JP7126668B2

JP7126668B2 - Collagen disease determination method

Info

Publication number: JP7126668B2
Application number: JP2017153891A
Authority: JP
Inventors: 隆志和田; 明宏相良; 靖彦山本; 宣彦坂井
Original assignee: Kanazawa University NUC
Current assignee: Kanazawa University NUC
Priority date: 2017-08-09
Filing date: 2017-08-09
Publication date: 2022-08-29
Anticipated expiration: 2037-08-09
Also published as: JP2019032257A

Description

本発明は、膠原病判定方法に関するものである。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a connective tissue disease determination method.

（膠原病）
膠原病は、多彩な炎症性病変を特徴とする自己免疫性疾患である。代表的な疾患としてSLEやRAが挙げられる。SLEは厚生労働省が指定する難病の1つであり、わが国での総患者数は約10万人である。免疫複合体の組織沈着による多彩な炎症性病変を特徴とする自己免疫疾患である。しかしながら病因は十分に解明されておらず、治療抵抗性や種々の合併症が問題となる。わが国におけるRAの患者数は、一般的に約70～80万人といわれているが、年間発症数や罹患している患者数等に関する情報は、十分には把握されていない。 (collagen disease)
Collagen diseases are autoimmune diseases characterized by diverse inflammatory lesions. Typical diseases include SLE and RA. SLE is one of the intractable diseases designated by the Ministry of Health, Labor and Welfare, and the total number of patients in Japan is about 100,000. It is an autoimmune disease characterized by various inflammatory lesions due to tissue deposition of immune complexes. However, the etiology is not fully elucidated, and treatment resistance and various complications are problems. The number of RA patients in Japan is generally said to be about 700,000 to 800,000, but information on the annual number of cases and the number of patients with RA is not well understood.

（膠原病の検査方法）
膠原病は、厚生労働省が定めた診断基準に従い、診断される。具体的には、血液検査、尿検査、レントゲン等の画像検査、心電図等の生理学的機能検査、関節液の検査、病理組織学的検査、眼底検査等により総合的に診断される。しかし、症状が多様であり、再燃を繰り返すなど、早期発見と再燃の予防は喫緊の課題である。 (Testing method for connective tissue disease)
Collagen disease is diagnosed according to the diagnostic criteria established by the Ministry of Health, Labor and Welfare. Specifically, it is comprehensively diagnosed by a blood test, a urine test, an image test such as an X-ray, a physiological function test such as an electrocardiogram, a joint fluid test, a histopathological test, an eye fundus test, and the like. However, the symptoms are diverse and relapses occur repeatedly, so early detection and prevention of relapse are urgent issues.

本発明者らは、これまでに、心腎連関モデルマウスおよび多重染色を用いたフローサイトメトリーを用いて、単核球の一分画としてのPrecursors of fibroblastic cell (preFC：CD45⁺C1q⁺CCR8⁺cell)を同定した。preFCは、心・腎線維化の増悪とともに、心、腎および血中にて増加した。さらに健常人の末梢血にても同定が可能であり、腎機能の増悪に伴ってpreFCが増加することも示した(特許文献1)。しかし、preFCによる膠原病の判定方法は、開発されていない。 The present inventors have so far investigated precursors of fibroblastic cells (preFC: CD45 ⁺ C1q ⁺ CCR8 ⁺ cells) were identified. preFC increased in heart, kidney and blood with exacerbation of cardio-renal fibrosis. Furthermore, it was also shown that preFC can be identified in the peripheral blood of healthy subjects, and that preFC increases with exacerbation of renal function (Patent Document 1). However, a method for judging connective tissue disease by preFC has not been developed.

特開2016-148644号公報JP 2016-148644 A

本発明者らは、新規な膠原病判定方法を開発することを目的とした。 The present inventors aimed to develop a novel connective tissue disease determination method.

本発明者らは、腎機能が正常な被験者から得られた試料中からpreFC比が膠原病のマーカーになることを確認して、本発明の膠原病判定方法を完成した。 The present inventors confirmed that the preFC ratio in samples obtained from subjects with normal renal function serves as a marker for collagen disease, and completed the method for determining collagen disease of the present invention.

