JP7124082B2 - Methods of screening palatability components for eel - Google Patents
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Description
本発明は、広く、ウナギのための嗜好性成分をスクリーニングする方法等に関する。 The present invention broadly relates to methods and the like for screening palatability components for eel.
ニホンウナギは年々漁獲高が減少傾向にあり、資源枯渇が危惧されており、２０１４年、ついに国際自然保護連合（ＩＵＣＮ）により絶滅危惧種の指定を受けた。長年完全養殖へむけた取り組みが行われているが、幼生時期を海で過ごすその生態については不明な点が多く、食性が不明であったなどの理由で、完全養殖に成功した今も、商業化ベースにのせるには程遠いという現状がある。 Japanese eel catches have been declining year by year, and there are concerns about resource depletion. Efforts have been made for many years to fully farm them, but there are many unknown points about their ecology, which spends their larval stage in the sea. There is a current situation that it is far from being put on the standardization base.
現在、ウナギの仔魚の餌としては、サメの卵を主体とし、大豆ペプチド、オキアミ分解物、及び／又はミネラル等を加えた餌が使われている。将来にわたってサメの卵を用いることは資源の面から考えても現実的ではない等の理由により、その代替物質の探索に関する研究が進められている。一方で、養殖飼料全体に目をむけると、嗜好性も重要な要素の一つと考えられている。嗜好性には物性、形状、サイズ、味など多様な要因を含む。 At present, eel larvae are fed mainly with shark eggs, to which soybean peptides, krill decomposition products and/or minerals are added. For reasons such as the fact that the use of shark eggs in the future is not realistic from the standpoint of resources, research on searching for substitutes for shark eggs is underway. On the other hand, palatability is also considered to be one of the important factors when looking at the whole culture feed. Palatability includes various factors such as physical properties, shape, size, and taste.
魚類は、一般的にＬ－アミノ酸に対して応答することが明らかになっている。味物質として感知している化学物質は、魚種によって異なることがわかっている。例えば、Ｌ－アミノ酸のうちのいずれに対する応答が強いかは魚種によって異なっており、味覚器の魚種間によるアミノ酸応答スペクトルの違いは種間の食性の違いを反映していると考えられている。近年、様々な動物種を対象とした味覚受容体の研究により、味覚受容体と食性には深い関係があることが示唆されている。 Fish have been shown to generally respond to L-amino acids. It is known that the chemical substances perceived as tastants differ depending on the fish species. For example, which of the L-amino acids has the strongest response differs depending on the fish species, and the difference in the amino acid response spectrum of the gustatory organs between fish species is thought to reflect the difference in eating habits between species. there is In recent years, research on taste receptors in various animal species has suggested that there is a close relationship between taste receptors and food habits.
脊椎動物において、甘味・旨味物質は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）であるＴ１Ｒファミリーの分子で、苦味物質はＴ２Ｒファミリーの分子で受容されることがわかっている。Ｔ１ＲファミリーはＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３の３つの分子種からなり、哺乳類ではＴ１Ｒ１＋Ｔ１Ｒ３のヘテロ二量体でＬ－アミノ酸等の旨味物質を、Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３のヘテロ二量体で糖及び人工甘味料等の甘味物質を受容する。一部の味細胞ではＴ１Ｒ３のみが発現し、高濃度の糖を受容することが知られている。一方、魚類ではＴ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３もＬ－アミノ酸の受容体として機能していることが明らかになってきている（Ｏｉｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， ２００７）。また、特開２００６－２０４２１４号公報には、メダカのＴ１Ｒ２とＴ１Ｒ３に相当すると思われる配列が開示されており、これらがアミノ酸の嗜好に関わることも記載されている。 In vertebrates, it is known that sweet and umami tastants are receptors of the T1R family of G protein-coupled receptors (GPCRs), and bitter tastants are receptors of the T2R family of receptors. The T1R family consists of three molecular species, T1R1, T1R2 and T1R3. In mammals, the T1R1+T1R3 heterodimer produces umami substances such as L-amino acids, and the T1R2+T1R3 heterodimer produces sweet substances such as sugars and artificial sweeteners. accept. It is known that some taste cells express only T1R3 and accept high concentrations of sugar. On the other hand, it has been revealed that T1R2+T1R3 also functions as an L-amino acid receptor in fish (Oike et al., J. Neurosci., 2007). In addition, JP-A-2006-204214 discloses sequences thought to correspond to T1R2 and T1R3 of medaka, and also describes that these are involved in amino acid preferences.
味覚受容体と食性には深い関係があるものの、両者の関係は複雑である。上述のとおり、哺乳類では、Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３が甘味受容体として機能するが、鳥類など一部の動物ではＴ１Ｒ２がないものの、甘味を知覚できないという推測はできず、花の蜜（甘味）を受容するハチドリではＴ１Ｒ１＋Ｔ１Ｒ３で甘味を受容することが明らかになっている（Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０１４）。 Although taste receptors and eating habits are closely related, the relationship between the two is complicated. As mentioned above, in mammals, T1R2 + T1R3 function as sweet receptors, but it cannot be assumed that some animals such as birds do not have T1R2, but cannot perceive sweetness. It has been shown that sweet taste is received at T1R1+T1R3 (Baldwin et al., Science, 2014).
上記事情に鑑みて、本発明は、ウナギのための嗜好性成分をスクリーニングするための新規方法、及びスクリーニングされた該嗜好性成分を含むウナギのための飼料を提供することを目的とする。 In view of the above circumstances, an object of the present invention is to provide a novel method for screening palatability components for eels and feed for eels containing the screened palatability components.
本発明者らは、味覚受容体Ｔ１Ｒ２ファミリーのいずれか一つのメンバーとＴ１Ｒ３ファミリーのいずれか一つのメンバーとから成るヘテロ二量体が、ウナギのための嗜好性成分の刺激に対して応答することを見出し、本発明を完成させるに至った。 The present inventors have demonstrated that a heterodimer consisting of any one member of the taste receptor T1R2 family and any one member of the T1R3 family responds to stimulation of palatability components for eel. and completed the present invention.
即ち、本願は以下の発明を包含する。
［１］ウナギのための嗜好性成分をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ウナギ由来の味覚受容体Ｔ１Ｒ２ファミリーのいずれか一つのメンバーとＴ１Ｒ３ファミリーのいずれか一つのメンバーとから成るヘテロ二量体と、嗜好性成分の候補物質とを接触させる工程、及び
（ｂ）ヘテロ二量体の活性を増大させる候補物質を嗜好性成分と評価する工程、を含む、方法。
［２］ヘテロ二量体がＧタンパク質αサブユニットと共役している、［１］に記載の方法。
［３］Ｇタンパク質αサブユニットが、Ｇα１５又はＧα１６単独であるか、あるいはＧα１５又はＧα１６のＣ末端５残基、２５残基又は４４残基が、Ｇｉ、Ｇｑ又はＧｓのファミリーに属するメンバーの対応するＣ末端残基で置換されているキメラタンパク質である、［２］に記載の方法。
［４］Ｔ１Ｒ２ファミリーのメンバーが、（ａ１）～（ａ６）から成る群から選ばれるタンパク質である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法：
（ａ１）配列番号１、３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列から成るタンパク質；
（ａ２）配列番号２、４、６、８又は１０に記載の塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ａ３）配列番号１、３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ａ４）配列番号２、４、６、８又は１０に記載の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ａ５）配列番号１、３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；あるいは
（ａ６）配列番号２、４、６、８又は１０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質。
［５］Ｔ１Ｒ２ファミリーのメンバーが、ＡｊＴ１Ｒ２ａ、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－２、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－３及びＡｊＴ１Ｒ２ｂ－４から成る群から選択される、
［４］に記載の方法。
［６］Ｔ１Ｒ３ファミリーのメンバーが（ｂ１）～（ｂ６）から成る群から選ばれるタンパク質である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法：
（ｂ１）配列番号１１に記載のアミノ酸配列から成るタンパク質；
（ｂ２）配列番号１２に記載の塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ３）配列番号１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ｂ４）配列番号１２に記載の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ｂ５）配列番号１１に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；あるいは
（ｂ６）配列番号１２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質。
［７］Ｔ１Ｒ３ファミリーのメンバーがＡｊＴ１Ｒ３である、［６］に記載の方法。
［８］活性がカルシウム感受性の発光タンパク質を用いて測定される、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］発光タンパク質がイクオリンである、［８］に記載の方法。
［１０］［１］～［９］のいずれかに記載の方法を用いてスクリーニングされた嗜好性成分を含む、ウナギのための飼料。
［１１］嗜好性成分としてクレアチニン、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン及びサルコシンのうちの１つ以上を含む、ウナギのための飼料。
［１２］ウナギがニホンウナギ（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃａ）又はヨーロッパウナギ（Ａ．ａｎｇｕｉｌｌａ）、インドネシアウナギ（Ａ．ｂｉｃｏｌｏｒ ｂｉｃｏｌｏｒ）、又はニューギニアウナギ（Ａ．ｂｉｃｏｌｏｒ ｐａｃｉｆｉｃａ）である、［１１］に記載の飼料。
［１３］仔魚用、稚魚用、未成魚用又は成魚用である、［１０］～［１２］のいずれかに記載の飼料。That is, the present application includes the following inventions.
