１Ａに見られるように、固体ヒドロゲル１４０を形成する材料は、多孔質剛性ベース１３０の開口部／表面特徴に広がり、したがって、材料が固化すると、ヒドロゲル層１４０は、多孔質剛性ベース１３０と結合する（例えば、連結する）。

図１１Ｂを参照すると、組立て方法の次のステップは以下を含む。
ｇ．金型２００のベース２１０上に第２の蓋２４０を配置する。ここで、金型のウェル２２０は、多孔質剛性ベース１３０、固体ヒドロゲルの界面層１４０、および多孔性ヒドロゲル１２０を含む。
ｈ．第２の低粘度ポリマーをツール３１０のノズル３１２で金型２００のウェル２２０内に導入または注入する（例えば、図示のように、ノズルチップ３１２は、第２の蓋２４０における開口部のサイズの違いを考慮してノズルチップ３１１とは異なる構造とすることができる）
ｉ．金型２００を約－２０℃に約４～２４時間凍結させ、続いてその金型を約２３℃で約４～１２時間解凍し、固体ヒドロゲル層１１０を形成させる。
ｊ．第２の蓋２４０を取り外す。
いくつかの実施形態では、第２の低粘度ポリマーはポリ（ビニル）アルコールまたはＰＶＡであるが、やはり他の非生分解性ポリマーを使用することができる。使用できる他の非生分解性ポリマーの例は、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリウレタン、およびそれらの組合せである。

第２のポリマーの濃度は、約１０％から約３０％の範囲であり、２０％が好ましい。

ＤＭＳＯを第２のポリマーの溶媒として使用することも好ましい。水も溶媒として使用できる。

第２の低粘度ポリマーは、第２の蓋２４０が金型２００のベース２１０に取り付けられた後、多孔質剛性ベース１３０、固体ヒドロゲルの界面層１４０および多孔性ヒドロゲル１２０を既に含む金型のウェル内に導入または注入される。ポリマーは、金型のウェル内にポリマーを正確に導入できる任意のツール３１０によって導入または注入することができる。そのようなツールの例は、シリンジポンプである。

次いで、金型２００全体は、凍結／解凍サイクルにかけられる。好ましい方法は、約－２０℃で約４～２４時間、好ましくは２０時間金型を凍結し、次に約２３℃で約４～１２時間、好ましくは４時間構造体を解凍することを含む。やはり、これは当業者によって変えることができる。凍結および／または解凍の両方の時間数は、サイクル数と同様に変えることができる。凍結／解凍サイクルの好ましい数は１である。金型は、各間隔において４～２４時間の範囲の一定時間、好ましくは２０時間凍結できる。解凍時間は、４～１２時間の範囲、好ましくは４時間であり得る。

金型の凍結／解凍サイクルの後、第２の蓋２４０が取り外される。

図１１Ｂを参照すると、得られる構造体は、多孔質剛性ベース１３０、多孔性ヒドロゲル１２０、固体ヒドロゲルの界面層１４０を含み、当該界面層は、約２０％～４０％、好ましくは３５％のポリマー濃度と、固体ヒドロゲル１１０からなる支持層を有し、当該支持層は、約１０％～３０％、好ましくは２０％のポリマー濃度を有する。図１１Ｂに示されるように、固体ヒドロゲル１１０は、多孔性ヒドロゲル１２０の間に形成され、固体ヒドロゲル１４０に隣接する。

組立て方法のこの時点で、金型内のインプラントが約６～１２時間の追加の凍結／解凍サイクルを受け、ヒドロゲルが所望の機械的特性に到達できるようになった後、完全な多成分インプラント（接合された一体構造）が作製される。得られるインプラントは、固体ヒドロゲル層に湾曲を有さない。図１１Ｂを参照のこと。そのような湾曲が望まれる場合、インプラントが追加の凍結／解凍サイクルを受ける前に、以下に概説する方法のさらなるステップを実行することができる。

図１１Ｃを参照すると、組立て方法の最終ステップは以下を含み得る。
ｋ．金型２００のベース２１０上に第３の蓋２５０を配置するステップ、ここで、金型２００のウェル２２０は、多孔質剛性ベース１３０、固体ヒドロゲルの界面層１４０、多孔性ヒドロゲル１２０、および固体ヒドロゲル１１０からなる支持層を含み、第３の蓋２５０は、約０ｍｍから約２ｍｍの範囲の曲率を有する（例えば、第３の蓋２５０の底面は、インプラントの表面を形成することを目的とする１つまたは複数の凹状の陥凹領域を備える）。
ｌ．金型２００に形成された底部の開口部を通過し、ウェルと連通して多孔質剛性ベース１３０を第３の蓋２５０の凹状の陥凹領域との接触を維持するためのインプラントの所望の最終曲率により定義される距離だけ変位させるツール３２０を使用して、多孔質剛性ベース１３０を変位させるステップ。
ｍ．第３の蓋２５０を伴い、多孔質剛性ベース１３０、多孔性ヒドロゲル１２０、固体ヒドロゲルの界面層１４０、および固体ヒドロゲルの支持層１１０を含む金型２００を、約－２０℃に約４～２４時間凍結し、続いてそのベース金型スポンジを約２３℃で約４～１２時間解凍するステップ。
ｎ．第３の蓋２５０を取り外して、多孔質剛性ベース１３０、多孔性ヒドロゲル１２０、固体ヒドロゲルの界面層１４０、および固体ヒドロゲル１１０からなる支持層を含むインプラントを得るステップ。
ｏ．多孔性ヒドロゲル１２０から生分解性ポリマーを除去するステップ。