本発明は、以下を含む。
１．被験者から得られた試料中から以下のいずれか1以上の細胞を検出することを特徴とする膠原病判定方法。
（１）CD45⁺C1q⁺CCR8⁺細胞
（２）CD45⁺C1q⁺細胞
（３）C1q⁺CCR8⁺細胞
（４）CD45⁺CCR8⁺細胞
２．以下の細胞を検出することを特徴とする前項1に記載の膠原病判定方法。
（１）CD45⁺C1q⁺CCR8⁺Sca1⁺細胞
（２）CD45⁺C1q⁺Sca1⁺細胞
（３）C1q⁺CCR8⁺Sca1⁺細胞
（４）CD45⁺CCR8⁺Sca1⁺細胞
（５）CD45⁺Sca1⁺細胞
３．前記被験者から得られた試料中の細胞数または該試料中のCD45⁺細胞に対する前記（1）～（5）の細胞の割合が、健常者から得られた試料中の細胞数または該試料中のCD45⁺細胞に対する前記（1）～（5）の細胞の割合と比較して、高い場合には、膠原病であると判定することを特徴とする前項1または2に記載の膠原病判定方法。
４．前記膠原病は、全身性エリテマトーデス（Systemic lupus erythematosus;SLE）、関節リウマチ（Rheumatoidarthritis; RA）、全身性強皮症、皮膚筋炎、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、多発血管炎性肉芽腫症、高安動脈炎、強直性脊椎炎、成人スチル病または天疱瘡である前項1～3のいずれか1に記載の膠原病判定方法。
５．前記膠原病は、SLEである前項1～4のいずれか1に記載の膠原病判定方法。
６．前記膠原病は、RAである前項1～4のいずれか1に記載の膠原病判定方法。
７．以下のいずれか1以上の抗体を含む膠原病判定キット。
（１）抗CD45抗体
（２）抗C1q抗体
（３）抗CCR8抗体
（４）抗Sca1抗体 The present invention includes the following.
1. A method for determining connective tissue disease, which comprises detecting any one or more of the following cells from a sample obtained from a subject.
(1) CD45 ⁺ C1q ⁺ CCR8 ⁺ cells (2) CD45 ⁺ C1q ⁺ cells (3) C1q ⁺ CCR8 ⁺ cells (4) CD45 ⁺ CCR8 ⁺ cells 2. 2. The connective tissue disease determination method according to the preceding item 1, wherein the following cells are detected.
(1) CD45 ⁺ C1q ⁺ CCR8 ⁺ Sca1 ⁺ cells (2) CD45 ⁺ C1q ⁺ Sca1 ⁺ cells (3) C1q ⁺ CCR8 ⁺ Sca1 ⁺ cells (4) CD45 ⁺ CCR8 ⁺ Sca1 ⁺ cells (5) CD45 ⁺ Sca1 ⁺ cells 3. The number of cells in the sample obtained from the subject or the ratio of the cells of (1) to (5) to the CD45 ⁺ cells in the sample is the number of cells in the sample obtained from a healthy subject or the number of cells in the sample 3. The collagen disease determination method according to the preceding item 1 or 2, wherein the collagen disease is determined when the ratio of the cells (1) to (5) to the CD45 ⁺ cells is higher than that of the CD45 + cells.
4. The collagen diseases include systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA), systemic sclerosis, dermatomyositis, eosinophilic granulomatosis with polyangiitis, and granulomatous polyangiitis. 4. The collagen disease determination method according to any one of the preceding items 1 to 3, wherein the disease is tumor, Takayasu's arteritis, ankylosing spondylitis, adult Still's disease, or pemphigus.
5. 5. The collagen disease determination method according to any one of the preceding items 1 to 4, wherein the collagen disease is SLE.
6. 5. The connective tissue disease determination method according to any one of the preceding items 1 to 4, wherein the connective tissue disease is RA.
7. A connective tissue disease determination kit containing any one or more of the following antibodies.
(1) Anti-CD45 antibody (2) Anti-C1q antibody (3) Anti-CCR8 antibody (4) Anti-Sca1 antibody

本発明の膠原病判定方法は、膠原病を判定する高感度、迅速、および簡便な方法である。 The method for determining connective tissue disease of the present invention is a highly sensitive, rapid, and convenient method for determining connective tissue disease.

SLE症例における陽性細胞の分類結果。SSC-Aは側方散乱光であり細胞の大きさを反映し、FSC-Aは前方散乱光であり細胞の形態および細胞内部構造に関する情報を反映する。CD45、C1qa、CCR8は、それらの検出強度を示す。上下段共に、左図の囲み線は血液試料中の単核細胞を含む細胞の選択を示し、中央図の囲み線は前記細胞中のCD45陽性（CD45⁺）単核細胞の選択を示し、右図はCD45⁺単核細胞中のC1qaおよびCCR8の検出強度を示す。右図において、四分割された領域のうち、右上の領域はpreFCの存在を示す。Classification results of positive cells in SLE cases. SSC-A is side scatter and reflects cell size, and FSC-A is forward scatter and reflects information about cell morphology and cell internal structure. CD45, C1qa, CCR8 show their detection intensities. In both the upper and lower panels, the boxed line in the left panel indicates the selection of cells containing mononuclear cells in the blood sample, the boxed line in the middle panel indicates the selection of CD45-positive (CD45 ⁺ ) mononuclear cells in the cells, and the right panel. The figure shows the detection intensity of C1qa and CCR8 in CD45 ⁺ mononuclear cells. In the right figure, the upper right region of the quadrants indicates the presence of preFC. RA症例における陽性細胞の分類結果。Classification results of positive cells in RA cases. SLE症例およびRA症例と健常者とにおけるpreFC/CD45⁺単核細胞の割合（preFC比）の比較。Comparison of the ratio of preFC/CD45 ⁺ mononuclear cells (preFC ratio) between SLE and RA cases and healthy subjects. SLE症例およびRA症例以外の膠原病症例における陽性細胞の分類結果。縦軸はC1qaの検出強度、横軸はCCR8の検出強度を示す。各図中、四分割された領域のうち、右上の領域はpreFCの存在を示す。Classification results of positive cells in connective tissue disease cases other than SLE and RA cases. The vertical axis indicates the detection intensity of C1qa, and the horizontal axis indicates the detection intensity of CCR8. In each figure, of the quadrants, the upper right region indicates the presence of preFC. SLE症例におけるpreFC比と既存マーカーとの比較。Comparison of preFC ratio and existing markers in SLE cases. RA症例におけるpreFC比と既存マーカーとの比較。Comparison of preFC ratio and existing markers in RA cases.