[1] A method for screening palatability components for eel, comprising:
(a) a step of contacting a heterodimer consisting of any one member of the eel-derived taste receptor T1R2 family and any one member of the T1R3 family with a candidate palatability component, and (b) ) evaluating a candidate substance that increases the activity of the heterodimer as a palatability component.
[2] The method of [1], wherein the heterodimer is conjugated to the G protein α subunit.
[3] The G protein α subunit is Gα15 or Gα16 alone, or the C-
[4] The method of any one of [1] to [3], wherein the T1R2 family member is a protein selected from the group consisting of (a1) to (a6):
(a1) a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9;
(a2) a protein encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10;
(a3) A protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9, the protein responding to L-amino acids;
(a4) A protein encoded by a gene comprising a nucleotide sequence having 80% or more identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10, the protein responding to L-amino acids;
(a5) A protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9 are deleted, substituted and/or added, and which responds to L-amino acids or (a6) a protein encoded by a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10, wherein the protein is responsive to L-amino acids protein.
[5] the member of the T1R2 family is selected from the group consisting of AjT1R2a, AjT1R2b-1, AjT1R2b-2, AjT1R2b-3 and AjT1R2b-4;
The method according to [4].
[6] The method of any one of [1] to [5], wherein the T1R3 family member is a protein selected from the group consisting of (b1) to (b6):
(b1) a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11;
(b2) a protein encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 12;
(b3) A protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11, the protein responding to L-amino acids;
(b4) A protein encoded by a gene consisting of a nucleotide sequence having 80% or more identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 12, the protein responding to L-amino acids;
(b5) A protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and/or added to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11, the protein responding to an L-amino acid; or (b6) a sequence A protein encoded by a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence of number 12 under stringent conditions, the protein responding to L-amino acids.
[7] The method of [6], wherein the T1R3 family member is AjT1R3.
[8] The method of any one of [1] to [7], wherein the activity is measured using a calcium-sensitive photoprotein.
[9] The method of [8], wherein the photoprotein is aequorin.
[10] A feed for eels containing the palatability component screened using the method according to any one of [1] to [9].
[11] A feed for eels containing one or more of creatinine, N,N-dimethylglycine and sarcosine as palatability ingredients.
[12] The feed according to [11], wherein the eel is Japanese eel (A. japonica), European eel (A. anguilla), Indonesian eel (A. bicolor bicolor), or New Guinea eel (A. bicolor pacifica).
[13] The feed according to any one of [10] to [12], which is for larval fish, juvenile fish, immature fish, or adult fish.
本発明によれば、ウナギの味覚受容体に直接作用する物質を嗜好性成分としてスクリーニングできるため、サメの卵などの従来の成分に代わる、これまでウナギの養殖において使用されていなかった新たな成分の探索が可能になる。 According to the present invention, substances that directly act on the taste receptors of eels can be screened as palatability ingredients, so that new ingredients that have not been used in eel farming can replace conventional ingredients such as shark eggs. can be explored.
（嗜好性成分のスクリーニング方法）
第一の実施形態において、本発明は、ウナギのための嗜好性成分をスクリーニングする方法であって、
（ａ）味覚受容体Ｔ１Ｒ２ファミリーのいずれか一つのメンバーとＴ１Ｒ３ファミリーのいずれか一つのメンバーとから成るヘテロ二量体と、嗜好性成分の候補物質とを接触させる工程、及び
（ｂ）ヘテロ二量体の活性を増大させる候補物質を嗜好性成分と評価する工程、を含む、方法を提供する。(Screening method for palatability component)
In a first embodiment, the present invention provides a method of screening palatability components for eel, comprising:
(a) contacting a heterodimer consisting of any one member of the taste receptor T1R2 family and any one member of the T1R3 family with a palatability component candidate substance; evaluating a palatability component for a candidate substance that increases the activity of the mer.
本明細書で使用する場合、「ウナギのための嗜好性成分」とは、その候補物質などのリガンドを含まないネガティブコントロール、例えば、バッファーとの比較でウナギの味覚受容体に有意に作用する物質、あるいは、ウナギが好む味物質又はウナギの摂食を促進するような成分を意味する。なお、ウナギが好む味物質又はウナギの摂食を促進するような成分として、Ｌ－アミノ酸、例えば、アラニン、アルギニン、グリシン、プロリン、リジン、セリン、ヒスチジン及びベタイン等が知られている。このような既知の嗜好性成分をスクリーニングの指標として使用することもできる。 As used herein, a “palatability component for eel” is a substance that significantly affects eel taste receptors compared to a negative control that does not contain a ligand such as the candidate substance, e.g., buffer. Alternatively, it means a tastant that is preferred by eels or an ingredient that promotes eel feeding. In addition, L-amino acids such as alanine, arginine, glycine, proline, lysine, serine, histidine and betaine are known as taste substances that eels like or ingredients that promote the ingestion of eels. Such known palatability components can also be used as indicators for screening.
本明細書で使用する場合、「ウナギ」とは、広くウナギ目魚類、特にウナギ属の魚類（Ａｎｇｕｉｌｌａ）のうち、味覚受容体Ｔ１Ｒ２ファミリーのいずれか一つのメンバーとＴ１Ｒ３ファミリーのいずれか一つのメンバーとから成るヘテロ二量体を有するものを意味する。本発明の効果を奏する限り、Ｔ１Ｒ２ファミリーに代えて、その他のＴ１Ｒファミリーを使用してもよい。生息地毎に分類すると、例えば、主要なウナギはニホンウナギ（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、ヨーロッパウナギ（Ａ．ａｎｇｕｉｌｌａ）、アメリカウナギ（Ａ．ｒｏｓｔｏｒａｔａ）、オオウナギ（Ａ．ｍａｒｍｏｒａｔａ）の４つに大別される。その他のウナギとしては、ニューギニアウナギ（Ａ．ｂｉｃｏｌｏｒ ｐａｃｉｆｉｃａ）、インドネシアウナギ（Ａ．ｂｉｃｏｌｏｒ ｂｉｃｏｌｏｒ）、モザンビークウナギ（Ａ．ｍｏｓｓａｍｂｉｃａ）、オーストラリアウナギ（Ａ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、オーストラリア淡水ウナギ（Ａ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ ｓｃｈｍｉｄｔｉｉ）、オーストラリアヒレナガウナギ（Ａ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、セレベスウナギ（Ａ．ｃｅｌｅｂｅｓｅｎｓｉｓ）、ポリネシアヒレナガウナギ（Ａ．ｍｅｇａｓｔｏｍａ）、太平洋短鰭ウナギ（Ａ．ｏｂｓｃｕｒａ）、ニューギニア高山ウナギ（Ａ．ｉｎｔｅｒｉｏｒｉｓ）、インドマダラウナギ（Ａ．ｎｅｂｕｌｏｓａ）、ニュージーランドオオウナギ（Ａ．ｄｉｆｆｅｎｂａｃｈｉｉ）、ルソンウナギ（Ａ．ｌｕｚｏｎｅｎｓｉｓ）、ベンガルウナギ（Ａ．ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ）、アフリカウナギ（Ａ．ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ ｌａｂｉａｔａ）、大陸淡水ウナギ（Ａ．ｂｒｅｖｉｃｅｐｓ）、大陸ウナギ（Ａ．ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）、インドネシアヒレナガウナギ（Ａ．ｍａｌｇｕｍｏｒａ）なども挙げられる。食用としてはニホンウナギとヨーロッパウナギの二種が主である。 As used herein, "eel" broadly refers to any one member of the T1R2 family and any one member of the T1R3 family of taste receptors, among Anguilla fishes, particularly fishes of the genus Anguilla. means having a heterodimer consisting of Other T1R families may be used instead of the T1R2 family as long as the effects of the present invention are achieved. When classified by habitat, for example, major eels are roughly divided into four: Japanese eel (A. japonica), European eel (A. anguilla), American eel (A. rostorata), and Giant eel (A. marmorata). be. Other eels include New Guinea eel (A. bicolor pacifica), Indonesian eel (A. bicolor bicolor), Mozambique eel (A. mossambica), Australian eel (A. australis australis), Australian freshwater eel (A. australis schmidtii). , Australian long-finned eel (A. reinhardtii), Celebes eel (A. celebesensis), Polynesian long-finned eel (A. megastoma), Pacific short-fin eel (A. obscura), New Guinea alpine eel (A. interioris), Indian spotted eel ( A. nebulosa), New Zealand eel (A. diffenbachii), Luzon eel (A. luzonensis), Bengal eel (A. bengalensis bengalensis), African eel (A. bengalensis labiata), continental freshwater eel (A. breviceps), continental eel ( A. nigricans), Indonesian longfin eel (A. malgumora), and the like. There are two main edible species, the Japanese eel and the European eel.
