JP7166022B2 - 治療用変異体アルファ2-マクログロブリン組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年11月20日に出願された米国仮出願第62/082,304号の優先権を主張し、当該出願はその全体が参考として本明細書に援用される。
アルファ2-マクログロブリン(A2M)とは、血漿中に比較的高濃度(0.1~6mg/ml)で存在する、高度に保存的なプロテアーゼ阻害剤である。A2Mは、全ての主要なクラスのプロテアーゼを阻害するその能力において固有である(Bhattacharjeeら(2000年)、J. Biol. Chem.、275巻、26806~26811頁)。A2Mは、肝細胞、肺線維芽細胞、マクロファージ、星状細胞、および腫瘍細胞など、いくつかの細胞型により産生されうる(Borth W、「Alpha 2-macroglobulin, A multifunctional binding and targeting protein with possible roles in immunity and autoimmunity」、Ann. N.Y. Acad. Sci.、737巻:267~272頁(1994年))。A2Mは、中空円筒様構造を形成する、180kDaの、4つの同一なサブユニットによる四量体として存在することが多い。A2Mは、その中央の「ベイト」ドメイン内に、攻撃するプロテアーゼに対する、複数の標的ペプチド結合を提示しうる。A2Mは、ヘビ毒など、外来のプロテアーゼに作用する、主要なプロテアーゼ阻害剤でありうる。しかし、循環中には、他の多くのプロテアーゼ阻害剤が存在し、A2Mは、サイトカインおよび増殖因子への結合ならびにこれらの活性の調節、マクロファージの殺腫瘍能の促進、および抗原提示の増強を含む、他の機能を有しうることも提起されている。A2Mはまた、サイトカインまたは増殖因子に対するターゲティング担体でもありうる。
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることが、具体的かつ個別に指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。万一、本明細書の用語と、参照により組み込まれる用語との間の利益相反の場合は、本明細書の用語が優先される。
本発明の実施形態の一部の例として、以下の項目が挙げられる。
(項目1)
複数のプロテアーゼ認識配列を含む非天然ベイト領域を含む変異体A2Mポリペプチドを含む組成物であって、前記非天然ベイト領域が、配列番号6~30からなる群から選択される配列に対して少なくとも60%の同一性を有する配列を含む組成物。
(項目2)
前記非天然ベイト領域が、配列番号84~143からなる群から選択される配列を含まない配列を有する、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記非天然ベイト領域が、配列番号6~30からなる群から選択される配列に対して少なくとも65%の同一性を有する配列を含む、項目1または2に記載の組成物。
(項目4)
前記非天然ベイト領域が、配列番号6~30からなる群から選択される配列に対して少なくとも70%の同一性を有する配列を含む、項目1から4のいずれか一項に記載の組成物。
(項目5)
前記非天然ベイト領域が、配列番号6~30からなる群から選択される配列に対して少なくとも75%の同一性を有する配列を含む、項目1から4のいずれか一項に記載の組成物。
(項目6)
前記非天然ベイト領域が、配列番号6~30からなる群から選択される配列に対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含む、項目1から5のいずれか一項に記載の組成物。
(項目7)
前記非天然ベイト領域が、配列番号6~30からなる群から選択される配列に対して少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、項目1から6のいずれか一項に記載の組成物。
(項目8)
前記非天然ベイト領域が、配列番号6~30からなる群から選択される配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、項目1から7のいずれか一項に記載の組成物。
(項目9)
前記非天然ベイト領域が、配列番号6~30からなる群から選択される配列に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、項目1から8のいずれか一項に記載の組成物。
(項目10)
前記非天然ベイト領域が、配列番号6~30からなる群から選択される配列を含む、項目1から9のいずれか一項に記載の組成物。
(項目11)
前記非天然ベイト領域が、配列番号31~81からなる群から選択されるプロテアーゼ認識配列を含む、項目1から10のいずれか一項に記載の組成物。
(項目12)
前記非天然ベイト領域が、配列番号82および83からなる群から選択されるプロテアーゼ認識配列を含む、項目1から10のいずれか一項に記載の組成物。
(項目13)
前記変異体A2Mポリペプチドが、組換えである、項目1から12のいずれか一項に記載の組成物。
(項目14)
前記変異体A2Mポリペプチドが、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、もしくは哺乳動物細胞、または無細胞系からなる群から選択される宿主内で産生される、項目1から13のいずれか一項に記載の組成物。
(項目15)
前記変異体A2Mポリペプチドが、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択されるプロテアーゼの、野生型A2Mタンパク質による前記プロテアーゼの阻害と比較して増強された阻害を特徴とする、項目1から14のいずれか一項に記載の組成物。
(項目16)
前記阻害の増強が、前記プロテアーゼに対して非特異的である、項目16に記載の組成物。
(項目17)
前記阻害の増強が、前記プロテアーゼに対して特異的である、項目16に記載の組成物。
(項目18)
前記変異体A2Mポリペプチドが、非正常グリコシル化部位をさらに含む、項目1から17のいずれか一項に記載の組成物。
(項目19)
前記変異体A2Mポリペプチドが、PEGを含む非正常グリコシル化部位をさらに含む、項目1から18のいずれか一項に記載の組成物。
(項目20)
前記変異体A2Mポリペプチドが、対象内に位置すると、野生型A2Mタンパク質の半減期より長い半減期を有する、項目1から19のいずれか一項に記載の組成物。
(項目21)
前記変異体A2Mポリペプチドが、対象内に位置すると、野生型A2Mポリペプチドの半減期より、少なくとも5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1090%、120%、140%、150%、160%、180%、200%、220%、240%、260%、280%、300%、350%、400%、450%、または500%長い半減期を有する、項目1から20のいずれか一項に記載の組成物。
(項目22)
前記変異体A2Mポリペプチドが、野生型A2Mタンパク質のプロテアーゼ阻害有効性と比較して少なくとも5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1090%、120%、140%、150%、160%、180%、200%、220%、240%、260%、280%、300%、350%、400%、450%、または500%増大したプロテアーゼ阻害有効性を特徴とする、項目1から21のいずれか一項に記載の組成物。
(項目23)
前記変異体A2Mポリペプチドが、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択されるプロテアーゼについてのコンセンサス配列を含む、項目1から22のいずれか一項に記載の組成物。
(項目24)
前記変異体A2Mポリペプチドが、MMP1(間質コラゲナーゼ)、MMP2(ゼラチナーゼA)、MMP3(ストロメリシン1)、MMP7(マトリリシン、PUMP1)、MMP8(好中球コラゲナーゼ)、MMP9(ゼラチナーゼB)、MMP10(ストロメリシン2)、MMP11(ストロメリシン3)、MMP12(マクロファージメタロエラスターゼ)、MMP13(コラゲナーゼ3)、MMP14(MT1-MMP)、MMP15(MT2-MMP)、MMP16(MT3-MMP)、MMP17(MT4-MMP)、MMP18(コラゲナーゼ4、xcol4、Xenopus属コラゲナーゼ)、MMP19(RASI-1、ストロメリシン4)、MMP20(エナメリシン)、MMP21(X-MMP)、MMP23A(CA-MMP)、MMP23B、MMP24(MT5-MMP)、MMP25(MT6-MMP)、MMP26(マトリリシン2、エンドメターゼ)、MMP27(MMP-22、C-MMP)、MMP28(エピリシン);ADAMTS1、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5(ADAMTS11)、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8(METH-2)、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20などのADAMTS(A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs)プロテアーゼ;キモトリプシン;トリプシン;エラスターゼ;補体因子;凝固因子;トロンビン;プラスミン;スブチリシン;ネプリリシン;プロコラーゲンペプチダーゼ;テルモリシン;妊娠関連血漿タンパク質A;骨形成タンパク質1;リソスタフィン;インスリン分解酵素;ZMPSTE2;ZMPSTE4;ZMPSTE24;アセチルコリンエステラーゼ;およびこれらの組合せからなる群から選択されるプロテアーゼについてのコンセンサス配列を含む、項目1から23のいずれか一項に記載の組成物。
(項目25)
前記変異体A2Mポリペプチドが、ADAMTS4、ADAMTS5、MMP13、およびこれらの組合せからなる群から選択されるプロテアーゼについてのコンセンサス配列を含む、項目24に記載の組成物。
(項目26)
前記変異体A2Mポリペプチドが、1または複数の生物に由来するプロテアーゼ認識コンセンサス配列を含む、項目1から25のいずれか一項に記載の組成物。
(項目27)