（本発明の膠原病判定方法）
本発明の膠原病判定方法（膠原病判定の補助方法、膠原病診断方法、膠原病診断方法の補助方法、膠原病の存在の検出方法も含む）は、被験者から得られた試料中から以下のいずれか1以上の細胞（各陽性細胞）を検出することを特徴とする。
（1）CD45⁺C1q⁺CCR8⁺細胞（細胞表面にCD45抗原、C1q抗原およびCCR8抗原が発現している細胞）
（2）CD45⁺C1q⁺細胞（細胞表面にCD45抗原およびC1q抗原が発現している細胞）
（3）C1q⁺CCR8⁺細胞（細胞表面にC1q抗原およびCCR8抗原が発現している細胞）
（4）CD45⁺CCR8⁺細胞（細胞表面にCD45抗原およびCCR8抗原が発現している細胞）
（5）CD45⁺C1q⁺CCR8⁺Sca1⁺細胞（細胞表面にCD45抗原、C1q抗原、CCR8抗原およびSca1抗原が発現している細胞）
（6）CD45⁺C1q⁺Sca1⁺細胞（細胞表面にCD45抗原、C1q抗原およびSca1抗原が発現している細胞）
（7）C1q⁺CCR8⁺Sca1⁺細胞（細胞表面にC1q抗原、CCR8抗原およびSca1抗原が発現している細胞）
（8）CD45⁺CCR8⁺Sca1⁺細胞（細胞表面にCD45抗原、CCR8抗原およびSca1抗原が発現している細胞）
（9）CD45⁺Sca1⁺細胞（細胞表面にCD45抗原およびSca1抗原が発現している細胞）
なお、CD45は、分子量約115kDの糖タンパク質である。Sca1は、グルコシルホスファチジールイノシトールに結合するLy（lymphocyteactivation protein）-6に属する細胞表面タンパク質である。C1qは、補体の一種である。C1qには、C1qa、C1qb、C1qcのサブクラスが存在するが、いずれのサブクラスでもよい。CCR8は、ケモカイン(C-C)レセプター８タンパク質を意味する。
上記した各種細胞の表面に発現している抗原は、各抗原に対する抗体（ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体のいずれでもよい）により、容易に検出することができる。なお、すべての抗原に対する抗体は、市販品の抗体が存在するので、当業者なら容易に入手可能である。 (Method for Determining Collagen Disease of the Present Invention)
The connective disease determination method of the present invention (including a connective disease determination assisting method, a connective disease diagnostic method, a connective tissue disease diagnostic method assisting method, and a connective tissue disease detection method) is performed from a sample obtained from a subject as follows. It is characterized by detecting any one or more cells (each positive cell).
(1) CD45 ⁺ C1q ⁺ CCR8 ⁺ cells (cells expressing CD45, C1q and CCR8 antigens on the cell surface)
(2) CD45 ⁺ C1q ⁺ cells (cells expressing CD45 and C1q antigens on the cell surface)
(3) C1q ⁺ CCR8 ⁺ cells (cells expressing C1q and CCR8 antigens on the cell surface)
(4) CD45 ⁺ CCR8 ⁺ cells (cells expressing CD45 and CCR8 antigens on the cell surface)
(5) CD45 ⁺ C1q ⁺ CCR8 ⁺ Sca1 ⁺ cells (cells expressing CD45, C1q, CCR8 and Sca1 antigens on their surface)
(6) CD45 ⁺ C1q ⁺ Sca1 ⁺ cells (cells expressing CD45 antigen, C1q antigen and Sca1 antigen on the cell surface)
(7) C1q ⁺ CCR8 ⁺ Sca1 ⁺ cells (cells expressing C1q antigen, CCR8 antigen and Sca1 antigen on the cell surface)
(8) CD45 ⁺ CCR8 ⁺ Sca1 ⁺ cells (cells expressing CD45, CCR8 and Sca1 antigens on the cell surface)
(9) CD45 ⁺ Sca1 ⁺ cells (cells expressing CD45 and Sca1 antigens on the cell surface)
CD45 is a glycoprotein with a molecular weight of approximately 115 kD. Sca1 is a cell surface protein belonging to Ly (lymphocyteactivation protein)-6 that binds glucosylphosphatidylinositol. C1q is a type of complement. C1q has subclasses C1qa, C1qb, and C1qc, and any subclass may be used. CCR8 means chemokine (CC) receptor 8 protein.
Antigens expressed on the surfaces of the various cells described above can be easily detected using antibodies against each antigen (both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies). Antibodies against all antigens are commercially available and can be easily obtained by those skilled in the art.

（被験者）
本発明の被験者は、哺乳類であれば特に限定されないが、例えば、ヒト、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ラット、ウサギ、フェレット、スンクス、ヒツジ、ロバ、ブタ等を例示することができ、特に腎機能が正常なヒト、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ラット、ウサギ、フェレット、スンクス、ヒツジ、ロバ、ブタ等である。 (subject)
Subjects of the present invention are not particularly limited as long as they are mammals. In particular, humans with normal renal function, mice, cats, dogs, horses, cows, rats, rabbits, ferrets, sunks, sheep, donkeys, pigs, and the like.

（腎機能）
本発明において「腎機能が正常」（正常腎機能）とは、eGFR値（推算糸球体濾過量）が６０ml/min/1.73m³以上をいう。 (Renal function)
In the present invention, "normal renal function" (normal renal function) means an eGFR value (estimated glomerular filtration rate) of 60 ml/min/1.73 m ³ or more.