ウナギには上記以外のウナギ目魚類、アナゴ、ウツボ、ハモなどが含まれ、例えば、マアナゴ（Ｃｏｎｇｅｒ ．ｍｙｒｉａｓｔｅｒ）、クロアナゴ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、ゴテンアナゴ（Ａｒｉｏｓｏｍａ ｍｅｅｋｉ）、ギンアナゴ（Ｇｎａｔｈｏｐｈｉｓ ｎｙｓｔｒｏｍｉ ｎｙｓｔｏｒｏｍｉ）、イラコアナゴ（Ｓｙｎａｐｈｏｂｒａｎｃｈｕｓ ｋａｕｐｉｉ）、ウツボ（Ｇｙｍｎｏｔｈｏｒａｘ ｋｉｄａｋｏ）、ハモ（Ｍｕｒａｅｎｅｓｏｘ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、及びスズハモ（Ｍｕｒａｅｎｅｓｏｘ ｂａｇｉｏ）も本発明のウナギに含まれ得る。 Eel includes other eel fishes, conger eels, moray eels, pike congers, etc., such as conger eel (Conger.myriaster), black conger eel (C.japonica), gotenanago (Ariosoma meeki), silver eel (Gnathophis nystromi nystromi), and eel. (Synaphobranchus kaupii), moray eel (Gymnothorax kidako), pike conger (Muraenesox cinereus), and eel (Muraenesox bagio) may also be included in the eels of the present invention.
上記ウナギのうち、ニホンウナギは、外洋で孵化し、プレレプトセファルスという孵化仔魚を経て、レプトセファルス又は仔魚と呼ばれる透明な浮遊幼生となり、稚魚（シラスウナギ、クロコ）を経由して成魚となる。スクリーニングされた嗜好性成分を摂食すると予想されるウナギは、Ｔ１Ｒ２ファミリーのいずれか一つのメンバーとＴ１Ｒ３ファミリーのメンバーとを発現している限りいずれの生育段階のものでもよく、また、人工孵化させたもの、天然のもののいずれでもよい。 Among the above eels, Japanese eels hatch in the open sea, pass through hatching larvae called preleptocephalus, become transparent floating larvae called leptocephalus or larvae, and become adult fish via juveniles (glass eel, crocodile). . Eels that are expected to eat the screened palatability component may be of any growth stage as long as they express any one member of the T1R2 family and a member of the T1R3 family, and may be artificially hatched. It can be natural or natural.
味覚受容体タンパク質
味覚に対する受容体は、７回膜貫通型タンパク質と称される膜タンパク質であり、Ｇタンパク質と連結することから、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）とも呼ばれる。味覚受容体タンパク質はその構造から、大きな細胞外領域を持つものと、この領域を持たないものとの二種類に大別され、前者はＴ１Ｒファミリー（Ｔａｓｔｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ－１）、後者はＴ２Ｒファミリー（Ｔａｓｔｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ－２）と称される。Ｔ１Ｒファミリーには、Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２、及びＴ１Ｒ３の３つの分子種からなる。 Taste Receptor Proteins Receptors for taste are membrane proteins called 7-transmembrane proteins and are also called G protein-coupled receptors (GPCRs) because they are linked to G proteins. Taste receptor proteins are roughly divided into two types, those with a large extracellular domain and those without this domain, based on their structure, the former being the T1R family (Taste Receptor type-1) and the latter being the T2R family ( It is called Taste Receptor type-2). The T1R family consists of three molecular species, T1R1, T1R2 and T1R3.
ウナギのＴ１Ｒについて、本発明者らは、５種類のＴ１Ｒ２の全長配列と、１種類のＴ１Ｒ３の全長配列を取得し、それぞれをＡｊＴ１Ｒ２ａ、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－２、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－３、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－４、ＡｊＴ１Ｒ３と命名した。これらのＡｊＴ１Ｒ２ａ、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－２、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－３、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－４、ＡｊＴ１Ｒ３は、それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１のアミノ酸配列、及び配列番号２、４、６、８、１０、１２の塩基配列を有する。得られた全長アミノ酸配列のアラインメントを図１に示す。 For eel T1R, the present inventors obtained five full-length sequences of T1R2 and one full-length sequence of T1R3, AjT1R2a, AjT1R2b-1, AjT1R2b-2, AjT1R2b-3, and AjT1R2b-4, respectively. , AjT1R3. These AjT1R2a, AjT1R2b-1, AjT1R2b-2, AjT1R2b-3, AjT1R2b-4, AjT1R3 are the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, respectively, and SEQ ID NOs: 2, 4, 6, It has 8, 10 and 12 base sequences. An alignment of the obtained full-length amino acid sequences is shown in FIG.
上記６つの配列は、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３の配列が既知の魚類の各配列と比較すると、Ｔ１Ｒ２では４４．２～５２．０％、Ｔ１Ｒ３では５１．５～５３．７％の相同性を有した（表１）。
また、ニホンウナギＴ１Ｒ間における相同性はＴ１Ｒ２同士では７６．９～９１．３％、Ｔ１Ｒ２とＴ１Ｒ３では３０．０～３１．２％であった（表２）。
得られた全長配列をもとに分子系統樹を作成した結果、いずれも哺乳類のＴ１Ｒクラスターではなく、魚類Ｔ１Ｒのクラスターに含まれることが明らかになった（結果は示さず）。 As a result of creating a molecular phylogenetic tree based on the obtained full-length sequences, it became clear that all of them were included in the fish T1R cluster, not in the mammalian T1R cluster (results not shown).
哺乳類ではＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３ファミリーはそれぞれ１つのメンバーが見つかっており、Ｔ１Ｒ１＋Ｔ１Ｒ３で旨味物質を、Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３で甘味物質を受容する。一方、これまで味覚受容体について報告のあるメダカ及びトラフグ等の魚類ではＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ３ファミリーは１つのメンバー、Ｔ１Ｒ２ファミリーは複数のメンバーが存在し、Ｔ１Ｒ１＋Ｔ１Ｒ３に加え、Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３でも旨味物質を受容する例が知られている。ウナギにおいても、他の魚類同様、遺伝子重複が起こることによって、Ｔ１Ｒ２が多様化している可能性が考えられた。なお、今回探索するにあたって対象としたゲノムデータベースのドラフトゲノムは、不完全な配列を含むうえ、全てのゲノム配列をカバーしているわけではないため、今回見出された配列以外にも受容体候補となる遺伝子配列が存在する可能性は十分にあると考えられる。 In mammals, one member each of T1R1, T1R2, and T1R3 families has been found, and T1R1+T1R3 accepts umami substances and T1R2+T1R3 accepts sweet substances. On the other hand, in fish such as medaka and tiger puffer, for which taste receptors have been reported so far, there are one member of the T1R1 and T1R3 families, and multiple members of the T1R2 family. Are known. It is possible that T1R2 is diversified in eels as well as in other fishes due to gene duplication. The draft genome of the genome database targeted for this search contains incomplete sequences and does not cover all genome sequences. It is thought that there is a good possibility that there is a gene sequence that becomes
本発明において嗜好性成分の候補物質と接触される味覚受容体は、ＡｊＴ１Ｒ２ａ、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－２、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－３、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－４等のＴ１Ｒ２ファミリーのいずれか一つのメンバーと、ＡｊＴ１Ｒ３等のＴ１Ｒ３ファミリーのいずれか一つのメンバーとから成るヘテロ二量体である。 Taste receptors that are contacted with candidate palatability components in the present invention include any one member of the T1R2 family, such as AjT1R2a, AjT1R2b-1, AjT1R2b-2, AjT1R2b-3, and AjT1R2b-4, and AjT1R3, etc. It is a heterodimer consisting of any one member of the T1R3 family.
ＡｊＴ１Ｒ２ａとＡｊＴ１Ｒ３の組み合わせは、Ｌ－アラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－アルギニン、グリシン、Ｌ－プロリンに応答する。ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１とＡｊＴ１Ｒ３の組み合わせは、Ｌ－プロリン、Ｌ－アラニンに応答する。ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１とＡｊＴ１Ｒ３の組み合わせは、サルコシン、クレアチニン、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシンにも応答する。ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－２とＡｊＴ１Ｒ３の組み合わせは、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－セリン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギンに応答する。ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－４とＡｊＴ１Ｒ３の組み合わせは、Ｌ－アラニン、グリシン、Ｌ－セリン、Ｌ－プロリンに応答する。 The combination of AjT1R2a and AjT1R3 responds to L-alanine, L-serine, L-arginine, glycine, L-proline. The combination of AjT1R2b-1 and AjT1R3 responds to L-proline, L-alanine. The combination of AjT1R2b-1 and AjT1R3 also responds to sarcosine, creatinine and N,N-dimethylglycine. The combination of AjT1R2b-2 and AjT1R3 responds to L-histidine, L-serine, L-phenylalanine, L-alanine, L-asparagine. The combination of AjT1R2b-4 and AjT1R3 responds to L-alanine, glycine, L-serine, L-proline.
Ｔ１Ｒ２ファミリーのメンバーは、以下の（ａ１）～（ａ６）から成る群から選択され得る：
（ａ１）配列番号１、３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列から成るタンパク質；
（ａ２）配列番号２、４、６、８又は１０に記載の塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ａ３）配列番号１、３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ａ４）配列番号２、４、６、８又は１０に記載の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ａ５）配列番号１、３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；あるいは
（ａ６）配列番号２、４、６、８又は１０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質。Members of the T1R2 family may be selected from the group consisting of (a1)-(a6) below:
(a1) a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9;
(a2) a protein encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10;
(a3) A protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9, the protein responding to L-amino acids;
(a4) A protein encoded by a gene comprising a nucleotide sequence having 80% or more identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10, the protein responding to L-amino acids;
(a5) A protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9 are deleted, substituted and/or added, and which responds to L-amino acids or (a6) a protein encoded by a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10, wherein the protein is responsive to L-amino acids protein.