前記1または複数の生物が、哺乳動物、動物、植物、細菌、酵母、魚類、爬虫類、両生類、ウイルス、または真菌からなる群から選択される、項目26に記載の組成物。
(項目28)
前記変異体A2Mポリペプチドが、A2M以外のタンパク質に由来するプロテアーゼ認識配列を含む、項目1から27のいずれか一項に記載の組成物。
(項目29)
A2M以外のタンパク質に由来する前記プロテアーゼ認識配列のうちの2つまたはそれ超が、同じである、項目28に記載の組成物。
(項目30)
A2M以外のタンパク質に由来する前記プロテアーゼ認識配列のうちの2つまたはそれ超が、異なる種に由来する、項目28または29に記載の組成物。
(項目31)
前記変異体A2Mポリペプチドが、野生型A2Mに由来するプロテアーゼ認識配列を含む、項目1から30のいずれか一項に記載の組成物。
(項目32)
野生型A2Mに由来する前記プロテアーゼ認識配列のうちの2つまたはそれ超が、同じである、項目31に記載の組成物。
(項目33)
前記変異体A2Mポリペプチドが、非天然プロテアーゼ認識配列を含む、項目1から32のいずれか一項に記載の組成物。
(項目34)
前記非天然プロテアーゼ認識配列のうちの2つまたはそれ超が、同じである、項目33に記載の組成物。
(項目35)
前記変異体A2Mポリペプチドが、自殺型阻害因子を含むプロテアーゼ認識配列を含み、前記自殺型阻害因子が、プロテアーゼを、前記変異体A2Mポリペプチドに共有結合によって接合させるように作動可能である、項目1から34のいずれか一項に記載の組成物。
(項目36)
前記変異体A2Mポリペプチドが、単離されている、項目1から35のいずれか一項に記載の組成物。
(項目37)
前記変異体A2Mポリペプチドが、精製されている、項目1から36のいずれか一項に記載の組成物。
(項目38)
前記変異体A2Mポリペプチドが、野生型A2MによるFACの形成の阻害と比較して、少なくとも5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、140%、150%、160%、180%、200%、220%、240%、260%、280%、300%、350%、400%、450%、または500%増強されたFACの形成の阻害を特徴とする、項目1から37のいずれか一項に記載の組成物。
(項目39)
前記変異体A2Mポリペプチドが、配列番号4に対して少なくとも80%、90%、または100%の同一性を有する配列を含む、項目1から38のいずれか一項に記載の組成物。
(項目40)
前記野生型A2Mポリペプチドが、配列番号3に対して少なくとも80%、90%、または100%の同一性を有する配列を含む、項目1から39のいずれか一項に記載の組成物。
(項目41)
前記変異体A2Mポリペプチドが、野生型A2Mのベイト領域以外の配列を含む、項目1から40のいずれか一項に記載の組成物。
(項目42)
1または複数の状態を有する対象を処置する方法であって、前記対象に、有効量の、項目1から41のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
(項目43)
前記対象における1または複数のプロテアーゼの非特異的阻害を増大させる、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記対象におけるアグリカンG3断片の形成の阻害を増大させる、項目42または43に記載の方法。
(項目45)
前記対象におけるFACの形成の阻害を増大させる、項目42から44のいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
前記対象における、組織、軟骨、および椎間板の変性、滑膜炎症、またはこれらの組合せの速度を減少させる、項目42から45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
前記1または複数の状態の重症度、発生、進行速度、またはこれらの組合せを低減する、項目42から46のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
1または複数のさらなる担体または薬物を投与するステップをさらに含む、項目42から47のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
前記1または複数のさらなる担体または薬物が、ハイドロゲル、ヒアルロン酸調製物、ポリマーマイクロスフェア、コルチコステロイド、マイクロ粒子、キトサン、局所麻酔剤、増殖因子、サイトカイン、プロテアーゼ阻害剤、ステロイド、ヒアルロン酸(HA)、または他の生物学的に活性な自原性もしくは内因性のメディエーターを含む、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記1または複数の状態が、その発症機序がプロテアーゼの活性を含む、変性疾患、慢性創傷、創傷、外傷性疾患、炎症性疾患、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目42から49のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
前記1または複数の状態が、骨関節炎、炎症性関節炎、軟骨形成、軟骨傷害、筋腱付着部症、腱障害、靭帯傷害、骨の変性疾患、軟骨の変性疾患、腱の変性疾患、靭帯の変性疾患、術後状態、創傷の治癒、筋骨格疾患、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目42から49のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
前記1または複数の状態が、関節炎、炎症、靭帯傷害、腱傷害、骨傷害、軟骨変性、軟骨傷害、自己免疫疾患、背部痛、関節痛、関節変性、椎間板変性、脊椎変性、骨変性、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目42から49のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記1または複数の状態が、手術により引き起こされる関節炎症、手術により引き起こされる椎間板炎症、関節置換術により引き起こされる関節炎症、椎間板置換術により引き起こされる椎間板炎症、またはこれらの組合せからなる群から選択される、項目42から49のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
前記1または複数の状態が、がんである、項目42から49のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
前記対象が、ヒトである、項目42から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
前記対象が、哺乳動物である、項目42から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記対象が、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、カエル、ウマまたはヤギである、項目42から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
前記対象が、前記1または複数の状態を有すると既に診断されている、項目42から57のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
前記組成物を、前記1または複数の状態の病態に関係する解剖学的部位に投与する、項目42から58のいずれか一項に記載の方法。
(項目60)
前記投与が、中空管デバイスまたは可撓性カテーテルによる注射を含む、項目42から59のいずれか一項に記載の方法。
(項目61)
前記中空管デバイスが、注射針、シリンジ、またはこれらの組合せを含む、項目60に記載の方法。
(項目62)
前記投与を、手術手順中に行う、項目42から61のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
単離変異体A2Mポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記変異体A2Mポリヌクレオチドが、複数のプロテアーゼ認識配列を含む非天然ベイト領域をコードし、前記非天然ベイト領域が、配列番号6~30からなる群から選択される配列に対して少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列を有する組成物。
(項目64)
前記非天然ベイト領域が、アミノ酸配列番号6~30のうちのいずれか1つからなる群から選択される配列に対して少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.98%、99.99%、または100%の同一性を有する配列をコードする配列を有する、項目63に記載の組成物。
(項目65)
前記非天然ベイト領域が、配列番号31~83からなる群から選択されるプロテアーゼ認識アミノ酸配列をコードする、項目63または64に記載の組成物。
(項目66)
前記非天然ベイト領域が、野生型A2M内に存在しないプロテアーゼ認識アミノ酸配列をコードする、項目63から65のいずれか一項に記載の組成物。
(項目67)
前記変異体A2Mポリヌクレオチドが、配列番号2に対して少なくとも90%、95%、または100%の同一性を含む、項目63から66のいずれか一項に記載の組成物。
(項目68)
野生型A2Mポリヌクレオチドが、配列番号1に対して少なくとも90%、95%、または100%の同一性を含む、項目63から67のいずれか一項に記載の組成物。
(項目69)
前記変異体A2Mポリヌクレオチドが、発現ベクター内にある、項目63から68のいずれか一項に記載の組成物。
(項目70)
変異体A2Mポリペプチドによるプロテアーゼの阻害の増強を決定する方法であって、
(a)配列番号6~30からなる群から選択される配列に対して少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.98%、99.99%、または100%の同一性を有する配列を含む変異体A2Mポリペプチドを用意するステップと;
(b)前記変異体A2Mポリペプチドを、前記プロテアーゼおよび前記プロテアーゼにより切断される基質と接触させるステップと;
(c)野生型A2Mポリペプチドを、前記プロテアーゼおよび前記プロテアーゼにより切断される前記基質と接触させるステップと;