（試料）
本発明の試料は、被験者から採取され、かつ、CD45⁺細胞、C1q⁺細胞およびCCR8⁺細胞のいずれか1以上、2以上または3つが存在していれば特に限定されないが、血液、リンパ液、髄液、骨髄液、唾液、尿、関節液、胸水、腹水、涙液、眼房水、硝子体液、鼻腔液、母乳、精液、前立腺液、膣液、膵液、胆汁、汗、膿、気管支洗浄液、生検サンプル（胃粘膜、大腸粘膜、気管支粘膜、皮膚、筋肉、腫瘍、リンパ節、子宮粘膜）、解剖検体（病理組織、法医学的組織）等を例示することができ、好ましくは、血液、リンパ液、髄液、唾液、気管支洗浄液、骨髄液、および生検サンプルである。 (sample)
The sample of the present invention is not particularly limited as long as it is collected from a subject and contains any one or more, two or more, or three of CD45 ⁺ cells, C1q ⁺ cells and CCR8 ⁺ cells. Fluid, bone marrow fluid, saliva, urine, synovial fluid, pleural fluid, ascitic fluid, tears, aqueous humor, vitreous humor, nasal fluid, breast milk, semen, prostatic fluid, vaginal fluid, pancreatic fluid, bile, sweat, pus, bronchial washings, Examples include biopsy samples (gastric mucosa, colon mucosa, bronchial mucosa, skin, muscle, tumor, lymph node, uterine mucosa), autopsy specimens (pathological tissue, forensic tissue), etc., preferably blood and lymph. , cerebrospinal fluid, saliva, bronchial lavage fluid, bone marrow fluid, and biopsy samples.

（各陽性細胞の検出方法）
本発明の膠原病判定方法は、試料中の各陽性細胞を検出することができれば、特に限定されないが、好ましくはフローサイトメトリーで行うことができる。フローサイトメトリーを用いて各陽性細胞の蛍光発光を検出・測定する場合、各抗原を特異的に認識可能な各種抗体は、蛍光標識物質で標識した標識抗体として使用することが好ましい。本発明で用いる蛍光標識物質の種類は、フローサイトメトリーで検出できるものであれば特に限定されず、例えば、フィコエリスリン、FITC等を例示することができる。 (Method for detecting each positive cell)
The connective tissue disease determination method of the present invention is not particularly limited as long as each positive cell in a sample can be detected, but flow cytometry is preferably used. When detecting and measuring the fluorescence emission of each positive cell using flow cytometry, various antibodies that can specifically recognize each antigen are preferably used as labeled antibodies labeled with fluorescent labeling substances. The type of fluorescent labeling substance used in the present invention is not particularly limited as long as it can be detected by flow cytometry, and examples thereof include phycoerythrin and FITC.