Ｔ１Ｒ３ファミリーのメンバーは、以下の（ｂ１）～（ｂ６）から成る群から選択され得る：
（ｂ１）配列番号１１に記載のアミノ酸配列から成るタンパク質；
（ｂ２）配列番号１２に記載の塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ３）配列番号１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ｂ４）配列番号１２に記載の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ｂ５）配列番号１１に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；あるいは
（ｂ６）配列番号１２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質。Members of the T1R3 family may be selected from the group consisting of (b1)-(b6) below:
(b1) a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11;
(b2) a protein encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 12;
(b3) A protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11, the protein responding to L-amino acids;
(b4) A protein encoded by a gene consisting of a nucleotide sequence having 80% or more identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 12, the protein responding to L-amino acids;
(b5) A protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and/or added to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11, the protein responding to an L-amino acid; or (b6) a sequence A protein encoded by a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence of number 12 under stringent conditions, the protein responding to L-amino acids.
アミノ酸配列は、Ｌ－アミノ酸等の既知の嗜好性成分又はスクリーニングにより同定された嗜好性成分の刺激に応答するものであれば、配列番号１、３、５、７、９又は１１のような野生型タンパク質が有するアミノ酸配列において、１から複数個、例えば、アミノ酸配列におけるアミノ酸数１００個を一単位とすれば、該一単位あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個、好ましくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The amino acid sequence may be a wild type such as SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 or 11 if it responds to stimulation of known palatability components such as L-amino acids or palatability components identified by screening. In the amino acid sequence of the type protein, if one unit is one to a plurality of amino acids, for example, 100 amino acids in the amino acid sequence, then 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20, preferably several amino acid deletions, substitutions, additions, etc. good.
ここで、アミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」における「１から数個」の範囲は特に限定されないが、上記一単位あたり、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個程度、より好ましくは１、２、３、４又は５個程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。 Here, the range of "1 to several" in the "deletion, substitution, addition of one to several amino acids" of the amino acid sequence is not particularly limited, but preferably 1, 2, 3, 4 per unit. , about 5, 6, 7, 8, 9 or 10, more preferably about 1, 2, 3, 4 or 5. In addition, "amino acid deletion" means deletion or disappearance of an amino acid residue in a sequence, and "amino acid substitution" means that an amino acid residue in a sequence is replaced with another amino acid residue. and "addition of an amino acid" means that a new amino acid residue is added to insert into the sequence.
「アミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な態様としては、Ｌ－アミノ酸等の既知の嗜好性成分、及びスクリーニングにより同定された嗜好性成分の刺激に対する応答を維持する限度で、野生型におけるアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様が挙げられる。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。 As a specific embodiment of "deletion, substitution, addition of amino acids", wild-type is replaced with another chemically similar amino acid. For example, replacement of a hydrophobic amino acid with another hydrophobic amino acid, replacement of a polar amino acid with another polar amino acid having the same charge, and the like can be mentioned. Such chemically similar amino acids are known in the art for each amino acid.
具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。 Specific examples of nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine, and the like. Polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, cysteine, and the like. Examples of positively charged basic amino acids include arginine, histidine, and lysine. Moreover, aspartic acid, glutamic acid, etc. are mentioned as an acidic amino acid with a negative charge.
また、上記アミノ酸配列において、「アミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な態様としては、配列番号１、３、５、７、９又は１１のような野生型タンパク質が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、例えば、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。 In addition, in the above amino acid sequence, as a specific embodiment of "deletion, substitution, addition of amino acids", the amino acid sequence constant with the wild-type protein such as SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 or 11 Examples include amino acid sequences having a sequence identity of greater than or equal to 75% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, most preferably 90% or more, with the amino acid sequence of the wild-type protein. Amino acid sequences with greater than 95% identity are included.
使用する塩基配列は、宿主生物に導入された際に、塩基配列の転写後にスプライシングを経由して所望の配列を生成するものでも、転写後にスプライシングを経由せずに所望の配列を生成するものでもよい。 The nucleotide sequence to be used, when introduced into a host organism, may generate a desired sequence via splicing after transcription of the nucleotide sequence, or may generate a desired sequence without via splicing after transcription. good.
使用する塩基配列は、野生型の配列と完全に同一でなくともよく、Ｌ－アミノ酸等の既知の嗜好性成分、又はスクリーニングにより同定された嗜好性成分の刺激に対する応答を維持する限り、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であってもよい。 The base sequence to be used may not be completely identical to the wild-type sequence, as long as it maintains the response to stimulation of known palatability components such as L-amino acids, or palatability components identified by screening. It may be a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the gene.
本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、配列番号２、４、６、８、１０又は１２のような野生型遺伝子の塩基配列の一部に相当するＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。 As used herein, the term "nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions" refers to a DNA corresponding to part of the nucleotide sequence of a wild-type gene such as SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 or 12. It means a base sequence of DNA used as a probe and obtained by colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern blot hybridization method or the like.
本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。 As used herein, the term "stringent conditions" refers to conditions under which a specific hybrid signal is clearly distinguished from a non-specific hybrid signal. and length dependent. Such conditions can be determined by varying the temperature of hybridization, varying the temperature and salt concentration of washing.
例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。 For example, when even non-specific hybrid signals are strongly detected, the specificity can be increased by raising the temperature of hybridization and washing and, if necessary, lowering the salt concentration of washing. If no specific hybrid signal is detected, hybrids can be stabilized by lowering the hybridization and washing temperatures and, if necessary, increasing the washing salt concentration.
一部の態様において、ストリンジェントな条件の具体例としては以下のものを含む。例えば、プローブとしてＤＮＡプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ）核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを用い、一晩（８～１６時間程度）で行う。洗浄は、０．１～０．５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーション及び洗浄を行う温度は６５℃以上、好ましくは６８℃以上である。 In some embodiments, specific examples of stringent conditions include the following. For example, using a DNA probe as a probe, hybridization is 5×SSC, 1.0% (w/v) blocking reagent for nucleic acid hybridization (manufactured by Boehringer Mannheim), 0.1% (w/v) N - lauroyl sarcosine, 0.02% (w/v) SDS overnight (approximately 8-16 hours). Wash twice for 15 minutes using 0.1-0.5×SSC, 0.1% (w/v) SDS, preferably 0.1×SSC, 0.1% (w/v) SDS conduct. The temperature for hybridization and washing is 65°C or higher, preferably 68°C or higher.
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、コロニー若しくはプラーク由来の野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって得られるＤＮＡ、及び０．５～２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、４０～７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１～１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。プローブの調製及びハイブリダイゼーションの方法は、Ｍｏｌｅｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ－Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １－３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７－１９９７などに記載されている方法に準じて実施することができる。 Examples of the DNA having a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions include, for example, colony- or plaque-derived DNA having the nucleotide sequence of a wild-type gene or a filter on which a fragment of the DNA is immobilized. DNA obtained by hybridization under gentle conditions, and in the presence of 0.5-2.0 M NaCl, after hybridization at 40-75° C., preferably 0.7-1.0 M After performing hybridization at 65 ° C. in the presence of NaCl, using 0.1 to 1 × SSC solution (1 × SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate), filter at 65 ° C. and DNA that can be identified by washing. Probe preparation and hybridization methods are described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd-Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. , 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons, 1987-1997.
なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度及び温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などの諸条件を加味して、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。 It should be noted that those skilled in the art would be able to determine the base sequence of the wild-type gene by taking into consideration other conditions such as probe concentration, probe length, reaction time, etc., in addition to conditions such as buffer salt concentration and temperature. Conditions for obtaining a DNA having a nucleotide sequence that hybridizes with a nucleotide sequence complementary to , under stringent conditions, can be appropriately set.
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡとしては、プローブとして使用する野生型遺伝子の塩基配列と一定以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば、野生型遺伝子の塩基配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。 The DNA containing a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the wild-type gene is a DNA that has at least a certain degree of sequence identity with the nucleotide sequence of the wild-type gene used as a probe. For example, a DNA having a sequence identity of 75% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more with the nucleotide sequence of the wild-type gene is mentioned.
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、塩基配列における塩基数５００個を一単位とすれば、野生型遺伝子の塩基配列において、該一単位あたり、１から複数個、例えば、１から１２５個、１から１００個、１から７５個、１から５０個、１から３０個、１から２０個、好ましくは１から数個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の塩基の欠失、置換、付加などを有する塩基配列を含む。 As a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence of the wild-type gene, for example, if 500 bases in the base sequence are taken as one unit, the base sequence of the wild-type gene is , 1 or more per unit, for example, 1 to 125, 1 to 100, 1 to 75, 1 to 50, 1 to 30, 1 to 20, preferably 1 to several, For example, base sequences having deletions, substitutions, additions, etc. of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 bases are included.