第３の蓋２５０は、その底面に沿った凹状の陥凹領域の存在の結果、最終的なインプラントの表面の湾曲を画定する。第３の蓋の曲率は、０ｍｍの曲率ゼロから最大２ｍｍまで変化し得る。最終的なインプラントの所望の曲率は、最終的なインプラントの使用および／または最終的なインプラントが移植される領域に応じて、当業者によって決定され得る。言い換えれば、複数の第３の蓋２５０をそれぞれ異なる湾曲度で提供することができ、ユーザーは所望のものを選択する。

多孔質剛性ベース１３０は、金型２００のベース２１０のウェル２２０の底部の開口部に挿入される、ネジまたはペグを含むがこれらに限定されない任意のツールによって変位させることができる。インプラントが変位する距離は、第３の蓋の曲率から第３の蓋の曲率の２倍の範囲であり得る。

上述のように、凍結および／または解凍の両方の時間数は、サイクル数と同様に変えることができる。凍結／解凍サイクルの好ましい数は、６から１２の範囲であり、８が好ましい。

生分解性ポリマー、例えば、コラーゲンスポンジは、酵素消化を含むがこれに限定されない任意の技術によって、インプラントの多孔性ヒドロゲル部分から除去することができる。

前述のステップは、ロボット装置、空気圧システムなどを使用するなど、自動化された方法で実行できること、または手動プロセスの一部として少なくとも部分的に実行できることが理解されよう。

組立てに続いて、滅菌および移植の前にインプラント全体を脱水することができる。脱水は、インプラントを１００％エタノールに一晩浸漬し、エタノールを蒸発させることで実行できる。

挿入または移植の前に、インプラントに補助剤を添加できる。インプラント、および／または損傷または欠損の内部への、およびその周りでの移行、一体化、再生、増殖、および細胞の成長を促し、および／または損傷または欠損の治癒を促進し、および／または軟骨形成性および造骨性である、すなわち軟骨と骨を形成する任意の薬剤をインプラントに添加できる。

これらの薬剤には、治療、修復、および／または置換される損傷または欠損に特異的なサイトカイン、ケモカイン、化学誘引物質、抗菌薬、抗ウイルス薬、抗炎症薬、炎症誘発薬、骨または軟骨再生分子、血液、血液成分、多血小板血漿、およびそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。

これらの成分の添加は、移植の前に脱水ヒドロゲルを薬剤に約１５分間浸漬して、多孔性ヒドロゲルを薬剤で再水和させることにより行うことができる。

ヒドロゲルまたは弾性ポリマーおよび多孔質剛性材料を含むデバイス、構造体または材料の製造方法
上記のように、本発明の目的は、ヒドロゲル－多孔質剛性材料、例えばＰＶＡ－金属の界面を有するデバイス、構造体または材料の製造方法を開発し、界面でのデバイス、構造体、または材料の機械的破損を防ぐことであった。デバイス、構造体または材料の界面強度は、上部領域層（例えば、２０％ＰＶＡ）から界面領域または層（例えば、３５％ＰＶＡ）への漸進的な遷移を伴う層状ヒドロゲルを作製することにより、大幅に改善できる。本明細書で説明する独自の製造方法により、一貫性のある界面層を作製できる（実施例７～１０）。

したがって、本発明のさらなる態様は、界面を有するヒドロゲルおよび多孔質剛性材料を含むデバイス、構造体、または材料を作製、製造および／または生産する方法であり、以下を含む。
ａ．多孔質剛性材料を担体に配置するステップ。
ｂ．第１の低粘度ポリマーを担体に導入または注入するステップ。
ｃ．担体を約－２０℃に約４～２４時間凍結し、続いてその担体を約２３℃で約４～１２時間解凍するステップ。
ｄ．第２の低粘度ポリマーを担体に導入または注入するステップ。
ｅ．担体を約－２０℃に約４～２４時間凍結し、続いてその担体を約２３℃で約４～１２時間解凍するステップ。
ｆ．担体を約－２０℃に約４～２４時間凍結し、続いてその担体を約２３℃で約４～１２時間解凍し、これらを約６～１２回実施するステップ。

いかなる理論にも束縛されることなく、本発明の方法は、シリンジまたは圧力システムなどによって多孔質剛性材料内に駆動される方法で第１の低粘度ポリマーを導入または注入することにより、この強力な界面を最初に作製するように機能する。次に、凍結／解凍サイクルが１回だけ実行されるため、第１の低粘度ポリマーによって形成された界面層に未架橋のヒドロゲルが残る。したがって、第２の低粘度ポリマーが導入または添加されるとき、ポリマーの濃度が異なる２つの層の間にいくらかの拡散がある。この場合も、第２の低粘度ポリマーによって形成されたヒドロゲルの一部はステップｅ．の凍結／解凍サイクルによって架橋されるが、ヒドロゲルの一部は未架橋のままであり、最終的な凍結／解凍サイクル（ステップｆ．）が約６～１２回、好ましくは８回実行されるまで、より多くの拡散がある状態になる。

いくつかの実施形態では、第１の低粘度ポリマーはポリ（ビニル）アルコールまたはＰＶＡであるが、他の非生分解性ポリマーを使用できる。使用できる他の非生分解性ポリマーの例は、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリウレタン、およびそれらの組合せである。

第１のポリマーの濃度は一般に、第２のポリマーの濃度よりも高い。第１のポリマーの濃度は、約２０％から約４０％の範囲であり、３５％が好ましい。

ＤＭＳＯを第１および第２のポリマーの両方の溶媒として使用することも好ましい。水も溶媒として使用できる。

いくつかの実施形態では、第２の低粘度ポリマーはポリ（ビニル）アルコールまたはＰＶＡであるが、やはり他の非生分解性ポリマーを使用することができる。使用できる他の非生分解性ポリマーの例は、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリウレタン、およびそれらの組合せである。

