JP7140328B2 - 筋張力測定用基板、当該筋張力測定用基板を用いる筋張力測定器及び装置並びに筋張力測定方法、スクリーニング方法及び評価指標として使用する方法 - Google Patents
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Description
[1]光透過性基板と、当該光透過性基板の上に積層されているシリコーンゲルと、当該シリコーンゲルの表面にプラズマ処理により形成されている親水性の表面硬化層と、を有し、当該表面硬化層に筋細胞を載置して電気刺激を印加する際に、筋細胞の収縮により親水性の表面硬化層に皺が形成され得る筋張力測定用基板。
[2]前記[1]に記載の筋張力測定用基板と、当該筋張力測定用基板に電気刺激を印加する電極と、を具備する筋張力測定器。
[3]前記筋張力測定用基板と、前記電極とを有する区画を2個以上有し、少なくとも1個の区画は対照区画を構成し、少なくとも1個の区画は測定区画を構成する、前記[2]に記載の筋張力測定器。
[4]前記[2]又は[3]の筋張力測定器と、光学顕微鏡と、当該光学顕微鏡により観察される当該筋張力測定用基板の親水性の表面硬化層に形成される皺の変化量を計算する画像処理及び解析手段と、を具備する筋張力測定装置。
[5]前記[1]に記載の筋張力測定用基板に筋細胞を載置し、前記筋張力測定用基板に電気刺激を印加し、電気刺激により収縮した筋細胞の皺を解析し、皺の変化量を算出する、筋張力測定方法。
[6]前記[1]に記載の筋張力測定用基板に筋細胞を載置し、前記筋張力測定用基板に電気刺激を印加し、電気刺激により収縮した筋細胞の皺を解析し、皺の変化量を算出して得られる筋張力評価を比較するスクリーニング方法。
[7]前記[1]に記載の筋張力測定用基板に筋細胞を載置し、前記筋張力測定用基板に電気刺激を印加し、電気刺激により収縮した筋細胞の皺を解析し、皺の変化量を算出して、筋線維の状態を評価する指標として使用する方法。
図1に本発明の筋張力測定用基板の概略断面図を示す。筋張力測定用基板1は、光透過性基板2と、光透過性基板2の上に積層されているシリコーンゲル3と、シリコーンゲル3の表面にプラズマ処理により形成された親水性の表面硬化層4と、を有する。図2の筋張力測定用基板1の平面図に示すように、表面硬化層4に筋細胞5を載置して電気刺激を印加すると、筋細胞5の収縮により親水性の表面硬化層4に皺6が形成され得る。
(1)筋細胞に電気刺激を印加しない弛緩状態の光学顕微鏡による観察画像データを格納する。
(2)弛緩時の観察画像を各コマに分割し(図5左)、筋細胞の輪郭を取り除き、弛緩時画像(図5右)とする。
(3)筋細胞に電気刺激を印加して収縮時の光学顕微鏡による観察画像データを格納する。
(4)収縮時の観察画像を各コマに分割し(図6左)、図5(右)画像をもとに筋細胞の輪郭を取り除き、細胞の輪郭が除かれた収縮時画像(図6右)とする。
(5)細胞の輪郭が除かれた画像(図6左)の輝度の違いを2階調化する(図7)。
(6)輝度の変化が観察される部分のうち、ドットはノイズとして取り除き、線形部分を皺として残し、線形画像(図8)とする。
(7)線形画像(図9左)の直線を細線化して細線画像(図9右)とする。
(8)細線画像(図9右)を拡大して、最小ピクセル(図9右下)を計数して、皺長さの情報を抽出して皺総長の原データ(図10)とする。
(9)皺総長の原データ(図11左)から、収縮3回の皺の長さの総和(曲線下の面積)(図11右)を算出する。
(10)収縮3回の皺の総長で、筋細胞の収縮力を評価する。
[筋張力測定用基板の製造]
市販のシリコーン(東レ・ダウコーニング株式会社製CY52-276)を用いて母剤と希釈剤の比率を1.3:1~1.4:1に調節して、カバーガラス(厚み150μm)の上に載置し、表面からプラズマ処理(45 mA、20 msec、1Hz)を60秒間行って、表面(深さ50 nm)を硬化させて親水性化させたシリコーンゲル(40μm)を調製し、筋張力測定用基板を製造した。さらに、硬化した表面をピラニア水(硫酸と過酸化水素の混合物)で洗浄し、硬化した表面の有機物を除去し、水酸化(OH基付加)して、親水性を高めた。
筋張力測定用基板の対向する側面に一対の炭素電極を取り付けて、スライドチャンバー(松浪ガラス工業株式会社SCS-002)の各区画内に位置づけて、筋張力測定器を組み立てた。
筋張力測定用基板にマトリゲル(356230 Corning, 1 g/mL)をコートし、その上にマウス由来初代培養細胞(EDL,SOL)を3×104/wellで蒔いた。
観察画像を各コマに分けて、弛緩時の原画像(図5左)から細胞の輪郭を抽出して除き、弛緩時画像(図5右)を作成した。
収縮時画像(図6右)と弛緩時画像(図5左)とを比較して、収縮により輝度変化が生じたところを抽出し(図7)、ドット状の白い部分はノイズとして取り除き、線形の皺を際だたせて線形画像(図8)を作成した。
細線画像(図9右)を拡大して、最小ピクセル(図9右下)を計数して、皺長さの情報を抽出して皺総長の原データ(図10)を取得した。