ストリンジェントな条件の中でも、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件、つまり、高ストリンジェントな条件が好ましい。高ストリンジェントな条件としては、同一性が高い核酸同士がハイブリダイズし、それより同一性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。 Among stringent conditions, conditions that form so-called specific hybrids but do not form non-specific hybrids, that is, highly stringent conditions are preferred. Highly stringent conditions include conditions under which nucleic acids with high identity hybridize to each other and nucleic acids with lower identity do not hybridize to each other.
ここで、「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味し、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、「塩基の付加」とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味する。 Here, "base deletion" means that a base in the sequence is missing or missing, and "base substitution" means that a base in the sequence is replaced with another base, "Addition of a base" means that a new base is added to insert.
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質は、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質が有するアミノ酸配列において１から複数個、好ましくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列を有するタンパク質である蓋然性があるが、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ効果を有すると考えられる。 The protein encoded by the nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the wild-type gene has one or more amino acid sequences in the protein encoded by the nucleotide sequence of the wild-type gene. It is likely that the protein has an amino acid sequence with deletions, substitutions, additions, etc. of one, preferably several, amino acids, but it is believed to have the same effect as the protein encoded by the base sequence of the wild-type gene.
また、タンパク質をコードする遺伝子は、１つのアミノ酸に対応するコドンが数種類あることを利用して、野生型遺伝子がコードする酵素が有するアミノ酸配列と同一又は近似するアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、野生型遺伝子と異なる塩基配列を含んでもよい。塩基配列は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。 A gene encoding a protein has a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that is identical or similar to the amino acid sequence of an enzyme encoded by a wild-type gene, using the fact that there are several types of codons corresponding to one amino acid. may contain nucleotide sequences that differ from the wild-type gene. The base sequence may be modified so as to have optimal codons according to the codon usage of the host to be used.
塩基配列及びアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られている方法を利用して、野生型遺伝子又は野生型遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列と対象となる塩基配列又はアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。 The method for determining the sequence identity of the nucleotide sequence and amino acid sequence is not particularly limited. It is determined by using a program for aligning the base sequence or amino acid sequence and calculating the rate of identity between the two sequences.
２つのアミノ酸配列や塩基配列における一致率を算出するためのプログラムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８、１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ９０：５８７３－５８７７、１９９３）が知られており、このアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌなどによって開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、１９９０）。さらに、ＢＬＡＳＴより感度よく配列同一性を決定するプログラムであるＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴも知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２、１９９７）。したがって、当業者は例えば、上記のプログラムを利用して、与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索することができる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において利用可能である。 Examples of programs for calculating the matching rate between two amino acid sequences or base sequences include the algorithm of Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:5873-5877, 1993), and a BLAST program using this algorithm has been developed by Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990). Furthermore, Gapped BLAST, which is a program for determining sequence identity with higher sensitivity than BLAST, is also known (Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997). Thus, one skilled in the art can, for example, use the above programs to search databases for sequences that exhibit high sequence identity to a given sequence. These are available, for example, at the website of the US National Center for Biotechnology Information on the Internet (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
上記の各方法は、データベース中から配列同一性を示す配列を検索するために通常的に用いられ得るが、個別の配列の配列同一性を決定する手段としては、Ｇｅｎｅｔｙｘネットワーク版 ｖｅｒｓｉｏｎ １２．０．１（ゼネティックス社製）のホモロジー解析を用いることもできる。この方法は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１４３５－１４４１、１９８５）に基づく。塩基配列の配列同一性を解析する際は、可能であればタンパク質をコードしている領域（ＣＤＳ又はＯＲＦ）を用いる。 Each of the above methods can be commonly used to search a database for sequences exhibiting sequence identity, but Genetyx network version version 12.0. 1 (manufactured by Genetics) can also be used. This method is based on the Lipman-Pearson method (Science 227:1435-1441, 1985). When analyzing the sequence identity of nucleotide sequences, protein-encoding regions (CDS or ORF) are used if possible.
Ｇタンパク質
Ｔ１Ｒ２とＴ１Ｒ３から成るヘテロ二量体は、味覚受容体細胞に特異的に発現しているヘテロ三量体のＧタンパク質と共役するため、スクリーニングの際には細胞内でヘテロ二量体とＧタンパク質とを共発現させてもよい。このようなＧタンパク質として、Ｇｑファミリー、ガストデューシン、トランスデューシン等が知られている。A heterodimer consisting of G proteins T1R2 and T1R3 couples with a heterotrimeric G protein that is specifically expressed in taste receptor cells. It may be co-expressed with the G protein. As such G proteins, the Gq family, gustducin, transducin and the like are known.
Ｇタンパク質は、Ｇα（αサブユニット）及びＧβγサブユニットからなる。嗜好性成分をスクリーニングするとき、これらのうち少なくともＧαサブユニットが発現していればよい。また、ＧαサブユニットとともにＧβγサブユニットが発現してもよい。Ｇαサブユニットには、Ｇｉ、Ｇｑ又はＧｓ、Ｇ１２／１３のグループが含まれることが知られている。中でも、Ｇα１５又はＧα１６単独、あるいは、それらのＣ末端５残基、２５残基又は４４残基が、Ｇｉ、Ｇｑ又はＧｓのファミリーに属するメンバーの対応するＣ末端残基で置換されているキメラタンパク質が好適に使用され得る。このようなＣ末端残基の置換は、当業者に公知である（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ Ａｐｒｉｌ ２， ２００２． ９９ （７） ４６９２－４６９等を参照のこと）。このようにＣ末端残基を置換することで受容体とカップリングしやすくなると考えられる。
G proteins consist of Gα (α subunits) and Gβγ subunits. When screening the palatability component, at least the Gα subunit should be expressed. Also, the Gβγ subunit may be expressed together with the Gα subunit. Ga subunits are known to include the Gi, Gq or Gs, G12/13 groups. Among them, Gα15 or Gα16 alone, or chimeric proteins in which the C-
「対応するＣ末端残基」とは、例えば、Ｇα１５のＣ末端配列５アミノ酸が他のＧαサブユニットに置き換えられる場合、そのＧαサブユニットのＣ末端配列を構成する５アミノ酸を意味する。また、キメラタンパク質の表記に関して、例えば、ｒＧ１５－ｒＧｉ３－５という表現は、ラットＧα１５（以下、Ｇα１５を「Ｇ１５」と記載する場合があり、ラットＧα１５を「ｒＧ１５」、マウスＧα１５を「ｍＧ１５」、ヒトＧα１６を「ｈＧ１６」などと記載する場合がある。）のＣ末端配列５アミノ酸がラットＧｉ３のＣ末端配列５アミノ酸で置換されていることを意味する。 "Corresponding C-terminal residue" means, for example, when 5 amino acids of the C-terminal sequence of Gα15 are replaced with another Gα subunit, the 5 amino acids that make up the C-terminal sequence of that Gα subunit. In addition, regarding the notation of chimeric proteins, for example, the expression rG15-rGi3-5 is rat Gα15 (hereinafter, Gα15 may be referred to as "G15", rat Gα15 as "rG15", mouse Gα15 as "mG15", human Gα16 is sometimes referred to as “hG16”, etc.) is replaced with 5 amino acids of the C-terminal sequence of rat Gi3.
Ｇタンパク質の選択にあたり、公知文献、例えば、ｒＧ１５－ｒＧｉ２－５については、Ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３ （ｔｈｅ ｕｍａｍｉ ｔａｓｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ） Ｔｏｄａ Ｙ， Ｎａｋａｇｉｔａ Ｔ， Ｈａｙａｋａｗａ Ｔ， Ｏｋａｄａ Ｓ， Ｎａｒｕｋａｗａ Ｍ， Ｉｍａｉ Ｈ， Ｉｓｈｉｍａｒｕ Ｙ， Ｍｉｓａｋａ Ｔ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１３ Ｄｅｃ ２７；２８８（５２）：３６８６３－７７． ｄｏｉ等を、また、ｍＧ１５については、Ｓｅｎｓｏｒｙ ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｓｗｅｅｔ ｔａｓｔｅ ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍｍｉｎｇｂｉｒｄｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｕｍａｍｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｂａｌｄｗｉｎ ＭＷ， Ｔｏｄａ Ｙ， Ｎａｋａｇｉｔａ Ｔ， Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ ＭＪ， Ｋｌａｓｉｎｇ ＫＣ， Ｍｉｓａｋａ Ｔ， Ｅｄｗａｒｄｓ ＳＶ， Ｌｉｂｅｒｌｅｓ ＳＤ．Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１４ Ａｕｇ ２２；３４５（６１９９）：９２９－３３． ｄｏｉ： １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２５５０９７等を参照することができる。 For the selection of the G protein, known literature, for example, rG15-rGi2-5, Two distinct determinants of ligand specificity in T1R1/T1R3 (the umami taste receptor) Toda Y, Nakagita T, Hayakawa T, Nakakawa T, O Imai H, Ishimaru Y, Misaka T.; J Biol Chem. 2013 Dec 27;288(52):36863-77. doi et al. and for mG15 Sensory biology. Evolution of sweet taste perception in hummingbirds by transformation of the ancestral umami receptor. Baldwin MW, Toda Y, Nakagita T, O'Connell MJ, Klasing KC, Misaka T, Edwards SV, Liberles SD. Science. 2014 Aug 22;345(6199):929-33. doi: 10.1126/science. 1255097 etc. can be referred.