第２のポリマーの濃度は、約１０％から約３０％の範囲であり、２０％が好ましい。

ＤＭＳＯを第１および第２のポリマーの両方の溶媒として使用することも好ましい。水も溶媒として使用できる。

本発明のこれらの方法の結果は、上部領域層（例えば、２０％ＰＶＡ）から界面領域または層（例えば、３５％ＰＶＡ）への漸進的な遷移を伴う層状ヒドロゲル、および多孔質剛性材料を含み、これら２つの非常に異なる層の間に一体化を最大限にする界面を有する、新規なデバイス、構造体、または材料である。

この新規なプロセスを使用して作製されたデバイス、構造体、および材料は、生物医学、自動車、航空機、および航空宇宙の分野で多く使用されている。

ただし、本発明のさらなる態様は、界面を有する弾性ポリマーおよび多孔質剛性材料を含むデバイス、構造体、または材料を作製、製造および／または生産する方法であり、以下を含む。
ｇ．多孔質剛性材料を担体に配置するステップ。
ｈ．第１の低粘度ポリマーを、化学架橋剤を含む担体に導入または注入するステップ。
ｉ．第１の低粘度ポリマーを、化学架橋剤を使用して一定時間にわたり一定温度でインキュベートして、化学架橋剤が第１のポリマーを部分的に架橋して界面層を形成できるようにするステップ。
ｊ．第２の低粘度ポリマーを、化学架橋剤を含む担体に導入または注入するステップ。
ｋ．第２の低粘度ポリマーを、化学的架橋剤を使用して一定時間にわたり一定温度でインキュベートして、所望の架橋パーセンテージに到達して層状弾性ポリマーが形成されるまで化学架橋剤が第２のポリマーを架橋できるようにするステップ。
ｌ．弾性ポリマーを洗浄して、未反応の架橋剤とポリマーを除去するステップ。
やはり、いかなる理論にも束縛されることなく、本発明のこの方法は、第１の低粘度ポリマーを部分的に架橋するだけでも機能し、したがって、第２の低粘度ポリマーが添加されると、ポリマー濃度の異なるこれら２つの層の間に拡散が生じる。これにより、これら２つの弾性ポリマー濃度が異なる層の間の漸進的な遷移と、より強力な界面層が可能になる。

いくつかの実施形態では、弾性ポリマーには、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、およびポリウレタンが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、化学架橋剤はグルタルアルデヒドである。

いくつかの実施形態では、ステップｆ．の洗浄は、水で行うことができる。

この新規なプロセスを使用して作製されたデバイス、構造体、および材料は、生物医学、自動車、航空機、および航空宇宙の分野で多く使用されている。

金型
本発明のさらなる態様は、インプラントの製造方法において使用される独自の金型である。この金型は、新規な製造方法を促進する。この金型は、インプラントをいくつでも製造できるように設計できるため、インプラントの生産規模を拡大するのに最適である。

図１１Ａ～１１Ｃに示される一実施形態では、金型２００は、少なくとも１つのウェル２２０と３つの異なる蓋２３０、２４０、および２５０を備えた単一のベース２１０から構成される。

ベースと蓋は、テフロン(登録商標)、ＰＥＥＫ、ＰＥＫＫ、ポリカーボネートまたはＵＬＴＥＭから、従来の製造方法を使用して作製でき、ポリカーボネートが好ましい材料である。金型は、３Ｄ印刷などの新しい技術を使用して製造することもできる。

金型のベース２１０は少なくとも１つのウェル２２０を含み、ベースは最大で約５０の複数のウェルを含むことが好ましい。

ウェル２２０のサイズは、所望の最終的なインプラントのサイズによって決定され、深さは約５ｍｍから約２０ｍｍの範囲であり得る。多孔質剛性ベース１３０が配置されるウェルの底部の直径は約５ｍｍ～約１０ｍｍの範囲であり、多孔性ヒドロゲル１２０が配置される直径が約１０ｍｍ～約２５ｍｍの範囲のウェルの上部よりも直径が小さい。

ウェルの底部は、第３の蓋２５０の取付け後に多孔質剛性ベースを変位させるために使用されるツール３２０を挿入するのに十分な大きさの開口部を有することができる。開口部は、挿入するツールのサイズによって決まり、直径は約３ｍｍ～約１０ｍｍの範囲であり得る。

第１の蓋２３０は、ベース２１０に嵌合するように設計されており、これによって、固体ヒドロゲルの界面層１４０に対するテンプレートが示され、また固体ヒドロゲルの界面層１４０となる第１の低粘度ポリマーの浸透が可能になる。図１１Ａに示されるように、第１の蓋２３０は、シリンジポンプなどのツール３１０を挿入できる開口部を有するように設計され、当該ツールは、低粘度ポリマーを金型２００のベース２１０のウェル２２０に導入または注入するために使用され、このウェルには多孔質剛性ベース１３０および多孔性ヒドロゲル１２０が含まれる。第１の蓋２３０は、開口部がベース２１０のウェル２２０の中心にくるように設計されている。

さらに、第１の蓋２３０は、固体ヒドロゲルの界面層１４０の形状を決定するテンプレートを有する。図１１Ａの例示的な金型の概略図に見られるように、第１の蓋２３０は、固体ヒドロゲルの界面層が同様に段形状を形成することを可能にする段設計テンプレートを有する。第１の蓋２３０は、界面層の所望の形状を得るために、任意の方法で設計することができることを当業者は理解するであろう。本発明の一実施形態では、金型には２つ以上の第１の蓋２３０が設けられており、第１の蓋は、固体ヒドロゲルの界面層を設計するさまざまなテンプレートを有する。さまざまなテンプレートの例には、アンカット、アリ溝、列が含まれるが、これらに限定されない。