[刺激電流値と収縮力の関係]
図12に、印加した電気刺激(電流値)と皺総長との関係を示す。40mAまでは印加した電気刺激の増大に従って皺総長が長くなるが、50mAの電気刺激印加は40mAの電気刺激印加と同等の皺総長となった。このことから、印加する電気刺激は20mA~40mA程度でよいことがわかる。
正常細胞では収縮力が大きく、筋萎縮細胞では収縮力が小さいことは知られている。筋萎縮細胞の電気刺激による皺形成を確認するため、長期培養モデル、癌筋萎縮モデル、薬剤誘導性筋萎縮モデルの3種について、本発明の筋力測定方法を行った。
(1)長期培養モデル
筋張力測定用基板にマトリゲル(356230 Corning, 1,g/mL)をコートし、その上にマウス由来初代培養細胞(EDL,SOL)を3×104/wellで蒔き、分化5日目、及び分化10日目に、各20mAの電気刺激を印加して上記の筋力測定及び皺解析を行った。結果を図13~15に示す。
図14は、細胞の短軸幅の比較である。分化10日目(day10)は、分化5日目(day5)と比較して短軸幅が小さいことが確認できた。分化10日目は、筋力が衰えている筋細胞とみなすことができる。
(2)癌筋萎縮モデル
筋張力測定用基板にマトリゲル(356230 Corning, 1,g/mL)をコートし、その上にマウス由来初代培養細胞(EDL)を3×104/wellで蒔き、分化4日目にルイス肺がん(LLC)細胞から得た培養上清を添加し、72時間置いた後、20mAと40mAの電気刺激をそれぞれ印加して上記の筋力測定及び皺解析を行った。結果を図16~18に示す。
図17は、細胞の短軸幅の比較である。癌筋萎縮モデル(LLC処理)は対照(コントロール)よりも短軸幅が小さいことが確認できた。癌筋萎縮モデル(LLC処理)は筋力が衰えている筋細胞といえる。
(3)薬剤誘導性筋萎縮モデル
筋張力測定用基板にマトリゲル(356230 Corning, 1,g/mL)をコートし、その上にマウス由来初代培養細胞(EDL)を3×104/wellで蒔き、分化5日目に、デキサメタゾン(Dex)200μMを添加して48時間処理した後、20mA及び40mAの電気刺激をそれぞれ印加して上記の筋力測定及び皺解析を行った。結果を図19~21に示す。
図20は、細胞の短軸幅の比較である。薬剤誘導性筋萎縮モデル(Dex処理)は対照(コントロール)よりも短軸幅が小さいことが確認できた。薬剤誘導性筋萎縮モデル(Dex処理)は筋力が衰えている筋細胞といえる。
Claims (7)
- 光透過性基板と、当該光透過性基板の上に積層されているシリコーンゲルと、当該シリコーンゲルの表面全体にプラズマ処理により形成されている親水性の表面硬化層と、を有し、当該シリコーンゲルと当該表面硬化層とは、シリコーンゲルの弾性定数:表面硬化層の弾性定数が1:1より大きく1:4より小さい範囲であり、当該表面硬化層に筋細胞を載置して電気刺激を印加する際に、筋細胞の収縮により親水性の表面硬化層に皺が形成され得る筋張力測定用基板。
- 請求項1に記載の筋張力測定用基板と、当該筋張力測定用基板に電気刺激を印加する電極と、を具備する筋張力測定器。
- 前記筋張力測定用基板と、前記電極とを有する区画を2個以上有し、少なくとも1個の区画は対照区画を構成し、少なくとも1個の区画は測定区画を構成する、請求項2に記載の筋張力測定器。
- 請求項2又は3の筋張力測定器と、光学顕微鏡と、当該光学顕微鏡により観察される当該筋張力測定用基板の親水性の表面硬化層に形成される皺の変化量を計算する画像処理及び解析手段と、を具備する筋張力測定装置。
- 請求項4に記載の筋張力測定装置を用いて筋細胞の筋張力を測定する方法であって、
前記筋張力測定用基板に載置した初期状態の筋細胞の画像を取得し、
前記筋張力測定用基板に電気刺激を印加し、
電気刺激により収縮した筋細胞の画像と前記初期状態の筋細胞の画像とを対比して該皺を解析し、
電気刺激により発生した皺の長さの合計として皺の変化量を算出する、筋張力測定方法。 - 請求項4に記載の筋張力測定装置を用いて筋細胞の筋張力を測定して筋張力評価を比較するスクリーニング方法であって、
前記筋張力測定用基板に載置した初期状態の筋細胞の画像を取得し、
前記筋張力測定用基板に電気刺激を印加し、
電気刺激により収縮した筋細胞の画像と前記初期状態の筋細胞の画像とを対比して該皺を解析し、
電気刺激により発生した皺の長さの合計として皺の変化量を算出して得られる筋張力評価を比較するスクリーニング方法。 - 請求項4に記載の筋張力測定装置を用いて筋細胞の筋張力を測定して筋線維の状態を評価する指標として使用する方法であって、
前記筋張力測定用基板に載置した初期状態の筋細胞の画像を取得し、
前記筋張力測定用基板に電気刺激を印加し、
電気刺激により収縮した筋細胞の画像と前記初期状態の筋細胞の画像とを対比して該皺を解析し、
電気刺激により発生した皺の長さの合計として皺の変化量を算出して、筋線維の状態を評価する指標として使用する方法。
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