JP7152068B2 - DGKδノックアウトマウス及びこれを用いた方法 - Google Patents
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Description
上記の通り、本実施形態において得られるノックアウトマウスを用いることで、様々な疾患に関するスクリーニングを行うことができる。より具体的に本実施形態に係る方法は、ジアシルグリセロールキナーゼδ(DGKδ)をノックアウトしたノックアウトマウスに被験物質を接触させる方法である。
して行われた。
DGKδノックアウトマウス(アクセッション番号CDB0660K:http://www2.clst.riken.jp/arg/mutant%20mice%20list.html)は、当該記載される方法により作製した(http://www2.clst.riken.jp/arg/Methods.html)。端的に説明すると、標的構築物は、DGKδのエキソン9に隣接するLoxP部位を配置することによって調製した。
ところで、loxP遺伝子の遺伝子型決定は、以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって行った。
フォワードプライマー:5’-TCCTACCTCTCTCTCCATTCCC-3’リバースプライマー:5’-AAGGTGTTGAATAATACTCTGTGAC-3’
フォワードプライマー:
5’-ACGGGAACAGGGCGTTTCGGAGGTGGTTGC-3’
リバースプライマー:
5’-CTAATCGCCATCTTCCAGCACGG-3’
フォワードプライマー:
5’-TGAGCGAGCTCATCAAGATAATCAGGT-3’
リバースプライマー:
5’-GTTAGCATTGAGCTGCAAGCGCCGTCT-3’
ところで脳のウェスタンブロッティングは、従前の報告(Tsushima et al.、DiacylglyCcerol kinaze γ serves as an upstream suppressor of Racl and lamellipodium fomation.J.Biol.Chem.279、28603-28613”、2004)により、抗DGKδ(Sakane et al.、“Alternative splicing of the human diacylglycerol kinase δ gene generates two isoforms differing in their expression patterns and in regulatory functions.J.Biol.Chem277,43519-43526”、2002)及び抗GFP抗体(sc-9996、Santa Cruz Biotechnology)を用いて行った。
まず、インビボでの脳におけるDGKδの潜在的役割を調べるため、マウスにおけるDGKδの生殖系列欠損による出生直後の致死を回避しながらエキソン9を標的とした脳特異的DGKδアレルを作製した。尾由来のゲノムDNAのPCRスクリーニングの結果、LoxP部位がDGKαのエキソン9に隣接して配置されていることが示された。
次に、これらマウスに対し新規物体認識試験を行った。
ビー玉埋込試験は強迫行動に関連しており、OCD様表現型を解析するために使用され
る。そのため、本試験をDGKδノックアウトマウスに対し行った。
選択的セロトニン再取込み阻害薬(SSRI)であるフルオキセチンは、OCD治療薬として利用されている。そこで、新規物体認識試験とビー玉埋設試験におけるSSRIの異常行動への影響を分析し、その効果を確認した。
ここで、DGKδ欠損によるニューロン細胞機能への影響を調べるために、初代培養皮質ニューロンをDGKδノックアウトから調製した。
(DGKhd-siRNA)
5’-UACUCACAGAGACUGAGGUGCUCCA-3’、
5’-UGGAGCACCUCAGUCUCUGUGAGUA-3’
(対照siRNA)
5’-UGGCACCUCUGACUCUGUAGAGGUA-3’、
5’-UAUCUUUGCAUCCAAGCCAAUGCCA-3’
Claims (4)
- ジアシルグリセロールキナーゼδ(DGKδ)の発現レベルに応じて神経細胞の分化状態を確認する方法。
- ジアシルグリセロールキナーゼδ(DGKδ)からなる神経細胞の分化状態バイオマーカー。
- ジアシルグリセロールキナーゼδ(DGKδ)を有効成分とする神経細胞の軸索/神経突起を調整する調整剤。
- 脳特異的にジアシルグリセロールキナーゼδ(DGKδ)をノックアウトしたノックアウトマウスを用いたセロトニン神経系の異常を改善する強迫性障害の治療薬のスクリーニング方法。
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Non-Patent Citations (2)
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臼木貴子 et al.,発達中マウスの脳におけるdiacylglycerol kinase δの発現とその脳特異的欠損マウスの表現型解析,BMB2015(第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会)講演要旨集,2015年,2P0491 |
臼木貴子,モデルマウスを用いたジアシルグリセロールキナーゼδの脳における機能解析,千葉大学学術成果リポジトリ,2016年03月25日,1-113,https://opac.II.chiba-u.jp/da/curator/101934 |
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