第２の蓋２４０も、ベース２１０に嵌合するように設計されており、これによって、固体ヒドロゲル１１０からなる支持層に対するテンプレートが示され、ツール３１０を使用してベースのウェルに第２の低粘度ポリマーを導入または注入できるようになる。図１１Ｂに示されるように、第２の蓋２３０は平坦であり、固体ヒドロゲルの支持層がこの製造段階で平坦化された上部を有することを可能にする。この設計はまた、２つのヒドロゲル層を重ねることができ、それら２つの層の間での漸進的な遷移をもたらす。

第３の蓋２５０もベース２１０に嵌合するように設計されている。第３の蓋２５０は、インプラントの表面の湾曲を画定するように設計されており、湾曲なしで平坦（０ｍｍ）に、最大湾曲で２ｍｍとなるように設計されている。最終的なインプラントの曲率は、その最終用途および／または移植先となる身体の領域によって決定されることは、当業者によって理解されるであろう。本発明の一実施形態では、金型には、０～２ｍｍの範囲の異なる曲率を有するいくつかの第３の蓋２５０が設けられ、例えば、０．２ｍｍ、０．５ｍｍ、０．８ｍｍ、１．０ｍｍ、１．２ｍｍ、１．５ｍｍ、１．８ｍｍ、および２．０ｍｍの曲率を有する蓋を含み得る。上述のように、湾曲を付与するために、第３の蓋２５０の底面は、凹状の陥凹領域を備える。

金型の蓋は、金型の縁と中央の周りのネジで固定できる。当業者は、蓋が移動するのを防ぐために必要なネジの必要数を決定することができるであろう。多孔質剛性ベースは、ネジなどのツール３２０によって移動させるか、または定義された高さのピンを含む追加のジグに固定することができる。

キット
本発明はまた、多成分インプラント、デバイス、構造体または材料を作製、製造および／または生産する新規な方法を実施するために必要な材料を含むキットを提供する。

一実施形態では、キットは、少なくとも１つのウェル２２０、少なくとも１つの第１の蓋２３０、少なくとも１つの第２の蓋２４０、および少なくとも１つの第３の蓋２５０を含むベース２１０を備える、本発明の金型を有する。

いくつかの実施形態では、キットは、複数の第１の蓋を含み、当該第１の蓋は、固体ヒドロゲルの界面層の形状を決定するためのさまざまなテンプレートを有する。

いくつかの実施形態では、キットは、複数の第３の蓋を含み、当該第３の蓋は、０～２ｍｍの範囲のさまざまな曲率を有し、例えば、曲率０．２ｍｍ、０．５ｍｍ、０．８ｍｍ、１．０ｍｍ、１．２ｍｍ、１．５ｍｍ、１．８ｍｍ、および２．０ｍｍの蓋を含み得る。

いくつかの実施形態では、金型のウェル内に第１および第２のポリマーを導入または注入するためのツールが、キットにおいて提供される。このようなツールには、シリンジポンプが含まれるが、これに限定されない。

いくつかの実施形態では、第３の蓋が金型のベース上にあるときに多孔質剛性ベースを変位させるためのツールもキットにおいて提供される。このようなツールには、ペグまたはネジが含まれるが、これらに限定されない。

さらなる実施形態では、キットは、多孔質剛性ベース、多孔性ヒドロゲル、および約１０％から約４０％までの範囲のさまざまな濃度の低粘度ポリマーを含むがこれらに限定されない、インプラントのための出発原料を提供する。生分解性ポリマーを除去する薬剤、最終的なインプラントを脱水する薬剤、溶媒、および補助薬剤を含むがこれらに限定されない他の材料がキットに含まれ得る。

いくつかの実施形態では、説明書がキットに含まれている。このような説明書には、さまざまな構成要素、ツール、および蓋を備えた金型の組立て、および時間、温度、サイクル数を含む凍結および解凍パラメータに関する情報が含まれます。

本発明は、本発明の好ましい実施形態をより十分に説明するために提示される以下の非限定的な実施例を参照することにより、よりよく理解され得る。それらは、決して本発明の広い範囲を制限するものと解釈されるべきではない。

実施例１－インプラントのヒドロゲル部分の改善された製造を開発およびテストするための材料および方法（実施例２－４）
すべての取扱いおよび製造技術は無菌的に行われ、細菌や他の感染性物質による汚染を最小限に抑えた。

ＰＶＡヒドロゲルの特性を改善する方法を得るために、（ｉ）温度、（ｉｉ）ポリマーブレンド、および（ｉｉｉ）ＰＶＡモノマーが溶解した溶媒の変更に関する変数をテストした。

製造方法－すべてのグループで同一：ＰＶＡの溶液は、均一な溶液温度を維持するために、鉱油浴のオーバーヘッドスターラーを使用して作製された。すべてのＰＶＡが溶解するまで溶液を攪拌した（１～４時間）。水中のＰＶＡ溶液は９０℃に加熱され、ＤＭＳＯで作製されたものは１２０℃に加熱された。ＰＶＡ溶液を金型に入れ、特注の温度チャンバー内で、－２０℃での２０時間の凍結サイクルと２３℃での４時間の解凍サイクルからなる凍結／解凍サイクルにかけた。