(d)(b)による前記基質の切断量を、(c)による前記基質の切断量と比較し、これにより、前記変異体A2Mポリペプチドによる前記プロテアーゼの阻害の前記増強を決定するステップと
を含む方法。
(項目71)
変異体A2Mポリヌクレオチドを製作する方法であって、
(a)配列番号2に対して少なくとも90%、95%、または100%の同一性を有する配列を含む変異体A2Mポリヌクレオチドを含有するベクターを用意するステップと;
(b)前記ベクターを制限酵素で消化して、直鎖状ベクターを形成するステップと;
(c)配列番号6~30からなる群から選択される配列に対して少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.98%、99.99%、または100%の同一性を有する非天然ベイト配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドの一方の端部を前記直鎖状ベクターの一方の端部にライゲーションするステップと;
(d)配列番号6~30からなる群から選択される配列に対して少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.98%、99.99%、または100%の同一性を有する非天然ベイト配列をコードする配列を含む前記ポリヌクレオチドの他方の端部を前記直鎖状ベクターの他方の端部にライゲーションし、これにより、前記変異体A2Mポリヌクレオチドを形成するステップと
を含む方法。
(項目72)
治療における使用のための、項目1から41または63から69のいずれか一項に記載の組成物。
(項目73)
非自家療法における使用のための、項目72に記載の組成物。
(項目74)
慢性創傷、がん、関節炎、炎症、靭帯傷害、腱傷害、骨傷害、軟骨変性、軟骨傷害、自己免疫疾患、背部痛、関節痛、関節変性、椎間板変性、脊椎変性、骨変性、またはこれらの任意の組合せの処置における使用のための組成物であり、炎症が、手術により引き起こされる関節炎症もしくは椎間板炎症、関節置換術もしくは椎間板置換術により引き起こされる関節炎症もしくは椎間板炎症、またはこれらの組合せを含む、項目72または73に記載の組成物。
(項目75)
治療における使用のための医薬を製造するための、項目1から41または63から69に記載の組成物の使用。
(項目76)
前記医薬が、非自家療法における使用のための医薬である、項目75に記載の使用。
(項目77)
前記医薬が、慢性創傷、がん、関節炎、炎症、靭帯傷害、腱傷害、骨傷害、軟骨変性、軟骨傷害、自己免疫疾患、背部痛、関節痛、関節変性、椎間板変性、脊椎変性、骨変性、手術により引き起こされる関節炎症もしくは椎間板炎症、関節置換術もしくは椎間板置換術により引き起こされる関節炎症もしくは椎間板炎症、またはこれらの任意の組合せの処置における使用のための医薬である、項目75または76に記載の使用。
(項目78)
医薬を製造する方法であって、創傷の治癒を促進するのに有効な量の、項目1から41または63から69に記載の変異体A2Mポリペプチド組成物と、薬学的に許容される担体とを一体にするステップを含む方法。
(項目79)
治療有効量の、項目1から41または63から69に記載の変異体A2Mポリペプチド組成物と、対象の創傷の処置における使用のための指示書とを含むパッケージ材料を含む製品。
「非免疫原性」または「非抗原性」という用語は、対象に投与される組成物が、免疫応答を誘発しないことを意味する。
A2Mとは、ADAMTS 4およびADAMTS5など、メタロプロテアーゼおよび他のプロテアーゼの一般的な阻害剤である。変性および炎症の結果として、またはこれらに先行して産生される、これらのプロテアーゼおよび他のプロテアーゼは、軟骨および椎間板変性、ならびに滑膜関節、脊椎、腱および靭帯、ならびに他の関節、筋腱付着部、および一般的組織における疼痛の一因でありうる。本明細書で記載される組換え組成物のうちのいずれかを、本明細書で記載される方法のうちのいずれかに従い、状態、疾患、疼痛、または炎症を有する対象の処置のために使用することができる。
3.1~50、3.2~50、3.3~50、3.4~50、3.5~50、3.6~50、3.7~50、3.8~50、3.9~50、4~50、5~50、6~50、7~50、8~50、9~50、10~50、11~50、12~50、13~50、14~50、15~50、16~50、17~50、18~50、19~50、20~50、25~50、30~50、35~50、40~50、1.5~40、1.6~40、1.7~40、1.8~40、1.9~40、2~40、2.1~40、2.2~40、2.3~40、2.4~40、2.5~40、2.6~40、2.7~40、2.8~40、2.9~40、3.0~40、3.1~40、3.2~40、3.3~40、3.4~40、3.5~40、3.6~40、3.7~40、3.8~40、3.9~40、4~40、5~40、6~40、7~40、8~40、9~40、10~40、11~40、12~40、13~40、14~40、15~40、16~40、17~40、18~40、19~40、20~40、25~40、30~40、1.5~30、1.6~30、1.7~30、1.8~30、1.9~30、2~30、2.1~30、2.2~30、2.3~30、2.4~30、2.5~30、2.6~30、2.7~30、2.8~30、2.9~30、3.0~30、3.1~30、3.2~30、3.3~30、3.4~30、3.5~30、3.6~30、3.7~30、3.8~30、3.9~30、4~30、5~30、6~30、7~30、8~30、9~30、10~30、11~30、12~30、13~30、14~30、15~30、16~30、17~30、18~30、19~30、20~30、1.5~20、1.6~20、1.7~20、1.8~20、1.9~20、2~20、2.1~20、2.2~20、2.3~20、2.4~20、2.5~20、2.6~20、2.7~20、2.8~20、2.9~20、3.0~20、3.1~20、3.2~20、3.3~20、3.4~20、3.5~20、3.6~20、3.7~20、3.8~20、3.9~20、4~20、5~20、6~20、7~20、8~20、9~20、10~20、11~20、12~20、13~20、14~20、15~20、1.5~15、1.6~15、1.7~15、1.8~15、1.9~15、2~15、2.1~15、2.2~15、2.3~15、2.4~15、2.5~15、2.6~15、2.7~15、2.8~15、2.9~15、3.0~15、3.1~15、3.2~15、3.3~15、3.4~15、3.5~15、3.6~15、3.7~15、3.8~15、3.9~15、4~15、5~15、6~15、7~15、8~15、9~15、10~15、11~15、12~15、13~15、14~15、1.5~10、1.6~10、1.7~10、1.8~10、1.9~10、2~10、2.1~10、2.2~10、2.3~10、2.4~10、2.5~10、2.6~10、2.7~10、2.8~10、2.9~10、3.0~10、3.1~10、3.2~10、3.3~10、3.4~10、3.5~10、3.6~10、3.7~10、3.8~10、3.9~10、4~10、5~10、6~10、7~10、8~10、9~10、1.5~9、1.6~9、1.7~9、1.8~9、1.9~9、2~9、2.1~9、2.2~9、2.3~9、2.4~9、2.5~9、2.6~9、2.7~9、2.8~9、2.9~9、3.0~9、3.1~9、3.2~9、3.3~9、3.4~9、3.5~9、3.6~9、3.7~9、3.8~9、3.9~9、4~9、5~9、6~9、7~9、8~9、1.5~8、1.6~8、1.7~8、1.8~8、1.9~8、2~8、2.1~8、2.2~8、2.3~8、2.4~8、2.5~8、2.6~8、2.7~8、2.8~8、2.9~8、3.0~8、3.1~8、3.2~8、3.3~8、3.4~8、3.5~8、3.6~8、3.7~8、3.8~8、3.9~8、4~8、5~8、6~8、7~8、1.5~7、1.6~7、1.7~7、1.8~7、1.9~7、2~7、2.1~7、2.2~7、2.3~7、2.4~7、2.5~7、2.6~7、2.7~7、2.8~7、2.9~7、3.0~7、3.1~7、3.2~7、3.3~7、3.4~7、3.5~7、3.6~7、3.7~7、3.8~7、3.9~7、4~7、5~7、6~7、1.5~6、1.6~6、1.7~6、1.8~6、1.9~6、2~6、2.1~6、2.2~6、2.3~6、2.4~6、2.5~6、2.6~6、2.7~6、2.8~6、2.9~6、3.0~6、3.1~6、3.2~6、3.3~6、3.4~6、3.5~6、3.6~6、3.7~6、3.8~6、3.9~6、4~6、5~6、1.5~5、1.6~5、1.7~5、1.8~5、1.9~5、2~5、2.1~5、2.2~5、2.3~5、2.4~5、2.5~5、2.6~5、2.7~5、2.8~5、2.9~5、3.0~5、3.1~5、3.2~5、3.3~5、3.4~5、3.5~5、3.6~5、3.7~5、3.8~5、3.9~5、4~5、1.5~4、1.6~4、1.7~4、1.8~4、1.9~4、2~4、2.1~4、2.2~4、2.3~4、2.4~4、2.5~4、2.6~4、2.7~4、2.8~4、2.9~4、3.0~4、3.1~4、3.2~4、3.3~4、3.4~4、3.5~4、3.6~4、3.7~4、3.8~4、3.9~4、1.5~3、1.6~3、1.7~3、1.8~3、1.9~3、2~3、2.1~3、2.2~3、2.3~3、2.4~3、2.5~3、2.6~3、2.7~3、2.8~3、2.9~3、1.5~2、1.6~2、1.7~2、1.8~2、または1.9~2倍である能力を有しうる。