（指標）
本発明の「指標（Cut off（カットオフ）値）」とは、膠原病の患者と健常者を区別するための試料中の各陽性細胞数またはCD45⁺単核細胞中の各陽性細胞の割合（%）を意味する。例えば、被験者の試料中の各陽性細胞が、予め設定した試料中の各陽性細胞数以上の場合には、膠原病が発症している、進行している、重篤である、および/または今後の発症の可能性が高いと判定することができる。また、被験者の試料中のCD45⁺単核細胞中の各陽性細胞の割合（%）が、予め設定した試料中のCD45⁺単核細胞中の各陽性細胞の割合（%）以上の場合には、膠原病が発症している、進行している、重篤である、および/または今後の発症の可能性が高いと判定することができる。
Cut off値の設定方法としては、膠原病ではない被験者の試料中の各陽性細胞数の平均値から算出する。通常、予め決定した膠原病ではない被験者（健常者）の試料中の各陽性細胞数の平均値（または、CD45⁺単核細胞中の各陽性細胞の割合の平均値）の標準偏差の90%以下、好ましくは80%以下、より好ましくは70%以下、さらに好ましくは60%以下、最も好ましくは50%以下の範囲の細胞数を指標とする。
また、別の指標の設定方法として、被験者の試料中の各陽性細胞数が、膠原病ではない被験者の試料中の各陽性細胞数の平均値に対して、105%以上、110%以上、120%以上、130%以上、140%以上、150%以上、180%以上、200%以上、250%以上、300%以上、400%以上、 500%以上、600%以上、700%以上、800%以上、900%以上または1000%以上の場合には、膠原病が発症している、進行している、重篤である、および/または今後の発症の可能性が高いと判定することができる。
また、別の指標の設定方法として、被験者の試料中のCD45⁺単核陽性細胞中の各陽性細胞の割合が、0.1%以上、0.2%以上、0.21%-0.59%以上、0.3%以上、0.4%以上、0.5%以上、0.6%以上、0.7%以上、0.8%以上、0.9%以上、1.0%以上、1.1%以上、1.2%以上、1.3%以上、1.4%以上、1.5%以上、1.6%以上、1.7%以上、1.8%以上、1.9%以上、2.0%以上、2.1%以上、2.2%以上、2.3%以上、2.4%以上、2.5%以上、2.6%以上、2.7%以上、2.8%以上、2.9%以上、3.0%以上、3.1%以上、3.2%以上、3.3%以上、3.4%以上、3.5%以上、3.6%以上、3.7%以上、3.9%以上、4.0%以上、4.5%以上、5.0%以上、5.5%以上、6.0%以上、6.5%以上、7.0%以上、7.5%以上、または、8.0%以上の場合には、膠原病が発症している、進行している、重篤である、および/または今後の発症の可能性が高いと判定することができる。なお。これらの数値の上限値は、特に限定されないが、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0%、40.0%、50.0%、60.0%、70.0%、80.0%、90.0%または95.0%である。
さらに、別のcut off値の設定方法としては、予め膠原病であることを確認している患者および膠原病ではない被験者において、試料中の各陽性細胞数を測定して得られた値に基づき、市販の統計解析ソフトを使用してROC(Receiver Operating Characteristic)曲線を作成し、最適な感度および特異度を求める。例えば、一次スクリーニング等の目的では感度が高い方を優先し、精査目的では特異度が高くなるようなcut off値を設定することが可能である。 (index)
The "index (Cutoff value)" of the present invention is the number of positive cells in a sample or the ratio of positive cells in CD45 ⁺ mononuclear cells for distinguishing between collagen disease patients and healthy subjects. (%). For example, if each positive cell in the sample of the subject is equal to or greater than the number of each positive cell in the preset sample, collagen disease is developing, progressing, serious, and / or in the future It can be determined that there is a high possibility of the onset of In addition, if the ratio (%) of each positive cell among the CD45 ⁺ mononuclear cells in the subject's sample is equal to or higher than the ratio (%) of each positive cell among the CD45 ⁺ mononuclear cells in the preset sample , it can be determined that collagen disease is developing, progressing, serious, and/or likely to develop in the future.
As a method for setting the cutoff value, it is calculated from the average value of the number of positive cells in samples from subjects who do not have connective tissue disease. Usually 90% of the standard deviation of the mean number of each positive cell (or the mean percentage of each positive cell among CD45 ⁺ mononuclear cells) in a sample from subjects without collagen disease (healthy subjects) determined in advance Below, the number of cells in the range of preferably 80% or less, more preferably 70% or less, even more preferably 60% or less, and most preferably 50% or less is used as an index.
In addition, as another index setting method, the number of each positive cell in the sample of the subject is 105% or more, 110% or more, 120 % or more, 130% or more, 140% or more, 150% or more, 180% or more, 200% or more, 250% or more, 300% or more, 400% or more, 500% or more, 600% or more, 700% or more, 800% or more , 900% or more, or 1000% or more, it can be determined that collagen disease is developing, progressing, serious, and/or likely to develop in the future.
In addition, as another index setting method, the ratio of each positive cell among the CD45 ⁺ mononuclear positive cells in the subject's sample is 0.1% or more, 0.2% or more, 0.21%-0.59% or more, 0.3% or more, 0.4 % or more, 0.5% or more, 0.6% or more, 0.7% or more, 0.8% or more, 0.9% or more, 1.0% or more, 1.1% or more, 1.2% or more, 1.3% or more, 1.4% or more, 1.5% or more, 1.6% or more , 1.7% or more, 1.8% or more, 1.9% or more, 2.0% or more, 2.1% or more, 2.2% or more, 2.3% or more, 2.4% or more, 2.5% or more, 2.6% or more, 2.7% or more, 2.8% or more, 2.9 % or more, 3.0% or more, 3.1% or more, 3.2% or more, 3.3% or more, 3.4% or more, 3.5% or more, 3.6% or more, 3.7% or more, 3.9% or more, 4.0% or more, 4.5% or more, 5.0% or more , 5.5% or more, 6.0% or more, 6.5% or more, 7.0% or more, 7.5% or more, or 8.0% or more, collagen disease is developing, progressing, serious, and / Or it can be determined that the possibility of future onset is high. note that. The upper limits of these figures are not particularly limited, but are 1.0%, 5.0%, 10.0%, 20.0%, 30.0%, 40.0%, 50.0%, 60.0%, 70.0%, 80.0%, 90.0% or 95.0%. .
In addition, another cut-off value setting method is based on the value obtained by measuring the number of positive cells in the sample in patients who have been confirmed to have collagen disease in advance and subjects who do not have collagen disease. , generate ROC (Receiver Operating Characteristic) curves using commercially available statistical analysis software to determine optimal sensitivity and specificity. For example, it is possible to set a cut-off value that gives priority to the one with higher sensitivity for the purpose of primary screening or the like, and that increases the specificity for the purpose of close examination.

（膠原病の種類）
本発明の膠原病判定方法で判定可能な膠原病は、特に限定されないが、例えば、SLE、RA、全身性強皮症、皮膚筋炎、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、多発血管炎性肉芽腫症、高安動脈炎、強直性脊椎炎、成人スチル病および天疱瘡等である。 (Types of connective tissue disease)
Collagen diseases that can be determined by the method for determining collagen diseases of the present invention are not particularly limited. granulomatosis, Takayasu's arteritis, ankylosing spondylitis, adult Still's disease and pemphigus.

（試料中の各陽性細胞の検出方法）
本発明の膠原病判定方法における試料中の各陽性細胞の検出方法の工程を下記に例示するが特に限定されない。
（1）被験者から血液（全血）を取得する。
（2）取得した血液を緩衝液で希釈する。
（3）希釈した血液を、市販の蛍光したCD45抗体（APC-Cy7）、C1q抗体（APC）およびCCR8抗体（PE）｛必要に応じてさらにSca1抗体（V450）｝を用いてフローサイトメトリーにより各陽性細胞の蛍光発光を検出・測定する。APC-Cy7、APC、PE、V450などの蛍光色素は、解析方法としてその他のものと置き換えることができる。
（4）測定した各陽性細胞数またはCD45⁺単核細胞中の各陽性細胞の割合（%）を、cut off値と比較して、膠原病を判定する。 (Method for detecting each positive cell in sample)
The steps of the method for detecting each positive cell in a sample in the connective tissue disease determination method of the present invention are illustrated below, but are not particularly limited.
(1) Obtain blood (whole blood) from a subject.
(2) dilute the obtained blood with a buffer;
(3) Diluted blood was analyzed by flow cytometry using commercially available fluorescent CD45 antibody (APC-Cy7), C1q antibody (APC) and CCR8 antibody (PE) {optionally additionally Sca1 antibody (V450)}. Detect and measure the fluorescence emission of each positive cell. Fluorescent dyes such as APC-Cy7, APC, PE, V450 can be substituted for others as analytical methods.
(4) The number of each positive cell measured or the ratio (%) of each positive cell in CD45 ⁺ mononuclear cells is compared with the cutoff value to determine connective tissue disease.