機械的評価の方法－すべてのグループで同一：各条件のヒドロゲルのシートから８つの１０ｍｍ円筒形プラグを抜き取った。円筒形ＰＶＡサンプルの初期直径を、テスト前に電子ノギスを使用して測定した。次に、サンプルを圧縮テスト装置の下部プラテンの中央に配置した。装置の上部プラテンは、プラテンがサンプルと接触したことを示す小さな圧縮荷重（＜０．０１Ｎ）が読み取られるまで下げられた。下部プラテンの高さを接触高さから差し引き、サンプルの高さを計算した。ＥｎｄｕｒａＴＥＣ ＥＬＦ ３２００ロードフレーム（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、デラウェア州ニューキャッスル）を使用して、変位制御下でＰＶＡサンプルを０．５％のひずみ率で３０％ひずみまで一軸圧縮した。アクチュエータの負荷と変位のデータが、ＷｉｎＴｅｓｔソフトウェア（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、デラウェア州ニューキャッスル）を使用してコンピューターに収集された。

実施例２－最適なポリマーブレンドの決定
最初に、ポリマーブレンドと、ＰＶＡヒドロゲルを乾燥させた温度の変更をテストした。

ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が、ＰＶＡヒドロゲルの安定性を改善するために以前に使用されていた（Ｍａｈｅｒ他、２００７年）ため、二次ポリマーとして選択された。これらのテストでは、液体に対するポリマーの合計重量／体積（ｗ／ｖ）が２０％に維持され、ＰＶＰの割合（ｗ／ｖ）が０から５％に変更された。ポリマー溶液を水に溶解し、６回の凍結／解凍サイクルにかけた。凍結／解凍サイクルが完了した後、ヒドロゲルを１００％エチルアルコール（ＥｔＯＨ）で２４時間、ＥｔＯＨ溶液を２回交換しながら洗浄した。ヒドロゲルを溶液から取り出し、室温（２３℃）または８５℃で２４時間乾燥させた。次いで、ヒドロゲルを、実施例１に記載されるように実施される機械的テストを実施する２４時間前に再水和した。

機械的テストの結果、８５℃で乾燥させた２０％ＰＶＡが、他の条件と比較して圧縮弾性率（１．４８±０．４ＭＰａ）を大幅に改善したことが示された（図２）。

実施例３－最適な溶媒の決定
テストのために、１）再蒸留Ｈ_２Ｏ（ｄｄＨ２Ｏ）および２）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の２つの溶媒が選択された。溶媒を使用して、２５％、３０％、および３５％ＰＶＡ（ｗ／ｖ）の濃度でＰＶＡの溶液を作製した。溶媒としてｄｄＨ２Ｏを使用した３５％ＰＶＡ溶液は、溶液の粘度が高いため作製できなかったので、この研究の結果にこのグループを含めなかった。次に、溶液を１００ｍｍ細胞培養皿に注ぎ、６回の凍結／解凍サイクルにかけた。

ｄｄＨ２Ｏでの（実施例１の説明のとおりにテストされた）ＰＶＡヒドロゲルの圧縮弾性率は、２５％および３０％ＰＶＡグループでそれぞれ０．６８±０．０７および１．３５±０．３１ＭＰａであった（図３）。ＤＭＳＯ中のＰＶＡヒドロゲルの圧縮弾性率は、２５％および３０％ＰＶＡグループでそれぞれ０．３９±０．０３および０．７２±０．０５ＭＰａであった。ｄｄＨ２Ｏグループの２５％および３０％ＰＶＡの係数は、対応するＤＭＳＯグループと比較して約４０％高かった。

これらのデータによって、ｄｄＨ２Ｏがより強度の高いゲルを作製することが示唆されたが、結果はｄｄＨ２Ｏに溶解したＰＶＡの最適な凍結／解凍サイクルに基づくものであった。したがって、凍結／解凍サイクル数がＤＭＳＯ中のＰＶＡの溶液から作製されたヒドロゲルの機械的特性をどのように変化させるかを理解するためにテストが行われた。２５％および３５％のＰＶＡ濃度がＤＭＳＯ中に作製され、６、８、または１１回の凍結／解凍サイクルにかけられた。解凍後、１０ｍｍの円筒形プラグをＰＶＡシートから抜き取り、３日間洗浄して残りのＤＭＳＯを除去した。次に、ヒドロゲルの圧縮特性をテストした。

２５％ＰＶＡの溶液（図４Ａ）では、ＰＶＡの係数は、８～１１回の凍結／解凍サイクル後のｄｄＨ２Ｏの２５％ＰＶＡ溶液と同じ範囲であった。２５％ＰＶＡヒドロゲルの係数は、８日間の凍結／解凍で０．７４±０．０４ＭＰａ、１１日後で０．７９±０．０６ＭＰａであった。また、３５％ＰＶＡ溶液（図４Ｂ）でも、６日間（１．９１±０．１７ＭＰａ）から８日間（２．６６±０．１４）にかけて圧縮弾性率の増加が観察されたが、８日間から１１日間にかけてはほとんど変化しなかった（２．７１±０．１０）。このテストに基づいて、ＤＭＳＯ中のＰＶＡの凍結／解凍サイクルの数を８に増加させ、ｄｄＨ２Ｏを使用して作成されたヒドロゲルと同じ特性を維持した。

ＤＭＳＯを溶媒として使用して、１５％～４０％（ｗ／ｖ）ＰＶＡの範囲のヒドロゲルの圧縮特性を測定した（図５）。ヒドロゲルは、４０％ＰＶＡで３．６２±０．５ＭＰａの最大特性を持つ指数曲線に適合する。４０％ヒドロゲルは優れた機械的特性を備えていたが、溶液は粘度が高いため操作が難しく、以降のテストでは使用されなかった。