25~70、30~70、35~70、40~70、45~70、50~70、60~70、1.5~60、1.6~60、1.7~60、1.8~60、1.9~60、2~60、2.1~60、2.2~60、2.3~60、2.4~60、2.5~60、2.6~60、2.7~60、2.8~60、2.9~60、3.0~60、3.1~60、3.2~60、3.3~60、3.4~60、3.5~60、3.6~60、3.7~60、3.8~60、3.9~60、4~60、5~60、6~60、7~60、8~60、9~60、10~60、11~60、12~60、13~60、14~60、15~60、16~60、17~60、18~60、19~60、20~60、25~60、30~60、35~60、40~60、45~60、50~60、1.5~50、1.6~50、1.7~50、1.8~50、1.9~50、2~50、2.1~50、2.2~50、2.3~50、2.4~50、2.5~50、2.6~50、2.7~50、2.8~50、2.9~50、3.0~50、3.1~50、3.2~50、3.3~50、3.4~50、3.5~50、3.6~50、3.7~50、3.8~50、3.9~50、4~50、5~50、6~50、7~50、8~50、9~50、10~50、11~50、12~50、13~50、14~50、15~50、16~50、17~50、18~50、19~50、20~50、25~50、30~50、35~50、40~50、1.5~40、1.6~40、1.7~40、1.8~40、1.9~40、2~40、2.1~40、2.2~40、2.3~40、2.4~40、2.5~40、2.6~40、2.7~40、2.8~40、2.9~40、3.0~40、3.1~40、3.2~40、3.3~40、3.4~40、3.5~40、3.6~40、3.7~40、3.8~40、3.9~40、4~40、5~40、6~40、7~40、8~40、9~40、10~40、11~40、12~40、13~40、14~40、15~40、16~40、17~40、18~40、19~40、20~40、25~40、30~40、1.5~30、1.6~30、1.7~30、1.8~30、1.9~30、2~30、2.1~30、2.2~30、2.3~30、2.4~30、2.5~30、2.6~30、2.7~30、2.8~30、2.9~30、3.0~30、3.1~30、3.2~30、3.3~30、3.4~30、3.5~30、3.6~30、3.7~30、3.8~30、3.9~30、4~30、5~30、6~30、7~30、8~30、9~30、10~30、11~30、12~30、13~30、14~30、15~30、16~30、17~30、18~30、19~30、20~30、1.5~20、1.6~20、1.7~20、1.8~20、1.9~20、2~20、2.1~20、2.2~20、2.3~20、2.4~20、2.5~20、2.6~20、2.7~20、2.8~20、2.9~20、3.0~20、3.1~20、3.2~20、3.3~20、3.4~20、3.5~20、3.6~20、3.7~20、3.8~20、3.9~20、4~20、5~20、6~20、7~20、8~20、9~20、10~20、11~20、12~20、13~20、14~20、15~20、1.5~15、1.6~15、1.7~15、1.8~15、1.9~15、2~15、2.1~15、2.2~15、2.3~15、2.4~15、2.5~15、2.6~15、2.7~15、2.8~15、2.9~15、3.0~15、3.1~15、3.2~15、3.3~15、3.4~15、3.5~15、3.6~15、3.7~15、3.8~15、3.9~15、4~15、5~15、6~15、7~15、8~15、9~15、10~15、11~15、12~15、13~15、14~15、1.5~10、1.6~10、1.7~10、1.8~10、1.9~10、2~10、2.1~10、2.2~10、2.3~10、2.4~10、2.5~10、2.6~10、2.7~10、2.8~10、2.9~10、3.0~10、3.1~10、3.2~10、3.3~10、3.4~10、3.5~10、3.6~10、3.7~10、3.8~10、3.9~10、4~10、5~10、6~10、7~10、8~10、9~10、1.5~9、1.6~9、1.7~9、1.8~9、1.9~9、2~9、2.1~9、2.2~9、2.3~9、2.4~9、2.5~9、2.6~9、2.7~9、2.8~9、2.9~9、3.0~9、3.1~9、3.2~9、3.3~9、3.4~9、3.5~9、3.6~9、3.7~9、3.8~9、3.9~9、4~9、5~9、6~9、7~9、8~9、1.5~8、1.6~8、1.7~8、1.8~8、1.9~8、2~8、2.1~8、2.2~8、2.3~8、2.4~8、2.5~8、2.6~8、2.7~8、2.8~8、2.9~8、3.0~8、3.1~8、3.2~8、3.3~8、3.4~8、3.5~8、3.6~8、3.7~8、3.8~8、3.9~8、4~8、5~8、6~8、7~8、1.5~7、1.6~7、1.7~7、1.8~7、1.9~7、2~7、2.1~7、2.2~7、2.3~7、2.4~7、2.5~7、2.6~7、2.7~7、2.8~7、2.9~7、3.0~7、3.1~7、3.2~7、3.3~7、3.4~7、3.5~7、3.6~7、3.7~7、3.8~7、3.9~7、4~7、5~7、6~7、1.5~6、1.6~6、1.7~6、1.8~6、1.9~6、2~6、2.1~6、2.2~6、2.3~6、2.4~6、2.5~6、2.6~6、2.7~6、2.8~6、2.9~6、3.0~6、3.1~6、3.2~6、3.3~6、3.4~6、3.5~6、3.6~6、3.7~6、3.8~6、3.9~6、4~6、5~6、1.5~5、1.6~5、1.7~5、1.8~5、1.9~5、2~5、2.1~5、2.2~5、2.3~5、2.4~5、2.5~5、2.6~5、2.7~5、2.8~5、2.9~5、3.0~5、3.1~5、3.2~5、3.3~5、3.4~5、3.5~5、3.6~5、3.7~5、3.8~5、3.9~5、4~5、1.5~4、1.6~4、1.7~4、1.8~4、1.9~4、2~4、2.1~4、2.2~4、2.3~4、2.4~4、2.5~4、2.6~4、2.7~4、2.8~4、2.9~4、3.0~4、3.1~4、3.2~4、3.3~4、3.4~4、3.5~4、3.6~4、3.7~4、3.8~4、3.9~4、1.5~3、1.6~3、1.7~3、1.8~3、1.9~3、2~3、2.1~3、2.2~3、2.3~3、2.4~3、2.5~3、2.6~3、2.7~3、2.8~3、2.9~3、1.5~2、1.6~2、1.7~2、1.8~2、または1.9~2倍である能力を有しうる。
配列番号1または2に言及して、本明細書で使用される場合の「A2Mポリヌクレオチド」とは、配列番号1もしくは2のポリヌクレオチド配列、またはこれらの断片のほか、1もしくは複数の挿入、欠失、突然変異、またはこれらの組合せを含む、任意の核酸変異体を意味する。挿入、欠失、および突然変異は、A2Mタンパク質のベイト領域をコードするポリヌクレオチド配列内にあることが好ましい。同様に、配列番号1または2に言及して使用される場合の「A2M cDNA」、「A2Mコード配列」、または「A2Mコード核酸」も、配列番号1もしくは2の核酸配列、またはこれらの断片のほか、1もしくは複数の挿入、欠失、突然変異、またはこれらの組合せを含む核酸変異体を意味する。A2Mポリヌクレオチドまたはこれらの断片は、変異体A2Mポリペプチドをコードする、変異体A2M組換えポリヌクレオチド構築物であって、変異体A2Mポリペプチドを発現させる変異体A2M組換えポリヌクレオチド構築物を創出するように、分子生物学における従来の技法を使用して操作することができる。変異体A2Mポリヌクレオチドは、配列番号1および2に対して少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。A2Mコード配列は、配列番号1および2のうちのいずれか1つに対して少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、または85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
当技術分野で公知の様々な方法を活用して、本発明の単離A2M変異体タンパク質のうちのいずれか1つを得ることができる。最も簡素なレベルでは、アミノ酸配列は、市販のペプチド合成装置を使用して、合成することができる。このようなポリペプチドは、アミノ末端上にメチオニンを伴って合成することもでき、メチオニンを伴わずに合成することもできる。化学合成されたポリペプチドは、これらの参考文献において明示されている方法を使用して、ジスルフィド架橋を形成するように、酸化することができる。合成により構築されたA2M変異体配列は、一次構造特徴、二次構造特徴、もしくは三次構造特徴、および/またはコンフォメーション特徴を、A2M変異体と共有しているために、A2M変異体と共通の生物学的特性であって、プロテアーゼ阻害活性を含む生物学的特性を有しうる。この技法は、小型のペプチドおよび大型のポリペプチドの断片の作製において、特に有用である。断片は、例えば、A2M変異体に対する抗体を作出するのに有用である。こうして、断片を、治療用化合物のスクリーニング、および抗体を開発するための免疫学的工程において、天然の精製A2M変異体の、生物学的に活性の代替物、または免疫学的代替物として援用することができる。
当技術分野で公知の任意の方法を使用して、慢性創傷を処置することもでき、慢性創傷を引き起こしうる病態を処置することもできる。方法は、神経障害性潰瘍、褥瘡性潰瘍、静脈性潰瘍、もしくは糖尿病性潰瘍、または感染性創傷など、哺乳動物における慢性創傷の処置を含みうる。方法は、A2M組成物の、創傷への適用を含みうる。A2M組成物およびA2M製剤を、プロテアーゼを阻害するために使用することができる。A2M組成物を使用して、FACの形成を防止するか、遅延させるか、または変更することができる。変異体A2Mは、プロテアーゼの阻害において、野生型A2Mポリペプチドより効果的であることが可能であり、半減期が長いか、クリアランス係数が緩徐であるか、またはこれらの任意の組合せを示す。
対象は、脊椎内または関節内の疼痛を提示する、任意の対象を含みうる。一部の実施形態では、対象を、A2Mの検出について選択することができる。好ましくは、対象は、ヒトでありうる。対象は、椎間板性疼痛、椎間関節性疼痛、または神経根障害性疼痛を含むがこれらに限定されない、脊椎と関連する疼痛など、任意の疼痛を受けている可能性がある。
本明細書で記載される組成物のうちのいずれかは、生物学的試料に由来しうる。生物学的試料はまた、組織学を目的として採取された生検試料、凍結切片などの組織切片試料、および洗浄液試料も含みうる。生物学的試料は、ウイルス、細菌、マイコプラズマ、寄生虫、真菌、または植物に由来しうる。生物学的試料は、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物、齧歯動物、ヤギ科動物、ウシ科動物、ヒツジ科動物、ウマ科動物、イヌ科動物、ネコ科動物、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、またはヤギなどの動物に由来しうる。