（膠原病判定キット）
本発明の膠原病判定キットは、CD45⁺C1q⁺CCR8⁺細胞、CD45⁺C1q⁺細胞、C1q⁺CCR8⁺細胞、CD45⁺CCR8⁺細胞、CD45⁺C1q⁺CCR8⁺Sca1⁺細胞、CD45⁺C1q⁺Sca1⁺細胞、C1q⁺CCR8⁺Sca1⁺細胞、CD45⁺CCR8⁺Sca1⁺細胞、および/またはCD45⁺Sca1⁺細胞を被験者から得られた試料中から検出するために必要な構成を含む。
例えば、本発明の膠原病判定キットは、下記のようないずれか1以上の抗体を含む。
（１）抗CD45抗体
（２）抗C1qa抗体
（３）抗CCR8抗体
（４）抗Sca1抗体
なお、上記すべての抗体は、自体公知の市販品でもよりが、各抗原を標的として作製したモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でもよい。 (Connective tissue disease determination kit)
The collagen disease determination kit of the present invention includes CD45 ⁺ C1q ⁺ CCR8 ⁺ cells, CD45 ⁺ C1q ⁺ cells, C1q ⁺ CCR8 ⁺ cells, CD45 ⁺ CCR8 ⁺ cells, CD45 ⁺ C1q ⁺ CCR8 ⁺ Sca1 ⁺ cells, CD45 ⁺ C1q ⁺ Sca1 ⁺ cells, C1q ⁺ CCR8 ⁺ Sca1 ⁺ cells, CD45 ⁺ CCR8 ⁺ Sca1 ⁺ cells, and/or CD45 ⁺ Sca1 ⁺ cells in a sample obtained from a subject.
For example, the connective tissue disease determination kit of the present invention contains any one or more of the following antibodies.
(1) Anti-CD45 antibody (2) Anti-C1qa antibody (3) Anti-CCR8 antibody (4) Anti-Sca1 antibody All of the above antibodies are commercially available monoclonal antibodies that target each antigen. Alternatively, it may be a polyclonal antibody.

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。なお、すべての実施例は、金沢大学ヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会で承認済である。 EXAMPLES The present invention will be described in detail below with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited by these Examples. All examples have been approved by the Kanazawa University Human Genome/Gene Analysis Research Ethics Committee.

（膠原病マーカーの確認）
各種膠原病症例においてpreFCが検出可能かを、フローサイトメトリー法（使用装置： FACSAria^TM Fusion、BectonDickinson社製）にて評価した。
使用した抗体は、抗CD45抗体（Affymetrix社製）、抗C1q（C1qa）抗体（Abcam社製）、抗CCR8抗体（BioLegend社製）である。
膠原病症例として、SLE症例、RA症例、全身性強皮症、皮膚筋炎、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、多発血管炎性肉芽腫症、高安動脈炎、強直性脊椎炎、成人スチル病および天疱瘡の男女を含む患者で評価した。また、対照として男女を含む健常者でも評価した。 (Confirmation of connective tissue disease markers)
Whether or not preFC can be detected in various collagen disease cases was evaluated by flow cytometry (equipment used: FACSAria ^™ Fusion, manufactured by Becton Dickinson).
Anti-CD45 antibody (manufactured by Affymetrix), anti-C1q (C1qa) antibody (manufactured by Abcam), and anti-CCR8 antibody (manufactured by BioLegend) were used.
Collagen disease cases include SLE, RA, systemic sclerosis, dermatomyositis, eosinophilic granulomatosis with polyangiitis, granulomatosis with polyangiitis, Takayasu's arteritis, ankylosing spondylitis, and adults. Patients, including men and women with Still's disease and pemphigus, were evaluated. In addition, healthy subjects, including both men and women, were also evaluated as controls.

（SLE症例における膠原病マーカー評価）
腎機能が正常なSLE症例（n = 5）および対照健常者（n = 9）より得た血液試料を用いて、フローサイトメトリー法にて検討を行った。
preFCは、健常者と比較して、SLE症例で増加した（参照：図1）。preFC比は、健常者では平均値 0.33% (上限値 0.59%、下限値 0.21%)であったのに対し、SLE症例では平均値 5.8% (上限値 9.7%、下限値 1.8%)であり、十分な有意差があり、preFC比が、膠原病、特にSLE症例のマーカーとなることを確認した（参照：図3）。 (Evaluation of collagen disease markers in SLE cases)
Blood samples obtained from SLE cases with normal renal function (n = 5) and healthy controls (n = 9) were analyzed by flow cytometry.
preFC was increased in SLE cases compared to healthy subjects (see Figure 1). The mean preFC ratio was 0.33% (upper limit 0.59%, lower limit 0.21%) in healthy subjects, while the mean value in SLE patients was 5.8% (upper limit 9.7%, lower limit 1.8%). There was a sufficiently significant difference, confirming that the preFC ratio serves as a marker for collagen disease, especially for SLE cases (see Figure 3).