主要なＧタンパク質のＡＣＳＥＳＳＩＯＮ番号（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を以下に示す。
マウス Ｇ１５：ＮＭ＿０１０３０４
ラット Ｇ１５：ＮＭ＿０５３５４２
ヒト Ｇ１６：ＮＭ＿００２０６８
ヒト Ｇｇｕｓｔ：ＮＭ＿００１１０２３８６
ラット Ｇｇｕｓｔ：ＮＭ＿１７３１３９
ラット Ｇｉ２：ＮＭ＿０３１０３５
ラット Ｇｉ３：ＮＭ＿０１３１０６
ラット Ｇｓ：ＮＭ＿０１９１３２The ACCESSION numbers (NCBI Reference Sequence) of major G proteins are shown below.
Mouse G15: NM_010304
Rat G15: NM_053542
Human G16: NM_002068
Human Ggust: NM_001102386
Rat Ggust: NM_173139
Rat Gi2: NM_031035
Rat Gi3: NM_013106
Rat Gs: NM_019132
実施例で使用したキメラタンパク質の配列情報について以下に記載する。
アミノ酸配列：
ｒＧ１５－ｒＧｉ３－５（配列番号１３）；
ｒＧ１５－ｒＧｉ２－５（配列番号１５）；
ｈＧ１６－ｒＧｉ３－５（配列番号１７）；
ｍＧ１５（配列番号１９）；
ｒＧ１５（配列番号２１）；
ｒＧ１５－ｒＧｇｕｓｔ－５（配列番号２３）；
ｈＧ１６（配列番号２５）；
ｈＧ１６－ｒＧｇｕｓｔ－２５（配列番号２７）；
ｈＧ１６－ｒＧｉ２－４４（配列番号２９）；
ｈＧ１６－ｒＧｓ－２５（配列番号３１）；
ｈＧ１６－ｒＧｓ－４４（配列番号３３）；
ｒＧ１５－ｒＧｇｕｓｔ－２５（配列番号３５）The sequence information of the chimeric proteins used in the examples are described below.
Amino acid sequence:
rG15-rGi3-5 (SEQ ID NO: 13);
rG15-rGi2-5 (SEQ ID NO: 15);
hG16-rGi3-5 (SEQ ID NO: 17);
mG15 (SEQ ID NO: 19);
rG15 (SEQ ID NO: 21);
rG15-rGgust-5 (SEQ ID NO:23);
hG16 (SEQ ID NO: 25);
hG16-rGgust-25 (SEQ ID NO:27);
hG16-rGi2-44 (SEQ ID NO:29);
hG16-rGs-25 (SEQ ID NO:31);
hG16-rGs-44 (SEQ ID NO:33);
rG15-rGgust-25 (SEQ ID NO:35)
塩基配列：
ｒＧ１５－ｒＧｉ３－５（配列番号１４）；
ｒＧ１５－ｒＧｉ２－５（配列番号１６）；
ｈＧ１６－ｒＧｉ３－５（配列番号１８）；
ｍＧ１５（配列番号２０）；
ｒＧ１５（配列番号２２）；
ｒＧ１５－ｒＧｇｕｓｔ－５（配列番号２４）；
ｈＧ１６（配列番号２６）；
ｈＧ１６－ｒＧｇｕｓｔ－２５（配列番号２８）；
ｈＧ１６－ｒＧｉ２－４４（配列番号３０）；
ｈＧ１６－ｒＧｓ－２５（配列番号３２）；
ｈＧ１６－ｒＧｓ－４４（配列番号３４）；
ｒＧ１５－ｒＧｇｕｓｔ－２５（配列番号３６）Nucleotide sequence:
rG15-rGi3-5 (SEQ ID NO: 14);
rG15-rGi2-5 (SEQ ID NO: 16);
hG16-rGi3-5 (SEQ ID NO: 18);
mG15 (SEQ ID NO: 20);
rG15 (SEQ ID NO: 22);
rG15-rGgust-5 (SEQ ID NO:24);
hG16 (SEQ ID NO: 26);
hG16-rGgust-25 (SEQ ID NO:28);
hG16-rGi2-44 (SEQ ID NO:30);
hG16-rGs-25 (SEQ ID NO:32);
hG16-rGs-44 (SEQ ID NO:34);
rG15-rGgust-25 (SEQ ID NO:36)
スクリーニングで使用するタンパク質は、各塩基配列を単独で、又は共に任意の組み合わせで作用可能に連結して、所望の細胞内で発現させることにより調製することができる。各配列は、同一の又は異なるベクター内に挿入することができる。 Proteins used in screening can be prepared by expressing each nucleotide sequence alone or by operably linking them together in any combination and expressing them in desired cells. Each sequence can be inserted into the same or different vectors.
ヘテロ二量体をコードする塩基配列は、適当な宿主、例えば、ヒト等の哺乳動物、カエル等の両生類のような動物細胞、昆虫細胞又は酵母で発現される。好ましくは、宿主は昆虫又は哺乳動物などの細胞である。より好ましくは、哺乳動物細胞はヒト細胞である。哺乳動物細胞の例は、Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ（ＨＥＫ）、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などがある。 Nucleotide sequences encoding heterodimers are expressed in suitable hosts such as mammals such as humans, animal cells such as amphibians such as frogs, insect cells or yeast. Preferably, the host is a cell such as an insect or mammal. More preferably, mammalian cells are human cells. Examples of mammalian cells are Human Embryonic Kidney (HEK), eg HEK293T, Madin-Darby Canine Kidney (MDCK), Chinese Hamster Ovary Cells (CHO), and the like.
宿主細胞へのヘテロ二量体をコードする塩基配列の導入は、公知の方法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， （１９８９）等に記載されている技術を用いて行うことができる。 Introduction of a base sequence encoding a heterodimer into a host cell can be carried out by known methods such as Sambrook, J. et al. , Fritsch, E. F. , and Maniatis, T.; , "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989).
本発明のスクリーニング方法は、以下の工程に加え、スクリーニングに使用される任意の工程を含み得る。
（ａ）味覚受容体Ｔ１Ｒ２ファミリーのいずれか一つのメンバーとＴ１Ｒ３ファミリーのいずれか一つのメンバーとから成るヘテロ二量体と、嗜好性成分の候補物質とを接触させる工程、及び
（ｂ）ヘテロ二量体の活性を増大させる候補物質を嗜好性成分と評価する工程The screening method of the present invention can include any steps used for screening in addition to the following steps.
(a) contacting a heterodimer consisting of any one member of the taste receptor T1R2 family and any one member of the T1R3 family with a palatability component candidate substance; A step of evaluating a candidate substance that increases the activity of the polymer as a palatability component
ヘテロ二量体の活性増大、例えば、細胞におけるカルシウムイオン濃度の増大は、カルシウムイオン測定試薬などを用いて測定することができる。そのような試薬として、例えば、カルシウム感受性の発光タンパク質、具体的にはカルシウムイオンの濃度に応じて発光するイクオリンなどのタンパク質が好ましい。試薬の代わりに、受容体の活性化を、画像を基に観察し、得られた画像から応答細胞数を計数し、応答度合を判断するカルシウムイメージングを使用することもできる。そのような活性化を測定する機器として、ＣＣＤカメラＣｏｏｌＳＮＡＰ ＨＱ２（日本ローパー）、倒立顕微鏡ＩＸ－８１（ＯＬＹＭＰＵＳ）が、そして、イメージングのためのソフトウェアとして、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ，ＭｅｔａＦｌｏｕｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）などがある。 An increase in heterodimer activity, for example, an increase in calcium ion concentration in cells, can be measured using a calcium ion measurement reagent or the like. As such a reagent, for example, a calcium-sensitive photoprotein, specifically a protein such as aequorin that emits light depending on the concentration of calcium ions, is preferable. Instead of reagents, calcium imaging can also be used to observe receptor activation on an image basis, count the number of responding cells from the resulting image, and judge the degree of response. Instruments for measuring such activation include a CCD camera CoolSNAP HQ2 (Nippon Roper), an inverted microscope IX-81 (OLYMPUS), and imaging software such as MetaMorph and MetaFlour (Molecular Devices).
他にも、マルチウェルプレート上の細胞応答を数値として取得するウェルベースアッセイを使用してもよい。このようなウェルベースアッセイにはＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）などを使用することができる。 Alternatively, well-based assays that numerically obtain cell responses on multiwell plates may be used. FlexStation 3 (Molecular Devices), FLIPR (Molecular Devices) and the like can be used for such well-based assays.
Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３のようなＧＰＣＲは、リガンド、つまり嗜好性成分と結合すると構造変化（活性化）を起こし、ガストデューシンのようなＧタンパク質を呼び寄せ、細胞内カルシウムの上昇以外にも、さまざまな下流のシグナルを誘導する（例えば、サイクリックＡＭＰ濃度の変動低分子量Ｇタンパク質ＲｈｏへのＧＴＰ結合など）。これらの細胞内イベントを検出することにより、ヘテロ二量体の活性を測定することもできる。 GPCRs such as T1R2 and T1R3 undergo conformational changes (activation) when bound to ligands, that is, preference components, attract G proteins such as gustducin, and induce various downstream activities in addition to increasing intracellular calcium. (eg, GTP binding to the small G-protein Rho), such as cyclic AMP concentration fluctuations. Heterodimer activity can also be measured by detecting these intracellular events.