上記の明細書で言及された、全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。当業者には、本発明の範囲および精神から逸脱しない限りにおいて、記載された本発明の方法およびシステムの、多様な改変および変形が明らかであろう。具体的実施形態との関係で、本発明について記載してきたが、特許請求される本発明は、このような具体的実施形態に、不当に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、本発明を実行するための、記載された方式の、多様な改変であって、当業者に明らかな改変は、本発明の範囲内にあることを意図する。他の実施形態も、特許請求の範囲内にある。
配列:
組換えA2Mを発現させる、HEK293クローンの作出および選択
組換えA2M野生型配列を、HEK293F細胞内で発現させた。Hek293F細胞を接着播種し、一晩にわたり付着させた。細胞に、XTreme Gene HP(Roche)およびDNAを、6uLの試薬:2ugのDNA比でトランスフェクトする。細胞を、5%のCO2および摂氏37度で、48時間にわたり増殖させる。トランスフェクションの48時間後、A2Mタンパク質を定量するELISAアッセイを介して、トランスフェクションの成功を確認するのに、培地試料を採取する。対数増殖期を経るように、細胞を分配し、選択用抗生剤(ブラストサイジン)を、10μg/mL(実験により決定された選択濃度)で添加する。全ての陰性対照細胞が死滅する(通常、約4~5日間)まで、細胞を、抗生剤中で選択する。この時点で、別の培地試料を採取して、この新たに確立されたプールが、やはりタンパク質を産生することを確認する。タンパク質の産生を確認したら、細胞を、7.5μg/mLのブラストサイジン(実験により決定された維持濃度)を伴う10cmのディッシュ1枚当たりの細胞約100個の密度で播種する。この播種密度は、各細胞が、個別のコロニーに増殖することを可能とするのに十分な間隔をあけて、細胞が配置されるように、十分に疎である。これらのコロニーを、クローニングシリンダー(Sigma)を使用して収集し、24ウェルプレート内に播種して、さらなる細胞増殖を可能とする。細胞が24ウェルプレート内でコンフルエントになったら、ELISAを、培地試料上で再度実施して、産生が最高度のクローンについてスクリーニングする。高発現クローンを選択し、A2Mの作製のために使用する。選び出されたクローンを拡大し、懸濁液に適応させた(図3)。細胞をシェーカーフラスコ内に置く間に、培地を、無血清培地にゆっくり交換することにより、懸濁液への適応を完了した。培養物を懸濁させたら、細胞を培地から単純にスピンすることにより、タンパク質を収集することができる。A2Mを含有する上清を、A2Mについての精製にかけた。培地の単位容量当たりの高細胞数は、培地1ミリリットル当たりの高タンパク質濃度を結果としてもたらす。2回にわたるクロマトグラフィー法の後で、高純度試料を得た。約12mg/L(接着性プール)の収量が、典型的であった(図15)。
ADAMTS-5およびADAMTS-4により誘導される軟骨の損傷の、A2Mによる阻害
ウシ軟骨外植片(BCE)を、500ng/mlのADAMTS-5またはADAMTS-4で、2日間にわたり、精製A2Mの3倍の系列希釈液と共に処理した(図7Aおよび7B)。被験A2Mの濃度は、100、33.3、11.1、3.7、1.2、0.4μg/mLであった。変異体A2Mは、軟骨の異化を、濃度依存的に阻害した。500ng/mlのADAMTS-5の阻害についてのIC50は、約7μg/mlのA2Mであると計算された(モル比を1:1とする)。最大阻害は、100μg/mlのA2Mにより、約90%と観察された(モル比を14:1とする)。A2Mは、アグリカンG3断片の形成(図7Aおよび7B)およびFACの形成(図9)を遮断することが示された。
APICの保持液と濾液との比較
新鮮な軟骨を、約7mg/mlのA2Mを含有するAPICで処置した。軟骨の異化は、APIC作製工程の1%v/vの保持液(>500kDaのサイズのタンパク質の濃度)により、効果的に遮断されたが、濾液(<500kDaのタンパク質を含有する)では、5%v/vであってもなお、遮断されなかった(図10)。APICの軟骨保護効果は、用量依存的であった。濾液が、軟骨を、ADAMTS-5による異化から保護できなかったことは、APICが、自家血液の保護因子のうちの>99%を濃縮することを裏付ける。
骨関節炎モデルにおける、A2Mによる、軟骨の異化の阻害
新鮮な軟骨を、TNF-αまたはIL-1βで処理して、骨関節炎の病態と同様に、軟骨細胞が、プロテアーゼを分泌するように誘導した。軟骨の異化は、培養培地中の、硫酸化グリコサミノグリカン(sGAG)の増大として検出する。炎症促進性サイトカインによる処理は、軟骨の異化を誘導するが、変異体A2Mポリペプチドによる処置が、これを用量依存的に遮断する。
変異体A2Mで処置された単球の、サイトカインプロファイル
THP-1単球細胞を、変異体A2Mを伴うかまたは伴わずに、2日間にわたり処置し、細胞の活性化を、サイトカインおよび増殖因子の、培地への分泌によりモニタリングした。THP-1は、被験サイトカインプロファイルの変化を示さなかった(図11)。同様の結果は、E6-1T細胞およびSW982線維芽細胞においても見られた。
タグ付けされた野生型A2M発現構築物の、設計および合成
野生型A2M前駆体タンパク質をコードするDNA配列(配列番号1)を、ヒトA2M前駆体タンパク質のRefSeqアミノ酸配列(RefSeq番号:NP_000005.2)(配列番号3)に基づき、GenScriptにより合成した。構築物内で使用されるコドンを、GenScriptにより、哺乳動物のコドン使用のバイアス、GC含量、CpGジヌクレオチド含量、mRNAの二次構造、クリプティックスプライシング部位、未成熟ポリアデニル化部位、内部のカイ部位およびリボソーム結合性部位、CpGアイランド陰性、RNA不安定性モチーフ、リピート配列、および制限エンドヌクレアーゼ部位について最適化した。融合タグ(DYKDDDDKGASHHHHHH)をコードする配列を、タンパク質配列の天然の末端に付加するのに続き、終止コドンを付加した。発現構築物の5’末端に、Kpn1制限部位を施し、3’末端に、BamH1制限部位を施した。この構築物を、pUC57ベクターにクローニングした。発現構築物をコードするインサートを、pUC57ベクターから、Kpn1およびBamH1による二重消化に続く、アガロースゲル電気泳動、および断片のゲル抽出を介して抽出した。このインサートを、pJ608哺乳動物発現ベクター(DNA 2.0)の、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの後にライゲーションし(図23)、E.coliのGC10株(Genessee Scientific)に形質転換した。このステップを実施して、ベクターを維持し、繁殖させる。発現構築物の配列は、DNAシークェンシング(Genewiz)により検証した。
可変ベイト領域のための、アクセプター構築物の設計
ベイト領域をコードする配列を挟む、Xho1制限部位およびHindIII制限部位を、まず導入することにより、ベイト領域の配列のスイッチングを可能とするように、野生型発現構築物を突然変異させた。これは、野生型発現構築物を、鋳型として使用する、2回にわたる、逐次的な部位指向突然変異誘発反応を介して行った。突然変異体「アクセプター」構築物の配列は、ベイト領域の、Genewizによる、DNAシークェンシングにより検証した(配列番号2)。対応するアミノ酸配列は、配列番号4である。DNA配列内の突然変異は必然的に、タンパク質内の3つのアミノ酸置換である、ベイト領域のN末端側のQ693E、ならびにベイト領域のC末端のT730KおよびV731Lを結果としてもたらす。天然のDNA配列は、ベイト配列を取り出すのに使用されうる、制限エンドヌクレアーゼ部位を有さないため、これらの突然変異は、回避できなかった。これらの突然変異は、新たなベイト領域設計に含まれる。アクセプター突然変異体の機能の保存は、トリプシンを阻害するその能力により検証し(下記を参照されたい)、設計されたベイト領域の査定の一部として、他のプロテアーゼと対比して調べた。
可変ベイト領域の発現構築物の、設計および創出
新規の変異体ベイト領域の配列(配列番号6~30)、および1または複数のプロテアーゼ認識配列(配列番号31~83)を含む変異体ベイト領域を、ADAMTS-4、ADAMTS-5、多様なMMP、および他のプロテアーゼによる、ヒトアグリカンの公知の切断部位(Fosangら、Eur. Cells and Mat.、15巻、2008年、11~26頁)(表1)に基づき設計した。一部の構築物は、野生型A2Mベイト配列の部分または全体を保持したが、非天然アミノ酸配列のインサートは、配列番号6~30の変異体ベイト領域と、配列番号31~83の1または複数のプロテアーゼ認識配列を含む変異体ベイト領域とを含んだ。各々が、1つ~6つの間のベイト領域の配列をコードするDNAインサート配列を含有する、いくつかのpUC57プラスミドは、GenScriptにより合成され、凍結乾燥粉末として、本発明者らに送付された。各インサート配列は、アクセプター構築物へのライゲーションのために、5’末端のXho1部位および3’末端のHindIII部位を含有する。各インサートプラスミドを、アクセプタープラスミドと共に、水中で再構成し、20UのXho1およびHindIIIにより、一晩にわたり二重消化して、インサート配列を放離し、消化されたプラスミドを、1%のアガロースゲル上の電気泳動により分離し、UV光下で可視化した。インサート長およびアクセプター長に対応するバンドは、キットの指示書の通りに、Qiagen Qiaquick Gel Extractionキットを介して、ゲルから抽出した。各抽出から得られるDNAの濃度は、Qubit 蛍光光度計(Invitrogen)を使用して決定した。インサートの、ベイト領域をコードするアクセプターの領域へのライゲーションは、各インサートベクターの消化から抽出されるインサート断片を、50ngの、消化されたアクセプタープラスミドと、インサート:プラスミドのモル比を3:1として混合することにより、セミランダム方式で行った。ライゲーションは、キットの指示書に従い、Quick Ligationキット(New England Biolabs)を使用して達成した。次いで、ライゲーションされたプラスミドの混合物を、E.coliのGC10株(Genessee Scientific)に形質転換し、100μg/mLのアンピシリンを含有するLuria培養液/寒天プレート上に塗り広げ、形質転換細胞の単一のコロニーを発生させた。各ライゲーション反応物に由来する、個々のコロニーの、5mLずつのLuria培養液による培養物を増殖させ、各培養物中に含有されたプラスミドDNAを、キットの指示書に従い、Qiagen QiaPrep miniprepキットを介して抽出した。これらのプラスミドは、ベイト領域のすぐ上流の、A2M構築物の配列にアニールするプライマーを使用する、配列の確認のために、Genewizに送付した。個々のクロマトグラムトレースを、配列内の異質性の存在について解析し、個々のインサートの配列を確認した。