実施例４－層状ヒドロゲル
層状ヒドロゲル作製の実現可能性をテストした。サンプルは、マイクロインデンテーションテストのために、ラッシュ大学（イリノイ州シカゴ）のＭａｒｋｕｓ Ｗｉｍｍｅｒ博士の研究室に送られた。テストした各ヒドロゲルの長さに沿って、深さ５ｎｍの３０のインデントを２ラウンド実行するために、５０ｕｍのラウンドエンド圧子を使用した。２０％と３５％のＰＶＡからなる層状ヒドロゲルについて、２つのＰＶＡ濃度間の界面に対して垂直にくぼみをつけた。

マイクロインデンテーションテストは、以前にテストされた２５％と３０％の濃度である均一なＰＶＡヒドロゲルで最初に最適化された。特性はヒドロゲル全体で一貫しており、２５％ＰＶＡは０．１７±０．０１２ＭＰａの測定特性を持ち、３０％ＰＶＡは０．２５±０．０４２ＭＰａの特性を持った。

次に、２０％および３５％のＰＶＡ層で構成される２層のヒドロゲルでテストを実施した。ヒドロゲルの特性はＳ字曲線に適合し、３５％から２０％へＰＶＡ層を漸進的に遷移した（図６）。Ｓ字適合から、３５％ＰＶＡの係数は０．４８ＭＰａで、２０％の係数は０．１８ＭＰａで、ヒドロゲルの１．４ｍｍにかかる遷移ゾーンがある。

実施例２～４に記載された結果は、同じ機械的特性を維持しながら、溶媒としてＤＭＳＯを使用して、より高濃度のＰＶＡヒドロゲルを作製できることを示した。異なる濃度のヒドロゲルを重ねることが可能であり、２つのゾーン間に漸進的な遷移がもたらされた。得られたヒドロゲル組成物を使用して、実施例５でテストされるインプラントを設計した。図８Ａ～８Ｃを参照のこと。

実施例５－計算有限要素（ＦＥ）モデルを使用したさまざまなインプラント設計のテスト
以前に開発、検証されたヒトの膝関節のＦＥモデル（Ｇｕｏ他、２０１５年）が、インプラント設計の機械的性能を評価するために使用された。手短に言えば、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）に基づいて、ヒトの死体膝の対象固有のモデルが作製された。歩行に関して死体シミュレーションから測定された膝固有の運動学が、大腿骨上顆軸の中点に適用される軸力入力と組み合わされた。関節軟骨と半月板が弾性材料としてモデル化された。半月板は横方向に等方性であると想定された。材料特性は、以前に報告された測定値の中間値として設定された。半月板のアタッチメントは線形バネとしてモデル化された。骨とインプラントベースは剛性であると想定され、剛性境界条件で表された。モデル内のすべての表面間接触は、摩擦なしと仮定された。異なるデザインのすべてのインプラントは、内側大腿軟骨の同じ場所に配置され、インプラントの表面は軟骨の湾曲に一致すると仮定された。ＦＥモデルは歩行周期で実行され、軸力の３つの局所ピーク（すなわち、歩行周期の４％、１４％、４５％）でのインプラント－骨界面でのせん断応力の結果が出力された（図７）。

ＦＥモデルが、３つの異なる金属ベース設計、すなわち４穴、１穴、およびアリ溝でのＰＶＡ－金属界面での力を理解するために使用された（図８Ａ～８Ｃ）。 ＦＥモデルが、３つの異なる金属ベース設計、すなわち４穴、１穴、およびアリ溝でのＰＶＡ－金属界面での力を理解するために使用された（図８Ａ～８Ｃ）。主要な応力方向の分析が行われ、主な応力が圧縮とせん断にあることが示された。したがって、分析はせん断に焦点を合わせた。

３つの設計すべてについて、歩行周期の４５％でのインプラントと骨の界面でのせん断応力は、調査した歩行周期の３つの時点で最高であり、歩行周期の４％でのせん断応力は最小であった。歩行周期の４５％で、インプラントと骨の界面でのピークせん断応力は、４穴およびアリ溝設計では約３ＭＰａであったが、１穴設計では２．３ＭＰａであった。歩行周期の４％で、インプラントと骨の界面でのピークせん断応力は、１穴およびアリ溝設計では約０．８ＭＰａであったが、４穴設計では１．７ＭＰａであった。４穴設計の平坦な界面でせん断応力集中が見られ、一方、１穴およびアリ溝設計では、尾部構造の根元でせん断応力集中が見られた。４穴設計の円柱は、１穴およびアリ溝設計の尾部構造よりも高いせん断応力を持ち、１穴およびアリ溝設計の尾部構造のほとんどの部分は０ＭＰａに近いせん断応力を持っていたが、これは多孔性フィーチャ内のヒドロゲルがせん断応力から保護されていることを示す。

実施例６－インプラントの多孔質剛体ベース部分の製造
直径９ｍｍ、サイズ約１５０～５００μｍの気孔、底部に４５°のテーパーを備えたチタン（Ｔｉ６Ａ１４ＶまたはＴｉ６Ａ１４ＶＥＬＩ）シリンダーを、ベースの上面に１つの追加穴（直径１．３ｍｍ、深さ４．５ｍｍ）を設けた状態で３Ｄ印刷にかけた。０．５ｍｍの段も作成された。これらのベースは、コンピューター支援設計を使用して設計され、電子ビーム溶融などの技術を使用して、またはレーザー金属焼結によって作製された。

実施例７－インプラントの組立て
コラーゲンスポンジにＤＭＳＯ中の１０％ＰＶＡを含浸させた。単一の凍結／解凍サイクルの後、同心パンチを使用してスポンジの芯を抜き取り、多孔性ヒドロゲルの縁部を形成した。

チタン（Ｔｉ）またはＰＥＥＫ製の多孔質金属ベースをベース金型に配置し（図１１Ａ～１１Ｃを参照）、その後、多孔性ヒドロゲルをベース金型のウェルに、エッジに沿って、金属ベースの上に入れた。