（RA症例における膠原病マーカー評価）
腎機能が正常なRA症例（n = 21）および対照健常者（n = 9）より得た血液試料を用いて、フローサイトメトリー法にて検討を行った。
preFCは、健常者と比較して、RA症例で増加した（参照：図2）。preFC比は、健常者では平均値 0.33% (上限値 0.59%、下限値 0.21%)であったのに対し、RA症例では平均値 2.9% (上限値 7.0%、下限値 0.28%)であり、十分な有意差があり、preFC比が、膠原病、特にRA症例のマーカーとなることを確認した（参照：図3）。 (Evaluation of collagen disease markers in RA cases)
Blood samples obtained from RA cases with normal renal function (n = 21) and healthy controls (n = 9) were analyzed by flow cytometry.
preFC was increased in RA cases compared to healthy subjects (see Figure 2). The mean preFC ratio was 0.33% (upper limit 0.59%, lower limit 0.21%) in healthy subjects, whereas the average value in RA cases was 2.9% (upper limit 7.0%, lower limit 0.28%). There was a sufficiently significant difference, confirming that the preFC ratio serves as a marker for connective tissue disease, especially in RA cases (see Figure 3).

（SLE症例およびRA症例以外での膠原病マーカー評価）
腎機能が正常な以下の膠原病症例および対照健常者より得た血液試料を用いて、フローサイトメトリー法にて検討を行った。
膠原病症例：全身性強皮症、皮膚筋炎、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、多発血管炎性肉芽腫症、高安動脈炎、強直性脊椎炎、成人スチル病および天疱瘡。
preFCは、健常者と比較して、上記全ての症例で増加した。preFC比は、健常者では平均値 0.33% (上限値 0.59%、下限値 0.21%)であったのに対し、上記全ての膠原病症例で上昇した。より詳しくは、全身性強皮症 2.9%、皮膚筋炎 1.9%、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症 3.1%、多発血管炎性肉芽腫症 2.3%、高安動脈炎 4.3%、強直性脊椎炎 1.4%、成人スチル病 3.1%および天疱瘡 3.8%であった（参照：図4）。よって、preFC比が、上記の膠原病症例のマーカーとなることを確認した。 (Evaluation of collagen disease markers in cases other than SLE and RA cases)
Using the blood samples obtained from the following collagen disease cases and healthy control subjects with normal renal function, we performed an examination by flow cytometry.
Collagen disease cases: systemic sclerosis, dermatomyositis, eosinophilic granulomatosis with polyangiitis, granulomatosis with polyangiitis, Takayasu's arteritis, ankylosing spondylitis, adult Still's disease and pemphigus.
preFC increased in all the above cases compared to healthy subjects. The preFC ratio was 0.33% on average (upper limit 0.59%, lower limit 0.21%) in healthy subjects, but increased in all collagen disease cases. More specifically, systemic sclerosis 2.9%, dermatomyositis 1.9%, eosinophilic granulomatosis polyangiitis 3.1%, granulomatosis polyangiitis 2.3%, Takayasu's arteritis 4.3%, ankylosing spine inflammation 1.4%, adult Still's disease 3.1% and pemphigus 3.8% (see Figure 4). Therefore, it was confirmed that the preFC ratio serves as a marker for the above collagen disease cases.

（本発明の判定方法と既存のマーカーとの比較）
膠原病症例において、preFC比および既存のマーカーの測定結果を比較した。膠原病症例として、SLE症例およびRA症例の男性および女性の患者で評価した。
使用した既存のマーカーは、以下の通りである。
CRP：高炎症状態で高値を示す一般的な炎症マーカーである。基準値（0.3 mg/dL）未満は正常である。
ESR 1hr：高炎症状態で高値を示す一般的な炎症マーカーである。基準値（男性 10 mm、女性 15 mm）以下は正常である。
CH50：血清中のC1～C9までの全ての補体成分の総合的な活性を表す指標（補体価）である。疾患活動性の高い症例で低値を示し、SLEの活動性マーカーになる。SLEでは基準値（32 U/mL－47 U/mL）以下となる。
抗ds-DNA抗体：疾患活動性の高い症例で高値を示すSLEの活動性マーカーである。基準値（12 IU/mL）未満は正常である。
MMP3（マトリックスメタロプロテアーゼ）：疾患活動性の高い症例で高値を示すRAの活動性マーカーである。RAでは基準値（男性 36.9 ng/mL-121 ng/mL、女性 17.3 ng/mL-59.7ng/mL）以上となる。
preFC比：実施例1で得た結果より、SLE、RAともに基準値（0.21%-0.59%）以上となる。 (Comparison between the determination method of the present invention and existing markers)
We compared the preFC ratio and the measurement results of existing markers in connective tissue disease cases. Male and female patients with SLE and RA were evaluated as connective tissue disease cases.
The existing markers used are as follows.
CRP: A general inflammatory marker that shows high levels in hyperinflammatory states. Below the reference value (0.3 mg/dL) is normal.
ESR 1hr: A general inflammatory marker that shows high values in high inflammatory conditions. Below the reference value (10 mm for men, 15 mm for women) is normal.
CH50: An index (complement value) representing the comprehensive activity of all complement components from C1 to C9 in serum. It shows low values in cases with high disease activity and can be used as a marker for SLE activity. In SLE, it is below the reference value (32 U/mL - 47 U/mL).
Anti-ds-DNA antibody: A marker of SLE activity that is elevated in cases of high disease activity. Below the reference value (12 IU/mL) is normal.
MMP3 (matrix metalloprotease): A marker of RA activity that is elevated in cases of high disease activity. RA is above the reference value (36.9 ng/mL-121 ng/mL for men, 17.3 ng/mL-59.7 ng/mL for women).
preFC ratio: From the results obtained in Example 1, both SLE and RA are above the standard values (0.21%-0.59%).