A2M変異体の発現
A2M変異体は、HEK293F細胞(Gibco)内で、懸濁細胞内の、各構築物の一過性トランスフェクションにより発現させた。細胞は、8%のCO2/空気混合物を含有する、37℃のインキュベーター内の、速度を125rpmとするローテーター上、1×GlutaMax(Gibco)を含有する、20mLのFreeStyle F17培地(Invitrogen)を含有する、Erlenmeyer製の細胞培養フラスコ内の、1mL当たりの細胞550,000個の密度まで増殖させた。細胞は、各構築物(野生型または変異体)20μgずつのプラスミドDNAを、10μLのTransIT Boost(Mirus)を加えたTransIT Proと、1:2(w/v)の比で、培地への添加の前に15分間にわたり混合することによりトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクション後3日間にわたり、同じ状態で維持してから、分泌された組換えタンパク質を含有する培地を、タンパク質精製のために取り出した(図3)。
A2M変異体の精製
A2M発現構築物は、前駆体A2Mタンパク質をコードするので、発現し、プロセシングされた組換えタンパク質は、天然のA2M分泌シグナルを介して、細胞培養培地に分泌される。分泌された、組換え野生型A2MおよびA2Mベイト領域変異体は、各構築物のC末端における6×Hisタグを使用して、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより、トランスフェクト細胞の培養培地から精製した。トランスフェクト細胞から取り出された培地は、17,500Gで、15分間にわたり遠心分離して、全ての細胞を除去した。イミダゾールを、清明化された培地に、10mMの最終濃度まで添加した。1mLのHisPur Cobalt樹脂スラリー(Pierce)を、試料に添加し、4℃で1時間にわたる、ロッカー上の振とうにより平衡化させた。ビーズを、700Gで2分間にわたる遠心分離により収集し、上清を廃棄した。ビーズを、50mMのトリス-HCl、150mMのNaCl、10mMのイミダゾール、pH7.4による緩衝液10mL中で3回にわたり洗浄し、各回において、ビーズを、700Gの遠心分離により収集し、上清を、除去および廃棄した。タンパク質は、2mLの溶出緩衝液(200mMのイミダゾールを含有する洗浄緩衝液)を、ビーズと混合し、700Gで2分間にわたり遠心分離することにより溶出させた。上清を収集および保持し、溶出を合計3回にわたり反復した。次いで、試料中に含有された精製タンパク質を、100KDaのNMCOを伴う、Amiconスピンフィルターを使用して、100μLの容量(典型的には、100μg/mL~600μg/mLの間)まで濃縮した。濃縮時において、イミダゾールを含有する緩衝液は、50mMのHEPES、150mMのNaCl、10mMのCaCl2、100μMのZnCl2、0.05%(w/v)のBrij-35、pH7.4(HNZCB緩衝液)と完全に交換した。タンパク質の濃度は、BCA(Pierce)アッセイおよび660nm(Pierce)アッセイを使用して決定した。1μgずつの各精製タンパク質を、還元SDS-PAGEローディング緩衝液と混合し、95℃で5分間にわたり加熱し、7.5%のトリス-グリシンSDS-PAGE色素非含有ゲル(Bio-rad)にロードした。UV光に、5分間にわたり露出することにより、ゲルを現像し、全タンパク質バンドの写真を撮影した。組換えA2Mの純度は、全ての変異体タンパク質および野生型タンパク質にわたり、一貫して90%を超えると推定された(図15)。
A2M変異体によるプロテアーゼ阻害の増大についてのスクリーニング
野生型A2Mタンパク質と、配列番号31~83の、1または複数のプロテアーゼ認識部位を含有する、配列番号6~30のベイト領域を含有する、A2M変異体を含む、A2M変異体ポリペプチドとを、G1ドメイン、G2ドメイン、および球間ドメイン(R&D)からなる、ヒトアグリカンの組換えIGD断片の、ADAMTS-4、ADAMTS-5、およびMMP13によるタンパク質分解を阻害するそれらの能力の比較についてスクリーニングした。これらの酵素の各々の阻害に対する、変異体の有効性についてのスクリーニングは、表3、4a、および4bのプロテアーゼなどの各プロテアーゼのタンパク質分解活性の速度を考慮に入れて、同じ方式で行った。各試料中のIGD断片の量を、0.1μgで一定に保つ一方、プロテアーゼの量は、IGD断片に対するプロテアーゼの活性に応じて変動させた。変異体A2Mおよび野生型A2Mの各々は、各プロテアーゼへの結合の反応速度を大幅に変動させるので、あるものは、A2Mの、プロテアーゼとのプレインキュベーションを伴わずに、完全な阻害を示す一方、他のものは、プロテアーゼと10分間にわたりインキュベートした場合に、ある程度の阻害を示し、他のものは、A2Mの、プロテアーゼとのプレインキュベーションの後であってもなお、阻害を示さなかった。各A2M変異体について、プロテアーゼ、IGD断片、およびA2Mの全てを、同時に添加する1つのアッセイ(プレインキュベーションを伴わない)と、阻害剤の、プロテアーゼへの、緩徐な結合を検出するために、IGD断片を添加する前に、室温で10分間にわたり、プロテアーゼとA2Mとをプレインキュベートする1つのアッセイとの、2つの独立のアッセイを実施した。プロテアーゼの、A2Mとのプレインキュベーションを伴わない実験では、HNZCB緩衝液中の、150nMの、タグ付けされた野生型A2MまたはA2M変異体5μLずつを、マイクロ遠心管に添加した。次いで、40μg/mLのIGD断片5μLを、同じ遠心管に添加し、混合した。最後に、150nM(ADAMTS-4およびADAMTS-5、A2M:プロテアーゼのモル比を1:1とする)または75nM(MMP13-A2M:プロテアーゼのモル比を2:1とする)のプロテアーゼ5μLずつを、遠心管に添加した。10分間にわたるプレインキュベーションを伴う実験では、各A2Mの5μLずつを、5μLのプロテアーゼと、10分間にわたり混合してから、5μLのIGD断片を添加した。全ての試料を、37℃で1時間にわたりインキュベートしてから、2×還元SDS-PAGEローディング緩衝液(Bio-rad)を添加し、95℃で5分間にわたり加熱することにより、停止させた。各試料15μLずつを、7.5%のTris-Glycine Stain Free Gel(Bio-Rad)にロードし、150Vで1時間にわたり泳動させた。全タンパク質を、ゲルの指示書の通り、UV光下で可視化し、イメージングした。次いで、タンパク質を、7分間の転写時間を使用する、iBlot(Invitrogen)乾式ブロッティングシステムを介して、ニトロセルロース膜にブロッティングし、TBSカゼインブロッキング溶液(Bio-rad)を使用して、1時間にわたりブロッキングし、抗IGD断片ヤギポリクローナル抗体(R&D Biosystems型番:AF1220)を、TBS-T中0.1μg/mLの濃度で使用して、プロービングした。ブロットを、TBS-Tで、3回にわたり洗浄し、カゼインブロッキング溶液中0.1μg/mLのHRPコンジュゲート抗ヤギIgGポリクローナル抗体(Sigma型番:A5420)で、プロービングした。ブロットは、製造元の指示書に従い、ECL Plus化学発光キット(Pierce)を使用して現像した。ウェスタンブロットは、ChemiDoc imagerシステム(Bio-rad)によりイメージングした。ウェスタンブロット上の各IGD断片バンド(完全IGD断片および分解IGD断片)は、ImageLabソフトウェアを使用して定量した。各A2M変異体の存在下におけるIGD断片の分解量は、分解IGD断片バンドの強度と、完全IGD断片バンドの強度と(図16~20)を比較することにより定量し、各変異体の阻害能を、各バッチの変異体と共に調製された、野生型A2M試料と比較した。スクリーニングの、この初期ラウンドから、8つの変異体を、MMP1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP12、およびカテプシンK(全ての酵素は、組換えヒト構築物であり、R&Dから購入した)、ならびに表4aおよび4bの酵素など、他の酵素に対するさらなるスクリーニングのために選択した。各変異体の阻害能の比較は、切断された断片が、ウェスタンブロット上に現れないような形で、IGD断片を分解させた、MMP9およびMMP13を例外として、分解バンドの強度の、完全バンドの強度に対する比をとることにより行った。MMP9およびMMP13の場合、比較は、残りの完全IGD断片バンドの強度のみに基づいて行った。加えて、IGD断片を感知可能に切断するのは、ADAMTS-1およびMMP7のみであったので、精密な阻害の測定を定量することはできなかった。これらの場合、変異体の全ては、これらの2つのプロテアーゼに関して、野生型と本質的に同等であると判定された。全ての阻害データを査定した後で、全ての被験プロテアーゼ(図17~21)または軟骨を分解することが公知であるプロテアーゼの混合物(図22)に対する、改善された阻害特徴または少なくとも同等な阻害特徴に基づき、4つの変異体を選択した。
プロテアーゼに対する、A2M変異体についてのスクリーニング