第１の蓋をベース金型の上に置き、シリンジポンプを使用して、ＤＭＳＯ中の液体３５％ＰＶＡをシリンジポンプを使用して注入口からベース金型のウェルに注入した。次に、金型全体を温度制御システムに入れて、単一の凍結／解凍サイクルにかけた。蓋を取り外し、余分なＰＶＡをはさみで切った。

次に、第２の蓋をベース金型に固定した。次いで、ＤＭＳＯ中の液体２０％ＰＶＡを金型のウェルの注入ポートから注入し、次いで、金型全体を温度制御システムに入れて、単一の凍結／解凍サイクルにかけた。第２の蓋を取り外した。

次に、第３の蓋をベース金型に固定した。第３の蓋はベース金型に固定された。第３の蓋の曲率は１ｍｍであった。

ネジをウェルの底に挿入し、ネジを回して金属ベースを１ｍｍ変位させた。次に、金型全体を温度制御システムに入れて、８回の凍結／解凍サイクルにかけた。

コラゲナーゼを使用してコラーゲンスポンジを消化し、インプラントをｄｄＨ２Ｏで１週間すすぎ、毎日溶液を交換して、残留酵素とＤＭＳＯを除去した。次に、インプラントを１００％ＥｔＯＨに一晩入れた。その後、エタノールを蒸発させて、最終的な脱水インプラントを残した。

実施例８－改良された製造方法により作製されたインプラントのせん断テスト
せん断テストの前に、実施例７の方法を使用して作製されたインプラントを１５分間浸漬し、その後、木材のブロックに事前に開けられた９ｍｍの穴に移植して外科的処置をシミュレートし、せん断テストの結果が移植後の界面の安定性を確実に再現するようにした。その後、インプラントは木材から取り外され、２４時間水に浸漬されて、インプラントが完全に再水和された。

サンプルの円筒形ＰＶＡ部分の初期直径は、テストの前に電子ノギスを使用して（垂直方向に）２回測定された。サンプルのＰＶＡ部分がテストデバイスの固定器具に挿入されている間に、サンプルのチタン（Ｔｉ）またはＰＥＥＫベースがテストデバイスの可動器具に固定された。ネジを使用して、ＰＶＡ－Ｔｉ／ＰＥＥＫ界面が可動器具と固定器具の間の隙間に配置されるようにサンプルを配置した。ネジはまた、ヒドロゲルが器具にトルクをかけることを防ぎ、純並進力が確実に界面に適用されるようにした。次に、Ｔｉ／ＰＥＥＫベースを含む可動器具を、変位制御下で０．０３ｍｍ／ｓの速度で一軸上方向に移動させ、ＥｎｄｕｒａＴＥＣ ＥＬＦ ３２００ロードフレーム（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、デラウェア州ニューキャッスル）を使用してＰＶＡ－Ｔｉ／ＰＥＥＫ界面にせん断を加えた。

界面の破損が発生したことを示す負荷の低下が確認されるまで、テストが実行された。アクチュエータの負荷と変位のデータが、ＷｉｎＴｅｓｔソフトウェア（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、デラウェア州ニューキャッスル）を使用してコンピューターに収集された。Ｗｏｏｄｆｉｅｌｄ（２０００年）で以前に説明されているように、界面せん断応力は最大力と変位を使用して計算された。各設計の安全係数は、ＦＥモデルで計算された最大界面応力を実験的に測定された破壊応力で除することによって計算された。

再水和されたインプラントは破損するまでテストされ、Ｔｉ（図９Ａ）およびＰＥＥＫ（図９Ｂ）ベースから作製されたインプラントについて安全係数が計算された。ソフトウェアで特性の低下が確認されると、インプラントが除去され、破損領域が確認された。すべての１穴Ｔｉインプラントについて、多孔性フィーチャを超えて破損するインプラントは認めらなかった。

単一のマクロ多孔性の穴を備えた多孔質チタンベースが、１より大きい安全係数をもたらす最適な組合せとして特定された。

実施例９－改良された製造方法によって作製されたインプラントの疲労テスト
ＦＥモデルを使用してデバイスが単一の歩行周期を通して生理的せん断および引張応力に耐える能力を分析できる一方で、実験モデルは繰り返し荷重に対する界面の応答を直接評価できる。したがって、実施例７の方法によって作製されたデバイスは、歩行をシミュレートするために、軸方向およびせん断力の組合せの２００，０００サイクルにかけられた。

成熟した馬の死体の膝関節から大腿骨顆が取り出された。大腿骨ブロックの中央領域にある４つの９ｍｍの円筒状の欠損は、デバイスの生体内移植用に設計された器具を使用して、軟骨表面に対して垂直に芯を抜き取った。その結果生じた骨軟骨欠損は、直径９ｍｍ×深さ１０ｍｍと測定された。実施例８で特定された最高の安全係数（ｎ＝１０／設計）を有する１穴デバイス設計を移植し、３７℃で一晩ＰＢＳで再水和させた。デバイスが埋め込まれた大腿骨ブロックは、特注のローリングおよびスライディングマシンの標本クランプに固定された。３／８インチの穴をもう一方の大腿骨顆に開け、１／２インチのステンレス鋼棒を穴に突き刺して回転軸を作製した。次に、ロッドを備えた顆を機械の回転軸に固定した。すべてのＦＥモデルで決定される最大軸力は、２３ポンドの重量に相当した。インプラントがより高い荷重に耐えられるようにするために、２０ＭＰａの圧縮応力に相当する５０ポンドの重量が機械の上部に適用された。大腿骨ブロックは、３か月間、通常の歩行の前後の並進移動の速度をシミュレートするために、２００，０００サイクルにわたって１０ｃｍのスパン全体で１０ｃｍ／秒の速度で平行移動した（Ｇｉｌｂｅｒｔ他、２０１５年）。