（SLE症例における比較）
腎機能が正常なSLE症例の男女より得た血液試料を用いた。CRPではSLE検出率が0%（0/4）であり、ESR 1hrではSLE検出率が25%（1/4）であり、CH50ではSLE検出率が0%（0/4）であり、抗ds-DNA抗体ではSLE検出率が25%（1/4）であった（参照：図5）。
一方、preFC比は全症例で基準値（0.21%-0.59%）を上回り、SLE陽性を示した。
すなわち、既存のマーカーでは、4症例中0または1症例で陽性と判定されたが、preFC比では、4症例中4症例で陽性と判定できた（参照：図5）。
よって、preFC比は、既存のマーカーと比較してより高感度に膠原病、特にSLE症例を判定できることを確認した。 (Comparison in SLE cases)
Blood samples obtained from male and female SLE cases with normal renal function were used. CRP had an SLE detection rate of 0% (0/4), ESR 1hr had an SLE detection rate of 25% (1/4), CH50 had an SLE detection rate of 0% (0/4), and The ds-DNA antibody had an SLE detection rate of 25% (1/4) (see Fig. 5).
On the other hand, the preFC ratio exceeded the standard value (0.21%-0.59%) in all cases, indicating SLE positive.
In other words, 0 or 1 out of 4 cases were positive for existing markers, but 4 out of 4 cases were positive for the preFC ratio (see Fig. 5).
Therefore, it was confirmed that the preFC ratio can determine connective tissue diseases, especially SLE cases, with higher sensitivity than existing markers.

（RA症例における比較）
腎機能が正常なRA症例の男女より得た血液試料を用いた。CRPではRA検出率が40%（6/15）であり、ESR 1hrではRA検出率が47%（7/15）であり、MMP3ではRA検出率が40%（6/15）であった（参照：図6）。
一方、preFC比は15症例中10症例で基準値（0.21%-0.59%）を上回り、陽性を示した。
すなわち、既存のマーカーでは、15症例中6または7症例で陽性と判定されたが、preFC比では、15症例中10症例で陽性と判定できた。
よって、preFC比は、既存のマーカーと比較してより高感度に膠原病、特にRA症例を判定できることを確認した。 (Comparison in RA cases)
Blood samples obtained from male and female RA cases with normal renal function were used. CRP had an RA detection rate of 40% (6/15), ESR 1hr had an RA detection rate of 47% (7/15), and MMP3 had an RA detection rate of 40% (6/15) ( See: Figure 6).
On the other hand, the preFC ratio exceeded the reference value (0.21%-0.59%) in 10 of the 15 cases, indicating positive.
In other words, 6 or 7 out of 15 cases were positive for existing markers, but 10 out of 15 cases were positive for the preFC ratio.
Therefore, it was confirmed that the preFC ratio can determine connective tissue disease, especially RA cases, with higher sensitivity than existing markers.

（総論）
以上の実施例の結果により、以下の各陽性細胞を被験者の試料中から検出することにより、膠原病を判定することができる。また、本発明の膠原病判定方法は、既存のマーカーと比較してより高感度に膠原病を判定できる。
（１）CD45⁺C1q⁺CCR8⁺細胞
（２）CD45⁺C1q⁺細胞
（３）C1q⁺CCR8⁺細胞
（４）CD45⁺CCR8⁺細胞 (general)
Based on the results of the above examples, connective tissue disease can be determined by detecting each of the following positive cells in a subject's sample. In addition, the connective tissue disease determination method of the present invention can determine connective tissue disease with higher sensitivity than existing markers.
(1) CD45 ⁺ C1q ⁺ CCR8 ⁺ cells (2) CD45 ⁺ C1q ⁺ cells (3) C1q ⁺ CCR8 ⁺ cells (4) CD45 ⁺ CCR8 ⁺ cells

本発明では、新規な膠原病判定方法を提供できる。また、正常腎機能の膠原病症例において、膠原病患者と健常者との有意差を確認できたことから、膠原病の病勢や治療反応性を示す新たな血液補助診断となりうる。さらに治療薬の開発といった臨床応用に繋がる可能性があり、医学的なメリットは大きい。 The present invention can provide a novel connective tissue disease determination method. In addition, in cases of connective tissue disease with normal renal function, we were able to confirm a significant difference between connective tissue disease patients and healthy subjects. Furthermore, there is a possibility that it will lead to clinical applications such as the development of therapeutic drugs, and the medical benefits are great.

Claims

A method for determining systemic lupus erythematosus (SLE), characterized by detecting CD45 ⁺ C1q ⁺ CCR8 ⁺ cells in a sample obtained from the blood of a subject.

The percentage of CD45 ^{+ C1q + CCR8 + cells in a sample obtained from the blood of said subject is higher than the percentage of CD45 +} ^{C1q +} ^{CCR8 +} ^cells ⁱⁿ ^a sample obtained from the blood of a healthy subject. 2. A method for determining according to claim 1, characterized in that it indicates SLE if it is.

Systemic lupus erythematosus determination kit containing the following antibodies.
(1) Anti-CD45 antibody
(2) Anti-C1q antibody
(3) Anti-CCR8 antibody