4つの、選択されたA2M変異体が、一般的なプロテアーゼである、トリプシンおよびキモトリプシンを、野生型タンパク質と同様の程度に阻害することがやはり可能であることを検証するため、変異体を、蛍光タンパク質分解アッセイにおいて調べた(Twining, S.S.、Anal. Biochem.、143巻、1984年、30~34頁)。このアッセイでは、蛍光色素のタンパク質分解依存的放出により引き起こされる、FITC標識タンパク質基質からの蛍光発光の増大をモニタリングする。各変異体について、2つの実験:A2M:プロテアーゼのモル比を1:1に保つ、1つの実験と、A2Mを、0.5:1に低減する別の実験とを行った。HNZCB緩衝液中の濃度を100nM(比を1:1とする場合)または50nM(比を0.5:1とする場合)とする、野生型A2Mまたは変異体A2Mの40μLを、40nMのウシトリプシン(Sigma)100μLと混合し、室温で5分間にわたりインキュベートする。この混合物に、40μg/mLのFTC-カゼイン基質(Pierce)70μLを添加し、混合し、384ウェルプレートの3つのウェルに速やかにピペッティングした(ウェル1当たり65μL)。プレートを、Cary Eclipse蛍光光度計に入れ、励起波長を485nmとし、発光波長を519nmとする反応速度モード(単一の波長)で、15分間にわたり読み取ったが、この間、プロテアーゼによるカゼインの分解速度は、ほぼ直線状を維持した。発光強度を、3つの試料ウェルについて平均し、時間と対比してプロットし、各試料および対照によるデータへの直線当てはめを行った(図18、左)。当てはめた直線の傾きを、溶液中に残存するプロテアーゼ活性の尺度とした。4つの選び出されたA2M変異体の、野生型タンパク質との比較は、変異体が全て、トリプシンおよびキモトリプシンを含む多様なプロテアーゼを、野生型A2Mとほぼ同等に阻害することが可能であることを示す(図18、右)。
自家療法のための血液の調製
120mLの全ヒト血液を、静脈穿刺により、対象から得た。38mLずつの血液アリコートを、各収集ボトル内に、適切な容量のクエン酸デキストロース溶液A(「ACD-A」)を伴う、2本またはそれ超の血液収集ボトルに収集した。血液/ACD-Aを伴う収集ボトルを、一定の角度のローター遠心分離機に取り付け、周囲温度条件下、所定の速度および時間で遠心分離した。沈殿した細胞を撹乱しないように、バフィーコートの水準の上方の血漿約1mLを残して、約15mLずつの血漿を、血清用ピペットで、各チューブからアリコート分割した。この過程を、1または複数の遠心分離機スピン周期における収集ボトルについて反復して、120mLの総採血量から、45mLの総血漿容量をもたらした。血漿は、個別の滅菌血液収集バッグにプールした。本明細書で記載される組成物は、対象への投与の前に、骨などの組織の自家移植片または同種移植片と混合することができる。
in vitroにおける軟骨分解アッセイ
炎症促進性サイトカインおよび軟骨分解性メタロプロテイナーゼ(ADAMTS)により引き起こされた軟骨の異化を、白血球リッチPRP(LR-PRP)またはAPIC-PRP(Autologous Platelet Integrated Concentrate)の調製物により阻害しうるという仮説を検証するため、in vitro軟骨分解対照アッセイを実施した。BCEを、LR-PRPまたはAPIC-PRPの存在下または非存在において、ADAMTS-5、TNF-α、またはIL-1βで処理した。軟骨の異化は、培養物中、2または3日後において、培地中の硫酸化グリコサミノグリカン(sGAG)の存在を介する、プロテオグリカンの放出により測定した。ウシ関節軟骨外植片(BCE、200mg)を、1~1.5歳の未出産の雌牛から単離し、培養物中で3日間にわたり平衡化させた。BCE培養物を、3日間にわたり、同じ患者から調製された、33%(v/v)の白血球リッチ血小板リッチ血漿(LR-PRP)、血液、またはAPIC-PRPを伴うかまたは伴わずに処置した。500ng/mlのADAMTS-5による、2日間にわたる、軟骨のプロテアーゼ消化を、APIC-PRPの2倍の系列希釈液で阻害した[ED50=0.1%v/v]。サイトカインにより誘導される軟骨の異化のために、BCEを、SFM中で、80ng/mlのヒトTNF-αまたは8ng/mlのヒトIL-1βを伴うかまたは伴わずに、3日間にわたりインキュベートした。軟骨の分解は、5mg/mlのA2Mまたは30%(v/v)のAPIC-PRPを添加することにより阻害した。APIC-PRPについての用量反応曲線を裏付けるため、APIC-PRPの3倍の系列希釈液[ED50=3%v/v]を使用して、TNF-α/IL-1βにより誘導される軟骨の分解を阻害した。軟骨の異化は、培養物上清中で、硫酸化グリコサミノグリカン(sGAG)の存在を介する、プロテオグリカンの放出により、コンドロイチン硫酸の検量線を伴うDMMBアッセイを使用して測定した。200mgのBCE中の軟骨の分解が、LR-PRP(33%v/v)の添加により誘導されたことから、LR-PRPは、軟骨の異化の発生源であることが裏付けられる。炎症促進性サイトカイン(80ng/mlのTNF-αまたは8ng/mlのIL-1β)、ADAMTS-5(500ng/ml)による処理もまた、培地中のsGAGの増大を結果としてもたらした。APIC-PRPの添加は、サイトカイン、メタロプロテイナーゼ、またはLR-PRPにより誘導される軟骨の異化を、用量依存的に阻害した。APIC-PRP研究において使用された、最高の濃度のLR-PRPの添加は、サイトカインまたはMMPにより誘導される軟骨の異化であって、培地中のsGAGの放出により測定される軟骨の異化を低減したが、これを阻害しなかった(データは示さない)。骨関節炎(OA)は、関節軟骨の進行性変性を特徴とする。BCEモデルは、OAにおける推定治療剤についての研究を代表する。この研究は、白血球リッチPRP(LR-PRP)が、軟骨の異化に寄与するのに対し、APIC-PRPは、軟骨を、公知のOAメディエーターによる分解から保護することを裏付ける。この活性は、APIC-PRP中のA2Mの濃度の、血中のその濃度に対する5~10倍の増大により説明することができる。この結論は、A2Mの、軟骨に対する保護効果を裏付ける実験と合致する。軟骨の生物学および代謝についての、この理解の改善は、ヒトにおけるAPIC-PRPについての臨床試験をもたらすはずである。
ウサギモデルにおける軟骨保護効果
骨関節炎の病態は、炎症性メディエーターおよびマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)などのプロテアーゼの上方調節を伴う。A2Mとは、強力なプロテアーゼ阻害剤である、自然発生の血漿糖タンパク質である。A2Mは、MMPに結合し、これを捕獲し、取り除くその能力により、軟骨の異化をモジュレートするように挙動する。A2Mは、複数の組織および細胞外腔全体で機能するが、通常、関節の関節内腔内で高レベルに達することはない。血液からA2Mを濃縮するAPIC-Cell Free(Autologous Protease Inhibitor Concentrate)が、軟骨の異化を阻害し、これにより、ACL-Tウサギモデルにおける骨関節炎の発生を緩和する能力について調べた。ウサギモデルは、骨関節炎を査定するための、耐荷重についての、機能的な、in vivo解剖モデルであって、ヒト組織と同様の、機械的特性、形状的構造、および治癒能を呈示する解剖モデルを表す。この研究では、8~12カ月齢の雌ニュージーランドホワイトウサギを使用した。このウサギモデルは、骨関節炎を査定するための、耐荷重についての、機能的な、in vivo解剖モデルであって、ヒト組織と同様の、機械的特性、形状的構造、および治癒能を呈示する解剖モデルを表す。複数回注射コホート(群1):6匹のウサギの、右膝にACL-T術を施し、左膝に偽手術を施した。0.3mLずつ4回分のAPIC-Cell Free(Autologous Protease Inhibitor Concentrate)注射液を、ウサギ血液から調製し、ACL膝傷害後1、4、14、および28日目に投与した。ウサギの対側対照膝には、同等容量の滅菌等張性生理食塩液を施した。ウサギを、6週間にわたりモニタリングし、次いで、軟骨変性評価のために屠殺した。対照群(群2):6匹のウサギの、右膝に、左膝の偽手術を伴わずに、ACL-T術を施した。これらのウサギは、対照群であり、したがって、いかなる処置も施されなかった。
ACL傷害の前に、変異体A2Mポリペプチドを調製した。全てのウサギに、プロテアーゼ阻害剤濃縮液を施した。ACL-T施術の6週間後、動物を、巨視的なおよび顕微鏡による膝関節の軟骨査定のために屠殺して、OAの進行を決定した。
巨視的査定のために、遠位大腿顆および脛骨プラトー表面を解析し、既に記載されている、バリデーション済みの、0~8のスケールを使用して、病変を分類した。関節内の病変の場所は、巨視的検査の後で、The International Cartilage Repair Society(OARSI)による分類であって、Lindhorstらが、ウサギ膝に適応させた分類に従い、各関節表面についての、特殊な9領域の格子により記録した。単離された大腿骨および脛骨試料にフィードし、組織学的査定(顕微鏡による査定)のために脱灰させた。大腿骨および脛骨についての巨視的査定は、OAと符合する軟骨(cartage)の異化と符合する特色を裏付けた。APIC Cell Freeによる処置は、軟骨の外見を大幅に改善し、偽手術対照と同様の外見をもたらした(図12~14)。APICの適用は、軟骨の分解を、非処置対照と比較して、53±20%軽減した(平均値±SEM;p=0.0086)(図13Aおよび13B)。変異体A2Mの濃度を決定した。A2Mの高濃度と、巨視的査定時における、OARSI総膝スコアの減少との間には、用量依存的相関が見られた(図13Aおよび13B)。Safarin-O染色(r2=0.73)、構造(r2=0.76)、軟骨細胞密度(r2=0.50)、およびクラスター形成(r2=0.97)についてのOARSI組織病理学査定(図14)の合計ではまた、処置の用量依存的治療利益も観察された。データは、血中のA2Mの濃度の9~10倍を含有する、APIC-Cell Free(Autologous Protease Inhibitor Concentrate)が、骨関節炎ウサギモデルに対して、軟骨保護効果を及ぼすことを示唆する。
A2Mの、BCEに対する効果
炎症促進性サイトカインまたは軟骨分解性メタロプロテイナーゼ(ADAMTSおよびMMP)の添加は、軟骨の分解を刺激するが、これは、A2Mにより阻害されるという仮説を検証するため、in vitro軟骨分解対照アッセイを実施した。ウシ軟骨外植片(BCE)を、精製A2Mの存在下または非存在下で、炎症促進性サイトカイン(TNF-αまたはIL-1β)または軟骨分解性メタロプロテイナーゼ(ADAMTS-5、ADAMTS-4、MMP-7、またはMMP-12)を伴うかまたは伴わずに、処置した。
in vitroにおける、A2Mの、創傷の治癒に対する効果