嗜好性成分と評価する工程においては、コントロールとして、候補物質などのリガンドを含まないサンプル、例えば、バッファーが使用され得る。そのようなコントロールとの比較で活性が同程度又はそれ以上の候補物質を嗜好性成分と評価され得る。バッファーなどのネガティブコントロールの代わりに、Ｌ－アミノ酸、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、グリシン、Ｌ－プロリン、Ｌ－リジン、Ｌ－セリン、Ｌ－ヒスチジン等の既知の嗜好性成分を使用してもよい。 In the step of evaluating the palatability component, a sample, such as a buffer, that does not contain a ligand such as a candidate substance can be used as a control. Candidate substances with comparable or greater activity compared to such controls can be evaluated as palatability components. Instead of negative controls such as buffers, known palatability components such as L-amino acids such as L-alanine, L-arginine, glycine, L-proline, L-lysine, L-serine, and L-histidine are used. may
（ウナギのための飼料）
第二の実施形態において、本発明は、上記方法を用いてスクリーニングされた嗜好性成分を含む、ウナギのための飼料を提供する。(fodder for eels)
In a second embodiment, the invention provides a feed for eels comprising a palatability component screened using the method described above.
飼料は、仔魚用、稚魚用、成魚用のいずれでもよい。ウナギの仔魚は、水温２３℃で孵化後７日目頃には消化酵素の分泌が活発になるため、このような段階であれば、本発明の飼料は有用であると考えられる。 The feed may be for larval fish, juvenile fish, or adult fish. Eel larvae actively secrete digestive enzymes around 7 days after hatching at a water temperature of 23° C. At such a stage, the feed of the present invention is considered useful.
本発明によりスクリーニングされる嗜好性成分としては、サルコシン、Ｎ，Ｎ‐ジメチルグリシン又はクレアチニン、あるいはそれらの類似体などがある。
嗜好性成分として、サルコシン、Ｎ，Ｎ‐ジメチルグリシン又はクレアチニンの一つ又は二つを以上含んでもよい。
As a palatability component, one or more of sarcosine, N,N-dimethylglycine or creatinine may be included.
サルコシンは、ズワイガニ脚肉エキスの成分の１つで（河合、２０１１）、フグが応答するという報告がある（Ｋｉｙｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．， １９８５）。またクレアチニンは、主に魚類以上の高等動物の筋肉中に含まれ、サバ科魚類に含まれるグアニジノ化合物として含まれるとの報告がある。クレアチニンについては、ヒトにおいて強い肉質様の呈味を付与する、だし風味を向上する効果があるという報告があるものの、魚類における味覚応答を検討した報告はなく、本発明者らが新たに見出した呈味成分である可能性が高い。 Sarcosine is one of the components of snow crab leg meat extract (Kawai, 2011), and it has been reported that pufferfish responds to it (Kiyohara et al., 1985). Creatinine is mainly contained in the muscles of higher animals such as fish, and is reported to be contained as a guanidino compound contained in mackerel fish. Regarding creatinine, although it has been reported that it has the effect of imparting a strong meat-like taste to humans and improving the flavor of soup stock, there is no report examining the taste response in fish, and the present inventors have newly discovered it. There is a high possibility that it is a taste component.
嗜好性成分の配合量は給餌されるウナギの種類やその生育状態、給餌回数等を考慮して当業者が適宜決定することができる。例えば、ニホンウナギの成魚にＮ，Ｎ‐ジメチルグリシンを１日１回与える場合、飼料におけるその配合量は、例えば、３質量％以上が好ましい。 A person skilled in the art can appropriately determine the amount of the palatability component in consideration of the type of eel to be fed, its growth state, feeding frequency, and the like. For example, when adult Japanese eels are fed with N,N-dimethylglycine once a day, the amount of N,N-dimethylglycine in the feed is preferably 3% by mass or more, for example.
ウナギの餌としては、従来使用されている、イワシなどの生餌、又はイワシ、サバ、ニシン若しくはアジ等の青魚を乾燥させた魚粉、サメ卵粉末などをベースとする、魚由来の成分を主とする配合飼料などを用いてもよい。飼料に添加する嗜好性成分の効果を損なわない限度で、従来の餌に使用されている魚由来の成分に加え、大豆ペプチド、オキアミ分解物、デンプン、リン酸カルシウム、食塩等のミネラル、酵母、薬草エキス等の成分を飼料に配合してもよい。 The eel feed mainly consists of fish-derived ingredients based on conventionally used live bait such as sardines, fish powder obtained by drying blue fish such as sardines, mackerel, herring or horse mackerel, and shark egg powder. You may use the compound feed etc. which assume. In addition to fish-derived ingredients used in conventional feed, soybean peptide, krill decomposition products, starch, calcium phosphate, minerals such as salt, yeast, and herbal extracts, as long as they do not impair the effects of palatability ingredients added to feed. You may mix|blend components, such as, with feed.
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to examples below, but the present invention is not limited to these.
（味覚受容体発現細胞を用いた評価系の構築）
各ＡｊＴ１Ｒ２をＡｊＴ１Ｒ３と共発現させ、ウェルベースアッセイによる発光検出系を用いて、アミノ酸に対する応答の有無を調べた。発光タンパク質としてはイクオリンを使用した。(Construction of evaluation system using taste receptor-expressing cells)
Each AjT1R2 was co-expressed with AjT1R3, and the presence or absence of response to amino acids was examined using a luminescence detection system based on a well-based assay. Aequorin was used as the luminescent protein.
キメラＧタンパク質は、公知であるｒＧ１５－ｒＧｉ３－５、ｒＧ１５－ｒＧｉ２－５、ｈＧ１６－ｒＧｉ３－５を用いた。以下の手順に従い、各キメラＧタンパク質との組み合わせで各受容体が１５種類のアミノ酸に対してどのように応答するかを調べた。 Chimeric G proteins used were known rG15-rGi3-5, rG15-rGi2-5, and hG16-rGi3-5. According to the following procedure, it was investigated how each receptor responds to 15 types of amino acids in combination with each chimeric G protein.
１）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２穴プレートへ播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養した。
２）１）の細胞に対し、各ＡｊＴ１Ｒ２、ＡｊＴ１Ｒ３、キメラＧタンパク質、アポイクオリンを発現するそれぞれのプラスミド（ｐＥＡＫ１０ベクター（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を使用。ＡｓｃＩとＮｏｔＩの制限酵素サイトに各配列を挿入した）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてトランスフェクションした。
３）６～７時間後に培地を交換し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養した。
４）翌日、測定用９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標） Ｓｕｒｆａｃｅ）へ細胞を播き直し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養した。
５）アッセイ当日、細胞をアッセイバッファーにて洗浄後、１０μＭ ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅを含むアッセイバッファー（０．１％ ＢＳＡを含む）中で、２７℃で４時間静置した（遮光下）。
６）リガンド添加時の発光強度の変化をＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で検出した。1) HEK293T cells were seeded in a 12-well plate and cultured overnight at 37°C and 5% CO2 .
2) Each plasmid (pEAK10 vector (Edge Biosystems, Gaithersburg, Md.) expressing AjT1R2, AjT1R3, chimeric G protein, and apoaequorin was used for the cells in 1). inserted) were transfected using Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.).
3) Change the medium after 6-7 hours and culture overnight at 37° C., 5% CO 2 .
4) The next day, the cells were replated in a 96-well plate for measurement (Corning, CellBIND® Surface) and cultured overnight at 37°C, 5% CO 2 .
5) On the day of the assay, the cells were washed with an assay buffer, and then allowed to stand at 27°C for 4 hours in an assay buffer containing 10 µM coelenterazine (containing 0.1% BSA) (under light shielding).
6) Changes in luminescence intensity upon ligand addition were detected with FlexStation 3 (Molecular Devices).
（結果と考察）
事前の検討として、ＡｊＴ１Ｒ２ａ＋ＡｊＴ１Ｒ３におけるＬ－アラニンに対する濃度依存性を評価した。その結果、いずれもＥＣ50値は１ｍＭ前後と算出されたが、応答強度に違いが見られた。ある程度高い応答を示したＧタンパク質のうち、いくつかの結果を表３に示す。
As a preliminary study, the concentration dependence of AjT1R2a+AjT1R3 on L-alanine was evaluated. As a result, EC 50 values were calculated to be around 1 mM for both, but there was a difference in response intensity. Table 3 shows the results of some of the G proteins that showed moderately high responses.
ＡｊＴ１Ｒ２ａ＋ＡｊＴ１Ｒ３及び各ＡｊＴ１Ｒ２ｂ＋ＡｊＴ１Ｒ３について、１５種類のアミノ酸のうち、特定のアミノ酸に対する応答結果を図２に示す。図２においては、リガンド投与時の発光強度の変化をＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３で検出した（平均値、ｎ＝２）。リガンド濃度はいずれも５０ｍＭ。縦軸は発光強度を表す。 FIG. 2 shows the results of responses to specific amino acids among the 15 types of amino acids for AjT1R2a+AjT1R3 and each AjT1R2b+AjT1R3. In FIG. 2, changes in luminescence intensity upon ligand administration were detected with FlexStation 3 (mean value, n=2). All ligand concentrations are 50 mM. The vertical axis represents the emission intensity.