生理学的負荷の２倍で２００，０００サイクルのテストを行ったインプラントでは、１）２００，０００サイクルに達する前にＰＶＡ層にずれが生じた、または２）テスト完了時の破壊応力が、テスト前の７５％未満であるとして定義される「破損」は示されなかった。ＰＶＡ層のずれは生じなかった。

実施例１０－機械的テスト
実施例９の疲労テストの終わりに、インプラントを大腿骨顆から取り出し、実施例５において前述したようにせん断テストを実施した。

図１２に示すせん断テストの結果では、初回と摩耗後のテストインプラントに違いは見られず、繰り返しの最悪のシナリオ荷重条件の後でも、インプラントは構造的完全性を維持することが示唆された。

また、これらの結果によって、テスト完了時の破壊応力がテスト前の応力の７５％ではなかったため、インプラント破損の兆候も示されなかった。

参考文献
1. “Treatment selection in articular cartilage lesions of the knee: a systematic review.” Am. J. Sports Med. 37 Suppl 1: 148S-155S.
2. Choi et al., (1990) “The elastic moduli of human subchondral, trabecular, and cortical bone tissue and the size-dependency of cortical bone modulus.” Journal of Biomechamics 23(11):1103-13.
3. Cole and Lee, (2003) “Complex knee reconstruction: articular cartilage treatment options.” Arthroscopy 19 Suppl 1: 1-10.
4. Deneweth et al., (2013) “Heterogeneity of tibial plateau cartilage in response to a physiological compressive strain rate.” J. Orthop.Res. 31(3):370-5.
5. Gilbert et al., (2013) “Dynamic contact mechanics on the tibial plateau of the human knee during activities of daily living.” Journal of Biomechanics 47(9):2006-12.
6. Guo et al.., (2015) “A statistically-augmented computational platform for evaluating meniscal function.” Journal of Biomechanics 48(8):1444-53.
7. Magnussen et al., (2008) “Treatment of focal articular cartilage defects in the knee: a systematic review.” Clin.Orthop.Relat.Res. 466(4): 952-962.
8. Maher et al., (2007) “Nondegradable hydrogels for the treatment of focal cartilage defects.” Journal of Biomedical Materials Research Part A 83(1):145-55.
9. Mauck et al. (2002).”Influence of seeding density and dynamic deformational loading on the developing structure/function relationships of chondrocyte-seeded agarose hydrogels.” Ann.Biomed.Eng. 30(8):1046-1056.
10. Radin et al., (1970) “A comparison of the dynamic force transmitting properties of subchondral bone and articular cartilage.” J. Bone Joint Surg.Am. 52(3):444-56.
11. Shelbourne et al., (2003).”Outcome of untreated traumatic articular cartilage defects of the knee: a natural history study.” J. Bone Joint Surg.Am. 85-A Suppl 2:8-16.
12. Woodfield, (2000) “Interfacial Shear Strength Criteria for Tissue-Engineered Cartilage Anchored To Porous Synthetic Scaffolds” Masters Thesis, University of Toronto.

Claims (12)

1. 生体組織の欠損または損傷の治療、修復または置換のために哺乳動物に移植するのに適したインプラントを作製、製造および／または生産する方法であって、
   ａ．多孔質剛性ベースを金型のウェルに配置するステップと、
   ｂ．前記多孔質剛性ベースの上部の前記ウェルに多孔性ヒドロゲルを入れるステップと、
   ｃ．前記金型に第１の蓋を配置するステップと、
   ｄ．前記金型の前記ウェルに第１のポリマーを導入または注入するステップと、
   ｅ．前記金型を約－２０℃に約４～２４時間凍結し、続いて前記金型を約２３℃で約４～１２時間解凍するステップと、
   ｆ．前記第１の蓋を取り外すステップと、
   ｇ．前記金型に第２の蓋を配置するステップと、
   ｈ．第２のポリマーを金型の前記ウェルに導入または注入するステップと、
   ｉ．前記金型を約－２０℃に約４～２４時間凍結し、続いて前記金型を約２３℃で約４～１２時間解凍するステップと、を含む方法。
2. 前記第１のポリマーが、ポリ（ビニル）アルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリウレタン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１のポリマーが約２０％から約４０％の濃度のポリ（ビニル）アルコールである、請求項２に記載の方法。
4. 前記第２のポリマーが、ポリ（ビニル）アルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリウレタン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
5. 前記第２のポリマーが約１０％から約３０％の濃度のポリ（ビニル）アルコールである、請求項４に記載の方法。
6. 前記第１および第２のポリマーがジメチルスルホキシド中にある、請求項１に記載の方法。
7. 前記第１および第２のポリマーが、シリンジポンプを使用して前記金型に注入される、請求項１に記載の方法。
8. ステップｉが６回から１２回実行される、請求項１に記載の方法。
9. 前記インプラント中の分解性ポリマーを除去するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. 移植前に前記インプラントを脱水するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
11. 請求項１に記載の方法であって、
    ｊ．約０ｍｍから約２ｍｍの範囲の曲率を有する第３の蓋を前記金型に配置するステップと、
    ｋ．前記多孔質剛性ベースを、前記多孔質剛性ベースを前記インプラントの所望の最終曲率によって定義される距離だけ変位させるツールを使用して変位させるステップと、
    ｌ．前記金型を約－２０℃に約４～２４時間凍結し、続いて前記金型を約２３℃で約４～１２時間解凍するステップと、をさらに含む方法。
12. 前記多孔質剛性ベースが幾何学的特徴を有する、請求項１に記載の方法。

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