炎症促進性サイトカインまたは軟骨分解性メタロプロテイナーゼ(ADAMTSおよびMMP)の添加は、創傷の治癒を遅延させるが、これは、組換えA2Mにより阻害されるという仮説を検証するため、in vitro創傷治癒対照アッセイを実施する。動物の創傷に由来する細胞を、組換えA2M組成物の存在下または非存在下で、炎症促進性サイトカイン(TNF-αまたはIL-1β)または軟骨分解性メタロプロテイナーゼ(ADAMTS-5、ADAMTS-4、MMP-7、またはMMP-12)を伴うかまたは伴わずに、処置する。創傷細胞を、無血清培地(SFM)中で、500ng/mLのADAMTS-4またはADAMTS-5、および3~5μg/mLのMMP-3、MMP-7、MMP-12、またはMMP-13を伴うかまたは伴わずに、2日間にわたりインキュベートする。MMP-3は、キモトリプシンで活性化させてから、創傷細胞に適用する。サイトカインにより誘導される創傷の治癒の遅延のために、創傷細胞を、SFM中で、80ng/mlのヒトTNF-αおよび8ng/mLのヒトIL-1βを伴うかまたは伴わずに、3日間にわたりインキュベートする。創傷の治癒は、プロテアーゼ消化について、100μg/mLの精製ヒト組換えA2Mの添加により増強されるか、またはサイトカインにより誘導される分解について、5mg/mLの組換えA2Mの添加により増強される。
創傷液の収集法
いくつかの技法が、創傷液を収集するのに活用された。1つの技法は、シリンジを活用して、湿性創傷から、創傷液を吸引するステップを伴った。別の技法は、創傷液を吸収する濾紙の使用に続く、緩衝液で洗浄することなどによる、吸収された創傷液の、濾紙からの抽出を伴う。別の技法は、縁辺が直線状の舌圧子を、創傷にわたり走らせ、流体を収集するステップを伴い、濾紙などにより、直線状の縁辺の前方で流体が集められる。
糖尿病性ラットにおける、A2M組成物の、創傷の治癒に対する効果
概要
糖尿病性潰瘍など、慢性創傷の治癒は、重大な臨床問題である。本研究では、in vivoにおける、本発明に従う、治療用組換えA2M組成物に対する応答について検討する。創傷の治癒に障害を来した、糖尿病性ラットモデルについての、予備的動物研究は、本明細書で記載される組換えA2M組成物を、蒸留水と比較して行う。結果として、A2M処置群では、創傷の完全閉止までの時間が短い。創傷の治癒の差違が、処置の9日目から明らかとなる。A2M処置動物は、瘢痕組織が小さく、体毛の増殖も完全である。水処置動物では、体毛の増殖に障害を来した瘢痕が明らかである。本研究の結果は、これらのA2M組成物の皮膚への使用が、創傷の治癒をモジュレートし、体毛の増殖を刺激する潜在的可能性を有することを示唆する。
組換えA2M組成物についてのin vivo試験のための動物モデルは、糖尿病性ラットの背部皮膚における全層創傷である。体重200~250gのWistarラットを使用する。動物は、個別のケージ内で飼育する。糖尿病は、ストレプトゾトシン(Sigma-Aldrich、UK)の投与により誘導する。ストレプトゾトシンは、55mg/kgの用量で、腹腔内投与する。ストレプトゾトシンの投与の前に、ラットの、ベースラインにおける血中グルコースを決定する。48時間後、血中グルコースを再度測定して、ラットが糖尿病性であることを確認する。血中グルコースレベルが倍増していれば、糖尿病の誘導が確認される。グルコースは、Glucometer(Infopia Co.、Korea)により決定する。血中グルコースの決定を、5日ごとに継続して、糖尿病の遷延を確認する。ストレプトゾトシンにより誘導される糖尿病の実体に関して、体重が大幅に減少し、虚弱となる動物、血中グルコースレベルが不安定な動物は、研究から除外する。対照群と被験群とを同数とする、合計14匹のラットを使用する。被験群には、組換えA2M組成物を含む、ある容量の溶液を適用し、対照群には、蒸留水を施す。0日後の時点で、円形で直径15mmの全層創傷を創出する(例えば、Wound Rep. Reg.、2002年、10巻:286~294頁に従って)。腹腔内ペントバルビタール(55mg/kg)により、ラットに麻酔をかけ、Betadineを使用して、背部皮膚を、手術のために調製する。創傷は、手術用鋏を使用して創出する。0日後の時点で、調製された包帯を、創傷に直接貼付する。創傷は、滅菌ガーゼで覆い、注意深く包み込む。手術後2~3日ごとに、ラットを麻酔下に置いて、創傷の包帯を、未使用の対照包帯または被験包帯に交換する。創傷は、滅菌生理食塩液でフラッシュ洗浄して、膿苔を除去し、創傷領域を清浄化する。ディジタルカメラを使用して、創傷の写真を撮影する。写真を、創傷のサイズおよび新鮮な新生上皮の外見の点から、創傷の治癒について検討する。撮影したら、未使用の包帯を創傷に貼付し、創傷を再度覆う。バイアスのコントロールは、実験群の各々に暗号を割り当てることにより達成する。試験責任医師を、群の各々の識別に対して盲検化し、被験群と対照群とが同様の外見を呈するようにする。最終的な4週間にわたる解析が完了した後で、暗号を解除する。
創傷のデブリドマン
in vivoにおけるデブリドマンの有効性研究のために、組換えA2M組成物を、ブタの壊死組織に適用する。組換えA2M組成物を、デブリドマン装置と併せて、発生させた創傷(直径約2cm)の各々に使用する。24時間後、A2M組成物で処置された創傷において、創傷の著明なデブリドマンが観察される。5日後、組換えA2M組成物を伴う創傷は、壊死組織を伴わない清浄化表面および完全な治癒を示す。デブリドマン装置で処置された創傷もまた、48時間後に、著明なデブリドマンを示す。しかし、創傷は、組換えA2M組成物で処置されたほど清浄化されず、5日後においても、完全な治癒を示さ
なかった。
Claims (18)
- 炎症性の疾患または状態を有する哺乳動物対象を処置する方法において使用するための医薬組成物であって、前記方法は、前記医薬組成物を前記対象に投与することを含み、前記医薬組成物は、
(a)非天然ベイト領域を含む組換えα-2-マクログロブリン(A2M)ポリペプチドと、
(b)薬学的に許容される担体と
を含み、前記非天然ベイト領域が、配列番号20に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含み、前記非天然ベイト領域が、配列番号34、36および80の配列の各々を含み、前記組換えA2Mポリペプチドが、配列番号3に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含み、前記非天然ベイト領域が、配列番号84~143からなる群より選択される配列を含まない配列を有する、医薬組成物。 - 前記組換えA2Mポリペプチドが、配列番号3の配列を含む野生型A2Mタンパク質によるプロテアーゼの阻害と比較して増強された、前記プロテアーゼの阻害を特徴とする、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記方法が、前記炎症性の疾患または状態の解剖学的部位に前記医薬組成物を投与することを含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 投与することが注射することを含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記方法が、手術手順中に前記医薬組成物を投与することを含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記炎症性の疾患または状態が、関節変性、骨変性、軟骨変性、腱変性、靭帯変性、および、脊椎変性からなる群より選択される変性疾患である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記炎症性の疾患または状態が、自己免疫疾患、関節炎、骨関節炎、炎症性関節炎、軟骨形成、筋腱付着部症、および、腱障害からなる群より選択される、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記炎症性の疾患または状態が骨関節炎である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記炎症性の疾患または状態が、手術により引き起こされる関節炎症、手術により引き起こされる椎間板炎症、関節置換術により引き起こされる関節炎症、椎間板置換術により引き起こされる椎間板炎症、および、これらの組合せからなる群より選択される、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記炎症性の疾患または状態が、靭帯傷害、腱傷害、骨傷害、脊椎傷害、および、軟骨傷害からなる群より選択される傷害である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記対象がヒトである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記非天然ベイト領域が、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)認識配列、および、トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ(ADAMTS)認識配列からなる群より選択されるプロテアーゼ認識配列を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記非天然ベイト領域が、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、および、これらの組合せからなる群より選択されるプロテアーゼについてのコンセンサス配列を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記非天然ベイト領域が、自殺型阻害因子を含むプロテアーゼ認識配列を含み、前記自殺型阻害因子が、プロテアーゼを前記組換えA2Mポリペプチドに共有結合によって接合させるように作動可能である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記非天然ベイト領域が、配列番号80を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記非天然ベイト領域が、配列番号20に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記非天然ベイト領域が、配列番号20を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が液体である、請求項1に記載の医薬組成物。
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