図２に示すように、共発現させるキメラＧタンパク質の種類によって応答の程度に差が見られたが、おおよそいずれのＧタンパク質でも応答プロファイルは似ていた。 As shown in FIG. 2, there was a difference in the degree of response depending on the type of co-expressed chimeric G protein, but the response profile was similar for all G proteins.
図２に示していない結果も踏まえて考察すると、使用した１５種類のアミノ酸のうち、ＡｊＴ１Ｒ２ａ＋ＡｊＴ１Ｒ３はＬ－アラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－アルギニン、グリシン、Ｌ－プロリン、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１＋ＡｊＴ１Ｒ３はＬ－プロリン、Ｌ－アラニン、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－２＋ＡｊＴ１Ｒ３はＬ－ヒスチジン、Ｌ－セリン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－４＋ＡｊＴ１Ｒ３はＬ－アラニン、グリシン、Ｌ－セリン、Ｌ－プロリンに応答が見られた。ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－３＋ＡｊＴ１Ｒ３は、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニンに応答する傾向が見られたが、全体的に応答が低かった。 Considering the results not shown in FIG. 2, among the 15 amino acids used, AjT1R2a+AjT1R3 are L-alanine, L-serine, L-arginine, glycine and L-proline, AjT1R2b-1+AjT1R3 are L-proline, L-alanine, AjT1R2b-2 + AjT1R3 responds to L-histidine, L-serine, L-phenylalanine, L-alanine, L-asparagine, AjT1R2b-4 + AjT1R3 responds to L-alanine, glycine, L-serine, and L-proline rice field. AjT1R2b-3+AjT1R3 tended to respond to L-serine, L-threonine, L-alanine, and L-arginine, but overall responded poorly.
ＡｊＴ１Ｒ２ａ＋ＡｊＴ１Ｒ３及び各ＡｊＴ１Ｒ２ｂ＋ＡｊＴ１Ｒ３におけるＬ－アラニンに対する濃度依存性の評価結果から、応答強度に差はあれ、いずれのキメラＧタンパク質も使用することが可能であることがわかった。また、キメラＧタンパク質に関して、以降の実験では全ての受容体の組み合わせに共通して、ベースラインが低く、ある程度高い応答を示すｈＧ１６－ｒＧｉ３－５を使用することとした。 From the results of evaluation of the concentration dependence of AjT1R2a+AjT1R3 and AjT1R2b+AjT1R3 on L-alanine, it was found that any chimeric G protein can be used, although there is a difference in response strength. Further, with respect to the chimeric G protein, hG16-rGi3-5, which exhibits a low baseline and a somewhat high response in common for all combinations of receptors, was used in subsequent experiments.
（サルコシン、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン、クレアチニンに対する応答評価）
アッセイの方法は、上述のアミノ酸に対する応答の確認と同様に行った。(Response evaluation to sarcosine, N,N-dimethylglycine, creatinine)
The assay method was the same as for confirming the response to amino acids described above.
ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１＋ＡｊＴ１Ｒ３は、サルコシン、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン、クレアチニンのそれぞれに濃度依存的に応答した。図３にＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１＋ＡｊＴ１Ｒ３のサルコシン、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン、及びクレアチニンに対する濃度応答曲線を示す（ｍｅａｎ±ＳＥＭ， ｎ＝３）。ｈＧ１６－ｒＧｉ３－５のみの導入した培養細胞ではいずれのリガンドに対しても応答が見られなかったため、これらのリガンドはＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１＋ＡｊＴ１Ｒ３を介して受容されることが明らかになった（結果は示さない）。 AjT1R2b-1+AjT1R3 responded to sarcosine, N,N-dimethylglycine, and creatinine in a concentration-dependent manner. FIG. 3 shows concentration-response curves of AjT1R2b-1+AjT1R3 to sarcosine, N,N-dimethylglycine, and creatinine (mean±SEM, n=3). Cultured cells into which only hG16-rGi3-5 had been introduced showed no response to any of the ligands, indicating that these ligands are accepted via AjT1R2b-1 + AjT1R3 (results not shown). ).
（給餌試験）
２００Ｌ容水槽にニホンウナギ未成魚を１０尾ずつ収容して各試験区を設けた。給餌は、１日１回とし、毎日給餌を行った。
ウナギ育成用配合飼料（成鰻用、林兼産業株式会社販売）から、公知の嗜好性成分であるベタイン、グリシン、アラニン、オキアミミールを除いたものを嗜好性成分除去飼料とした。嗜好性成分除去飼料にＮ，Ｎ－ジメチルグリシンを３％添加して得られた飼料（以下、「Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン添加飼料」という）をニホンウナギ未成魚に上記のとおり給餌し、それらの摂餌量、飼料効率等を測定することで、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシンの嗜好性を評価した。比較群として、嗜好性成分除去飼料群、ウナギ育成用配合飼料群をおいた。
試験期間は３１日間とした。試験期間中の水温は、３０～３４℃であった。(Feeding test)
Ten immature Japanese eels were housed in a 200 L water tank, and each test area was established. Feeding was carried out once a day and every day.
A compound feed for raising eels (for mature eels, sold by Hayashikane Sangyo Co., Ltd.) was prepared by removing the known palatable ingredients betaine, glycine, alanine, and krill meal as a palatable ingredient-free feed. A feed obtained by adding 3% of N,N-dimethylglycine to a feed without palatable ingredients (hereinafter referred to as "N,N-dimethylglycine-added feed") was fed to immature Japanese eels as described above, and The palatability of N,N-dimethylglycine was evaluated by measuring the feed intake, feed efficiency, etc. As comparison groups, a group of diets without palatable ingredients and a group of mixed diets for breeding eels were set.
The test period was 31 days. The water temperature during the test period was 30-34°C.
結果を表４に示す（Ａ群：嗜好性成分除去飼料群、Ｂ群：Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン添加飼料群、Ｃ群：ウナギ育成用配合飼料群）。摂餌量は、残餌量をもとに評価し、乾燥重量で示した。
この結果から、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシンはニホンウナギの摂餌を誘引し、成長促進効果を有することが示唆された。
These results suggest that N,N-dimethylglycine attracts Japanese eels to feed and has a growth-promoting effect.
本発明のスクリーニング方法によれば、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン等の従来ウナギの養殖において使用されていなかった新たな成分の探索が可能になる。 According to the screening method of the present invention, it becomes possible to search for new components such as N,N-dimethylglycine, which have not been used in conventional eel farming.
Claims (12)
（ａ）ウナギ由来の味覚受容体Ｔ１Ｒ２ファミリーのいずれか一つのメンバーとＴ１Ｒ３ファミリーのいずれか一つのメンバーとから成るヘテロ二量体と、嗜好性成分の候補物質とを接触させる工程、及び
（ｂ）ヘテロ二量体の活性を増大させる候補物質を嗜好性成分と評価する工程、を含む、方法。 A method of screening palatability components for eel comprising:
(a) a step of contacting a heterodimer consisting of any one member of the eel-derived taste receptor T1R2 family and any one member of the T1R3 family with a candidate palatability component, and (b) ) evaluating a candidate substance that increases the activity of the heterodimer as a palatability component.
（ａ１）配列番号１、３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列から成るタンパク質；
（ａ２）配列番号２、４、６、８又は１０に記載の塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ａ３）配列番号１、３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ａ４）配列番号２、４、６、８又は１０に記載の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ａ５）配列番号１、３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；あるいは
（ａ６）配列番号２、４、６、８又は１０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質。 The method of any one of claims 1-3, wherein the member of the T1R2 family is a protein selected from the group consisting of (a1)-(a6):
(a1) a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9;
(a2) a protein encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10;
(a3) A protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9, the protein responding to L-amino acids;
(a4) A protein encoded by a gene comprising a nucleotide sequence having 80% or more identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10, the protein responding to L-amino acids;
(a5) A protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9 are deleted, substituted and/or added, and which responds to L-amino acids or (a6) a protein encoded by a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10, wherein the protein is responsive to L-amino acids protein.
（ｂ１）配列番号１１に記載のアミノ酸配列から成るタンパク質；
（ｂ２）配列番号１２に記載の塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ３）配列番号１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ｂ４）配列番号１２に記載の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ｂ５）配列番号１１に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；あるいは
（ｂ６）配列番号１２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質。 The method of any one of claims 1-5, wherein the T1R3 family member is a protein selected from the group consisting of (b1) to (b6):
(b1) a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11;
(b2) a protein encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 12;
(b3) A protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11, the protein responding to L-amino acids;
(b4) A protein encoded by a gene consisting of a nucleotide sequence having 80% or more identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 12, the protein responding to L-amino acids;
(b5) A protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and/or added to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11, the protein responding to an L-amino acid; or (b6) a sequence A protein encoded by a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence of number 12 under stringent conditions, the protein responding to L-amino acids.
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